JP2008001690A - Gタンパク質共役型レセプターの作動剤および医薬 - Google Patents
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Abstract
Description
J. Biol Chem. 272, 5637, 1907 Hauner H., Diabetes Metab. Res. Rev., 2002 Mar-Apr;18 Suppl 2:S10-5)(Tan MH, Int. J. Clin. Pract. Suppl., 2000 Oct;(113):54-62 Ishida H et al., Metabolism, 2004 Apr;53(4):488-94. Sato O. et al., J. Biol. Chem., 2002 May 3;277(18):15703-11 GuoYT et al., World J. Gastroenterol, 2005 Aug 14;11(30):4735-9. Nature, 391, 79-82,1998 Nature, 391, 82-86,1998 Valentiner U et al., Toxicology, 2005 Sep 15;213(1-2):157-68.
本実施例に用いた材料及び方法は以下の通りである。
1.蛋白質回収
(1)本実験には細胞株TXGPR40およびTXGPR120を用い、35 mm dishに細胞数5×105 / dishになるよう播種した。Dishへの定着を確認した後Doxycyclin処理(10μg Doxycyclinを細胞溶液に加える)し、その28時間前にStarvation(FBS(-)Mediumに置き換え、Dox入)を行い、更にその20時間後にAssayした。
なお、TXGR40、TXGR120はそれぞれ、ヒトGPR40(hGPT40)又はヒトGPR120(hGPR120)遺伝子をDoxycycline処理で発現する発現ベクターに組み込んだプラスミドを遺伝子導入し、安定的にGPR40又はGPR120蛋白質を発現する細胞株を意味する。
(2)Ligandは、ピオグリタゾン(pioglitazone)、トログリタゾン(troglitazone)、シグリタゾン(ciglitazone)、ロジグリタゾン(rosiglitazone)の4種類を用いた。これらをDMSOに溶解して調製し、Mediumで10倍に希釈して、全量100μlとした。また、ネガティブコントロールとしてDMSOを、ポジティブコントロールとしてPMA(Phorbol-12-myristate-13-acetate)を用いた。
(3)細胞のdishからMediumを除き、全液量を0.9 mlとした。
(4)Ligand溶液を細胞の溶液の上からポタポタと垂らすように加え、軽くdishを揺すって拡散させ、室温で反応させた。
(5)5分間の反応の後、Mediumを捨て、dishに残ったMediumは氷上にてアスピレータで除去した。
(6)150μl Lysis buffer(50mM HEPES(pH7.0), 150mM NaCl, 10% glycerol, 1% NonidetP-40, 2mM MgCl2, 1mM EDTA, 100mM NaF, 10mM Sodiumphosphate, 1mM Na3VO4, 20mM β-glycerophosphate, Proteinase Inhibitor)を入れ、Cell Scraperで細胞を回収した。
(7)回収した液は150μl(等量)の1×SDS Sample Buffer(0.1M Tris-HCl(pH6.8), 4% SDS, 12% Mercaptoethanol, 20% glycerol, BPB)と混合し、以下のWestern Blottingに使用、または-20℃で保存した。
(1)SDS Sample Bufferに混合した粗酵素液は、sonifierを用いて超音波破砕した後、90℃で5minインキュベートした。
(2)ボルテックスにかけて遠心(15,000 rpm 5min 4℃)した。
(3)泳動槽に1×SDS-PAGE Running Buffer(25mM Tris, 0.2M Glycine, 1% SDS)を満たし、2枚の7.5%アクリルアミドゲルをセットし、サンプル遠心後の上清をアプライした。泳動は40mAの定電流で行った。(約80?90min)
(1)PVDF membraneはゲルの大きさにあわせて切り、methanolに約15sec浸した後、Transfer Buffer C solution(25mM Tris, 0.02% SDS, 2% methanol, 40mM 6-aminohexanoic acid)中で15min振盪(室温)して膨潤させた。Blottingに使用する濾紙は10cm×10cmの大きさに切った。
(2)Blotting装置にA solution(0.3M Tris, 0.02% SDS, 2% methanol)に浸した濾紙2枚、B solution(25mM Tris, 0.02% SDS, 2% methanol)に浸した濾紙2枚の順に重ね、その上にmembraneを乗せた。更にその上に泳動終了後のゲルを乗せ、最後にC solutionに浸らせた濾紙2枚を重ねてふたをした。
(3)15 Vで30分間Transferを行った。
(1)以下の作業はすべて室温。Transfer終了後のmembraneを1×TTBS(0.2M Tris, 1.5M NaCl, 0.2& Tween20)を入れたケースに移し、15分間washした。
(2)TTBSを除き、Block Ace約10 mlを加えて1時間振盪してBlockingした。
(1)一次抗体(p44/42 MAP Kinase AntibodyおよびPhospho-p44/42 MAP Kinase Antibody)は、それぞれTTBSで1000倍希釈。
(2)Blocking終了後、Block Ace溶液を除き、一次抗体溶液を入れて2時間振盪して反応させた。
(1)二次抗体(Anti-rabbit Ig, Horseradish Peroxidase linkednF (ab’)2 fragment)はTTBSで5000倍希釈。
(2)一次抗体溶液を除き、TTBS中で5?10分間振盪しwashした。washは3回。
(3)TTBSを除き、二次抗体溶液を入れて1時間振盪した。
(1)氷上にてECL kit中のDetection Reagent 1とDetection Reagent 2それぞれ2 mlずつを混合した。
(2)二次抗体反応終了後のmembraneから、二次抗体溶液を除き、TTBS中で5分間振盪しwashした。washは3回。
(3)membraneを、しっかり水を切ってパック内へ入れ、1枚のmembraneにつき2 mlのDetection Reagent混合液をかけた。
(4)カセット内でmembraneとフィルムとを1分?5分間接触させ、自動現像機で現像した。
(1)フィルムをスキャンしてパソコンに取り込み、「Image J」のアプリケーション(Image J 1.345: National Institutes of Healthから公開されているフリーソフト)を用いてバンドを数値化した。
(2)DMSOおよびPMAによりnormalizeし、薬物間の値を比較した。
C57BL/6 CrSlc (8週令、♂、約25g) にネンブタール溶液(原液を生理食塩水で1/10に希釈)を投与して麻酔した。開腹後、投与物質を100nmol/g 体重 ポリエチレングリコール(Polyehylene glycol(PEG):平均分子量400、SIGMA)100μlに懸濁して、腸管(結腸)へ投与した。投与後15分静置し、門脈より採血した。採血した血液サンプルを遠心分離し、血漿を凍結保存した。血漿のGLP−1濃度をELISA(ラットGLP-1ELISAキットワコー:和光純薬工業株式会社)を用いて測定した。使用マウスは各群5匹を用いた。αリノレン酸(SIGMA)及びトログリタゾン(SIGMA)を用いた。
(I)消化活動の協調的促進、消化活動障害の治療薬。Nutrition 2001; 17(3):230-5、Best Pract Res Clin Endocrinol Metab 2004 ;18(4):569-86、Dig Dis Sci.2004;49(3):361-9、Endocrinology 2004;145(6):2653-9、Pharmacol Toxicol 2002;91(6):375-81、Gastroenterology 2004;127(3):957-69、Best Pract Res Clin Endocrinol Metab 2004 ;18(4):569-86、Med Res Rev.2003;23(5):559-605、Med Res Rev.2003;23(5):559-605、Horm Metab Res 2004;36(11-12):842-5、Horm Metab Res 2004;36(11-12):842-5、Am J Phyusiol Endcrinol Metab 2004;287(6):E1209-15、Dig Dis Sci 1998;43(4):799-805、(II)食欲抑制による肥満予防治療薬、過食症の治療薬。Physiol Behav. 2004;83(4): 617-21,Best Pract Res Cli Endocrinol Metab. 2004;18(4):569-86、Trends Endcrinol Metab.2004;15(6):259-63, Cuur Drug Target CNS Neurol disord 2004;3(5):379-88
(III)膵臓β細胞の分化増殖促進による糖尿病予防治療薬。特にβ細胞あるいはその前駆細胞移植治療時の治療効果促進剤Diobetology, 2005;48(9):1700-13、Diabetes 2004;53suppl 3:S225-32、Hormone Metab Res.2004(11-12):766-70、Hormone Metab Res.2004、36(11-12):846-51
(IV)神経細胞可塑性、生存維持作用による神経移植、神経接合時の治療促進剤あるいはアルツハイマー症等、神経細胞障害が原因の疾患治療薬。Curr Drug Target CNS Neurol Disord 2002; 1(5): 495-510、Curr Drug Targets.2004;5(69:565-71、Curr Alzheimer Res 2005,2(3):377-85
(V)腸管運動の正常化作用による腸炎時の腸管運動異常の治療薬Drug 2003;63(12):1785-97、Br J Pharmacol. 2004;141(8):1275-84,
(VI)肺におけるサーファクタント分泌促進によるCOPD(慢性閉塞性肺疾患)などの肺疾患治療薬Endocrinology. 1998;139(5):2363-8. Am J Respir Crit Care Med. 2001;163(4):840-6.
(VII)メタボリックシンドローム治療薬。前述のNature Medicine、11(1), 90-94,2005 および特開2005−15358および(II)の文献を総合
となる。
Claims (11)
- 一般式(I)で表される化合物が、ピオグリタゾン(pioglitazone)、トログリタゾン(troglitazone)、シグリタゾン(ciglitazone)、及びロジグリタゾン(rosiglitazone)からなる群より選ばれる少なくとも1種である請求項1に記載のGタンパク質共役型レセプター作動剤。
- 前記Gタンパク質共役型レセプター(GPCR)が、GPR120である請求項1に記載のGタンパク質共役型レセプター作動剤。
- 前記Gタンパク質共役型レセプター(GPCR)が、GPR40である請求項1に記載のGタンパク質共役型レセプター作動剤。
- 請求項1〜4のいずれかに記載のGタンパク質共役型レセプター作動剤を有効成分として含有する食欲調節剤。
- 請求項1〜4のいずれかに記載のGタンパク質共役型レセプター作動剤を有効成分として含有する膵臓ベータ細胞分化再生増殖促進剤。
- 請求項1〜4のいずれかに記載のGタンパク質共役型レセプター作動剤を有効成分として含有する消化器疾患治療薬。
- 請求項1〜4のいずれかに記載のGタンパク質共役型レセプター作動剤を有効成分として含有する神経障害治療薬。
- 請求項1〜4のいずれかに記載のGタンパク質共役型レセプター作動剤を有効成分として含有する精神障害治療薬。
- 請求項1〜4のいずれかに記載のGタンパク質共役型レセプター作動剤を有効成分として含有する肺疾患治療薬。
- 請求項1〜4のいずれかに記載のGタンパク質共役型レセプター作動剤を有効成分として含有するメタボリックシンドローム治療薬。
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