JP2008094827A - 受精調節のためのHipキナーゼ - Google Patents
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Abstract
【課題】男性不妊症に密接に関連するヒト精巣における酵素代謝の障害、及び特に男性不妊症が診断及び処理され、そして受精調節のために使用され得る新規手段の提供。
【解決手段】***形成/***完成の工程において重要な役割を演じる酵素Hipキナーゼ4(HipK4)に対応する少なくとも1つのHipK4核酸、HipK4ポリペプチド、HipK4のモジュレーター、HipK4に対して向けられた抗体、HipK4アンチセンス、及びHipK4 RNAiを活性成分として含む医薬組成物を、受精障害の診断及び処理、避妊、及び受精障害の処理のための使用。
【選択図】なし
【解決手段】***形成/***完成の工程において重要な役割を演じる酵素Hipキナーゼ4(HipK4)に対応する少なくとも1つのHipK4核酸、HipK4ポリペプチド、HipK4のモジュレーター、HipK4に対して向けられた抗体、HipK4アンチセンス、及びHipK4 RNAiを活性成分として含む医薬組成物を、受精障害の診断及び処理、避妊、及び受精障害の処理のための使用。
【選択図】なし
Description
本発明は、男性不妊症に密接に関連する酵素Hipキナーゼ4に関する。従って、それは、男性不妊症の診断及び処理のために、及び避妊薬を製造するための手段として適切である。
現在、ドイツにおけるすべての夫婦の約15%が故意ではないが、子供を有さず、そしてその割合はますます上昇している。不妊症についての理由は、男性及び女性から同等に由来する。女性における理由は実質的に研究されており、そして診断され得るが、男性においては、わずか約30%の患者において生まれつきの原因をたぶん有する。残る患者の約1/3が未知の起源の***過少症に寄与し、そして残る患者についての理由は現在の知識状態ではまだ不明確である。特に、精巣上体において生じる***成熟の障害が、***における***の適切な数にもかかわらず、女性卵子の受精が生じない特発性不妊症の場合、疑わしい(H.W.G. Baker, Male Reproductive Dysfunction, 341 ff, 1986)。
多くの酵素的に調節された工程が、***成熟においてお互い関連している。酵素の異常調節により引起される障害が***成熟の障害、及び従って、受精できない***を誘導すると思われる。
本発明の目的は、ヒト精巣における酵素代謝の障害、及び特に男性不妊症が診断され、そして処理され、そして受精調節のために使用され得る新規手段を提供することである。
本発明の目的は、ヒト精巣における酵素代謝の障害、及び特に男性不妊症が診断され、そして処理され、そして受精調節のために使用され得る新規手段を提供することである。
Hipキナーゼ4は、他のタンパク質のドメインと、酵母2−ハイブリッドスクリーンにおいて相互作用する新規ファミリーの酵素に属する。それらのタンパク質は、保存されたタンパク質キナーゼドメイン、及び他のタンパク質と相互作用するドメインを含んで成り、そして従って、タンパク質キナーゼは、ホモドメイン−相互作用タンパク質キナーゼ(HipKs)として言及される。今日まで、次の4種のイソフォームが知られている:HipK1, HipK2, HipK3及びHipK4(Kim Choiなど. 1998, J. Biol. Chem., 273 (40): 25875-9)。それらのタンパク質キナーゼは、チロシンリン酸化により調節され、そしてセリン/トレオニン残基及びチロシン残基に対するそれらの自己リン酸化を触媒するが、しかしセリン/トレオニン残基に対してのみそれらの基質をリン酸化する大きなファミリーのキナーゼに属する(Zhang, Liなど. 2005, Genomics 85(1): 117-30)。HipK1, 2及び3は、細胞核に検出できており、そしてそれは同様に、いくつかの基質を同定することが可能であった。
HipK4については今日まで、ほとんど知られていない。HipK4の配列は、出願WO04/087901号(Wyeth)において最初に主張された。
しかしながら、機能的情報は今日まで、HipK4については入手されていない(Kim, Choi など. 1998, J Biol Chem 273 (40); 25875-9; Moilanen, Karvonen など. 1998, Mol Biol Cell 9(9): 2527-43; Rochat-Steiner, Becker など. 2000, J Exp Med 192(8); 1165-74; Ecsedy, Michaelson など. 2003, Mol Cell Biol 23(3); 950-60; Zhang, Li など. 2005; Zhang, Nottke など. 2005, Proc Nat1 Acad Sci USA 102(8): 2802-7)。
しかしながら、機能的情報は今日まで、HipK4については入手されていない(Kim, Choi など. 1998, J Biol Chem 273 (40); 25875-9; Moilanen, Karvonen など. 1998, Mol Biol Cell 9(9): 2527-43; Rochat-Steiner, Becker など. 2000, J Exp Med 192(8); 1165-74; Ecsedy, Michaelson など. 2003, Mol Cell Biol 23(3); 950-60; Zhang, Li など. 2005; Zhang, Nottke など. 2005, Proc Nat1 Acad Sci USA 102(8): 2802-7)。
HipK4が***形成/***完成の工程において重要な役割を演じることを、本発明において最初に示すことが現在、可能であった。
HipK4が特に精巣において発現されることを示すことが可能であった。Hipキナーゼ4の定量的組織分布がマウス及びヒトにおいて、Q−RT−RCRにより決定された(図1A及びB)。HipK4は特にマウス及びヒトにおける精巣において発現される。発現はさらに、マウス脳において検出でき、これは精巣における発現レベルの強さの37%を示す(図1B)。
HipK4が特に精巣において発現されることを示すことが可能であった。Hipキナーゼ4の定量的組織分布がマウス及びヒトにおいて、Q−RT−RCRにより決定された(図1A及びB)。HipK4は特にマウス及びヒトにおける精巣において発現される。発現はさらに、マウス脳において検出でき、これは精巣における発現レベルの強さの37%を示す(図1B)。
ラット精巣におけるin situハイブリダイゼーションによるHipK4の発現の詳細な研究は、HipK4が独占的に、後−減数***近くの***細胞において発現されることを示すことができた(図2)。PNA−レクチン(アクロソーム染色)及びヨウ化プロピジウム染色との組合せにおいて、成長段階4−6への***完成の間、HipK4の発現を制限することが可能であった(図2)。後−減数***近くの***細胞に制限される、この実質的に精巣−特異的HipK4発現が、後−減数******完成におけるHipキナーゼの実質的な役割を強化し、そして従って、受精障害の診断及びHipK4の阻害に基づく避妊のための手段を開発する可能性を支持する。
HipK4−ノックアウトマウス系を用いて、HipK4が***完成の間、実質的に役割を演じることを示すことが、精巣及び精巣上体の組織学的分析により可能であった(図8−9)。精巣におけるHipK4の欠損は、精細管における成長***細胞の典型的でない配列により示されるように、***完成に対する影響を導く(図8)。***細胞における形態学的変化は、精細管の内腔中への***の開放の直前の段階において最も高く観察されることである(図8、円)。HipK4−欠失マウス系の***は、この成長段階の特徴である延長形状をもはや示さないが、しかし変更された形態学を示す。結局、この欠陥性***完成は、精巣における劇的に低められた数の***の解放を導き、そして従って、***細胞の尾におけるそれらの変形された***の蓄積を導く(図9)。
HipK4−欠失のマウス系の分析は、***完成におけるこのキナーゼの実質的な機能を明白に示すことができた。従って、HipK4の不在が不妊症を導くことが推定される。結果的に、HipK4モジュレーターが避妊のための新規薬物として開発され得、そしてHipK4機能性の分析が不妊症を診断するために利用され得る。
従って、本発明は、酵素Hipキナーゼ4及びこの酵素のモジュレーターが、不妊症の診断及び受精能調節のために適切である新規薬物を開発するための標的物質として作用する新規治療方法を提供することにより、本発明の問題を解決する。
従って、本発明は、酵素Hipキナーゼ4及びこの酵素のモジュレーターが、不妊症の診断及び受精能調節のために適切である新規薬物を開発するための標的物質として作用する新規治療方法を提供することにより、本発明の問題を解決する。
本発明は、配列番号1に対応するHipK4核酸、配列番号2に対応するHipK4ポリペプチド、HipK4のモジュレーター、HipK4に対して向けられた抗体、HipK4アンチセンス、及びHipK4 RNAiから成る群から選択された少なくとも1つの物質を活性成分として含む医薬組成物の、受精障害の診断及び処理、避妊、及び受精障害の処理のための薬物の製造のための使用に関する。
HipK4核酸は、一本鎖又は二本鎖DNA、例えばcDNA及びRNA、例えばmRNA、cRNA、プレmRNa、及びそれらの一部を包含する。DNA及びタンパク質配列は、配列番号1及び4で示されている(配列番号1:HipK4ヒトヌクレオチド配列番号ENST00000291823及び配列番号2:HipK4ヒトタンパク質配列番号ENSP00000291823)。配列番号1で示される核酸は、ヒトHipK4タンパク質をコードする。
核酸が配列番号1で示される核酸配列のタンパク質をコードするセグメントを包含する医薬組成物を使用することが好ましい。配列番号1で示される配列のタンパク質コードセグメントは、286−2136領域に位置する。
核酸は、哺乳類、例えばヒト細胞から、又はヒト細胞から得られるcDNAライブラリー又はゲノムライブラリーから得られる。それは、ハイブリダイゼーションプローブ又は増幅プライマーとして、配列番号1で示される核酸配列の短いセグメントを用いて、既知技法により単離され得る。
核酸は、哺乳類、例えばヒト細胞から、又はヒト細胞から得られるcDNAライブラリー又はゲノムライブラリーから得られる。それは、ハイブリダイゼーションプローブ又は増幅プライマーとして、配列番号1で示される核酸配列の短いセグメントを用いて、既知技法により単離され得る。
本発明はさらに、ポリペプチドが配列番号2で示されるアミノ酸配列を包含する医薬組成物の上記使用にも関する。
ポリペプチドは、組換えポリペプチド、天然の単離されたポリペプチド、又は合成ポリペプチドであり得る。
配列番号2に対応するポリペプチドのmRNAは、精巣又は胚細胞において転写される。
本発明は位置1〜616に配列番号2で示されるアミノ酸配列に対応するポリペプチドフラグメントを含んで成る医薬組成物の上記使用に関する。
ポリペプチドは、組換えポリペプチド、天然の単離されたポリペプチド、又は合成ポリペプチドであり得る。
配列番号2に対応するポリペプチドのmRNAは、精巣又は胚細胞において転写される。
本発明は位置1〜616に配列番号2で示されるアミノ酸配列に対応するポリペプチドフラグメントを含んで成る医薬組成物の上記使用に関する。
HipK4ポリペプチド又はその一部の領域(ペプチド)が、抗体を生成するために使用され得る。ポリクローナル抗体を生成するために、ポリペプチド又はペプチドが、例えばKLH(カサガイヘモシアニン)に結合され得、そして動物、例えばウサギ中に注入され得る。それらはまた、モノクローナル抗体を生成するためにも使用され得る。HipK4ポリペプチド又はペプチド、又は多くのHipK4ペプチドの混合物が、抗体を生成するために使用され得る。抗体は、例えばKohler, G. and Milstein, C., Nature 1975, 256, 495-497及びNelson, P.N. など., Mol. Pathol. 2000, 53, 111-117に記載されるような標準方法により生成される。
本発明は、受精障害の診断のためにHipK4ポリペプチドに対して向けられる抗体を含んで成る医薬組成物の使用に関する。
抗体は、HipK4ポリペプチドを検出するために使用され得る。これは、例えば免疫組織化学により可能である。抗体はまた、他のイムノアッセイ、例えばELISA(酵素結合された免疫吸着アッセイ)又はラジオイムノアッセイに使用され得る。従って、組織又は細胞抽出物におけるポリペプチドの濃度が検出され得る。
抗体は、HipK4ポリペプチドを検出するために使用され得る。これは、例えば免疫組織化学により可能である。抗体はまた、他のイムノアッセイ、例えばELISA(酵素結合された免疫吸着アッセイ)又はラジオイムノアッセイに使用され得る。従って、組織又は細胞抽出物におけるポリペプチドの濃度が検出され得る。
ポリペプチドの発現はまた、細胞におけるmRNAを検出することによっても検出され得る。従って、本発明はまた、配列番号2で示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸配列に対して相補的である核酸配列を有するプローブの、細胞におけるmRNAの存在を検出するための試薬を調製するためへの使用にも関する。プローブは、少なくとも14個のヌクレオチドを有するRNA又はDNAの短い断片である。本発明のプローブは、ノザンブロット分析に使用され得る。この方法は例えば、Sambrook, J. など., 1989 Cold Spring Harbor Laboratory Pressに記載されている。RNAを検出するための他の方法は、in situハイブリダイゼーション、RNアーゼ保護アッセイ又はPCRである。
本発明はさらに、核酸配列に対して向けられ、そしてHipK4タンパク質、例えばHipK4 mRNAの安定性又は翻訳を阻害するアンチセンス分子及び合成分子の発現を抑制することができる分子を含んで成る医薬組成物の使用にも関する。それらのタイプの分子は特に避妊のために使用され得る。
本発明はまた、少なくとも1つのHipK4核酸を、活性成分として、又はHipK4ポリペプチド又はHipk4アンチセンス分子を、HipK4遺伝子及び/又はタンパク質に原因的に関連する疾病の処理のための組成物を生成するための標的物質として含んで成る組成物の使用にも関する。
本発明はさらに、その原因がHipK4タンパク質の突然変異を包含する障害を診断するための方法にも関する。このためには、DNAチップを使用することが可能である。従って、本発明は、完全なcDNA配列又はその部分配列、又は配列番号1で記載される配列に対する相補的配列に対応する少なくとも1つのオリゴヌクレオチドを固定されているDNAチップに関する。従って、本発明はさらに、好ましくは精巣及び卵管における受精障害を診断するためへの本発明のDNAチップの使用にも関する。
DNAマイクロアレイとしても知られているDNAチップは、通常ガラス又は珪素から製造された小形化された支持体であり、その表面上に、既知配列のDNA分子が規則正しいアレイで高密度で固定されている。表面結合されたDNA分子は、たぶんラベルされた相補的核酸によりハイブリダイズされる。ラベルは蛍光色素であり得る。
オリゴヌクレオチドチップの場合、本発明のDNAチップに結合され得るオリゴヌクレオチドが、遺伝子生成物(それから誘導されるmRNA又はcDNA)の部分配列を表す。1又は複数のオリゴヌクレオチドが、DNAチップ上に遺伝子当たり結合され得る。25個の長さのヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチドが好ましい。それらは、好ましくは、遺伝子のそれぞれの3’末翻訳末端から選択される。DNAチップを生成し、そして使用するための方法は、例えばアメリカ特許第5,578,832号;第5,557,752号及び第5,510,270号に記載されている。
cDNAチップの場合、完全な遺伝子生成物(cDNA)又は副フラグメント(200〜500bpの長さ)がチップ上に結合される。この方法は例えば、Eckmann L. など., J. Biol. Chem., 2000, 275(19), 14084-14094に記載されている。
最初に、配列番号1で示されるような適切なDNA配列が決定される。適切な配列は、選択された遺伝子転写体とハイブリダイズすることができるそれらである。次に、オリゴヌクレオチドがフォトリトグラフィー方法に基づく化学的工程によりチップ上に調製される。このために使用されるフォトリトグラフィーマウスは、適切なコンピューターアルゴリズムにより生成される。
ラベルされたRNAが、ハイブリダイゼーションオーブンにおいてチップと共にインキュベーションされる。続いて、チップは、ハイブリダイゼーションプロフィールを決定するスキャナーにおいて分析される。従って、転写体に変化(例えば、突然変異、切断)が存在するかどうかを確立することが可能である。同様に、転写体及び従って、HipK4タンパク質を定量化し、そして例えばプロモーターにおける突然変異についての結論を引出すことが可能にされる。
本発明はさらに、HipK4転写体を修飾するためへのRNAi(RNA干渉)の使用に基づかれる方法に関する。そのような適用は、避妊剤を製造するために特に使用され得る。RNAiに使用されるオリゴヌクレオチドは、配列番号1に基づかれ、そして内因性HipK4 RNAとの相互作用を通して転写体の修飾を導く。
本発明はさらに、遺伝子療法アプローチの形で使用され得るHipK4核酸を活性成分として含んで成る医薬組成物の、男性用不妊症の処理のためへの使用に関する。遺伝子療法は、ゲノムを修飾することにより、遺伝子的に関連する障害の原因を処理するすべての方法を意味する。この方法においては、不明の遺伝子情報が身体に直接的に適用される。遺伝子を含んで成るベクターが注入されるか又は吸入され、そして従って、作用のそれらの部位に達する。
本発明はさらに、HipK4受容体をコードする核酸配列、又はベクターによりトランスフェクトされる細胞にも関する。使用され得る細胞の例は、E. コリ、酵母、ピチア(Pichia)、Sf9, HEK 293, CHO, COS, CV-1又はBHKである。それらの細胞は、HipK4ポリペプチドを成長するために、又はアッセイシステムのために使用され得る。
本発明はまた、宿主細胞が、DNA配列の発現を可能にする条件下で培養され、そしてそれにより、発現生成物が培養された混合物から得られることを特徴とする、HipK4ポリペプチドの調製方法にも関する。
本発明はまた、宿主細胞が、DNA配列の発現を可能にする条件下で培養され、そしてそれにより、発現生成物が培養された混合物から得られることを特徴とする、HipK4ポリペプチドの調製方法にも関する。
タンパク質キナーゼの機能は、リン酸化する特異的基質タンパク質から成る。これは一般的に、活性の状態又は結合性質の変化により、たぶん明示される、基質の生化学的性質の修飾を導く。避妊のための手段の開発は現在、キナーゼの活性の調節に基づかれ得る。しかしながら、このための前提条件は、調節されるべきタンパク質が酵素活性を示し、そしてまさしく、細胞内伝達内の結合パートナーとして作用しないことである。HipK4が固有のキナーゼ活性を有する証拠は、一般的なキナーゼ基質MBPが使用されるキナーゼアッセイにより示される(図4)。
リン酸化の強さは、使用されるHipK4の量の関数として生じる。一般的なキナーゼ基質としてその性質を有するMBPは、多数のセリン及びトレオニンリン酸化残基を含んで成り、そして従って、インヒビターを同定し、そしてキナーゼ動力学を研究するための理想的基質ではない。理想的基質は、ペプチドライブラリーの組織的研究により同定されており、使用される前記ペプチドの配列は、既知リン酸化部位及び記載される基質の活性化ループに基づかれている。
そのような実験アプローチの助けによるHipK4基質として同定されるタンパク質は、中でも次のものである:Fox03a(NP_963853及びRBL2(NM-005611)。Fox03a及びRBL2が明白に、***形成において重要な機能を有し、又は受精能のために必須であることは、興味の対象である(Yan, Keroなど., 20001; Hosaka、Bosaka, Biggなど. 2004)。HipK4のみならず、またHipK4によりリン酸化された基質がヒト及びマウス受精能の調節の重要な構成成分である事実は、適切なシグナル化経路におけるHipK4のキナーゼ活性の必須の機能を示唆する。しかしながら、HipK4基質の同定は、生物学的機能の解明に寄与するのみならず、またHipK4モジュレーターのさらなる分析及び開発のために必要な情報も生成する。これに関しては、基質として同定されるペプチドが、HipK4のために最適化されたHTS技法を確立するために使用される。
HipK4がその最も近い相同体、HipK1及びHipK2と、ATP結合ポケットにおいてわずか74%の配列同一性を共有する配列比較により示すことが可能である(表1)。特に、推定上のインヒビターの主要標的領域を表すATP結合ポケットにおいて、他のタンパク質とのそのような低い相同性は、HipK4モジュレーターが、小さな配列同一性のために、追加のタンパク質を結合しないであろうことが予測され得るので、特定のHipK4モジュレーターの開発を促進する。
同様に、本発明は、HipK4ポリペプチドのエフェクターを同定するための、
a)HipK4核酸、
b)HipK4ポリペプチド、又は
c)HipK4を発現する細胞の使用に関する。
エフェクターは、HipK4ポリペプチドに対する阻害又は活性化活性を有し、そしてHipK4ポリペプチドのHipK4機能に影響を及ぼすことができる物質である。
a)HipK4核酸、
b)HipK4ポリペプチド、又は
c)HipK4を発現する細胞の使用に関する。
エフェクターは、HipK4ポリペプチドに対する阻害又は活性化活性を有し、そしてHipK4ポリペプチドのHipK4機能に影響を及ぼすことができる物質である。
本発明はさらに、その完全な又は部分的配列としてのHipK4ポリペプチドがモジュレーターと共にインキュベートされ、そしてHipK4ポリペプチドへの分子の結合が測定される、HipK4ポリペプチドのエフェクターを同定するためのアッセイシステムに関する。本発明はさらに、HipK4ポリペプチドのエフェクターを同定するためのアッセイシステムにも関する。これは、放射性ラベルされたATP及び基質MBPと共にインキュベートされる精製された酵素を必要とし、そして適切なインキュベーションの後、基質のリン酸化の程度が決定される(図4)。
同様に、本発明は、
a)物質がHipK4エフェクターを同定するためにアッセイシステムと接触され、
b)前記アッセイシステムに対する前記物質の効果が、対照との比較により測定され、
c)段階b)におけるHipK4ポリペプチドの活性の調整が同定され、そして
d)段階c)において同定された物質が薬局において慣例の配列材料と共に混合される、医薬組成物の供給方法に関する。
HipK4ポリペプチドのエフェクターは、男性における受精能を促進するための診断及び男性における避妊のために使用され得る。
a)物質がHipK4エフェクターを同定するためにアッセイシステムと接触され、
b)前記アッセイシステムに対する前記物質の効果が、対照との比較により測定され、
c)段階b)におけるHipK4ポリペプチドの活性の調整が同定され、そして
d)段階c)において同定された物質が薬局において慣例の配列材料と共に混合される、医薬組成物の供給方法に関する。
HipK4ポリペプチドのエフェクターは、男性における受精能を促進するための診断及び男性における避妊のために使用され得る。
好ましい調製物は、経口、腸又は非経口投与のために適切である用量形から成る。そのような用量形の例は、錠剤、フィルム被覆された錠剤、糖被覆された錠剤、ピル、カプセル、粉末又はデポット(depot)形、及び坐薬である。適切な錠剤は、活性成分を、既知賦形剤、例えば不活性希釈剤、例えばデキストロース、糖、ソルビトール、マンニトール、ポリビニルピロリドン、砕解剤、例えばトウモロコシ澱粉又はアルギン酸、結合剤、例えば澱粉又はゼラチン、滑剤、例えばカルボキシポリメチレン、カルボキシメチルセルロース、セルロースアセテートフタレート又はポリビニルアセテートと共に混合することにより得られる。錠剤はまた、多くの層から成ることができる。
同様に、不妊症の診断のために本発明の医薬組成物を使用することが可能である。これは、ELISAアッセイ又はタンパク質チップにより決定されるHipK4の量を必要とする。
本発明はまた、体液における自己免疫抗体を診断するためへの本発明の医薬組成物の使用にも関する。
本発明はまた、体液における自己免疫抗体を診断するためへの本発明の医薬組成物の使用にも関する。
本発明はさらに、医薬組成物の使用を通しての遺伝子療法のための手段として使用され得る。これは、遺伝子療法の使用を通してブロックされるHipK4の効果を必要とする。これに関しては、HipK4アンチセンス配列を含んで成るベクターが構成され、そして投与される。それらのベクターは、HipK4アンチセンス配列を含んで成るベクターが構成され、そして投与される。それらのベクターの例は、アデノウィルス、アデノウィルス結合ウィルス、単純ヘルペスウィルス又はSV40由来のベクターである。遺伝子療法は、記載のようにして実施され得る(Gomez-Navarroなど. 1999, Eur. J. Cancer, 35, 867-885)。投与は局部的に、すなわち腹腔中に直接的に、又は全身的に、すなわち血流を通して実施される。これは、精巣におけるHipK4の発現の遮断を導く。従ってHipK4により仲介される生物学的機能が阻害される。
生物学的例:
1.ヒトHipK4のクローニング及び発現:
配列番号1の塩基対286−2136のセグメントを、標準PCRにより増幅し、そしてHindIII −Not I制限切断部位を通して発現ベクターpBB4.5中にクローン化した。昆虫細胞におけるHipK4の発現のためのバキュロウィルスを、Invitrogenからの“Bac-N-Blue-キット”の助けにより、その製造業者の説明書に従って生成した。
1.ヒトHipK4のクローニング及び発現:
配列番号1の塩基対286−2136のセグメントを、標準PCRにより増幅し、そしてHindIII −Not I制限切断部位を通して発現ベクターpBB4.5中にクローン化した。昆虫細胞におけるHipK4の発現のためのバキュロウィルスを、Invitrogenからの“Bac-N-Blue-キット”の助けにより、その製造業者の説明書に従って生成した。
Sf9昆虫細胞(1L)を、HipK4バキュロウィルスにより、3のMOI(感染の多重度)で感染し、そして3日間、培養した。次に、細胞ペレットを、溶解緩衝液(50mMのトリス、pH7.5、150mMのNaCl、プロテアーゼインヒビターカクテル(Sigma))により粉砕し、そしてHipK4タンパク質を、抗−FLAG親和性カラム(Sigma)を用いて、その使用説明書に従って、精製した。精製の効率及び純度を、標準のSDSゲル電気泳動、続くウェスターンブロットにより調べた(図3)。
2.RNA調製及び組織サンプル:
RNA調製のために、それぞれの器官を、溶液窒素に移し、そしてさらなる処理まで貯蔵した(ヒトRNAサンプルは、Contechから得られた)。RNAをTrizol(Invitrogen)を用いて単離し、そしてSuperScript III First Strand キット(Invitrogen)を用いて、cDNAを合成した。両方法を、製造業者の説明書にしたがって厳密に実施する。野生型及びHipK4−欠失マウスからの精巣及び***細胞を、組織学的分析のために調製し、そしてBouin’s固定溶液(0.9%ピクリン酸、9.5%ホルムアルデヒド及び4.8%酢酸)において一晩、撹拌する。次の日、検体を、上昇するエタノールシリーズにおいて脱水し、そしてパラフィンに包埋する。続いて調製される5μMの組織切片を、標準のH&E染色により処理することができる。
RNA調製のために、それぞれの器官を、溶液窒素に移し、そしてさらなる処理まで貯蔵した(ヒトRNAサンプルは、Contechから得られた)。RNAをTrizol(Invitrogen)を用いて単離し、そしてSuperScript III First Strand キット(Invitrogen)を用いて、cDNAを合成した。両方法を、製造業者の説明書にしたがって厳密に実施する。野生型及びHipK4−欠失マウスからの精巣及び***細胞を、組織学的分析のために調製し、そしてBouin’s固定溶液(0.9%ピクリン酸、9.5%ホルムアルデヒド及び4.8%酢酸)において一晩、撹拌する。次の日、検体を、上昇するエタノールシリーズにおいて脱水し、そしてパラフィンに包埋する。続いて調製される5μMの組織切片を、標準のH&E染色により処理することができる。
3.ヒト及びネズミ組織における組織分布(TaqMan qPCR):
種々のヒト及びマウス組織においてHipK4の異なったレベルの発現を検出するために、転写体の一部を、PCRにより定量化する(Real−Time TaqMan, Applied Biosystems)。ハウスキーピング遺伝子延長因子1α(EF1α)を、cDNAの量を標準化するために使用する。PCR反応を、次のプライマー対(マウスHipK4:5’−CCGTCTGTCATCCCACAAC−3’及び5’−TAGGGTCCATTCTGGCTCAC−3’;ヒトHipK4:5’−CCCGCTGCCCCTTCA−3’及び5’−GCACCTCGCTGAAAATGCT−3’)を用いて、標準のプロトコール(製造業者の説明書)に従って、iQ−SYBR Green Supermix (BIO-RAD)を用いて設定する。
種々のヒト及びマウス組織においてHipK4の異なったレベルの発現を検出するために、転写体の一部を、PCRにより定量化する(Real−Time TaqMan, Applied Biosystems)。ハウスキーピング遺伝子延長因子1α(EF1α)を、cDNAの量を標準化するために使用する。PCR反応を、次のプライマー対(マウスHipK4:5’−CCGTCTGTCATCCCACAAC−3’及び5’−TAGGGTCCATTCTGGCTCAC−3’;ヒトHipK4:5’−CCCGCTGCCCCTTCA−3’及び5’−GCACCTCGCTGAAAATGCT−3’)を用いて、標準のプロトコール(製造業者の説明書)に従って、iQ−SYBR Green Supermix (BIO-RAD)を用いて設定する。
ピペット作業の誤差を通しての差異を低めるために、反応混合物を、プライマー及びSYBR Greenミックスを含んで成るマスターミックスを用いることにより組合す。次に、後者をcDNAに添加する。PCRプログラム:変性、95℃、2分;増幅(40サイクル)、94℃、15秒及び60℃、60秒。DNA濃度を、増幅の間、検出する。種々の個々の間の発現の差異を低めるために、常に多くの組織サンプルを組合し、合計のプールを得る。ピペット作業及びPCR工程の誤差を低めるために、すべてのPCR反応を少なくとも三重反復して設定する。平均を、標準編成を考慮し、後での定量化のために使用する。
4.in situハイブリダイゼーションによるラット組織における組織分布:
特にことわらない限り、インキュベーション及び洗浄段階を、室温で行う。パラフィン切片を、キシレンにそれぞれ10分間、2度、浸漬することによりワックス除去し、そして低下するエタノール/PBSシリーズにより、純粋なPBS中に移す。これに続いて、4%PEAにおいて20分間、カウンター固定化し、続いてPBSによりそれぞれ5分間、2度、洗浄する。切片をプロテイナーゼK処理に10分間ゆだねた後(100mMのトリス−HCl(pH7.5)中、10mg/mlのプロテイナーゼK)、それらを0.2%グリセロール/PBSに10分間、浸漬し、反応を阻害する。PBSにより5分間、2度、洗浄した後、4%PFAにおいて10分間、固定化する。
特にことわらない限り、インキュベーション及び洗浄段階を、室温で行う。パラフィン切片を、キシレンにそれぞれ10分間、2度、浸漬することによりワックス除去し、そして低下するエタノール/PBSシリーズにより、純粋なPBS中に移す。これに続いて、4%PEAにおいて20分間、カウンター固定化し、続いてPBSによりそれぞれ5分間、2度、洗浄する。切片をプロテイナーゼK処理に10分間ゆだねた後(100mMのトリス−HCl(pH7.5)中、10mg/mlのプロテイナーゼK)、それらを0.2%グリセロール/PBSに10分間、浸漬し、反応を阻害する。PBSにより5分間、2度、洗浄した後、4%PFAにおいて10分間、固定化する。
次に切片を、PBSにより5分間洗浄し、0.2NのHCl溶液に15分間浸漬し、再度PBSにより5分間、2度、洗浄し、TEA溶液(0.1Mのトリエタノールアミン、pH8.0;0.25%の無水酢酸)において10分間インキュベートし、アミノ基を飽和する。次に、切片をPBS及びDEPC−H2Oにより、それぞれ5分間、洗浄し、70℃で2時間、プレハイブリダイズする(50%ホルムアミド;5×SSC(20×SSC;3MのNaCl;0.3Mのクエン酸ナトリウム、pH7.0)、50μg/mlの酵母tRNA;1%SDS;50μg/mlのヘパリン;1×Denhard’s;0.1%Tween)。ハイブリダイゼーションが、70℃で一晩、プレハイブリダイゼーション溶液中、3mg/mlのジゴキシゲニン−ラベルされたサンプルとで生じる。
次の日、切片を溶液1(ddH2O中、50%ホルムアミド;5×SSC, pH4.5及び1%SDS)において67℃で30分間、3度、洗浄する。RTで5分間のTNT(10mMのトリス−HCl、pH7.5;0.5MのNaCl;0.1%Tween‐20)における3回のインキュベーションに続いて、切片を、TNT中、100μg/mlのRNアーゼにより37℃で30分間、2度、処理する。次に、切片を、TNT:溶液II(1:1)におけるRTでの5分間の短時間の洗浄の後、溶液II(非DEPC―処理された水中、50%ホルムアミド;2×SSC、pH4.5;0.2%SDS)において63℃で30分間、3度インキュベートする。
切片をMAP溶液(100mMのマレイン酸;150mMのNaCl;2mMのレバミゾール、pH7.5)において、それぞれ5分間、3度、洗浄した後、MAP/ブロック/羊血清(100mMのマレイン酸;150mMのNaCl;2mMのレバミゾール、pH7.5;10%羊血清中、2%Rocheブロッキング試薬)において、続いてシェーカー上での一定の撹拌下でRTで3時間、遊離結合部位をブロッキングする。最終的に、200μlの抗体溶液(抗−ジコキシゲニン)を個々のスライドに適用し、そして4℃で一晩インキュベートする。
ISHの3日目、切片を、MAP溶液において10分間、3度、及び1時間、4度、洗浄する。次に、切片を、NTMT(100mMのトリス−HCl、pH9.5;50mMのMgCl2;100mMのNaCl)により10分間、3度、すすぐ。次に、色彩反応を、シグナルが同定できるまで、BM Purple(Roche, Switzerland)において、最大一晩、実施する。色彩の進行を、PBT(pH4.5)においてRTでそれぞれ5分間、3度、洗浄することにより停止する。組織学的検体を、貯蔵のためにMOVIOL(商標)においてカバーガラスをする。
5.活性検出(キナーゼアッセイ):
精製されたHipキナーゼ4を、60μlの最終体積において、25μgのMBP(Upstate biotechnology)と共に、種々の量の20mMのMOPS、pH7.2、25mMのβ−グリセロールホスフェート、5mMのEGTA、1mMのNa3VO4, 1mMのジチオトレイトール、10mMのMgOAc、及び25μMのATP(上昇する10μCiの[γ−33P]ATP)をインキュベートする。室温での2時間のインキュベーションの後、10μlの反応混合物を、Whatman P81ホスホセルロース紙上に置く。次に、フィルターを0.75%リン酸により洗浄し、そして乾燥し、そして残存する放射能を測定する。
精製されたHipキナーゼ4を、60μlの最終体積において、25μgのMBP(Upstate biotechnology)と共に、種々の量の20mMのMOPS、pH7.2、25mMのβ−グリセロールホスフェート、5mMのEGTA、1mMのNa3VO4, 1mMのジチオトレイトール、10mMのMgOAc、及び25μMのATP(上昇する10μCiの[γ−33P]ATP)をインキュベートする。室温での2時間のインキュベーションの後、10μlの反応混合物を、Whatman P81ホスホセルロース紙上に置く。次に、フィルターを0.75%リン酸により洗浄し、そして乾燥し、そして残存する放射能を測定する。
結果は図3に示される。HTS方法において推定上の基質を同定するために、反応体積を15μlに減じ、そして反応を384−ウェルマイクロタイタープレートにおいて行う。ペプチドを水に希釈し、そして2.5μMの最終濃度で反応混合物に添加する。反応を10ngのHipK4タンパク質と共に1時間インキュベートし、そしてPBS中、50mMのEDTA、3.33mg/mlのストレプタビジン−SPAビーズ(Amersham)の添加により停止する。プレートを10分間、混合し、そして1000rpmで遠心分離し、そしてシンチレーションシグナルを、Wallacマイクロベータリーダーを用いて定量化する。
6.HipK4ノックアウトの生成:
標的ベクターを、C57BL/6J BAC DNA収集(Artemis)を用いてクローン化する。好結果をうむ相同組換えは、ネズミHipK4対立遺伝子のエキソン2−3の欠失、及び従って、タンパク質キナーゼドメインの部分的欠失を導く。ES細胞クローンB−B2(遺伝学的バックグラウンドC57BL/6N)を、相同組換え(図5)(Artemis)に関して、陽性としてサザンブロットにより同定する。このためには、種々のES細胞クローンのゲノムDNAを、制限酵素HindIII により消化し、そしてアガロースゲル上で分別する。消化されたDNAをサザンブロットによりニトロセルロース膜に移した後、相同組換えに起因する制限フラグメント長多形現象(RFLP)を、3’外部プローブを用いることにより検出できる(図5)。
標的ベクターを、C57BL/6J BAC DNA収集(Artemis)を用いてクローン化する。好結果をうむ相同組換えは、ネズミHipK4対立遺伝子のエキソン2−3の欠失、及び従って、タンパク質キナーゼドメインの部分的欠失を導く。ES細胞クローンB−B2(遺伝学的バックグラウンドC57BL/6N)を、相同組換え(図5)(Artemis)に関して、陽性としてサザンブロットにより同定する。このためには、種々のES細胞クローンのゲノムDNAを、制限酵素HindIII により消化し、そしてアガロースゲル上で分別する。消化されたDNAをサザンブロットによりニトロセルロース膜に移した後、相同組換えに起因する制限フラグメント長多形現象(RFLP)を、3’外部プローブを用いることにより検出できる(図5)。
2種のフラグメントは、野生型クローンについて予測されるべきであり、そして3種のフラグメントは対立遺伝子上での好結果をうむ相同組換えを有するクローンについて予測されるべきであり:野生型について11.2kb及び8.7kbのサイズのフラグメント、及び好結果をうむ相同組換え(HR)によるクローンについて5.3kbのサイズの追加のフラグメント。ES細胞クローンB-B-2を、C57BL/6N未分化胚芽細胞中への注入のために使用し、そしてそれから得られるキメラを、C57BL/6N雌と交配する。トランスジェニック子孫の遺伝子型分類を、尾の先端からのゲノムDNAを用いてPCR分析により実施する。
このために使用されるプライマー、すなわちHipK4-A:5’−CTACTGCACAACTAAATCTGTAGC−3’及びHipK4−B:5’−CAGCGGTAGAGGAAGATAGAGG−3’は、ネズミHipK4遺伝子のイントロン2(HipK4-A)及びイントロン3(HipK4-B)においてハイブリダイズする。それらのプライマーの使用に基づいて、野生型対立遺伝子に関してフラグメント364塩基対及びノックアウト対立遺伝子に関してフラグメント2850塩基対の増殖が存在する(図6)。
ホモ接合性ノックアウトマウスを、ヘテロ接合性マウスを交配することにより生成する。ホモ接合性ノックアウト動物におけるHipK4転写体の不在が、従来のRT-PCRを用いて検出され得る(図7)。次のプライマーをこのために使用する:HipK4−C:5’−TGCAGACTCAGGTCATCGAG−3’及びHipK4−D:5’−GCAAGGCTCACCACTTCTTC−3’;そして次のプライマーを延長因子1αとの対照反応のために使用する:E-A:5’−AATTCACCAACACCAGCAGCAA−3’;E−B:5’−TGCCCCAGGACACAGAGACTTCA−3’。
Claims (20)
- 配列番号1に対応するHipK4核酸、配列番号2に対応するHipK4ポリペプチド、HipK4のモジュレーター、HipK4に対して向けられた抗体、HipK4アンチセンス、及びHipK4 RNAiから成る群から選択された少なくとも1つの物質を活性成分として含む医薬組成物の、受精障害の診断及び処理、避妊、及び受精障害の処理のための薬物の製造のための使用。
- 前記核酸が、配列番号1で表される核酸配列に対応するタンパク質コードセグメントを含む請求項1記載の使用。
- 前記核酸が、配列番号2で示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする請求項1記載の使用。
- 前記タンパク質コードセグメントが、配列番号1で示される配列のヌクレオチド286−2136の領域に位置する請求項3記載の使用。
- 前記含まれるHipK4ポリペプチドが、配列番号2で示されるアミノ酸配列の位置1〜位置616の領域に位置するポリペプチドフラグメントを含む請求項1記載の使用。
- 前記含まれる抗体が、受精障害の診断のためにHipK4ポリペプチドに対して向けられる請求項1記載の使用。
- 前記組成物が、受精障害の診断のために、配列番号4で示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸配列に対して相補的である核酸プローブを含んで成る請求項1記載の使用。
- 前記ヌクレオチド配列が、検出できるマーカーを供給される請求項7記載の使用。
- 前記組成物が、避妊のためにHipK4の発現を抑制できる分子を含んで成る請求項1記載の使用。
- 前記分子がアンチセンス分子である請求項9記載の使用。
- 少なくとも1つのHipK4核酸を、活性成分として、又はHipK4ポリペプチド又はHipk4アンチセンス分子を、HipK4遺伝子及び/又はタンパク質に原因的に関連する疾病の処理のための組成物を生成するための標的物質として含んで成る請求項1記載の使用。
- 活性成分がHipK4核酸である遺伝子療法のための手段としての請求項1記載の使用。
- 請求項4又は5記載の医薬組成物に存在するタンパク質又はポリペプチドの生成方法であって、宿主が、DNA配列の発現を可能にする条件下で培養され、そしてそれにより、発現生成物が前記培養混合物から得られることを特徴とする方法。
- 特異的リガンドを単離し、そして調製するための、請求項1記載の医薬組成物に存在するタンパク質又はポリペプチドの使用。
- HipK4ポリペプチドのエフェクターを同定するために、HipK4核酸、HipK4ポリペプチド、又はHipK4を発現する細胞を含んで成る請求項1記載の使用。
- HipK4ポリペプチドのエフェクターを同定するためのアッセイシステムであって、その完全な又は部分的配列としてのHipK4ポリペプチドがモジュレーターと共にインキュベートされ、そしてHipK4ポリペプチドへの分子の結合が測定され、ここでHipK4が放射性ラベルされたATP及び基質MBPと共にインキュベートされ、そして適切なインキュベーション時間の後、前記基質のリン酸化の程度が決定されることを特徴とするアッセイシステム。
- 前記エフェクターが、避妊のためのHipK4のインヒビターである請求項1記載の使用。
- 医薬組成物の供給方法であって、
a)物質がHipK4エフェクターを同定するためにアッセイシステムと接触され、
b)前記アッセイシステムに対する前記物質の効果が、対照との比較により測定され、
c)段階b)におけるHipK4ポリペプチドの活性の調整が同定され、そして
d)段階c)において同定された物質が薬局において慣例の配列材料と共に混合される方法。 - 好ましくは精巣及び卵管における受精障害を診断するための本発明のDNAチップの使用。
- 避妊のために、HipK4転写体の修飾をもたらすsiRNAを含んで成る請求項1記載の使用。
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JP2013528283A (ja) * | 2010-05-27 | 2013-07-08 | 建▲遠▼ 李 | ヒト睾丸および副睾丸で発現される305種類の生殖関連***局在タンパク質の検出方法 |
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