JP2008131931A - 連続発酵による乳酸の製造方法 - Google Patents
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Abstract
簡便な操作条件で、長時間にわたり安定して高生産性を維持する連続発酵法による乳酸の製造方法を提供する。
【解決手段】
本発明は、乳酸を生産する能力を有する原核微生物の発酵培養液を分離膜によって濾液と未濾過液に分離し、濾液から所望の発酵生産物である乳酸を回収するとともに、未濾過液を発酵培養液に保持または還流する連続発酵方法であって、分離膜として、高い透過性と高い細胞阻止率を持ち閉塞しにくい特定の多孔性膜を用い、特定の低い膜間差圧で濾過処理することにより、安定に低コストで発酵による乳酸の生産効率を著しく向上させることが可能となる。
【選択図】 図1
Description
財団法人バイオインダストリー協会 発酵と代謝研究会編、「発酵ハンドブック」、64−65、共立出版(2001) 小林猛ら,ケミカル・エンジニア,12,49(1988)
・装置 原子間力顕微鏡装置(Digital Instruments(株)製Nanoscope IIIa)
・条件 探針 SiNカンチレバー(Digital Instruments(株)製)
走査モード コンタクトモード(気中測定)
水中タッピングモード(水中測定)
走査範囲 10μm、25μm 四方(気中測定)
5μm、10μm 四方(水中測定)
走査解像度 512×512
・試料調製 測定に際し膜サンプルは、常温でエタノールに15分浸漬後、RO水中に24時間浸漬し洗浄した後、風乾し用いた。RO水とは、濾過膜の一種である逆浸透膜(RO膜)を用いて濾過し、イオンや塩類などの不純物を排除した水を指す。RO膜の孔の大きさは、概ね2nm以下である。
発酵生産速度(g/L/hr)
=抜き取り液中の生産物濃度(g/L)×発酵液抜き取り速度(L/hr)
÷装置の運転液量(L) ・・・・(式3)
また、バッチ式培養による発酵生産速度は、原料炭素源をすべて消費した時点の生産物量(g)を、炭素源の消費に要した時間(h)とその時点の培養液量(L)で除して求められる。
図1に示す連続発酵装置を稼働させることにより、乳酸が連続発酵で得られるかどうかを調べるため、同装置を用いた連続発酵試験を行った。培地には表1に示すラクトコッカス・ラクティス用乳酸発酵培地を用い、121℃の温度で15分間高圧蒸気滅菌処理して用いた。分離膜エレメント部材には、ステンレスおよびポリサルホン樹脂の成形品を用いた。分離膜には、ポリフッ化ビニリデン(PVDF)を主成分とする、後述の参考例1で作製した多孔性膜を用いた。この多孔性膜の特性を調べたところ、平均細孔径が0.1μmであり、純水透過係数が50×10-9m3/m2/s/paであった。この実施例1における運転条件は、特に断らない限り下記のとおりである。
・発酵反応槽容量:1.5(L)
・使用分離膜:PVDF濾過膜
・膜分離エレメント有効濾過面積:120平方cm
・温度調整:37(℃)
・発酵反応槽通気量:200(mL/分)
・発酵反応槽攪拌速度:600(rpm)
・滅菌:分離膜エレメントを含む培養槽、および使用培地は総て121℃、20分のオー
トクレーブにより高圧蒸気滅菌。
・pH調整:8N アンモニア水溶液によりpHを6.5に調整
・膜透過水量制御:膜分離槽水頭差により流量を制御(水頭差は2m以内で制御した。)。
・カラム:Shim−Pack SPR−H(島津社製)
・移動相:5mM p−トルエンスルホン酸(流速0.8mL/分)
・反応液:5mM p−トルエンスルホン酸、20mM ビストリス、および0.1mM EDTA・2Na(流速0.8mL/分)
・検出方法:電気伝導度
・温度:45(℃)。
・カラム:TSK−gel Enantio L1(東ソー社製)
・移動相 :1mM 硫酸銅水溶液
・流速:1.0ml/分
・検出方法 :UV254nm
・温度 :30℃。
・光学純度(%)=100×(L−D)/(L+D)
ここで、LはL−乳酸の濃度を表し、DはD−乳酸の濃度を表す。また、グルコース濃度の測定には、“グルコーステストワコーC”(登録商標)(和光純薬社製)を用いた。
図2に示す連続発酵装置を稼働させることにより、乳酸がで得られるかどうかを調べるため、同装置を用いた連続発酵試験を行った。培地には表1に示すラクトコッカス・ラクティス用乳酸発酵培地を用い、121℃の温度で15分間高圧蒸気滅菌処理して用いた。分離膜エレメント部材には、ステンレスおよびポリサルホン樹脂の成形品を用いた。また分離膜には、実施例1と同じ多孔性膜を用いた。この多孔質膜の特性を調べたところ、平均細孔径は0.1μmであり、純水透過係数は50×10-9m3/m2/s/paであった。この実施例2における運転条件は、特に断らない限り下記のとおりである。
・発酵反応槽容量:1.5(L)
・使用分離膜:PVDF濾過膜
・膜分離エレメント有効濾過面積:120平方cm
・温度調整:37(℃)
・発酵反応槽通気量:200(L/分)
・発酵反応槽攪拌速度:600(rpm)
・滅菌:分離膜エレメントを含む培養槽、および使用培地は総て121℃、20分のオー
トクレーブにより高圧蒸気滅菌。
・pH調整:8N アンモニア水溶液によりpHを6.5に調整
・膜透過水量制御:膜分離槽水頭差により流量を制御(水頭差は2m以内で制御した。)。
乳酸が連続発酵で得られるかどうかを調べるため、実施例1と同じく図1に示す続発酵装置を用いて連続発酵試験を行った。培地には表3に示すラクトバシラス・カゼイ用乳酸発酵培地を用い、121℃の温度で15分間高圧蒸気滅菌処理して用いた。分離膜エレメント部材、分離膜および多孔質膜の特性は実施例1に記載のものと同様である。この実施例3における運転条件は、特に断らない限り下記のとおりである。
・発酵反応槽容量:1.5(L)
・使用分離膜:PVDF濾過膜
・膜分離エレメント有効濾過面積:120平方cm
・温度調整:30(℃)
・発酵反応槽通気量:100(mL/分)
・発酵反応槽攪拌速度:800(rpm)
・滅菌:分離膜エレメントを含む培養槽、および使用培地は総て121℃、20分のオー
トクレーブにより高圧蒸気滅菌。
・pH調整:8N 水酸化カルシウム水溶液によりpHを6.0に調整
・膜透過水量制御:膜分離槽水頭差により流量を制御(水頭差は2m以内で制御した。)。
図2に示す連続発酵装置を稼働させることにより、乳酸がで得られるかどうかを調べるため、同装置を用いた連続発酵試験を行った。培地には表3に示すラクトバシラス・カゼイ用乳酸発酵培地を用い、121℃の温度で15分間高圧蒸気滅菌処理して用いた。分離膜エレメント部材、分離膜および多孔質膜の特性は実施例2に記載のものと同様である。この実施例4における運転条件は、特に断らない限り下記のとおりである。
・発酵反応槽容量:1.5(L)
・使用分離膜:PVDF濾過膜
・膜分離エレメント有効濾過面積:120平方cm
・温度調整:30(℃)
・発酵反応槽通気量:100(L/分)
・発酵反応槽攪拌速度:800(rpm)
・滅菌:分離膜エレメントを含む培養槽、および使用培地は総て121℃、20分のオー
トクレーブにより高圧蒸気滅菌。
・pH調整:8N 水酸化カルシウム水溶液によりpH6.0に調整
・膜透過水量制御:膜分離槽水頭差により流量を制御(水頭差は2m以内で制御した。)。
参考例1で作成したポリフッ化ビニリデン(PVDF)を主成分とする多孔性膜の代わりに、分離膜として参考例2で作製したポリフッ化ビニリデン(PVDF)を主成分とする多孔性膜(中空糸膜)を用いた他は、実施例3と同様にして、連続発酵試験を行った。また、乳酸および総糖濃度から算出された投入グルコースから算出された乳酸生産速度を、表2に示した。500時間の発酵試験を行った結果、この連続発酵装置を用いることにより、安定した乳酸の連続発酵による製造が可能であることを確認することができた。
参考例1で作成したポリフッ化ビニリデン(PVDF)を主成分とする多孔性膜の代わりに、分離膜として参考例2で作製したポリフッ化ビニリデン(PVDF)を主成分とする多孔性膜(中空糸膜)を用いた他は、実施例4と同様にして、連続発酵試験を行った。また、乳酸および総糖濃度から算出された投入グルコースから算出された乳酸生産速度を、表2に示した。500時間の発酵試験を行った結果、この連続発酵装置を用いることにより、安定した乳酸の連続発酵による製造が可能であることを確認することができた。
原核微生物を用いた発酵形態として最も典型的なバッチ発酵を2L容のジャーファーメンターを用いて行い、その乳酸生産性を評価した。培地には表1に示すラクトコッカス・ラクティス用乳酸発酵培地を用い、121℃の温度で15分間高圧蒸気滅菌処理して用いた。この比較例1では、原核微生物としてラクトコッカス ラクティス JCM7638株を用い、生産物である乳酸の濃度の評価は、実施例1に示した方法を用いて評価し、グルコース濃度の測定には、“グルコーステストワコーC”(登録商標)(和光純薬社製)を用いた。比較例1の運転条件は、下記のとおりである。
・発酵反応槽容量(乳酸発酵培地量):1.5(L)
・温度調整:37(℃)
・発酵反応槽通気量:200(mL/分)
・発酵反応槽攪拌速度:200(rpm)
・pH調整:8N アンモニア水溶液によりpH6.5に調整
まず、ラクトコッカス ラクティス JCM7638株を、試験管で表1に示す5mlの窒素ガスでパージしたラクトコッカス・ラクティス用乳酸発酵培地で24時間、37℃の温度で静置培養した(前々培養)。得られた培養液を窒素ガスでパージした新鮮な乳酸発酵培地50mlに植菌し、48時間、37℃の温度で静置培養した(前培養)。前培養液をジャーファーメンターの1.5Lの表1に示す連続・バッチ発酵培地に植菌し、バッチ発酵を行った。バッチ発酵の結果を、上記実施例1および実施例2の連続発酵試験で得られた乳酸発酵生産性と比較して表2に示す。
原核微生物を用いた発酵形態として最も典型的なバッチ発酵を2L容のジャーファーメンターを用いて行い、その乳酸生産性を評価した。培地には表3に示すラクトバシラス・カゼイ用乳酸発酵培地を用い、121℃の温度で15分間高圧蒸気滅菌処理して用いた。この比較例2では、原核微生物としてラクトバシラス カゼイ NRIC1941株を用い、生産物である乳酸の濃度の評価は、実施例1に示した方法を用いて評価し、グルコース濃度の測定には“グルコーステストワコーC”(登録商標)(和光純薬社製)を用いた。またスクロース濃度とフラクトース濃度の測定にはF−キット(Roche社)を用いた。比較例2の運転条件は下記のとおりである。
・発酵反応槽容量(乳酸発酵培地量):1.5(L)
・温度調整:30(℃)
・発酵反応槽通気量(窒素ガス):100(mL/分)
・発酵反応槽攪拌速度:120(rpm)
・pH調整:8N 水酸化カルシウム水溶液によりpHを6.0に調整。
樹脂としてポリフッ化ビニリデン(PVDF)樹脂を、また溶媒としてN,N−ジメチルアセトアミド(DMAc)をそれぞれ用い、これらを90℃の温度下に十分に攪拌し、次の組成を有する原液を得た。
・PVDF:13.0重量%
・DMAc:87.0重量%
次に、上記の原液を25℃の温度に冷却した後、あらかじめガラス板上に貼り付けて置いた、密度が0.48g/cm3で、厚みが220μmのポリエステル繊維製不織布に塗布し、直ちに次の組成を有する25℃の温度の凝固浴中に5分間浸漬して、多孔質樹脂層が形成された多孔質基材を得た。
・水 :30.0重量%
・DMAc:70.0重量%
この多孔質基材をガラス板から剥がした後、80℃の温度の熱水に3回浸漬してDMAcを洗い出し、総膜厚が350μmの分離膜(平膜の多孔性膜)を得た。この分離膜の凝固浴と接触した側における、多孔質樹脂層表面の9.2μm×10.4μmの範囲内を、倍率10,000倍で走査型電子顕微鏡観察を行ったところ、観察できる細孔すべての直径の平均は2.0μmであり、反対側における、多孔質樹脂層表面の9.2μm×10.4μmの範囲内を、倍率10,000倍で走査型電子顕微鏡観察を行ったところ、観察できる細孔すべての直径の平均は0.1μmであった。次に、上記の分離膜について純水透水量を評価したところ、50×10-9m3/m2・s・Paであった。透水量の測定は、逆浸透膜による25℃の温度の精製水を用い、ヘッド高さ1mで行った。
重量平均分子量41.7万のフッ化ビニリデンホモポリマーとγ-ブチロラクトンとを、それぞれ38重量%と62重量%の割合で配合し、170℃の温度で混合溶解し原液を作製した。このようにして得られた原液を、γ-ブチロラクトンを中空部形成液体として随拌させながら口金から吐出し、温度20℃のγ-ブチロラクトン80重量%水溶液からなる冷却浴中で固化して中空糸膜を作製した。
2 分離膜エレメント
3 水頭差制御装置
4 気体供給装置
5 攪拌機
6 レベルセンサ
7 培地供給ポンプ
8 pH調整溶液供給ポンプ
9 pHセンサ・制御装置
10 温度調節器
11 発酵液循環ポンプ
12 膜分離槽
13 支持板
14 流路材
15 分離膜
16 凹部
17 集水パイプ
18 分離膜束
19 上部樹脂封止層
20 下部樹脂封止層
21 支持フレーム
22 集水パイプ
Claims (12)
- 乳酸を生産する能力を有する原核微生物の発酵培養液を分離膜で濾過し、濾液から生産物を回収するとともに未濾過液を前記発酵培養液に保持または還流し、かつ、その原核微生物の発酵原料を前記発酵培養液に追加する連続発酵により乳酸を製造する方法であって、前記分離膜として平均細孔径が0.01μm以上1μm未満の多孔性膜を用い、その膜間差圧を0.1から20kPaの範囲にして濾過処理することを特徴とする連続発酵による乳酸の製造方法。
- 多孔性膜の純水透過係数が、2×10−9m3/m2/s/pa以上6×10−7m3/m2/s/pa以下である請求項1記載の連続発酵による乳酸の製造方法。
- 多孔性膜の平均細孔径が0.01μm以上0.2μm未満であり、かつ、該平均細孔径の標準偏差が0.1μm以下である請求項1または2記載の連続発酵による乳酸の製造方法。
- 多孔性膜の膜表面粗さが0.1μm以下である請求項1から3のいずれかに記載の連続発酵による乳酸の製造方法。
- 多孔性膜が多孔性樹脂層を含み、その多孔性樹脂層の素材がポリフッ化ビニリデン系樹脂である請求項1から4のいずれかに記載の連続発酵による乳酸の製造方法。
- 原核微生物の発酵原料が糖類を含む請求項1から5のいずれかに記載の連続発酵による乳酸の製造方法。
- 原核微生物の発酵原料が1.6重量%以上の糖類を含む請求項1から5のいずれかに記載の連続発酵による乳酸の製造方法。
- 原核微生物が乳酸菌であることを特徴とする請求項1から7のいずれかに記載の連続発酵による乳酸の製造方法。
- 乳酸菌がラクトコッカス属(Genus Lactococcus)またはラクトバシラス属(Genus Lactobacillus)に属する乳酸菌である請求項8記載の連続発酵による乳酸の製造方法。
- 乳酸菌がラクトコッカス ラクティス(Lactococcus lactis)である請求項8または9記載の連続発酵による乳酸の製造方法。
- 乳酸菌がラクトバシラス カゼイ(Lactobacillus casei)である請求項8または9記載の連続発酵による乳酸の製造方法。
- 乳酸がL−乳酸である請求項1から11のいずれかに記載の連続発酵による乳酸の製造方法。
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