KR101850065B1

KR101850065B1 - TSHR(Thyroid Stimulating Hormone Receptor) 유전자 돌연변이 및 DIO2(type 2 iodothyronine deiodinase)유전자의 SNP 검출을 이용한 갑상선기능저하증 환자의 약물치료방법 결정을 위한 정보제공방법

Info

Publication number: KR101850065B1
Application number: KR1020160143157A
Authority: KR
Inventors: 이시훈
Original assignee: 가천대학교 산학협력단; (의료)길의료재단
Priority date: 2016-10-31
Filing date: 2016-10-31
Publication date: 2018-04-18

Abstract

본 발명은 갑상선기능저하증의 치료와 관련, L-T4(Levothyroxine)만을 투여하는 단독 요법 외에 L-T3(liothyronine)를 함께 투여하는 병용처방이 필요한 갑성기능저하증환자를 진단하기 위한 마이크로어레이, 키트 및 이를 이용한 진단방법에 관한 것이다. 구체적으로, DIO2(type 2 iodothyronine deiodinase) 유전자의 C.274A>G(DIO2 단백질을 암호화하는 mRNA 서열의 274번째 염기를 암호화하는 DIO2 유전자상의 A가 G로 변화) 동형접합체 SNP 및 TSHR(Thyroid Stimulating Hormone Receptor) 유전자의 C.1349G>A(TSHR 단백질을 암호화하는 mRNA 서열의 1349번째 염기를 암호화하는 TSHR 유전자상의 A가 G로 변화)의 이형접합체 기능상실(loss-of-function) 돌연변이를 가지고 있는 경우, 갑상선 자극 호르몬(Thyroid stimulating hormone; TSH)에 의한 DIO2 단백질의 발현 및 활성화가 현저히 억제되어 있음을 확인, 상기 DIO2 유전자의 SNP 및 TSHR 돌연변이는 L-T3의 병행 투여가 필요한 갑상선기능저하증 환자 진단에 유용하게 이용될 수 있다.

Description

TSHR(Thyroid Stimulating Hormone Receptor) 유전자 돌연변이 및 DIO2(type 2 iodothyronine deiodinase)유전자의 SNP 검출을 이용한 갑상선기능저하증 환자의 약물치료방법 결정을 위한 정보제공방법{Information providing method for drug treatment decisions of hypothyroidism patients by TSHR mutations and DIO2 T92A single nucleotide polymorphism detection}

TSHR(Thyroid Stimulating Hormone Receptor) 유전자 돌연변이 및 DIO2(type 2 iodothyronine deiodinase) 유전자의 SNP(single nucleotide polymorphism) 검출을 이용한 갑상선기능저하증 환자의 약물치료방법 결정을 위한 정보제공방법에 관한 것이다.

갑상선 기능 저하증이란 갑상선에서 갑상선 호르몬이 잘 생성되지 않아 체내에 갑상선 호르몬 농도가 저하된 또는 결핍된 상태를 뜻하며, 원인은 갑상선 자체에 문제가 있어서 갑상선 호르몬 생산이 줄어드는 경우와 갑상선에서 호르몬을 만들도록 하는 신호에 문제가 생겨서 갑상선 호르몬 생산이 줄어드는 경우로 나눌 수 있다. 가장 흔한 원인은 하시모토 갑상선염(자가면역성 갑상선염)에 의해 갑상선 자체에서 갑상선 호르몬의 생산이 줄어드는 경우이다. 뇌하수체 기능 저하증이 있는 경우도 갑상선 자극 호르몬(Thyroid stimulating hormone; TSH)이 분비되지 않아 갑상선 기능 저하증이 발생할 수 있다. 갑상선암 등을 이유로 갑상선을 제거한 경우 역시 갑상선 호르몬이 생성되지 못하므로 갑상선 기능 저하증이 올 수 있다. 주요증상으로 만성 피로, 식욕 부진, 체중 증가, 추위를 타는 것, 변비 등이 있을 수 있다. 그 외에도 피부가 건조해지고, 여자의 경우 생리 주기의 변화가 생기며, 월경 과다가 동반되기도 한다. 혈중 프로락틴(prolactin, 젖분비 호르몬) 수치를 증가시켜 유즙 분비가 생길 수 있다. 갑상선 호르몬이 심하게 부족한 경우 혼수 등의 신경학적 증상이 동반될 수 있다. 이의 치료를 위해선 갑상선호르몬(thyroxine(T4) 또는 triiodothyronine(T3)의 투여가 필요하다.

갑상선 기능 저하증의 치료와 관련하여 L-T4(Levothyroxine) 단독 요법은 표준치료방법으로 적용되고 있는데 이는 갑상선호르몬의 비활성형태인 L-T4를 투여하더라도 활성형 갑상선 호르몬인 트리요오드티로닌(triiodothyronine, T3)으로 생체내에서 온전하게 변환될 것이라는 것을 전제로 하고 있다. 그러나 L-T4 단독 요법의 유효성에 대한 의문도 존재하는데, 이는 이 요법으로 치료받은 환자의 10 % ~ 15 %가 신경인지 기능 장애, 신체기능저하등의 갑상선기능저하증 증상을 여전히 나타내기 때문이다. 관련하여 인간에서는 아직 그 임상적 중요성이 일관된 결과를 보여주고 있지 않지만 여러 동물 모델들의 연구 결과는 갑상선기능저하증의 치료에서 정상적인 T3 수준을 유지시키는 것이 우선사항이며, 따라서 L- T4 및 L-T3(liothyronine)를 함께 투여, 혈청 내 T3의 수준(level)을 올리는 것이 일부 환자들에서는 유용할 수도 있음을 제시하고 있다. 그러나 어떠한 환자들이 L-T4의 단독 투여가 효과가 없는지 따라서 L-T3의 병용 투여가 필요할지에 대해서는 연구된 바가 거의 없다.

갑상선 대사는 거시적 관점에서 양성적, 음성적 피드백 메커니즘을 통해 시상 하부 - 뇌하수체 - 갑상선 (HPT) 축에 의해 엄격하게 조절되는 것이 잘 알려져 있다. 그러나 미시적 관점, 즉 세포수준에서의 갑상선 호르몬의 조절에 관하여는 몇몇 셀레노단백질의 일종인 디이오디네이즈 효소(deiodinases, DIOs)가 관여한다는 것이 알려져 있으나 그 조절과 관련된 기전등이 거의 알려진 바가 없다.

제2형 디이오디네이즈(DIO2)는 비활성 티록신(thyroxine, T4)을 활성형 갑상선 호르몬인 트리요오드티로닌(triiodothyronine, T3)으로 변환시키는 효소로서, 생체내에서 활성을 나타내는 T3의 최종 농도 결정자로서 중요한 역할을 담당하고 있으며 TSH에 의해 상향조절(upregulation)되는 것이 알려져 있다. DIO2 유전자의 경우 특정 SNP, 즉 DIO2 단백질을 암호화하는 mRNA 서열의 274번째 염기에 상응하는 DIO2 유전자상의 G가 A로 변화된 SNP를 동형접합체(homozyogous)로 가지고 있는 갑상선기능저하증 환자의 경우 DIO2의 기능 저하로 인해 세포 내에서 T3가 적절히 보충되지 못하므로 L-T4 단독요법만으로는 한계가 있어 L-T3의 병행 투여가 필요한 환자로 볼 수 있다는 일부 주장이 있으나 상기 SNP가 모든 인류의 약 40% 정도로 흔히 관찰된다는 점에서 상기 SNP만으로 설명하기에는 난점이 있다.

이에 본 발명자들은 일반적으로 갑상선기능저하증환자에서 증가된 것이 관찰되는 TSH를 처리하였음에도 불구하고 다른 정상인 유래 섬유아세포에 비해 DIO2의 활성증가가 현저히 억제되어 있는 갑상선기능저하증 환자의 피부 유래 섬유아세포를 확인, 그 유전형을 분석한 결과 DIO2 유전자의 C.274A>G(DIO2 단백질을 암호화하는 mRNA 서열의 274번째 염기를 암호화하는 DIO2 유전자상의 G가 A로 변화) 동형접합체 SNP 및 TSHR 유전자의 C.1349G>A(TSHR 단백질을 암호화하는 mRNA 서열의 1349번째 염기를 암호화하는 TSHR 유전자상의 A가 G로 변화)의 이형접합체 기능상실(loss-of-function) 돌연변이를 가지고 있음을 확인, 상기 DIO2 유전자의 SNP 및 TSHR 돌연변이를 L-T3의 병행 투여가 필요한 갑상선기능저하증 환자 진단에 이용할 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명은 갑상선기능저하증의 호르몬 치료방법 결정에 있어 L-T3(liothyronine)의 병행 투여가 필요한 환자를 효과적으로 진단하기 위한 정보 제공방법 및 상기 진단을 위한 키트를 제공한다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 DIO2(type 2 iodothyronine deiodinase) 단백질을 암호화하는 서열번호 1로 구성된 폴리뉴클레오타이드에 있어서 274번째에 위치하는 염기가 A에서 G로 바뀐 단일염기다형성(C.274A>G)을 포함하는 10 내지 100개의 연속된 염기를 포함하는 폴리뉴클레오타이드 또는 이의 상보적 폴리뉴클레오타이드, 및 TSHR(Thyroid Stimulating Hormone Receptor) 단백질을 암호화하는 서열번호 2로 구성된 폴리뉴클레오타이드에 있어서 1349번째에 위치하는 염기 G가 A로 바뀐 돌연변이(C.1349G>A)를 포함하는 10 내지 100개의 연속된 염기를 포함하는 폴리뉴클레오타이드 또는 이의 상보적 폴리뉴클레오타이드를 포함하는, L-T4(Levothyroxine)와 L-T3(liothyronine)의 병용투여가 필요한 갑상선기능저하증 환자 진단용 마이크로어레이를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 마이크로어레이를 포함하는 T4(Levothyroxine)와 L-T3(liothyronine)의 병용투여가 필요한 갑상선기능저하증 환자 진단용 키트를 제공한다.

또한, 본 발명은 DIO2 단백질을 암호화하는 서열번호 1로 구성된 폴리뉴클레오타이드에 있어서 274번째에 위치하는 염기가 A에서 G로 바뀐 단일염기다형성(C.274A>G) 및 TSHR 단백질을 암호화하는 서열번호 2로 구성된 폴리뉴클레오타이드에 있어서 1349번째에 위치하는 염기 G가 A로 바뀐 돌연변이(C.1349G>A)를 검출할 수 있는 상보적인 프로브 또는 프라이머 세트를 포함하는, L-T4(Levothyroxine)와 L-T3(liothyronine)의 병용투여가 필요한 갑상선기능저하증 환자 진단용 키트를 제공한다.

또한, 본 발명은

1) 피검체로부터 분리된 생물학적 시료로부터 핵산을 분리하는 단계; 및

2) 상기 핵산으로부터 서열번호 1의 폴리뉴클레오타이드의 274번째에 위치하는 SNP 염기 서열 및 서열번호 2의 폴리뉴클레오타이드의 1349번째에 위치하는 돌연변이 염기 서열을 결정하는 단계를 포함하는 L-T4(Levothyroxine)와 L-T3(liothyronine)의 병용투여가 필요한 갑상선기능저하증 환자 진단에 필요한 정보제공 방법을 제공한다.

아울러, 본 발명은

1) 피검체로부터 분리된 생물학적 시료로부터 단백질을 분리하는 단계; 및

2) N-말단으로부터 450번째 아미노산인 아르기닌(R)이 히스티딘(H)으로 변화(R450H)된 TSHR 단백질 및 N-말단으로부터 92번째 아미노산인 트레오닌(T)이 알라닌(A)으로 변화(T92A)된 DIO2 단백질을 검출하는 단계를 포함하는 L-T4(Levothyroxine)와 L-T3(liothyronine)의 병용투여가 필요한 갑상선기능저하증 환자 진단에 필요한 정보제공 방법을 제공한다.

본 발명에서는 갑상선기능저하증의 진단과 관련하여, DIO2(type 2 iodothyronine deiodinase) 유전자의 C.274A>G(DIO2 단백질을 암호화하는 mRNA 서열의 274번째 염기를 암호화하는 DIO2 유전자상의 A가 G로 변화) 동형접합체 SNP 및 TSHR(Thyroid Stimulating Hormone Receptor) 유전자의 C.1349G>A(TSHR 단백질을 암호화하는 mRNA 서열의 1349번째 염기를 암호화하는 TSHR 유전자상의 A가 G로 변화)의 이형접합체 기능상실(loss-of-function) 돌연변이를 가지고 있는 경우, 갑상선 자극 호르몬(Thyroid stimulating hormone; TSH)에 의한 DIO2 단백질의 발현 및 활성화가 현저히 억제되어 있음을 확인하였고, 이로 인해 T4를 T3로 전환 시키는 능력이 감소되어 L-T4(Levothyroxine)만을 투여하는 단독 요법 외에 L-T3(liothyronine)를 함께 투여하는 병용처방이 필요한 갑성기능저하증환자를 진단하는 것이 갑상선기능저하증 치료에 매우 중요함을 확인함으로써, 상기 DIO2 유전자의 SNP 및 TSHR 돌연변이는 T4(Levothyroxine)와 L-T3(liothyronine)의 병용투여가 필요한 갑상선기능저하증 환자 진단에 유용하게 이용될 수 있다.

도 1a은 갑상선기능저하증 환자 A와 그 가족의 가계도 및 갑상선 기능 검사결과, DIO2 C.274A>G SNP, DIO2 활성 및 TSHR 유전자 돌연변이를 나타낸 도이다.
도 1b는 갑상선기능저하증 환자 A의 염기서열 분석 결과에 따른 DIO2 유전자의 SNP 및 TSHR 유전자의 돌연변이를 나타낸 도이다:
TSHR R450H: C.1349G>A(TSHR 단백질을 암호화하는 mRNA 서열의 1349번째 염기를 암호화하는 TSHR 유전자상의 A가 G로 변화); 및
DIO2 T92A: C.274A>G(DIO2 단백질을 암호화하는 mRNA 서열의 274번째 염기를 암호화하는 DIO2 유전자상의 A가 G로 변화).
도 1c는 갑상선기능저하증 환자 A의 갑상선 호르몬 수치를 나타낸 도이다.
도 2a는 인간 뇌하수체 조직에서 TSHR을 면역화학염색으로 확인한 도이다.
도 2b는 C2C12 세포, TaT1 세포 및 프라이머리 섬유아세포에서 발현되는 DIO2 및 TSHR 단백질의 발현을 나타낸 도이다.
도 3a은 TaT1 세포 및 프라이머리 섬유아세포에서 TSH 또는 T4 처리에 따른 TSHR 및 DIO2 단백질의 발현을 나타낸 도이다:
TSH: TSH 무처리(0), 1, 10IU 처리 및
T4: T4 무처리(0), 20, 100pM 처리.
도 3b는 동형접합성 DIO2 유전자(C.274A>G) SNP 및 이형접합성 TSHR 돌연변이 유전자(C.1349G>A)를 가진 갑상선기능저하증 환자의 섬유아세포에서 TSH 처리에 따른 DIO2 mRNA 발현 및 상대적 DIO2 활성 변화를 측정한 도이다.
WT(DIO2 WT/WT, TSHR WT/WT): 섬유아세포의 정상 DIO2 및 정상 TSHR 유전자 타입;
Hetero(DIO2 WT/VT, TSHR WT/WT): 섬유아세포의 이형접합성 DIO2 유전자(C.274A>G) 및 정상 TSHR 유전자 타입;
Hemo(DIO2 VT/VT, TSHR WT/WT): 섬유아세포의 동형접합성 DIO2 유전자(C.274A>G) 및 정상 TSHR 유전자 타입; 및
Patient(DIO2 VT/VT, TSHR WT/MT): 섬유아세포의 동형접합성 DIO2 유전자(C.274A>G) 및 이형접합성 TSHR 돌연변이 유전자(C.1349G>A) 타입.
도 4a는 동형접합성 DIO2 유전자(C.274A>G) SNP 및 이형접합성 TSHR 돌연변이 유전자(C.1349G>A)를 가진 갑상선기능저하증 환자의 섬유아세포에서 cAMP 처리에 의한 상대적 DIO2 mRNA 발현을 나타낸 도이다.
도 4b는 동형접합성 DIO2 유전자(C.274A>G) SNP 및 이형접합성 TSHR 돌연변이 유전자(C.1349G>A)를 가진 갑상선기능저하증 환자의 섬유아세포에서 TSH 자극에 따라 생성된 cAMP 량을 측정한 도이다.

이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.

본 발명은 DIO2(type 2 iodothyronine deiodinase) 단백질을 암호화하는 서열번호 1로 구성된 폴리뉴클레오타이드에 있어서 274번째에 위치하는 염기가 A에서 G로 바뀐 단일염기다형성(C.274A>G)을 포함하는 10 내지 100개의 연속된 염기를 포함하는 폴리뉴클레오타이드 또는 이의 상보적 폴리뉴클레오타이드, 및 TSHR(Thyroid Stimulating Hormone Receptor) 단백질을 암호화하는 서열번호 2로 구성된 폴리뉴클레오타이드에 있어서 1349번째에 위치하는 염기 G가 A로 바뀐 돌연변이(C.1349G>A)를 포함하는 10 내지 100개의 연속된 염기를 포함하는 폴리뉴클레오타이드 또는 이의 상보적 폴리뉴클레오타이드를 포함하는, L-T4(Levothyroxine)와 L-T3(liothyronine)의 병용투여가 필요한 갑상선기능저하증 환자 진단용 마이크로어레이를 제공한다.

상기 연속된 염기는 10 내지 70개의 연속된 염기인 것이 더욱 바람직하나 이에 한정하지 않는다.

상기 마이크로어레이는 프로브 폴리뉴클레오티드에 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것을 제외하고는 통상적인 마이크로어레이로 이루어진다. 프로브 폴리뉴클레오티드를 기판상에 고정화하여 마이크로어레이를 제조하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있다. 상기 “프로브 폴리뉴클레오티드”는 혼성화할 수 있는 폴리뉴클레오티드를 의미하는 것으로, 핵산의 상보성 가닥에 서열 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드를 의미한다. 이러한 프로브에는 문헌(Nielsen 등, Science, 254, 1497-1500(1991))에 기재된 펩티드 핵산을 포함한다. 본 발명의 프로브는 대립형질 특이적 프로브로서, 같은 종의 두 구성원으로부터 유래한 핵산 단편 중에 다형성 부위가 존재하여, 한 구성원으로부터 유래한 DNA 단편에는 혼성화하나, 다른 구성원으로부터 유래한 단편에는 혼성화하지 않는다. 이 경우 혼성화 조건은 대립형질간의 혼성화 강도에 있어서 유의한 차이를 보여, 대립형질 중 하나에만 혼성화 하도록 충분히 엄격해야 한다. 이렇게 함으로써 다른 대립형질성 형태 간에 좋은 혼성화 차이를 유발할 수 있다. 본 발명의 상기 프로브는 대립형질을 검출하기 위한 진단 방법 등에 사용될 수 있다. 상기 진단 방법에는 서던 블롯트 등과 같은 핵산의 혼성화에 근거한 검출방법들이 포함되며, DNA 칩을 이용한 방법에서 DNA 칩의 기판에 미리 결합된 형태로 제공될 수도 있다. 상기 혼성화란 엄격한 조건, 예를 들면 1M 이하의 염 농도 및 25℃ 이상의 온도하에서 보통 수행될 수 있다. 예를 들면, 5x SSPE (750 mM NaCl, 50 mM Na Phosphate, 5 mM EDTA, pH 7.4) 및 25∼30 ℃의 조건이 대립형질 특이적 프로브 혼성화에 적합할 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 마이크로어레이를 포함하는 L-T4(Levothyroxine)와 L-T3(liothyronine)의 병용투여가 필요한 갑상선기능저하증 환자 진단용 키트를 제공한다.

또한, 본 발명은 DIO2(type 2 iodothyronine deiodinase) 단백질을 암호화하는 서열번호 1로 구성된 폴리뉴클레오타이드에 있어서 274번째에 위치하는 염기가 A에서 G로 바뀐 단일염기다형성(C.274A>G) 및 TSHR(Thyroid Stimulating Hormone Receptor) 단백질을 암호화하는 서열번호 2로 구성된 폴리뉴클레오타이드에 있어서 1349번째에 위치하는 염기 G가 A로 바뀐 돌연변이(C.1349G>A)를 검출할 수 있는 상보적인 프로브 또는 프라이머 세트를 포함하는, L-T4(Levothyroxine)와 L-T3(liothyronine)의 병용투여가 필요한 갑상선기능저하증 환자 진단용 키트를 제공한다.

상기 키트는 상기 프라이머 증폭에 필요한 시약을 포함할 수 있고, 이를 위하여 핵산의 증폭에 필요한 시약을 더 포함할 수 있으며, 이때, 상기 핵산은 검출가능한 표지로 표지될 수 있다. 또한, 상기 검출 가능한 표지로는 스트렙타비딘-알칼리 탈인화효소 접합물질(streptavidin-like phosphatease conjugate), 화학형광물질(chemiflurorensce) 및 화학발광물질(chemiluminescent)로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 추가적으로 포함하여 혼성화하는 것이 바람직하나 이에 한정하지 않는다. 또한, 상기 혼성화는 완충용액, 역전사효소(reverse transcriptase), dNTP, rNTP(사전혼합형 또는 분리공급형), 표식시약, 및 세척 완충용액으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 추가적으로 포함하는 것이 바람직하나 이에 한정하지 않는다. 또한, 상기 프라이머는 표적 부위인 상기 SNP를 증폭할 수 있고, 크기 및 주형에 결합하는 위치가 제한되지 않으며, 당업자라면 통상의 프라이머 선정용 소프트웨어를 이용하여 용이하게 프라이머의 고안이 가능할 수 있다.

상기 갑상선기능저하증 환자 진단용 키트는 당업자에게 알려져있는 통상적인 방법으로 제조될 수 있다. 상기 적절한 프라이머 세트는 본 발명의 서열을 참조하여 당업자가 용이하게 설계할 수 있다. 본 명세서에서, 용어 "프로브"는 특정 뉴클레오타이드 서열에 혼성화될 수 있는 디옥시리보뉴클레오타이드 및 리보뉴클레오타이드를 포함하는 자연 또는 변형되는 모노머 또는 결합을 갖는 선형의 올리고머를 의미한다. 바람직하게는, 프로브는 혼성화에서의 최대 효율을 위한 단일가닥이다. 프로브는 바람직하게는 디옥시리보 뉴클레오타이드이다.

상기 키트에 추가적으로 형광물질을 포함할 수 있으며, 상기 형광물질은 스트렙아비딘-알칼리 탈인화효소 접합물질(strepavidin-like phosphatease conjugate), 화학형광물질(chemiflurorensce) 및 화학발광물질(chemiluminescent)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 키트에 추가적으로 반응 시약을 포함시킬 수 있으며, 상기 반응 시약은 혼성화에 사용되는 완충용액, RNA로부터 cDNA를 합성하기 위한 역전사효소, cNTPs 및 rNTP(사전 혼합형 또는 분리 공급형), 형광 염색제의 화학적 유도제와 같은 표식시약, 세척 완충용액 등으로 구성될 수 있으나 이에 한정된 것은 아니며, 당업자에게 알려진 DNA 마이크로어레이 칩의 혼성화 반응에 필요한 반응 시약은 모두 포함시킬 수 있다.

또한, 본 발명은

상기 단계 2)에서 TSHR(C.1349G>A) 단백질 발현 및 DIO2(C.274A>G) 단백질 발현은 변이 단백질 특이적인 항체를 사용하여 측정되는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않으며, 상기 시료는 머리카락, 혈액, 조직, 세포, 혈청, 혈장, 타액, 객담 및 소변으로 구성된 군으로부터 선택되는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

상기 방법에 있어서, 피검체로부터 분리된 시료로부터 게놈 DNA를 추출하는 단계는 당업계에 알려진 방법을 통해서 수행될 수 있다. 예컨데, 관심 DNA가 세포에 있을 때 순수한 DNA를 제조하기 위하여 먼저 세포 추출물을 제조한 다음, 차등 침강(differential precipitation), 칼럼 크로마토그래피, 유기용매 추출 등을 더 수행할 수 있고, 상기 추출물은 해당 기술분야의 표준기술에 의해서 제조될 수 있다. 상기와 같은 방법으로 세포 또는 조직으로부터 분리한 DNA는 직접적으로 정제하거나 PCR 또는 RT-PCT(real time PCR)과 같은 증폭 방법을 사용하여 특정 영역을 특이적으로 증폭하고 이를 분리함으로써 이루어질 수 있으나 이에 한정하지 않는다. 상기 DNA는 DNA뿐만 아니라 mRNA로부터 합성되는 cDNA도 포함한다. 또한, PCR 또는 RT-PCR은 개체의 전체 DNA 서열에 대해 수행될 수도 있지만, 단일염기다형성으로 알려져 있는 부위 주변만에 대해서도 수행될 수 있다.

상기 방법에 있어서, 분리된 DNA의 염기서열의 결정은 당업계에 알려진 다양한 방법에 의해 이루어질 수 있다. 예를 들면, 디데옥시법에 의하여 직접적인 DNA의 뉴클레오티드 서열의 결정을 통하여 이루어지거나 단일염기다형성 부위의 서열을 포함하는 프로브 또는 그에 상보적인 프로브를 상기 DNA와 혼성화시키고 그로부터 얻어지는 혼성화 정도를 측정함으로써 다형성 부위의 뉴클레오티드 서열을 결정하는 방법 등이 이용될 수 있다. 상기 혼성화의 정도는 검출가능한 표지를 표적 DNA에 표지하여, 혼성화된 표적 DNA만을 특이적으로 검출함으로써 이루어질 수 있으나, 그 외 전기적 신호검출방법 등이 사용될 수 있다. 구체적으로, 마이크로어레이(microarray)에 의한 혼성화, 대립유전자 특이적 탐침 혼성화(allele-specific hybridization), 대립유전자 특이적 증폭(allele-specific amplification), 서열분석(sequencing), 5' 뉴클라아제 분해(5' nuclease digestion), 분자 비콘어세이(molecular beacon assay), 올리고뉴클레오티드 결합 어세이(oligonucleotide ligation assay), 크기분석(size analysis) 및 단일가닥 배좌 다형성(single-stranded conformation polymorphism)으로 구성된 군으로부터 선택되는 것이 바람직하나 이에 한정하지 않는다.

아울러, 본 발명은

2) N-말단으로부터 450번째 아미노산인 아르기닌(R)이 히스티딘(H)으로 변화(C.1349G>A)된 TSHR(Thyroid Stimulating Hormone Receptor) 단백질 및 N-말단으로부터 92번째 아미노산인 트레오닌(T)이 알라닌(A)으로 변화(C.274A>G)된 DIO2(type 2 iodothyronine deiodinase) 단백질을 검출하는 단계를 포함하는 L-T4(Levothyroxine)와 L-T3(liothyronine)의 병용투여가 필요한 갑상선기능저하증 환자 진단에 필요한 정보제공 방법을 제공한다.

상기 단계 2)에서 TSHR(C.1349G>A) 단백질 발현 및 DIO2(C.274A>G) 단백질 발현은 변이 단백질 특이적인 항체를 사용하여 측정되는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

상기 시료는 머리카락, 혈액, 조직, 세포, 혈청, 혈장, 타액, 객담 및 소변으로 구성된 군으로부터 선택되는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명자들은 갑상선기증저하증 환자의 DIO2 및 TSHR 유전자 변이를 분석한 결과 TSHR cDNA 서열의 1349번째 염기에 상응하는 게놈 DNA상의 G염기가 하나의 대립형질 유전자에서 A로 돌연변이가 일어나 있었으며(heterozygous mutation for TSHR C.1349G>A) 또한 DIO2 cDNA 서열의 274번째 염기에 상응하는 게놈 DNA상의 A염기가 G로 변화된 SNP(Single Nucleotide Polymorphism)를 두 개의 대립형질 유전자 모두에 지니고 있음(homozygous SNP for DIO2 C.274A>G)을 확인할 수 있었다(도 1b 참조). 상기 TSHR 유전자의 C.1349G>A 돌연변이로 인해 N-말단으로부터 450번째 아미노산인 아르기닌(R)은 히스티딘(H)으로 변화(R450H)되며, DIO2 유전자의 C.274A>G SNP로 인해 N-말단으로부터 92번째 아미노산인 트레오닌(T)은 알라닌(A)으로 변화(T92A)된다.

이에, 본 발명자들은 인간 뇌하수체 조직에서 TSHR 단백질 발현을 조사하기 위해 인간 뇌하수체 조직 슬라이드 샘플을 이용해 면역화학염색을 수행한 결과 인간 뇌하수체 조직에서 TSHR 단백질이 발현됨을 확인하였다(도 2a 참조). 또한, 다양한 세포주 및 프라이머리 피부 섬유아세포에서도 DIO2 및 TSHR 단백질 발현을 조사한 결과, C2C12 세포주, TαT1 세포뿐 아니라 프라이머리 피부 섬유아세포에서 모두 DIO2 단백질과 TSHR 단백질이 발현됨을 확인하였다(도 2b 참조).

또한, 본 발명자들은 TSHR 유전자의 C.1349G>A 돌연변이 및 DIO2 유전자의 C.274A>G SNP에 따른 DIO2 활성 변화를 확인하고자 하였다. 우선 TSH 또는 T4의 처리에 따른 TaT1 세포주 및 IMR90 섬유아세포에서 TSHR 및 DIO2 단백질의 발현 변화를 조사항 결과, TSH를 처리한 군(TaT1 및 섬유아세포) 에서 그 농도의존적으로 TSHR이 감소한 반면, DIO2의 단백질 발현이 증가됨을 확인하였다. 반면에 T4를 처리한 군(TaT1 및 섬유아세포)에서는 T4 농도의존적으로 TSHR 및 DIO2 모두 그 단백질 발현이 감소됨을 확인하였다(도 3a 참조). 또한, 갑상선기능저하증 환자의 피부 섬유아세포에서 TSH 처리에 따른 DIO2 mRNA 발현 및 DIO2 활성 변화 확인한 결과, DIO2 유전자의 T92A SNP 존재여부와 무관하게 TSHR 유전자가 WT인 섬유아세포에서 TSH 자극에 의해 DIO2 mRNA 발현 및 DIO2 활성은 증가하였으나, 갑상선기능저하증 환자 A 유래의 섬유아세포(heterozygous TSHR R450H + homozygous DIO2 T92A)에서는 DIO2 mRNA 발현 및 활성이 크게 증가하지 않음을 확인하였다(도 3b 참조).

또한, 본 발명자들은 갑상선기증저하증 환자 유래 섬유아세포에서 TSH에 의한 cAMP의 생성 조절을 확인하고자 하였다. TSH 처리에 의한 유전형에 따른 DIO2의 활성변화가 TSHR의 돌연변이에 따른 cAMP 합성 정도와 관련이 있는지를 조사하였다. DIO2 유전자의 프로모터에는 cAMP-반응요소(cAMP response element)가 포함되어 있어서, TSH 자극 없이 cAMP 처리만으로도 DIO2의 발현을 유도할 수 있다. DIO2 유전자의 mRNA 발현은 조사된 세포에서 DIO2 유전자의 SNP 존재나 TSHR 유전자의 변이 여부에 상관없이 모두 cAMP 처리에 의해 현저하게 증가하는 것을 알 수 있었다(도 4a 참조). 또한, TSH 처리시 DIO2 유전자의 SNP, TSHR 유전자의 돌연변이 유무에 따른 cAMP의 합성 정도를 확인한 결과, 갑상선기능저하증 환자(heterozygous TSHR R450H + homozygous DIO2 T92A) 유래의 세포의 경우 다른 세포와 달리 TSH에 의한 cAMP의 합성이 저해됨을 확인할 수 있었다(도 4b 참조). 이는 도 3c에서의 TSH에 의한 DIO2의 mRNA 발현 및 활성 변화 결과와 상응하는 것으로 TSH 처리시 갑상선기능저하증 환자의 섬유아세포에서 충분한 cAMP가 생성되지 않는 것이 DIO2 mRNA 수준 및 활성이 증가하지 않은 하나의 원인임을 제시한다.

따라서, DIO2(type 2 iodothyronine deiodinase) 유전자의 C.274A>G(DIO2 단백질을 암호화하는 mRNA 서열의 274번째 염기를 암호화하는 DIO2 유전자상의 A가 G로 변화) 동형접합체 SNP 및 TSHR(Thyroid Stimulating Hormone Receptor) 유전자의 C.1349G>A(TSHR 단백질을 암호화하는 mRNA 서열의 1349번째 염기를 암호화하는 TSHR 유전자상의 A가 G로 변화)의 이형접합체 기능상실(loss-of-function) 돌연변이를 가지고 있는 경우, 갑상선 자극 호르몬(Thyroid stimulating hormone; TSH)에 의한 DIO2 단백질의 발현 및 활성화가 현저히 억제되어 있음을 확인, 상기 DIO2 유전자의 SNP 및 TSHR 돌연변이는 L-T3의 병행 투여가 필요한 갑상선기능저하증 환자 진단에 유용하게 이용될 수 있다.

이하, 본 발명을 하기 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용을 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

갑상선기능저하증 환자 및 환자 가족의 갑상선기능 검사 및 유전자 분석

<1-1> 갑상선 기능저하증환자(A) 및 그 가족의 유전자 가계도

68세 한국인 남성(도 1a에서 I-1)은 갑상선 기능 저하증으로 3차 진료기관을 내방하였다. 이 환자는 주요 증상은 3개월간의 식욕부진과 체중증가였다. 지역 병원에서 측정되었던 최초 혈청 내 갑상선 자극 호르몬(Thyroid stimulating hormone; TSH)은 85.50 mIU/L (0.27-4.20), 유리 T4 (free T4, fT4)는 0.16 ng/dL (0.93-1.70)이었다. 이 환자는 3개월 동안 매일 L-T4 100㎍을 섭취하도록 처방되었고 약물 섭취를 통해 갑상선 기능 저하증과 관련된 증상은 개선되었지만 혈청 TSH 수준은 상기 치료를 통해 억제되지 않았다(도 1c).

이에 갑상선 기능과 갑상선 자가 항체 검사를 수행한 결과, TSH 98.74 mIU/L, fT4 1.10 ng/dL, T3 64.93 ng/dL (80.00-200.00), Tg antibody 114.8 IU/mL (0.0-115.0), TPO antibody 16.34 IU/mL (0.00-34.00), 및 TSH-receptor antibody 3.0 IU/L (0.0-1.5)로 나타났다. 처음에 이호항체(heterophile antibody) 간섭으로 인해 혈중 TSH 레벨에 대한 면역학적 분석이 잘못된 것으로 생각되었지만 상기 간섭현상에 대한 3가지 검사는 모두 음성이었다. 이에 하루에 L-T4 100㎍ 대신 L-T3 30㎍을 하루 세 번 투여하자, 혈중 TSH 레벨이 5.53 mIU/L으로 급격히 감소되었다. 따라서 L-T4와 함께 L-T3가 처방되었고, 환자의 갑상선 기능은 5년간 정상 범위를 유지하였다(도 1c).

상기 환자의 장남(II-1)은 무증상 갑상선기능저하증을 가지고 있었고 갑상선 기능 검사결과, TSH 4.97 mIU/L, fT4 1.41 ng/dL, T3 103.00 ng/dL, Tg antibody 16.3 IU/mL, TPO antibody 16.4 IU/mL, 및 TSH-receptor antibody 0.8 IU/L로 나타났다. 그 환자의 며느리(II-2)는 정상 갑상선 기능을 나타내었으나, 갑상선 질병에 대한 항체가 양성으로 나타났고 그 검사결과는 TSH 2.78 mIU/L, fT4 0.99 ng/dL, T3 112.50 ng/dL, Tg antibody 55.7 IU/mL, TPO antibody 294.2 IU/mL, 및 TSH-receptor antibody 2.5 IU/L로 나타났다. 환자의 딸(II-4), 막내 아들(II-5)은 둘다 무증상 갑상선기능저하증이었고, 환자의 손자(III-1)는 선천성 갑상선기능저하증으로 L-T4를 복용하고 있었다. 또한, 손자의 TSH는 L-T4의 투여로 적절하게 억제되어 있었는데 이는 정상적인 DIO2(type 2 iodothyronine deiodinase) 활성을 가지고 있음을 의미한다.

도 1a는 환자 A 및 그 가족의 DIO2 활성, TSHR(Thyroid Stimulating Hormone Receptor) 및 DIO2의 유전자의 대립유전자 유전자형(genotype)을 표시한 유전자 가계도 및 갑상선 기능 검사 결과를 나타낸 도이다. 혈액 내 TSH, free T4와 T3, TPO 항체, Tg 항체, TSHR 항체 레벨을 면역화학발광법(immunochemiluminescence)에 의해 측정하였으며, 혈청 셀레늄은 plasma - mass spectrometry로 측정하였다.

<1-2> 갑상선 기능저하증 환자(B)

잘 분화된 유두상 갑상선암에 걸린 적이 있는 42세의 한국인 남자는 갑상선절제술 및 경부림프절 근치술(radical neck node dessection) 시술을 받았다. 갑상선 악성 종양이 다수의 림프노드에서 발견되었기 때문에, 방사선 요오드(radioactive iodine ablation, 100 mCi) 또한 투여되었다. L-T4를 단계적으로 250㎍ 까지 증가시켰음에도 증가된 TSH를 억제하지 못했기 때문에 갑상선중독 증상(thyrotoxic symptom)을 막기 위해 L-T4의 투여량은 100㎍까지 감소시키고 하루에 두 번 L-T3 30㎍을 투여하였다. 이후 TSH 레벨은 정상 범위내로 감소하였다(표 1).

<1-3> 갑상선 기능저하증 환자(C)

75세의 여자 환자는 20대 초반 이래로 거대한 갑상선종(직경 10cm)을 호소하고 있다. 이 환자의 갑상선 기능 테스트 결과는 극도로 높은 TSH 레벨, 높은 fT4 레벨 및 상대적으로 낮은 T3 레벨을 보여주었다(갑상선중독 증상 없이 TSH 82 mIU/L, fT4 >7.70 ng/dL, T3 64 ng/dL). 하루에 두 번 L-T3 30㎍을 투여하였을 때, 갑상선종 크기는 현저하게 줄어들었으며 fT4의 레벨은 별 차이가 없었으나 TSH 레벨은 감소하였고 T3의 레벨은 증가하였다(표 2A). 갑상선 자극 호르몬 방출 호르몬(Thyrotropin-releasing hormone; TRH) 자극 테스트 결과는 비정상적으로 증가된 TSH가 RTH 또는 TSH를 분비하는 뇌하수체 선종(pituitary adenoma) 때문에 의한 것은 아님을 보여주었다.

<1-4> 갑상선기증저하증 환자의 DIO2 및 TSHR 유전자 분석 결과

상기 환자들에 대해서 TSHR 및 DIO2 유전자의 변이를 분석하였다. 구체적으로 유전자 분석을 위해서 혈액 시료부터 표준 추출방법으로 gDNA를 분리하고, 전체 엑솜 염기서열분석(whole exome sequencing)을 수행하였다. Pre-enrichment DNA library는 Illumina TrueSeq DNA의 시료준비지침(Illumina TrueSeq DNA sample preparation guide, Illumina, Inc., San Diego, CA, USA)에 따라 수행하여 준비하였다. Exome enrichment는 Illumina TrueSeq Exome Enrichment probes 및 스트렙타비딘 비즈(streptavidin beads)를 사용하여 수행하였다. 상기 enriched exome library는 클러스터 형성을 위한 Illumina cBot에 로드되었고, 그 enriched exome libraries의 클러스터를 가진 유세포는 Illumina HiSeq2000fh 옮겨진 후 약 40배의 평균시퀀싱뎁스(average sequecing depth)를 만족시키도록 각각의 캡쳐된 라이브러리에 대해 고효율시퀀싱(high-throughput sequencing)을 수행하였다. TSHR 돌연변이 및 DIO2 SNP는 Sanger seqencing 방법으로도 확인하였다. gDNA는 하기의 서열번호 3 및 서열번호 4로 기재되는 TSHR 유전자의 엑손(exon)에 대한 프라이머와 하기의 서열번호 5 및 서열번호 6으로 기재되는 DIO2 유전자의 엑손(exon)2에 대한 프라이머를 이용해서 PCR(중합효소연쇄반응)을 수행하였고 PCR 반응 산물은 ABI 3500xL DNA Analyzer로 분석하였다.

그 결과 환자 A는(도 1a의 I-1) 서열번호 2로 기재되는 TSHR cDNA 서열의 1349번째 염기에 상응하는 게놈 DNA상의 G 염기가 하나의 대립형질 유전자에서 A로 돌연변이가 일어나 있었으며(heterozygous mutation for TSHR C.1349G>A) 또한 서열번호 1로 기재되는 DIO2 cDNA 서열의 274번째 염기에 상응하는 게놈 DNA상의 A 염기가 G로 변화된 SNP(Single Nucleotide Polymorphism)를 두 개의 대립형질 유전자 모두에 지니고 있음(homozygous SNP for DIO2 C.274A>G)을 확인할 수 있었다(도 1B). 상기 TSHR 유전자의 C.1349G>A 돌연변이로 인해 N-말단으로부터 450번째 아미노산인 아르기닌(R)은 히스티딘(H)으로 변화(R450H)되며, DIO2 유전자의 C.274A>G SNP로 인해 N-말단으로부터 92번째 아미노산인 트레오닌(T)은 알라닌(A)으로 변화(T92A))된다.

환자 B 및 C 또한 상기 DIO2유전자의 C.274A>G SNP를 두 개의 대립형질 유전자 모두에 지니고 있었으나(homozygous SNP for DIO2 C.274A>G), TSHR 유전자의 경우에는 하나의 대립 유전자(heterozygous)에서 그 단백질 서열을 변화시킬 수 있는 염기서열 변화를 확인할 수 있었다(환자 B는 D727E(GAC>GAG), 환자 C는 F525S(TTC>TCC)).

	서열	서열번호
TSHR exon 프라이머(F)	5'-CTGGGCAATGTCTTTGTCCTGCTTATTC-3'	서열번호 3
TSHR exon 프라이머(R)	5'-TATGTGTTGGGGGTGTCATGGGATTG-3'	서열번호 4
DIO2 exon2 프라이머(F)	5'-TGTGAATTCAAGTGGCAATG-3'	서열번호 5
DIO2 exon2 프라이머(R)	5'-CCAATAGGGCTCTGTTGAAA-3'	서열번호 6

인간 뇌하수체 조직 및 세포주( C2C12 세포 및 TaT1 세포), 피부 섬유아세포(프라이머리 세포)에서 TSHR 단백질 발현

TSH에 의한 시상 하부 - 뇌하수체 - 갑상선 (HPT) 축에 의해 음성 조절에서 DIO2의 역할은 잘 알려져 있다. 이와 관련, DIO2 및 TSHR은 인간 뇌하수체, 마우스 갑상샘자극세포 TαT1 세포에서 함께 발현되는 것으로 알려져 있으며 또한 DIO2 및 TSHR은 여러 세포, 특히 마우스 근원세포(myoblast) C2C12 세포, 인간 조골세포(osteoblast) 및 인간 섬유아세포(fibroblast)에서도 함께 발현되는 것으로 보고되었다. 이에 본 발명에서도 이를 확인하고자 하였다.

<2-1> 인간 뇌하수체 조직에 존재하는 TSHR 확인

인간 뇌하수체 조직에서 TSHR 단백질 발현을 조사하기 위해 인간 뇌하수체 조직 슬라이드 샘플을 이용해 면역화학염색을 수행하였다.

구체적으로 인간 뇌하수체 조직을 차가운 4% 파라포름알데하이드(paraformaldehyde in 0.1M PBS, pH 7.4)로 고정(fixing)하고, 파라핀 블록을 제조한 후, 4-5㎛ 섹션을 유리 슬라이드에 마운팅한 후 탈파라핀과 탈수분처리를 수행하였다(xylene에 5분간 3회, 100% ethanol에 10분간 2회, 95% ethanol에 10분간 2회, 70% ethanol에 10 분간 2회 및 물에 5분간 2회 슬라이드를 처리). 준비된 조직 슬라이드 샘플은 DIO2 또는 TSHR에 대한 1차 항체를 (DIO2 항체(1:1000 희석, Abcam) 및 TSHR 항체(1:250희석, Abbiotec))를 실온에서 2시간 처리하고 PBS로 세척한 뒤, 2차 항체인 FITC goat anti-rabbit IgG 항체(1:500 희석, Invitrogen)를 실온에서 한 시간 처리, DAPI 염색을 수행한 후 형광현미경으로 관찰하였다.

그 결과, 도 2a에서 나타난 바와 같이 인간 뇌하수체 조직에서 TSHR 단백질이 발현됨을 확인하였다.

<2-2> 세포주( C2C12 세포 및 TαT1 세포) 및 피부 섬유아세포에서 DIO2 및 TSHR 단백질 발현

상기 실시예 <2-1>의 조직 이외에 다양한 세포주 및 프라이머리 피부 섬유아세포에서도 DIO2 및 TSHR 단백질 발현을 조사하였다.

구체적으로 C2C12 세포, TαT1 세포 및 프라이머리 피부 섬유아세포를 각각 2×10⁴ cells/well (6 well plate)로 분주하고 24시간 배양 후 세포를 회수 하였다. RIPA 버퍼((150 mM NaCl, 1% Nonidet P-40, 0.5% sodium deoxycholate, 0.1% SDS, and 50 mM Tris buffer, pH 8.0)로 용해(lysis)시켜 수득한 단백질을 12% polyacrylamide gel에서 전기영동(SDS-PAGE)후, PVDF 막(membrane)에 blotting하였다. 상기 PVDF막을 5% BSA로 1시간 블로킹하고, 항-DIO2 항체(1:2000, Abcam), 항-TSHR 항체(1:1500, Abbiotec) 및 항-액틴 항체(1:2000, Abcam)로 밤새 반응시킨 뒤, 0.1% Tween-20이 포함된 PBS로 세척하고, 다시 실온에서 한 시간 동안 2차 항체를 처리한 후 WEST-ZOL plus ECL Western blotting detection system(iNtRON BioTechnology)으로 각각의 단백질 발현정도를 확인하였다.

그 결과, 도 2b에서 나타난 바와 같이 C2C12 세포주, TαT1 세포뿐 아니라 프라이머리 피부 섬유아세포에서 모두 DIO2 단백질과 TSHR 단백질이 발현됨을 확인하였다.

TSHR 유전자의 C.1349G>A 돌연변이 및 DIO2 유전자의 C.274A>G SNP에 따른 DIO2 활성 변화

<3-1> TSH 또는 T4 처리시 TαT1 세포 및 섬유아세포에서 TSHR 및 DIO2 단백질의 발현 확인

본 발명자들은 TSH 또는 T4의 처리에 따른 TaT1 세포주 및 IMR90 섬유아세포에서 TSHR 및 DIO2 단백질의 발현 변화를 조사하기 위해 웨스턴 블랏(western blot)을 수행하였다.

구체적으로 TaT1 세포 및 프라이머리 피부 섬유아세포를 각각 2×10⁴ cells/well (6 well plate)로 분주하고 24시간 배양 후, 다시 무혈청 배지에서 18시간 배양하였다. 이후 TSH(1, 10IU)는 8시간 동안 또는 T4(20, 100pM)는 16시간 처리하고 상기<2-2>에서 기재한 방법과 같이 웨스턴 블랏(wkestern blot)을 수행하였다.

그 결과, 도 3a에서 나타난 바와 같이 TSH를 처리한 군(TaT1 및 섬유아세포) 에서 그 농도의존적으로 TSHR이 감소한 반면, DIO2의 단백질 발현이 증가됨을 확인하였다. 반면에 T4를 처리한 군(TaT1 및 섬유아세포)에서는 T4 농도의존적으로 TSHR 및 DIO2 모두 그 단백질 발현이 감소됨을 확인하였다.

<3-2> 갑상선기능저하증 환자의 피부 섬유아세포에서 TSH 처리에 따른 DIO2 mRNA 발현 및 DIO2 활성 변화 확인

최근 소아그룹에서 증가된 TSH가 T3/T4 및 T4의 T3로의 변환과 관련성이 있음이 보고되었는데 이는 DIO2를 통한 T4의 T3로의 변환에 있어 TSH가 기능함을 제시한다. 이에 본 발명자들은 TSH 자극에 따른 DIO2 mRNA 발현 및 DIO2 활성 변화를 조사하였다.

구체적으로 갑상선기능저하증 환자(heterozygous TSHR C.1349G>A + homozygous DIO2 )와 대조군(Wild type (WT) (TSHR WT + DIO2 WT), Hetero (TSHR WT + heterozygous DIO2 C.274A>G), Homo (TSHR WT + homozygous DIO2 C.274A>G)에서 적출한 피부 조직을 매우 미세하게 절단하고 PBS로 세척한 뒤, 40% FBS가 함유된 DMEM 배양액에 넣고 일주일에 한번씩 배지를 교체하면서 배양하였다. 상기 세포들을 15% FBS와 페니실린(100U/mL)과 스트렙토마이신(100ug/mL)을 포함하는 DMEM 배양액으로 바꾸어 최대 10번까지 계대 배양하였다. 모든 배양 세포들은 5% CO₂와 37℃에서 배양하였고, 본 실험에서는 5번 내지 10번 계대배양한 세포들을 이용하였다. 상기의 방법으로 배양한 피부 섬유아세포에 각각 TSH 1 및 10IU(무처리 대조군 포함)를 처리하였으며, 실험군 별로 각각 3시간, 6시간 뒤, 상대적인 DIO2 mRNA 발현량과 DIO2 활성도를 측정하였다. mRNA 발현량 측정을 위해 상기 수득한 세포로부터 전체 RNA(total RNA)를 추출한 후 정량적 RT-PCR을 수행하였다. 전체 RNA는 트리졸(TRIzol, Invitrogen, USA) 시약을 이용하여 제조사의 프로토콜에 따라 추출하였다. RevertAid™ H Minus First Strand cDNA Synthesis Kit(Fermentas Inc., Hanover, USA)를 이용, 올리고 dT 프라이머로 추출된 RNA를 역전사하였으며, ABI Prism 7000 Sequence Detection System (Applied Biosystems, Foster City, USA)을 사용하여 실시간 정량적 RT-PCR을 수행하였다. 모든 PCR 증폭반응은 SYBR Green I qPCR 키트(TaKaRa, Shiga, Japan)를 사용하였으며, 150ng의 cDNA를 포함하는 25㎕의 전체볼륨에서 수행되었다. DIO2의 증폭을 위한 프라이머로는 하기의 서열번호 7 및 서열번호 8로 기재되는 5'-TCCAGTGTGGTGCATGTCTC-3'(Forward Primer) 및 5'-CTGGCTCGTGAAAGGAGGTC-3'(Reverse Primer)를 이용하였으며, 상대적인 발현량 비교를 위한 Gapdh 증폭을 위한 프라이머로는 하기의 서열번호 9 및 서열번호 10으로 기재되는 5'-TGTTGCCATCAATGACCCCTT-3'(Forward Primer) 및 5'-CTCCACGACGTACTCAGCG-3'(Reverse Primer)를 이용하였다. Gapdh의 발현량을 이용한 보정(normalization)은 제조자(Applied Biosystems)에 의한 comparative threshold (Ct) 방법으로 수행하였다. DIO2 활성 측정을 위해, 배지로부터 수득한 상기 피부 섬유아세포들을 차가운 PBS로 세척한 뒤, 원심분리(4C, 3000 rpm, 10분)하고, 상층액을 버린 pellet에 세포 용해버퍼(100 mm potassium phosphate, pH 7.0, containing 1 mm EDTA and 20 mm DTT)를 넣고 sonication 하여 일정량의 [125I]T4 또는 [125I]rT3와 반응시켰다. 100 μl 2% BSA and 800 μl 10% 트리클로로아세트산(trichloroacetic acid)를 넣어 반응을 종결시킨 뒤, 방출된 125I를 AG 50W-X2 레진을 이용한 컬럼 크로마토그라피에 의해 분리하고 125I량을 카운팅하였다. 탈요오드화 활성은 시간당 단백질의 mg 당 방출된 요오드의 femtomoles로 계산하였다.

그 결과, 도 3b에서 나타난 바와 같이 DIO2 유전자의 C.274A>G SNP 존재 여부와 무관하게 TSHR 유전자가 WT인 섬유아세포에서 TSH 자극에 의해 DIO2 mRNA 발현 및 DIO2 활성은 증가하였으나, 상기 실시예 <1-1>의 갑상선기능저하증 환자 A 유래의 섬유아세포(heterozygous TSHR C.1349G>A + homozygous DIO2 C.274A>G)에서는 DIO2 mRNA 발현 및 활성이 크게 증가하지 않음을 확인하였다.

	서열	서열번호
DIO2 증폭 프라이머(F)	5'-TCCAGTGTGGTGCATGTCTC-3'	서열번호 7
DIO2 증폭 프라이머(R)	5'-CTGGCTCGTGAAAGGAGGTC-3'	서열번호 8
Gapdh 증폭 프라이머(F)	5'-TGTTGCCATCAATGACCCCTT-3'	서열번호 9
Gapdh 증폭 프라이머(R)	5'-CTCCACGACGTACTCAGCG-3'	서열번호 10

갑상선기증저하증 환자 유래 섬유아세포에서 TSH에 의한 cAMP의 생성 조절

TSH에 의한 DIO2 유전자의 발현 조절은 TSHR 수용체 단백질의 활성화를 통해 합성된 cAMP에 의해 매개되는 것으로 알려져 있다. 이에, 상기 <실시예 3>에서 확인한 TSH 처리에 의한 유전형에 따른 DIO2의 활성변화가 TSHR의 돌연변이에 따른 cAMP 합성 정도와 관련이 있는지를 조사하였다.

<4-1> cAMP에 의한 DIO2 유전자 mRNA 발현 조절

DIO2 유전자의 프로모터에는 cAMP-반응요소(cAMP response element)가 포함되어 있어서, TSH 자극 없이 cAMP 처리만으로도 DIO2의 발현을 유도할 수 있다.

이에 먼저 프라이머리 피부 섬유아세포를 각각 2×10⁴ cells/well (6 well plate)로 분주하고 24시간 동안 배양하고, 다시 무혈청 배지에서 18시간 배양한 후 1mM db-CAMP(Sigma)를 16시간 처리하여 세포를 수득하였다. 이 세포로부터 전체 RNA(total RNA)를 추출한 후 정량적 RT-PCR을 수행하였다. 구체적으로 전체 RNA는 트리졸(TRIzol, Invitrogen, USA) 시약을 이용하여 제조사의 프로토콜에 따라 추출하였다. RevertAid™ H Minus First Strand cDNA Synthesis Kit(Fermentas Inc., Hanover, USA)를 이용, 올리고 dT 프라이머로 추출된 RNA를 역전사하였으며, ABI Prism 7000 Sequence Detection System (Applied Biosystems, Foster City, USA)을 사용하여 실시간 정량적 RT-PCR을 수행하였다. 모든 PCR 증폭반응은 SYBR Green I qPCR 키트(TaKaRa, Shiga, Japan)를 사용하였으며, 150ng의 cDNA를 포함하는 25㎕의 전체볼륨에서 수행되었다. DIO2의 증폭을 위한 프라이머로는 하기의 서열번호 7 및 서열번호 8로 기재되는 5'-TCCAGTGTGGTGCATGTCTC-3'(Forward Primer) 및 5'-CTGGCTCGTGAAAGGAGGTC-3'(Reverse Primer)를 이용하였으며, 상대적인 발현량 비교를 위한 Gapdh 증폭을 위한 프라이머로는 하기의 서열번호 9 및 서열번호 10으로 기재되는 5'-TGTTGCCATCAATGACCCCTT-3'(Forward Primer) 및 5'-CTCCACGACGTACTCAGCG-3'(Reverse Primer) Gapdh의 발현량을 이용한 보정(normalization)은 제조자(Applied Biosystems)에 의한 comparative threshold (Ct) 방법으로 수행하였다.

그 결과, 도 4a에 나타낸 바와 같이 DIO2 유전자의 mRNA 발현은 조사된 세포에서 DIO2 유전자의 SNP 존재나 TSHR 유전자의 변이 여부에 상관없이 모두 cAMP 처리에 의해 현저하게 증가하는 것을 알 수 있었다.

<4-2> TSH 처리시 DIO2 유전자의 SNP, TSHR 유전자의 돌연변이 유무에 따른 cAMP의 합성 조절

TSH 처리시 유전형에 따른 DIO2의 활성변화의 차이가 cAMP 합성 정도와 관련이 있는지를 조사하였다.

구체적으로 프라이머리 피부 섬유아세포를 각각 2×10⁴ cells/well (6 well plate)로 분주하고 24시간 동안 배양하고, 다시 무혈청 배지에서 18시간 배양한 후 TSH를 1IU로 30분 동안 처리하였다. cAMP 분석을 위해 먼저 상기 세포에 0.1N 염산(hydrochlric acid)을 처리, 세포내 포스포디에스터레이즈(phosphodiesterase) 활성을 억제하고, 세포를 깬(lysis) 후 상온에서 600g로 원심분리, 상층액(supernatant)을 수득하였다. cAMP는 cAMP direct immunoassay kit (Millpore)를 이용하여 제조자의 프로토콜에 따라 측정하였으며 총 세 번 반복하였다.

그 결과, 도 4b에 나타낸 바와 같이 갑상선기능저하증 환자(heterozygous TSHR C.1349G>A + homozygous DIO2 C.274A>G) 유래의 세포의 경우 다른 세포와 달리 TSH에 의한 cAMP의 합성이 저해됨을 확인할 수 있었다. 이는 도 3c에서의 TSH에 의한 DIO2의 mRNA 발현 및 활성 변화 결과와 상응하는 것으로 TSH 처리시 갑상선기능저하증 환자의 섬유아세포에서 충분한 cAMP가 생성되지 않는 것이 DIO2 mRNA 수준 및 활성이 증가하지 않은 하나의 원인임을 제시한다.

<110> Gachon University Gil Medical Center <120> Information providing method for drug treatment decisions of hypothyroidism patients by TSHR mutations and DIO2 T92A single nucleotide polymorphism detection <130> 2016P-07-055 <160> 10 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 5985 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 atgggcatcc tcagcgtaga cttgctgatc acactgcaaa ttctgccagt ttttttctcc 60 aactgcctct tcctggctct ctatgactcg gtcattctgc tcaagcacgt ggtgctgctg 120 ttgagccgct ccaagtccac tcgcggagag tggcggcgca tgctgacctc agagggactg 180 cgctgcgtct ggaagagctt cctcctcgat gcctacaaac aggtgaaatt gggtgaggat 240 gcccccaatt ccagtgtggt gcatgtctcc agtacagaag gaggtgacaa cagtggcaat 300 ggtacccagg agaagatagc tgagggagcc acatgccacc ttcttgactt tgccagccct 360 gagcgcccac tagtggtcaa ctttggctca gccacttgac ctcctttcac gagccagctg 420 ccagccttcc gcaaactggt ggaagagttc tcctcagtgg ctgacttcct gctggtctac 480 attgatgagg ctcatccatc agatggctgg gcgataccgg gggactcctc tttgtctttt 540 gaggtgaaga agcaccagaa ccaggaagat cgatgtgcag cagcccagca 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tctgttgaaa 20 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DIO2 amplification forward primer <400> 7 tccagtgtgg tgcatgtctc 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DIO2 amplification reverse primer <400> 8 ctggctcgtg aaaggaggtc 20 <210> 9 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Gapdh amplification forward primer <400> 9 tgttgccatc aatgacccct t 21 <210> 10 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Gapdh amplification reverse primer <400> 10 ctccacgacg tactcagcg 19

Claims

DIO2(type 2 iodothyronine deiodinase) 단백질을 암호화하는 서열번호 1로 구성된 폴리뉴클레오타이드에 있어서 274번째에 위치하는 염기가 A에서 G로 바뀐 단일염기다형성(C.274A>G)을 포함하는 10 내지 100개의 연속된 염기를 포함하는 폴리뉴클레오타이드 또는 이의 상보적 폴리뉴클레오타이드, 및 TSHR(Thyroid Stimulating Hormone Receptor) 단백질을 암호화하는 서열번호 2로 구성된 폴리뉴클레오타이드에 있어서 1349번째에 위치하는 염기 G가 A로 바뀐 돌연변이(C.1349G>A)를 포함하는 10 내지 100개의 연속된 염기를 포함하는 폴리뉴클레오타이드 또는 이의 상보적 폴리뉴클레오타이드를 포함하는, L-T4(Levothyroxine)와 L-T3(liothyronine)의 병용투여가 필요한 갑상선기능저하증 환자 진단용 마이크로어레이.
제 1항에 있어서, 상기 연속된 염기는 10 내지 70개의 연속된 염기인 것을 특징으로 하는 갑상선기능저하증 환자 진단용 마이크로어레이.
제 1항의 마이크로어레이를 포함하는 L-T4(Levothyroxine)와 L-T3(liothyronine)의 병용투여가 필요한 갑상선기능저하증 환자 진단용 키트.
DIO2(type 2 iodothyronine deiodinase) 단백질을 암호화하는 서열번호 1로 구성된 폴리뉴클레오타이드에 있어서 274번째에 위치하는 염기가 A에서 G로 바뀐 단일염기다형성(C.274A>G) 및 TSHR(Thyroid Stimulating Hormone Receptor) 단백질을 암호화하는 서열번호 2로 구성된 폴리뉴클레오타이드에 있어서 1349번째에 위치하는 염기 G가 A로 바뀐 돌연변이(C.1349G>A)를 검출할 수 있는 상보적인 프로브 또는 프라이머 세트를 포함하는, L-T4(Levothyroxine)와 L-T3(liothyronine)의 병용투여가 필요한 갑상선기능저하증 환자 진단용 키트.
1) 피검체로부터 분리된 생물학적 시료로부터 핵산을 분리하는 단계; 및
2) 상기 핵산으로부터 서열번호 1의 폴리뉴클레오타이드의 274번째에 위치하는 SNP 염기 서열 및 서열번호 2의 폴리뉴클레오타이드의 1349번째에 위치하는 돌연변이 염기 서열을 결정하는 단계를 포함하는 L-T4(Levothyroxine)와 L-T3(liothyronine)의 병용투여가 필요한 갑상선기능저하증 환자 진단에 필요한 정보제공 방법.
1) 피검체로부터 분리된 생물학적 시료로부터 단백질을 분리하는 단계; 및
2) N-말단으로부터 450번째 아미노산인 아르기닌(R)이 히스티딘(H)으로 변화(C.1349G>A)된 TSHR(Thyroid Stimulating Hormone Receptor) 단백질 및 N-말단으로부터 92번째 아미노산인 트레오닌(T)이 알라닌(A)으로 변화(C.274A>G)된 DIO2(type 2 iodothyronine deiodinase) 단백질을 검출하는 단계를 포함하는 L-T4(Levothyroxine)와 L-T3(liothyronine)의 병용투여가 필요한 갑상선기능저하증 환자 진단에 필요한 정보제공 방법.
제 6항에 있어서, 상기 단계 2)에서 TSHR(C.1349G>A) 단백질 발현 및 DIO2(C.274A>G) 단백질 발현은 변이 단백질 특이적인 항체를 사용하여 측정되는 것을 특징으로 하는 갑상선기능저하증 환자 진단에 필요한 정보제공 방법.
제 5항 또는 제 6항에 있어서, 상기 시료는 머리카락, 혈액, 조직, 세포, 혈청, 혈장, 타액, 객담 및 소변으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 갑상선기능저하증 환자 진단에 필요한 정보제공 방법.