JP2008099660A - Recombinant microorganism - Google Patents

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Abstract

<P>PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a microorganism having improved productivity of cellulase and useful for the industrial production of the cellulase; and to provide a method for producing the cellulase by utilizing the microorganism. <P>SOLUTION: The recombinant microorganism is obtained by introducing a gene encoding the cellulase to a microorganism having genes constituted so as to overexpress a secY gene of Bacillus subtilis or a gene equivalent to the gene. <P>COPYRIGHT: (C)2008,JPO&INPIT

Description

本発明は、セルラーゼの生産に用いる組換え微生物、及びこれを用いたセルラーゼの製造方法に関する。   The present invention relates to a recombinant microorganism used for cellulase production and a method for producing cellulase using the same.

セルロースは植物細胞壁の主成分であり、衣料、紙、建築材料などに有効利用されるバイオマスの代表的存在である。またバイオマスの有効的な利用方法としてセルロースを分解する酵素を用い糖類や更にエネルギー物質に変換しようとする試みが以前から行われている。また、掘越によって好アルカリ性バチルス属細菌由来のアルカリセルラーゼが見出されて以来（例えば、特許文献１、非特許文献１参照）、困難とされていたセルラーゼの衣料用重質洗剤への応用が可能となり、好アルカリ性バチルス属細菌の生産するアルカリセルラーゼ（例えば、特許文献２〜４参照）が衣料用洗剤へ配合されるに至っている。   Cellulose is a main component of plant cell walls and is a representative biomass that is effectively used for clothing, paper, building materials, and the like. In addition, as an effective method for using biomass, attempts have been made to convert sugars and energy materials using enzymes that decompose cellulose. Moreover, since alkaline cellulase derived from alkalophilic Bacillus genus bacteria was discovered by Minegoshi (see, for example, Patent Document 1 and Non-Patent Document 1), application of cellulase, which has been considered difficult, to heavy laundry detergent Alkaline cellulase produced by alkalophilic Bacillus bacteria (for example, see Patent Documents 2 to 4) has been incorporated into detergents for clothing.

近年、遺伝子工学の発展に伴い、微生物による有用物質の工業的生産が広く行われるようになり、洗剤用酵素の生産も遺伝子組換えにより大量生産されるようになってきている。こうした微生物による有用物質の工業生産においては、その生産性の向上が重要な課題の一つである。その為の手法として、突然変異等の遺伝学的手法による生産菌の育種が行われるようになっており、遺伝子組換えに適した宿主微生物の開発が進められている。   In recent years, along with the development of genetic engineering, industrial production of useful substances by microorganisms has been widely performed, and the production of enzymes for detergents has also been mass-produced by genetic recombination. In industrial production of useful substances by such microorganisms, improvement of productivity is one of the important issues. For this purpose, breeding of production bacteria by genetic methods such as mutation has been carried out, and development of host microorganisms suitable for gene recombination is being promoted.

一方、枯草菌をはじめとするBacillus属細菌やそれらを含むグラム陽性菌、更には大腸菌等のグラム陰性菌において、細胞内で合成されたタンパク質（未成熟な分泌タンパク質）の細胞外への輸送は、主としてSec経路と呼ばれる輸送システムを経由して行われる。枯草菌におけるSec経路は、分泌タンパク質を細胞外へ押し出すモーターの役割を担うSecA、また分泌タンパク質が通過する輸送チャネルの主要部分を構成するSecY、SecE、SecGの３つのタンパク質のほか、輸送チャネルの補助因子であるSecDF等によって、その機能が担われている。 On the other hand, gram-positive bacteria including Bacillus bacteria and their including Bacillus subtilis, further in the Gram-negative bacteria such as Escherichia coli, transport to extracellular proteins synthesized intracellularly (immature secretory protein) This is mainly done via a transport system called the Sec route. The Sec pathway in Bacillus subtilis consists of SecA, which plays the role of a motor that pushes secreted proteins out of the cell, and SecY, SecE, and SecG, which constitute the main part of the transport channel through which secreted proteins pass, as well as the transport channel. Its function is supported by SecDF, which is a cofactor.

このうち、SecGタンパク質をコードするsecG遺伝子を過剰発現し得る発現ベクター（特許文献５）や、secG遺伝子のリボソーム結合部位を改変することによりsecG遺伝子の発現を変化させたグラム陽性菌（特許文献６）に関する報告がなされており、secG遺伝子を破壊した枯草菌の生育が、異種タンパク質生産時に阻害されること等が示されている。また大腸菌において、secY遺伝子の変異が低温での生育やタンパク質の分泌を阻害することが報告されている（非特許文献２）。 Among them, the expression vector (Patent Document 5) the secG gene may overexpress encoding SecG protein or gram-positive bacteria with varying expression of secG gene by altering the ribosome binding site of the secG gene (Patent Document 6 ) And the growth of Bacillus subtilis disrupting the secG gene is shown to be inhibited during heterologous protein production. In addition, in Escherichia coli, it has been reported that a mutation in the secY gene inhibits growth at low temperatures and protein secretion (Non-patent Document 2).

しかしながら、secG遺伝子やsecY遺伝子の生菌内での過剰発現による目的タンパク質の分泌生産性向上を示すデータはこれまでに報告されておらず、またその他のSec経路に関わる遺伝子の過剰発現についても、目的タンパク質の分泌生産に如何なる影響を与えるかについては、これまでのところ充分な知見は得られていない。
特公昭５０−２８５１５号公報 特公昭６０−２３１５８号公報 特公平６−０３０５７８号公報 米国特許第４９４５０５３号明細書 特表２００１−５１００４６号公報 米国特許出願公開第２００３／０１５７６４２号明細書 Horikoshi & Akiba, Alkalophilic Microorganisms, Springer, Berlin (1982） Cell, 32, :789 (1983) However, no data has been reported so far to improve the secretory productivity of the target protein due to overexpression of secG gene or secY gene in live bacteria, and overexpression of genes related to other Sec pathways, So far, sufficient knowledge has not been obtained as to how it affects the secretory production of the target protein.
Japanese Patent Publication No. 50-28515 Japanese Patent Publication No. 60-23158 Japanese Patent Publication No. 6-030578 US Pat. No. 4,945,053 JP 2001-510046 JP US Patent Application Publication No. 2003/0157642 Horikoshi & Akiba, Alkalophilic Microorganisms, Springer, Berlin (1982) Cell, 32,: 789 (1983)

本発明は、セルラーゼの生産性が向上しセルラーゼの工業的生産に有用な微生物、及び当該微生物を利用したセルラーゼの製造方法を提供することに関する。   The present invention relates to providing a microorganism that improves cellulase productivity and is useful for industrial production of cellulase, and a method for producing cellulase using the microorganism.

本発明者らは、微生物ゲノム上にコードされる各種遺伝子において、有用なタンパク質又はポリペプチドの生産に影響を及ぼす遺伝子を探索したところ、枯草菌の分泌装置の主要構成因子をコードするsecY遺伝子を過剰発現した微生物が、セルラーゼの生産性向上に特に有用であることを見出した。 The present inventors searched for genes that affect the production of useful proteins or polypeptides in various genes encoded on the microbial genome. As a result, the secY gene encoding the major component of the Bacillus subtilis secretion apparatus was identified . It has been found that overexpressed microorganisms are particularly useful for improving cellulase productivity.

すなわち、本発明は、枯草菌のsecY遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子を過剰発現するように遺伝子構築された微生物に、セルラーゼをコードする遺伝子を導入した組換え微生物に係るものである。 That is, the present invention relates to a recombinant microorganism in which a cellulase-encoding gene is introduced into a microorganism constructed so as to overexpress the Bacillus subtilis secY gene or a gene corresponding to the gene.

また本発明は、当該組換え微生物を用いたセルラーゼの製造方法に係るものである。   The present invention also relates to a method for producing cellulase using the recombinant microorganism.

本発明の組換え微生物は、セルラーゼの生産に特に有用なものであり、これを用いることによりセルラーゼの生産性向上を図ることができる。   The recombinant microorganism of the present invention is particularly useful for the production of cellulase. By using this, the productivity of cellulase can be improved.

本発明において、転写開始制御領域は、プロモーター及び転写開始点を含む領域であり、リボソーム結合部位は、開始コドンと共に翻訳開始制御領域を形成するShine-Dalgarno（SD）配列（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74, 5463 (1974)）に相当する部位である。   In the present invention, the transcription initiation control region is a region containing a promoter and a transcription start site, and the ribosome binding site is a Shine-Dalgarno (SD) sequence (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74, 5463 (1974)).

本発明において、遺伝子の上流・下流とは、複製開始点からの位置ではなく、上流とは対象として捉えている遺伝子又は領域の5'側に続く領域を示し、一方、下流とは対象として捉えている遺伝子又は領域の3'側に続く領域を示す。   In the present invention, upstream / downstream of a gene is not a position from the replication start point, but upstream refers to a region continuing on the 5 ′ side of the gene or region regarded as a target, while downstream refers to a target. The region following the 3 ′ side of the gene or region being shown is indicated.

本発明において、アミノ酸配列および塩基配列の同一性は、Lipman-Pearson法 (Science, 227, 1435, (1985))によって計算される。具体的には、遺伝情報処理ソフトウェアGenetyx-Win（ソフトウェア開発）のホモロジー解析（Search homology）プログラムを用いて、Unit size to compare（ktup）を２として解析を行うことにより算出される。   In the present invention, the identity of the amino acid sequence and the base sequence is calculated by the Lipman-Pearson method (Science, 227, 1435, (1985)). Specifically, it is calculated by performing an analysis with Unit size to compare (ktup) set to 2 using a homology analysis (Search homology) program of genetic information processing software Genetyx-Win (software development).

本発明の微生物を構築するための親微生物としては、枯草菌のsecY遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子を有するものであればよく、これらは野生型のものでも変異を施したものでもよい。具体的には、バチルス（Bacillus）属細菌や、クロストリジウム(Clostridium)属細菌、或いは酵母等が挙げられ、中でもバチルス（Bacillus）属細菌が好ましい。更に、全ゲノム情報が明らかにされ、遺伝子工学、ゲノム工学技術が確立されている点、またタンパク質を菌体外に分泌生産させる能力を有する点から特に枯草菌（Bacillus subtilis）が好ましい。
本明細書に記載の枯草菌の各遺伝子及び遺伝子領域の名称は、Nature, 390, 249-256,(1997)で報告され、JAFAN: Japan Functional Analysis Network for Bacillus subtilis (BSORF DB)でインターネット公開（http://bacillus.genome.ad.jp/、2004年3月10日更新）された枯草菌ゲノムデータに基づいて記載している。 The parent microorganism for constructing the microorganism of the present invention may be any microorganism having the secY gene of Bacillus subtilis or a gene corresponding to the gene, and these may be wild-type or mutated. Specific examples include bacteria belonging to the genus Bacillus, bacteria belonging to the genus Clostridium , yeast, etc. Among them, bacteria belonging to the genus Bacillus are preferable. Furthermore, Bacillus subtilis is particularly preferred from the viewpoint that whole genome information has been clarified, genetic engineering and genome engineering techniques have been established, and that it has the ability to secrete and produce proteins outside the cells.
The names of the genes and gene regions of Bacillus subtilis described in this specification are reported in Nature, 390, 249-256, (1997) and published on the Internet on JAFAN: Japan Functional Analysis Network for Bacillus subtilis (BSORF DB) ( http://bacillus.genome.ad.jp/, updated on March 10, 2004), based on genome data of Bacillus subtilis.

本発明の枯草菌のsecY遺伝子とは、配列番号１で示される塩基配列からなる遺伝子をいう。枯草菌のsecY遺伝子に相当する遺伝子とは、枯草菌のsecY遺伝子と実質的に同じ機能を有する遺伝子をいい、例えば、バチルス リケニホルミス（Bacillus licheniformis）、バチルス アントラシス（Bacillus anthracis）、バチルス セレウス（Bacillus cereus）、バチルス チューリンジェンシス（Bacillus thuringiensis）、或いはオーシャノバチルス イヘエンシス（Oceanobacillus iheyensis）等において、主にゲノム解析により同定された各secY遺伝子、及びSecYタンパク質をコードする遺伝子が挙げられる。尚、バチルス アントラシス（Bacillus anthracis）の様に当該遺伝子が２種類同定されているものもある。また枯草菌のsecY遺伝子に相当する遺伝子としては以下の（１）〜（４）のいずれかの遺伝子が挙げられる。
（１）配列番号１で示される塩基配列と９０％以上、好ましくは９５％以上、より好ましくは９９％以上の同一性を有する塩基配列からなり、且つ配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質と機能的に等価なタンパク質をコードするDNAからなる遺伝子。
（２）配列番号１で示される塩基配列と相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つ配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質と機能的に等価なタンパク質をコードするDNAからなる遺伝子。なお、ここで、「ストリンジェントな条件」としては、例えばMolecular Cloning −A LABORATORY MANUAL THIRD EDITION［Joseph Sambrook, David W. Russell., Cold Spring Harbor LaboratoryPress］記載の方法が挙げられ、例えば、６×SSC（１×SSCの組成：０.１５M 塩化ナトリウム、０．０１５M クエン酸ナトリウム、pH７．０）、０．５％ SDS、５ｘデンハート及び１００mg／mLニシン***DNAを含む溶液にプローブとともに６５℃で８〜１６時間恒温し、ハイブリダイズさせる条件が挙げられる。
（３）配列番号２で示されるアミノ酸配列と９０％以上、好ましくは９５％以上、更に好ましくは９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つ配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質と機能的に等価なタンパク質をコードするDNAからなる遺伝子。
（４）配列番号２で示されるアミノ酸配列において、１若しくは２以上のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つ配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質と機能的に等価なタンパク質をコードするDNAからなる遺伝子。なお、ここで、配列番号２で示されるアミノ酸配列において、１若しくは２以上のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列には、１若しくは数個、好ましくは１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列が含まれ、付加には、両末端への１〜数個のアミノ酸の付加が含まれる。
なお、配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質と機能的に等価なタンパク質とは、secY遺伝子によりコードされるタンパク質と実質的に同じ機能を有し、分泌タンパク質が通過する輸送チャネルの主要部分を構成することのできるタンパク質をいう。 The secY gene of Bacillus subtilis of the present invention refers to a gene consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 1. The gene corresponding to secY gene of B. subtilis refers to a gene having secY gene substantially the same function in Bacillus subtilis, e.g., Bacillus licheniformis (Bacillus licheniformis), Bacillus anthracis (Bacillus anthracis), Bacillus cereus (Bacillus cereus ), Bacillus thuringiensis , Oceanobacillus iheyensis, etc., and the genes encoding each secY gene identified by genome analysis and the SecY protein. In some cases, two types of the genes have been identified, such as Bacillus anthracis . Examples of the gene corresponding to the secY gene of Bacillus subtilis include any of the following genes (1) to (4).
(1) A protein comprising a nucleotide sequence having 90% or more, preferably 95% or more, more preferably 99% or more identity with the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1, and comprising an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 A gene consisting of DNA that encodes a functionally equivalent protein.
(2) A protein that is hybridized under stringent conditions with a DNA comprising a nucleotide sequence complementary to the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 and functionally equivalent to a protein comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 A gene consisting of DNA encoding. Here, examples of the “stringent conditions” include a method described in Molecular Cloning-A LABORATORY MANUAL THIRD EDITION [Joseph Sambrook, David W. Russell., Cold Spring Harbor Laboratory Press], for example, 6 × SSC. (Composition of 1 × SSC: 0.15 M sodium chloride, 0.015 M sodium citrate, pH 7.0), 0.5% SDS, 5 × Denhart and 100 mg / mL herring sperm DNA together with the probe at 65 ° C. for 8 The conditions are such that the temperature is kept constant for 16 hours and hybridized.
(3) A protein comprising an amino acid sequence having 90% or more, preferably 95% or more, more preferably 99% or more identity with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 and comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 A gene consisting of DNA that encodes a functionally equivalent protein.
(4) In the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, it consists of an amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted, substituted or added, and is functionally equivalent to a protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2. A gene consisting of DNA that codes for various proteins. Here, in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, one or several, preferably 1 to 10 amino acids are missing in the amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted, substituted or added. A deleted, substituted or added amino acid sequence is included, and the addition includes the addition of one to several amino acids at both ends.
The protein functionally equivalent to the protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 has substantially the same function as the protein encoded by the secY gene, and is the main part of the transport channel through which the secreted protein passes. Refers to a protein that can constitute

枯草菌のsecY遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子を過剰発現させる手段としては、例えば微生物において機能を有する転写開始制御領域若しくは転写開始制御領域とリボソーム結合部位を、枯草菌のsecY遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子のゲノム上における上流、又は枯草菌のsecY遺伝子又は当該遺伝子を含むゲノム上のオペロンの先頭遺伝子の上流に導入してなるか、或いは微生物において機能を有する転写開始制御領域若しくは転写開始制御領域とリボソーム結合部位を枯草菌のsecY遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子の上流に連結した遺伝子断片を導入することが挙げられる。 As a means for overexpressing the Bacillus subtilis secY gene or a gene corresponding to the gene, for example, a transcription initiation control region or transcription initiation control region having a function in a microorganism and a ribosome binding site are added to the Bacillus subtilis secY gene or the gene. A transcription initiation control region or transcription initiation control function that is introduced upstream of the corresponding gene in the genome, upstream of the secY gene of Bacillus subtilis or the first gene of the operon on the genome containing the gene, or has a function in the microorganism For example, a gene fragment in which a region and a ribosome binding site are linked upstream of the secY gene of Bacillus subtilis or a gene corresponding to the gene can be mentioned.

ここで、微生物において機能する転写開始制御領域若しくは転写開始制御領域とリボソーム結合部位としては、宿主となる微生物において機能する転写開始制御領域若しくは転写開始制御領域とリボソーム結合部位であれば特に限定されないが、例えば、枯草菌spoVG遺伝子若しくはaprE遺伝子又はこれらの遺伝子に相当する遺伝子の上流に位置する転写開始制御領域若しくは転写開始制御領域とリボソーム結合部位が好ましく、特に枯草菌spoVG遺伝子若しくは当該遺伝子に相当する遺伝子の上流に位置する転写開始制御領域若しくは転写開始制御領域とリボソーム結合部位が好ましい。 Here, the transcription initiation control region or transcription initiation control region functioning in the microorganism and the ribosome binding site are not particularly limited as long as the transcription initiation control region or transcription initiation control region and ribosome binding site function in the host microorganism. For example, a transcription initiation control region or a transcription initiation control region located upstream of a Bacillus subtilis spoVG gene or aprE gene or a gene corresponding to these genes and a ribosome binding site are preferable, and particularly corresponds to the Bacillus subtilis spoVG gene or the gene. A transcription initiation control region or transcription initiation control region located upstream of the gene and a ribosome binding site are preferred.

枯草菌のspoVG遺伝子の転写開始制御領域としては、JAFAN：Japan Functional Analysis Network for Bacillus subtilis (BSORF DB)でインターネット公開（http://bacillus.genome.ad.jp/、2004年3月10日更新）により、遺伝子番号BG101126として開示されたspoVG遺伝子の転写を制御する領域が挙げられる。より具体的には、配列番号７の塩基番号38〜210で示される塩基配列からなるDNA、又は当該配列と相同な塩基配列からなり枯草菌のspoVG遺伝子の転写開始制御領域としての機能を有するDNAが挙げられる。また、枯草菌のspoVG遺伝子の転写開始制御領域とリボソーム結合部位としては、配列番号７の塩基番号38〜230で示される塩基配列からなるDNA、又は当該配列と相同な塩基配列からなり枯草菌のspoVG遺伝子の転写開始制御領域とリボソーム結合部位としての機能を有するDNAが挙げられる。 As a transcription initiation regulatory region of the spoVG gene of Bacillus subtilis, JAFAN: Japan Functional Analysis Network for Bacillus subtilis (BSORF DB) published on the Internet (http://bacillus.genome.ad.jp/, updated March 10, 2004) ) Includes a region that controls the transcription of the spoVG gene disclosed as gene number BG101126. More specifically, DNA consisting of the base sequence represented by base numbers 38 to 210 of SEQ ID NO: 7, or DNA consisting of a base sequence homologous to the sequence and having a function as a transcription initiation control region of the spoVG gene of Bacillus subtilis Is mentioned. Further, the transcription initiation control region and the ribosome binding site of the spoVG gene of Bacillus subtilis include DNA consisting of the base sequence represented by base numbers 38 to 230 of SEQ ID NO: 7, or a base sequence homologous to the sequence and Examples thereof include DNA having a function as a transcription initiation control region of the spoVG gene and a ribosome binding site.

配列番号７の塩基番号38〜210で示される塩基配列や塩基番号38〜230で示される塩基配列と相同な塩基配列としては、例えば、（Ａ）配列番号７の塩基番号38〜210又は塩基番号38〜230で示される塩基配列と相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAからなる塩基配列、（Ｂ）配列番号７の塩基番号38〜210又は塩基番号38〜230で示される塩基配列と９０％以上、好ましくは９５％以上、更に好ましくは９９％以上の同一性を有する塩基配列等が挙げられる。
尚、ここで、「ストリンジェントな条件」としては、上記したものと同様の条件が挙げられる。 Examples of the base sequence represented by base numbers 38 to 210 of SEQ ID NO: 7 and the base sequence homologous to the base sequence represented by base numbers 38 to 230 include (A) base numbers 38 to 210 of SEQ ID NO: 7 or base numbers A base sequence comprising a DNA that hybridizes under stringent conditions with a DNA comprising a base sequence complementary to the base sequence represented by 38 to 230, (B) base numbers 38 to 210 of SEQ ID NO: 7 or base numbers 38 to Examples thereof include a base sequence having 90% or more, preferably 95% or more, more preferably 99% or more identity with the base sequence shown by 230.
Here, examples of the “stringent conditions” include the same conditions as described above.

また、枯草菌のspoVG遺伝子の転写開始制御領域若しくは、転写開始制御領域とリボソーム結合部位としての機能を有するとは、枯草菌のsecY遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子の上流、又は枯草菌のsecY遺伝子又は当該遺伝子を含むゲノム上のオペロンの先頭遺伝子（枯草菌においてはrpsJ遺伝子）の上流に導入した際に、secY遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子が過剰発現され、目的タンパク質又はポリペプチドの生産性が向上し、しかも、その向上の程度が、枯草菌のspoVG遺伝子の転写開始制御領域若しくは、転写開始制御領域とリボソーム結合部位を枯草菌のsecY遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子の上流、又は枯草菌のsecY遺伝子又は当該遺伝子を含むゲノム上のオペロンの先頭遺伝子（枯草菌においてはrpsJ遺伝子）の上流に導入した時と同等に向上するものをいう。 In addition, the transcription initiation control region of the spoVG gene of Bacillus subtilis or having a function as a transcription initiation control region and a ribosome binding site means that the secY gene of Bacillus subtilis or upstream of the gene corresponding to the gene, or secY of Bacillus subtilis When introduced upstream of the gene or the first gene of the operon on the genome containing the gene ( rpsJ gene in Bacillus subtilis), the secY gene or the gene corresponding to the gene is overexpressed to produce the target protein or polypeptide The transcription initiation control region of the spoVG gene of Bacillus subtilis, or the transcription initiation control region and the ribosome binding site upstream of the Bacillus subtilis secY gene or a gene corresponding to the gene, or guide upstream of the first gene in the operon on the genome containing secY gene or the gene of Bacillus subtilis (RpsJ gene in B. subtilis) Say what to improve to equal and when.

当該転写開始制御領域、若しくは転写開始制御領域とリボソーム結合部位のsecY遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子のゲノム上の上流、又は枯草菌のsecY遺伝子又は当該遺伝子を含むゲノム上のオペロンの先頭遺伝子（枯草菌においてはrpsJ遺伝子）の上流への導入には、枯草菌のsecY遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子、又は枯草菌のsecY遺伝子又は当該遺伝子を含むゲノム上のオペロンの本来の転写開始制御領域、若しくは転写開始制御領域とリボソーム結合部位の一部又は全部を置換するものの他に、本来の転写開始制御領域、若しくは転写開始制御領域とリボソーム結合部位を残したまま挿入するものが含まれる。 The transcription initiation control region, or the secY gene of the transcription initiation control region and the ribosome binding site or the upstream of the gene corresponding to the gene, or the secY gene of Bacillus subtilis or the leading gene of the operon on the genome containing the gene ( In the upstream of the Bacillus subtilis rpsJ gene), the Bacillus subtilis secY gene or a gene corresponding to the gene, or the Bacillus subtilis secY gene or the original transcription initiation control region of the operon on the genome containing the gene In addition to those that replace part or all of the transcription initiation control region and the ribosome binding site, the original transcription initiation control region, or the one that is inserted while leaving the transcription initiation control region and the ribosome binding site are included.

当該転写開始制御領域、若しくは転写開始制御領域とリボソーム結合部位への置換は、例えば相同組換えによる公知の方法を用いて行うことができる。すなわち、まず、斯かる転写開始制御領域、若しくは転写開始制御領域とリボソーム結合部位を含むDNA断片の上流にsecY遺伝子を含むオペロンの本来の転写開始制御領域の上流領域を含むDNA断片と薬剤耐性遺伝子断片を、一方、下流にsecY遺伝子を含むオペロンの先頭の遺伝子であるrpsJ遺伝子の翻訳開始制御領域と構造遺伝子領域の一部又は全部、或いはrpsJ遺伝子の構造遺伝子領域の一部又は全部を含むDNA断片を、SOE（splicing by overlap extension）−PCR法（Gene,77,61,1989）などの公知の方法により結合させる。この様にして、secY遺伝子を含むオペロンの本来の転写開始制御領域の上流領域を含むDNA断片、薬剤耐性遺伝子断片、当該転写開始制御領域、若しくは転写開始制御領域とリボソーム結合部位を含むDNA断片、rpsJ遺伝子の翻訳開始制御領域と構造遺伝子領域の一部又は全部、或いはrpsJ遺伝子の構造遺伝子領域の一部又は全部を含むDNA断片の順に結合したDNA断片を得る。次に、かかるDNA断片を、公知の方法により親微生物細胞内に取り込ませることにより、親微生物ゲノムのsecY遺伝子を含むオペロンの本来の転写開始制御領域の上流領域、及びrpsJ遺伝子の翻訳開始制御領域と構造遺伝子領域の一部又は全部、或いはrpsJ遺伝子の構造遺伝子領域の一部又は全部を含む領域の２箇所において、二重交差の相同組換えが起こる。その結果、本来の転写開始制御領域、若しくは転写開始制御領域とリボソーム結合部位が当該転写開始制御領域、若しくは転写開始制御領域とリボソーム結合部位に置換された形質転換体を、上記薬剤耐性遺伝子を指標として分離することができる。これにより、ゲノム上のsecY遺伝子を含むオペロンの上流へ導入された当該転写開始制御領域、若しくは転写開始制御領域とリボソーム結合部位は、遺伝的に安定に保持されることとなる。尚、具体的に導入用DNA断片を宿主微生物に導入する公知の方法としては、コンピテントセル形質転換方法(J. Bacterial. 93, 1925 (1967))、プロトプラスト形質転換法(Mol. Gen. Genet. 168, 111 (1979))、或いはエレクトロポレーション法（FEMS Microbiol. Lett. 55,135 (1990)）等が挙げられ、特にコンピテントセル形質転換方法が好ましい。
特に、本発明微生物の宿主として枯草菌を用いる場合、secY遺伝子を含むオペロンの本来の転写開始制御領域、若しくは転写開始制御領域とリボソーム結合部位から、当該転写開始制御領域、若しくは転写開始制御領域とリボソーム結合部位への相同組換えによる置換は、Mol.Gen.Genet.,223,268,1990記載の方法等を利用して行うことが出来る。 The transcription initiation control region, or the substitution to the transcription initiation control region and the ribosome binding site can be performed using, for example, a known method by homologous recombination. That is, first, such a transcription initiation control region, or a DNA fragment containing the upstream region of the original transcription initiation control region of the operon containing the secY gene upstream of the DNA fragment containing the transcription initiation control region and the ribosome binding site, and the drug resistance gene DNA containing the fragment, on the other hand, part or all of the translation initiation control region and structural gene region of the rpsJ gene, which is the first gene of the operon including the secY gene downstream, or part or all of the structural gene region of the rpsJ gene The fragments are bound by a known method such as SOE (splicing by overlap extension) -PCR (Gene, 77, 61, 1989). In this way, a DNA fragment containing the upstream region of the original transcription initiation control region of the operon containing the secY gene, a drug resistance gene fragment, the transcription initiation control region, or a DNA fragment containing the transcription initiation control region and the ribosome binding site, rpsJ gene translational initiation regulatory region and part or all of the structural gene region or to obtain a bound DNA fragment in the order of DNA fragments containing a part or the whole of the structural gene region of rpsJ gene. Next, by incorporating such a DNA fragment into the parent microbial cell by a known method, the upstream region of the original transcription initiation control region of the operon containing the secY gene of the parent microbial genome, and the translation initiation control region of the rpsJ gene And double crossover homologous recombination occurs in two parts of the structural gene region, part or all of the region, or part of the structural gene region of the rpsJ gene. As a result, the original transcription initiation control region, or a transformant in which the transcription initiation control region and the ribosome binding site are replaced with the transcription initiation control region, or the transcription initiation control region and the ribosome binding site, is used as an indicator of the drug resistance gene. Can be separated as As a result, the transcription initiation control region introduced to the upstream of the operon containing the secY gene on the genome, or the transcription initiation control region and the ribosome binding site are genetically stably maintained. Specifically, known methods for introducing a DNA fragment for introduction into a host microorganism include competent cell transformation methods (J. Bacterial. 93, 1925 (1967)), protoplast transformation methods (Mol. Gen. Genet 168, 111 (1979)) or electroporation method (FEMS Microbiol. Lett. 55, 135 (1990)), etc., and competent cell transformation methods are particularly preferred.
In particular, when Bacillus subtilis is used as the host of the microorganism of the present invention, from the original transcription initiation control region of the operon containing the secY gene, or from the transcription initiation control region and the ribosome binding site, the transcription initiation control region or the transcription initiation control region Substitution by homologous recombination to the ribosome binding site can be performed using the method described in Mol. Gen. Genet., 223, 268, 1990, and the like.

また、当該転写開始制御領域若しくは転写開始制御領域とリボソーム結合部位の挿入は、挿入したい転写開始制御領域若しくは転写開始制御領域とリボソーム結合部位の両末端に付加するDNA断片の配列を適切に選択すれば、上述の置換の方法と同様の方法により行うことができる。例えば、かかる転写開始制御領域の上流に、secY遺伝子を含むオペロンの本来の転写開始制御領域の上流領域を含むDNA断片と薬剤耐性遺伝子断片とを結合させ、下流に本来の転写開始制御領域の一部又は全部を含むDNA断片を結合させる。この様にして、secY遺伝子を含むオペロンの本来の転写開始制御領域の上流領域を含むDNA断片、薬剤耐性遺伝子断片、当該転写開始制御領域、本来の転写開始制御領域の一部又は全部を含むDNA断片の順に結合したDNA断片を得る。次に、かかるDNA断片を宿主微生物に挿入したのち、薬剤耐性遺伝子を指標として形質転換体を分離することができる。このようにして分離した形質転換体のゲノム上では、secY遺伝子を含むオペロンの本来の転写開始制御領域と当該転写開始制御領域とがそれぞれ間をあけずに隣接した状態で安定に保持されることとなる。或いは、かかる転写開始制御領域の上流に、secY遺伝子の上流領域を含むDNA断片と薬剤耐性遺伝子断片とを結合させ、下流にsecY遺伝子の一部又は全部を含むDNA断片を結合させたDNA断片を調製して用いることにより、当該転写開始制御領域がsecY遺伝子の直上流に導入された状態で安定に保持されることとなる。 In addition, for the insertion of the transcription initiation control region or transcription initiation control region and the ribosome binding site, appropriately select the transcription initiation control region to be inserted or the sequence of the DNA fragment added to both ends of the transcription initiation control region and the ribosome binding site. For example, it can be carried out by the same method as the above-described substitution method. For example, a DNA fragment containing an upstream region of the original transcription initiation control region of an operon containing the secY gene and a drug resistance gene fragment are bound upstream of the transcription initiation control region, and one of the original transcription initiation control regions is downstream. DNA fragments containing parts or all are bound. In this way, a DNA fragment containing the upstream region of the original transcription initiation control region of the operon containing the secY gene, a drug resistance gene fragment, the transcription initiation control region, a DNA containing a part or all of the original transcription initiation control region A DNA fragment linked in the order of the fragments is obtained. Next, after inserting such a DNA fragment into a host microorganism, a transformant can be isolated using a drug resistance gene as an index. On the genome of the transformant thus isolated, the original transcription initiation control region of the operon containing the secY gene and the transcription initiation control region should be stably maintained in a state adjacent to each other without any gap between them. It becomes. Alternatively, a DNA fragment containing a DNA fragment containing an upstream region of the secY gene and a drug resistance gene fragment upstream of the transcription initiation control region and a DNA fragment containing a part or all of the secY gene downstream is attached. When prepared and used, the transcription initiation control region is stably maintained in a state of being introduced immediately upstream of the secY gene.

本発明において、微生物において機能を有する転写開始制御領域若しくは転写開始制御領域とリボソーム結合部位が導入されるゲノム上における上流とは、secY遺伝子を含むオペロンの先頭の遺伝子であるrpsJ遺伝子の開始コドンの上流側、或いはsecY遺伝子の開始コドンの上流側であれば特に限定されないが、隣接する２０００塩基対以内の領域が好ましく、５００塩基対以内の領域がより好ましく、１００塩基対以内の領域が更に好ましく、５０塩基対以内の領域が特に好ましい。 In the present invention, the upstream in the genome ribosome binding site and a transcription initiation control region or transcription initiation control region having a function in a microorganism are introduced, the start codon of rpsJ gene is a gene of the head of the operon containing secY gene It is not particularly limited as long as it is upstream or upstream of the start codon of the secY gene, but an adjacent region within 2000 base pairs is preferable, a region within 500 base pairs is more preferable, and a region within 100 base pairs is more preferable. A region within 50 base pairs is particularly preferred.

本発明における当該転写開始制御領域、又は転写開始制御領域とリボソーム結合部位をsecY遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子の上流に連結した遺伝子断片の導入は、枯草菌その他の微生物のゲノムをテンプレートとして、PCR法等の公知のクローニング方法により得た当該転写開始制御領域、又は転写開始制御領域とリボソーム結合部位断片、secY遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子の断片をもとに、制限酵素法やSOE（splicing byoverlap extension）−PCR法（Gene,77,61,1989）など公知の方法により連結して得た遺伝子断片を用いて行うことができる。かかる断片は、公知の形質転換法によって細胞内に導入した核酸断片と染色体との間で相同組換えをさせることにより、染色体上に導入することができる。 The transcription initiation control region in the present invention, or the introduction of a gene fragment in which a transcription initiation control region and a ribosome binding site are linked upstream of a secY gene or a gene corresponding to the gene, using the genome of Bacillus subtilis or other microorganisms as a template, Based on the transcription initiation control region obtained by a known cloning method such as PCR, or the transcription initiation control region and a ribosome binding site fragment, secY gene or a fragment of the gene corresponding to the gene, a restriction enzyme method or SOE ( splicing by overlap extension) -PCR method (Gene, 77, 61, 1989) can be performed using a gene fragment obtained by ligation by a known method. Such a fragment can be introduced onto the chromosome by homologous recombination between the nucleic acid fragment introduced into the cell and a chromosome by a known transformation method.

導入するsecY遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子の塩基配列は、secY遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子の塩基配列である限り、その微生物が本来有するsecY遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子の塩基配列と一致しないものであってもよい。また導入する枯草菌のspoVG遺伝子の転写開始制御領域若しくは、転写開始制御領域とリボソーム結合部位等、微生物において機能する転写開始制御領域若しくは、転写開始制御領域とリボソーム結合部位の塩基配列は、当該塩基配列である限り、その微生物が本来有する塩基配列と一致しないものであってもよい。核酸断片の宿主への導入方法としては、コンピテントセル形質転換方法、プロトプラスト形質転換法、或いはエレクトロポレーション法等が挙げられ、特にコンピテントセル形質転換方法が好ましい。
またかかる断片は、プラスミド等のベクターによって細胞質中に導入することができる。尚、後記実施例に示す様に、かかる断片は1菌体当たり１コピーの導入で目的タンパク質又はポリペプチドの生産に対し充分な効果を発揮することから、プラスミドによって導入した場合、生産培養中に一部のプラスミドが脱落しても、その影響を受け難い。 As long as the nucleotide sequence of the secY gene to be introduced or the gene corresponding to the gene is the nucleotide sequence of the secY gene or the gene corresponding to the gene, the nucleotide sequence of the secY gene that the microorganism originally has or the gene corresponding to the gene It may not match. In addition, the transcription initiation control region of the spoVG gene of Bacillus subtilis to be introduced, the transcription initiation control region that functions in microorganisms, such as the transcription initiation control region and the ribosome binding site, or the nucleotide sequence of the transcription initiation control region and the ribosome binding site As long as it is a sequence, it may be one that does not match the base sequence originally possessed by the microorganism. Examples of the method for introducing a nucleic acid fragment into a host include a competent cell transformation method, a protoplast transformation method, an electroporation method, and the like, and a competent cell transformation method is particularly preferable.
Such a fragment can be introduced into the cytoplasm by a vector such as a plasmid. As shown in the Examples below, such a fragment exhibits a sufficient effect on the production of the target protein or polypeptide by introducing one copy per cell. Even if some plasmids are lost, they are not easily affected.

なお、宿主において導入を起こさせる染色体の領域としては、必須でない遺伝子の内部、若しくは必須でない遺伝子上流の非遺伝子領域の内部が好ましく、例えば、aprE遺伝子、sacB遺伝子、nprE遺伝子、amyE遺伝子、ybxG遺伝子の内部、若しくは当該遺伝子上流の非遺伝子領域の内部が挙げられるが、amyE遺伝子の内部、若しくはybxG遺伝子上流の非遺伝子領域の内部が好ましい。ここで必須でない遺伝子とは、破壊されたとしても、少なくともある条件においては、宿主は生存することができる遺伝子の意である。また、導入に際して、必須でない遺伝子、若しくは必須でない遺伝子上流の非遺伝子領域の一部又は全部の欠失を伴ってもなんら問題は生じない。 The chromosomal region to be introduced in the host is preferably a non-essential gene or a non-essential gene non-gene region upstream, for example, aprE gene, sacB gene, nprE gene, amyE gene, ybxG gene internal, or while the interior of the non-gene region of the gene upstream and the like, inside the amyE gene, or the interior of the non-gene region of ybxG gene upstream preferred. Here, a non-essential gene means a gene that allows a host to survive at least under certain conditions even if it is destroyed. In addition, no problem arises even when a part or all of a non-essential gene upstream or a non-gene region upstream of a non-essential gene is involved in introduction.

本発明においては、セルラーゼの生産性の向上に影響を与えない範囲で、上記枯草菌のsecY遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子を過剰発現することに加え、枯草菌のSec経路に関する他の遺伝子、例えばsecE遺伝子等の過剰発現を行ってもよいし、Sec経路以外の機能に関与する遺伝子の過剰発現、或いは１又は２以上の遺伝子の不活性化や欠失を併せて行っても良い。尚、遺伝子の不活性化や欠失には当該遺伝子中の全部又は一部の塩基の置換・欠失の他、当該遺伝子中への塩基の挿入が含まれる。 In the present invention, in addition to overexpressing the Bacillus subtilis secY gene or a gene corresponding to the gene in a range that does not affect the productivity of cellulase, other genes related to the Bacillus subtilis Sec pathway, For example, overexpression of the secE gene or the like may be performed, overexpression of genes involved in functions other than the Sec pathway, or inactivation or deletion of one or more genes may be performed together. In addition, inactivation and deletion of a gene include all or part of the base substitution / deletion in the gene, as well as insertion of the base into the gene.

以下、より具体的にSOE（splicing by overlap extension）−PCR法（Gene,77,61,1989）によって調製されるDNA断片を用いたspoVG遺伝子の転写開始制御領域、又は転写開始制御領域とリボソーム結合部位をsecY遺伝子の上流に連結した遺伝子断片の二重交差による宿主のゲノム上への導入方法について説明するが、本発明に於ける導入方法は下記に限定されるものではない。
本方法で用いる導入用DNA断片は、宿主のゲノム上の導入部位の上流に隣接する約0.1〜3、好ましくは0.4〜3kbの断片（以下、断片（１））と、下流に隣接する約0.1〜3、好ましくは0.4〜3kbの断片（以下、断片（２））の間に、当該spoVG遺伝子の転写開始制御領域、若しくは転写開始制御領域とリボソーム結合部位を含む断片（以下、断片（３））、secY遺伝子断片（以下、断片（４））、及びクロラムフェニコール耐性遺伝子等の薬剤耐性マーカー遺伝子断片（以下、断片（５））を順に挿入したDNA断片である。まず、1回目のPCRによって、断片（１）〜断片（５）の5断片を調製する。この際、例えば、断片（１）の下流末端に断片（３）の上流側10〜30塩基対配列、断片（４）の上流末端に断片（３）の下流側10〜30塩基対配列、断片（４）の下流末端に断片（５）の上流側10〜30塩基対配列、更に断片（２）の上流側に断片（５）の下流側10〜30塩基対配列が付加される様にデザインしたプライマーを用いる（図１）。
次いで、1回目に調製した5種類のPCR断片を鋳型とし、断片（１）の上流側プライマーと断片（２）の下流側プライマーを用いて２回目のPCRを行う。これにより、断片（１）の下流末端に付加された断片（３）の配列に於いて断片（３）とのアニールが生じ、同様に、断片（４）の上流末端に付加された断片（３）の配列に於いて断片（３）とのアニールが生じ、断片（４）の下流末端に付加された断片（５）の配列に於いて断片（５）とのアニールが生じ、断片（２）の上流側に付加された断片（５）の配列において断片（５）とのアニールが生じるので、PCR増幅の結果、断片（１）〜断片（５）の5断片が、（１）（３）（４）（５）（２）の順に結合したDNA断片を得ることが出来る（図１）。 More specifically, the transcription initiation control region of the spoVG gene using a DNA fragment prepared by SOE (splicing by overlap extension) -PCR method (Gene, 77, 61, 1989), or the transcription initiation control region and ribosome binding A method for introducing a gene fragment having a site linked upstream of the secY gene into a host genome by double crossing will be described. However, the method for introducing the present invention is not limited to the following.
The DNA fragment for introduction used in the present method is about 0.1 to 3, preferably 0.4 to 3 kb fragment (hereinafter referred to as fragment (1)) adjacent to the upstream of the introduction site on the genome of the host, and about 0.1 adjacent to the downstream. Between 3 to 3, preferably 0.4 to 3 kb fragment (hereinafter referred to as fragment (2)), a transcription initiation control region of the spoVG gene, or a fragment comprising a transcription initiation control region and a ribosome binding site (hereinafter referred to as fragment (3) ), SecY gene fragment (hereinafter referred to as fragment (4)), and drug resistance marker gene fragment (hereinafter referred to as fragment (5)) such as chloramphenicol resistance gene. First, five fragments of fragment (1) to fragment (5) are prepared by the first PCR. At this time, for example, the upstream 10-30 base pair sequence of fragment (3) at the downstream end of fragment (1), and the downstream 10-30 base pair sequence of fragment (3) at the upstream end of fragment (4) Designed to add the 10-30 base pair sequence upstream of fragment (5) at the downstream end of (4), and the 10-30 base pair sequence downstream of fragment (5) upstream of fragment (2). Were used (FIG. 1).
Next, the second PCR is carried out using the five types of PCR fragments prepared in the first round as templates and using the upstream primer of fragment (1) and the downstream primer of fragment (2). This causes annealing with the fragment (3) in the sequence of the fragment (3) added to the downstream end of the fragment (1), and similarly, the fragment (3) added to the upstream end of the fragment (4). ) In the sequence of the fragment (3), an anneal with the fragment (5) in the sequence of the fragment (5) added to the downstream end of the fragment (4), and the fragment (2). In the sequence of fragment (5) added upstream of fragment (5), annealing with fragment (5) occurs, and as a result of PCR amplification, five fragments from fragment (1) to fragment (5) are (1) (3) (4) DNA fragments bound in the order of (5) and (2) can be obtained (FIG. 1).

ここで行うPCR反応は、表１に示したプライマーセットを用い、Pyrobest DNAポリメーラーゼ（宝酒造）などの一般のPCR用酵素キット等を用いて、成書（PCR Protocols. Current Methods and Applications, Edited by B.A.White, Humana Press pp251 ,1993、Gene,77,61,1989）等に示される通常の条件に準じて行えばよい。
かくして得られた導入用DNA断片を、コンピテント法等によって細胞内に導入すると、同一性のあるゲノム上導入部位の上流及び下流の相同領域おいて、細胞内での遺伝子組換えが生じ、spoVG遺伝子の転写開始制御領域、又は転写開始制御領域とリボソーム結合部位をsecY遺伝子の上流に連結した遺伝子断片が導入された細胞を薬剤耐性マーカーによる選択によって分離することができる。薬剤耐性マーカーによる選択は、例えば、クロラムフェニコールを含む寒天培地上に生育するコロニーを分離したのち、ゲノムを鋳型としたPCR法などによってゲノム上への導入が確認されるものを選択することにより行えばよい。尚、上記薬剤耐性マーカー遺伝子は、一般的に用いられる抗生物質を用いた選択に利用可能なものであれば特に限定されないが、クロラムフェニコール耐性遺伝子の他には、エリスロマイシン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子、スペクチノマイシン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子及びブラストサイジンS耐性遺伝子等の薬剤耐性マーカー遺伝子が挙げられる。 The PCR reaction performed here uses the primer set shown in Table 1 and a general PCR enzyme kit such as Pyrobest DNA Polymerase (Takara Shuzo), etc. (PCR Protocols. Current Methods and Applications, Edited by BAWhite). , Humana Press pp251, 1993, Gene, 77, 61, 1989) and the like.
When the DNA fragment for introduction thus obtained is introduced into a cell by a competent method or the like, genetic recombination occurs in the cell in the homologous region upstream and downstream of the introduction site on the same genome, and spoVG Cells into which a gene transcription initiation control region or a gene fragment in which a transcription initiation control region and a ribosome binding site are linked upstream of the secY gene are introduced can be isolated by selection with a drug resistance marker. Selection with a drug resistance marker is, for example, selecting a colony that grows on an agar medium containing chloramphenicol and then confirming its introduction into the genome by PCR using the genome as a template. It may be performed by. The drug resistance marker gene is not particularly limited as long as it can be used for selection using commonly used antibiotics. In addition to the chloramphenicol resistance gene, the erythromycin resistance gene, neomycin resistance And drug resistance marker genes such as genes, spectinomycin resistance genes, tetracycline resistance genes and blasticidin S resistance genes.

本発明の微生物は、かくして作製された微生物に、目的とするセルラーゼをコードする遺伝子を導入することによって作製することができる。尚、ここで、セルラーゼをコードする遺伝子とは、その微生物が本来有する遺伝子を含むのみならず、その微生物が本来有しない遺伝子、すなわち外来の遺伝子を含む意である。   The microorganism of the present invention can be produced by introducing a gene encoding a target cellulase into the microorganism thus produced. Here, the gene encoding cellulase means not only a gene inherent in the microorganism but also a gene not inherent in the microorganism, that is, a foreign gene.

本発明におけるセルラーゼとしては、多糖加水分解酵素の分類（Biochem.J.,280,309,1991）中でファミリー５に属するセルラーゼが挙げられ、中でも微生物由来、特にBacillus属細菌由来のセルラーゼが挙げられる。例えば、バチルス エスピー（Bacillus sp.）KSM-S237株（FERM BP-7875）、やバチルス エスピー（Bacillus sp.）KSM-64株（FERM BP-2886）由来のアルカリセルラーゼが挙げられ、更に好適な例としては、配列番号４のアミノ酸番号１〜７９５のアミノ酸配列からなるBacillus属細菌由来のアルカリセルラーゼ、又は配列番号６のアミノ酸番号１〜７９３のアミノ酸配列からなるBacillus属細菌由来のアルカリセルラーゼ、或いは当該アミノ酸配列と70％、好ましくは80％、より好ましくは90％以上、さらに好ましくは95％以上、特に好ましくは98％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるセルラーゼが挙げられる。 Cellulases in the present invention include cellulases belonging to family 5 in the classification of polysaccharide hydrolases (Biochem. J., 280, 309, 1991). Among them, cellulases derived from microorganisms, particularly Bacillus bacteria are mentioned. Examples include alkaline cellulases derived from Bacillus sp. KSM-S237 strain (FERM BP-7875) and Bacillus sp. KSM-64 strain (FERM BP-2886), and more preferred examples. the, Bacillus bacteria-derived alkaline cellulase comprising the amino acid sequence of amino acid numbers 1 to 795 of SEQ ID NO: 4, or comprising the amino acid sequence of amino acid numbers 1 to 793 of SEQ ID NO: 6 Bacillus bacteria-derived alkaline cellulase, or the A cellulase comprising an amino acid sequence having 70%, preferably 80%, more preferably 90% or more, still more preferably 95% or more, and particularly preferably 98% or more identity with an amino acid sequence can be mentioned.

本発明の微生物に導入されるべきセルラーゼの遺伝子は、その上流に当該遺伝子の転写、翻訳、分泌に関わる制御領域、即ち、プロモーター及び転写開始点を含む転写開始制御領域、リボソーム結合部位及び開始コドンを含む翻訳開始制御領域及び分泌シグナルペプチド領域から選ばれる１以上の領域が適正な形で結合されていることが望ましい。特に、転写開始制御領域、翻訳開始制御領域及び分泌シグナル領域からなる３領域が結合されていることが好ましく、更に分泌シグナルペプチド領域がバチルス属細菌のセルラーゼ遺伝子由来のものであり、転写開始制御領域及び翻訳開始制御領域が当該セルラーゼ遺伝子の上流0.6〜1 kb領域であるものが、目的セルラーゼ遺伝子と適正に結合されていることが望ましい。例えば、特開2000-210081号公報や特開平4-190793号公報等に記載されているBacillus属細菌、すなわちKSM-S237株（FERM BP-7875）、KSM-64株（FERM BP-2886）由来のセルラーゼ遺伝子と当該セルラーゼ遺伝子の転写開始制御領域、翻訳開始制御領域及び分泌用シグナルペプチド領域がセルラーゼの構造遺伝子と適正に結合されていることが望ましい。より具体的には配列番号３で示される塩基配列の塩基番号1〜659の塩基配列、又は配列番号５で示される塩基配列の塩基番号1〜696の塩基配列、或いは当該塩基配列に対して70％以上、好ましくは80％以上、より好ましくは90％以上、さらに好ましくは95％以上、特に好ましくは98％以上の同一性を有する塩基配列からなるDNA断片、あるいは上記いずれかの塩基配列の一部が欠失、置換若しくは付加した塩基配列からなるDNA断片が、セルラーゼの構造遺伝子と適正に結合されていることが望ましい。尚、ここで、上記塩基配列の一部が欠失、置換若しくは付加した塩基配列からなるDNA断片とは、上記塩基配列の一部が欠失、置換若しくは付加しているが、遺伝子の転写、翻訳、分泌に関わる機能を保持しているDNA断片を意味する。 The cellulase gene to be introduced into the microorganism of the present invention is upstream of the control region involved in transcription, translation, and secretion of the gene, that is, a transcription initiation control region including a promoter and a transcription initiation site, a ribosome binding site and an initiation codon. It is desirable that at least one region selected from a translation initiation control region containing a secretory signal peptide region and a secretory signal peptide region be bound in an appropriate form. In particular, it is preferable that three regions consisting of a transcription initiation control region, a translation initiation control region, and a secretion signal region are combined, and the secretion signal peptide region is derived from a cellulase gene of a Bacillus bacterium, and the transcription initiation control region In addition, it is desirable that the translation initiation regulatory region that is 0.6-1 kb upstream of the cellulase gene is appropriately bound to the target cellulase gene. For example, the bacterium belonging to the genus Bacillus described in JP 2000-210081, JP 4-190793, etc., that is, KSM-S237 strain (FERM BP-7875), KSM-64 strain (FERM BP-2886) It is desirable that the cellulase gene and the transcription initiation control region, translation initiation control region, and secretory signal peptide region of the cellulase gene are appropriately linked to the cellulase structural gene. More specifically, the base sequence of base numbers 1 to 659 of the base sequence shown in SEQ ID NO: 3, the base sequence of base numbers 1 to 696 of the base sequence shown in SEQ ID NO: 5, or 70 relative to the base sequence % Or more, preferably 80% or more, more preferably 90% or more, still more preferably 95% or more, particularly preferably 98% or more. It is desirable that a DNA fragment consisting of a base sequence in which a portion is deleted, substituted, or added is appropriately bound to a cellulase structural gene. Here, a DNA fragment consisting of a base sequence in which a part of the base sequence is deleted, substituted or added is a part of the base sequence deleted, substituted or added, but the gene transcription, This means a DNA fragment that retains functions related to translation and secretion.

このような目的とするセルラーゼをコードする遺伝子の導入は、例えば、（１）ベクターによる導入、（２）ゲノムへの挿入により行うことができる。（１）ベクターによって導入する場合、その上流に「当該遺伝子の転写、翻訳、分泌に関わる制御領域、即ち、プロモーター及び転写開始点を含む転写開始制御領域、リボソーム結合部位及び開始コドンを含む翻訳開始制御領域及び分泌シグナルペプチド領域から選ばれる１以上の領域」が適正な形で結合されている目的タンパク質又は目的ポリペプチドをコードする遺伝子を含むベクターを、コンピテントセル形質転換方法、プロトプラスト形質転換法、或いはエレクトロポレーション法等の適当な形質転換法により導入すればよい。ここで、ベクターとしては、目的とする遺伝子を宿主に導入し、増殖、発現させるための適当な運搬体核酸分子であれば特に限定されず、プラスミドのみならず、例えば、YAC,BACなどの人工染色体、トランスポゾンを用いたベクター、コスミドが挙げられ、プラスミドとしては例えば、pUB110、pHY300PLKが挙げられる。   The introduction of the gene encoding the desired cellulase can be performed, for example, by (1) introduction by a vector and (2) insertion into the genome. (1) When introduced by a vector, upstream of it, “a transcription initiation, including a control region related to transcription, translation and secretion of the gene, ie, a transcription initiation control region including a promoter and a transcription initiation site, a ribosome binding site and an initiation codon” Competent cell transformation method, protoplast transformation method, vector containing gene encoding target protein or target polypeptide to which one or more regions selected from control region and secretory signal peptide region are appropriately linked Alternatively, it may be introduced by an appropriate transformation method such as electroporation. Here, the vector is not particularly limited as long as it is an appropriate carrier nucleic acid molecule for introducing a target gene into a host, allowing it to proliferate and express, and not only a plasmid but also an artificial such as YAC or BAC. Examples include vectors using chromosome and transposon, and cosmids. Examples of plasmids include pUB110 and pHY300PLK.

また、（２）ゲノムへの挿入は、例えば相同組換えによる方法を用いればよい。すなわち、セルラーゼをコードする遺伝子に導入を起こさせる染色体領域の一部を結合したDNA断片を、微生物細胞内に取り込ませ、当該染色体領域の一部領域における相同組換えを起こさせることによって、ゲノムに組み込ませることができる。ここで、導入を起こさせる染色体領域としては、特に制限されないが、必須でない遺伝子領域、若しくは必須でない遺伝子領域上流の非遺伝子領域が好ましい。   In addition, (2) for insertion into the genome, for example, a method by homologous recombination may be used. That is, a DNA fragment in which a part of a chromosomal region that causes introduction into a gene encoding cellulase is bound is incorporated into a microbial cell, and homologous recombination occurs in a partial region of the chromosomal region. Can be incorporated. Here, the chromosomal region causing the introduction is not particularly limited, but a non-essential gene region or a non-gene region upstream of the non-essential gene region is preferable.

かくして作製された微生物は、セルラーゼの生産に特に有用であり、目的セルラーゼの生産性が高いものである。   The microorganism thus produced is particularly useful for the production of cellulase and has a high productivity of the target cellulase.

本発明の組換え微生物を用いたセルラーゼの生産は、当該菌株を同化性の炭素源、窒素源、その他の必須成分を含む培地に接種し、通常の微生物培養法にて培養し、培養終了後、タンパク質又はポリペプチドを採取・精製することにより行えばよい。   Cellulase production using the recombinant microorganism of the present invention is carried out by inoculating the strain into a medium containing an assimilable carbon source, nitrogen source and other essential components, cultivating it by a normal microorganism culture method, The protein or polypeptide may be collected and purified.

以下の実施例におけるDNA断片増幅のためのポリメラーゼ連鎖反応（PCR）には、GeneAmp PCR System（アプライドバイオシステムズ）を使用し、Pyrobest DNA Polymerase（タカラバイオ）と付属の試薬類を用いてDNA増幅を行った。PCRの反応液組成は、適宜希釈した鋳型DNAを1μL、センス及びアンチセンスプライマーを各々20pmol及びPyrobest DNA Polymeraseを2.5U添加して、反応液総量を50μLとした。PCRの反応条件は、98℃で10秒間、55℃で30秒間及び72℃で1〜5分間（目的増幅産物に応じて調整。目安は1kbあたり1分間）の3段階の温度変化を30回繰り返した後、72℃で5分間反応させることにより行った。   For the polymerase chain reaction (PCR) for DNA fragment amplification in the following examples, GeneAmp PCR System (Applied Biosystems) is used, and DNA amplification is performed using Pyrobest DNA Polymerase (Takara Bio) and attached reagents. went. The PCR reaction solution composition was 1 μL of appropriately diluted template DNA, 20 pmol of sense and antisense primers and 2.5 U of Pyrobest DNA Polymerase, respectively, and the total amount of the reaction solution was 50 μL. PCR reaction conditions were 98 ° C for 10 seconds, 55 ° C for 30 seconds and 72 ° C for 1 to 5 minutes (adjusted according to the target amplification product, 1 minute per 1 kb). After repeating, the reaction was carried out at 72 ° C. for 5 minutes.

また、以下の実施例における各遺伝子及び遺伝子領域の名称は、Nature, 390, 249-256,(1997)で報告され、JAFAN: Japan Functional Analysis Network for Bacillus subtilis (BSORF DB)でインターネット公開（http://bacillus.genome.ad.jp/、2004年3月10日更新）された枯草菌ゲノムデータに基づいて記載している。   In addition, the names of genes and gene regions in the following examples are reported in Nature, 390, 249-256, (1997), and published on the Internet at JAFAN: Japan Functional Analysis Network for Bacillus subtilis (BSORF DB) (http: //bacillus.genome.ad.jp/, updated March 10, 2004), based on genome data of Bacillus subtilis.

枯草菌の形質転換は以下の様に行った。
すなわち、枯草菌株をSPI培地（0.20% 硫酸アンモニウム、1.40% リン酸水素二カリウム、0.60% リン酸二水素カリウム、0.10% クエン酸三ナトリウム二水和物、0.50% グルコース、0.02% カザミノ酸 (Difco)、5mM 硫酸マグネシウム、0.25μM 塩化マンガン、50μg/ml トリプトファン）において37℃で、生育度(OD600)の値が1程度になるまで振盪培養した。振盪培養後、培養液の一部を9倍量のSPII培地（0.20% 硫酸アンモニウム、1.40% リン酸水素二カリウム、0.60% リン酸二水素カリウム、0.10% クエン酸三ナトリウム二水和物、0.50% グルコース、0.01% カザミノ酸 (Difco)、5mM 硫酸マグネシウム、0.40μM 塩化マンガン、5μg/ml トリプトファン）に接種し、更に生育度(OD600)の値が0.4程度になるまで振盪培養することで、枯草菌株のコンピテントセルを調製した。次いで調製したコンピテントセル懸濁液（SPII培地における培養液）100μＬに各種ＤＮＡ断片を含む溶液（ＳＯＥ−ＰＣＲの反応液等）５μＬを添加し、37℃で１時間振盪培養後、適切な薬剤を含むＬＢ寒天培地（１％トリプトン、０．５％酵母エキス、１％ＮａＣｌ、１．５％寒天）に全量を塗沫した。37℃における静置培養の後、生育したコロニーを形質転換体として分離した。得られた形質転換体のゲノムを抽出し、これを鋳型とするＰＣＲによって目的とするゲノム構造の改変が為されたことを確認した。 Transformation of Bacillus subtilis was performed as follows.
That is, the Bacillus subtilis strain is SPI medium (0.20% ammonium sulfate, 1.40% dipotassium hydrogen phosphate, 0.60% potassium dihydrogen phosphate, 0.10% trisodium citrate dihydrate, 0.50% glucose, 0.02% casamino acid (Difco) , 5 mM magnesium sulfate, 0.25 μM manganese chloride, 50 μg / ml tryptophan) at 37 ° C. with shaking until the degree of growth (OD600) is about 1. After shaking culture, a portion of the culture broth was added to 9 times the amount of SPII medium (0.20% ammonium sulfate, 1.40% dipotassium hydrogen phosphate, 0.60% potassium dihydrogen phosphate, 0.10% trisodium citrate dihydrate, 0.50% Inoculate glucose, 0.01% casamino acid (Difco), 5 mM magnesium sulfate, 0.40 μM manganese chloride, 5 μg / ml tryptophan), and further shake culture until the growth degree (OD600) is about 0.4. A competent cell was prepared. Next, 5 μL of a solution containing various DNA fragments (SOE-PCR reaction solution, etc.) is added to 100 μL of the prepared competent cell suspension (culture medium in SPII medium), and after shaking culture at 37 ° C. for 1 hour, an appropriate drug is obtained. LB agar medium (1% tryptone, 0.5% yeast extract, 1% NaCl, 1.5% agar) containing the whole amount was smeared. After static culture at 37 ° C., the grown colonies were isolated as transformants. The genome of the obtained transformant was extracted, and it was confirmed that the intended genomic structure was altered by PCR using this as a template.

実施例１ secY遺伝子過剰発現株の構築
以下の様に、secY遺伝子を過剰発現する変異株の構築を行った（図２参照）。枯草菌168株から抽出したゲノムDNAを鋳型として、表１に示したPVG-FWとPVG-R、及びsecY/PVG-FとsecY/Cm-Rのプライマーセットを用いてspoVG遺伝子の転写開始制御領域とリボソーム結合部位を含む0.2kb断片（Ａ）、及びsecY遺伝子を含む1.3kb断片（Ｂ）をPCRにより増幅した。またプラスミドpC194（J. Bacteriol. 150 (2), 815 (1982)）を鋳型として、表１に示したcatfとcatrのプライマーセットを用いてクロラムフェニコール（Cm）耐性遺伝子を含む0.9kb断片（Ｃ）をPCRにより増幅した。次いで、得られた（Ａ）（Ｂ）（Ｃ）3断片を混合して鋳型とし、表１に示したPVG-FW2とcatr2のプライマーセットを用いたSOE-PCRを行うことによって、3断片を（Ａ）（Ｂ）（Ｃ）の順になる様に結合させ、spoVG遺伝子の転写開始制御領域とリボソーム結合部位がsecY遺伝子の上流に連結し（spoVG遺伝子の開始コドンの位置にsecY遺伝子の開始コドンが位置する様に連結）、更にその下流にCm耐性遺伝子が結合した2.2kbのDNA断片（Ｄ）を得た。続いて枯草菌168株から抽出したゲノムDNAを鋳型として、表１に示したamyEfw2とamyE/PVG2-R、及びamyE/Cm2-FとamyErv2のプライマーセットを用いてamyE遺伝子の5'側領域を含む1.0kb断片（Ｅ）、及びamyE遺伝子の3'側領域を含む1.0kb断片（Ｆ）をPCRにより増幅した。次いで、得られた（Ｅ）（Ｆ）（Ｄ）3断片を混合して鋳型とし、表１に示したamyEfw1とamyErv1のプライマーセットを用いたSOE-PCRを行うことによって、3断片を（Ｅ）（Ｄ）（Ｆ）の順になる様に結合させ、spoVG遺伝子の転写開始制御領域とリボソーム結合部位の下流にsecY遺伝子が連結し、更にその下流にクロラムフェニコール耐性遺伝子が結合した2.2kbのDNA断片がamyE遺伝子の中央に挿入された総塩基長4.2kbのDNA断片（Ｇ）を得た。得られた4.2kbのDNA断片（Ｇ）を用いてコンピテントセル法により枯草菌168株を形質転換し、クロラムフェニコール（10μg/mL）を含むLB寒天培地上に生育したコロニーを形質転換体として分離した。得られた形質転換体から抽出したゲノムDNAを鋳型として、表１に示すamyEfw2とsecY/Cm-R、及びsecY/PVG-FとamyErv2のプライマーセットを用いたPCRを行うことによって2.5kb及び3.1kbのDNA断片の増幅を確認し、枯草菌168株ゲノム上のamyE遺伝子部位にspoVG遺伝子の転写開始制御領域とリボソーム結合部位の下流にsecY遺伝子が連結したDNA断片が挿入されたことを確認した。この様にして得られた菌株をsecY-K株と命名した。 Example 1 Construction of a secY gene overexpression strain A mutant strain overexpressing the secY gene was constructed as follows (see FIG. 2). Using the genomic DNA extracted from Bacillus subtilis 168 as a template, transcription start control of the spoVG gene using the PVG-FW and PVG-R and secY / PVG-F and secY / Cm-R primer sets shown in Table 1 A 0.2 kb fragment (A) containing the region and the ribosome binding site and a 1.3 kb fragment (B) containing the secY gene were amplified by PCR. A 0.9 kb fragment containing the chloramphenicol (Cm) resistance gene using the plasmid pC194 (J. Bacteriol. 150 (2), 815 (1982)) as a template and the catf and catr primer sets shown in Table 1 (C) was amplified by PCR. Next, the 3 fragments obtained by mixing the obtained (A), (B), and (C) 3 fragments as a template and performing SOE-PCR using the PVG-FW2 and catr2 primer sets shown in Table 1 were obtained. (a) (B) bonded to as made in the order of (C), the start codon of secY gene at the position of initiation codon of the transcription initiation regulatory region and the ribosome binding site of spoVG gene is linked upstream of secY gene (spoVG gene And a 2.2-kb DNA fragment (D) with a Cm resistance gene bound downstream thereof was obtained. Subsequently, using the genomic DNA extracted from Bacillus subtilis 168 as a template, using the amyEfw2 and amyE / PVG2-R and amyE / Cm2-F and amyErv2 primer sets shown in Table 1, the 5 'region of the amyE gene was identified. The 1.0 kb fragment containing (E) and the 1.0 kb fragment containing the 3 ′ region of the amyE gene (F) were amplified by PCR. Next, the obtained (E) (F) (D) 3 fragments were mixed to form a template, and SOE-PCR using the amyEfw1 and amyErv1 primer sets shown in Table 1 was performed to obtain the 3 fragments (E ) (D) coupled to so as to become the order of (F), 2.2 kb which was ligated the secY gene downstream of the transcription initiation regulatory region and the ribosome binding site of spoVG gene, chloramphenicol resistance gene downstream thereof is bonded further A DNA fragment (G) having a total base length of 4.2 kb was obtained in which the DNA fragment was inserted in the center of the amyE gene. The resulting 4.2 kb DNA fragment (G) was used to transform Bacillus subtilis 168 by competent cell method, and colonies grown on LB agar medium containing chloramphenicol (10 μg / mL) were transformed. Separated as a body. By using the genomic DNA extracted from the obtained transformant as a template, PCR was performed using the primer sets of amyEfw2 and secY / Cm-R and secY / PVG-F and amyErv2 shown in Table 1. to confirm amplification of the kb of DNA fragments, DNA fragments secY gene are linked downstream of the transcription initiation regulatory region and the ribosome binding site of spoVG gene amyE gene site on the Bacillus subtilis 168 strain genome was confirmed to be inserted . The strain thus obtained was named secY-K strain.

実施例２ アルカリセルラーゼ分泌生産評価
実施例１にて得られたsecY-K株、及び対照として枯草菌168株の異種タンパク質生産性評価は、配列番号４で示されるアミノ酸配列からなるバチルス属細菌由来のアルカリセルラーゼの生産性を指標として以下の様に行った。すなわち、バチルス エスピー（Bacillus sp.）KSM-S237株（FERM BP-7875）由来のアルカリセルラーゼ遺伝子（特開2000-210081号公報）断片（3.1 kb）を表１に示した237UB1と237DB1のプライマーセットを用いて増幅した後BamHI制限酵素処理し、シャトルベクターpHY300PLKのBamHI制限酵素切断点に挿入した組換えプラスミドpHY-S237を、プロトプラスト形質転換法によって各菌株に導入した。これによって得られた組換え菌株を10 mLのＬＢ培地で一夜37℃で振盪培養を行い、更にこの培養液0.05 mLを50 mLの２×Ｌ−マルトース培地（2% トリプトン、1% 酵母エキス、1% NaCl、7.5% マルトース、7.5 ppm硫酸マンガン4-5水和物、15 ppmテトラサイクリン）に接種し、30℃にて３日間振盪培養を行った。遠心分離によって菌体を除いた培養液上清のアルカリセルラーゼ活性を測定し、培養によって菌体外に分泌生産されたアルカリセルラーゼの量を求めた。
セルラーゼ活性測定については、1/7.5M リン酸緩衝液(pH7.4 和光純薬)で適宜希釈したサンプル溶液50μLに0.4mM p-nitrophenyl-β-D-cellotrioside(生化学工業)を50μL加えて混和し、30℃にて反応を行った際に遊離するp-ニトロフェノール量を420nmにおける吸光度(OD420nm)変化により定量した。1分間に1μmolのp-ニトロフェノールを遊離させる酵素量を1Uとした。 Example 2 Evaluation of Alkaline Cellulase Secretion Production Evaluation of heterologous protein productivity of secY-K strain obtained in Example 1 and Bacillus subtilis 168 strain as a control was derived from a bacterium belonging to the genus Bacillus comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4. The production was carried out as follows using the productivity of alkaline cellulase as an index. That is, the primer set of 237UB1 and 237DB1 shown in Table 1 for the alkaline cellulase gene (Japanese Patent Laid-Open No. 2000-210081) fragment (3.1 kb) derived from Bacillus sp. KSM-S237 strain (FERM BP-7875) and Bam HI restriction enzyme treatment was amplified using the recombinant plasmid pHY-S237 was inserted into Bam HI restriction enzyme cleavage point of a shuttle vector pHY300PLK, it was introduced into each bacterial strain by the protoplast transformation method. The recombinant strain thus obtained was shake-cultured overnight at 37 ° C. in 10 mL of LB medium, and 0.05 mL of this culture was further added to 50 mL of 2 × L-maltose medium (2% tryptone, 1% yeast extract, 1% NaCl, 7.5% maltose, 7.5 ppm manganese sulfate 4-5 hydrate, 15 ppm tetracycline), followed by shaking culture at 30 ° C. for 3 days. The alkaline cellulase activity of the culture supernatant from which the cells were removed by centrifugation was measured, and the amount of alkaline cellulase secreted and produced outside the cells by the culture was determined.
For the measurement of cellulase activity, 50 μL of 0.4 mM p-nitrophenyl-β-D-cellotrioside (Seikagaku) was added to 50 μL of a sample solution appropriately diluted with 1 / 7.5 M phosphate buffer (pH 7.4 Wako Pure Chemical Industries). The amount of p-nitrophenol liberated when mixed and reacted at 30 ° C. was quantified by the change in absorbance at 420 nm (OD420 nm). The amount of enzyme that liberates 1 μmol of p-nitrophenol per minute was defined as 1 U.

アルカリセルラーゼ活性測定の結果、表２に示した様に、宿主としてsecY-K株を用いた場合、対照の168株（野生型）の場合と比較して高いアルカリセルラーゼの分泌生産が認められた。これはsecY-K株にてsecY遺伝子の発現が野生株より高まり、分泌装置であるSecYタンパク質量が増加したことにより、セルラーゼの分泌効率が向上した結果によるものと推測された。 As a result of the measurement of alkaline cellulase activity, as shown in Table 2, when secY-K strain was used as a host, higher secretory production of alkaline cellulase was observed compared to the control 168 strain (wild type). . It was speculated that this was because the secY-K strain had higher secY gene expression than the wild strain and increased the amount of SecY protein, which is a secretion apparatus, and thus improved the secretion efficiency of cellulase.

比較例１ 他のsec遺伝子過剰発現株の構築−１
secY遺伝子と共にsecE遺伝子を過剰発現する菌株の構築を以下の様に行った（図３参照）。すなわち、枯草菌168株から抽出したゲノムDNAを鋳型として、表１に示したsecE/Y-F2とsecE/Ne-R、secY/PVG-FとsecY/Cm-R、及びamyE/Nm-FとamyErv2のプライマーセットを用いて、secE遺伝子及びそのリボソーム結合部位を含む0.2kb断片（Ｈ）、secY遺伝子を含む1.3kb断片（Ｉ）、及びamyE遺伝子の3'側領域を含む1.0kb断片（Ｊ）をPCRにより増幅した。また表１に示したrneofとrepUr-Nmとのプライマーセット及び鋳型としてプラスミドpUB110（Plasmid 15, 93 (1986)）を用いて調製したrepU遺伝子プロモーター領域を含む0.4kb断片と、表１に示したNmUf-repとNmrとのプライマーセット及び鋳型としてプラスミドpUB110を用いて調製したネオマイシン耐性遺伝子の構造遺伝子領域を含む0.8kb断片とを混合して鋳型とし、表１に示したプライマーrneofとNmrのプライマーセットを用いたSOE-PCRを行うことによって1.2kbのネオマイシン耐性カセット断片（Ｋ）を調製した。次いで、得られた（Ｈ）（Ｉ）（Ｊ）（Ｋ）の4断片を混合して鋳型とし、表１に示したsecY-F2とamyErv1のプライマーセットを用いたSOE-PCRを行うことによって、4断片を（Ｉ）（Ｈ）（Ｋ）（Ｊ）の順になる様に結合させ、secY遺伝子の下流にリボソーム結合部位を伴うsecE遺伝子が連結し、更にその下流にネオマイシン耐性カセットとamyE遺伝子の3'側領域が連結した総塩基長3.7kbのDNA断片（Ｌ）を得た。得られた3.7kbのDNA断片（Ｌ）を用いてコンピテントセル法により実施例１にて構築したsecY-K株を形質転換し、ネオマイシン（10μg/mL）を含むLB寒天培地上に生育したコロニーを形質転換体として分離した。得られた形質転換体から抽出したゲノムDNAを鋳型として、表１に示すamyEfw2とsecE/Ne-R、及びsecE/Y-F2とamyErv2のプライマーセットを用いたPCRを行うことによって2.6kb及び2.4kbのDNA断片の増幅を確認し、枯草菌168株ゲノム上のamyE遺伝子部位にspoVG遺伝子の転写開始制御領域とリボソーム結合部位の下流にsecY遺伝子が連結し、更にその下流にsecE遺伝子が連結したDNA断片が挿入されたことを確認した。尚、secY遺伝子とsecE遺伝子との間に転写終結部位は存在せず、secE遺伝子はsecY遺伝子と同一転写単位として、spoVG遺伝子転写開始制御領域の機能により転写されるものと考えられた。この様にして得られた菌株をsecYE-K株と命名した。また実施例１の方法と同様の方法にて、枯草菌168株ゲノム上のamyE遺伝子部位にspoVG遺伝子の転写開始制御領域とリボソーム結合部位の下流にsecG遺伝子が連結したDNA断片が挿入されたsecG-K株を作成した。secG-K株の構築には表１に示すプライマーを使用し、それぞれのプライマーとsecY-K株の構築に用いたプライマーとの対応を表３に示した。 Comparative Example 1 Construction of Other sec Gene Overexpression Strains-1
A strain overexpressing the secE gene together with the secY gene was constructed as follows (see FIG. 3). That is, using the genomic DNA extracted from Bacillus subtilis 168 as a template, secE / Y-F2 and secE / Ne-R, secY / PVG-F and secY / Cm-R, and amyE / Nm-F shown in Table 1 And amyErv2 primer set, a 0.2 kb fragment containing the secE gene and its ribosome binding site (H), a 1.3 kb fragment containing the secY gene (I), and a 1.0 kb fragment containing the 3 'region of the amyE gene ( J) was amplified by PCR. In addition, a 0.4 kb fragment containing the repU gene promoter region prepared using the plasmid pUB110 (Plasmid 15, 93 (1986)) as a template and a primer set of rneof and repUr-Nm shown in Table 1, and shown in Table 1. A primer set of NmUf-rep and Nmr and a 0.8 kb fragment containing the structural gene region of the neomycin resistance gene prepared using plasmid pUB110 as a template were used as templates, and the primers rneof and Nmr shown in Table 1 were used as templates. A 1.2 kb neomycin resistance cassette fragment (K) was prepared by performing SOE-PCR using the set. Next, the obtained 4 fragments of (H), (I), (J), and (K) were mixed to form a template, and SOE-PCR was performed using the secY-F2 and amyErv1 primer sets shown in Table 1. the 4 fragment (I) (H) (K ) coupled to so as to become the order of (J), connected is secE gene with a ribosome binding site downstream of secY gene, further neomycin resistance cassette and amyE genes downstream thereof A DNA fragment (L) having a total base length of 3.7 kb to which the 3′-side regions of the DNA fragments were linked. Using the obtained 3.7 kb DNA fragment (L), the secY-K strain constructed in Example 1 was transformed by a competent cell method and grown on an LB agar medium containing neomycin (10 μg / mL). Colonies were isolated as transformants. Using the genomic DNA extracted from the obtained transformant as a template, PCR was performed using the primer sets of amyEfw2 and secE / Ne-R and secE / Y-F2 and amyErv2 shown in Table 1 to obtain 2.6 kb and 2.4 kb. to confirm amplification of the kb of DNA fragment, secY gene ligated downstream of the transcription initiation regulatory region and the ribosome binding site of spoVG gene amyE gene site on the Bacillus subtilis 168 strain genome, secE genes are linked further downstream thereof It was confirmed that the DNA fragment was inserted. In addition, transcription termination site between the secY gene and secE gene absent, secE genes as the same transcription unit and secY gene, were believed to be transcribed by the function of the spoVG gene transcription initiation regulatory region. The strain thus obtained was named secYE-K strain. In addition, in the same manner as in Example 1, secG was obtained by inserting a transcription initiation control region of the spoVG gene into the amyE gene site on the Bacillus subtilis 168 genome and a DNA fragment linked to the secG gene downstream of the ribosome binding site. -Created K shares. The primers shown in Table 1 were used for the construction of the secG-K strain, and the correspondence between each primer and the primers used for the construction of the secY-K strain is shown in Table 3.

比較例２ アルカリセルラーゼ分泌生産評価
比較例１にて構築した菌株のアルカリセルラーゼ分泌生産性評価を、実施例２と同様に行った。対照として枯草菌168株及び実施例１にて構築したsecY-K株についても評価を行った。 Comparative Example 2 Evaluation of Alkaline Cellulase Secretion Production Evaluation of the alkaline cellulase secretion productivity of the strain constructed in Comparative Example 1 was performed in the same manner as in Example 2. As control, Bacillus subtilis 168 strain and secY-K strain constructed in Example 1 were also evaluated.

その結果、表４に示した様に、secG遺伝子を過剰発現するsecG-K株のセルラーゼ生産性は野生株168株よりは若干高いものの、secY-K株の生産性には及ばなかった。またsecY遺伝子と同時にsecE遺伝子を過剰発現するsecYE-K株のセルラーゼ生産性はsecY-K株と同等であり、secE遺伝子を過剰発現することの効果は認められなかった。すなわち、分泌タンパク質の輸送チャネルの主要部分を構成するSecY、SecE、SecGの3つのタンパク質のうち、特にSecYタンパク質を増加させることが、セルラーゼの分泌効率の向上には有効であることが明らかとなった。 As a result, as shown in Table 4, the cellulase productivity of the secG-K strain overexpressing the secG gene was slightly higher than that of the wild strain 168, but did not reach the productivity of the secY-K strain. The cellulase productivity of secYE-K strain overexpressing secE genes simultaneously and secY gene is equivalent to secY-K strain, the effect of overexpressing secE gene was observed. In other words, among the SecY, SecE, and SecG proteins that constitute the major part of the secretory protein transport channel, increasing the SecY protein in particular is effective for improving the secretion efficiency of cellulase. It was.

比較例３ アルカリアミラーゼ分泌生産評価
実施例１にて構築したsecY-K株、及び比較例１にて構築したsecG-K菌株のアルカリアミラーゼ分泌生産性評価を以下の様に行った。すなわち、バチルス エスピー（Bacillus sp.）KSM-K38株(FERM BP-6946)より抽出したゲノムDNAを鋳型として、K38matu-F2(ALAA)とSP64K38-R(XbaI)のプライマーセットを用いてPCRを行い、アルカリアミラーゼ（Appl. Environ. Microbiol., 67, 1744, (2001)）をコードする1.5kbのDNA断片を増幅した。またバチルス エスピー（Bacillus sp.）KSM-S237株（FERM BP-7875）より抽出したゲノムDNAを鋳型として、S237ppp-F2(BamHI)とS237ppp-R2(ALAA)のプライマーセットを用いてPCRを行い、アルカリセルラーゼ遺伝子（特開2000-210081号公報）のプロモーター領域と分泌シグナル配列をコードする領域を含む0.6kbのDNA断片を増幅した。次いで、得られた2断片を混合して鋳型とし、S237ppp-F2(BamHI)とSP64K38-R(XbaI)のプライマーセットを用いたSOE-PCRを行うことによって、アルカリセルラーゼ遺伝子のプロモーター領域と分泌シグナル配列をコードする領域の下流にアルカリアミラーゼ遺伝子が連結した2.1kbのDNA断片を得た。得られた2.1kbのDNA断片をシャトルベクターpHY300PLK（ヤクルト）のBamHI-XbaI制限酵素切断点に挿入し、アルカリアミラーゼ生産性評価用プラスミドpHYK38(S237ps)を構築した。
構築したプラスミドpHYK38(S237ps)をプロトプラスト形質転換法によって各菌株に導入した。対照として枯草菌168株についてもプラスミドを導入した。これによって得られた組換え菌株を、上記実施例２と同様の条件にて５日間、振盪培養を行った。培養後、遠心分離によって菌体を除いた培養液上清のアルカリアミラーゼ活性を測定し、培養によって菌体外に分泌生産されたアミラーゼの量を求めた。培養上清中のアミラーゼの活性測定にはリキテックAmy EPS(ロシュ・ダイアグノスティック社)を使用した。すなわち1% NaCl-1/7.5M リン酸緩衝液 (pH7.4 和光純薬工業)で適宜希釈したサンプル溶液50μLに、100μLのR1・R2混合液(R1(カップリング酵素)：R2(アミラーゼ基質)=5：1(Vol.))を加えて混和し、30℃にて反応を行った際に遊離するp-ニトロフェノール量を405nmにおける吸光度(OD405nm)変化により定量した。1分間に1μmolのp-ニトロフェノールを遊離させる酵素量を1Uとした。 Comparative Example 3 Evaluation of Alkaline Amylase Secretion Production Evaluation of alkaline amylase secretion productivity of the secY-K strain constructed in Example 1 and the secG-K strain constructed in Comparative Example 1 was performed as follows. Specifically, PCR was performed using a genomic DNA extracted from Bacillus sp. KSM-K38 strain (FERM BP-6946) as a template and a primer set of K38matu-F2 (ALAA) and SP64K38-R (XbaI). A 1.5 kb DNA fragment encoding alkaline amylase (Appl. Environ. Microbiol., 67, 1744, (2001)) was amplified. Also, using genomic DNA extracted from Bacillus sp. KSM-S237 strain (FERM BP-7875) as a template, PCR was performed using a primer set of S237ppp-F2 (BamHI) and S237ppp-R2 (ALAA), A 0.6 kb DNA fragment containing the promoter region of the alkaline cellulase gene (Japanese Patent Laid-Open No. 2000-210081) and the region encoding the secretory signal sequence was amplified. Next, the two fragments obtained were mixed and used as a template. By performing SOE-PCR using the S237ppp-F2 (BamHI) and SP64K38-R (XbaI) primer sets, the promoter region and secretion signal of the alkaline cellulase gene were used. A 2.1 kb DNA fragment was obtained in which an alkaline amylase gene was ligated downstream of the region encoding the sequence. The obtained 2.1 kb DNA fragment was inserted into the BamHI-XbaI restriction enzyme cleavage point of shuttle vector pHY300PLK (Yakult) to construct alkaline amylase productivity evaluation plasmid pHYK38 (S237ps).
The constructed plasmid pHYK38 (S237ps) was introduced into each strain by protoplast transformation method. As a control, plasmids were also introduced for Bacillus subtilis 168 strain. The recombinant strain thus obtained was subjected to shaking culture for 5 days under the same conditions as in Example 2 above. After culturing, the alkaline amylase activity of the culture supernatant after removing the cells by centrifugation was measured, and the amount of amylase secreted and produced outside the cells by the culture was determined. Liquitech Amy EPS (Roche Diagnostics) was used to measure the amylase activity in the culture supernatant. In other words, 50 μL of a sample solution appropriately diluted with 1% NaCl-1 / 7.5 M phosphate buffer (pH 7.4 Wako Pure Chemical Industries) was added to 100 μL of R1 and R2 mixture (R1 (coupling enzyme): R2 (amylase substrate) ) = 5: 1 (Vol.)) Was added and mixed, and the amount of p-nitrophenol released when the reaction was performed at 30 ° C. was quantified by the change in absorbance (OD405 nm) at 405 nm. The amount of enzyme that liberates 1 μmol of p-nitrophenol per minute was defined as 1 U.

その結果表５に示した様に、secG遺伝子を過剰発現したsecG-K株のアミラーゼ生産性は野生株168株より若干低い程度であったが、secY-K株のアミラーゼ生産性は野生株と比較して著しく低下していた。即ち、SecYタンパク質の増加はアミラーゼ生産性に対してはむしろ悪影響を及ぼすことが明らかとなり、secY遺伝子の過剰発現は、セルラーゼに対して特にその生産性向上に寄与することが示唆された。
本発明に関連のある遺伝子について、遺伝子番号、及び機能を表６に示した。 As a result, as shown in Table 5, the amylase productivity of the secG-K strain overexpressing the secG gene was slightly lower than that of the wild strain 168, but the amylase productivity of the secY-K strain was the same as that of the wild strain. In comparison, it was significantly reduced. That is, it has been clarified that an increase in SecY protein has an adverse effect on amylase productivity, suggesting that overexpression of secY gene contributes to cellulase, particularly in improving its productivity.
Table 6 shows gene numbers and functions of genes related to the present invention.

なお、これら各遺伝子の名称、番号及び機能等は、Kunstらによって報告され（Nature,390,249-256,1997）、JAFAN: Japan Functional Analysis Network for Bacillus subtilis (BSORF DB)でインターネット公開（http://bacillus.genome.ad.jp/、2004年3月10日更新）された枯草菌ゲノムデータに基づいて記載している。   The names, numbers, functions, etc. of these genes were reported by Kunst et al. (Nature, 390, 249-256, 1997) and published online on the JAFAN: Japan Functional Analysis Network for Bacillus subtilis (BSORF DB) (http: // Bacillus.genome.ad.jp/, updated March 10, 2004), based on genome data of Bacillus subtilis.

比較例４ 他のsec遺伝子発現強化株の構築−２
secY遺伝子と共にsecG遺伝子の発現を強化した菌株の構築を比較例１と同様に行った。すなわち、secYE-K株の構築に用いたプライマーのうち、secE/Y-F2を表７に示すsecG/Y-F2に、またsecE/Ne-Rを表７に示すsecG/Ne-Rに替えて用いることにより、secYG-K株を構築した。
また、実施例１の方法と同様の方法にて、枯草菌168株ゲノム上のamyE遺伝子部位にspoVG遺伝子の転写開始制御領域とリボソーム結合部位の下流にsecE遺伝子が連結したDNA断片が挿入されたsecE-K株を作成した。secE-K株の構築にはsecY-K株の構築に用いたプライマーのうち、secY/PVG-Fを表７に示すsecE/PVG-Fに、またsecY/Cm-Rを表７に示すsecE/Cm-Rに替えて用いた。
構築した上記菌株のアルカリセルラーゼ分泌生産性評価を、実施例２と同様に行った。対照として枯草菌168株及び実施例１にて構築したsecY-K株についても評価を行った。 Comparative Example 4 Construction of another sec gene expression-enhanced strain-2
Construction of strains with enhanced expression of the secG gene with secY gene was performed in the same manner as in Comparative Example 1. That is, among the primers used to construct the secYE-K strain, secE / Y-F2 is changed to secG / Y-F2 shown in Table 7, and secE / Ne-R is changed to secG / Ne-R shown in Table 7. SecYG-K strain was constructed.
Further, in the same manner as in Example 1, DNA fragment secE gene are linked downstream of the transcription initiation regulatory region and the ribosome binding site of spoVG gene amyE gene site on the Bacillus subtilis 168 strain genome is inserted A secE-K strain was created. For construction of secE-K strain, among the primers used for construction of secY-K strain, secY / PVG-F is secE / PVG-F shown in Table 7 and secY / Cm-R is secE shown in Table 7. Used in place of / Cm-R.
The alkaline cellulase secretion productivity evaluation of the constructed strain was performed in the same manner as in Example 2. As control, Bacillus subtilis 168 strain and secY-K strain constructed in Example 1 were also evaluated.

その結果、表８に示した様に、secY遺伝子と同時にsecG遺伝子の発現を強化したsecYG-K株のセルラーゼ生産性はsecY-K株と同等であり、secG遺伝子を発現強化することの効果は認められなかった。また表９に示した様に、secE遺伝子の発現を強化したsecE-K株のセルラーゼ生産性は野生株168株よりは若干高いものの、secY-K株の生産性には及ばなかった。すなわち、分泌タンパク質の輸送チャネルの主要部分を構成するSecY、SecE、SecGの3つのタンパク質のうち、特にSecYタンパク質を増加させることが、セルラーゼの分泌効率の向上には有効であることが明らかとなった。 As a result, as shown in Table 8, cellulase productivity of secYG-K strain with enhanced expression of simultaneously secG gene secY gene is equivalent to secY-K strain, the effect of enhancing expression of the secG gene I was not able to admit. As shown in Table 9, the cellulase productivity of the secE-K strain with enhanced secE gene expression was slightly higher than that of the wild strain 168, but did not reach the productivity of the secY-K strain. In other words, among the SecY, SecE, and SecG proteins that constitute the major part of the secretory protein transport channel, increasing the SecY protein in particular is effective for improving the secretion efficiency of cellulase. It was.

比較例５ アルカリプロテアーゼ分泌生産評価
実施例１にて構築したsecY-K株のアルカリプロテアーゼ生産性評価を以下の様に行った。対照として枯草菌168株についても評価を行った。即ち、バチルス クラウジ（Bacillus clausii）KSM-K16株（FERM BP-3376）より抽出したゲノムDNAを鋳型として、表１０に示されるS237pKAPpp-FとKAPter-R(BglII)のプライマーセットを用いてPCRを行い、配列番号４２で示されるアミノ酸配列を有するアルカリプロテアーゼ（Appl. Microbiol. Biotechnol., 43, 473, (1995)）をコードする1.3kbのDNA断片を増幅した。またバチルス エスピー（Bacillus sp.）KSM-S237株（FERM BP-7875）より抽出したゲノムDNAを鋳型として、表１０に示されるS237ppp-F2(BamHI)とS237pKAPpp-Rのプライマーセットを用いてPCRを行い、アルカリセルラーゼ遺伝子（特開2000-210081号公報）のプロモーター領域を含む0.6kbのDNA断片を増幅した。次いで、得られた2断片を混合して鋳型とし、表１０に示されるS237ppp-F2(BamHI)とKAPter-R(BglII)のプライマーセットを用いたSOE-PCRを行うことによって、アルカリセルラーゼ遺伝子のプロモーター領域の下流にアルカリプロテアーゼ遺伝子が連結した1.8 kbのDNA断片を得た。得られた1.8 kbのDNA断片をシャトルベクターpHY300PLK（ヤクルト）のBamHI-BglII制限酵素切断点に挿入し、アルカリプロテアーゼ生産性評価用プラスミドpHYKAP(S237p)を構築した。 Comparative Example 5 Evaluation of Alkaline Protease Secretion Production Evaluation of alkaline protease productivity of secY-K strain constructed in Example 1 was performed as follows. As a control, 168 strains of Bacillus subtilis were also evaluated. That is, using genomic DNA extracted from Bacillus clausii strain KSM-K16 (FERM BP-3376) as a template, PCR was performed using the S237pKAPpp-F and KAPter-R (BglII) primer sets shown in Table 10. Then, a 1.3 kb DNA fragment encoding an alkaline protease having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 42 (Appl. Microbiol. Biotechnol., 43, 473, (1995)) was amplified. Using genomic DNA extracted from Bacillus sp. KSM-S237 strain (FERM BP-7875) as a template, PCR was performed using the S237ppp-F2 (BamHI) and S237pKAPpp-R primer sets shown in Table 10. Then, a 0.6 kb DNA fragment containing the promoter region of the alkaline cellulase gene (Japanese Patent Laid-Open No. 2000-210081) was amplified. Next, the obtained two fragments were mixed to form a template, and SOE-PCR using the S237ppp-F2 (BamHI) and KAPter-R (BglII) primer sets shown in Table 10 was performed, thereby allowing the alkaline cellulase gene to A 1.8 kb DNA fragment with an alkaline protease gene linked downstream of the promoter region was obtained. The obtained 1.8 kb DNA fragment was inserted into the BamHI-BglII restriction enzyme cleavage point of shuttle vector pHY300PLK (Yakult) to construct a plasmid pHYKAP (S237p) for evaluating alkaline protease productivity.

構築したプラスミドpHYKAP(S237p)をプロトプラスト形質転換法によって各菌株に導入した。これによって得られた組換え菌株を10 mLのＬＢ培地で一夜37℃で振盪培養を行い、更にこの培養液0.05 mLを50 mLの２×Ｌ−マルトース培地（2% トリプトン、1% 酵母エキス、1% NaCl、7.5% マルトース、7.5 ppm硫酸マンガン4-5水和物、15 ppmテトラサイクリン）に接種し、30℃にて３日間振盪培養を行った。培養後、遠心分離によって菌体を除いた培養液上清のアルカリプロテアーゼ活性を測定し、培養によって菌体外に分泌生産されたアルカリプロテアーゼの量を求めた。培養上清中のプロテアーゼの活性測定は以下のとおり行った。すなわち、2mM 塩化カルシウム溶液で適宜希釈した培養上清50μlに、7.5mMのSuccinyl-L-Alanyl-L-Alanyl-L-Alanine p-Nitroanilide (STANA；ペプチド研究所)を基質として含む75mM ほう酸-KCl緩衝液（pH10.5）を100μL加えて混和し、30℃にて反応を行った際に遊離するp-ニトロアニリン量を420nmにおける吸光度(OD420nm)変化により定量した。1分間に1μmolのp-ニトロアニリンを遊離させる酵素量を1Uとした。   The constructed plasmid pHYKAP (S237p) was introduced into each strain by protoplast transformation method. The recombinant strain thus obtained was shake-cultured overnight at 37 ° C. in 10 mL of LB medium, and 0.05 mL of this culture was further added to 50 mL of 2 × L-maltose medium (2% tryptone, 1% yeast extract, 1% NaCl, 7.5% maltose, 7.5 ppm manganese sulfate 4-5 hydrate, 15 ppm tetracycline), followed by shaking culture at 30 ° C. for 3 days. After the culture, the alkaline protease activity of the culture supernatant after removing the cells by centrifugation was measured, and the amount of the alkaline protease secreted and produced outside the cells by the culture was determined. The activity of protease in the culture supernatant was measured as follows. That is, 75 mM boric acid-KCl containing 7.5 mM Succinyl-L-Alanyl-L-Alanyl-L-Alanine p-Nitroanilide (STANA; Peptide Institute) as a substrate in 50 μl of culture supernatant diluted appropriately with 2 mM calcium chloride solution 100 μL of a buffer solution (pH 10.5) was added and mixed, and the amount of p-nitroaniline released when the reaction was performed at 30 ° C. was quantified by the change in absorbance at 420 nm (OD420 nm). The amount of enzyme that liberates 1 μmol of p-nitroaniline per minute was defined as 1 U.

その結果、表１１に示すように、宿主としてsecY-K株を用いた場合、そのアルカリプロテアーゼ生産性は対照の168株（野生型）と同等であり、特に生産性向上は認められなかった。即ち、SecYタンパク質の増加はプロテアーゼ生産性に対して影響を与えず、比較例３の結果と合わせ、secY遺伝子の過剰発現は、セルラーゼ生産性向上に対して特異的に寄与するものであることが示唆された。 As a result, as shown in Table 11, when the secY-K strain was used as a host, the alkaline protease productivity was equivalent to the control 168 strain (wild type), and no improvement in productivity was observed. That is, the increase in SecY protein does not affect protease productivity, and combined with the results of Comparative Example 3, the overexpression of secY gene contributes specifically to cellulase productivity improvement. It was suggested.

SOE-PCR法により調製した結合核酸断片を用いた遺伝子導入を模式的に示したものである。1 schematically shows gene transfer using a bound nucleic acid fragment prepared by SOE-PCR. spoVG遺伝子の転写開始制御領域とリボソーム結合領域を連結したsecY遺伝子導入用のDNA断片のSOE−PCRによる調製、及び当該DNA断片を用いて遺伝子を染色体中に導入する方法の一例を模式的に示した図である。 Schematic illustration of an example of SOE-PCR preparation of a DNA fragment for introduction of the secY gene that links the transcription initiation control region of the spoVG gene and the ribosome binding region, and a method for introducing the gene into the chromosome using the DNA fragment. It is a figure. amyE遺伝子部位に導入したsecY遺伝子と共にsecE遺伝子が転写される様、secY遺伝子の下流にsecE遺伝子が連結した遺伝子導入用のDNA断片のSOE−PCRによる調製、及び当該DNA断片を用いて遺伝子を染色体中に導入する方法の一例を模式的に示した図である。 As secE gene with secY gene introduced into amyE gene site is transferred, the chromosomal gene by using preparation by SOE-PCR of DNA fragments for gene transfer secE gene downstream of secY gene was ligated, and the DNA fragment It is the figure which showed typically an example of the method introduce | transduced in.

Claims (10)

枯草菌のsecY遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子を過剰発現するように遺伝子構築された微生物に、セルラーゼをコードする遺伝子を導入した組換え微生物。 A recombinant microorganism in which a gene encoding cellulase is introduced into a microorganism constructed so as to overexpress the Bacillus subtilis secY gene or a gene corresponding to the gene. 微生物において機能を有する転写開始制御領域若しくは転写開始制御領域とリボソーム結合部位を、枯草菌のsecY遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子のゲノム上における上流、又は枯草菌のsecY遺伝子又は当該遺伝子を含むゲノム上のオペロンの先頭遺伝子の上流に導入してなるか、或いは微生物において機能を有する転写開始制御領域若しくは転写開始制御領域とリボソーム結合部位を枯草菌のsecY遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子の上流に連結した遺伝子断片を導入することにより、secY遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子を過剰発現させる請求項１記載の組換え微生物。 Genome comprising a transcriptional initiation regulatory region or transcription initiation control region and the ribosome binding site having a function in a microorganism, upstream on the genome of a gene corresponding to the secY gene or the gene of Bacillus subtilis, or secY gene or the gene of Bacillus subtilis It is introduced upstream of the top gene of the above operon, or the transcription initiation control region or transcription initiation control region having a function in a microorganism and the ribosome binding site are upstream of the Bacillus subtilis secY gene or a gene corresponding to the gene. The recombinant microorganism according to claim 1, wherein the secY gene or a gene corresponding to the gene is overexpressed by introducing a linked gene fragment. 微生物において機能を有する転写開始制御領域若しくは転写開始制御領域とリボソーム結合部位が、枯草菌のspoVG遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子の転写開始制御領域若しくは転写開始制御領域とリボソーム結合部位である請求項２記載の組換え微生物。 The transcription initiation control region or transcription initiation control region having a function in a microorganism or the ribosome binding site is a spoVG gene of Bacillus subtilis or a transcription initiation control region of the gene corresponding to the gene or a transcription initiation control region and a ribosome binding site. 2. The recombinant microorganism according to 2. 微生物がバチルス属（Bacillus）細菌である請求項１〜３のいずれか１項記載の組換え微生物。 Microorganism is Bacillus (Bacillus) any one recombinant microorganism according to claim 1 is a bacterium. バチルス（Bacillus）属細菌が枯草菌（Bacillus subtilis）である請求項４記載の組換え微生物。 The recombinant microorganism according to claim 4, wherein the bacterium belonging to the genus Bacillus is Bacillus subtilis . セルラーゼをコードする遺伝子の上流に転写開始制御領域、翻訳開始制御領域及び分泌用シグナル領域から選ばれる１以上の領域を結合した請求項１〜５のいずれか１項記載の組換え微生物。   The recombinant microorganism according to any one of claims 1 to 5, wherein at least one region selected from a transcription initiation control region, a translation initiation control region, and a signal region for secretion is linked upstream of a gene encoding cellulase. 転写開始制御領域、翻訳開始制御領域及び分泌シグナル領域からなる３領域を結合した請求項６記載の組換え微生物。   The recombinant microorganism according to claim 6, wherein three regions comprising a transcription initiation control region, a translation initiation control region, and a secretion signal region are combined. 分泌シグナル領域がバチルス（Bacillus）属細菌のセルラーゼ遺伝子由来のものであり、転写開始制御領域及び翻訳開始制御領域が当該セルラーゼ遺伝子の上流０．６〜１ｋｂ領域由来のものである請求項６又は７記載の組換え微生物。 The secretory signal region is derived from a cellulase gene of a bacterium belonging to the genus Bacillus , and the transcription initiation control region and the translation initiation control region are derived from a 0.6-1 kb region upstream of the cellulase gene. The recombinant microorganism described. 転写開始制御領域、翻訳開始制御領域及び分泌シグナル領域からなる３領域が、配列番号３で示される塩基配列からなるセルラーゼ遺伝子の塩基番号１〜６５９の塩基配列、配列番号５で示される塩基配列からなるセルラーゼ遺伝子の塩基番号１〜６９６の塩基配列又は当該塩基配列のいずれかと７０%以上の同一性を有する塩基配列からなるDNA断片、又は当該塩基配列の一部が欠失した塩基配列からなるDNA断片である請求項６〜８のいずれか１項記載の組換え微生物。   Three regions comprising a transcription initiation control region, a translation initiation control region, and a secretion signal region are derived from the base sequence of base numbers 1 to 659 of the cellulase gene comprising the base sequence represented by SEQ ID NO: 3 and the base sequence represented by SEQ ID NO: 5. A DNA fragment comprising a base sequence of base numbers 1 to 696 of the cellulase gene or a base sequence having 70% or more identity with any of the base sequences, or a DNA comprising a base sequence from which a part of the base sequence has been deleted The recombinant microorganism according to any one of claims 6 to 8, which is a fragment. 請求項１〜９のいずれか１項記載の組換え微生物を用いるセルラーゼの製造方法。   A method for producing cellulase using the recombinant microorganism according to any one of claims 1 to 9.
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