JP2008127331A - タンパク質を固定化した粒子 - Google Patents

Abstract

【課題】還元処理を行うことなくタンパク質や抗体などを磁性ナノ粒子などの粒子上にその活性を維持したまま固定化した粒子、及びその製造方法を提供すること。
【解決手段】アルデヒド基を有する粒子と、アミノオキシ基、カルボキシヒドラジン基またはヒドラジン基を有するタンパク質とを接触させて、オキシム結合又はヒドラゾン結合を形成させることにより得られる、タンパク質を固定化した粒子。
【選択図】なし

Description

本発明は、タンパク質をその活性を維持したまま固定化した粒子、並びにタンパク質をその活性を維持したまま粒子の表面に固定化する方法に関する。本発明の粒子は、ライフサイエンス、バイオセンサー、又は無機材料の機能化などの分野において使用することができる。

生体物質を固定化するための反応は、ナノ粒子に共有結合される分子の生物学的活性に有害作用を及ぼさない条件下で行われるべきである。例えば、タンパク質を粒子に結合するときは、高温、特定の有機溶媒、および、高イオン強度溶液のようなタンパク質または、ペプチドの変性を起こす条件は避けられるべきである。また、有機溶媒は、反応系から除外され、そしてEDCのような水溶性カップリング試薬が代わりに用いられる。それ以外にも、チオール−マレイミド、アルデヒド−アミンの組み合わせが報告されている。例えば、非特許文献1では、金コロイド粒子表面にアルデヒド基を提示し、合成糖鎖に存在するアミノ基とシッフ塩基を形成した後に、還元剤を添加し、２級アミンを介した共有結合で安定に固定化できることが報告されている。

しかしながら、この手法をタンパク質修飾に適用すると、タンパク質内に存在する還元されやすいアミノ酸がダメージを受けたり、還元反応後に生成した求核性の高い２級アミンの副反応が起こるため、タンパク質の失活が懸念される。即ち、タンパク質固定化の際に、アルデヒド基とタンパク質中の1級アミンから形成されるシッフ塩基を還元処理する手法では、タンパク質自体が還元される可能性があり、その結果、活性の低下が生じるという問題がある。

J. Am. Chem. Soc., 123, 8226, (2001)

本発明は、上記した従来技術の問題点を解消することを解決すべき課題とした。即ち、本発明は、還元処理を行うことなくタンパク質や抗体などを磁性ナノ粒子などの粒子上にその活性を維持したまま固定化した粒子、及びその製造方法を提供することを解決すべき課題とした。

本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討した結果、アルデヒド基と、アミノオキシ基、カルボキシヒドラジン基またはヒドラジン基との組み合わせから形成されるシッフ塩基は、還元処理を必要としない安定な結合を提供でき、タンパク質の活性も失活しないことを見出した。本発明はこれらの知見に基づいて完成したものである。

即ち、本発明によれば、アルデヒド基を有する粒子と、アミノオキシ基、カルボキシヒドラジン基またはヒドラジン基を有するタンパク質とを接触させて、オキシム結合又はヒドラゾン結合を形成させることにより得られる、タンパク質を固定化した粒子が提供される。

本発明の別の側面によれば、アルデヒド基を有するタンパク質と、アミノオキシ基、カルボキシヒドラジン基またはヒドラジン基を有する粒子とを接触させて、オキシム結合又はヒドラゾン結合を形成させることにより得られる、タンパク質を固定化した粒子が提供される。

好ましくは、本発明の粒子は、無機酸化物粒子である。
好ましくは、本発明の粒子は、磁性粒子である。

本発明のさらに別の側面によれば、アルデヒド基を有する粒子と、アミノオキシ基、カルボキシヒドラジン基またはヒドラジン基を有するタンパク質とを接触させて、オキシム結合又はヒドラゾン結合を形成させることを含む、タンパク質を固定化した粒子の製造方法が提供される。

本発明のさらに別の側面によれば、アルデヒド基を有するタンパク質と、アミノオキシ基、カルボキシヒドラジン基またはヒドラジン基を有する粒子とを接触させて、オキシム結合又はヒドラゾン結合を形成させることを含む、タンパク質を固定化した粒子の製造方法が提供される。

本発明のさらに別の側面によれば、上記した本発明の粒子を含む、温熱療法剤が提供される。
本発明のさらに別の側面によれば、上記した本発明の粒子を含む、ＭＲＩ造影剤が提供される。
本発明のさらに別の側面によれば、上記した本発明の粒子を含む、薬物送達剤が提供される。
本発明のさらに別の側面によれば、上記した本発明の粒子を含む、分析診断用プローブが提供される。

本発明の粒子においては、タンパク質は失活することなく、磁性ナノ粒子などの粒子の上に安定に固定化されている。

以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。
本発明の粒子は、アルデヒド基（−ＣＨＯ）を有する粒子と、アミノオキシ基（−Ｏ−ＮＨ₂）、カルボキシヒドラジン基（−ＣＯＮＨ−ＮＨ₂）またはヒドラジン基（−ＮＨ―ＮＨ₂）を有するタンパク質とを接触させて、オキシム結合（−Ｃ（Ｒ）＝Ｎ−Ｏ−）又はヒドラゾン結合（−Ｃ（Ｒ）＝ＮＮＨ−）を形成させることにより得られるタンパク質を固定化した粒子、並びにアルデヒド基を有するタンパク質と、アミノオキシ基、カルボキシヒドラジン基またはヒドラジン基を有する粒子とを接触させて、オキシム結合又はヒドラゾン結合を形成させることにより得られる、タンパク質を固定化した粒子の何れかである。

本発明において粒子に固定化されるタンパク質の種類は特に限定されない。温熱療法剤、ＭＲＩ造影剤、薬物送達剤、又は分析診断用プローブなどの用途に応じて所望のタンパク質を選択して固定化することができる。

本発明において粒子に固定化されるタンパク質は、アミノオキシ基、カルボキシヒドラジン基またはヒドラジン基を有するタンパク質であるか、又はアルデヒド基を有するタンパク質である。アミノオキシ基、カルボキシヒドラジン基またはヒドラジン基を有するタンパク質およびアルデヒド基を有するタンパク質は、これらの官能基を分子内に含む化合物とタンパク質とを反応させて両者を結合させることにより調製することができる。

本発明で用いる粒子の種類は特に限定されず、有機粒子又は無機粒子の何れでもよいが、好ましくは無機粒子であり、さらに好ましくは金属粒子である。また粒子サイズも特には限定されず、ナノ粒子、マイクロ粒子、又はミリ粒子の何れでもよいが、好ましくはナノ粒子である。特に好ましくは、本発明の粒子は、平均粒径１〜５００ｎｍのナノ粒子であり、好ましくは平均粒径１〜１００ｎｍのナノ粒子であり、特に好ましくは平均粒径１〜７０ｎｍのナノ粒子である。

金属粒子の一例としては、磁性粒子、特に好ましくは磁性ナノ粒子を用いることができる。磁性ナノ粒子としては、水性媒体に分散又は懸濁することができ、分散液又は懸濁液から磁場の適用により分離することができる粒子であれば任意の粒子を使用することができる。本発明で用いる磁性ナノ粒子としては、例えば、鉄、コバルト又はニッケルの塩、酸化物、ホウ化物又は硫化物；高い磁化率を有する稀土類元素（例えば、ヘマタイト又はフェライト）などが挙げられる。磁性ナノ粒子の具体例としては、例えば、マグネタイト（Ｆｅ₃Ｏ₄）、ＦｅＰｄ、ＦｅＰｔ、ＣｏＰｔなどの強磁性規則合金を使用することもできる。本発明では好ましい磁性ナノ粒子は、金属酸化物、特に、酸化鉄およびフェライト（Ｆｅ，Ｍ）₃Ｏ₄からなる群から選択されるものである。ここで酸化鉄には、とりわけマグネタイト、マグヘマイト、またはそれらの混合物が含まれる。前記式中、Ｍは、該鉄イオンと共に用いて磁性金属酸化物を形成することのできる金属イオンであり、典型的には遷移金属の中から選択され、最も好ましくはＺｎ²⁺、Ｃｏ²⁺、Ｍｎ²⁺、Ｃｕ²⁺、Ｎｉ²⁺、Ｍｇ²⁺などであり、Ｍ／Ｆｅのモル比は選択されるフェライトの化学量論的な組成に従って決定される。金属塩は固形でまたは溶液状で供給されるが、塩化物塩、臭化物塩、または硫酸塩であることが好ましい。このうち、安全性の観点から酸化鉄、フェライトが好ましい。特に好ましくは、マグネタイト（Ｆｅ₃Ｏ₄）である。

アルデヒドを有する粒子、及びアミノオキシ基、カルボキシヒドラジン基またはヒドラジン基を有する粒子の製造方法について以下に説明する。
10 mLの蒸留水に懸濁させた酸化鉄（10 mg / mL程度）に、アルデヒド基を有するカルボン酸誘導体の水溶液（濃度1M、体積1 mL）を添加して、室温で３〜５時間激しく攪拌することで水分散性の磁性ナノ粒子を得た。ここで得られた磁性ナノ粒子分散液に磁石を近づけても、粒子の凝集は観測されなかった。

本発明では、アルデヒド基を有する粒子と、アミノオキシ基、カルボキシヒドラジン基またはヒドラジン基を有するタンパク質とを接触させて、オキシム結合又はヒドラゾン結合を形成させるか、あるいはアルデヒド基を有するタンパク質と、アミノオキシ基、カルボキシヒドラジン基またはヒドラジン基を有する粒子とを接触させて、オキシム結合又はヒドラゾン結合を形成させる。粒子とタンパク質とを結合させるためには、タンパク質の表面に、例えば、HydraLink SHNH Reagent（Novabiochem社）を修飾する必要がある。

上記のようにして得られる粒子が、磁性ナノ粒子である場合には、当該磁性ナノ粒子は、例えば、腫瘍などの温熱療法剤として使用することができる。磁性ナノ粒子を用いて腫瘍の温熱療法を行う場合、磁性ナノ粒子を患者に投与し、電磁波を照射することによって温熱療法を行うことができる。磁性ナノ粒子の投与方法は、特に限定されず、経口投与でも非経口投与でもよいが、好ましくは非経口投与であり、例えば、静脈内投与、腹腔内投与、筋肉投与、皮下投与など任意の投与経路を選択することができる。磁性ナノ粒子の投与量は、患者の体重、疾患の状態などに応じて適宜設定することができるが、一般的には、１回の投与につき、１０μｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ程度を投与することができ、好ましくは、２０μｇ〜５０ｍｇ／ｋｇ程度を投与することができる。磁性ナノ粒子を投与してから一定時間後に、電磁波を照射することにより温熱療法を行うことができる。即ち、本発明の磁性体ナノ粒子を体内に注入し、腫瘍箇所に凝集させた後、電磁波をかけることにより局所的に加熱することが可能である。電磁波としては、高周波磁場を用いることが特に好ましく、特に電磁波としては、周波数が、1KHz〜1MHzの高周波磁場であることが好ましい。1KHzより高い周波数の高周波磁場が好ましい理由は、磁気ヒステリシス加熱の効率が高いからであり、1MHzより低い周波数の高周波磁場が好ましい理由は、誘導電流による生体の発熱を生起させることなく磁性微粒子を加熱することができるからである。前記高周波磁場の周波数は、なかでも5KHz〜200KHzの範囲が好適である。

磁性ナノ粒子は、磁性を有するため、磁力により所定の部位に誘導することができる。即ち、磁性ナノ粒子は体内に投与し、磁力により疾患部位に誘導することができる、また上記のようにして疾患部位に誘導された磁性ナノ粒子は、ＭＲＩ造影により確認することができる。即ち、磁性ナノ粒子は、ＭＲＩ用造影剤として有用である。

本発明の磁性ナノ粒子には、所望により薬物（薬学的活性成分）を含ませてもよい。このような磁性ナノ粒子は、上記の方法に従って疾患部位に誘導した後、高周波をあてて加熱し、ナノ粒子に内包した薬学的活性成分を放出させることができる。即ち、本発明の磁性ナノ粒子は、薬物送達剤として有用である。

さらに本発明の磁性ナノ粒子は、分析診断用プローブとして使用することもできる。具体的には、具体的には、粒子表面に様々な生体物質（DNA, タンパク質、抗体など）を固定化可能なので、以下のような解析においてハイスループットなスクリーニングが可能になると期待される。１）薬剤レセプターの単離・同定、２）レセプターの機能解析、３）生体反応制御ネットワークの解析などである。

以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。

実施例１：
ConcanavalinA（ConA）を5 mLの50 mM Tris HCl pH 8.0に溶解させ（40 μM ）, HydraLink SHNH Reagent（Novabiochem社、構造を以下に示す）（Succinimidyl 2-hydrazinonicotinate Hydrochloride）の最終濃度が 2 mM（50 eq. / ConA monomer）になるように加え、4℃で12時間静置した。精製は透析（セルロース：三光純薬、分画12000〜14000）で行った。50 mM Phosphate pH 7.2 の緩衝液中で２日間行った。MALDI-TOF-MSでHydraLinkが結合した分子量に相当するピークを確認した。

その後、アルデヒド基を表面に有する粒子を加えて反応させた。
10 mLの蒸留水に懸濁させた酸化鉄（10 mg / mL程度）に、アルデヒド基を有するカルボン酸誘導体の水溶液（濃度1M、体積1 mL）を添加して、室温で３〜５時間激しく攪拌することで水分散性の磁性ナノ粒子を得た。ここで得られた磁性ナノ粒子分散液に磁石を近づけても、粒子の凝集は観測されなかった。

Claims (10)

1. アルデヒド基を有する粒子と、アミノオキシ基、カルボキシヒドラジン基またはヒドラジン基を有するタンパク質とを接触させて、オキシム結合又はヒドラゾン結合を形成させることにより得られる、タンパク質を固定化した粒子。
2. アルデヒド基を有するタンパク質と、アミノオキシ基、カルボキシヒドラジン基またはヒドラジン基を有する粒子とを接触させて、オキシム結合又はヒドラゾン結合を形成させることにより得られる、タンパク質を固定化した粒子。
3. 無機酸化物粒子である、請求項１又は２に記載の粒子。
4. 磁性粒子である、請求項１から３の何れかに記載の粒子。
5. アルデヒド基を有する粒子と、アミノオキシ基、カルボキシヒドラジン基またはヒドラジン基を有するタンパク質とを接触させて、オキシム結合又はヒドラゾン結合を形成させることを含む、タンパク質を固定化した粒子の製造方法。
6. アルデヒド基を有するタンパク質と、アミノオキシ基、カルボキシヒドラジン基またはヒドラジン基を有する粒子とを接触させて、オキシム結合又はヒドラゾン結合を形成させることを含む、タンパク質を固定化した粒子の製造方法。
7. 請求項１から４の何れかに記載の粒子を含む、温熱療法剤。
8. 請求項１から４の何れかに記載の粒子を含む、ＭＲＩ造影剤。
9. 請求項１から４の何れかに記載の粒子を含む、薬物送達剤。
10. 請求項１から４の何れかに記載の粒子を含む、分析診断用プローブ。