JP2007537711A

JP2007537711A - IGF binding protein

Info

Publication number: JP2007537711A
Application number: JP2006533896A
Authority: JP
Inventors: ヘンリーロウマン，; サマンサリエン，
Original assignee: Genentech Inc
Current assignee: Genentech Inc
Priority date: 2003-10-03
Filing date: 2004-09-08
Publication date: 2007-12-27
Also published as: US20080199886A1; EP1670822A2; AU2004278311A1; US7351545B2; CA2541015A1; US7348154B2; WO2005033132A2; US7192738B2; US20050148035A1; US20070020709A1; WO2005033132A3; US20070020698A1

Abstract

例えば、細胞ベースのアッセイにおいて、ＩＧＦアンタゴニストとして有用な、そしてファージディスプレイにより同定される、他の分子（例えば、野生型ＩＧＦＢＰ−３およびＩＧＦアゴニストのペプチド）上のＩＧＦ−Ｉ結合部位およびＩＧＦ−ＩＩ結合部位のマッピングの際に有用な、ＩＧＦＢＰ−３融合タンパク質が提供される。このような融合タンパク質を作製するための方法もまた提供される。一つの実施形態において、この融合タンパク質は、ファージ上にディスプレイされる。For example, IGF-I binding sites and IGF-II on other molecules (eg, wild type IGFBP-3 and IGF agonist peptides) useful as IGF antagonists and identified by phage display in cell-based assays. IGFBP-3 fusion proteins are provided that are useful in mapping binding sites. Also provided are methods for making such fusion proteins. In one embodiment, the fusion protein is displayed on a phage.

Description

（関連出願）
本願は、米国特許法施行規則１．５３（ｂ）（１）のもとに出願された非仮出願であり、米国特許法１１９（ｅ）のもとで、２００３年１０月３日に出願された仮出願番号６０／５０８，３４５に対して優先権を主張し、この内容は、本明細書中に参考として援用される。 (Related application)
This application is a non-provisional application filed under US Patent Act Enforcement Regulations 1.53 (b) (1) and filed on October 3, 2003 under US Patent Act 119 (e) Priority is claimed on provisional application No. 60 / 508,345, the contents of which are hereby incorporated by reference.

（発明の分野）
本発明は、ＩＧＦＢＰ−３の最小の機能的領域を決定するのに有用で、かつ、ＩＧＦ−Ｉ活性もしくはＩＧＦ−ＩＩ活性をアンタゴナイズするのに有用な分子に関する。 (Field of Invention)
The present invention relates to molecules useful for determining the minimal functional region of IGFBP-3 and useful for antagonizing IGF-I or IGF-II activity.

（背景技術および関連技術の説明）
インスリン様増殖因子Ｉおよびインスリン様増殖因子ＩＩ（それぞれ、ＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩ）は、複数の効果（このような効果としては、細胞増殖、細胞分化、細胞死の阻害、およびインスリン様活性が挙げられる）をインビボで媒介する（非特許文献１；非特許文献２に概説されている）。これらのマイトジェンの応答および代謝応答のほとんどは、ＩＧＦ−Ｉレセプターであるα_２β_２−ヘテロテトラマー（これは、インスリンレセプターに密接に関連している）の活性化により開始される（非特許文献３；非特許文献４）。このＩＧＦ−Ｉレセプターおよびインスリンレセプターは、その特異的リガンドにナノモルの親和性で結合する。ＩＧＦ−Ｉおよびインスリンは、親和性が１０００分の１〜１００分の１であるにも関わらず、各々の非同系レセプターと交差反応し得る（非特許文献２（前出））。ＩＧＦ−Ｉレセプターの細胞外部分の一部を記載する結晶構造が報告されている（非特許文献５）。 (Description of background technology and related technologies)
Insulin-like growth factor I and insulin-like growth factor II (IGF-I and IGF-II, respectively) have multiple effects (such as cell proliferation, cell differentiation, inhibition of cell death, and insulin-like activity). ) In vivo (reviewed in Non-Patent Document 1; Non-Patent Document 2). Most of these mitogenic and metabolic responses are initiated by activation of the IGF-I receptor α ₂ β ₂ -heterotetramer, which is closely related to the insulin receptor (Non-Patent Literature). 3; Non-patent document 4). The IGF-I receptor and insulin receptor bind to its specific ligand with nanomolar affinity. Although IGF-I and insulin have an affinity of 1/1000 to 1/100, they can cross-react with each non-syngeneic receptor (Non-patent Document 2 (supra)). A crystal structure describing a part of the extracellular portion of the IGF-I receptor has been reported (Non-patent Document 5).

インスリンとは異なり、ＩＧＦ−Ｉの活性および半減期は、６種のＩＧＦ−Ｉ結合タンパク質（ＩＧＦＢＰ１−６）により調節され、そしておそらく、さらに遠縁のクラスのタンパク質によりさらに調節される（非特許文献２（前出）；非特許文献６）。ＩＧＦＢＰは、これらが可溶性であるかまたは細胞膜結合型であるかに依存して、ＩＧＦ活性を阻害するかまたは増強するかのいずれかをなし得る（非特許文献７）。このＩＧＦＢＰは、ＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩを結合し、その親和性および特異性は、様々である（非特許文献２（前出）；非特許文献７（前出））。例えば、ＩＧＦＢＰ−３は、ＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩを同程度の親和性で結合し、その一方で、ＩＧＦＢＰ−２およびＩＧＦＢＰ−６は、ＩＧＦ−ＩＩを、これらがＩＧＦ−Ｉを結合するよりはるかに高い親和性で結合する（非特許文献７（前出）；非特許文献８）。特許文献１は、さらなるヒト分泌型ＩＧＦＢＰ様ポリペプチドを開示し、そのヒト分泌型ＩＧＦＢＰ様ポリペプチドは、副腎のｍＲＮＡおよび胸腺のｍＲＮＡからのｃＤＮＡライブラリーより単離される核酸配列によりコードされている。 Unlike insulin, the activity and half-life of IGF-I is regulated by six IGF-I binding proteins (IGFBP 1-6) and possibly further regulated by a more distant class of proteins (non-patented Reference 2 (supra); Non-patent reference 6). IGFBPs can either inhibit or enhance IGF activity depending on whether they are soluble or cell membrane bound (7). This IGFBP binds IGF-I and IGF-II, and its affinity and specificity vary (Non-patent document 2 (supra); Non-patent document 7 (supra)). For example, IGFBP-3 binds IGF-I and IGF-II with similar affinity, while IGFBP-2 and IGFBP-6 bind IGF-II, which binds IGF-I. It binds with a much higher affinity (Non-patent document 7 (supra); Non-patent document 8). U.S. Patent No. 6,057,031 discloses a further human secreted IGFBP-like polypeptide, which is encoded by a nucleic acid sequence isolated from a cDNA library from adrenal mRNA and thymic mRNA. .

構造的には、ＩＧＦ−Ｉは、一本鎖の、７０アミノ酸タンパク質であり、これは、プロインスリンと高い相同性を有する。インスリンスーパーファミリーの他のメンバーとは異なり、ＩＧＦのＣ領域は、翻訳後にタンパク分解性に除去されない。ＩＧＦ−Ｉの溶液ＮＭＲ構造（非特許文献９；非特許文献１０）、ミニ−ＩＧＦ−Ｉ（Ｃ−鎖を欠く、遺伝子操作された改変体；非特許文献１１）およびＩＧＦ−ＩＩ（非特許文献１２；非特許文献１３）が報告されている。ＩＧＦ−Ｉ上の特有のエピトープが、レセプターおよび結合タンパク質を結合するために使用されることが、一般に容認されている。レセプター不活性ＩＧＦ変異体が内因性ＩＧＦ−Ｉを結合タンパク質から置換し得、これによって、純ＩＧＦ−Ｉ効果をインビボで生成し得ることが、動物モデルで実証されている（非特許文献１４；非特許文献１５；特許文献２および特許文献３）。残基Ｙ２４、Ｙ２９、Ｙ３１およびＹ６０が、レセプターの結合に関与するが、そのＩＧＦ変異体は、さらにＩＧＦＢＰに結合する（非特許文献１６；非特許文献１７；非特許文献１８；非特許文献１５（前出））。 Structurally, IGF-I is a single chain, 70 amino acid protein that is highly homologous to proinsulin. Unlike other members of the insulin superfamily, the C region of IGF is not proteolytically removed after translation. Solution NMR structure of IGF-I (Non-patent document 9; Non-patent document 10), mini-IGF-I (gene engineered variant lacking C-chain; non-patent document 11) and IGF-II (non-patent document) Reference 12; Non-patent reference 13) has been reported. It is generally accepted that unique epitopes on IGF-I are used to bind receptors and binding proteins. It has been demonstrated in animal models that receptor inactive IGF mutants can displace endogenous IGF-I from the binding protein, thereby producing a pure IGF-I effect in vivo (14). Non-Patent Document 15; Patent Document 2 and Patent Document 3). Residues Y24, Y29, Y31 and Y60 are involved in receptor binding, but the IGF variant further binds to IGFBP (Non-Patent Document 16; Non-Patent Document 17; Non-Patent Document 18; Non-Patent Document 15). (Above)).

さらに、設計された改変体（１−２７、ｇｌｙ^４、３８−７０）−ｈＩＧＦ−Ｉ（ここで、ヒトＩＧＦ−ＩのＣ領域の残基２８−残基３７は、４残基のグリシンブリッジにより置換される）は、ＩＧＦＢＰのレセプターに結合するが、ＩＧＦのレセプターには結合しないことが発見されている（非特許文献１９）。 Furthermore, the designed variant (1-27, gly ⁴ , 38-70) -hIGF-I (wherein residue 28-residue 37 in the C region of human IGF-I is a 4-residue glycine bridge) Has been found to bind to the receptor for IGFBP but not to the receptor for IGF (Non-patent Document 19).

突然変異誘発の規模の研究は、ＩＧＦ−Ｉ上のＩＧＦＢＰ−結合エピトープの特徴づけに取り組んでいる（非特許文献２０；非特許文献２１；非特許文献２２；非特許文献２３；非特許文献２；非特許文献２４；非特許文献８（前出））。要約すれば、Ｎ末端残基３およびＮ末端残基４、ならびに、残基８〜残基１７を含むヘリカル領域が、ＩＧＦＢＰに結合するために重要であると見出された。さらに、ＩＧＦＢＰ−１、ＩＧＦＢＰ−２およびＩＧＦＢＰ−５に結合する残基４９〜残基５１に関するエピトープが同定されている（非特許文献２（前出））。さらに、最初の３つのＮ末端アミノ酸を欠く天然に存在する短縮型形態のＩＧＦ−Ｉ（ｄｅｓ（１−３）−ＩＧＦ−Ｉと呼ばれる）は、２５分の１の親和性でＩＧＦＢＰ−３を結合することが実証された（非特許文献２５；特許文献４；特許文献５；および特許文献６）。 Mutagenesis scale studies are addressing the characterization of IGFBP-binding epitopes on IGF-I (Non-Patent Document 20; Non-Patent Document 21; Non-Patent Document 22; Non-Patent Document 23; Non-Patent Document 2). Non-patent document 24; Non-patent document 8 (supra)). In summary, a helical region comprising N-terminal residue 3 and N-terminal residue 4 and residues 8 to 17 was found to be important for binding to IGFBP. Furthermore, epitopes relating to residues 49 to 51 that bind to IGFBP-1, IGFBP-2, and IGFBP-5 have been identified (Non-patent Document 2 (supra)). Furthermore, the naturally occurring truncated form of IGF-I lacking the first three N-terminal amino acids (referred to as des (1-3) -IGF-I) produces IGFBP-3 with a 25 / fold affinity. It has been demonstrated to bind (Non-patent Document 25; Patent Document 4; Patent Document 5; and Patent Document 6).

Ｎ末端のへリックスにおける露出されたアミノ酸残基の結合の寄与を特徴付けようとして、数個のＩＧＦ−Ｉアラニン変異体が構築された（非特許文献２６）。しかし、これらの変異体タンパク質の円偏光二色性スペクトルは、野生型ＩＧＦ−Ｉと比して、構造的な変化を示し、ＩＧＦＢＰ−結合の寄与を上記変異した側鎖が明らかに原因にする。異なるアプローチが非常に最近の研究でとられ、その最近の研究では、ＩＧＦ−Ｉ上のＩＧＦＢＰ−１結合エピトープは、ヘテロ核ＮＭＲスペクトル分光学により確認された（非特許文献２７）。著者らは、ＩＧＦＢＰ−１への結合に機能的に関与する、残基Ｒ３６、残基Ｒ３７、および残基Ｒ５０をさらに同定した。 Several IGF-I alanine mutants were constructed in an attempt to characterize the contribution of exposed amino acid residue binding in the N-terminal helix (26). However, the circular dichroism spectra of these mutant proteins show structural changes compared to wild type IGF-I, and the mutated side chain is apparently responsible for the contribution of IGFBP-binding. . A different approach was taken in a very recent study, in which the IGFBP-1 binding epitope on IGF-I was confirmed by heteronuclear NMR spectral spectroscopy (27). The authors further identified residues R36, R37, and R50 that are functionally involved in binding to IGFBP-1.

他のＩＧＦ−Ｉ改変体が開示されている。例えば、特許文献の特許文献７は、真正のＩＧＦ−Ｉの残基１〜残基６９を有する短縮型改変体を記載する。特許文献８は、省略されたＣドメインを有する、天然に存在する一本鎖ＩＧＦ−Ｉの誘導体である２本鎖ＩＧＦ−Ｉスーパーアゴニストを開示する。このＩＧＦ−Ｉアナログは、式：ＢＣ^ｎ、Ａ（ここで、Ｂは、ＩＧＦ−ＩのＢドメインであるか、またはその機能的なアナログであり、Ｃは、ＩＧＦ−ＩのＣドメインであるかまたはその機能的アナログであり、ｎは、Ｃドメインにおけるアミノ酸の数であり、約６〜約１２であり、そしてＡは、ＩＧＦ−ＩのＡドメインまたはその機能的アナログである）である。 Other IGF-I variants have been disclosed. For example, Patent Document 7 of Patent Document describes a truncated variant having residues 1 to 69 of authentic IGF-I. U.S. Patent No. 6,057,031 discloses a double chain IGF-I superagonist that is a derivative of a naturally occurring single chain IGF-I with an omitted C domain. The IGF-I analog is of the formula: BC ⁿ , A (where B is the B domain of IGF-I or a functional analog thereof and C is the C domain of IGF-I. Or n is the number of amino acids in the C domain, from about 6 to about 12, and A is the A domain of IGF-I or a functional analog thereof).

さらに、非特許文献２７は、ＩＧＦ−Ｉの４種の変異体を開示し、これらのうちの３つは、１型ＩＧＦレセプターに対する親和性が低減している。これらの変異体は、（Ｐｈｅ^２３、Ｐｈｅ^２４、Ｔｙｒ^２５）ＩＧＦ−Ｉである（これは、１型および２型のＩＧＦレセプターおよびインスリンレセプターに対する効力が、ヒトＩＧＦ−１と等しい）、（Ｌｅｕ^２４）ＩＧＦ−Ｉおよび（Ｓｅｒ^２４）ＩＧＦ−Ｉ（これは、ヒトの胎盤の１型ＩＧＦレセプターまたは胎盤のインスリンレセプターならびにラットおよびマウスの細胞の１型ＩＧＦレセプターに対するＩＧＦ−Ｉよりも親和性が低い）、ならびにデスオクタペプチド（Ｌｅｕ^２４）ＩＧＦ−Ｉ（これにおいて、位置２４の芳香族性の損失が、ｈＩＧＦ−Ｉのカルボキシ末端のＤ領域の欠失と組み合わされ、これは、１型レセプターについて、（Ｌｅｕ^２４）ＩＧＦ−Ｉよりも低い親和性を有し、そしてインスリンレセプターについて、（Ｌｅｕ^２４）ＩＧＦ−Ｉよりも高い親和性を有する）。これら４種の変異体は、ヒト血清結合タンパク質に対して正常な親和性を有する。 Furthermore, Non-Patent Document 27 discloses four variants of IGF-I, three of which have reduced affinity for type 1 IGF receptors. These mutants are (Phe ²³ , Phe ²⁴ , Tyr ²⁵ ) IGF-I (which has potency for type 1 and type 2 IGF receptors and insulin receptor equal to human IGF-1), (Leu ²⁴ ) IGF-I and (Ser ²⁴ ) IGF-I (which has a greater affinity than IGF-I for type 1 IGF receptor in human placenta or insulin receptor in placenta and type 1 IGF receptor in rat and mouse cells). Low), as well as the desoctapeptide (Leu ²⁴ ) IGF-I (wherein the loss of aromaticity at position 24 is combined with a deletion of the D region at the carboxy terminus of hIGF-I, which is a type 1 receptor) for ^has a lower affinity than ^(Leu 24) IGF-I, and insulin receptacle For ^terpolymers, it has a higher affinity than ^{(Leu 24) IGF-I)} . These four variants have normal affinity for human serum binding proteins.

非特許文献２９は、ＩＧＦ−Ｉの３つの構造アナログ（（１−６２）ＩＧＦ−Ｉ（これは、ＩＧＦ−Ｉのカルボキシ末端の８アミノ酸Ｄ領域を欠く）、（１−２７、Ｇｌｙ^４、３８−７０）ＩＧＦ−Ｉ（これにおいては、ＩＧＦ−ＩのＣ領域の残基２８−残基３７が、４残基グリシンブリッジにより置き換えられている）および（１−２７、Ｇｌｙ^４、３８−６２）ＩＧＦ−Ｉ（Ｃ領域にグリシンの置換を有し、そしてＤ領域に欠失を有する）を開示する。非特許文献２９は、非特許文献１７の上記Ｇｌｙ^４変異体を用いて、データを開示する。特許文献９は、ＩＧＦ−ＩまたはＩＧＦ−Ｉの活性濃度を増加させる化合物を使用して、神経損傷を処置することに言及する。 Non-Patent Document 29 describes three structural analogs of IGF-I ((1-62) IGF-I (which lacks the 8 amino acid D region at the carboxy terminus of IGF-I)), (1-27, Gly ⁴ , 38-70) IGF-I, in which residues 28-residue 37 of the C region of IGF-I are replaced by a 4-residue glycine bridge) and (1-27, Gly ⁴ , 38- 62) Disclose IGF-I (with a glycine substitution in the C region and a deletion in the D region) Non-Patent Document 29 uses the above Gly ⁴ mutant of Non-Patent Document 17 to U.S. Patent No. 6,099,059 refers to treating nerve injury using IGF-I or compounds that increase the active concentration of IGF-I.

非特許文献３１は、ＩＧＦ−Ｉの３つのアナログを開示し、このアナログでは、ＩＧＦ−ＩのＡ領域の特定の残基が、インスリンのＡ鎖における、対応する残基で置き換えられる。これらのアナログは、（Ｉｌｅ^４１、Ｇｌｕ^４５、Ｇｌｎ^４６、Ｔｈｒ^４９、Ｓｅｒ^５０、Ｉｌｅ^５１、Ｓｅｒ^５３、Ｔｙｒ^５５、Ｇｌｎ^５６）ＩＧＦ−Ｉ（残基４１がスレオニンからイソロイシンへと変更されており、そしてＡ領域の残基４２〜残基５６が置換されているＡ鎖変異体）；（Ｔｈｒ^４９、Ｓｅｒ^５０、Ｉｌｅ^５１）ＩＧＦ−１；ならびに（Ｔｙｒ^５５、Ｇｌｎ^５６）ＩＧＦ−Ｉである。 Non-Patent Document 31 discloses three analogs of IGF-I in which specific residues in the A region of IGF-I are replaced with corresponding residues in the A chain of insulin. These analogs are (Ile ⁴¹ , Glu ⁴⁵ , Gln ⁴⁶ , Thr ⁴⁹ , Ser ⁵⁰ , Ile ⁵¹ , Ser ⁵³ , Tyr ⁵⁵ , Gln ⁵⁶ ) IGF-I (residue 41 is changed from threonine to isoleucine. And an A chain variant in which residues 42 to 56 of the A region are substituted); (Thr ⁴⁹ , Ser ⁵⁰ , Ile ⁵¹ ) IGF-1; and (Tyr ⁵⁵ , Gln ⁵⁶ ) IGF-I .

非特許文献３２は、種々のＩＧＦおよびインスリン改変体のＩＧＦＢＰ、ＩＧＦレセプター、およびインスリンレセプターへの結合の結合親和性を記載する。 Non-Patent Document 32 describes the binding affinity of various IGF and insulin variants for binding to IGFBP, IGF receptor, and insulin receptor.

ＩＧＦＢＰは、培養物中の細胞により分泌され、そしてＩＧＦ−刺激された機能を阻害または増強するかのいずれかである（非特許文献３３）。ＩＧＦＢＰの公知の形態としては、ＩＧＦＢＰ−１が挙げられ、これは、ヒトにおいては、約３０ｋＤａ〜約４０ｋＤａの分子量を有する。例えば、特許文献１０（１９９０年１０月公開、ＩＧＦＢＰ−１およびＩＧＦＢＰ−２のｃＤＮＡ配列およびクローニングベクターに関する）；特許文献１１（１９８９年９月２１日公開、ＩＧＦＢＰ−１のアミノ酸配列に関する）；および特許文献１２（１９８９年１０月５日公開、ＩＧＦＢＰ−１のｃＤＮＡ配列およびＩＧＦＢＰ−１の発現の方法に関する））を参照のこと。 IGFBP is secreted by cells in culture and either inhibits or enhances IGF-stimulated function (33). Known forms of IGFBP include IGFBP-1, which has a molecular weight of about 30 kDa to about 40 kDa in humans. For example, Patent Document 10 (published October 1990, relating to cDNA sequences and cloning vectors of IGFBP-1 and IGFBP-2); Patent Document 11 (published September 21, 1989, relating to the amino acid sequence of IGFBP-1); See Patent Document 12 (published October 5, 1989, relating to cDNA sequence of IGFBP-1 and method of expression of IGFBP-1)).

ＩＧＦＢＰ−２は、約３３−３６ｋＤａの分子量を有する。例えば、非特許文献３４（ＩＧＦＢＰ−２のヌクレオチドおよび推定アミノ酸配列に関する）を参照のこと。 IGFBP-2 has a molecular weight of approximately 33-36 kDa. See, for example, Non-Patent Document 34 (related to the nucleotide and deduced amino acid sequence of IGFBP-2).

ＩＧＦＢＰ−３は、約２８ｋＤａの非グリコシル化分子量を有する。例えば、非特許文献３５（ヒト血清より精製された、５３ｋＤａのグリコシル化されたＩＧＦＢＰ−３のサブユニットに関する）；非特許文献３６（ＩＧＦＢＰ−３の全長アミノ酸配列および哺乳動物組織培養物細胞における、クローン化されたＩＧＦＢＰ−３ＣＤＮＡの細胞性発現に関する）；特許文献１３（１９９０年１月２５日公開、ヒトの血漿からＩＧＦＢＰ複合体の酸不安定性サブユニット（ＡＬＳ）の単離およびこのＩＧＦＢＰ−３のサブユニットに関するＡＬＳについての特定のアミノ酸配列に関する）；および非特許文献３７（２種の異なる骨芽細胞株上に対する、全長ＩＧＦＢＰ−３および短縮型ＩＧＦＢＰ−３の影響に関する）を参照のこと。 IGFBP-3 has an aglycosylated molecular weight of approximately 28 kDa. For example, Non-Patent Document 35 (related to a 53 kDa glycosylated IGFBP-3 subunit purified from human serum); Non-Patent Document 36 (in full length amino acid sequence of IGFBP-3 and mammalian tissue culture cells, Regarding the cellular expression of cloned IGFBP-3 CDNA); Patent Document 13 (published January 25, 1990, isolation of the acid labile subunit (ALS) of the IGFBP complex from human plasma and the IGFBP- See specific amino acid sequence for ALS for 3 subunits); and non-patent document 37 (for the effects of full-length IGFBP-3 and truncated IGFBP-3 on two different osteoblast cell lines). .

最初のうちは、ＩＧＦＢＰ−４、ＩＧＦＢＰ−５、およびＩＧＦＢＰ−６に対する命名における矛盾が、いくつか存在したが、１９９１年に第二回国際ＩＧＦシンポジウムの参加者が認知されたＩＧＦＢＰ−４、ＩＧＦＢＰ−５およびＩＧＦＢＰ−６の命名について同意した。一般に認められた専門用語を用いて、非特許文献３８は、ヒトの骨肉種細胞により調製された培地から単離されたＩＧＦＢＰ−４のＮ末端アミノ酸配列に関し、そして非特許文献３９は、ラットおよびヒト由来のＩＧＦＢＰ−４をコードするＩＧＦＢＰのｃＤＮＡに関する。特許文献１４（１９９２年３月５日公開）は、ＩＧＦＢＰ−４（その文献中では、もともとＩＧＦＢＰ−５として表記されている）に関し；そして特許文献１５（１９９２年３月５日公開）は、ＩＧＦＢＰ−４（その文献中では、もともとＩＧＦＢＰ−５と表記されている）をコードする遺伝性物質に関する。 Initially, there were some inconsistencies in the nomenclature for IGFBP-4, IGFBP-5, and IGFBP-6, but IGFBP-4, IGFBP were recognized by the participants of the second International IGF Symposium in 1991 Agreed on naming of -5 and IGFBP-6. Using generally accepted terminology, Non-Patent Document 38 relates to the N-terminal amino acid sequence of IGFBP-4 isolated from media prepared by human osteosarcoma cells, and Non-Patent Document 39 includes rat and The present invention relates to IGFBP cDNA encoding human-derived IGFBP-4. Patent Document 14 (published March 5, 1992) relates to IGFBP-4 (originally written as IGFBP-5 in that document); and Patent Document 15 (published March 5, 1992): The present invention relates to a genetic material encoding IGFBP-4 (originally written as IGFBP-5 in the literature).

１９９２年７月２３日に公開された特許文献１６は、ＩＧＦＢＰ−５（これは、もともと、その文献中では、ＩＧＦＢＰ−６として表記された）に関する。非特許文献４０は、（Ｕ−２−細胞条件培地から、アフィニティー精製されたＩＧＦＢＰの混合物のＩＧＦに対する細胞性作用の調節に関する。１９９２年３月５日に公開された特許文献１７は、ＩＧＦＢＰ−６（これは、もともと、その文献中ではＩＧＦＢＰ−４として表記されている）をコードする遺伝性物質に関し；そして１９９２年３月５日に公開された特許文献１８は、ＩＧＦＢＰ−６（これは、もともと、その文献中ではＩＧＦＢＰ−４として表記されている）に関する。特許文献１９および特許文献２０および特許文献２１もまた参照のこと。これらは、ＩＧＦＢＰ−６およびそのフラグメントを開示する。 Patent Document 16 published on July 23, 1992 relates to IGFBP-5 (which was originally written as IGFBP-6 in that document). Non-Patent Document 40 relates to the regulation of cellular effects on IGF of a mixture of affinity-purified IGFBP from U-2-cell conditioned medium. Patent Document 17 published on March 5, 1992 describes IGFBP- 6 (which was originally designated as IGFBP-4 in that document); and US Pat. , Originally referred to in that document as IGFBP-4) See also Patent Document 19, Patent Document 20 and Patent Document 21, which disclose IGFBP-6 and fragments thereof.

非特許文献４１は、４種のＩＧＦＢＰ（ＩＧＦＢＰ−２、ＩＧＦＢＰ−３、短縮形態のＩＧＦＢＰ−３、およびＩＧＦＢＰ−４）に関し、これらのＩＧＦＢＰは、成人ヒト血清から、インスリン様増殖因子（ＩＧＦ）のアフィニティークロマトグラフィーおよび高性能液体クロマトグラフィーにより単離される。非特許文献４２は、ＩＧＦＢＰ−４、ＩＧＦＢＰ−５およびＩＧＦＢＰ−６のアミノ末端アミノ酸を論じている。 Non-Patent Document 41 relates to four types of IGFBPs (IGFBP-2, IGFBP-3, truncated IGFBP-3, and IGFBP-4), and these IGFBPs are derived from adult human serum from insulin-like growth factor (IGF). Isolated by affinity chromatography and high performance liquid chromatography. Non-Patent Document 42 discusses the amino terminal amino acids of IGFBP-4, IGFBP-5 and IGFBP-6.

単独で投与された場合（すなわち、ＩＧＦなしで投与された場合）、上記ＩＧＦＢＰはまた、ＩＧＦの副作用（例えば、ＩＧＦが過剰に産生された場合に生ずる副作用（例えば、特定の癌細胞（例えば、ホルモン産生癌細胞（例えば、乳癌細胞または腎臓癌細胞））により分泌される遊離のＩＧＦ））をブロックするのに治療上有用であり得る。さらに最近では、Ｕ−２ヒト骨肉種細胞がＩＧＦＢＰ−５およびＩＧＦＢＰ−６を分泌することが実証された（非特許文献４０（前出）；非特許文献４３；非特許文献４４）。Ｕ−２条件培地に由来する、アフィニティー精製されたＩＧＦ結合タンパク質は、ＩＧＦ−Ｉ刺激された有糸***誘発を明確に増強した（非特許文献４０、前出）が、これらの研究からはどのタンパク質がこの作用の原因であるのかが不明確であった。非特許文献３８は、ＩＧＦＢＰ−４（これは、ＴＥ−８９ヒト骨肉種細胞から精製された）が、ＩＧＦ−刺激骨芽細胞有糸***誘発を阻害することを実証した（非特許文献４５；また、非特許文献４６を参照のこと）。特許文献２２は、腫瘍の増殖を阻害するためのＩＧＦＢＰ−３の使用を開示する。特許文献２３は、癌細胞におけるアポトーシスを誘導する方法を開示し、この方法は、この細胞によるＩＧＦＢＰ−５の発現をアポトーシス誘導量まで増加させる工程を包含する。癌細胞を殺す方法、アポトーシスを誘導する薬剤に癌細胞を感作させる方法、および患者における癌を処置する方法もまた記載される。特許文献２４は、前立腺癌のリスクを予測する方法を開示し、そして２００１年８月３０日に公開された特許文献２５は、前立腺癌を、特にＩＧＦＢＰ（ＩＧＦＢＰ−３を含む）で処置する方法を開示する。特許文献２６および特許文献２７は、ＩＧＦＢＰ−３またはＩＧＦＢＰ−３の発現もしくは活性をアップレギュレートするＩＧＦＢＰ−３の調節因子を投与することにより、ｐ５３関連の腫瘍の増殖を阻害する方法を開示する。特許文献２８は、炎症性疾患（腫瘍の新脈管形成を包含する）を処置するためのＩＧＦＢＰ−６の使用を開示する。特許文献２９は、癌（前立腺癌を含む）を処置するための任意のＩＧＦＢＰ−３の使用を開示する。特許文献３０は、ラットの血清から単離された２種のＩＧＦＢＰ（一方は、癌を処置するのに有用なＩＧＦＢＰ−５として同定されている）を開示する。 When administered alone (ie, when administered without IGF), the IGFBP may also cause IGF side effects (eg, side effects that occur when IGF is overproduced (eg, certain cancer cells (eg, It may be therapeutically useful to block free IGF)) secreted by hormone-producing cancer cells (eg breast cancer cells or kidney cancer cells)). More recently, it has been demonstrated that U-2 human osteosarcoma cells secrete IGFBP-5 and IGFBP-6 (Non-patent document 40 (supra); Non-patent document 43; Non-patent document 44). Affinity-purified IGF-binding protein derived from U-2 conditioned media clearly enhanced IGF-I-stimulated mitogenesis (Non-Patent Document 40, supra), but from these studies It was unclear whether the protein was responsible for this effect. Non-Patent Document 38 demonstrated that IGFBP-4 (purified from TE-89 human osteosarcoma cells) inhibits IGF-stimulated osteoblast mitogenesis (Non-Patent Document 45; See also non-patent document 46). U.S. Patent No. 6,057,031 discloses the use of IGFBP-3 to inhibit tumor growth. Patent Document 23 discloses a method of inducing apoptosis in cancer cells, and this method includes the step of increasing the expression of IGFBP-5 by the cells to an apoptosis-inducing amount. Also described are methods of killing cancer cells, methods of sensitizing cancer cells to agents that induce apoptosis, and methods of treating cancer in a patient. US Pat. No. 6,057,031 discloses a method for predicting the risk of prostate cancer, and US Pat. No. 5,057,028 published on Aug. 30, 2001 describes a method for treating prostate cancer, particularly with IGFBP (including IGFBP-3). Is disclosed. U.S. Patent Nos. 6,057,049 and 5,037,797 disclose methods of inhibiting the growth of p53-related tumors by administering IGFBP-3 or a modulator of IGFBP-3 that upregulates IGFBP-3 expression or activity. . U.S. Patent No. 6,057,031 discloses the use of IGFBP-6 to treat inflammatory diseases, including tumor angiogenesis. U.S. Patent No. 6,057,031 discloses the use of any IGFBP-3 to treat cancer (including prostate cancer). U.S. Patent No. 6,057,031 discloses two IGFBPs, one identified as IGFBP-5 useful for treating cancer, isolated from rat serum.

しかし、疾患をスクリーニングするか、予防するか、または処置する際の、ＩＧＦとＩＧＦＢＰとの間の相互作用の利用は、特異的アンタゴニストの不在のために、制限されている。ＩＧＦ−１／ＩＧＦ−２アンタゴニストの、癌の処置における潜在的治療上の補助剤としての適用は、非特許文献４７により記載されている。その報告では、ＩＧＦ−１のＤ領域と一致するペプチドは、ＩＧＦ−１／２アンタゴニストとして使用するために合成された。このペプチドは、ＩＧＦ−１に対して、疑わしい阻害活性を示した。観測された阻害についての基本原理は、明らかではない。なぜなら、上記Ｄ領域は、ＩＧＦ−１レセプター（ＩＧＦ−１Ｒ）結合においてではなく、インスリンレセプターに対するＩＧＦ−１結合において有意な役割を果たすからである（非特許文献４８；非特許文献４９；非特許文献５０）。ＩＧＦアンタゴニスト（この作用機序は、ＩＧＦ−１レセプター界面における相互作用の遮断を介する）はまた、インスリンレセプターにおけるインスリン作用を著しく変更し得、このことは、このようなアンタゴニストの短所である。 However, the use of the interaction between IGF and IGFBP in screening, preventing or treating disease is limited due to the absence of specific antagonists. The application of IGF-1 / IGF-2 antagonists as potential therapeutic adjuncts in the treatment of cancer has been described by [47]. In that report, a peptide consistent with the D region of IGF-1 was synthesized for use as an IGF-1 / 2 antagonist. This peptide showed suspected inhibitory activity against IGF-1. The basic principle of observed inhibition is not clear. This is because the D region plays a significant role not in IGF-1 receptor (IGF-1R) binding but in IGF-1 binding to the insulin receptor (Non-patent document 48; Non-patent document 49; Non-patent document). Reference 50). IGF antagonists (this mechanism of action is through blockade of interaction at the IGF-1 receptor interface) can also significantly alter insulin action at the insulin receptor, which is a disadvantage of such antagonists.

特定のＩＧＦ−１アンタゴニストはまた、特許文献３１により記載されており、これは、ＩＧＦＢＰおよびＩＧＦペプチドの一部を開示し、これらが、ＩＧＦ−１およびＩＧＦＢＰ（すなわち、少なくとも全長ＩＧＦＢＰと同程度の結合親和性でＩＧＦを結合する、ＩＧＦＢＰまたはこれらの修飾体の、単離されたＩＧＦ結合ドメイン）の結合を説明する。特許文献はまた、ＩＧＦのＩＧＦレセプターへの結合を低減し、そして／またはＩＧＦＢＰの結合ドメインへ結合するＩＧＦアンタゴニストを開示する。 Certain IGF-1 antagonists are also described by US Pat. No. 6,057,027, which discloses IGFBP and some of the IGF peptides, which are IGF-1 and IGFBP (ie, at least comparable to full length IGFBP). The binding of IGFBPs or their modifications, isolated IGF binding domains) that bind IGF with binding affinity is described. The patent literature also discloses IGF antagonists that reduce the binding of IGF to the IGF receptor and / or bind to the binding domain of IGFBP.

さらに、特許文献３２は、薬学的組成物を開示し、この組成物は、ＩＧＦ−１レセプターアンタゴニストとして機能する小ペプチド（ｓｈｏｒｔｐｅｐｔｉｄｅ）を含む。薬学的組成物において使用されるペプチドは、２５未満のアミノ酸からなり、ＩＧＦ−１のＣ領域またはＤ領域の少なくとも一部を含み、そしてＩＧＦ−１レセプターのＩＧＦ−１誘導型自己リン酸化を阻害する。細胞増殖を阻害する方法および望ましくない細胞増殖（例えば、癌、再狭窄、および喘息）と関連する疾患に罹患している疑いのある個体またはこの疾患に罹患しやすい個体を処置する方法が開示される。 In addition, US Pat. No. 6,057,031 discloses a pharmaceutical composition, which comprises a short peptide that functions as an IGF-1 receptor antagonist. The peptide used in the pharmaceutical composition consists of less than 25 amino acids, comprises at least part of the C or D region of IGF-1, and inhibits IGF-1 induced autophosphorylation of the IGF-1 receptor To do. Disclosed are methods of inhibiting cell proliferation and methods of treating individuals suspected of or susceptible to diseases associated with unwanted cell proliferation (eg, cancer, restenosis, and asthma). The

ＩＧＦおよびＩＧＦＢＰの構造を研究することが困難であるために、特異的なＩＧＦ−１アンタゴニストの生成が、少なくとも部分的に制限される。回析研究に適したＩＧＦ−１の結晶を得ることができないために、例えば、ブタのインスリンの結晶構造に基づくＩＧＦ構造の推定は、入手可能なＩＧＦ−１の最も重要な構造ロードマップであった（非特許文献５１）。また、非特許文献５２（これは、ＩＧＦの、三次構造、レセプター結合、および抗原性を開示する）を参照のこと。化学的に修飾され、そして変異されたＩＧＦ−１の研究に基づき、ＩＧＦ−１とインスリンとの間の多くの共通の残基が、ＩＧＦ−１Ｒインスリンレセプター接触部位の一部（特に、２３位〜２５位での芳香族残基）として同定されている。ＮＭＲおよび制限された分子動力学を用いて、ＩＧＦ−１の溶液構造は、最近報告された（非特許文献４８、前出）。生じた最小化構造は、改変されたＩＧＦ−１についての実験上の知見、およびインスリンの構造−活性研究からなされた推定に、よりよく一致することが示された。さらには、非特許文献５３は、ミニＩＧＦ−１の溶液構造を開示する。非特許文献５４は、１Ｈ−ＮＭＲおよびディスタンスジオメトリー法により決定されるＩＧＦ−１の三次元構造を開示する。非特許文献５５は、ヒトＩＧＦ−２の溶液構造、およびヒトＩＧＦ−２とレセプターとの関係、および結合タンパク質相互作用を開示する。非特許文献５６は、長（Ａｒｇ（３））ＩＧＦ−１の溶液構造およびバックボーン力学（ｂａｃｋｂｏｎｅｄｙｎａｍｉｃｓ）を開示する。 Due to the difficulty in studying the structure of IGF and IGFBP, the production of specific IGF-1 antagonists is at least partially limited. Because IGF-1 crystals suitable for diffraction studies cannot be obtained, for example, the estimation of IGF structure based on the crystal structure of porcine insulin was the most important structural roadmap of IGF-1 available. (Non-Patent Document 51). See also Non-Patent Document 52 (which discloses the tertiary structure, receptor binding, and antigenicity of IGF). Based on the study of chemically modified and mutated IGF-1, many common residues between IGF-1 and insulin are part of the IGF-1R insulin receptor contact site (particularly position 23). (Aromatic residue at position -25)). Using NMR and limited molecular dynamics, the solution structure of IGF-1 was recently reported (Non-Patent Document 48, supra). The resulting minimized structure was shown to better match the experimental findings for the modified IGF-1 and the assumptions made from the structure-activity studies of insulin. Furthermore, Non-Patent Document 53 discloses a solution structure of mini IGF-1. Non-Patent Document 54 discloses the three-dimensional structure of IGF-1 determined by 1H-NMR and the distance geometry method. Non-Patent Document 55 discloses the solution structure of human IGF-2, the relationship between human IGF-2 and the receptor, and the binding protein interaction. Non-Patent Document 56 discloses the solution structure and backbone dynamics of long (Arg (3)) IGF-1.

アゴニスト活性またはアンタゴニスト活性のいずれかを有する、インスリンおよび／またはインスリン様増殖因子レセプターに結合し得るペプチド配列、ならびに種々のペプチドライブラリーから同定されたペプチド配列は、２００１年１０月４日に公開された特許文献３３において記載される。 Peptide sequences that can bind to insulin and / or insulin-like growth factor receptors with either agonist or antagonist activity and peptide sequences identified from various peptide libraries were published on October 4, 2001. Patent Document 33.

２００３年５月１５日に公開された特許文献３４は、ＩＧＦ−１と、結合タンパク質、インスリンレセプター、およびＩＧＦレセプターとの相互作用をアンタゴナイズするペプチドを開示する。これらのＩＧＦアンタゴニストペプチドは、原因因子としてＩＧＦ−１が関与する障害（例えば、種々の癌）を処置するのに有用である。 U.S. Patent No. 5,053,033 published on May 15, 2003 discloses peptides that antagonize the interaction of IGF-1 with binding proteins, insulin receptors, and IGF receptors. These IGF antagonist peptides are useful for treating disorders involving IGF-1 as a causative factor (eg, various cancers).

古典的なＩＧＦＢＰに基づく構造的な情報に関して、ＩＧＦＢＰは、２２ｋＤａ〜３１ｋＤａの範囲の分子量を有し、そして保存されたアミノ末端ドメインまたは保存されたカルボキシ末端ドメインに、全部で１６−２０個のシステインを含む（非特許文献７、前出；非特許文献５７；非特許文献５８）。システインリッチな両領域をつなぐ中心ドメインは、非常に弱く保存されていて、そしてＩＧＦＢＰ特異的なプロテアーゼの切断部位を含む（非特許文献５９；非特許文献５７（前出）；非特許文献６０）。ＩＧＦＢＰのさらなる調節は、リン酸化およびグリコシル化により達成され得る（非特許文献７（前出）；非特許文献５７（前出））。ＩＧＦＢＰファミリーの任意のインタクトなメンバーにとって利用可能な高分解能構造はない。特許文献３５は、ＩＧＦＢＰ−５およびその改変体を開示する。特許文献３６および特許文献３７は、短縮型のＣ末端ＩＧＦＢＰ−５フラグメントを開示し、このフラグメントは、全長ＩＧＦＢＰ−５と比較して、ＩＧＦ−Ｉに対して親和性が低減している。特許文献３８は、Ｃ末端短縮化ＩＧＦＢＰ−５を用いて、骨形成を刺激する工程を開示する。これらの化合物は、骨細胞の増殖を刺激するために、骨障害を処置するために、またはマイトジェンの活性を刺激するために、使用され得る。 With respect to structural information based on classical IGFBP, IGFBP has a molecular weight ranging from 22 kDa to 31 kDa and contains a total of 16-20 cysteines in a conserved amino-terminal domain or a conserved carboxy-terminal domain. (Non-patent document 7, supra; non-patent document 57; non-patent document 58). The central domain connecting both cysteine-rich regions is very weakly conserved and contains a cleavage site for an IGFBP-specific protease (Non-patent document 59; Non-patent document 57 (supra); Non-patent document 60). . Further regulation of IGFBP can be achieved by phosphorylation and glycosylation (Non-patent document 7 (supra); Non-patent document 57 (supra)). There is no high resolution structure available for any intact member of the IGFBP family. Patent document 35 discloses IGFBP-5 and its modification. U.S. Patent Nos. 6,057,036 and 3,037,37 disclose a truncated C-terminal IGFBP-5 fragment that has a reduced affinity for IGF-I compared to full length IGFBP-5. U.S. Patent No. 6,057,031 discloses a process of stimulating bone formation using C-terminal truncated IGFBP-5. These compounds can be used to stimulate bone cell proliferation, to treat bone disorders, or to stimulate mitogenic activity.

ＩＧＦ−結合活性を保持するＩＧＦＢＰ−５からの２種のＮ末端フラグメントのＮＭＲ構造が、最近報告され、ＩＧＦＢＰ−５の残基４０〜残基９２が、このタンパク質のＮ−末端ドメインのＩＧＦ結合部位を含むことを示した（非特許文献６１）。他の研究により、ＩＧＦＢＰ−３のＮ−末端フラグメント（残基１−残基８８、および残基１−残基９７）はまた、ＩＧＦを結合することが見出されている（非特許文献６２；非特許文献６３）。 The NMR structures of two N-terminal fragments from IGFBP-5 that retain IGF-binding activity have recently been reported and residues 40-92 of IGFBP-5 are the IGF-binding of the N-terminal domain of this protein. It was shown that the region was included (Non-Patent Document 61). Other studies have found that the N-terminal fragment of IGFBP-3 (residue 1-residue 88 and residue 1-residue 97) also binds IGF (62). Non-patent document 63).

特に、非特許文献６２は、ヒトＩＧＦＢＰ−３のアミノ末端（残基１−残基８８；Ｎ−８８）およびカルボキシ末端（残基１６５−２６４；Ｃ−１６５）の両ドメインを、カルボキシ末端ＦＬＡＧペプチドとの融合タンパク質として、細菌中で合成した。溶液結合アッセイにより、ＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩへの結合を示したのはＣ−１６５だけだった。しかし、バイオセンサー分析により、全長ＩＧＦＢＰ−３と比較して親和性が低減しているにもかかわらず、Ｎ−８８およびＣ−１６５の両方が、ＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩへの結合を示した。カルボキシ末端フラグメント（Ｃ−１６５）のみが、ＩＧＦ−Ｉと酸不安定性サブユニット（ＡＬＳ）とのヘテロトリマー複合体を形成し得た。 Specifically, Non-Patent Document 62 describes both the amino-terminal (residue 1-residue 88; N-88) and carboxy-terminal (residues 165-264; C-165) domains of human IGFBP-3 as carboxy-terminal FLAG. It was synthesized in bacteria as a fusion protein with a peptide. Only C-165 showed binding to IGF-I and IGF-II by solution binding assay. However, biosensor analysis shows that both N-88 and C-165 show binding to IGF-I and IGF-II, despite a reduced affinity compared to full length IGFBP-3. It was. Only the carboxy terminal fragment (C-165) could form a heterotrimeric complex of IGF-I and acid labile subunit (ALS).

非特許文献６３は、バイオセンサー分析を用いて、組み換えヒトＮ−末端（残基１−残基９７；Ｎ−９７）ＩＧＦＢＰ−３フラグメントおよび組み換えヒトＣ−末端（残基９８−残基２６４；Ｃ９８）ＩＧＦＢＰ−３フラグメントに対するＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩの結合を測定し、それを、ＩＧＦとインタクトなＩＧＦＢＰ−３との結合と比較した。結合タンパク質もしくはフラグメントを固定化するか、またはＩＧＦを固定化するかのいずれかで、実験が行われた。これらの実験は、ＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩが、４×１０^−９Ｍ〜５×１０^−９Ｍの親和性で、そして同程度の速度論で、ＩＧＦＢＰ−３に結合することを示した。ＩＧＦタンパク質に対するＮ−９７およびＣ−９８の両方の親和性は、全長ＩＧＦＢＰ−３の親和性よりも３桁低かった。 Non-Patent Document 63 uses a biosensor analysis to show recombinant human N-terminal (residue 1-residue 97; N-97) IGFBP-3 fragment and recombinant human C-terminal (residue 98-residue 264; C98) The binding of IGF-I and IGF-II to the IGFBP-3 fragment was measured and compared to the binding of IGF to intact IGFBP-3. Experiments were performed either to immobilize the binding protein or fragment or to immobilize IGF. These experiments, IGF-I and IGF-II is an affinity of ^{^{4 × 10 -9 M~5 × 10 -9}} M, and at comparable kinetics were shown to bind to IGFBP-3 . The affinity of both N-97 and C-98 for IGF protein was three orders of magnitude lower than that of full-length IGFBP-3.

２００３年８月２８日に公開された特許文献３９および特許文献４０は、免疫不全によってではなく免疫刺激により特徴付けられる状態を処置するための、ＩＧＦ−Ｉを結合しないＩＧＦＢＰ−３のフラグメントを開示する。このペプチドは、ＩＧＦＢＰ−３のＣ末端のＣＤ７４ホモロジードメイン配列およびこの領域（独特の抗原性を有する）に局在化する活性を標的化する。この領域の配列に合わせて作製されたペプチドは、ＩＧＦＢＰ−３と多くの公知のリガンド（このようなリガンドとしては、ＲＸＲ−α、トランスフェリン、ＡＬＳ、プラスミノーゲン、フィブリノーゲン、およびプレカリクレインが挙げられる）との結合を妨害することが以前に示されている（非特許文献６４；非特許文献６５；非特許文献６６；非特許文献６７；非特許文献６８）。 U.S. Patent Nos. 5,028,028 and 4,037, published Aug. 28, 2003, disclose fragments of IGFBP-3 that do not bind IGF-I to treat conditions characterized by immune stimulation rather than by immune deficiency. To do. This peptide targets the CD74 homology domain sequence at the C-terminus of IGFBP-3 and the activity that localizes to this region (with unique antigenicity). Peptides made to the sequence of this region include IGFBP-3 and many known ligands (such as RXR-α, transferrin, ALS, plasminogen, fibrinogen, and prekallikrein). ) Has previously been shown to be disrupted (Non-Patent Document 64; Non-Patent Document 65; Non-Patent Document 66; Non-Patent Document 67; Non-Patent Document 68).

ＩＧＦＢＰ−３由来の金属結合ドメインペプチドは、以前に開示されたＩＧＦＢＰ−３由来の分子（これは、ＩＧＦ−Ｉを結合し得ないこと、独特の抗原性、およびＩＧＦＢＰ−３のＩＧＦＢＰ−３推定デスレセプター（ｄｅａｔｈｒｅｃｅｐｔｏｒ）（Ｐ４．３３）相互作用ドメイン（いわゆる「中間領域（ｍｉｄ−ｒｅｇｉｏｎ）」、アミノ酸８８−１４８）が存在しないという点で）とは異なる。上記Ｐ４．３３の推定上のデスレセプターは、特許文献４１に記載されている（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＢＣ０３１２１７；ｇｉ；２１４１１４７７）。例えば、特許文献４２は、ＩＧＦＢＰ−３の点変異の使用を教える（ＩＧＦＢＰ−３の点変異では、ＩＧＦ−Ｉに対する結合が弱化されている）。しかし、記載された分子は、ＩＧＦＢＰ−３の中間領域を含み、そしてＰ４．３３推定レセプターと相互作用することにより、生物学的効果を発揮することが予想されている。特許文献４３は、疾患を処置するためのＰ４．３３調節因子の使用を教示する。上記金属結合ペプチドは、Ｐ４．３３推定相互作用ドメイン（ＩＧＦＢＰ−３の中間領域）を含まない。 A metal binding domain peptide derived from IGFBP-3 is a previously disclosed molecule derived from IGFBP-3 (which is unable to bind IGF-I, unique antigenicity, and IGFBP-3 putative of IGFBP-3 It differs from the death receptor (P4.33) interaction domain (so-called “mid-region”, amino acids 88-148). The putative death receptor of P4.33 is described in Patent Document 41 (Genbank accession number BC031217; gi; 2111477). For example, U.S. Patent No. 6,057,031 teaches the use of a point mutation of IGFBP-3 (the IGFBP-3 point mutation has weakened binding to IGF-I). However, the described molecule contains the intermediate region of IGFBP-3 and is expected to exert biological effects by interacting with the P4.33 putative receptor. U.S. Patent No. 6,057,032 teaches the use of P4.33 modulators to treat disease. The metal binding peptide does not contain the P4.33 putative interaction domain (intermediate region of IGFBP-3).

特許文献４４、特許文献４５および特許文献４６は、加水分解に耐性であるように修飾されたＩＧＦＢＰ−３改変体を開示する。また、ネイティブなＩＧＦＢＰ−３における核局在化シグナル（ＮＬＳ）が変更された改変体ＩＧＦＢＰ−３も開示される。さらに、アミノ末端が伸張されたＩＧＦＢＰ−３が開示され、これとしては、種々のＮ−末端伸張（ペプチドおよびヌクレオチド結合ドメインを含む）、特定の結合メンバー（例えば、レセプターからのリガンド結合ドメインまたは免疫グロブリンからの抗原結合ドメイン）、ならびにペプチドホルモンおよびタンパク質ホルモンおよび増殖因子が挙げられる。Ｎ−末端伸張型ＩＧＦＢＰ−３は、加水分解耐性のＩＧＦＢＰ−３またはＮＬＳ改変体ＩＧＦＢＰ−３を包含し得る。 Patent Document 44, Patent Document 45, and Patent Document 46 disclose IGFBP-3 variants modified to be resistant to hydrolysis. Also disclosed is a modified IGFBP-3 in which the nuclear localization signal (NLS) in native IGFBP-3 is altered. In addition, IGFBP-3 extended at the amino terminus is disclosed, including various N-terminal extensions (including peptides and nucleotide binding domains), specific binding members (eg, ligand binding domains or immunity from receptors). Antigen binding domains from globulins), and peptide and protein hormones and growth factors. N-terminally extended IGFBP-3 may include hydrolysis-resistant IGFBP-3 or NLS variant IGFBP-3.

最近の刊行物のいくつかは、培養物中の細胞を処理するためのＩＧＦＢＰ−３ペプチドの使用を記載する。乳癌細胞に対して活性であることが見出されている唯一のペプチドは、ＩＧＦＢＰ−３の中間領域に由来する（非特許文献６９；非特許文献７０）。 Some recent publications describe the use of IGFBP-3 peptides to treat cells in culture. The only peptide that has been found to be active against breast cancer cells is derived from the intermediate region of IGFBP-3 (Non-Patent Document 69; Non-Patent Document 70).

２００３年３月２７日に公開された特許文献４７は、上記のＩＧＦ結合タンパク質由来のペプチド（ＩＧＦＢＰ−３のＣ末端ドメインから１２アミノ酸〜２２アミノ酸のみを含む小ペプチドを含む）が、全長分子の、コ−アポトーシス特性、細胞貫通特性、および金属を結合する特性を模倣し得ることを開示する。 Patent Document 47, published on March 27, 2003, discloses a peptide derived from the above IGF binding protein (including a small peptide containing only 12 to 22 amino acids from the C-terminal domain of IGFBP-3). Disclose that it can mimic co-apoptotic properties, cell penetration properties, and metal binding properties.

特許文献４８は、ＩＧＦＢＰ−３の変異体を開示し、このＩＧＦＢＰ−３の変異体は、ＤＮＡ合成を阻害し得、アポトーシスを誘導し得、そしてヒトＩＧＦ−ＩにもヒトＩＧＦ−ＩＩにも結合せず、そしてＹ５７にて変異を含み得る。 U.S. Patent No. 6,057,031 discloses a variant of IGFBP-3, which can inhibit DNA synthesis, induce apoptosis, and both human IGF-I and human IGF-II. It does not bind and may contain a mutation at Y57.

特許文献４９は、Ｘ線回折に適した結晶（この結晶は、ＩＧＦ−ＩまたはＩＧＦ−ＩＩと、ＩＧＦＢＰ−１、ＩＧＦＢＰ−２、ＩＧＦＢＰ−３、ＩＧＦＢＰ−４、またはＩＧＦＢＰ−５の少なくとも第９番目〜第１２番目のシステインまたはＩＧＦＢＰ−６の少なくとも第７番目〜第１０番目のシステインを含む、ＩＧＦＢＰ−１のアミノ酸３９−９１、ＩＧＦＢＰ−２のアミノ酸５５−１０７、ＩＧＦＢＰ−３のアミノ酸４７−９９、ＩＧＦＢＰ−４のアミノ酸３９−９１、ＩＧＦＶＰ−５のアミノ酸４０−９２もしくはＩＧＦＢＰ−６のアミノ酸４０−９２またはこれらのフラグメントとからなるポリペプチドとの複合体を含む）；このような結晶の原子上の座標の決定のための方法；ＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩに対する結合親和性が増強されたＩＧＦＢＰ変異体、ならびにＩＧＦを結合タンパク質から置換する低分子を同定および最適化する方法を開示する。 Patent Document 49 discloses a crystal suitable for X-ray diffraction (this crystal is at least a ninth of IGF-I or IGF-II, IGFBP-1, IGFBP-2, IGFBP-3, IGFBP-4, or IGFBP-5). IGFBP-1 amino acids 39-91, IGFBP-2 amino acids 55-107, IGFBP-3 amino acids 47-, 99, amino acids 39-91 of IGFBP-4, amino acids 40-92 of IGFVP-5 or amino acids 40-92 of IGFBP-6, or fragments thereof, including complexes with such crystals); Method for determination of coordinates on atoms; binding affinity for IGF-I and IGF-II Enhanced IGFBP variants, and discloses a method for identifying and optimizing small molecules that replaced the binding protein IGF.

特許文献５０は、ＩＧＦに対する結合がまったくないかまたは結合が低減した変異体ＩＧＦＢＰ−３ポリペプチドおよびこれらのフラグメントを開示し、ヒトＩＧＦＢＰ−３レセプター（「Ｐ４．３３」）に対して結合する能力を保持する。このフラグメントは、８７アミノ酸〜２６４アミノ酸を有するＮ欠失フラグメントである。フラグメント１−８７は、ＩＧＦ−Ｉにわずかに結合し、そして他のフラグメント（１−４６、１−７５および１−８０）は、まったく結合しない。 U.S. Patent No. 6,057,031 discloses mutant IGFBP-3 polypeptides and fragments thereof with no or reduced binding to IGF and the ability to bind to the human IGFBP-3 receptor ("P4.33"). Hold. This fragment is an N deletion fragment having 87 amino acids to 264 amino acids. Fragment 1-87 binds slightly to IGF-I and the other fragments (1-46, 1-75 and 1-80) do not bind at all.

特許文献５１は、ＩＧＦ−ＩＧＦＢＰ結合の原因となるＩＧＦＢＰフラグメントを開示する。それは、ＩＧＦＢＰまたはこの修飾体の単離されたＩＧＦ結合ドメイン（これは、全長ＩＧＦＢＰと少なくとも同程度の結合親和性でＩＧＦを結合する）を提供する。それはまた、ＩＧＦレセプターに対するＩＧＦの結合を低減するＩＧＦアンタゴニストを提供する。それは、ＩＧＦＢＰ−２フラグメントに特に関連するが、またＩＧＦＢＰ−１、ＩＧＦＢＰ−３、ＩＧＦＢＰ−４、ＩＧＦＢＰ−５、およびＩＧＦＢＰ−６の単離されたＩＧＦ結合ドメインを提供する。ＩＧＦＢＰ−２のＩＧＦ結合ドメインに関し、他のＩＧＦＢＰのＩＧＦ結合ドメインを含むアミノ酸配列は、結合ドメインの結合親和性が比較上のネイティブ全長ＩＧＦＢＰの結合親和性とほぼ同一である限り、修飾された形態を含み得る。 Patent Document 51 discloses an IGFBP fragment that causes IGF-IGFBP binding. It provides an isolated IGF binding domain of IGFBP or a modification thereof that binds IGF with at least as much binding affinity as full length IGFBP. It also provides an IGF antagonist that reduces IGF binding to the IGF receptor. It is particularly related to IGFBP-2 fragments but also provides isolated IGF binding domains of IGFBP-1, IGFBP-3, IGFBP-4, IGFBP-5, and IGFBP-6. With respect to the IGF-binding domain of IGFBP-2, the amino acid sequence comprising the IGF-binding domain of the other IGFBP is a modified form as long as the binding affinity of the binding domain is approximately the same as the binding affinity of the native native full-length IGFBP. Can be included.

特許文献５２は、ＩＧＦＢＰフラグメントおよびその使用（すなわち、そのアミノ酸配列部分において特徴づけられるペプチドは、ＩＧＦＢＰのアミノ酸配列と一致する）を開示する。本発明はまた、環状誘導体、グリコシル化誘導体、リン酸化誘導体、アセチル化誘導体、アミド化誘導体および／または硫酸化誘導体に関する。これらは、ＩＧＦＢＰ−３のＣ末端ドメインを含む。 U.S. Patent No. 6,057,051 discloses an IGFBP fragment and its use (ie, the peptide characterized in its amino acid sequence portion is consistent with the amino acid sequence of IGFBP). The invention also relates to cyclic derivatives, glycosylated derivatives, phosphorylated derivatives, acetylated derivatives, amidated derivatives and / or sulfated derivatives. These contain the C-terminal domain of IGFBP-3.

遺伝子融合体（ｇｅｎｅｆｕｓｉｏｎ）の使用（これは、必要不可欠ではない）は、Ｅ．ｃｏｌｉにおける異種ペプチドの発現およびその後の遺伝子産物の精製を促進し得る（Ｈａｒｒｉｓ，ＧｅｎｅｔｉｃＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｗｉｌｌｉａｍｓｏｎ，Ｒ．編（非特許文献７１；非特許文献７２；および非特許文献７３）。プロテインＡ融合体がしばしば使用される。なぜなら、プロテインＡのＩｇＧに対する結合、より具体的にはプロテインＡのＺドメインのＩｇＧに対する結合は、上記融合タンパク質の精製のための「親和性ハンドル（ａｆｆｎｉｔｙｈａｎｄｌｅ）」を提供する。Ｅ．ｃｏｌｉ内で直接的に発現された場合、多くの異種タンパク質が分解されるが、融合タンパク質として発現された場合には、安定であることもまた示されている（非特許文献７４）。 The use of gene fusions (which is not essential) is described in E.C. Expression of heterologous peptides in E. coli and subsequent purification of the gene product can be facilitated (Harris, Genetic Engineering, Williamson, R. (Non-Patent Document 71; Non-Patent Document 72; and Non-Patent Document 73)). The binding of protein A to IgG, more specifically the binding of protein A Z domain to IgG provides an “affinity handle” for purification of the fusion protein. Many heterologous proteins are degraded when expressed directly in E. coli, but have also been shown to be stable when expressed as a fusion protein (74). ).

融合タンパク質は、メチオニンまたはヒドロキシルアミンにて切断し、Ａｓｎ残基とＧｌｙ残基との間を切断する化学薬品（例えば、臭化シアン）を用いて切断され得る。標準的な組み換えＤＮＡ方法論を用いて、これらのアミノ酸をコードするヌクレオチド塩基対は、所望のペプチドをコードする遺伝子の５’末端の前に挿入され得る。 The fusion protein can be cleaved with a chemical (eg, cyanogen bromide) that cleaves with methionine or hydroxylamine and cleaves between the Asn and Gly residues. Using standard recombinant DNA methodology, nucleotide base pairs encoding these amino acids can be inserted before the 5 'end of the gene encoding the desired peptide.

あるいは、融合タンパク質のタンパク質分解性の切断が使用され得る（非特許文献７５）。 Alternatively, proteolytic cleavage of the fusion protein can be used (75).

エピトープをＩＧＦＢＰ−３または他のリガンドの上に結合させる工程を解明するために使用され得、治療上または診断上の用途のためにＩＧＦアンタゴニストとして作用して循環型ＩＧＦおよびレセプター応答のレベルを制御し、そして他の治療上、診断上、またはアッセイの目的で使用され得る分子が、当該分野においてずっと必要とされている。
国際公開第０１／７５０６４号パンフレット米国特許第６，１２１，４１６号明細書米国特許第６，２５１，８６５号明細書米国特許第５，０７７，２７６号明細書米国特許第５，１６４，３７０号明細書米国特許第５，４７０，８２８号明細書国際公開第９６／３３２１６号パンフレット欧州特許第７４２，２２８号明細書米国特許第５，７１４，４６０号明細書国際公開第９７９２号パンフレット国際公開第８９／０８６６７号パンフレット国際公開第８９／０９２６８号パンフレット国際公開第９０／００５６９号パンフレット国際公開第９２／０３４７１号パンフレット国際公開第９２／０３４７０号パンフレット国際公開第９２／１２２４３号パンフレット国際公開第９２／０３４６９号パンフレット国際公開第９２／０３１５２号パンフレット米国特許出願公開第２００３／００８２７４４号明細書米国特許第６，０２５，４６５号明細書米国特許第５，２１２，０７４号明細書国際公開第０３／０６８１６０号パンフレット国際公開第０３／００６０２９号パンフレット米国特許第６，４１０，３３５号明細書米国特許出願公開第２００１／００１８１９０号明細書米国特許第５，８４０，６７３号明細書欧州特許第８７１，４７５号明細書国際公開第００／３５４７３号パンフレット国際公開第９４／２２４６６号パンフレット国際公開第９２／１４８３４号パンフレット国際公開第００／２３４６９号パンフレット欧州特許第６３９９８１号明細書国際公開第０１／７２７７１号パンフレット米国特許出願公開第２００３／００９２６３１号明細書米国特許第６，５００，６３５号明細書米国特許第６，３９１，５８８号明細書米国特許第６，４８９，２９４号明細書米国特許第６，３６９，０２９号明細書米国特許出願公開第２００３／０１６１８２９Ａ１号明細書国際公開第０３／０２５１２１号パンフレット国際公開第０１／８７２３８号パンフレット国際公開第０２／３４９１６号パンフレット国際公開第０１／８７２３８号パンフレット米国特許第６，４１７，３３０号明細書国際公開第９９／６３０８６号パンフレット米国特許出願公開第２００２／００７２５８９号明細書米国特許出願公開第２００３／００５９４３０号明細書国際公開第０３／０５２０７９号パンフレット国際公開第０２／０９８９１４号パンフレット国際公開第０２／３４９１６号パンフレット国際公開第００／２３４６９号パンフレット国際公開第９９／３２６２０号パンフレットＣｌａｒｋおよびＲｏｂｉｎｓｏｎ，ＣｙｔｏｋｉｎｅＧｒｏｗｔｈＦａｃｔｏｒＲｅｖ．，７：６５−８０（１９９６）ＪｏｎｅｓおよびＣｌｅｍｍｏｎｓ，Ｅｎｄｏｃｒ．Ｒｅｖ．，１６：３−３４（１９９５）ＭｃＩｎｎｅｓおよびＳｙｋｅｓ，Ｂｉｏｐｏｌｙ．，４３：３３９−３６６（１９９８）Ｕｌｌｒｉｃｈら、ＥＭＢＯＪ．，５：２５０３−２５１２（１９８６）Ｇａｒｒｅｔｔら、Ｎａｔｕｒｅ，３９４：３９５−３９９（１９９８）Ｂａｘｔｅｒら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，１３９：４０３６（１９９８）ＢａｃｈおよびＲｅｃｈｌｅｒ，ＤｉａｂｅｔｅｓＲｅｖｉｅｗｓ，３：３８−６１（１９９５）Ｏｈら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，１３２：１３３７−１３４４（１９９３）Ｃｏｏｋｅら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３０：５４８４−５４９１（１９９１）Ｈｕａら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２５９：２９７−３１３（１９９６）ＤｅＷｏｌｆら、ＰｒｏｔｅｉｎＳｃｉｅｎｃｅ，５：２１９３−２２０２（１９９６）Ｔｅｒａｓａｗａら、ＥＭＢＯＪ．１３：５５９０−５５９７（１９９４）Ｔｏｒｒｅｓら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２４８：３８５−４０１（１９９５）Ｌｏｄｄｉｃｋら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９５：１８９４−１８９８（１９９８）Ｌｏｗｍａｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３７：８８７０−８８７８（１９９８）Ｂａｙｎｅら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５：１５６４８−１５６５２（１９９０）Ｂａｙｎｅら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６４：１１００４−１１００８（１９８９）Ｃａｓｃｉｅｒｉら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２７：３２２９−３２３３（１９８８）Ｂａｒら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，１２７：３２４３−３２４５（１９９０）Ｂａｇｌｅｙら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，２５９：６６５−６７１（１９８９）Ｂａｘｔｅｒら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６７：６０−６５（１９９２）Ｂａｙｎｅら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６３：６２３３−６２３９（１９８８）Ｃｌｅｍｏｎｓら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５：１２２１０−１２２１６（１９９０）Ｃｌｅｍｍｏｎｓら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，１３１：８９０−８９５（１９９２）Ｈｅｄｉｎｇら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７１：１３９４８−１３９５２（１９９６）Ｊａｎｓｓｏｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍｓｔｒｙ，３６：４１０８−４１１７（１９９７）Ｊａｎｓｓｏｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７３：２４７０１−２４７０７（１９９８）Ｃａｓｃｉｅｒｉら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２７：３２２９−３２３３（１９８８）Ｂａｙｎｅら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６４：１１００４−１１００８（１９８８）Ｐｅｔｅｒｋｏｆｓｋｙら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ、１２８：１７６９−１７７９（１９９１）Ｃａｓｃｉｅｒｉら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６４：２１９９−２２０２（１９８９）Ｓｌｉｅｃｋｅｒら、Ａｄｖ．ＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌＭｅｄ．Ｂｉｏｌ．，３４３：２５−３２（１９９４））Ｃｌｅｍｍｏｎｓら、（１９９１）ＭｏｄｅｒｎＣｏｎｃｅｐｔｓｏｆＩｎｓｕｌｉｎ−ｌｉｋｅＧｒｏｗｔｈＦａｃｔｏｒｓ．Ｅ．Ｍ．Ｓｐｅｎｃｅｒ（編）Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，ＮｅｗＹｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．４７５−４８６Ｂｉｎｋｅｒｔら、ＴｈｅＥＭＢＯＪｏｕｒｎａｌ，８：２４９７−２５０２（１９８９）Ｂａｘｔｅｒら、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍ．，１３９：１２５６−１２６１（１９８６）Ｗｏｏｄら、Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．，２：１１７６−１１８５（１９８８）Ｓｃｈｍｉｄら、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．ＲｅｓＣｏｍ．，１７９：５７９−５８５（１９９１）Ｍｏｈａｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，８６：８３３８−８３４２（１９８９）Ｓｈｉｍａｓａｋｉら、Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｏｇｙ，４：１４５１−１４５８（１９９０）ＡｎｄｒｅｓｓおよびＢｉｒｎｂａｕｍ、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．ＲｅｓＣｏｍ．，１７６：２１３−２１８（１９９１）Ｚａｐｆら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６５：１４８９２〜１４８９８（１９９０）Ｓｈｉｍａｓａｋｉら、第２回国際ＩＧＦシンポジウムのアブストラクト（１９９１年１月）Ｓｈｉｍａｓａｋｉら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６：１０６４６−１０６５３（１９９１）Ｓｈｉｍａｓａｋｉら、Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．，５：９３８−９４８（１９９１）Ｍｏｈａｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（Ｕ．Ｓ．Ａ．）８６：８３３８−８３４２（１９８９）ＬａＴｏｕｒら、Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．４：１８０６−１８１４（１９９０）Ｐｉｅｔｚｋｏｗｓｋｉら、ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．５２：６４４７−６４５１（１９９２）Ｃｏｏｋｅら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．，３０：５４８４−５４９１（１９９１）Ｂａｙｎｅら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６４：１１００４−１１００８（１９８８）Ｙｅｅら、ＣｅｌｌＧｒｏｗｔｈａｎｄＤｉｆｆｅｒｅｎｔ．，５：７３−７７（１９９４）Ｂｌｕｎｄｅｌｌら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７５：１８０−１８４（１９７８）Ｂｌｕｎｄｅｌｌら、ＦｅｄＰｒｏｃ．，４２：２５９２（１９８３）ＤｅＷｏｌｆら、ＰｒｏｔｅｉｎＳｃｉ．，５：２１９３（１９９６）Ｓａｔｏら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔ．４１：４３３（１９９３）Ｔｏｒｒｅｓら、ＪＭｏｌ．Ｂｉｏｌ．２４８：３８５（１９９５）Ｌａａｊｏｋｉら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５：１０００９（２０００）Ｃｌｅｍｍｏｎｓ，ＣｙｔｏｋｉｎｅＧｒｏｗｔｈＦａｃｔｏｒＲｅｖ．８：４５−６２（１９９７）ＭａｒｔｉｎおよびＢａｘｔｅｒ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．Ｄｉａｂ．１６−２１（１９９４）Ｃｈｅｒｎａｕｓｅｋら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：１１３７７−１１３８２（１９９５）Ｃｏｎｏｖｅｒ，Ｐｒｏｇ．ＧｒｏｗｔｈＦａｃｔｏｒＲｅｓ．，６：３０１−３０９（１９９５）Ｋａｌｕｓら、ＥＭＢＯＪ．１７：６５５８〜６５７２（１９９８）Ｇａｌａｎｉｓら、ＪｏｕｎｒａｌｏｆＥｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，１６９（１）：１２３−１３３（２００１）Ｖｏｒｗｅｒｋら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，１４３（５）：１６７７−１６８５（２００２）Ｌｉｕら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７５：３３６０７〜３３６１３（２０００）Ｗｅｉｎｚｅｉｍｅｒら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．Ｍｅｔａｂ．，８６：１８０６−１３（２００１）Ｃａｍｐｂｅｌｌら、Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．，２７５：Ｅ３２１−Ｅ２３１（１９９８）Ｃａｍｐｂｅｌｌら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４：３０３１５−３０２２１（１９９９）Ｆｉｒｔｈら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７３：２６３１−２６３８（１９９８）ＭｃＣａｉｇら、Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，８６：１９６３−１９６９（２００２）Ｐｅｒｋｓら、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．、２９４：９８８−９９４（２００２）Ｈａｒｒｉｓ，ＧｅｎｅｎｔｉｃＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｗｉｌｌｉａｍｓｏｎ，Ｒ．（編）（ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ，第４巻、１９８３），ｐ１２７Ｌｊｕｎｇｑｕｉｓｔら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１８６：５５７−５６１（１９８９）Ｌｊｕｎｇｑｕｉｓｔら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１８６：５６３−５６９（１９８９）Ｍａｒｓｔｏｎ，ＢｉｏｃｈｅｍＪ．２４０：１（１９８６）Ｃａｒｔｅｒ、ＰｒｏｔｅｉｎＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：ＭｏｌｅｃｕｌａｒＭｅｃｈａｎｉｓｍｔｏＬａｒｇｅ−ＳｃａｌｅＰｒｏｃｅｓｓｅｓ，Ｌａｄｉｓｃｈら、編（ＡｍｅｒｉｃａｎＣｈｅｍｉｃａｌＳｏｃｉｅｔｙＳｙｍｐｏｓｉｕｍＳｅｒｉｅｓ、Ｎｏ．４２７，１９９０）、Ｃｈ１３、１８１頁〜１９３頁 Can be used to elucidate the process of binding epitopes onto IGFBP-3 or other ligands and act as IGF antagonists for therapeutic or diagnostic applications to control the level of circulating IGF and receptor responses However, there is a continuing need in the art for molecules that can be used for other therapeutic, diagnostic, or assay purposes.
International Publication No. 01/75064 Pamphlet US Pat. No. 6,121,416 US Pat. No. 6,251,865 US Pat. No. 5,077,276 US Pat. No. 5,164,370 US Pat. No. 5,470,828 International Publication No. 96/33216 Pamphlet EP 742,228 US Pat. No. 5,714,460 International Publication No. 9792 Pamphlet International Publication No. 89/08667 Pamphlet WO89 / 09268 pamphlet International Publication No. 90/00569 Pamphlet International Publication No. 92/03471 Pamphlet International Publication No. 92/03470 Pamphlet International Publication No. 92/12243 International Publication No. 92/03469 Pamphlet International Publication No. 92/03152 Pamphlet US Patent Application Publication No. 2003/0082744 US Pat. No. 6,025,465 US Pat. No. 5,212,074 International Publication No. 03/068160 Pamphlet International Publication No. 03/006029 Pamphlet US Pat. No. 6,410,335 US Patent Application Publication No. 2001/0018190 US Pat. 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No. 6,417,330 WO99 / 63086 pamphlet US Patent Application Publication No. 2002/0072589 US Patent Application Publication No. 2003/0059430 International Publication No. 03/052079 Pamphlet International Publication No. 02/098914 Pamphlet International Publication No. 02/34916 Pamphlet International Publication No. 00/23469 Pamphlet WO99 / 32620 pamphlet Clark and Robinson, Cytokine Growth Factor Rev. 7: 65-80 (1996). Jones and Clemmons, Endocr. Rev. 16: 3-34 (1995) McInnes and Sykes, Biopoly. 43: 339-366 (1998). Ullrich et al., EMBO J. et al. , 5: 2503-2512 (1986) Garrett et al., Nature, 394: 395-399 (1998). Baxter et al., Endocrinology, 139: 4036 (1998). Bach and Rechler, Diabetes Reviews, 3: 38-61 (1995). Oh et al., Endocrinology, 132: 1337-1344 (1993). Cooke et al., Biochemistry, 30: 5484-5491 (1991). Hua et al. Mol. Biol. 259: 297-313 (1996). DeWolf et al., Protein Science, 5: 2193-2202 (1996). Terasawa et al., EMBO J. et al. 13: 5590-5597 (1994) Torres et al. Mol. 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（発明の要旨）
従って、本発明は、請求される通りである。一つの実施形態において、本発明は、融合タンパク質（すなわち、ヒトＩＧＦＢＰ−３）を提供し、この融合タンパク質は、ＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓからのプロテインＡの合成されたＺドメインに連結されたネイティブ配列ヒトＩＧＦＢＰ−３フラグメントの残基４７〜残基９９からなるＩＧＦＢＰ−３フラグメント（以下の配列番号１）（すなわち、短縮型ＩＧＦＢＰ−３）を含み、これは、以下の配列：
ＶＤＮＫＦＮＫＥＱＱＮＡＦＹＥＩＬＨＬＰＮＬＮＥＥＱＲＮＡＦＩＱＳＬＫＤＤＰＳＱＳＡＮＬＬＡＥＡＫＫＬＮＤＡＱＡＰＫ（配列番号１０）
を有する。 (Summary of the Invention)
Accordingly, the present invention is as claimed. In one embodiment, the present invention provides a fusion protein (ie, human IGFBP-3), which is a native sequence human IGFBP- linked to the synthesized Z domain of protein A from Staphylococcus aureus. 3 fragment IGFBP-3 fragment (SEQ ID NO: 1 below) consisting of residue 47 to residue 99 (ie, truncated IGFBP-3), which has the following sequence:
VDNKFNKEQQNAFYEILHLPNLNEEEQRNAFIQSLKDDSQSANLLLAEAKKLNDAQAPK (SEQ ID NO: 10)
Have

このような一つの実施形態において、この融合タンパク質は、ファージ上にディスプレイされる。別の実施形態では、このフラグメントは、切断可能なリンカーペプチドを用いて、Ｚドメインに連結される。このような切断可能なリンカーペプチドは、好ましくは、以下の配列のうちの一つを含む：ＤＬＶＤ（配列番号２）、ＤＥＭＤ（配列番号３）、ＤＡＶＤ（配列番号４）、ＥＦＧＧＧＤＤＤＫ（配列番号５）、ＥＦＧＧＬＶＰＲＧＳ（配列番号６）、ＥＦＧＧＤＬＶＤ（配列番号７）、ＥＦＧＧＤＥＭＤ（配列番号８）、またはＥＦＧＧＤＡＶＤ（配列番号９）。別の実施形態では、ＡＳＡ配列は、ＺドメインのＮ末端に存在する。なお別の実施形態では、このフラグメントは、アフィニティーマチュレーションされる。 In one such embodiment, the fusion protein is displayed on a phage. In another embodiment, the fragment is linked to the Z domain using a cleavable linker peptide. Such a cleavable linker peptide preferably comprises one of the following sequences: DLVD (SEQ ID NO: 2), DEMD (SEQ ID NO: 3), DAVD (SEQ ID NO: 4), EFGGGDDDK (SEQ ID NO: 5 ), EFGGLVPRGS (SEQ ID NO: 6), EFGGDLVD (SEQ ID NO: 7), EFGGDEMD (SEQ ID NO: 8), or EFGGDAVD (SEQ ID NO: 9). In another embodiment, the ASA sequence is at the N-terminus of the Z domain. In yet another embodiment, the fragment is affinity maturated.

本明細書中でまた提供されるのは、キャリア（好ましくは薬学的に受容可能なキャリア）中に上記融合タンパク質を含有する組成物である。好ましくは、この組成物は、滅菌されている。 Also provided herein is a composition containing the fusion protein in a carrier, preferably a pharmaceutically acceptable carrier. Preferably the composition is sterilized.

さらに提供されるのは、融合タンパク質をコードする核酸分子、上記核酸を含むベクター、上記核酸を含む宿主細胞、ならびにＩＧＦＢＰ−３融合タンパク質を産生する方法であって、この方法は、上記宿主細胞を適切な条件下で培養し、上記融合タンパク質を発現させる工程、およびこの融合タンパク質を宿主細胞培養物から回収する工程を包含する。上記宿主が原核生物であり、より好ましくは、細菌細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）であることが望ましい。 Further provided is a nucleic acid molecule encoding the fusion protein, a vector comprising the nucleic acid, a host cell comprising the nucleic acid, and a method of producing an IGFBP-3 fusion protein, the method comprising: Culturing under appropriate conditions to express the fusion protein, and recovering the fusion protein from the host cell culture. Desirably, the host is a prokaryote, more preferably a bacterial cell (eg, E. coli).

これらの融合タンパク質は、リガンドがＩＧＦＢＰ−３結合部位を有するかを決定するためのアッセイを包含する多くの適用において使用され得る。ＩＧＦ−Ｉ結合部位またはＩＧＦ−ＩＩ結合部位を含む、本明細書中の融合タンパク質は、構造的なデータがない場合に、ネイティブ配列ヒトＩＧＦＢＰ−３上の、ＩＧＦ結合部位およびＩＧＦ−Ｉ以外のＩＧＦ−ＩアゴニストリガンドＩＧＦ結合部位およびＩＧＦ−Ｉ以外のＩＧＦ−Ｉアゴニストリガンド（例えば、ファージパニング実験により単離されたペプチド（例えば、Ｌｏｗｍａｎら（前出）中に記載されたｂｐ１５）の結合部位の解明およびマッピングのためにさらに有用である。 These fusion proteins can be used in many applications, including assays for determining whether a ligand has an IGFBP-3 binding site. Fusion proteins herein that contain an IGF-I binding site or an IGF-II binding site are those other than IGF binding site and IGF-I on native sequence human IGFBP-3 in the absence of structural data. IGF-I agonist ligands IGF binding sites and IGF-I agonist ligands other than IGF-I (eg, peptides isolated by phage panning experiments (eg, bp15 described in Lowman et al., Supra)) More useful for elucidation and mapping.

なお別の実施形態では、本発明は、細胞ベースのアッセイにおける、ネイティブ配列ヒトＩＧＦＢＰ−３、ネイティブ配列ヒトＩＧＦ−Ｉ、もしくはネイティブ配列ヒトＩＧＦ−ＩＩ、または上記ＩＧＦ−Ｉもしくは上記ＩＧＦ−ＩＩのアゴニストの生物学的活性を決定するための方法を提供し、この方法は、細胞と、融合タンパク質（これは、ネイティブ配列ヒトＩＧＦＢＰ−３ではなくＩＧＦ−ＩもしくはＩＧＦ−ＩＩに結合するＩＧＦＢＰ−３フラグメントに連結されたペプチドを含む）とを接触させる工程、ならびにネイティブ配列ヒトＩＧＢＰ−３、ネイティブ配列ヒトＩＧＦ−Ｉ、またはネイティブ配列ヒトＩＧＦ−ＩＩ、または上記ＩＧＦ−Ｉもしくは上記ＩＧＦ−ＩＩのアゴニストに起因し得る生物学的活性が観察されるか否かを決定する工程を包含する。 In yet another embodiment, the present invention relates to native sequence human IGFBP-3, native sequence human IGF-I, or native sequence human IGF-II, or IGF-I or IGF-II in a cell-based assay. A method is provided for determining the biological activity of an agonist, which comprises a cell and a fusion protein (which binds to IGF-I or IGF-II rather than native sequence human IGFBP-3 to IGFBP-3). And a native sequence human IGBP-3, native sequence human IGF-I, or native sequence human IGF-II, or an agonist of IGF-I or IGF-II Is biological activity that can be attributed to Or it includes the step of determining the.

一つの実施形態では、この生物学的活性は、ＩＧＦ−Ｉとは独立した、ネイティブ配列ヒトＩＧＦＢＰ−３のアポトーシスである。 In one embodiment, the biological activity is apoptosis of native sequence human IGFBP-3 independent of IGF-I.

別の実施形態では、このアッセイは、ＩＧＦ依存性のＫＩＲＡリン酸化アッセイである。このアッセイは、ヒト１型レセプターの直接的な活性のアッセイである。チロシンキナーゼファミリーのレセプター（例えば、１型ＩＧＦ−１レセプター）が活性化される場合、これは、チロシン残基上でリン酸化される。このアッセイにおいて、１型ＩＧＦレセプターを含む細胞は、インビトロで活性化され、次いで、崩壊（ｄｉｓｒｕｐｔ）され、そしてこのレセプターに対する抗体が使用され、ＩＧＦレセプターを沈殿せしめる。次に、抗ホスホチロシン抗体を使用し、リン酸化された１型ＩＧＦレセプターの量をアッセイする。固定数の細胞が使用される場合、リン酸化されたレセプターの量は、１型ＩＧＦレセプター上の分子の活性の直接的な基準である。このＫＩＲＡアッセイにおいて、細胞（例えば、乳癌細胞株）は、ＩＧＦ−ＩまたはＩＧＦ−ＩＩプラス上記融合タンパク質で処理され、そしてこの融合タンパク質の生物学的活性は、リン酸化されたレセプターの量により決定される。 In another embodiment, the assay is an IGF-dependent KIRA phosphorylation assay. This assay is a direct activity assay for the human type 1 receptor. When a tyrosine kinase family receptor (eg, type 1 IGF-1 receptor) is activated, it is phosphorylated on tyrosine residues. In this assay, cells containing type 1 IGF receptor are activated in vitro, then disrupted, and antibodies to this receptor are used to precipitate the IGF receptor. The amount of phosphorylated type 1 IGF receptor is then assayed using an anti-phosphotyrosine antibody. When a fixed number of cells is used, the amount of phosphorylated receptor is a direct measure of the activity of the molecule on the type 1 IGF receptor. In this KIRA assay, cells (eg, breast cancer cell lines) are treated with IGF-I or IGF-II plus the fusion protein and the biological activity of the fusion protein is determined by the amount of phosphorylated receptor. Is done.

なお別の実施形態では、生物学的活性は、放射標識したＩＧＦ−ＩまたはＩＧＦ−ＩＩの細胞への結合の阻害である。 In yet another embodiment, the biological activity is inhibition of radiolabeled IGF-I or IGF-II binding to cells.

さらなる局面では、本発明は、アポトーシスの増強を決定するための方法を提供し、この方法は、乳癌細胞を、細胞をアポトーシス因子（例えば、パクリタキセルまたはドキソルビシン）で処理する前にＩＧＦ−ＩまたはＩＧＦ−ＩＩを結合するＩＧＦＢＰ−３フラグメントまたはその融合タンパク質、およびネイティブ配列ヒトＩＧＦＢＰ−３または上記ＩＧＦＢＰ−３フラグメントもしくはその融合タンパク質で少なくとも２４時間処理する工程、ならびに、この前処理もしくは処理が、アポトーシス因子を用いた処理により誘導されるアポトーシスを増強するか、または前処理もしくは処理がその目的に対して有効である量を決定する工程を包含する。 In a further aspect, the present invention provides a method for determining enhanced apoptosis, wherein the method comprises treating breast cancer cells with IGF-I or IGF prior to treating the cells with an apoptotic factor (eg, paclitaxel or doxorubicin). Treatment with IGFBP-3 fragment or fusion protein binding II, and native sequence human IGFBP-3 or the IGFBP-3 fragment or fusion protein thereof for at least 24 hours, and this pretreatment or treatment comprises an apoptosis factor Enhancing the apoptosis induced by treatment with or determining the amount that pretreatment or treatment is effective for that purpose.

（発明の詳細な説明）
（Ａ．定義）
本明細書中で使用される場合、「ＩＧＦ」とは、ネイティブなインスリン様増殖因子Ｉおよびネイティブなインスリン様増殖因子ＩＩ、ならびにこれらの天然に存在する改変体（例えば、脳ＩＧＦ、別名デス（１−３）ＩＧＦ−Ｉとして公知）をいう。 (Detailed description of the invention)
(A. Definition)
As used herein, “IGF” refers to native insulin-like growth factor I and native insulin-like growth factor II, and naturally occurring variants thereof (eg, brain IGF, also known as death ( 1-3) known as IGF-I).

本明細書中で使用される場合、「ＩＧＦ−Ｉ」とは、任意の種（このような種としては、ウシ、ヒツジ、ブタ、ウマ、およびヒトが挙げられるが、好ましくは、ヒト）からのインスリン様増殖因子Ｉならびに任意の供給源からのインスリン様増殖因子Ｉ（天然インスリン様増殖因子Ｉ、合成インスリン様増殖因子Ｉ、または組み換えインスリン様増殖因子Ｉ）をいう。これは、例えば、１９８７年８月５日に公開されたＥＰ２３０，８６９；１９８４年１２月１９日に公開されたＥＰ１２８，７３３；または１９８８年１０月２６日に公開されたＥＰ２８８，４５１に記載されるプロセスにより調製され得る。「ネイティブ配列ヒトＩＧＦ−Ｉ」または「野生型ＩＧＦ−Ｉ」は、野生型のヒトＩＧＦ−Ｉである。 As used herein, “IGF-I” refers to any species (such species include cattle, sheep, pigs, horses, and humans, but preferably humans). Of insulin-like growth factor I as well as insulin-like growth factor I from any source (natural insulin-like growth factor I, synthetic insulin-like growth factor I, or recombinant insulin-like growth factor I). This is described, for example, in EP 230,869 published August 5, 1987; EP 128,733 published December 19, 1984; or EP 288,451 published October 26, 1988. Can be prepared by a process. “Native sequence human IGF-I” or “wild type IGF-I” is wild type human IGF-I.

本明細書中で使用される場合、「ＩＧＦ−ＩＩ」とは、任意の種（このような種としては、ウシ、ヒツジ、ブタ、ウマ、およびヒトが挙げられるが、好ましくはヒト）からのインスリン様増殖因子ＩＩならびに任意の供給源からのインスリン様増殖因子ＩＩ（天然インスリン様増殖因子ＩＩ、合成インスリン様増殖因子ＩＩ、または組み換えインスリン様増殖因子ＩＩ）をいう。ＩＧＦ−ＩＩは、例えば、ＥＰ１２８，７３３において記載される方法により調製され得る。「ネイティブ配列ヒトＩＧＦ−ＩＩ」または「野生型ＩＧＦ−ＩＩ」は、野生型のヒトＩＧＦ−ＩＩである。 As used herein, “IGF-II” refers to any species (such as bovines, sheep, pigs, horses, and humans, but preferably humans). It refers to insulin-like growth factor II as well as insulin-like growth factor II from any source (natural insulin-like growth factor II, synthetic insulin-like growth factor II, or recombinant insulin-like growth factor II). IGF-II can be prepared, for example, by the method described in EP128,733. “Native sequence human IGF-II” or “wild type IGF-II” is wild type human IGF-II.

「ＩＧＦＢＰ」または「ＩＧＦ結合タンパク質」とは、ＩＧＦ−ＩまたはＩＧＦ−ＩＩが循環性（すなわち、血清中または組織中）であるか否かに関わらず、通常ＩＧＦ−ＩまたはＩＧＦ−ＩＩと会合するか、結合するか、または複合体形成するタンパク質またはポリペプチドをいう。このような結合タンパク質は、レセプターを含まない。この定義は、ＩＧＦＢＰ−１、ＩＧＦＢＰ−２、ＩＧＦＢＰ−３、ＩＧＦＢＰ−４、ＩＧＦＢＰ−５、ＩＧＦＢＰ−６、Ｍａｃ２５（ＩＧＦＢＰ−７）、およびプロスタサイクリン刺激因子（ＰＳＦ）、または内皮細胞特異的分子（ＥＳＭ−１）、ならびにＩＧＦＢＰに対して高い相同性を有する他のタンパク質を包含する。Ｍａｃ２５は、例えば、Ｓｗｉｓｓｈｅｌｍら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９２：４４７２−４４７６（１９９５）およびＯｈら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７１：３０３２２〜３０３２５（１９９６）に記載される。ＰＳＦは、Ｙａｍａｇｕｃｈｉら、ＢｉｏｃｈｅｍｃａｌＪｏｕｒｎａｌ，３０３：５９１−５９８（１９９４）に記載されている。ＥＳＭ−１は、Ｌａｓｓａｌｌｅら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７１：２０４５８−２０４６４（１９９６）に記載されている。他の同定されたＩＧＦＢＰとしては、例えば、１９９０年６月２７日に公開されたＥＰ３７５，４３８；１９９０年５月２３日に公開されたＥＰ３６９，９４３；１９８９年１０月５日に公開されたＷＯ８９／０９２６８；Ｗｏｏｄら、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＥｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，２：１１７６−１１８５（１９８８）；Ｂｒｉｎｋｍａｎら、ＴｈｅＥＭＢＯＪ．７：２４１７−２４２３（１９８８）；Ｌｅｅら、Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．，２：４０４−４１１（１９８８）；Ｂｒｅｗｅｒら、ＢＢＲＣ，１５２：１２８９−１２９７（１９８８）；１９８８年１２月７日に公開されたＥＰ２９４，０２１；Ｂａｘｔｅｒら、ＢＢＲＣ、１４７：４０８−４１５（１９８７）；Ｌｅｕｎｇら、Ｎａｔｕｒｅ，３３０：５３７−５４３（１９８７）；Ｍａｒｔｉｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６１：８７５４−８７６０（１９８６）；Ｂａｘｔｅｒら、Ｃｏｍｐ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．９１Ｂ：２２９−２３５（１９８８）；１９８９年９月２１日に公開されたＷＯ８９／０８６６７；１９８９年１０月１９日に公開されたＷＯ８９／０９７９２；Ｂｉｎｋｅｒｔら、ＥＭＢＯＪ．，８：２４９７−２５０２（１９８９）；ＥＰ３６９，９４３Ｂ１；米国特許第５，９７３，１１５号；ＥＰ１，２９５、９３９；および米国特許第６，００４，７７５号およびＥＰ５４６０５３を参照のこと。 “IGFBP” or “IGF-binding protein” is usually associated with IGF-I or IGF-II, regardless of whether IGF-I or IGF-II is circulating (ie, in serum or tissue). Refers to a protein or polypeptide that binds, binds, or forms a complex. Such binding proteins do not contain receptors. This definition includes IGFBP-1, IGFBP-2, IGFBP-3, IGFBP-4, IGFBP-5, IGFBP-6, Mac25 (IGFBP-7), and prostacyclin stimulating factor (PSF), or endothelial cell specific molecule (ESM-1), as well as other proteins with high homology to IGFBP. Mac25 is described, for example, in Swisshelm et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92: 4472-4476 (1995) and Oh et al., J. Biol. Biol. Chem. 271: 30322-30325 (1996). PSF is described in Yamaguchi et al., Biochemical Journal, 303: 591-598 (1994). ESM-1 is described in Lassalle et al. Biol. Chem. 271: 20458-20464 (1996). Other identified IGFBPs include, for example, EP 375,438 published on June 27, 1990; EP 369,943 published on May 23, 1990; published on October 5, 1989 WO 89/09268; Wood et al., Molecular Endocrinology, 2: 1176-1185 (1988); Brinkman et al., The EMBO J. Biol. 7: 2417-2423 (1988); Lee et al., Mol. Endocrinol. 2: 404-411 (1988); Brewer et al., BBRC, 152: 1289-1297 (1988); EP 294,021 published December 7, 1988; Baxter et al., BBRC, 147: 408-415 (1987). Leung et al., Nature, 330: 537-543 (1987); Martin et al., J. Biol. Biol. Chem. 261: 8754-8760 (1986); Baxter et al., Comp. Biochem. Physiol. 91B: 229-235 (1988); WO 89/08667 published September 21, 1989; WO 89/09792 published October 19, 1989; Binkert et al., EMBO J. et al. 8: 2497-2502 (1989); EP 369,943B1; US Pat. No. 5,973,115; EP 1,295,939; and US Pat. No. 6,004,775 and EP 546053.

「ＩＧＦＢＰ−３」すなわち「インスリン様増殖因子結合タンパク質−３」とは、任意の種（このような種としては、ウシ、ヒツジ、ブタ、ウマ、およびヒトが挙げられるが、好ましくは、ヒト）からのＩＧＦＢＰ−３もしくはＢＰ５３、または任意の供給源（天然、合成または組み換え）からのＩＧＦＢＰ−３もしくはＢＰ５３をいい、米国特許第５，２５８，２８７号および同第５，３２８，８９１号に記載される。「ネイティブ配列ヒトＩＧＦＢＰ−３」「野生型ＩＧＦＢＰ−３」および「全長ＩＧＦＢＰ−３」は、米国特許第５，２５８，２８７号および同第５，３２８，８９１号に記載された、５位にグリシンを有する野生型ヒトＩＧＦＢＰ−３もしくはＢＰ−５３（すなわち、配列番号１）または５位にアラニンを有する野生型ヒトＩＧＦＢＰ−３もしくはＢＰ−５３（すなわち、配列番号１２）である。 "IGFBP-3" or "insulin-like growth factor binding protein-3" refers to any species (such species include cattle, sheep, pigs, horses, and humans, but preferably humans) IGFBP-3 or BP53 from IGFBP-3, or IGFBP-3 or BP53 from any source (natural, synthetic or recombinant), as described in US Pat. Nos. 5,258,287 and 5,328,891 Is done. “Native sequence human IGFBP-3”, “wild type IGFBP-3” and “full length IGFBP-3” are in position 5 as described in US Pat. Nos. 5,258,287 and 5,328,891. Wild type human IGFBP-3 or BP-53 with glycine (ie, SEQ ID NO: 1) or wild type human IGFBP-3 or BP-53 with alanine at position 5 (ie, SEQ ID NO: 12).

配列番号１は、以下の配列： SEQ ID NO: 1 is the following sequence:

である。

It is.

配列番号１２は、以下の配列： SEQ ID NO: 12 is the following sequence:

である。

It is.

「ＩＧＦＢＰ−３フラグメント」とは、少なくとも１つのアミノ酸を欠くネイティブ配列ヒトＩＧＦＢＰ−３（配列番号１または配列番号１２）である。好ましくは、このフラグメントは、ネイティブ配列ヒトＩＧＦＢＰ−３（配列番号１または配列番号１２）のＮ末端フラグメント（例えば、残基１−残基４６、残基１−残基８８、残基１−残基８９、残基１−残基９０、残基１−残基９１、残基１−残基９２、残基１−残基９３、残基１−残基９４、残基１−残基９５、残基１−残基９６、残基１−残基９７、残基１−残基９８、残基１−残基９９、残基１−残基１８５、または残基４７−残基９９を有する（もしくはこれと一致する）ペプチド）あるいはネイティブ配列ヒトＩＧＦＢＰ−３（配列番号１）のＣ末端フラグメント（例えば、残基９８−残基２６４、残基１００−残基２６４、残基１６５−残基２６４、残基１８５−残基２６４を有するペプチド）である。より好ましくは、ＩＧＦＢＰ−３フラグメントは、ネイティブ配列ヒトＩＧＦＢＰ−３（配列番号１または配列番号１２）の残基１−残基４６、残基１−残基８８、残基１−残基９７、残基１−残基９９、残基４７−残基９９、残基１−残基１８５、残基９８−残基２６４、残基１００−残基２６４、残基１６５−残基２６４および残基１８５−残基２６４を有するペプチドからなる群より選択され、そして最も好ましくは、ネイティブ配列ヒトＩＧＦＢＰ−３（配列番号１）の残基４７−残基９９を有するペプチドである。 An “IGFBP-3 fragment” is a native sequence human IGFBP-3 lacking at least one amino acid (SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 12). Preferably, this fragment is an N-terminal fragment (eg, residue 1-residue 46, residue 1-residue 88, residue 1-residue) of native sequence human IGFBP-3 (SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 12). Group 89, residue 1-residue 90, residue 1-residue 91, residue 1-residue 92, residue 1-residue 93, residue 1-residue 94, residue 1-residue 95 , Residue 1-residue 96, residue 1-residue 97, residue 1-residue 98, residue 1-residue 99, residue 1-residue 185, or residue 47-residue 99 Or a C-terminal fragment of native sequence human IGFBP-3 (SEQ ID NO: 1) (eg, residue 98-residue 264, residue 100-residue 264, residue 165-residue Peptide having group 264, residue 185-residue 264). More preferably, the IGFBP-3 fragment is from residue 1-residue 46, residue 1-residue 88, residue 1-residue 97 of native sequence human IGFBP-3 (SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 12), Residue 1-residue 99, residue 47-residue 99, residue 1-residue 185, residue 98-residue 264, residue 100-residue 264, residue 165-residue 264 and residue A peptide having residues 47-residue 99 of the native sequence human IGFBP-3 (SEQ ID NO: 1) is selected from the group consisting of peptides having 185-residue 264, and most preferably.

「融合タンパク質」は、直接的にかまたはリンカー（すなわち、「リンカーペプチド」または「連結ペプチド（ｌｉｎｋｉｎｇｐｅｐｔｉｄｅ）」）を介してのいずれか（好ましくは、このようなリンカーを介して）で、一緒に連結された２個の別個のペプチドを有するタンパク質である。例えば、１種の融合タンパク質は、ＩＧＦＢＰ−３フラグメントに融合されたプロテインＡのＺドメインを含むタンパク質であり、Ｚドメインおよびフラグメントは、切断が所望されない場合に直接的に連結され得るか、または切断が所望され得る場合に切断部位（例えば、カスパーゼ−３タンパク質分解部位）を介して連結され得る。 “Fusion proteins” can be either directly or via a linker (ie, “linker peptide” or “linking peptide”), preferably via such a linker. A protein having two distinct peptides linked to each other. For example, one fusion protein is a protein comprising the Z domain of protein A fused to an IGFBP-3 fragment, and the Z domain and fragment can be directly linked when cleavage is not desired, or cleavage. Can be linked via a cleavage site (eg, a caspase-3 proteolytic site).

本明細書中で使用される場合、「プロテインＡのＺドメイン」とは、例えばＥＰ２３０，８６９Ｂ１に図３の合成Ｚ領域として、そしてＳａｍｕｅｌｓｓｏｎら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，９：３６３（１９９１）およびＮｉｌｓｓｏｎら、ＰｒｏｔｅｉｎＥｎｇ．１（２）：１０７−１１３（１９８７）に記載されたＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃａｌプロテインＡのＩｇＧ結合ドメインをいう。 As used herein, “Z domain of protein A” refers to the synthetic Z region of FIG. 3, for example, in EP 230,869 B1, and Samuelsson et al., Bio / Technology, 9: 363 (1991) and Nilsson. Et al., Protein Eng. 1 (2): Refers to the IgG binding domain of Staphylococcal protein A described in 107-113 (1987).

「ペプチド」は、少なくとも２個のアミノ酸を有する分子であり、そして少なくとも約５０アミノ酸を有するポリペプチドを包含する。この定義としては、ペプチドフラグメント、誘導体、その塩、または光学異性体、ならびにリンカーが挙げられる。好ましくは、本明細書中のペプチドは、約３５アミノ酸〜２００アミノ酸、より好ましくは、約４０アミノ酸〜１７０アミノ酸を有する。 A “peptide” is a molecule having at least 2 amino acids and includes a polypeptide having at least about 50 amino acids. This definition includes peptide fragments, derivatives, salts thereof, or optical isomers, and linkers. Preferably, the peptides herein have from about 35 amino acids to 200 amino acids, more preferably from about 40 amino acids to 170 amino acids.

本明細書中に記載される場合、「アポトーシス因子」は、アポトーシスまたは細胞死を誘導する分子である。このような分子としては、化学療法剤、抗ホルモン剤、細胞傷害性因子および他の薬剤（細胞死を誘導するこれらのいくつかは、以下に定義される）が挙げられる。好ましくは、このような因子は、化学療法剤であり、より好ましくは、ドキソルビシンまたはパクリタキセルであり、最も好ましくは、パクリタキセルである。 As described herein, an “apoptotic factor” is a molecule that induces apoptosis or cell death. Such molecules include chemotherapeutic agents, antihormonal agents, cytotoxic factors and other agents, some of which induce cell death as defined below. Preferably, such factors are chemotherapeutic agents, more preferably doxorubicin or paclitaxel, and most preferably paclitaxel.

「アフィニティーマチュレーションされた」ＩＧＦＢＰ−３ペプチドフラグメントまたは融合タンパク質は、このペプチドフラグメントまたは融合タンパク質内に１以上の変更を有し、これらの変更を保有しない対応する親ペプチドフラグメントまたは融合タンパク質と比較して、上記ペプチドフラグメント融合タンパク質のＩＧＦ−ＩもしくはＩＧＦ−ＩＩに対する親和性を改良する。アフィニティーマチュレーションされた好ましいＩＧＦＢＰ−３ペプチドフラグメントまたは融合タンパク質は、標的ＩＧＦに対して、ナノモル濃度の親和性を有するか、または、ピコモル濃度の親和性さえを有する。アフィニティーマチュレーションされたペプチドフラグメントおよび融合タンパク質は、当該分野で公知の手順（ファージディスプレイ（ＬｏｗｍａｎおよびＷｅｌｌｓ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２３４（３）：５６４−５７８（１９９３）；Ｌｏｗｍａｎら、Ｂｉｏｃｈｅｉｍｓｔｒｙ，３０（４５）：１０８３２−１０８３８（１９９１））；合理的な突然変異誘発（Ｌｏｗｍａｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６１（１７）：１０９８２〜１０９８８（１９９１）；Ｈａｗｋｉｎｓら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２３４（４）：９５８−９６４（１９９３））；ランダムな突然変異誘発（Ｆｉｅｄｌｅｒら、ＰｒｏｔｅｉｎＥｎｇ．１５（１１）：９３１−９４１（２００２））ならびにＤＮＡシャッフリングおよびファージディスプレイ（Ｈｕｌｓら、ＣａｎｃｅｒＩｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．５０（３）：１６３−１７１（２００１）；ｖａｎｄｅｎＢｅｕｃｋｅｎら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，３１０（３）：５９１−６０１（２００１））が挙げられる）により生み出される。 An “affinity-maturated” IGFBP-3 peptide fragment or fusion protein has one or more changes in the peptide fragment or fusion protein and is compared to the corresponding parent peptide fragment or fusion protein that does not carry these changes. Thus, the affinity of the peptide fragment fusion protein for IGF-I or IGF-II is improved. Affinity-maturated preferred IGFBP-3 peptide fragments or fusion proteins have nanomolar or even picomolar affinities for the target IGF. Affinity-maturated peptide fragments and fusion proteins can be prepared using procedures known in the art (phage display (Lowman and Wells, J. Mol. Biol., 234 (3): 564-578 (1993); Lowman et al., Biochemistry, 30 (45): 10832-10838 (1991)); rational mutagenesis (Lowman et al., J. Biol. Chem., 261 (17): 10982-10988 (1991); Hawkins et al., J. Mol. Biol. , 234 (4): 958-964 (1993)); random mutagenesis (Fiedler et al., Protein Eng. 15 (11): 931-941 (2002)) and DNA shuffling and phage Display (Huls et al., Cancer Immunol. Immunother. 50 (3): 163-171 (2001); van den Beucken et al., J. Mol. Biol., 310 (3): 591-601 (2001))) Produced by.

本明細書中で用いられる場合、処置目的の「哺乳動物」とは、哺乳動物として分類される任意の動物（このような動物としては、ヒト、家畜、および農場動物、ならびに動物園の動物、スポーツ用動物、もしくはペットの動物（例えば、イヌ、ウマ、ネコ、ヒツジ、ブタ、牝牛などが挙げられる）をいう。本明細書中での好ましい哺乳動物は、ヒトである。用語「非成体」とは、周産期（例えば、生誕時の体重が軽い乳児）から思春期までの哺乳動物をいい、ここで、思春期は、十分な増殖可能性にまだ到達していないものである。 As used herein, a “mammal” for treatment purposes is any animal classified as a mammal (such animals include humans, farm animals, farm animals, and zoo animals, sports Animal or pet animals (for example, dogs, horses, cats, sheep, pigs, cows, etc.) The preferred mammal herein is a human. Refers to mammals from the perinatal period (eg, infants with a light weight at birth) to puberty, where puberty has not yet reached full proliferative potential.

本明細書中で使用される場合、用語「処置すること」とは、治療上の処置および予防上（ｐｒｏｐｈａｌｙｔｉｃ）もしくは予防上（ｐｒｅｖｅｎｔａｔｉｖｅ）の手段の両方をいう。処置を必要とする人々としては、すでに障害を有する人々ならびに障害を有する傾向があるか、または障害を有すると診断された人々または上記障害が予防されるべき人々が挙げられる。継続性の処置または投与とは、１日以上処置が中断されることのない少なくとも１日単位での処置をいう。間欠性の処置もしくは投与、または間欠性の様式での処置もしくは投与とは、継続的ではないが、むしろ周期的な性質の処置をいう。本明細書中での処置レジームは、継続性であるかまたは間欠性のいずれかであり得る。 As used herein, the term “treating” refers to both therapeutic treatment and prophylactic or preventative measures. People in need of treatment include those who already have a disability, as well as those who are prone to having a disability or have been diagnosed with a disability, or who are to be prevented from the disability. Continuous treatment or administration refers to treatment on a daily basis at which treatment is not interrupted for more than one day. Intermittent treatment or administration, or treatment or administration in an intermittent manner, refers to treatment that is not continuous but rather periodic. The treatment regimes herein can be either continuous or intermittent.

本明細書中で用いられる場合、「ＩＧＦアンタゴニスト」とは、ＩＧＦ−ＩまたはＩＧＦ−ＩＩの１種以上の生物学的活性（例えば、ＩＧＦ−ＩまたはＩＧＦ−ＩＩの同化作用）を遮断または阻害するペプチドをいう。 As used herein, an “IGF antagonist” blocks or inhibits one or more biological activities of IGF-I or IGF-II (eg, anabolic effects of IGF-I or IGF-II). Refers to the peptide.

本明細書中で使用される場合、内因性ＩＧＦの血清レベルまたは組織レベルが変化する状況での「活性な」ＩＧＦまたは「生物学的に活性な」ＩＧＦとは、ＩＧＦのレセプターに結合するか、または別のやり方で生物学的活性（例えば、同化作用）を生ぜしめるＩＧＦをいう。 As used herein, “active” IGF or “biologically active” IGF in the context of changes in serum or tissue levels of endogenous IGF binds to a receptor for IGF Or otherwise refers to an IGF that produces a biological activity (eg, anabolism).

用語「有効量」とは、哺乳動物内において疾患または障害を処置するのに有効なペプチドの量をいう。癌の場合、有効量のペプチドは、癌細胞の数を減少し得；腫瘍の大きさを小さくし得；癌細胞の末梢器官への浸潤を阻害（すなわち、ある程度遅延させ、そして好ましくは停止）し得；腫瘍の転移を阻害（すなわち、ある程度遅延させ、そして好ましくは停止）し得；ある程度腫瘍の増殖を阻害し得；そして／またはこの障害に関連する１種以上の症状をある程度緩解し得る。ペプチドが増殖を妨害し、そして／または存在する癌細胞を殺傷し得る程度に、このペプチドは、細胞増殖抑制性および／または細胞傷害性であり得る。癌治療としては、例えば、疾患の進行までの時間（ＴＴＰ）を評価し、そして／または応答速度（ＲＲ）を決定することにより、インビボでの効能が測定され得る。 The term “effective amount” refers to the amount of peptide effective to treat a disease or disorder in a mammal. In the case of cancer, an effective amount of the peptide can reduce the number of cancer cells; reduce the size of the tumor; inhibit the penetration of cancer cells into peripheral organs (ie, delay to some extent and preferably stop) May inhibit tumor metastasis (ie, delay to some extent and preferably stop); may inhibit tumor growth to some extent; and / or may ameliorate to some extent one or more symptoms associated with this disorder . To the extent that the peptide can interfere with growth and / or kill existing cancer cells, the peptide can be cytostatic and / or cytotoxic. For cancer treatment, efficacy in vivo can be measured, for example, by assessing the time to disease progression (TTP) and / or determining the response rate (RR).

用語「癌」および「癌の」とは、代表的には、制御されない細胞増殖により特徴付けられる、哺乳動物における生理学的状態をいい、これを描写する。癌の例としては、癌腫、リンパ腫、芽腫、肉腫、および白血病が挙げられるが、これらに限定されない。このような癌の、より詳細な例としては、扁平上皮癌、肺癌（小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺の腺癌、および肺の扁平上皮癌（ｓｑｕａｍｏｕｓｃａｒｃｉｎｏｍａ））、腹膜癌、肝細胞癌、胃癌（ｇａｓｔｒｉｃｃａｎｃｅｒまたはｓｔｏｍａｃｈｃａｎｃｅｒ）（胃腸癌を含む）、膵臓癌、多形性グリア芽腫、頚部癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、肝癌、乳癌、結腸癌、直腸結腸癌、子宮内膜癌もしくは子宮癌、唾液腺癌、腎臓癌（ｋｉｄｎｅｙｃａｎｃｅｒもしくはｒｅｎａｌｃａｎｃｅｒ）、肝臓癌、前立腺癌、外陰部の癌、甲状腺癌、肝癌および種々の型の頭部癌および頚部癌、ならびにＢ細胞リンパ腫（低グレード／小胞の非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）；小リンパ球性（ＳＬ）ＮＨＬ；中グレード／小胞ＮＨＬ；中グレード拡散性ＮＨＬ；高グレードの免疫芽球性ＮＨＬ；高グレードのリンパ芽球性ＮＨＬ；高グレ−ドの小非切断性細胞ＮＨＬ；大きな腫瘍ＮＨＬ；皮膜細胞リンパ腫；ＡＩＤＳ関連リンパ腫；およびヴァルデンストレームマクログロブリン血症）；慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）；急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）；へアリーセル白血病；慢性骨髄芽球性白血病；ならびに移植後リンパ球増殖性障害（ＰＴＬＤ）が挙げられる。好ましくは、上記癌は、ＩＧＦレセプターを発現する腫瘍を包含し、より好ましくは、乳癌、肺癌、直腸結腸癌、または前立腺癌を包含し、最も好ましくは、乳癌および前立腺癌を包含する。 The terms “cancer” and “cancerous” refer to and describe the physiological condition in mammals that is typically characterized by unregulated cell growth. Examples of cancer include, but are not limited to, carcinoma, lymphoma, blastoma, sarcoma, and leukemia. More detailed examples of such cancers include squamous cell carcinoma, lung cancer (small cell lung cancer, non-small cell lung cancer, lung adenocarcinoma, and squamous carcinoma of the lung), peritoneal cancer, hepatocytes Cancer, gastric cancer (including stomach cancer) (including gastrointestinal cancer), pancreatic cancer, pleomorphic glioblastoma, cervical cancer, ovarian cancer, liver cancer, bladder cancer, liver cancer, breast cancer, colon cancer, colorectal cancer, Endometrial cancer or uterine cancer, salivary gland cancer, kidney cancer, kidney cancer, liver cancer, prostate cancer, vulvar cancer, thyroid cancer, liver cancer and various types of head and neck cancer, and B Cellular lymphoma (low grade / vesicular non-Hodgkin's lymphoma (NHL); small lymphocytic (SL) NHL; medium grade / vesicle NHL; medium gray High-grade immunoblastic NHL; high-grade lymphoblastic NHL; high-grade small non-cleavable cell NHL; large tumor NHL; capsule cell lymphoma; AIDS-related lymphoma; Trauma macroglobulinemia); chronic lymphocytic leukemia (CLL); acute lymphocytic leukemia (ALL); hairy cell leukemia; chronic myeloblastic leukemia; and post-transplant lymphoproliferative disorder (PTLD) . Preferably, the cancer includes a tumor that expresses an IGF receptor, more preferably includes breast cancer, lung cancer, colorectal cancer, or prostate cancer, and most preferably includes breast cancer and prostate cancer.

本明細書中に使用される場合、用語「細胞傷害性因子」とは、細胞の機能を阻害もしくは予防し、そして／または細胞の破壊を引き起こす物質をいう。この用語は、放射活性な異性体（例えば、Ａｔ２１１、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、Ｓｍ１５３、Ｂｉ２１２、Ｐ３２およびルテチウムの放射活性な異性体）、化学療法剤、および毒素（例えば、細菌、菌類、植物、または動物が起源の、低分子毒素または酵素的に活性な毒素（これらのフラグメントおよび／もしくは改変体を含む）を包含することが意図される。 As used herein, the term “cytotoxic factor” refers to a substance that inhibits or prevents the function of cells and / or causes destruction of cells. The term includes radioactive isomers (eg, radioactive isomers of At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32 and lutetium), chemotherapeutic agents, and toxins (eg, bacteria It is intended to include small molecule toxins or enzymatically active toxins (including fragments and / or variants thereof) originating from fungi, plants or animals.

「化学療法剤」は、癌の治療に有用である化学化合物である。化学療法剤の例としては、アルキル化剤（例えば、チオテパおよびＣＹＴＯＸＡＮ（登録商標）シクロホスファミド）；アルキルスルホン酸塩（ブスルファン、イムプロスルファン、ピポスルファン）；アジリジン（例えば、ベンゾドパ、カルボコン、メツレドパ（ｍｅｔｕｒｅｄｏｐａ）およびウレドパ（ｕｒｅｄｏｐａ））；エチレンイミンおよびメチルアメラミン（アルトレタミン、トリエチレンメラミン（ｔｒｉｅｔｈｙｌｅｎｅｍｅｌａｍｉｎｅ）、トリエチレンホスホロアミド、トリエチレンチオホスホロアミド、およびトリメチロロメラミン（ｔｒｉｍｅｔｈｙｌｏｌｏｍｅｌａｍｉｎｅ）；アセトゲニン（特に、ブラタシン（ｂｕｌｌａｔａｃｉｎ）およびブラタシノン（ｂｕｌｌａｔａｃｉｎｏｎｅ）；カンプトテシン（合成アナログトポテカンを含む）；ブリオスタチン；カリスタチン（ｃａｌｌｙｓｔａｔｉｎ）；ＣＣ−１０６５（これのアドゼレシン（ａｄｏｚｅｌｅｓｉｎ）、カルゼレシン（ｃａｒｚｅｌｅｓｉｎ）およびビゼレシン（ｂｉｚｅｌｅｓｉｎ）の合成アナログを含む）；クリプトフィシン（ｃｒｙｐｔｏｐｈｙｃｉｎ）（特に、クリプトフィシン１およびクリプトフィシン８）；ドラスタチン（ｄｏｌａｓｔａｔｉｎ）；ズオカルマイシン（ｄｕｏｃａｒｍｙｃｉｎ）（合成アナログ、ＫＷ−２１８９およびＣＢ１−ＴＭ１を含む）；エレウセロビン（ｅｌｅｕｔｈｅｒｏｂｉｎ）；パンクラティスタチン（ｐａｎｃｒａｔｉｓｔａｔｉｎ）；サルコジクチン（ｓａｒｃｏｄｉｃｔｙｉｎ）；スポンギスタチン（ｓｐｏｎｇｉｓｔａｔｉｎ）；ナイトロジェンマスタード（例えば、クロラムブシル、クロラナファジン（ｃｈｌｏｒｎａｐｈａｚｉｎｅ）、コロホスファミド（ｃｈｏｌｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）、エストラムスチン、イフォスファミド、メクロレタミン、塩酸メクロレタミンオキシド、メルファラン、ノベンビチン（ｎｏｖｅｍｂｉｃｈｉｎ）、フェネステリン（ｐｈｅｎｅｓｔｅｒｉｎｅ）、プレドニムスチン、トロフォスファミド（ｔｒｏｆｏｓｆａｍｉｄｅ）およびウラシルマスタード）；ニトロソ尿素類（例えば、カルムスチン、クロロゾトシン、フォテムスチン、ロムスチン、ニムスチン、およびラニムスチン）；エネジイン（ｅｎｅｄｙｉｎｅ）抗生物質のような抗生物質（例えば、カリケアミシン、特にカリケアミシンγＩＩおよびカリケアミシンωＩＩ（例えば、Ａｇｎｅｗ、ＣｈｅｍＩｎｔｌ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．，３３：１８３−１８６（１９９４）を参照のこと））；ジネミシン（ｄｙｎｅｍｉｃｉｎ）（ジネミシンＡを含む）；ビスホスホネート（例えば、クロドロネート）；エスペラミシン（ｅｓｐｅｒａｍｉｃｉｎ）；ならびにネオカルチノスタチン、クロモフォアおよび関連するクロモプロテインエネジイン抗生物質クロモフォア、アクラシノマイシン、アクチノマイシン、アウスラマイシン（ａｕｔｈｒａｍｙｃｉｎ）、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン、カラビシン（ｃａｒａｂｉｃｉｎ）、カルミノマイシン（ｃａｒｍｉｎｏｍｙｃｉｎ）、カルジノフィリン（ｃａｒｚｉｎｏｐｈｉｌｉｎ）、クロモマイシニス（ｃｈｒｏｍｏｍｙｃｉｎｉｓ）、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン、６−ジアゾ−５−オキソ−Ｌ−ノルロイシン、ＡＤＲＩＡＭＹＣＩＮ（登録商標）ドキソルビシン（モルホリノ−ドキソルビシン、シアノモルホリノ−ドキソルビシン、２−ピロリノ−ドキソルビシンおよびデオキシドキソルビシンを含む）、エピルビシン、エソルビシン、イダルビシン、マルセロマイシン、マイトマイシン（例えば、マイトマイシンＣ、ミコフェノール酸、ノガラマイシン、オリボマイシン、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン、ピューロマイシン、クエラマイシン（ｑｕｅｌａｍｙｃｉｎ）、ロドルビシン、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン（ｔｕｂｅｒｃｉｄｉｎ）、ウベニメクス（ｕｂｅｎｉｍｅｘ）、ジノスタチン（ｚｉｎｏｓｔａｔｉｎ）、ゾルビシン）；抗代謝剤（例えば、メトトレキサートおよび５−フルオロウラシル（５−ＦＵ））；葉酸アナログ（例えば、デノプテリン（ｄｅｎｏｐｔｅｒｉｎ）、メトトレキサート、プテロプテリン（ｐｔｅｒｏｐｔｅｒｉｎ）、トリメトレキサート）；プリンアナログ（例えば、フルダラビン、６−メルカプトプリン、チアミプリン（ｔｈｉａｍｉｐｒｉｎｅ）、チオグアニン（ｔｈｉｏｇｕａｎｉｎｅ））；ピリミジンアナログ（例えば、アンシタビン、アザシチジン、６−アザウリジン、カルモフール（ｃａｒｍｏｆｕｒ）、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキリフルリジン、エノシタビン、フルオキシウリジン（ｆｌｕｏｘｕｒｉｄｉｎｅ））；アンドロゲン（例えば、カルステロン（ｃａｌｕｓｕｔｅｒｏｎｅ）、プロピオン酸ドロモスタノロン（ｄｒｏｍｏｓｔａｎｌｏｎｅ）、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトン（ｔｅｓｔｏｌａｃｔｏｎｅ））；抗副腎ステロイド（ａｎｔｉ−ａｄｒｅｎａｌ）（例えば、アミノグルテチミド、ミトーテン、トリロスタン）；葉酸補充剤（ｒｅｐｌｅｎｉｓｈｅｒ）（例えば、フロリニック酸（ｆｌｏｌｉｎｉｃａｃｉｄ））；アセグラトン；アルドホスファミドグリコシド（ａｌｄｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅｇｌｙｃｏｓｉｄｅ）；アミノレブリン酸；エニルラシル（ｅｎｉｌｕｒａｃｉｌ）；アムサクリン；ベストラブシル（ｂｅｓｔｒａｂｕｃｉｌ）；ビサントレン；エダトラキセート（ｅｄａｔｒａｘａｔｅ）；デフォファミン（ｄｅｆｏｆａｍｉｎｅ）；デメコルチン；ジアジコン（ｄｉａｚｉｑｕｏｎｅ）；エルフォルニチン（ｅｌｆｏｒｎｉｔｈｉｎｅ）；酢酸エリプチニウルム（ｅｌｉｐｔｉｎｕｒｍ）；エポチロン；エトグルシド（ｅｔｏｇｌｕｃｉｄ）；硝酸ガリウム；ヒドロキシ尿素；レンチナン（ｌｅｎｔｉｎａｎ）；ロニダイニン（ｌｏｎｉｄａｉｎｉｎｅ）；メイタンシノイド（例えば、メイタシン）およびアンサミトシン（ａｎｓａｍｉｔｏｃｉｎ）；ミトグアゾン（ｍｉｔｏｇｕａｚｏｎｅ）；ミトキサントロン；モピダンモール（ｍｏｐｉｄａｎｍｏｌ）；ニトラエリン（ｎｉｔｒａｅｒｉｎｅ）；ペントスタチン；フェナメット（ｐｈｅｎａｍｅｔ）；ピラルビシン；ロソキサントロン（ｌｏｓｏｘａｎｔｒｏｎｅ）；ポドフィリン酸；２−エチルヒドラジド；プロカルバジン；ＰＳＫ（登録商標）ポリサッカライド複合体（ＪＨＳＮａｔｕｒａｌＰｒｏｄｕｃｔｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）；ラゾキサン；リゾキシン（ｒｈｉｚｏｘｉｎ）；シゾフィラン；スピロゲルマニウム、テヌアゾン酸；トリアジコン；２，２’，２’’−トリクロロトリエチルアミン；トリコテセン（ｔｒｉｃｈｏｔｈｅｃｅｎｅ）（特に、Ｔ−２トキシン、ベラキュリン（ｖｅｒｒａｃｕｒｉｎ）Ａ、ロリジン（ｒｏｒｉｄｉｎ）Ａおよびアンギジン）；ウレタン；ビンデシン；ダカルバジン；マンノムスチン；ミトブロニトール；ミトラクトール；ピポブロマン；ガシトシン；アラビノシド（「Ａｒａ−Ｃ」）；シクロホスファミド；チオテパ；タキソイド（例えば、ＴＡＸＯＬ（登録商標）パクリタキセル（Ｂｒｉｓｔｏｌ−ＭｙｅｒｓＳｑｕｉｂｂＯｎｃｏｌｏｇｙ，Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ，Ｎ．Ｊ．）、ＡＢＲＡＸＡＮＥ^ＴＭクレモフォールフリー（Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ−ｆｒｅｅ）、パクリタキセルのアルブミン操作したナノ粒子形成（ＡｍｅｒｉｃａｎＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＰａｒｔｎｅｒｓ，Ｓｃｈａｕｍｂｅｒｇ、Ｉｌｌｉｎｏｉｓ）、およびＴＡＸＯＴＥＲＥ（登録商標）ドキセタキセル（Ｒｈｏｎｅ−ＰｏｕｌｅｎｃＲｏｒｅｒ、Ａｎｔｏｎｙ、Ｆｒａｎｃｅ）、クロランブシル；ＧＥＭＺＡＲ（登録商標）ゲンシタビン；６−チオグアニン；メルカプトプリン；メトトレキサート；プラチナアナログ（例えば、シスプラチンおよびカルボプラチン；ビンブラスチン；プラチナ；エトポシド（ＶＰ−１６））；イフォスファミド；ミトキサントロン；ビンクリスチン；ＮＡＶＥＬＢＩＮＥ（登録商標）ビノレブリン；ノバントロン；テニポシド；エダトレキサート；ダウノマイシン；アミノプテリン；キセロダ（ｘｅｌｏｄａ）；イバンドロネート（ｉｂａｎｄｒｏｎａｔｅ）；ＣＰＴ−１１；トポイソメラーゼインヒビターＲＦＳ２０００；ジフルオロメチルオルニチン（ＤＭＦＯ）；レチノイド（例えば、レチン酸）；カペシタビン（ｃａｐｅｃｉｔａｂｉｎｅ）；および上記のものの薬学的に受容可能な塩、酸または誘導体が挙げられる。 A “chemotherapeutic agent” is a chemical compound that is useful in the treatment of cancer. Examples of chemotherapeutic agents include alkylating agents (eg, thiotepa and CYTOXAN® cyclophosphamide); alkyl sulfonates (busulfan, improsulfan, pipersulfan); aziridine (eg, benzodopa, carbocon, Metredopa (uredopa); ethyleneimine and methylammelamine (altretamine, triethylenemelamine), triethylenephosphoramide, triethylenethiophosphoramide, and trimethylolomelamine (trimethylolomelamine); In particular, bratacin and bullatacinone; camptothecin ( Bryostatin; callistatin; CC-1065 (including synthetic analogs of adzelesin, carzelesin, and bizesin); cryptophysin (especially, Cryptophysin 1 and cryptophysin 8); dolastatin; duocarmycin (including synthetic analogs, KW-2189 and CB1-TM1); eleutherobin; pancratistatin; sarcodictin (Sarcodetyin); spongistatin Nitrogen mustard (eg, chlorambucil, chlornafazine, cholophosphamide), estramustine, ifosfamide, mechloretamine, mechloretamine oxide hydrochloride, melphalan, nobenbitine (trobetinine), prembitine Nitrosoureas (eg, carmustine, chlorozotocin, fotemustine, lomustine, nimustine, and ranimustine); antibiotics such as enedyne antibiotics (eg, calicheamicin, especially calicheamicin γII) And calicheamic ωII (for example, Agnew, Chem Intl. Ed. Engl. 33: 183-186 (1994))); dynemicin (including dynemicin A); bisphosphonates (eg clodronate); esperamicin; and neocalcinostatin, chromophore and related chromos Protein enzyme antibiotics chromophore, acracinomycin, actinomycin, austramycin, azaserine, bleomycin, cactinomycin, carabicin, carminomycin, carzinophilin c, chromomycin , Dactinomycin, daunorubicin, detorubicin, 6-diazo-5 Xoxo-L-norleucine, ADRIAMYCIN® doxorubicin (including morpholino-doxorubicin, cyanomorpholino-doxorubicin, 2-pyrrolino-doxorubicin and deoxyxorubicin), epirubicin, esorubicin, idarubicin, marcellomycin, mitomycin (eg, mitomycin C Mycophenolic acid, nogaramycin, olivomycin, pepromycin, potophilomycin, puromycin, queramycin, rhodorubicin, streptonigrin, streptozocin, tubercidin, ubenimex, dinostatin (zinost); Antimetabolites such as methotrexate and 5 Fluorouracil (5-FU)); folic acid analogues (eg, denoterin, methotrexate, pteropterin, trimethrexate); purine analogues (eg, fludarabine, 6-mercaptopurine, thiamipurine, thioguanine (thiaguanine) )); Pyrimidine analogs (eg, ancitabine, azacitidine, 6-azauridine, carmofur, cytarabine, dideoxyuridine, dokifluridine, enocytabine, fluoxyuridine) androgens (eg, caluspituone) Acid drostanolone, epi Thiostanol, mepithiostan, test lactone); anti-adrenal steroids (eg, aminoglutethimide, mitoten, trilostane); folic acid replenishers (eg, florinic acid); Acegraton; aldophosphamide glycoside; aminolevulinic acid; eniluracil; amsacrine; bestlabucil; bisantrene; edatlaxate; defafamine di; Fornitine eliptinurm acetate; epothilone; etoglucid; etoglucid; gallium nitrate; hydroxyurea; lentinan; lonidainine; Mitoxantrone; mopiddanmol; nitrerarine; pentostatin; phenamet; pirarubicin; rosoxantrone; podophyllic acid; 2-ethylhydrazide; procarbazine; PSK® polysaccharide complex JHS Natural Product , Eugene, OR); Razoxan; Rhizoxin; Schizophyllan; Spirogermanium, Tenuazonic acid; Triadicon; 2,2 ′, 2 ″ -Trichlorotriethylamine; Trichothecene (especially T-2 toxin, veracurin) ) A, loridine A and angidin); urethane; vindesine; dacarbazine; mannomustine; mitoblonitol; mitracitol; pipobroman; gacitosine; arabinoside ("Ara-C");cyclophosphamide;thiotepa; Registered trademark Paclitaxel (Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, N .; J. et al. ), ABRAXANE ^™ Cremophor-free, albumin-engineered nanoparticle formation of paclitaxel (American Pharmaceutical Partners, Schaumberg, Illinois), and TAXOTERE (R) doxetaxel (Rulon) GEMZAR® Gencitabine; 6-thioguanine; Mercaptopurine; Methotrexate; Platinum analogs (eg, cisplatin and carboplatin; Vinblastine; Platinum; Etoposide (VP-16)); Ifosfamide; Mitoxantrone; Vincristine; NAVELBINE® ) Vinolevulin Tenonposide; edatrexate; daunomycin; aminopterin; xeloda; ibandronate; CPT-11; topoisomerase inhibitor RFS2000; difluoromethylornithine (DMFO); retinoid (eg, retinoic acid); capecitab c ); And pharmaceutically acceptable salts, acids or derivatives of the above.

この定義にまた包含されるのは、腫瘍に対するホルモンの作用を調節または阻害するために作用する抗ホルモン剤（例えば、抗エストロゲン剤および選択的エストロゲンレセプター調節因子（ＳＥＲＭ）（例えば、タモキシフェン（ＮＯＬＶＡＤＥＸ（登録商標）タモキシフェンが挙げられる）、ラロキシフェン、ドロロキシフェン、４−ヒドロキシタモキシフェン、トリオキシフェン、ケオキシフェン（ｋｅｏｘｉｆｅｎｅ）、ＬＹ１１７０１８、オナプリストン、およびＦＡＲＥＳＴＯＮトレミフェン；酵素アロマターゼ（この酵素は、副腎におけるエストロゲン産生を調節する）を阻害するアロマターゼインヒビターが挙げられ、このインヒビターは、副腎においてエストロゲンの産生を調節する（例えば、４（５）−イミダゾール、アミノグルテチミド、ＭＥＧＡＳＥ（登録商標）酢酸メゲストロール、ＡＲＯＭＡＳＩＮ（登録商標）エキセメスタン（ｅｘｅｍｅｓｔａｎｅ）、フォルメスタニエ（ｆｏｒｍｅｓｔａｎｉｅ）、ファドロゾール（ｆａｄｒｏｚｏｌｅ）、ＲＩＶＩＳＯＲ（登録商標）ボロゾール（ｖｏｒｏｚｏｌｅ）、ＦＥＭＡＲＡ（登録商標）レトロゾール、およびＡＲＩＭＩＤＥＸ（登録商標）アナストロゾール（ａｎａｓｔｒｏｚｏｌｅ）；ならびに抗アンドロゲン（例えば、フルタミド、ニルタミド、ビカルタミド（ｂｉｃａｌｕｔａｍｉｄｅ）、ロイプロリド、およびゴセレリン；ならびにトロキサシタビン（ｔｒｏｘａｃｉｔａｂｉｎｅ）（１，３−ジオキソランヌクレオシドシトシンアナログ）；アンチセンスオリゴヌクレオチド（特に、不粘着性の細胞の増殖に関与するシグナル伝達経路中の遺伝子の発現を阻害するもの（例えば、ＰＫＣ−α、ＲａｌｆおよびＨ−Ｒａｓ））；リボザイム（例えば、ＶＥＧＦ発現インヒビター（例えば、ＡＮＧＩＯＺＹＭＥ（登録商標）リボザイム）およびＨＥＲ２発現インヒビター）；ワクチン（例えば、遺伝子治療ワクチン（例えば、ＡＬＬＯＶＥＣＴＩＮ（登録商標）ワクチン、ＬＥＵＶＥＣＴＩＮ（登録商標）ワクチン、およびＶＡＸＩＤ（登録商標）ワクチン））；ＰＲＯＬＥＵＫＩＮ（登録商標）ｒＩＬ−２；ＬＵＲＴＯＴＥＣＡＮ（登録商標）トポイソメラーゼ１インヒビター；ＡＢＡＲＥＬＩＸ（登録商標）ｒｍＲＨ）；ならびに、上記のものの任意の薬学的に受容可能な塩、酸または誘導体である。 Also encompassed by this definition are antihormonal agents that act to modulate or inhibit the action of hormones on tumors (eg, antiestrogens and selective estrogen receptor modulators (SERMs) (eg, tamoxifen (NOLVADEX ( Registered trademark) tamoxifen), raloxifene, droloxifene, 4-hydroxy tamoxifen, trioxyphene, keoxifene, LY11018, onapristone, and FARESTON toremifene; An aromatase inhibitor that inhibits the regulation of estrogen in the adrenal gland (eg, 4 (5) -imidazole, Minoglutethimide, MEGASE (R) megestrol acetate, AROMASIN (R) exemestane, formestanie, fadrozole, RIVISOR (R) vorozole, FEMARA (R) retro Sol, and ARIMIDEX® anastrozole; and antiandrogens (eg, flutamide, nilutamide, bicalutamide, leuprolide, and goserelin; and troxacitabine (1,3-dioxolane nucleoside cytosine analog) Antisense oligonucleotides (especially non-sense Those that inhibit the expression of genes in signal transduction pathways involved in the growth of adherent cells (eg, PKC-α, Ralf and H-Ras); ribozymes (eg, VEGF expression inhibitors (eg, ANGIOZYME®) ) Ribozyme) and HER2 expression inhibitors); vaccines (eg, gene therapy vaccines (eg, ALLOVECTIN® vaccines, LEUVECTIN® vaccines, and VAXID® vaccines)); PROLEUKIN® rIL− 2; LURTOTECAN® topoisomerase 1 inhibitor; ABARELIX® rmRH); and any pharmaceutically acceptable salt, acid or derivative of the above.

本明細書中で用いられる場合、「増殖阻害因子」とは、インビトロおよび／またはインビボでの細胞の増殖を阻害する化合物または組成物をいう。従って、上記増殖阻害因子は、Ｓ期における細胞の百分率を有意に減少させるものであり得る。増殖阻害因子の例としては、細胞周期の進行を（Ｓ期以外の場所で）遮断する因子（例えば、ＧＩ停止およびＭ期停止を誘導する因子）が挙げられる。古典的なＭ期のブロッカーとしては、ビンカ（ビンクリスチンおよびビンブラスチン）、ＴＡＸＯＬ（登録商標）パクリタキセル、およびトポＩＩインヒビター（例えば、ドキソルビシン、エピルビシン、ダウノルビシン、エトポシド、およびブレオマイシン）が挙げられる。ＧＩで停止させるこれらの因子（例えば、ＤＮＡアルキル化剤（例えば、タノキシフェン、プレドニゾン、ダカルバジン、メクロレタミン、シスプラチン、メトトレキサート、５−フルオロウラシル、およびａｒａ−Ｃ）はまた、Ｓ期の停止に波及する。さらなる情報が、ＴｈｅＭｏｌｅｃｕｌａｒＢａｓｉｓｏｆＣａｎｃｅｒ、ＭｅｎｄｅｌｓｏｈｎおよびＩｓｒａｅｌ編、第１章、題名「ＣｅｌｌＣｙｃｌｅｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ，ｏｎｃｏｇｅｎｅｓ，ａｎｄａｎｔｉｅｉｏｐｌａｓｔｉｃｄｒｕｇｓ」（Ｍｕｒａｋａｉｎｉら）（ＷＢＳａｕｎｄｅｒｓ：Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，１９９５）特にｐ．１３に見出され得る。 As used herein, “growth inhibitory factor” refers to a compound or composition that inhibits the growth of cells in vitro and / or in vivo. Thus, the growth inhibitory factor may significantly reduce the percentage of cells in S phase. Examples of growth inhibitory factors include factors that block cell cycle progression (at a place other than S phase) (eg, factors that induce GI arrest and M-phase arrest). Classic M-phase blockers include vinca (vincristine and vinblastine), TAXOL® paclitaxel, and topo II inhibitors (eg, doxorubicin, epirubicin, daunorubicin, etoposide, and bleomycin). These factors that arrest at GI, such as DNA alkylating agents (eg, tanoxifen, prednisone, dacarbazine, mechloretamine, cisplatin, methotrexate, 5-fluorouracil, and ara-C) also ripple through S phase arrest. Information in The Molecular Basis of Cancer, edited by Mendelsohn and Israel, Chapter 1, entitled “Cell Cycle regulation, oncogenes, and anti-antiplastic drugs” (Murakaini et al., P13). Can be done.

「増殖阻害性」抗ＨＥＲ２抗体の例は、ＨＥＲ２に結合し、そしてＨＥＲ２を過剰発現する癌細胞の増殖を阻害するものである。好ましい増殖阻害性抗ＨＥＲ２抗体は、約０．５〜３０μｇ／ｍｌの抗体濃度で、２０％より多く、そして好ましくは、５０％より多く（例えば、約５０％〜約１００％）、細胞培養物中のＳＫＢＲ３乳癌細胞の増殖を阻害する。ここで、増殖阻害は、ＳＫＢＲ３細胞を抗体へ曝した６日後に決定される（１９９７年１０月１４日に発行された米国特許第５，６７７，１７１号を参照のこと）。 Examples of “growth inhibitory” anti-HER2 antibodies are those that bind to HER2 and inhibit the growth of cancer cells that overexpress HER2. Preferred growth inhibitory anti-HER2 antibodies are greater than 20% and preferably greater than 50% (eg, about 50% to about 100%) cell cultures at an antibody concentration of about 0.5-30 μg / ml. Inhibits proliferation of SKBR3 breast cancer cells. Here, growth inhibition is determined 6 days after exposing SKBR3 cells to the antibody (see US Pat. No. 5,677,171 issued Oct. 14, 1997).

「細胞死を誘導する」抗体は、生存可能な細胞を生存できなくする抗体をいう。この細胞は、一般的には、抗原を発現する細胞であり、特に上記細胞が抗原を過剰発現する場合に、この抗原に抗体が結合する。好ましくは、上記細胞は、癌細胞であり、例えば、胸部、卵巣、胃、子宮内膜、唾液腺、肺、腎臓、結腸、甲状腺、膵臓または膀胱の細胞である。インビトロでは、上記細胞は、ＳＫＢＲ３、ＢＴ４７４、Ｃａｌｕ３、ＭＤＡ−ＭＢ−４５３、ＭＤＡ−ＭＢ−３６１またはＳＫＯＶ３細胞であり得る。インビトロでの細胞死は、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）または補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）により誘導される細胞死を識別するために、補体および免疫エフェクター細胞の非存在下で決定され得る。従って、細胞死のアッセイは、熱不活性化血清を用いて（すなわち、補体の非存在下で、そして免疫エフェクター細胞の非存在下で）使用され得る。この抗体が細胞死を誘導し得るか否かを決定するために、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）、トリパンブルー（Ｍｏｏｒｅら、Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１７：１−１１（１９９５）を参照のこと）または７ＡＡＤの取り込みにより評価される膜の完全性の損失が未処理の細胞に対して評価され得る。 An antibody that “induces cell death” refers to an antibody that renders viable cells unable to survive. This cell is generally a cell that expresses an antigen, and particularly when the cell overexpresses the antigen, an antibody binds to the antigen. Preferably, the cell is a cancer cell, such as a breast, ovary, stomach, endometrium, salivary gland, lung, kidney, colon, thyroid, pancreas or bladder cell. In vitro, the cell can be a SKBR3, BT474, Calu3, MDA-MB-453, MDA-MB-361 or SKOV3 cell. Cell death in vitro is in the absence of complement and immune effector cells to distinguish cell death induced by antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity (ADCC) or complement-dependent cytotoxicity (CDC) Can be determined. Thus, cell death assays can be used with heat-inactivated serum (ie, in the absence of complement and in the absence of immune effector cells). Incorporation of propidium iodide (PI), trypan blue (see Moore et al., Cytotechnology, 17: 1-11 (1995)) or 7AAD to determine whether this antibody can induce cell death. The loss of membrane integrity as assessed by can be assessed against untreated cells.

「アポトーシスを誘導する」抗体は、アネキシンＶの結合、ＤＮＡの断片化、細胞収縮、小胞体の拡張、細胞の断片化、および／または膜小胞の形成（アポトーシス体（ａｐｏｐｔｏｔｉｃｂｏｄｙ）と呼ばれる）により決定されるプログラム化された細胞死を誘導する抗体である。この細胞は、抗体が結合する抗原を発現する細胞であり、そして抗原を過剰発現する細胞であり得る。この細胞は、腫瘍細胞（例えば、胸部、卵巣、胃、子宮内膜、唾液腺、肺、腎臓、結腸、甲状腺、膵臓または膀胱の細胞）であり得る。インビトロでは、上記細胞は、ＳＫＢＲ３、ＢＴ４７４、Ｃａｌｕ３細胞、ＭＤＡ−ＭＢ−４５３、ＭＤＡ−ＭＢ−３６１、またはＳＫＯＶ３細胞であり得る。アポトーシスに関連する細胞性事象を評価するための種々の方法が利用可能である。例えば、ホスファチジルセリン（ＰＳ）のトランスロケーションは、アネキシンの結合により評価され得；ＤＮＡの断片化は、ＤＮＡのラダリング（ｌａｄｄｅｒｉｎｇ）を通して評価され得；そして核／クロマチンの凝縮は、ＤＮＡ断片化とともに、低二倍体の細胞の増加により評価され得る。好ましくは、アポトーシスを誘導する抗体は、上記抗体が結合する抗原を発現する細胞を用いて、未処理の細胞に対して、アネキシン結合アッセイにおいて、約２倍〜５０倍（好ましくは、約５倍〜５０倍、そして最も好ましくは、約１０倍〜５０倍）の、アネキシン結合を誘導する抗体である。 An antibody that “induces apoptosis” binds annexin V, DNA fragmentation, cell contraction, endoplasmic reticulum expansion, cell fragmentation, and / or membrane vesicle formation (referred to as apoptotic body) An antibody that induces programmed cell death as determined by The cell is a cell that expresses the antigen to which the antibody binds and can be a cell that overexpresses the antigen. The cells can be tumor cells (eg, breast, ovary, stomach, endometrium, salivary gland, lung, kidney, colon, thyroid, pancreas or bladder cells). In vitro, the cell can be a SKBR3, BT474, Calu3 cell, MDA-MB-453, MDA-MB-361, or SKOV3 cell. Various methods are available for assessing cellular events associated with apoptosis. For example, phosphatidylserine (PS) translocation can be assessed by annexin binding; DNA fragmentation can be assessed through DNA laddering; and nuclear / chromatin condensation, along with DNA fragmentation, It can be assessed by the increase in hypodiploid cells. Preferably, an antibody that induces apoptosis is about 2 to 50 times (preferably about 5 times) in an annexin binding assay relative to an untreated cell using a cell expressing an antigen to which the antibody binds. An antibody that induces annexin binding (˜50-fold, and most preferably about 10-fold to 50-fold).

アポトーシスを誘導する抗体の例としては、抗ＨＥＲ２モノクローナル抗体７Ｆ３（ＡＴＣＣＨＢ１２２１６）、および７Ｃ２（ＡＴＣＣＨＢ１２２１５）が挙げられ、これらとしては、これらのヒト化され、そして／またはアフィニティーマチュレーションされた改変体が含まれる；抗ＤＲ５抗体３Ｆ１１．３９．７（ＡＴＣＣＨＢ−１２４５６）；３Ｈ３．１４．５（ＡＴＣＣＨＢ−１２５３４）；３Ｄ５．１．１０（ＡＴＣＣＨＢ−１２５３６）；および３Ｈ３．１４．５（ＡＴＣＣＨＢ−１２５３４）（これとしては、これらのヒト化され、そして／またはアフィニティーマチュレーションされた改変体が含まれる）；ヒト抗ＤＲ５レセプター抗体１６Ｅ２および２０Ｅ６（これらとしては、これらのアフィニティーマチュレーションされた改変体が含まれる）（ＷＯ９８／５１７９３、参考として明示的に本明細書中に援用される）；ならびに抗ＤＲ−４抗体４Ｅ７．２４．３（ＡＴＣＣＨＢ−１２４５４）；４Ｈ６．１７．８（ＡＴＣＣＨＢ−１２４５５）；１Ｈ５．２５．９（ＡＴＣＣＨＢ−１２６９５）；４Ｇ７．１８．８（ＡＴＣＣＰＴＡ−９９）；および５ＧＩ１．１７．１（ＡＴＣＣＨＢ−１２６９４）（これのヒト化され、そして／またはアフィニティーマチュレーションされた改変体を含む）が挙げられる。 Examples of antibodies that induce apoptosis include anti-HER2 monoclonal antibodies 7F3 (ATCC HB12216) and 7C2 (ATCC HB12215), which include humanized and / or affinity-maturated variants thereof Anti-DR5 antibody 3F 11.39.7 (ATCC HB-12456); 3H 3.14.5 (ATCC HB-12534); 3D 5.1.10 (ATCC HB-12536); and 3H 3.14.5 ( ATCC HB-12534) (which include these humanized and / or affinity matured variants); human anti-DR5 receptor antibodies 16E2 and 20E6 (these include these affinity maturations). Modified variants) (WO 98/51793, expressly incorporated herein by reference); and anti-DR-4 antibody 4E7.24.3 (ATCC HB-12454); 4H6.17 8 (ATCC HB-12455); 1H5.25.9 (ATCC HB-12695); 4G7.18.8 (ATCC PTA-99); and 5GI1.17.1 (ATCC HB-12694) (humanization thereof) And / or including affinity maturated variants).

目的の抗体により結合される抗原上のエピトープに結合する抗体をスクリーニングするために、慣用的な交差遮断アッセイ（ｃｒｏｓｓ−ｂｌｏｃｋｉｎｇａｓｓａｙ）（例えば、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ（編）（ＮｅｗＹｏｒｋ：ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８８）に記載されるようなもの）が実行され得る。 To screen for antibodies that bind to an epitope on the antigen bound by the antibody of interest, a conventional cross-blocking assay (eg, Antibodies, A Laboratory Manual, Harlow and Lane (eds) (New) York: Cold Spring Harbor Laboratory, 1988).

（Ｂ．本発明を実行するための様式）
本明細書中の発明は、一局面では、ＩＧＦＢＰ−３ペプチドフラグメントを含む融合タンパク質に関し、このＩＧＦＢＰ−ペプチドフラグメントは、ネイティブ配列ヒトＩＧＦＢＰ−３（配列番号１）の残基４７−残基９９のみを含む（これは、本明細書中でミニＢＰ−３と呼ばれ、直接的に連結されるのであれリンカーを介して連結されるのであれ、プロテインＡのＺドメインに連結され、このリンカーは、上記フラグメントを放出することができるように、酵素により切断され得る）。このようなリンカーまたは連結ペプチドは、例えば、切断可能リンカー（例えば、タンパク分解性部位のＤＬＶＤ（配列番号２）、ＤＥＭＤ（配列番号３）またはＤＡＶＤ（配列番号４）を含むカスパーゼ−３切断可能リンカー）であり得る。このような連結ペプチドの例は、ＥＦＧＧＤＬＶＤ（配列番号７）、ＥＦＧＧＤＥＭＤ（配列番号８）、またはＥＦＧＧＤＡＶＤ（配列番号９）である。連結ペプチドの他の例は、エンテロキナーゼ−切断可能リンカー（ＥＦＧＧＤＤＤＫ（配列番号５））およびトロンビン−切断可能リンカー（ＥＦＧＧＬＶＰＲＧＳ（配列番号６））である。 (B. Mode for carrying out the present invention)
The invention herein, in one aspect, relates to a fusion protein comprising an IGFBP-3 peptide fragment, wherein the IGFBP-peptide fragment is only residue 47-residue 99 of native sequence human IGFBP-3 (SEQ ID NO: 1). (This is referred to herein as miniBP-3, whether directly linked or via a linker, linked to the Z domain of protein A, which linker is It can be cleaved by an enzyme so that the fragment can be released). Such linkers or connecting peptides include, for example, a cleavable linker (eg, a caspase-3 cleavable linker comprising the proteolytic site DLVD (SEQ ID NO: 2), DEMD (SEQ ID NO: 3) or DAVD (SEQ ID NO: 4). ). Examples of such connecting peptides are EFGGDLVD (SEQ ID NO: 7), EFGGDEMD (SEQ ID NO: 8), or EFGGDAVD (SEQ ID NO: 9). Other examples of connecting peptides are enterokinase-cleavable linker (EFGGDDDK (SEQ ID NO: 5)) and thrombin-cleavable linker (EFGGLVPRGS (SEQ ID NO: 6)).

（１．調製）
本発明の融合ペプチドは、化学合成または組み換え技術を用いることにより作製され得る。これらの方法は、当該分野において公知である。小ペプチド（例えば、５０残基未満のペプチド）または不自然もしくは異常なアミノ酸（例えば、Ｄ−Ｔｙｒ、オルニチン、アミノアジピン酸など）を含むものに対しては、化学合成（特に固相合成）が好まれる。より長いポリペプチドに対しては、組み換え技術が好まれる。組み換え手順が選択される場合、合成遺伝子が、デノボで構築され得るか、または天然の遺伝子は、例えば、カセット式変異誘発により変異され得る。以下に記載されるのは、例示的で一般的な組み換え手順である。 (1. Preparation)
The fusion peptides of the invention can be made by using chemical synthesis or recombinant techniques. These methods are known in the art. For small peptides (eg, peptides of less than 50 residues) or those containing unnatural or unusual amino acids (eg, D-Tyr, ornithine, aminoadipic acid, etc.), chemical synthesis (especially solid phase synthesis) is used. Liked. For longer polypeptides, recombinant techniques are preferred. If a recombination procedure is chosen, the synthetic gene can be constructed de novo or the native gene can be mutated, for example, by cassette mutagenesis. Described below is an exemplary general recombination procedure.

（ａ．組み換え調製）
融合ペプチドは、組み換えＤＮＡ技術を用いて作製され得る。これらの技術は、簡便化された形態で、上記ペプチドをコードする上記遺伝子（天然の遺伝子または合成の遺伝子のいずれか）を、獲得する工程；この獲得した遺伝子を適切なベクター中に挿入する工程；このベクターを適切な宿主細胞へと挿入する工程；この宿主細胞を培養し、この遺伝子の発現を引き起こす工程；およびこれにより生産されたペプチドを回収または単離する工程を企図する。好ましくは、この回収されたペプチドは、次いで、適切な程度にまで精製される。 (A. Recombination preparation)
Fusion peptides can be made using recombinant DNA technology. These techniques include, in a simplified form, obtaining the gene (either a natural gene or a synthetic gene) encoding the peptide; inserting the obtained gene into an appropriate vector Inserting the vector into a suitable host cell; culturing the host cell to cause expression of the gene; and recovering or isolating the peptide produced thereby. Preferably, the recovered peptide is then purified to an appropriate degree.

多少より詳しくは、ＩＧＦＢＰ−３融合タンパク質をコードするＤＮＡ配列がクローニングおよび操作され、その結果、簡便な宿主においてＩＧＦＢＰ−３融合タンパク質が発現され得る。親ポリペプチドをコードするＤＮＡは、遺伝子ライブラリーより、このペプチドを発現する細胞のｍＲＮＡ由来のｃＤＮＡより、またはこのＤＮＡ配列を合成的に構築する工程より取得され得る（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ（第２版）、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎ．Ｙ．，１９８９）。 More specifically, the DNA sequence encoding the IGFBP-3 fusion protein is cloned and manipulated so that the IGFBP-3 fusion protein can be expressed in a convenient host. The DNA encoding the parent polypeptide can be obtained from a gene library, from cDNA derived from mRNA of cells expressing this peptide, or from the step of synthetically constructing this DNA sequence (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd edition), Cold Spring Harbor Laboratory, NY, 1989).

次いで、親ＤＮＡは、適切なプラスミドまたはベクター（このベクターは、宿主細胞を形質転換するために使用される）へと挿入される。一般的に、宿主細胞に適合性の種に由来する複製配列および調節配列を含むプラスミドベクターは、これらの宿主と組み合わせて使用される。上記ベクターは、通常、複製部位、および形質転換された細胞に表現型の選別を付与し得るタンパク質またはペプチドをコードする配列を保持する。 The parent DNA is then inserted into an appropriate plasmid or vector, which is used to transform host cells. In general, plasmid vectors containing replication and regulatory sequences derived from species compatible with the host cell are used in conjunction with these hosts. Such vectors usually carry a replication site and a sequence encoding a protein or peptide that can confer phenotypic selection to transformed cells.

例えば、Ｅ．ｃｏｌｉは、ｐＢＲ３２２（Ｅ．ｃｏｌｉ種由来のプラスミド）を用いて形質転換され得る（Ｍａｎｄｅｌら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，５３：１５４（１９７０））。プラスミドｐＢＲ３２２は、アンピシリン耐性遺伝子およびテトラサイクリン耐性遺伝子を含み、従って、選別のための簡単な手段を提供する。他のベクターは、様々な特徴（例えば、様々なプロモーター（これは、発現においてしばしば重要である））を包含する。例えば、プラスミドｐＫＫ２２３−３、ｐＤＲ７２０、およびｐＰＬ−λは、現在入手可能（ＰｈａｒｍａｃｉａＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）な、ｔａｃプロモーター、ｔｒｐプロモーター、またはＰ_Ｌプロモーターを有する発現ベクターを表す。 For example, E.I. E. coli can be transformed with pBR322 (a plasmid derived from an E. coli species) (Mandel et al., J. Mol. Biol., 53: 154 (1970)). Plasmid pBR322 contains an ampicillin resistance gene and a tetracycline resistance gene and thus provides a simple means for selection. Other vectors include various features, such as various promoters, which are often important in expression. For example, plasmids pKK223-3, pDR720, and the pPL-lambda, currently available (Pharmacia Biotechnology), representing an expression vector having a tac promoter, trp promoter or _{P L} promoters.

好ましいベクターは、ｐＥＴ２１ａである。このベクターは、Ｔ７プロモーターにより制御され、そしてＮｏｖａｇｅｎｅ，Ｉｎｃ．から入手可能であり、そしてＳｔｕｄｉｅｒら、ＭｅｔｈｏｄｓＥｎｚｙｍｏｌ．，１８５：６０−８９（１９９０）に記載されている。他の好ましいベクターは、ｐＲ１Ｔ５およびｐＲ１Ｔ２Ｔ（ＰｈａｒｍａｃｉａＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）である。これらのベクターは、適切なプロモーターを含み、このプロモーターに、プロテインＡのＺドメインが続き、このことにより、遺伝子がこのベクター中に挿入され、融合タンパク質として発現されるのが可能になっている。別の適切なベクターは、ｐＢ０４７５であり、これは、ファージおよびＥ．ｃｏｌｉの複製起点を含み、このために、このベクターがこのような宿主間でシャトルされることが可能になり、これにより、突然変異誘発および発現の両方を促進する（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４３：１３３０−１３３６（１９８９）；米国特許第５，５８０，７２３号）。 A preferred vector is pET21a. This vector is controlled by the T7 promoter, and Novagene, Inc. And available from Studio et al., Methods Enzymol. 185: 60-89 (1990). Other preferred vectors are pR1T5 and pR1T2T (Pharmacia Biotechnology). These vectors contain a suitable promoter, which is followed by the Z domain of protein A, which allows the gene to be inserted into the vector and expressed as a fusion protein. Another suitable vector is pB0475, which is phage and E. coli. an origin of replication of E. coli, which allows this vector to be shuttled between such hosts, thereby facilitating both mutagenesis and expression (Cunningham et al., Science, 243: 1330-1336 (1989); U.S. Pat. No. 5,580,723).

他の好ましいベクターは、上に記載されたベクターの関連する特徴を組み合わせることにより、標準的な技術を用いて構築され得る。関連する特徴としては、プロモーター、リボソーム結合部位、デコルシン遺伝子もしくはオルナチン遺伝子または遺伝子融合（プロテインＡのＺドメインと、デコルシンもしくはオルナチンと、そのリンカー）、抗生物質耐性マーカー、および適切な複製起点が挙げられる。 Other preferred vectors can be constructed using standard techniques by combining the relevant features of the vectors described above. Related features include promoters, ribosome binding sites, decorcine or ornatine genes or gene fusions (Z domain of protein A, decorcin or ornatine and their linkers), antibiotic resistance markers, and appropriate origins of replication. .

宿主細胞は、原核細胞であっても真核細胞であってもよい。ＤＮＡ配列をクローニングおよび発現させ、その融合タンパク質を産生するための原核生物が好まれる。例えば、Ｅ．ｃｏｌｉＫ１２株２９４（ＡＴＣＣ番号３１４４６）ならびにＥ．ｃｏｌｉＢ、Ｅ．ｃｏｌｉＸ１７７６（ＡＴＣＣ番号３１５３７）、およびＥ．ｃｏｌｉｃ６００およびｃ６００ｈｆｌ、Ｅ．ｃｏｌｉＷ３１１０（Ｆ−、γ−、原栄養菌／ＡＴＣＣ番号２７３２５）、バシラス属（例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ）および他の腸内細菌科（例えば、ＳａｌｍｏｎｅｌｌａｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍもしくはＳｅｒｒａｔｉａｍａｒｃｅｓａｎｓ）および種々のＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ種が使用され得る。好ましい原核細胞は、Ｅ．ｃｏｌｉＢＬ２１（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）であり、これは、ＯｍｐＴおよびロンプロテアーゼ（これらが、インタクトな組み換えタンパク質の単離を妨害し得る）が欠損しており、そしてＴ７プロモーターがドライブされたベクター（例えば、ｐＥＴベクター）があれば有用である。別の適切な原核細胞は、Ｅ．ｃｏｌｉＷ３１１０（ＡＴＣＣ番号２７３２５）である。原核細胞により発現された場合、このペプチドは、代表的には、Ｎ末端メチオニンまたはホルミルメチオニンを含み、そしてグリコシル化されない。融合タンパク質の場合、Ｎ末端メチオニンまたはホルミルメチオニン残基は、この融合タンパク質のアミノ末端またはこの融合タンパク質のシグナル配列のアミノ末端に存在する。これらの例は、当然、限定的であることを意図されるのではなく、例示的であることを意図される。 The host cell may be a prokaryotic cell or a eukaryotic cell. Prokaryotes for cloning and expressing DNA sequences and producing the fusion protein are preferred. For example, E.I. E. coli K12 strain 294 (ATCC No. 31446) and E. coli coli B, E.I. E. coli X1776 (ATCC number 31537), and E. coli. coli c600 and c600hfl, E. coli. E. coli W3110 (F-, γ-, prototrophic / ATCC No. 27325), Bacillus (eg Bacillus subtilis) and other Enterobacteriaceae (eg Salmonella typhimurium or Serratia marcesans) and various Pseudomonas species are used. obtain. Preferred prokaryotic cells are E. coli. E. coli BL21 (Stratagene), which is deficient in OmpT and Ron protease (which may interfere with the isolation of intact recombinant protein) and a T7 promoter driven vector (eg, pET vector) ) Is useful. Another suitable prokaryotic cell is E. coli. E. coli W3110 (ATCC number 27325). When expressed by prokaryotic cells, the peptide typically contains an N-terminal methionine or formyl methionine and is not glycosylated. In the case of a fusion protein, the N-terminal methionine or formyl methionine residue is present at the amino terminus of the fusion protein or at the amino terminus of the signal sequence of the fusion protein. These examples are, of course, not intended to be limiting, but are intended to be exemplary.

原核細胞に加えて、真核微生物（例えば、糸状菌または酵母）は、融合タンパク質をコードするベクターの適切なクローニングのための宿主または適切な発現のための宿主である。Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅは、一般に使用された低級の真核細胞宿主微生物である。他としては、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｐｏｍｂｅ（ＢｅａｃｈおよびＮｕｒｓｅ，Ｎａｔｕｒｅ，２９０：１４０（１９８１））；ＥＰ１３９，３８３、１９８５年５月２日公開）；Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ宿主（米国特許第４，９４３，５２９号；Ｆｌｅｅｒら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，９：９６８−９７５（１９９１））（例えば、Ｋ．ｌａｃｔｉｓ（ＭＷ９８−８Ｃ、ＣＢＳ６８３、ＣＢＳ４５７４；Ｌｏｕｖｅｎｃｏｕｒｔら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１５４（２）：７３７−７４２（１９８３））、Ｋ．ｆｒａｇｉｌｉｓ（ＡＴＣＣ１２，４２４）、Ｋ．ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ（ＡＴＣＣ番号１６，０４５）、Ｋ．ｗｉｃｋｅｒａｍｉｉ（ＡＴＣＣ番号２４，１７８）、Ｋ．ｗａｌｔｉｉ（ＡＴＣＣ番号５６，５００）、Ｋ．ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａｒｕｍ（ＡＴＣＣ番号３６，９０６；ＶａｎｄｅｎＢｅｒｇら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，８：１３５（１９９０））、Ｋ．ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ、およびＫ．ｍａｒｘｉａｎｕｓ；ｙａｒｒｏｗｉａ（ＥＰ４０２，２２６）；Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ（ＥＰ１８３，０７０；Ｓｒｅｅｋｒｉｓｈｎａら、Ｊ．ＢａｓｉｃＭｉｃｒｏｂｉｏｌ．，２８：２６５−２７８（１９８８））；Ｃａｎｄｉｄａ；Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａｒｅｅｓｉａ（ＥＰ２４４，２３４）；Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａｃｒａｓｓａ（Ｃａｓｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７６：５２５９−５２６３（１９７９））；Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ（例えば、Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓ（ＥＰ３９４，５３８、１９９０年１０月３１日公開））；および糸状菌（例えば、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ，Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ，Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ（１９９１年１月１０日公開、ＷＯ９１／００３５７）、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ宿主（例えば、Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ（Ｂａｌｌａｎｃｅら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１１２：２８４−２８９（１９８３）；Ｔｉｌｂｕｒｎら、Ｇｅｎｅ，２６：２０５−２２１（１９８３）；Ｙｅｌｔｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８１：１４７０−１４７４（１９８４））およびＡ．ｎｉｇｅｒ（ＫｅｌｌｙおよびＨｙｎｅｓ，ＥＭＢＯＪ．，４：４７５−４７９（１９８５））。本明細書中では、メチロトローフの酵母は適切であり、そしてこれとしては、メタノールに依存して増殖し得る酵母（これは、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ，Ｃａｎｄｉｄａ、Ｋｌｏｅｃｋｅｒａ、Ｐｉｃｈｉａ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ、およびＲｈｏｄｏｔｏｒｕｌａからなる属より選択される）が挙げられるが、これらに限定されない。酵母のこの網の例示である特定の種のリストは、Ｃ．Ａｎｔｈｏｎｙ、ＴｈｅＢｉｏｃｈｅｍｓｔｒｙｏｆＭｅｔｈｙｌｔｒｏｐｈｓ、２６９（１９８２）において見出され得る。 In addition to prokaryotes, eukaryotic microorganisms (eg, filamentous fungi or yeast) are hosts for the appropriate cloning or expression of vectors encoding the fusion protein. Saccharomyces cerevisiae is a commonly used lower eukaryotic host microorganism. Others include Schizosaccharomyces pombe (Beach and Nurse, Nature, 290: 140 (1981)); EP 139,383, published May 2, 1985); Kluyveromyces host (US Pat. No. 4,943,529; Freer et al. Bio / Technology, 9: 968-975 (1991)) (eg, K. lactis (MW98-8C, CBS683, CBS4574; Louvencourt et al., J. Bacteriol. 154 (2): 737-742 (1983)), K. .Fragilis (ATCC 12,424), K. bulgaricus (ATCC number 16,045), K. wickeramii (ATCC number 24,178), K. Waltii ( ATCC No. 56,500), K. drosophilarum (ATCC No. 36,906; Van den Berg et al., Bio / Technology, 8: 135 (1990)), K. thermotolerans, and K. marxianus; yarrowia (EP 402,226) Pichia pastoris (EP 183,070; Sreekrishna et al., J. Basic Microbiol., 28: 265-278 (1988)); Candida; Trichoderma reeadia (EP 244, 234); Neurospora se. Proc. Sci.USA, 76: 5259-5263 (1979)); Schwanniomyces (Eg, Schwanniomyces occidentalis (EP 394,538, published October 31, 1990)); and filamentous fungi (eg, Neurospora, Penicillium, Tolypocladium (published 10 January 1991, WO 91/00357), Aspergillus host See, for example, A. nidulans (Ballance et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 112: 284-289 (1983); Tilburn et al., Gene, 26: 205-221 (1983); Yelton et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 1470-1474 (1984)) and A. niger (Kelly and Hynes, EMBO J. Biol. 4: 475-479 (1985)). As used herein, methylotrophic yeast is suitable and includes yeasts that can grow in dependence on methanol (this is from the genus consisting of Hansenula, Candida, Kloeckera, Pichia, Saccharomyces, Torulopsis, and Rhodotorula). Is selected), but is not limited thereto. A list of specific species that are examples of this net of yeast is C.I. Anthony, The Biochemistry of Methyltrops, 269 (1982).

融合タンパク質の発現に適した他の適切な宿主細胞は、多細胞生物に由来する。脊椎動物細胞の例としては、昆虫細胞（例えば、ショウジョウバエＳ２およびＳｐｏｄｏｐｔｅｒａＳｆ９）ならびに植物細胞が挙げられる。有用な哺乳動物宿主細胞株の例としては、チャニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞およびＣＯＳ細胞が挙げられる。より具体的な例としては、ＳＶ４０により形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株（ＣＯＳ−７、ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ１６５１）；２９３細胞またはヒト胚腎臓株（懸濁培養物における増殖のためにサブクローニングされた２９３細胞；Ｇｒａｈａｍら、Ｊ．ＧｅｎＶｉｒｏｌ．，３６：５９（１９７７））；チャイニーズハムスター卵巣細胞／−ＤＨＦＲ（ＣＨＯ，ＵｒｌａｕｂおよびＣｈａｓｉｎ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７７：４２１６（１９８０））；マウスセルトリ細胞（ＴＭ４、Ｍａｔｈｅｒ，Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．，２３：２４３−２５１（１９８０））；ヒト肺細胞（Ｗ１３８、ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ７５）；ヒト肝細胞（ＨｅｐＧ２、ＨＢ８０６５）；およびマウス***腫瘍（ＭＭＴ０６０５６２、ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ５１）が挙げられる。適切な宿主細胞の選別は、当該技術の範囲内であると考えられる。 Other suitable host cells suitable for the expression of the fusion protein are derived from multicellular organisms. Examples of vertebrate cells include insect cells (eg, Drosophila S2 and Spodoptera Sf9) and plant cells. Examples of useful mammalian host cell lines include Chinese hamster ovary (CHO) cells and COS cells. More specific examples include monkey kidney CV1 strain (COS-7, ATCC number CRL1651) transformed with SV40; 293 cells or human embryonic kidney strain (293 cells subcloned for growth in suspension culture) Graham et al., J. Gen Virol., 36:59 (1977)); Chinese hamster ovary cells / -DHFR (CHO, Urlaub and Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77: 4216 (1980)); Mouse Sertoli cells (TM4, Mother, Biol. Reprod., 23: 243-251 (1980)); human lung cells (W138, ATCC number CCL75); human hepatocytes (Hep G2, HB 8065); and mouse breast tumors ( MMT 0605 2, ATCC No. CCL51) and the like. Selection of appropriate host cells is considered within the skill of the art.

好ましくは、融合タンパク質のＺドメイン部分は、細胞（例えば、シグナル配列を有する）により分泌され、この融合タンパク質を培養物培地から単離および精製することを可能にし、そして所望のペプチドが細胞内に残存している場合に生じる、この宿主細胞を破壊する必要性を排除する。あるいは、この融合タンパク質は、細胞内に発現され得る。高度に発現された融合タンパク質を使用することが有用である。 Preferably, the Z domain portion of the fusion protein is secreted by the cell (eg, having a signal sequence), allowing the fusion protein to be isolated and purified from the culture medium, and the desired peptide to enter the cell. Eliminates the need to destroy this host cell that would otherwise occur. Alternatively, the fusion protein can be expressed intracellularly. It is useful to use a highly expressed fusion protein.

このペプチドは、融合タンパク質として発現された場合、適切にフォールディングされてもよいし、フォールディングされなくてもよい。また、上記切断部位を含む特異的なペプチドリンカーは、プロテアーゼに接近可能であってもよいし、接近不可能であってもよい。これらの因子は、この融合タンパク質が変性されなければならないか、または再度フォールディングを受けなければならないかを決定し、そしてその場合、これらの手順が切断前または切断後に用いられるかを決定する。 This peptide may or may not be properly folded when expressed as a fusion protein. Further, the specific peptide linker containing the cleavage site may be accessible to the protease or may not be accessible. These factors determine whether the fusion protein must be denatured or refolded, and if so, whether these procedures are used before or after cleavage.

変性および再度のフォールディングが必要とされる場合、代表的には、このペプチドがカロトロープ（ｃｈａｏｔｒｏｐｅ）（例えば、グアニジンＨＣｌ）で処理され、次いで、酸化還元緩衝液（例えば、還元されたジチオトレイロールおよび酸化されたジチオトレイロール、または還元されたグルタチオンおよび酸化されたグルタチオンを適切な比率、ｐＨ、および温度で含有する）で処理され、その結果、このペプチドは、そのネイティブな構造になるように再度フォールディングされる。 Where denaturation and refolding is required, typically the peptide is treated with a chaotrope (eg, guanidine HCl) and then redox buffer (eg, reduced dithiothreol and Oxidized dithiothreol, or reduced glutathione and oxidized glutathione at the appropriate ratio, pH, and temperature) so that the peptide is reconstituted to its native structure Folded.

（ｂ．合成上の調製）
当該分野で公知の他の均等の化学合成は、使用価値がある（ｅｍｐｌｏｙａｂｌｅ）が、ペプチドが組み換えＤＮＡ技術を用いて調製されない場合、ペプチドは、好ましくは、固相合成（例えば、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，８５：２１４９（１９６３）に全体的に記載されるような固相合成）を用いて調製されるが、当該分野で公知の他の同等の化学合成も使用可能である。固相合成は、保護されたα−アミノ酸を適切な樹脂に結合させることにより、ペプチドのＣ末端より開始される。このような出発物質は、エステル結合により、α−アミノ−保護アミノ酸と、クロロメチル化樹脂もしくはヒドロキシメチル樹脂とを結合することにより、またはＢＨＡ樹脂もしくはＭＢＨＡ樹脂とのアミド結合により、調製され得る。ヒドロキシメチル樹脂の調製は、Ｂｏｄａｎｓｋｙら、Ｃｈｅｍ．Ｉｎｄ．（Ｌｏｎｄｏｎ）、３８：１５９７−１５９８（１９６６）により記載される。クロロメチル化樹脂は、ＢｉｏＲａｄＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｒｉｃｈｍｏｎｄ、ＣＡおよびＬａｂ．Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．から市販されている。このような樹脂の調製は、Ｓｔｅｗａｒｔら、（Ｆｒｅｍａｎ＆Ｃｏ．，ＳａｎＦｒａｎｃｉｓｃｏ１９６９）「ＳｏｌｉｄＰｈａｓｅＰｅｐｔｉｄｅＳｙｎｔｈｅｓｉｓ」、第１章、ｐｐ１〜６により記載されている。ＢＨＡおよびＭＢＨＡ樹脂支持体は、市販されており、そして一般的に、合成される所望のポリペプチドが、Ｃ末端にて非置換のアミドを有する場合にのみ使用される。 (B. Synthetic preparation)
Other equivalent chemical syntheses known in the art are useful, but if the peptide is not prepared using recombinant DNA technology, the peptide is preferably solid phase synthesized (see, for example, Merrifield, J. et al. Am. Chem. Soc., 85: 2149 (1963)), but other equivalent chemical syntheses known in the art can also be used. . Solid phase synthesis is initiated from the C-terminus of the peptide by attaching a protected α-amino acid to an appropriate resin. Such starting materials can be prepared by combining an α-amino-protected amino acid with a chloromethylated resin or a hydroxymethyl resin by an ester bond, or by an amide bond with a BHA resin or MBHA resin. The preparation of the hydroxymethyl resin is described by Bodansky et al., Chem. Ind. (London), 38: 1597-1598 (1966). Chloromethylated resins are available from BioRad Laboratories, Richmond, CA and Lab. Systems, Inc. Commercially available. The preparation of such resins is described by Stewart et al. (Freman & Co., San Francisco 1969) “Solid Phase Peptide Synthesis”, Chapter 1, pp 1-6. BHA and MBHA resin supports are commercially available and are generally used only when the desired polypeptide being synthesized has an unsubstituted amide at the C-terminus.

アミノ酸は、ペプチド結合の形成のための周知の技術を用いてペプチド鎖に結合される。一つの方法は、アミノ酸を誘導体に転換する工程を包含し、この誘導体は、カルボキシル基を融合タンパク質の遊離Ｎ末端アミノ基を用いた反応により感受性にする。例えば、このアミノ酸は、保護されたアミノ酸とエチルクロロギ酸、フェニルクロロギ酸、ｓｅｃ−ブチルクロロギ酸、イソブチルクロロギ酸、塩化ピバロイルまたは酸塩化物との反応により、混合された無水物に転換され得る。あるいは、アミノ酸は、活性なエステル（例えば、２，４，５−トリクロロフェニルエステル、ペンタクロロフェニルエステル、ペンタフルオロフェニルエステル、ｐ−ニトロフェニルエステル、Ｎ−ヒドロキシルコハク酸エステル、または１−ヒドロキシベンゾトリアゾールから形成されるエステルへと転換され得る。 Amino acids are attached to the peptide chain using well-known techniques for the formation of peptide bonds. One method involves the conversion of an amino acid into a derivative that makes the carboxyl group more sensitive to reactions with the free N-terminal amino group of the fusion protein. For example, the amino acid can be converted to a mixed anhydride by reaction of the protected amino acid with ethyl chloroformate, phenylchloroformate, sec-butylchloroformate, isobutylchloroformate, pivaloyl chloride or acid chloride. Alternatively, the amino acid is from an active ester (eg, 2,4,5-trichlorophenyl ester, pentachlorophenyl ester, pentafluorophenyl ester, p-nitrophenyl ester, N-hydroxysuccinic acid ester, or 1-hydroxybenzotriazole). It can be converted to the ester formed.

別のカップリングの方法は、適切なカップリング剤（例えば、Ｎ，Ｎ’−ジシクロへキシルカルボジイミドまたはＮ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド）の使用を必要とする。他の適切なカップリング剤（当業者に公知のもの）は、Ｅ．ＧｒｏｓｓおよびＪ．Ｍｅｉｅｎｈｏｆｅｒ、ＴｈｅＰｅｐｔｉｄｅｓ：Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｂｉｏｌｏｇｙ；第Ｉ巻：ＭａｊｏｒＭｅｔｈｏｄｓｏｆＰｅｐｔｉｄｅＢｏｎｄＦｏｒｍａｔｉｏｎ（ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ，ＮｅｗＹｏｒｋ，１９７９）中に開示されている。 Another method of coupling requires the use of a suitable coupling agent (eg, N, N'-dicyclohexylcarbodiimide or N, N'-diisopropylcarbodiimide). Other suitable coupling agents (known to those skilled in the art) are available from E.I. Gross and J.M. Meienhofer, The Peptides: Analysis, Structure, Biology; Volume I: Major Methods of Peptide Bond Formation (Academic Press, New York, 1979).

このペプチド合成において使用される各アミノ酸のα−アミノ基は、カップリング反応の間、活性なα−アミノ官能を伴う副反応を防止するために、保護されなければならないことが認識されるべきである。最初のカップリング反応の間およびその後のカップリング反応の間の両方で、その部位で化学反応が生ずるのを防止するために、特定のアミノ酸が、反応性の側鎖官能基（例えば、スルフヒドリル、アミノ、カルボキシル、およびヒドロキシル）を含むこと、ならびにこのような官能基もまた、適切な保護基で保護されなければならないこともまた認識されるべきである。当該分野で公知の適切な保護基は、ＧｒｏｓｓおよびＭｅｉｅｎｈｏｆｅｒ、ＴｈｅＰｅｐｔｉｄｅｓ：Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｂｉｏｌｏｇｙ，第３巻：「ＰｒｏｔｅｃｔｉｏｎｏｆＦｕｎｃｔｉｏｎａｌＧｒｏｕｐｓｉｎＰｅｐｔｉｄｅＳｙｎｔｈｅｓｉｓ」（ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ，ＮｅｗＹｏｒｋ，１９８１）に記載されている。 It should be appreciated that the α-amino group of each amino acid used in this peptide synthesis must be protected during the coupling reaction to prevent side reactions involving active α-amino functions. is there. In order to prevent a chemical reaction from occurring at that site, both during the initial coupling reaction and during the subsequent coupling reaction, certain amino acids are reacted with reactive side chain functional groups (eg, sulfhydryls, It should also be recognized that the amino group includes amino, carboxyl, and hydroxyl) and that such functional groups must also be protected with a suitable protecting group. Suitable protecting groups known in the art are described in Gross and Meienhofer, The Peptides: Analysis, Structure, Biology, Volume 3: “Protection of Functional Groups in Peptide Synthesis” (According to 1981). Yes.

ペプチド合成において使用される特定の側鎖保護基の選択において、以下の一般的な規則が遵守される。αアミノ保護基は、（ａ）このアミノ酸の機能を、このカップリング反応において使用される条件下で、不活性化しなければならない、（ｂ）側鎖保護基を除去せず、そして融合タンパク質の構造を変更させない条件下で、カップリング反応後に容易に除去可能でなければならず、そして（ｃ）カップリングのまさに直前の活性化の際に、ラセミ化の可能性を排除しなければならない。側鎖保護基は、（ａ）カップリング反応において使用される条件下で、上記側鎖官能基を不活性にしなければならない、（ｂ）上記αアミノ保護基を除去する際に使用される条件下で安定化していなければならない、そして（ｃ）上記ペプチド鎖の構造を変更しない反応条件下で、所望のアミノ酸ペプチドが完了するとすぐに、容易に除去可能でなければならない。 The following general rules are adhered to in the selection of specific side chain protecting groups used in peptide synthesis. The α-amino protecting group (a) must deactivate the function of this amino acid under the conditions used in the coupling reaction, (b) does not remove the side chain protecting group, and Under conditions that do not alter the structure, it must be easily removable after the coupling reaction, and (c) the possibility of racemization must be eliminated upon activation just prior to coupling. The side chain protecting group must: (a) the side chain functional group must be inactive under the conditions used in the coupling reaction; (b) the conditions used in removing the α-amino protecting group And (c) must be easily removable as soon as the desired amino acid peptide is completed under reaction conditions that do not alter the structure of the peptide chain.

ペプチド合成のために有用であることが公知の保護基が、除去のために使用される薬剤との反応性において変動することが当業者に明らかである。例えば、特定の保護基（例えば、トリフェニルメチルおよび２−（ｐ−ビフェニリル）イソプロピルオキシカルボニルは、非常に不安定であり、そして穏やかな酸条件下で切断され得る。他の保護基（例えば、ｔ−ブチルオキシカルボニル（ＢＯＣ）、ｔ−アミロキシカルボニル、アダマンチル−オキシカルボニル、およびｐ−メトキシベンジルオキシカルボニル）は、より安定（ｌｅｓｓｌａｂｉｌｅ）であり、適度に強い酸（例えば、トリフルオロ酢酸、塩酸、または、酢酸中の三フッ化ホウ素）を保護基の除去のために必要とする。さらに他の保護基（例えば、ベンジルカルボニル（ＣＢＺまたはＺ）、ハロベンジルオキシカルボニル、ｐ−ニトロベンジルオキシカルボニル、シクロアルキルオキシカルボニルおよびイソプロピルオキシカルボニル）は、より一層安定（ｅｖｅｎｌｅｓｓｌａｂｉｌｅ）であり、より強度の酸（例えば、フッ化水素、臭化水素、またはトリフルオロ酢酸中のトリフルオロ酢酸ホウ素）を、保護基の除去のために必要とする。有用なアミノ酸保護基の部類としては、以下：
（１）αアミノ基に対して、（ａ）芳香族ウレタン型の保護基（例えば、フルオレニルメキシチルオキシカルボニル（ＦＭＯＣ））ＣＢＺ、および置換されたＣＢＺ（例えば、ｐ−クロロベンジルオキシカルボニル、ｐ−６−ニトロベンジルオキシカルボニル、ｐ−ブロモベンジルオキシカルボニル、およびｐ−メトキシベンジルオキシカルボニル、ｏ−クロロベンジルオキシカルボニル、２，４−ジクロロベンジルオキシカルボニル、２，６−ジクロロベンジルオキシカルボニルなど）；（ｂ）脂肪族ウレタン型保護基（例えば、ＢＯＣ、ｔ−アミロキシカルボニル、イソプロピルオキシカルボニル、２−（ｐ−ビフェニリル）−イソプロピルオキシカルボニル、アリ−ルオキシカルボニルなど）；（ｃ）シクロアルキルウレタン型保護基（例えば、シクロペンチルオキシカルボニル、アダマンチルオキシカルボニル、およびシクロへキシルオキシカルボニル）；ならびに（ｄ）アリールオキシカルボニル、が挙げられる。好ましいαアミノ保護基は、ＢＯＣまたはＦＭＯＣである。
（２）Ｌｙｓに存在する側鎖アミノ基に対して、保護が、上記（１）に言及される基（例えば、ＢＯＣ、ｐ−クロロベンジルオキシカルボニルなど）の任意の基であり得る。
（３）Ａｒｇのグアニジノ基に対して、保護は、ニトロ、トシル、ＣＢＺ、アダマンチルオキシカルボニル、２，２，５，７，８−ペンタメチルクロマン−６−スルホニルまたは２，３，６−トリメチル−４−メトキシフェニルスルホニル、またはＢＯＣによるものであり得る。
（４）Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、またはＴｙｒのヒドロキシル基に対して、保護は、例えば、Ｃ１−Ｃ４アルキル（例えば、ｔ−ブチル）；ベンジル（ＢＺＬ）；置換されたＢＺＬ（例えば、ｐ−メトキシベンジル、ｐ−ニトロベンジル、ｐ−クロロベンジル、ｏ−クロロベンジル、および２，６−ジクロロベンジル）によるものであり得る。
（５）ＡｓｐまたはＧｌｕのカルボキシル基に対して、保護は、例えば、基（例えば、ＢＺＬ、ｔ−ブチル、シクロへキシル、シクロペンチルなど）を用いたエステル化によるものであり得る。
（６）Ｈｉｓのイミダゾール窒素に対しては、トシル部分が適切に使用され得る。
（７）Ｔｙｒのフェノール性ヒドロキシル基に対しては、保護基（例えば、テトラヒドロピラニル、ｔｅｒｔ−ブチル、トリチル、ＢＺＬ、クロロベンジル、４−ブロモベンジル、または２，６−ジクロロベンジルは、適切に使用される。好ましい保護基は、２，６−ジクロロベンジルである。
（８）ＡｓｎまたはＧｌｎの側鎖アミノ基に対しては、好ましくは、キサンチル（Ｘａｎ）が使用される。
（９）Ｍｅｔに対しては、好ましくは、アミノ酸が保護されないままである。
（１０）Ｃｙｓのチオ基に対しては、代表的には、ｐ−メトキシベンジルが、使用される。 It will be apparent to those skilled in the art that protecting groups known to be useful for peptide synthesis vary in reactivity with the agents used for removal. For example, certain protecting groups such as triphenylmethyl and 2- (p-biphenylyl) isopropyloxycarbonyl are very labile and can be cleaved under mild acid conditions. t-Butyloxycarbonyl (BOC), t-amyloxycarbonyl, adamantyl-oxycarbonyl, and p-methoxybenzyloxycarbonyl) are less stable and have moderately strong acids (eg, trifluoroacetic acid, Hydrochloric acid or boron trifluoride in acetic acid is required for removal of protecting groups, and other protecting groups such as benzylcarbonyl (CBZ or Z), halobenzyloxycarbonyl, p-nitrobenzyloxy Carbonyl, cycloalkyloxycarbonyl and isopropyloxy Cycarbonyl) is even less labile, and a stronger acid (eg, boron trifluoroacetate in hydrogen fluoride, hydrogen bromide, or trifluoroacetic acid) can be used to remove protecting groups. A useful class of amino acid protecting groups includes:
(1) For an α-amino group, (a) an aromatic urethane-type protecting group (for example, fluorenylmexyloxycarbonyl (FMOC)) CBZ, and substituted CBZ (for example, p-chlorobenzyloxycarbonyl) P-6-nitrobenzyloxycarbonyl, p-bromobenzyloxycarbonyl, and p-methoxybenzyloxycarbonyl, o-chlorobenzyloxycarbonyl, 2,4-dichlorobenzyloxycarbonyl, 2,6-dichlorobenzyloxycarbonyl, etc. (B) an aliphatic urethane type protecting group (for example, BOC, t-amyloxycarbonyl, isopropyloxycarbonyl, 2- (p-biphenylyl) -isopropyloxycarbonyl, aryloxycarbonyl, etc.); (c) cyclo Alkyl urethane type protecting group For example, cyclopentyloxycarbonyl, adamantyloxycarbonyl, and cyclohexyl oxycarbonyl cyclohexylene); and (d) aryloxycarbonyl, and the like. Preferred α-amino protecting groups are BOC or FMOC.
(2) For the side chain amino group present in Lys, the protection may be any group of the groups mentioned in (1) above (eg BOC, p-chlorobenzyloxycarbonyl, etc.).
(3) protection against guanidino group of Arg is nitro, tosyl, CBZ, adamantyloxycarbonyl, 2,2,5,7,8-pentamethylchroman-6-sulfonyl or 2,3,6-trimethyl- It may be due to 4-methoxyphenylsulfonyl, or BOC.
(4) Protection against the hydroxyl group of Ser, Thr, or Tyr includes, for example, C1-C4 alkyl (eg, t-butyl); benzyl (BZL); substituted BZL (eg, p-methoxybenzyl, p-nitrobenzyl, p-chlorobenzyl, o-chlorobenzyl, and 2,6-dichlorobenzyl).
(5) For the carboxyl group of Asp or Glu, protection may be by, for example, esterification with groups (eg, BZL, t-butyl, cyclohexyl, cyclopentyl, etc.).
(6) For the imidazole nitrogen of His, the tosyl moiety can be used appropriately.
(7) For the phenolic hydroxyl group of Tyr, a protecting group (eg tetrahydropyranyl, tert-butyl, trityl, BZL, chlorobenzyl, 4-bromobenzyl, or 2,6-dichlorobenzyl is suitably A preferred protecting group is 2,6-dichlorobenzyl.
(8) Xantyl (Xan) is preferably used for the side chain amino group of Asn or Gln.
(9) For Met, preferably the amino acid remains unprotected.
(10) Typically, p-methoxybenzyl is used for the thio group of Cys.

適切に選択された保護基（Ｌｙｓの場合、ＢＯＣ）は、Ｃ末端のアミノ酸（例えば、Ｌｙｓ）のＮ−アミノ位を保護する。ＢＯＣ−Ｌｙｓ−ＯＨは、Ｈｏｒｉｋｉら、ＣｈｅｍｉｓｔｒｙＬｅｔｔｅｒｓ、１６５−１６８（１９７８）に記載される手順に従って、または約２５℃で２時間攪拌しながらイソプロピルカルボジイミドを用いて、最初にベンジヒドリルアミンまたはクロロメチル化樹脂にカップリングされる。ＢＯＣ−保護されたアミノ酸の樹脂支持体へのカップリングに続き、α−アミノ保護基が、塩化メチレン中のトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）またはＴＦＡのみを用いて、除去される。この脱保護は、約０℃〜室温の温度で実行される。他の標準的な切断用試薬（例えば、ジオキサン中のＨＣｌ）、および特定のα−アミノ保護基の除去のための保護基は、文献中に記載される。 A properly selected protecting group (in the case of Lys, BOC) protects the N-amino position of the C-terminal amino acid (eg Lys). BOC-Lys-OH can be prepared according to the procedure described in Horiki et al., Chemistry Letters, 165-168 (1978) or using isopropylcarbodiimide with stirring at about 25 ° C. for 2 hours, initially with benzhydrylamine or chloromethyl. Coupled to a fluorinated resin. Following coupling of the BOC-protected amino acid to the resin support, the α-amino protecting group is removed using only trifluoroacetic acid (TFA) or TFA in methylene chloride. This deprotection is performed at a temperature of about 0 ° C. to room temperature. Other standard cleavage reagents (eg, HCl in dioxane) and protecting groups for removal of certain α-amino protecting groups are described in the literature.

αアミノ保護基の除去後、残存するαアミノおよび側鎖保護アミノ酸は、同様に所望の順序でカップリングされる。合成において各アミノ酸を別々に添加する工程の代替として、いくつかは、お互いにカップリングされ、その後、固相合成機へと添加される。適切なカップリング剤の選択は、当該分野の範囲内である。カップリング剤として特別に適切なのは、Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミドまたはジイソプロピルカルボジイミドである。 After removal of the α-amino protecting group, the remaining α-amino and side chain protected amino acids are similarly coupled in the desired order. As an alternative to adding each amino acid separately in the synthesis, some are coupled together and then added to the solid phase synthesizer. The selection of a suitable coupling agent is within the skill of the art. Particularly suitable as coupling agents are N, N'-dicyclohexylcarbodiimide or diisopropylcarbodiimide.

保護された各アミノ酸またはアミノ酸配列は、固相反応器中に過剰に導入され、そして上記カップリングは、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）もしくはＣＨ_２Ｃｌ_２またはこれらの混合物の媒質（ｍｅｄｉｕｍ）中で適切に実行される。不完全なカップリングが生じると、カップリングの手順が反復され、その後、Ｎ−アミノ保護基が除去され、その後、次のアミノ酸がカップリングされる。各合成段階でのカップリング反応の成功が、モニタリングされ得る。合成をモニタリングする好ましい方法は、Ｋｌａｉｓｅｒら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ，３４：５９５（１９７０）に記載されるようなニンヒドリン反応による。このカップリング反応は、周知の方法（例えば、ＢＩＯＳＥＡＲＣＨ９５００^ＴＭペプチド合成機）を用いて、自動的に行われ得る。 Each protected amino acid or amino acid sequence is introduced in excess into a solid phase reactor, and the coupling is suitably carried out in dimethylformamide (DMF) or CH ₂ Cl ₂ or a medium of these mixtures. Executed. When incomplete coupling occurs, the coupling procedure is repeated, after which the N-amino protecting group is removed, and then the next amino acid is coupled. The success of the coupling reaction at each synthesis step can be monitored. A preferred method of monitoring synthesis is described by Klaiser et al., Anal. By a ninhydrin reaction as described in Biochem, 34: 595 (1970). This coupling reaction can be performed automatically using well-known methods (eg, BIOSEARCH 9500 ^™ peptide synthesizer).

所望のペプチド配列が完成するとすぐ、保護されたペプチドは、樹脂支持体から切断され得、そしてすべての保護基が除去され得る。この切断反応および保護基の除去は、同時にまたは段階式に、適切に完遂される。この樹脂支持体が、クロロメチル化ポリスチレン樹脂である場合、このペプチドを樹脂に係留（ａｎｃｈｏｒｉｎｇ）する結合は、Ｃ末端残基の遊離のカルボキシル基と、樹脂マトリックス上に存在する多くのクロロメチル基の内の一つとの間に形成されるエステル結合である。エステル結合を破壊し、そして上記樹脂マトリックスを貫通し得ることが公知の試薬は、係留結合を切断し得ることが理解される。 As soon as the desired peptide sequence is complete, the protected peptide can be cleaved from the resin support and all protecting groups can be removed. This cleavage reaction and removal of the protecting group is suitably accomplished simultaneously or stepwise. When the resin support is a chloromethylated polystyrene resin, the bond that anchors the peptide to the resin is the free carboxyl group of the C-terminal residue and the many chloromethyl groups present on the resin matrix. It is an ester bond formed between one of these. It is understood that reagents known to break ester bonds and penetrate the resin matrix can cleave tether bonds.

特に便利な一つの方法は、液体の無水フッ化水素を用いた処理によるものである。この試薬は、このペプチドを樹脂から切断するだけではなく、すべての保護基を除去する。従って、この試薬の使用は、十分に脱保護されたペプチドを直接的に産出する。クロロメチル化された樹脂が使用される場合、フッ化水素の処理により、遊離ペプチド酸が形成される。ベンズヒドリルアミン樹脂が使用される場合、フッ化水素処理により、遊離ペプチドアミンが直接的に生じる。アニソールおよびジメチルスルフィドの存在下、０℃、１時間での、フッ化水素との反応により、同時に側鎖保護基が除去され、この樹脂からペプチドが放出される。 One particularly convenient method is by treatment with liquid anhydrous hydrogen fluoride. This reagent not only cleaves the peptide from the resin but also removes all protecting groups. Thus, the use of this reagent directly yields a fully deprotected peptide. When a chloromethylated resin is used, treatment with hydrogen fluoride forms free peptide acids. When benzhydrylamine resin is used, the free peptide amine is generated directly by the hydrogen fluoride treatment. Reaction with hydrogen fluoride in the presence of anisole and dimethyl sulfide at 0 ° C. for 1 hour simultaneously removes the side chain protecting groups and releases the peptide from the resin.

保護基を除去することなくこのペプチドを切断することが望まれる場合、保護されたペプチド樹脂は、メタン分解（ｍｅｔｈａｎｏｌｙｓｉｓ）を経て、Ｃ末端のカルボキシ基がメチル化された、保護されたペプチドを得得る。次いで、このメチルエステルは、穏やかなアルカリ条件下で加水分解され、遊離のＣ末端カルボキシル基が生じる。次いで、ペプチド鎖上の保護基は、強酸（例えば、液体フッ化水素）を用いた処理により除去される。メタン分解のために特に有用な技術は、Ｍｏｏｒｅら、Ｐｅｐｔｉｄｅｓ，Ｐｒｏｃ．ＦｉｆｔｈＡｍｅｒ．Ｐｅｐｔ．Ｓｙｍｐ．，Ｍ．ＧｏｏｄｍａｎおよびＪ．Ｍｅｉｅｎｏｈｏｆｅｒ編（ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ，Ｎ．Ｙ．，１９７７）、ｐ５１８−ｐ５２１に記載される技術であり、この技術では、保護されたペプチド−樹脂は、クラウンエーテルの存在下で、メタノールおよびシアニドカリウムで処理される。 If it is desired to cleave this peptide without removing the protecting group, the protected peptide resin undergoes methanolysis to obtain a protected peptide in which the C-terminal carboxy group is methylated. obtain. The methyl ester is then hydrolyzed under mild alkaline conditions to yield a free C-terminal carboxyl group. The protecting group on the peptide chain is then removed by treatment with a strong acid (eg, liquid hydrogen fluoride). A particularly useful technique for methane decomposition is described by Moore et al., Peptides, Proc. Fifth Amer. Pept. Symp. , M.M. Goodman and J.M. A technique described in Meienhofer (John Wiley, NY, 1977), p518-p521, in which the protected peptide-resin is bound with methanol and potassium cyanide in the presence of crown ether. It is processed.

クロロメチル化された樹脂が使用される場合に、保護されたペプチドを、この樹脂から切断するための別の方法は、アンモニア分解またはヒドラジンを用いた処理による。所望の場合、生じたＣ末端アミドまたはヒドラジドは、遊離のＣ末端カルボキシ部分に加水分解され得、そして上記脱保護基は、便宜上除去され得る。 If a chloromethylated resin is used, another method for cleaving the protected peptide from the resin is by ammonia decomposition or treatment with hydrazine. If desired, the resulting C-terminal amide or hydrazide can be hydrolyzed to the free C-terminal carboxy moiety and the deprotecting group can be conveniently removed.

Ｎ末端αアミノ基上に存在する保護基は、この保護されたペプチドが支持体から切断される前またはその後のいずれかに、優先的に除去され得ることもまた認識される。 It will also be appreciated that protecting groups present on the N-terminal α-amino group can be preferentially removed either before or after the protected peptide is cleaved from the support.

本発明のポリペプチドの精製は、代表的には、従来の手順（例えば、分取ＨＰＬＣ（逆相ＨＰＬＣを含む）もしくは他の公知のクロマトグラフィー技術（例えば、ゲルパーミエーション、イオン交換、分画クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー（モノクローナル抗体カラムを含む）または向流分配を用いて達成される。 Purification of the polypeptides of the present invention typically involves conventional procedures (eg, preparative HPLC (including reverse phase HPLC) or other known chromatographic techniques (eg, gel permeation, ion exchange, fractionation). This is accomplished using chromatography, affinity chromatography (including monoclonal antibody columns) or countercurrent distribution.

本発明のペプチドは、重合により安定化され得る。これは、モノマー鎖を、多官能性架橋剤を用いて、直接的にまたは間接的にのいずれかで、多官能性ポリマーを介して、架橋することにより達成され得る。通常は、２種の実質的に同一のポリペプチドが、二官能性架橋剤を用いて、Ｃ末端またはＮ末端にて架橋される。この薬剤は、末端アミノ基および／または末端カルボキシル基を架橋するために使用される。一般的に、両末端カルボキシル基または両末端アミノ基は、お互いに架橋されるが、適切な架橋剤の選択により、一方のポリペプチドのαアミノ基は、もう一方のポリペプチドの末端カルボキシル基に架橋される。好ましくは、このポリペプチドは、システインを用いて、Ｃ末端にて置換される。当該分野で周知の条件下で、ジスルフィド結合は、末端システイン間で形成され得、これにより、このポリペプチド鎖を架橋する。例えば、ジスルフィドブリッジは、便宜上、遊離システインの金属触媒化酸化により、または適切に修飾されたシステイン残基の求核性置換により形成される。架橋剤の選択は、ポリペプチドに存在する、アミノ酸の反応性側鎖の同一性に依存する。例えば、ジスルフィド架橋は、システインがＣ末端以外のさらなる部位のポリペプチドに存在した場合には、好ましくない。本明細書中の範囲内にあるのは、メチレンブリッジで架橋されたペプチドである。 The peptides of the present invention can be stabilized by polymerization. This can be achieved by crosslinking the monomer chain, either directly or indirectly, with a multifunctional crosslinker, via a multifunctional polymer. Usually, two substantially identical polypeptides are cross-linked at the C-terminus or N-terminus using a bifunctional cross-linking agent. This agent is used to crosslink terminal amino groups and / or terminal carboxyl groups. In general, both terminal carboxyl groups or both terminal amino groups are cross-linked to each other, but by selecting an appropriate cross-linking agent, the α-amino group of one polypeptide is linked to the terminal carboxyl group of the other polypeptide. Cross-linked. Preferably, the polypeptide is substituted at the C-terminus with cysteine. Under conditions well known in the art, disulfide bonds can be formed between the terminal cysteines, thereby cross-linking the polypeptide chain. For example, disulfide bridges are conveniently formed by metal-catalyzed oxidation of free cysteine or by nucleophilic substitution of appropriately modified cysteine residues. The choice of cross-linking agent depends on the identity of the reactive side chain of the amino acid present in the polypeptide. For example, disulfide bridges are not preferred when cysteine is present in the polypeptide at additional sites other than the C-terminus. Within the scope herein are peptides cross-linked with methylene bridges.

上記ペプチド上の適切な架橋部位としては、Ｎ末端アミノ基およびＣ末端カルボキシル基を除き、リジン残基上に見出されるεアミノ基、ならびにアミノ基、イミノ基、カルボキシル基、スルフヒドリル基およびヒドロキシル基が挙げられ、これらは、フランキング配列中に導入されるペプチドまたは残基の内側残基の側鎖上に位置する。外部から架橋剤を添加することを介して、架橋は、例えば、当業者に公知の多くの試薬のいずれかを使用して（例えば、ポリペプチドのカルボジイミド処理を介して）、適切に達成される。多官能性（通常は二官能性）架橋剤の他の適切な例は、文献中に見出される。 Suitable cross-linking sites on the peptide include ε-amino groups found on lysine residues, as well as amino groups, imino groups, carboxyl groups, sulfhydryl groups and hydroxyl groups, except for the N-terminal amino group and the C-terminal carboxyl group. These are located on the side chain of the inner residue of the peptide or residue introduced into the flanking sequence. Through the addition of an external crosslinking agent, crosslinking is suitably accomplished, for example, using any of a number of reagents known to those skilled in the art (eg, via carbodiimide treatment of the polypeptide). . Other suitable examples of polyfunctional (usually bifunctional) crosslinkers are found in the literature.

本発明のペプチドはまた、環化により、高次構造的に安定化され得る。このペプチドは、通常は、あるペプチドのＮ末端ドメインおよびＣ末端ドメインを、２種以上の反復ペプチド配列を含むシクロオリゴマー（各内部ペプチドは、実質的に同一の配列を有する）を形成するように、本発明の別のペプチドの対応するドメインに共有結合することにより環化される。さらに、環化ペプチド（シクロオリゴマーまたはシクロモノマー）は、架橋され、その中に２ペプチド〜６ペプチドを有する１−３の環状構造を形成する。上記ペプチドは、好ましくは、αアミノ基および主鎖カルボキシル基（頭部から尾部まで）を介して共有結合されず、Ｎ末端ドメインおよびＣ末端ドメインに位置する残基の側鎖を介して架橋される。従って、架橋部位は、一般的に、残基の側鎖間に存在する。 The peptides of the present invention can also be stabilized structurally by cyclization. This peptide usually forms the N-terminal and C-terminal domains of a peptide so as to form a cyclooligomer comprising two or more repetitive peptide sequences, each internal peptide having a substantially identical sequence. Cyclized by covalent attachment to the corresponding domain of another peptide of the invention. In addition, cyclized peptides (cyclooligomers or cyclomonomers) are cross-linked to form 1-3 cyclic structures with 2-6 peptides in them. The peptide is preferably not covalently linked via the α-amino group and the main chain carboxyl group (from head to tail) and is cross-linked via the side chains of residues located in the N-terminal domain and the C-terminal domain. The Thus, cross-linking sites are generally present between the side chains of the residues.

本明細書中で企図されるような、モノ環化ペプチドまたはポリ環化ペプチドを調製するための多くの適切な方法それ自体は、公知である。Ｌｙｓ／Ａｓｐの環化は、Ｆｍｏｃ／９−フルオレニルメチル（ＯＦｍ）側鎖保護作用（Ｌｙｓ／Ａｓｐに対する）を有する固相支持体上のナトリウム−ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル（Ｎａ−Ｂｏｃ）−アミノ酸を用いて達成され；このプロセスは、ピペリジン処理、これに続く環化により完了される。 Many suitable methods for preparing mono- or polycyclized peptides, as contemplated herein, are known per se. The cyclization of Lys / Asp is sodium-tert-butyloxycarbonyl (Na-Boc)-on a solid support with Fmoc / 9-fluorenylmethyl (OFm) side chain protection (on Lys / Asp). This process is accomplished using an amino acid; the process is completed by piperidine treatment followed by cyclization.

ＧｌｕおよびＬｙｓ側鎖はまた、環式ペプチドまたは二環式環式ペプチドを調製する際に架橋される：上記ペプチドは、ｐ−メチルベンズヒドリルアミン樹脂上の固相化学反応（ｓｏｌｉｄ−ｐｈａｓｅｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）により合成される。このペプチドは、樹脂から切断され、そして脱保護される。この環式ペプチドは、希釈されたメチルホルムアミド中のジフェニルホスホリルアジドを用いて形成される。代替的な手順については、Ｓｃｈｉｌｌｅｒら、ＰｅｐｔｉｄｅＰｒｏｔｅｉｎＲｅｓ．，２５：１７１−１７７（１９８５）を参照のこと。また、米国特許第４，５４７，４８９号を参照のこと。 Glu and Lys side chains are also cross-linked in preparing a cyclic or bicyclic cyclic peptide: the peptide is a solid-phase chemistry on p-methylbenzhydrylamine resin. Is synthesized. This peptide is cleaved from the resin and deprotected. This cyclic peptide is formed using diphenylphosphoryl azide in diluted methylformamide. For an alternative procedure, see Schiller et al., Peptide Protein Res. 25: 171-177 (1985). See also U.S. Pat. No. 4,547,489.

ジスルフィド架橋されたペプチドまたは環化されたペプチドは、従来の方法により生成される。Ｐｅｌｔｏｎらの方法（Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，２９：２３７０−２３７５（１９８６））が適切である（Ｐｅｌｔｏｎらに記載される希釈反応混合物（シクロモノマーの生成について）より濃縮された溶液で反応を行うことにより、より大きな部分のシクロオリゴマーが生み出される場合を除く）。同一の化学的性質は、ダイマーまたはシクロオリゴマーまたはシアノモノマーの合成にとって有用である。また有用なのは、チオメチレンブリッジである。ＬｅｂｌおよびＨｒｕｂｙ、ＴｅｔｒａｈｅｄｒｏｎＬｅｔｔｅｒｓ，２５：２０６７−２０６８（１９８４）。また、Ｃｏｄｙら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，２８：５８３（１９８５）を参照のこと。 Disulfide bridged or cyclized peptides are produced by conventional methods. The method of Pelton et al. (J. Med. Chem., 29: 2370-2375 (1986)) is suitable (reacting with a more concentrated solution than the dilute reaction mixture described for Pelton et al. (For the formation of cyclomonomers)). Unless this produces a larger portion of the cyclo-oligomer). The same chemistry is useful for the synthesis of dimers or cyclooligomers or cyano monomers. Also useful is a thiomethylene bridge. Lebl and Hruby, Tetrahedron Letters, 25: 2067-2068 (1984). Also, Cody et al. Med. Chem. 28: 583 (1985).

所望の環式ペプチドまたは重合ペプチドは、ゲル濾過、これに続く逆相高圧液体クロマトグラフィーまたは他の従来の手順により、精製される。このペプチドは、滅菌濾過され、そして薬学的に受容可能な従来のビヒクルへと処方される。 The desired cyclic or polymerized peptide is purified by gel filtration followed by reverse phase high pressure liquid chromatography or other conventional procedures. The peptide is sterile filtered and formulated into a conventional pharmaceutically acceptable vehicle.

本明細書中に記載のプロセスに必要とされる出発物質は、文献中で公知であるか、または公知の方法および公知の出発物質を用いて調製され得る。 The starting materials required for the processes described herein are known in the literature or can be prepared using known methods and known starting materials.

作製されるペプチドにおいて、４個の非同一の置換基に結合された炭素原子が非対称性である場合、このペプチドは、ジアステレオ異性体、エナンチオマー、またはこれらの混合物として存在し得る。上記の合成は、ラセミ体、エナンチオマーまたはジアステレオマーを出発物質または中間体として使用し得る。例えば、このような合成物から生じるジアステレオマー生成物は、クロマトグラフィーの方法または結晶化の方法により分離され得る。同様に、エナンチオマー生成物の混合物は、同一の技術または当該分野で公知の他の方法により分離され得る。各不斉炭素原子は、存在する場合、２種の立体配置Ｒ）またはＳ）のうちの一方であり得、そして両方が、本発明の範囲内である。 In the peptide produced, if the carbon atoms attached to four non-identical substituents are asymmetric, the peptide can exist as a diastereoisomer, an enantiomer, or a mixture thereof. The above synthesis may use racemates, enantiomers or diastereomers as starting materials or intermediates. For example, diastereomeric products resulting from such compositions can be separated by chromatographic or crystallization methods. Similarly, mixtures of enantiomeric products can be separated by the same technique or other methods known in the art. Each asymmetric carbon atom, if present, can be one of the two configurations R) or S), and both are within the scope of the present invention.

別の実施形態では、本明細書中の融合タンパク質のフラグメントは、アフィニティーマチュレーションされ得、その結果、上記フラグメントは、ＩＧＦ−Ｉおよび／またはＩＧＦ−ＩＩに対して、親フラグメントより十分な親和性を有する。このようなアフィニティーマチュレーションは、例えば、ファージディスプレイ、合理的な突然変異誘発、ランダムな突然変異誘発、またはＤＮＡシャッフリング（ＤＮＡｓｈｕｆｆｌｉｎｇ）およびファージディスプレイ、またはこの変化を達成するための、当該分野で公知のこのような他の任意の手段を介して、行われ得る。定義の節に述べられた参考文献を参照のこと。 In another embodiment, the fragments of the fusion proteins herein can be affinity matured so that the fragments have a greater affinity for IGF-I and / or IGF-II than the parent fragment. Have Such affinity maturation is known in the art to achieve, for example, phage display, rational mutagenesis, random mutagenesis, or DNA shuffling and phage display, or this change. Through any other such means. See the references mentioned in the definition section.

（２．用途）
本明細書中に開示された適用に関して、融合タンパク質を用いることには、多くの利点がある。例えば、哺乳動物の系は、野生型ＩＧＦＢＰ−３の工業上の生産について費用がかかる。他方では、ペプチド融合体は、当業者に周知の合成化学的方法または非常に効率的な生物学的産生系を用いれば、野生型ＩＧＦＢＰ−３よりも廉価で生産しやすいことが予想される。 (2. Use)
There are many advantages to using fusion proteins for the applications disclosed herein. For example, mammalian systems are expensive for industrial production of wild type IGFBP-3. On the other hand, peptide fusions are expected to be cheaper and easier to produce than wild-type IGFBP-3 using synthetic chemical methods well known to those skilled in the art or highly efficient biological production systems.

本明細書中のペプチドは、診断用アッセイ（例えば、特定の細胞中、組織中、または血清中の、ＩＧＦ−１の発現を検出するためのアッセイ）において有用であり得る。 The peptides herein can be useful in diagnostic assays (eg, assays for detecting expression of IGF-1 in specific cells, tissues, or serum).

診断上の適用に関して、上記ペプチドは、代表的には、検出可能な部分で標識される。多くの標識が、利用可能であり、これらは、一般的に以下のカテゴリーへと分類され得る：
（ａ）放射性同位元素（例えば、３５Ｓ、１４Ｃ、１２１Ｉ、３Ｈ、および１３１Ｉ）が利用可能である。このペプチドは、放射性同位元素を用いて、例えば、ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、第１巻および第２巻、Ｃｏｌｉｇｅｎら、編（Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ：ＮｅｗＹｏｒｋ，１９９１）に記載される技術を用いて標識され得、そして放射活性は、シンチレーション計数を用いて測定され得る。
（ｂ）蛍光標識（例えば、希土類キレート（ユーロピウムキレート）またはフルオロセインおよびその誘導体、ローダミンおよびその誘導体、ダンシル、リサミン、フィコエリスリンおよびテキサスレッド）が利用可能である。蛍光標識は、例えば、ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（前出）に開示されるような技術を用いて、ペプチドに結合体化され得る。蛍光は、蛍光計を用いて定量化され得る。
（ｃ）種々の酵素−基質標識が利用可能であり、そして米国特許第４，２７５，１４９号は、これらのいくつかの概説（ｒｅｖｉｅｗ）を提供する。この酵素は、一般的には、種々の技術を用いて測定され得る発色体基質の化学変化（ｃｈｅｍｉｃａｌａｌｔｅｒａｔｉｏｎ）を触媒する。例えば、この酵素は、基質の色彩の変化を触媒し得、この色彩の変化は、分光光度法で測定され得る。あるいは、この酵素は、基質の蛍光または化学発光を変更し得る。蛍光の変化を定量するための技術は、上に記載されている。上記化学発光基質は、化学反応により電気的に励起され、次いで、（例えば、化学照度計を用いて）測定され得る光を放出するか、またはエネルギーを蛍光受容器に付与し得る。酵素標識の例としては、ルシフェラーゼ（例えば、ホタルルシフェラーゼおよび細菌性ルシフェラーゼ；米国特許第４，７３７，４５６号）、ルシフェリン、２，３−ジヒドロフタラジンジオン、リンゴ酸ジヒドロゲナーゼ、ウレアーゼ、ペルオキシダーゼ（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＰＲＯ）、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、リゾチーム、サッカライドオキシダーゼ（例えば、グルコースオキシダーゼ、ガラクトースオキシダーゼ、およびグルコース−６−ホスフェートデヒドロゲナーゼ）、複素環式オキシダーゼ（例えば、ウリカーゼおよびキサンチンオキシダーゼ）、ラクトペルオキシダーゼ、ミクロペルオキシダーゼなどが挙げられる。酵素を抗体に結合体化するための技術は、Ｏ’Ｓｕｌｌｉｖａｎら、「ＭｅｔｈｏｄｓｆｏｒＰｒｅｐａｒａｔｉｏｎｏｆＥｎｚｙｍｅ−ＡｎｔｉｂｏｄｙＣｏｎｊｕｇａｔｅｓｆｏｒｕｓｅｉｎＥｎｚｙｍｅＩｍｍｕｎｏａｓｓａｙ」、ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＥｎｚｙｍ．（Ｊ．ＬａｎｇｏｎｅおよびＨ．ＶａｎＶｕｎａｋｉｓ編），７３：１４７−１６６（ＡｃａｄｍｉｃＰｒｅｓｓ，ＮｅｗＹｏｒｋ，１９８１）に記載されている。 For diagnostic applications, the peptide is typically labeled with a detectable moiety. Many labels are available and these can generally be classified into the following categories:
(A) Radioisotopes (eg, 35S, 14C, 121I, 3H, and 131I) are available. This peptide is labeled with a radioisotope, for example, using the technique described in Current Protocols in Immunology, Volumes 1 and 2, Coligen et al., Ed. (Wiley-Interscience: New York, 1991). And radioactivity can be measured using scintillation counting.
(B) Fluorescent labels (eg, rare earth chelates (europium chelates) or fluorescein and its derivatives, rhodamine and its derivatives, dansyl, lissamine, phycoerythrin and Texas Red) are available. Fluorescent labels can be conjugated to peptides using techniques such as those disclosed in, eg, Current Protocols in Immunology (supra). Fluorescence can be quantified using a fluorimeter.
(C) Various enzyme-substrate labels are available, and US Pat. No. 4,275,149 provides a review of some of these. This enzyme generally catalyzes a chemical alteration of the chromogenic substrate that can be measured using various techniques. For example, the enzyme can catalyze a change in substrate color, which can be measured spectrophotometrically. Alternatively, the enzyme can alter the fluorescence or chemiluminescence of the substrate. Techniques for quantifying the change in fluorescence are described above. The chemiluminescent substrate can be electrically excited by a chemical reaction and then emit light that can be measured (eg, using a chemiluminometer) or impart energy to a fluorescent acceptor. Examples of enzyme labels include luciferases (eg firefly luciferase and bacterial luciferase; US Pat. No. 4,737,456), luciferin, 2,3-dihydrophthalazinedione, malate dihydrogenase, urease, peroxidase (eg Horseradish peroxidase (HPRO), alkaline phosphatase, β-galactosidase, glucoamylase, lysozyme, saccharide oxidase (eg, glucose oxidase, galactose oxidase, and glucose-6-phosphate dehydrogenase), heterocyclic oxidase (eg, uricase and xanthine) Oxidase), lactoperoxidase, microperoxidase, etc. Techniques for conjugating enzymes to antibodies are O'Sullivan et al., “Methods for Preparation of Enzyme-Antibody Conjugates for use in Enzyme Immunoassay,” 198, Methods in Enzym. (J. Lange, 66). )It is described in.

酵素−基質の組み合わせの例としては、例えば：
（ｉ）西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰＯ）と（基質としての）過酸化水素の組み合わせ（ここで、過酸化水素は、色素前躯体（例えば、オルトフェニレンジアミン（ＯＰＤ）、または塩酸３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）を酸化する）；
（ｉｉ）アルカリホスファターゼ（ＡＰ）と（色素体形成基質としての）パラニトロフェニルホスフェートとの組み合わせ；そして
（ｉｉｉ）β−Ｄ−ガラクトシダーゼ（β−Ｄ−Ｇａｌ）と色素形成基質（例えば、ｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトシダーゼ）または蛍光発生的基質（４−メチルウンベリフリル−β−Ｄ−ガラクトシダーゼ）との組み合わせ
が挙げられる。 Examples of enzyme-substrate combinations include, for example:
(I) A combination of horseradish peroxidase (HRPO) and hydrogen peroxide (as a substrate), where hydrogen peroxide is a dye precursor (eg, orthophenylenediamine (OPD) or hydrochloric acid 3,3 ′, 5 , 5′-tetramethylbenzidine (TMB) is oxidized);
(Ii) a combination of alkaline phosphatase (AP) and paranitrophenyl phosphate (as a chromogenic substrate); and (iii) β-D-galactosidase (β-D-Gal) and a chromogenic substrate (eg, p- Nitrophenyl-β-D-galactosidase) or a combination with a fluorogenic substrate (4-methylumbelliferyl-β-D-galactosidase).

多くの他の酵素−基質の組み合わせが、当業者に利用可能である。これらの全体的な概説としては、米国特許第４，２７５，１４９号および同第４，３１８，９８０号を参照のこと。 Many other enzyme-substrate combinations are available to those skilled in the art. For a general review of these, see U.S. Pat. Nos. 4,275,149 and 4,318,980.

時として、この標識がペプチドに間接的に結合される場合がある。当業者は、これを達成するための種々の技術を知っている。例えば、上記ペプチドは、ビオチンと結合体化され得、そして上に言及される任意の３種の広汎なカテゴリーの標識のいずれかは、アビジンと結合体化され得、逆も成り立つ。ビオチンは、選択的にアビジンに結合体化する。従って、この標識は、この間接的な様式でペプチドと結合体化され得る。あるいは、この標識とペプチドとの間接的な結合体化を達成するために、このペプチドは、低分子のハプテン（例えば、ジゴキシン）と結合体化され、上に言及される異なる型の標識の一つは、抗ハプテンペプチド（例えば、抗ジオキシン抗体）と結合される。このようにして、上記標識と上記ペプチドとの間接的な結合体化が、達成され得る。 Sometimes this label is indirectly attached to the peptide. Those skilled in the art are aware of various techniques for accomplishing this. For example, the peptide can be conjugated with biotin, and any of the three broad categories of labels mentioned above can be conjugated with avidin and vice versa. Biotin is selectively conjugated to avidin. Thus, the label can be conjugated with the peptide in this indirect manner. Alternatively, to achieve indirect conjugation of the label to the peptide, the peptide is conjugated to a small molecule hapten (eg, digoxin) and one of the different types of labels referred to above. One is conjugated with an anti-hapten peptide (eg, an anti-dioxin antibody). In this way, indirect conjugation of the label and the peptide can be achieved.

本発明の別の局面では、このペプチドは、標識される必要がなく、そしてこのペプチドの存在は、このペプチドに結合する標識化抗体を用いて検出され得る。 In another aspect of the invention, the peptide need not be labeled and the presence of the peptide can be detected using a labeled antibody that binds to the peptide.

本発明のペプチドは、任意の公知のアッセイ方法（例えば、競合的な結合アッセイ、直接的なサンドウィッチアッセイおよび間接的なサンドウィッチアッセイ、ならびに免疫沈降アッセイ）において使用され得る。Ｚｏｌａ，ＭｏｎｏｃｌｏｎａｌＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ＡＭａｎｕａｌｏｆＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，ｐｐ．１４７−１５８（ＣＲＣＰｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．１９８７）。 The peptides of the present invention can be used in any known assay method, such as competitive binding assays, direct and indirect sandwich assays, and immunoprecipitation assays. Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Technologies, pp. 147-158 (CRC Press, Inc. 1987).

このペプチドはまた、インビボの診断用アッセイのために使用され得る。一般的に、このペプチドは、放射性核種（例えば、１１１Ｉｎ、９９Ｔｃ、１４Ｃ、１３１Ｉ、１２５Ｉ、３Ｈ、３２Ｐ、または３５Ｓ）で標識され、その結果、抗原または抗原を発現する細胞は、イムノシンチノグラフィーを用いて局在化され得る。 This peptide can also be used for in vivo diagnostic assays. Generally, the peptide is labeled with a radionuclide (eg, 111In, 99Tc, 14C, 131I, 125I, 3H, 32P, or 35S) so that the antigen or cells expressing the antigen are immunoscintinographed. Can be used to localize.

他の用途としては、ｂｐ１５およびＩＧＦＢＰ−３および他のＩＧＦペプチドアゴニストの結合エピトープのマッピングが挙げられる。さらに、ＩＧＦ−ＩもしくはＩＧＦ−ＩＩまたはこれらを含む融合タンパク質に結合するＩＧＦＢＰ−３フラグメントは、細胞ベースのアッセイにおいて使用され得る。このような特定のアッセイは、細胞とネイティブ配列ヒトＩＧＦＢＰ−３とではなく、細胞と上記融合タンパク質とを接触させる工程、およびネイティブ配列ヒトＩＧＦＢＰ−３、ネイティブ配列ヒトＩＧＦ−Ｉもしくはネイティブ配列ＩＧＦ−ＩＩに起因する生物学的活性、または上記ＩＧＦ−Ｉもしくは上記ＩＧＦ−ＩＩのアゴニストの生物学的活性が観察されるか否かを決定する工程を包含する。一つの実施形態では、この生物学的活性は、ＩＧＦ−Ｉとは無関係のネイティブ配列ヒトＩＧＦＢＰ−３のアポトーシスである。別の例では、このアッセイは、ＩＧＦ−依存性ＫＩＲＡリン酸化アッセイである。このアッセイは、ＩＧＦ−Ｉキナーゼレセプター活性化アッセイであり、そしてこれは、ヒト１型レセプターの直接的な活性アッセイである。チロシンキナーゼファミリーにおけるレセプター（例えば、１型ＩＧＦレセプター）が活性化される場合、このレセプターは、チロシン残基上でリン酸化される。このアッセイにおいて、１型ＩＧＦレセプターを含む細胞は、インビトロで活性化され、次いで、崩壊され、そして、レセプターに対する抗体が使用され、ＩＧＦレセプターを沈殿させる。次に、抗ホスホチロシン抗体が、リン酸化された１型ＩＧＦレセプターの量をアッセイするために使用される。固定数の細胞が使用される場合、リン酸化されるレセプターの量は、１型ＩＧＦレセプター上の分子の活性の直接的な基準である。このＫＩＲＡアッセイにおいて、細胞（例えば、乳癌細胞株）は、ＩＧＦ−ＩまたはＩＧＦ−ＩＩプラス融合タンパク質で処理され、そして融合タンパク質の生物学的活性が、リン酸化されたレセプターの量により決定される。ＫＩＲＡアッセイは、米国特許第６，２５１，８６５号（ここでは、ＭＣＦ−７乳癌細胞が一実施形態として用いられる）およびＣｈｅｎら、Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．Ｍｅｔａｂ．，２８４：Ｅ１１４９−Ｅ１１５５（２００３）において、さらに記載される。 Other uses include mapping the binding epitopes of bp15 and IGFBP-3 and other IGF peptide agonists. Furthermore, IGFBP-3 fragments that bind to IGF-I or IGF-II or fusion proteins containing them can be used in cell-based assays. Such a specific assay involves contacting the cell with the fusion protein rather than the cell and native sequence human IGFBP-3, and the native sequence human IGFBP-3, native sequence human IGF-I or native sequence IGF- Determining whether a biological activity attributable to II or a biological activity of said IGF-I or an agonist of said IGF-II is observed. In one embodiment, the biological activity is apoptosis of native sequence human IGFBP-3 independent of IGF-I. In another example, the assay is an IGF-dependent KIRA phosphorylation assay. This assay is an IGF-I kinase receptor activation assay and it is a direct activity assay for the human type 1 receptor. When a receptor in the tyrosine kinase family (eg, type 1 IGF receptor) is activated, the receptor is phosphorylated on tyrosine residues. In this assay, cells containing type 1 IGF receptor are activated in vitro and then disrupted, and antibodies to the receptor are used to precipitate the IGF receptor. An anti-phosphotyrosine antibody is then used to assay the amount of phosphorylated type 1 IGF receptor. When a fixed number of cells is used, the amount of receptor phosphorylated is a direct measure of the activity of the molecule on the type 1 IGF receptor. In this KIRA assay, cells (eg, breast cancer cell lines) are treated with IGF-I or IGF-II plus fusion protein, and the biological activity of the fusion protein is determined by the amount of phosphorylated receptor. . The KIRA assay is described in US Pat. No. 6,251,865 (where MCF-7 breast cancer cells are used as one embodiment) and Chen et al., Am. J. et al. Physiol. Endocrinol. Metab. 284: E1149-E1155 (2003).

なお別の実施形態では、上記生物学的活性は、放射標識されたＩＧＦ−ＩまたはＩＧＦ−ＩＩの上記細胞への結合の阻害である。 In yet another embodiment, the biological activity is inhibition of binding of radiolabeled IGF-I or IGF-II to the cells.

さらなる例は、乳癌細胞を、ＩＧＦＢＰ−３フラグメントまたはその融合タンパク質で前処理する工程を包含する方法であり、このＩＧＦＢＰ−３フラグメントまたはその融合タンパク質は、ＩＧＦ−ＩまたはＩＧＦ−ＩＩを、少なくとも約２４時間結合し、その後、この細胞を、アポトーシス因子（例えば、化学療法剤（例えば、ドキソルビシンもしくはパクリタキセル）およびネイティブ配列ヒトＩＧＦＢＰ−３もしくは上記ＩＧＦＢＰ−３フラグメントまたは融合タンパク質で処理する工程、ならびに上記前処理または処理が、アポトーシス因子を用いた処理により誘導されるアポトーシスを増強するか否か、または前処理もしくは処理の量がこの目的に有効であるか否かを決定する工程を包含する。 A further example is a method comprising pretreating breast cancer cells with an IGFBP-3 fragment or fusion protein thereof, wherein the IGFBP-3 fragment or fusion protein comprises at least about IGF-I or IGF-II. Binding for 24 hours, and then treating the cells with an apoptotic factor (eg, a chemotherapeutic agent (eg, doxorubicin or paclitaxel) and native sequence human IGFBP-3 or the IGFBP-3 fragment or fusion protein, and Determining whether the treatment or treatment enhances apoptosis induced by treatment with an apoptotic factor, or whether the amount of pretreatment or treatment is effective for this purpose.

キットはまた、本発明の目的のために企図される。このキットは、一般的に、上記融合タンパク質を含有する組成物およびその使用（例えば、アッセイにおける使用）のための説明書を含む容器を含む。代表的なキットは、上記融合タンパク質を緩衝液中に含有する融合タンパク質処方物のための容器（好ましくは、バイアル）、および使用者に（例えば、エピトープをマッピングするためもしくは細胞ベースのアッセイのための）処方物を利用するように指示する説明書（例えば、製品挿入物またはラベル）を含む。このキットは、必要に応じて、融合タンパク質と一緒に使用される薬剤のために、容器（好ましくは、バイアル）を含む。 Kits are also contemplated for the purposes of the present invention. The kit generally comprises a container containing a composition containing the fusion protein and instructions for its use (eg, use in an assay). Exemplary kits include a container (preferably a vial) for a fusion protein formulation containing the fusion protein in a buffer, and a user (eg, for mapping epitopes or for cell-based assays). Instructions) (eg, product inserts or labels) that direct the use of the formulation. The kit optionally includes a container (preferably a vial) for the drug used with the fusion protein.

本発明は、以下の実施例を、参照することにより、より十分に理解される。しかし、これらは、本発明の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。本明細書中に言及されるすべての文献、特許の引用は、参考として明白に援用される。 The invention will be more fully understood by reference to the following examples. However, these should not be construed as limiting the scope of the invention. All literature and patent citations mentioned in this specification are expressly incorporated by reference.

（実施例１）
（ＩＧＦＢＰ−３およびミニＢＰ−３融合タンパク質の産生）
（イントロダクション）
ネイティブ配列ヒトＩＧＦＢＰ−３およびミニＢＰ−３融合タンパク質を調製し、ＢＩＡｃｏｒｅ^ＴＭアッセイにおけるネイティブ配列ヒトＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩの直接的な結合を評価した。 Example 1
(Production of IGFBP-3 and miniBP-3 fusion protein)
(introduction)
Native sequence human IGFBP-3 and miniBP-3 fusion proteins were prepared and evaluated for direct binding of native sequence human IGF-I and IGF-II in the BIAcore ^™ assay.

以下に記載されるミニＢＰ−３融合タンパク質を用いた実験の結果に基づき、本明細書中で特許請求されるこの型の分子が、活性なＩＧＦのレベルを低減することが予想される。 Based on the results of experiments with the miniBP-3 fusion protein described below, it is expected that this type of molecule claimed herein will reduce the level of active IGF.

（材料と方法）
（野生型のＩＧＦＢＰ−３およびミニＢＰ−３融合体および切断されたミニＢＰ−３の発現と精製）
野生型ＩＧＦＢＰ−３およびミニＢＰ−３を、ベクターｐＥＴ２１ａ（Ｎｏｖａｇｅｎｅ）を用いて、以下のようにしてＥ．ｃｏｌｉ中で生産した：
慣用的な化学試薬をすべて、ＳｉｇｍａＣｈｅｍｉｃａｌＣｏ．（ＳｔＬｏｕｉｓ，ＭＯ）またはＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（ＦａｉｒＬａｗｎ，ＮＪ）より購入した。制限酵素およびＴ４ＤＮＡリガーゼを、ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ（Ｂｅｖｅｒｌｅｙ、ＭＡ）より取得した。オリゴヌクレオチド合成試薬、ＤＮＡ配列決定キット、およびＰＣＲのキットを、ＰＥＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（ＦｏｓｔｅｒＣｉｔｙ，ＣＡ）より取得した。ｄＮＴＰ、ＩＰＴＧ、およびＡＴＰを、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ（Ｉｎｄｉｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）より購入した。ＤＮＡポリメラーゼおよびＥ．ｃｏｌｉ株ＢＬ２１を、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（ＬａＪｏｌｌａ，ＣＡ）より購入した。 (Materials and methods)
(Expression and purification of wild-type IGFBP-3 and miniBP-3 fusions and cleaved miniBP-3)
Wild type IGFBP-3 and miniBP-3 were transformed into E. coli using vector pET21a (Novagene) as follows. produced in E. coli:
All conventional chemical reagents are available from Sigma Chemical Co. (StLouis, MO) or Fisher Scientific (Fair Lawn, NJ). Restriction enzymes and T4 DNA ligase were obtained from New England Biolabs (Beverley, MA). Oligonucleotide synthesis reagents, DNA sequencing kits, and PCR kits were obtained from PE Biosystems (Foster City, CA). dNTP, IPTG, and ATP were purchased from Boehringer-Mannheim (Indinapolis, IN). DNA polymerase and E. coli E. coli strain BL21 was purchased from Stratagene (La Jolla, Calif.).

プラスミドｐＥＴ２１ａを、ＮｏｖａｇｅｎＩｎｃ．（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）より購入した。アフィニティーカラムを、Ｐｈａｒｍａｃｉａ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）から得た。ＬＢ培地を、標準的処方に従って調製した（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前出）。ＨＥＰＥＳ緩衝液およびＣＨＡＰＳ緩衝液ならびにＤＴＴは、以下に示される供給源より取得可能である。周辺質の抽出緩衝液は、１０ｍＭＴＲＩＳ−ＨＣｌ、ｐＨ８．５および１ｍＭのＥＤＴＡを含んだ。ＴＥ緩衝液は、１０ｍＭＴＲＩＳ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０および１ｍＭＥＤＴＡを含んだ。 Plasmid pET21a was obtained from Novagen Inc. (Madison, WI). Affinity columns were obtained from Pharmacia (Piscataway, NJ). LB medium was prepared according to standard recipes (Sambrook et al., Supra). HEPES and CHAPS buffers and DTT can be obtained from the sources shown below. Periplasmic extraction buffer contained 10 mM TRIS-HCl, pH 8.5 and 1 mM EDTA. TE buffer contained 10 mM TRIS-HCl, pH 8.0 and 1 mM EDTA.

オリゴデオキシリボヌクレオチドを、ＰＥＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓからの３９４自動化ＤＮＡ合成機を用いて合成した。ＰＣＲおよび配列決定用プライマーを、エタノール沈殿により精製し、そしてＴＥ緩衝液中に溶解した。上記Ｚドメインを、プライマー Oligodeoxyribonucleotides were synthesized using a 394 automated DNA synthesizer from PE Biosystems. PCR and sequencing primers were purified by ethanol precipitation and dissolved in TE buffer. The Z domain is a primer

および

and

を用いた、ベクターｐＡ−１００−Ｚ（これは、Ｄｅｎｎｉｓら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，４０：９５１３（２００１）に記載される構築物に由来する）のＰＣＲにより増幅した。増幅したＺドメインを、ＮｈｅＩおよびＥｃｏＲＩで消化し、そして同一対の制限酵素で処理したクローニングベクターｐＥＴ２１ａ（Ｎｏｖａｇｅｎ）中に連結し、そしてｐＥＴ２１ａ−Ｚドメイン融合体を生成した。Ｚドメインの挿入を、配列決定により確認した。

Was amplified by PCR of the vector pA-100-Z (derived from the construct described in Dennis et al., Biochemistry, 40: 9513 (2001)). The amplified Z domain was digested with NheI and EcoRI and ligated into the cloning vector pET21a (Novagen) treated with the same pair of restriction enzymes, generating a pET21a-Z domain fusion. The insertion of the Z domain was confirmed by sequencing.

ミニＢＰ−３融合体のコード領域を、Ｓｔｅｍｍｅｒら、Ｇｅｎｅ，１６４：４９−５３（１９９５）の遺伝子組み立て方法を用いてＰＣＲにより合成した。遺伝子組み立てのために使用されたオリゴヌクレオチドは、以下の配列： The coding region of the miniBP-3 fusion was synthesized by PCR using the gene assembly method of Stemmer et al., Gene, 164: 49-53 (1995). The oligonucleotides used for gene assembly have the following sequences:

および

and

を有した。組み立てられた遺伝子を、以下のオリゴヌクレオチド：

Had. The assembled gene is converted into the following oligonucleotides:

および

and

を用いて増幅した。

Was amplified using.

全長の融合ミニＢＰ−３タンパク質をコードする遺伝子を、ＰＣＲＳｙｓｔｅｍ９７００^ＴＭサーモサイクラー（ＰＥＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて、Ｃａｏら、Ｇｅｎｅ，１９７：２０５−２１４（１９９７）に記載の通りに、プライマーを用いて増幅した。増幅産物を、ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化し、そして同一対の制限酵素で処理したｐＥＴ２１ａ−Ｚ−ドメイン含有ベクターへと連結し、ｐＥＴ２１ａ−ミニＢＰ−３融合体を生成した。ミニＢＰ−３フラグメントの挿入を、配列決定により確認した。エンテロキナーゼ切断部位ＥＦＧＧＤＤＤＤＫ（配列番号４）を、後に、ＱＵＩＣＫＣＨＡＮＧＥ^ＴＭＳｉｔｅ−ＤｉｒｅｃｔｅｄＭｕｔａｇｅｎｅｓｉｓＫｉｔを用いて、カスパーゼ−３切断部位のＥＦＧＧＤＬＶＤ（配列番号７）と置換した。これらの２種の突然変異誘発プライマーは、配列： The gene encoding the full-length fusion miniBP-3 protein can be generated using primers as described in Cao et al., Gene, 197: 205-214 (1997) using a PCR System 9700 ^™ thermocycler (PE Biosystems). Amplified. The amplified product was digested with EcoRI and HindIII and ligated into a pET21a-Z-domain containing vector treated with the same pair of restriction enzymes to generate a pET21a-miniBP-3 fusion. The insertion of the miniBP-3 fragment was confirmed by sequencing. The enterokinase cleavage site EFGGDDDDDK (SEQ ID NO: 4) was later replaced with EFGGDLVD (SEQ ID NO: 7) at the caspase-3 cleavage site using QUICKCHANGE ^™ Site-Directed Mutagenesis Kit. These two mutagenic primers have the sequence:

および

and

を有した。上記変異体を、配列決定により確認した。

Had. The mutant was confirmed by sequencing.

このベクターで、Ｅ．ｃｏｌｉのＢＬ２１株（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を形質転換した。ｐＥＴ発現ベクター中の挿入物を、両方向に配列決定し、上記プラスミド構築物にＰＣＲのエラーまたはライゲーションのエラーがないことを確かめた。 With this vector, E. coli strain BL21 (Stratagene) was transformed. The insert in the pET expression vector was sequenced in both directions to confirm that the plasmid construct was free of PCR or ligation errors.

この細胞を、３７℃で一晩、５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有する２ＹＴ培地（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前出）で増殖させた。一晩培養した培養物を、同一の倍地中に１００倍希釈し、培養物の６００ｎｍでの光学密度が０．５に達するまで培養し、次いで、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を最終濃度が５０μＭになるまで添加することにより誘導し、そして同一の条件下でさらに４時間増殖させた。細胞を、遠心分離により収集し、周辺質抽出緩衝液（−２０℃／４℃）中で凍結／解凍し、そしてＣａｏら（前出）に記載されるように、遠心分離により浄化した。 The cells were grown overnight at 37 ° C. in 2YT medium (Sambrook et al., Supra) containing 50 μg / ml ampicillin. The overnight culture is diluted 100-fold in the same medium, cultured until the optical density at 600 nm of the culture reaches 0.5, then isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside (IPTG) was induced by adding to a final concentration of 50 μM and grown for an additional 4 hours under the same conditions. Cells were collected by centrifugation, frozen / thawed in periplasmic extraction buffer (−20 ° C./4° C.), and clarified by centrifugation as described in Cao et al. (Supra).

ＩｇＧＳＥＰＨＡＲＯＳＥ^ＴＭイオン交換カラム（ＡｍｅｒｓｈａｍＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて、Ｎｉｌｓｓｓｅｎら（前出）に記載されるように、遠心分離からの周辺質の抽出物を、クロマトグラフィーに供した。簡単に、このカラムを、５容積の５０ｍＭＴＲＩＳ緩衝液（ｐＨ７．６、１５０ｍＭＮａＣｌおよび０．０５％ＴＷＥＥＮ−２０^ＴＭ緩衝液（ＴＳＴ））で洗浄し、次いで、代替的に０．５Ｍの酢酸（ＨＡｃ）、ｐＨ３．４およびＴＳＴで２回洗浄した。このカラムを、ＴＳＴで平衡化し、そして融合タンパク質をカラム上で捕捉した（Ｎｉｌｓｓｏｎら、前出に記載されるように）。このカラムを、１０の総容積（ｂｅｄ）のＴＳＴおよび２の総容積の酢酸アンモニウム（５ｍＭ）（溶出前はｐＨ５．０）で洗浄した。 The periplasmic extract from the centrifugation was subjected to chromatography as described by Nilsssen et al. (Supra) using an IgG SEPHAROSE ^™ ion exchange column (Amersham Biosciences). Briefly, the column is washed with 5 volumes of 50 mM TRIS buffer (pH 7.6, 150 mM NaCl and 0.05% TWEEN-20 ^TM buffer (TST)) and then alternatively with 0.5 M acetic acid. Washed twice with (HAc), pH 3.4 and TST. The column was equilibrated with TST and the fusion protein was captured on the column (as described in Nilsson et al., Supra). The column was washed with 10 total volumes of bed TST and 2 total volumes of ammonium acetate (5 mM) (pH 5.0 before elution).

上記融合タンパク質を４の総容積の０．５ＭのＨＡｃで溶出した後、これを、１２５ｎＭのカスパーゼ−３（これは、親切にも、ＴｈｅＢｕｒｎｈａｍＩｎｓｔｉｔｕｔｅ，ＬａＪｏｌｌａ，ＣＡのＤｒ．ＧｕｙＳａｌｖｅｓｅｎが提供してくれた）と一緒に、１００ｍＭのＨｅｐｅｓ緩衝液（ＰｒｏＳｃｉＴｅｃｈ）、０．１％のＣＨＡＰＳ溶解緩衝液（ＣｈｅｍｉｃｏｎＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）、０．５ｍＭのジチオトレイトール（ＤＴＴ）（ＪＴＢａｋｅｒ）中で、ｐＨ７．５、４℃で一晩インキュベートした。切断されたミニＢＰ−３を、遠心分離後の反応の上清から回収した。この融合タンパク質の純度は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析、これに続いて、過剰負荷されたゲルを慣用的なクマシーブルーＲ染色で視覚化したことにより立証した。図２を参照のこと。図２は、種々の段階のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。 After eluting the fusion protein with a total volume of 0.5 M HAc of 4, this was provided by 125 nM caspase-3 (kindly provided by Dr. Guy Salvesen of The Burnham Institute, La Jolla, Calif. PH 7 in 100 mM Hepes buffer (ProSciTech), 0.1% CHAPS lysis buffer (Chemicon International), 0.5 mM dithiothreitol (DTT) (JT Baker) 5. Incubated overnight at 4 ° C. The cut miniBP-3 was collected from the supernatant of the reaction after centrifugation. The purity of the fusion protein was verified by SDS-PAGE analysis followed by visualization of the overloaded gel with conventional Coomassie blue R staining. See FIG. FIG. 2 shows the SDS-PAGE analysis at various stages.

野生型ＩＧＦＢＰ−３を発現するＢＬ２１細胞を培養し、そしてミニＢＰ−３の場合と同様に発現を誘導した。野生型ＩＧＦＢＰ−３を、封入体から抽出し、そして標準的条件を用いて、インビトロで再度フォールディングさせた。ＱおよびＳの両方のＳＥＰＨＡＲＯＳＥ^ＴＭ（ＡｍｅｒｓｈａｍＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）カラムによるイオン交換クロマトグラフィーおよびフェニルＳＵＰＥＲＯＳＥ^ＴＭ（ＡｍｅｒｓｈａｍＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）カラムによる疎水性相互作用クロマトグラフィーを用いて、精製を達成した。 BL21 cells expressing wild type IGFBP-3 were cultured and expression was induced as with miniBP-3. Wild type IGFBP-3 was extracted from inclusion bodies and refolded in vitro using standard conditions. Purification was achieved using ion exchange chromatography on both Q and S SEPHAROSE ^™ (Amersham Biosciences) columns and hydrophobic interaction chromatography on phenyl SUPEROSE ^™ (Amersham Biosciences) columns.

（バイオセンサー反応速度測定）
野生型ＩＧＦＢＰ−３およびミニＢＰ３融合タンパク質のＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩに対する結合親和性を、ＢＩＡｃｏｒｅ^ＴＭ−２０００リアルタイム速度相互作用分析系（ＢＩＡｃｏｒｅ，Ｉｎｃ．，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）を用いて決定し、会合速度（ｋ_ａ）および解離速度（ｋ_ｄ）を測定した。２種の型のチップを、この目的で調製した。 (Biosensor reaction rate measurement)
The binding affinity of wild-type IGFBP-3 and miniBP3 fusion proteins to IGF-I and IGF-II was determined using the BIAcore ^™ -2000 real-time rate interaction analysis system (BIAcore, Inc., Piscataway, NJ) association rate _{(k a)} and dissociation rates _{(k d)} were determined. Two types of chips were prepared for this purpose.

（ＣＭ５チップ調製）
カルボキシメチル化デキストランバイオセンサーチップ（ＣＭ５、ＢＩＡｃｏｒｅ，Ｉｎｃ．）を、業者の説明書に従ってＥＤＣ（塩酸Ｎ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド）およびＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシコハク酸）で活性化した。固定化のため、１０ｍＭの酢酸ナトリウム（ｐＨ４）において、野生型ＩＧＦＢＰ−３および変異体をバイオセンサーチップ上に、０．２ｍｇ／ｍｌの濃度で注入し、約４５０−７００ＲＵ（共鳴反応の単位）の共有結合されたタンパク質を得た。未反応の基を、１Ｍのエタノールアミンの注入により遮断した。 (CM5 chip preparation)
Carboxymethylated dextran biosensor chip (CM5, BIAcore, Inc.) was prepared using EDC (N-ethyl-N ′-(3-dimethylaminopropyl) -carbodiimide hydrochloride) and NHS (N-hydroxysuccinic acid) according to the manufacturer's instructions. ). For immobilization, wild type IGFBP-3 and the mutant were injected onto the biosensor chip at a concentration of 0.2 mg / ml in 10 mM sodium acetate (pH 4), and about 450-700 RU (unit of resonance reaction). Of covalently bound protein. Unreacted groups were blocked by injection of 1M ethanolamine.

反応速度測定を、２０μｌ／分または５０μｌ／分の流速を用いて、２５℃のＰＢＳＴランニング緩衝液（ＰＢＳ、０．０５％ＴＷＥＥＮ−２０^ＴＭ緩衝液、０．０１％のアジ化ナトリウム）中のＩＧＦ−ＩまたはＩＧＦ−ＩＩの２倍での段階希釈物の注入により行った。ＩＧＦＢＰ−３に関しては、ＩＧＦ濃度の範囲は、０．４ｎＭ〜５０ｎＭの間であり、ミニＢＰ−３融合体に関しては、１００ｎＭ〜２５μＭの間であった。両タンパク質に関しては、結合速度および解離速度を１：１のＬａｎｇｍｕｉｒ会合モデルを用いて、ＢＩＡｃｏｒｅ^ＴＭ評価ソフトウェアにおいて計算した。野生型ＩＧＦＢＰ−３に関しては、平衡解離定数を、ｋ_ｄ／ｋ_ａとして計算した。ミニＢＰ−３融合体に関しては、平衡解離定数を、ＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍ^ＴＭソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄＳｏｆｔｗａｒｅＩｎｃ．，ＳａｎＤｉｅｇｏ，ＣＡ）中の平衡結合データをプロットし、一部位結合モデルにあてはめることにより計算した。 Kinetic measurements were performed in PBST running buffer (PBS, 0.05% TWEEN-20 ^TM buffer, 0.01% sodium azide) at 25 ° C. using a flow rate of 20 μl / min or 50 μl / min. This was done by injection of serial dilutions at twice the IGF-I or IGF-II. For IGFBP-3, the range of IGF concentrations was between 0.4 nM and 50 nM and for miniBP-3 fusions between 100 nM and 25 μM. For both proteins, association and dissociation rates were calculated in the BIAcore ^™ evaluation software using a 1: 1 Langmuir association model. For the wild-type IGFBP-3, the equilibrium dissociation _constant, was calculated as _k d / k _a. For the miniBP-3 fusion, the equilibrium dissociation constant was calculated by plotting the equilibrium binding data in GraphPad Prism ^™ software (GraphPad Software Inc., San Diego, Calif.) And fitting it to the partial binding model.

（ＳＡチップ調製）
ストレプタビジンで被覆したチップを、製造業者（ＢＩＡｃｏｒｅ，Ｉｎｃ．）の説明書に従って調整し、その後、１０ｍＭの酢酸ナトリウム（ｐＨ４）中の０．０２ｍｇ／ｍｌのビオチニル化したＩＧＦ−ＩまたはＩＧＦ−ＩＩを注入した。ビオチニル化したＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩを、製造業者（Ｐｉｅｒｃｅ）の説明書に従って、ＥＺ−Ｌｉｎｋビオチニル化試薬を用いて調製した。１００ＲＵ〜１０００ＲＵを、チップ上に固定した。 (SA chip preparation)
Chips coated with streptavidin were prepared according to the manufacturer's instructions (BIAcore, Inc.) and then 0.02 mg / ml biotinylated IGF-I or IGF-II in 10 mM sodium acetate (pH 4). Injected. Biotinylated IGF-I and IGF-II were prepared using EZ-Link biotinylation reagent according to the manufacturer's instructions (Pierce). 100 RU to 1000 RU were fixed on the chip.

反応速度測定を、ミニＢＰ−３融合タンパク質の２倍での段階希釈物を、ＰＢＳＴランニング緩衝液中に、５０μｌ／分で注入することにより行った。濃度は、２５０ｎＭ〜３２μＭであった。 Kinetic measurements were performed by injecting serial dilutions of 2-fold miniBP-3 fusion protein into PBST running buffer at 50 μl / min. The concentration was 250 nM to 32 μM.

競合結合実験を、以下のようにして行った。１５ｎＭ〜１００μＭのｂｐ１５ペプチドおよび２０ｎＭのＩＧＦＢＰ−３を、１時間室温でインキュベートし、その後、ＰＢＳＴ中に、固定化したビオチン化ＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩ上を、２０μｌ／分で注入した。平衡結合データを、ＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍ^ＴＭソフトウェアでプロットし、そして一部位競合結合モデルにあてはめた。 Competitive binding experiments were performed as follows. 15 nM-100 μM bp15 peptide and 20 nM IGFBP-3 were incubated for 1 hour at room temperature and then injected at 20 μl / min onto immobilized biotinylated IGF-I and IGF-II in PBST. Equilibrium binding data was plotted with GraphPadPrism ^™ software and fitted to a partial competition binding model.

（結果）
野生型ＩＧＦＢＰ−３およびミニＢＰ−３融合タンパク質を、ＢＩＡｃｏｒｅ^ＴＭの器機を用いた反応速度分析のために提示し、そしてＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩの結合親和性を試験した。この結果を、野生型ＩＧＦＢＰ−３については表Ｉに、そしてミニＢＰ−３融合タンパク質については表ＩＩに示す。 (result)
Wild type IGFBP-3 and miniBP-3 fusion proteins were presented for kinetic analysis using a BIAcore ^™ instrument and the binding affinity of IGF-I and IGF-II was tested. The results are shown in Table I for wild type IGFBP-3 and in Table II for the miniBP-3 fusion protein.

表Ｉの結果（図３および図４もまた参照のこと）は、ＩＧＦＢＰ−３がＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩに対して高い親和性を有し、これらが文献中の他の測定値に有利に匹敵することを示す。表Ｉと比較した場合、表ＩＩの結果（図５および図６もまた参照のこと）は、ミニＢＰ−３融合タンパク質が、野生型ＩＧＦＢＰ−３と比較してＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩに対して、親和性が低いことを示す。任意の一つの理論に限定されることなく、これが主としてオフレート（ｏｆｆ−ｒａｔｅ）の増加に起因すると考えられている。ＩＧＦＢＰ−３の他のフラグメントに関する研究は、表ＩＩＩに示されるような同様の知見を示す。

The results in Table I (see also FIGS. 3 and 4) show that IGFBP-3 has a high affinity for IGF-I and IGF-II, which favors other measurements in the literature. Is comparable to When compared to Table I, the results in Table II (see also FIG. 5 and FIG. 6) show that the miniBP-3 fusion protein is IGF-I and IGF-II compared to wild-type IGFBP-3. In contrast, the affinity is low. Without being limited to any one theory, it is believed that this is mainly due to an increase in off-rate. Studies on other fragments of IGFBP-3 show similar findings as shown in Table III.

（実施例２ミニＢＰ−３融合体へのペプチドｂｐ１５の結合）
ペプチドｂｐ１５（ＳＥＥＶＣＷＰＶＡＥＷＹＬＣＮ）（配列番号１１）を、ファージディスプレイにより同定した（Ｌｏｗｍａｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１９９８、前出）。実施例Ｉに記載されるように、ＢＩＡｃｏｒｅ^ＴＭ分析により決定される場合、ｂｐ１５は、ＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩと、ＩＧＦＢＰ−３に対する結合について競合する。従って、ｂｐ１５がミニＢＰ−３融合体に結合するかを調べるために、ｂｐ１５を試験した。図７および図８（それぞれ、ｂｐ１５とＩＧＦＢＰ−３の競合的結合データおよびｂｐ１５とミニＢＰ−３融合体の競合的結合データに関する）を比較のこと。

(Example 2 Binding of peptide bp15 to miniBP-3 fusion)
Peptide bp15 (SEEVCPWPVAEWLCN) (SEQ ID NO: 11) was identified by phage display (Lowman et al., Biochemistry, 1998, supra). As described in Example I, bp15 competes with IGF-I and IGF-II for binding to IGFBP-3 as determined by BIAcore ^™ analysis. Therefore, bp15 was tested to see if it binds to the miniBP-3 fusion. Compare FIG. 7 and FIG. 8 (for competitive binding data for bp15 and IGFBP-3 and competitive binding data for bp15 and miniBP-3 fusions, respectively).

ペプチドｂｐ１５は、ミニＢＰ融合を結合するが、野生型ＩＧＦＢＰ−３と比較すると、親和性が低減していることがわかり得る。正確な親和性は、飽和の欠如のために、決定されないかもしれない。 Peptide bp15 binds the miniBP fusion, but it can be seen that the affinity is reduced compared to wild type IGFBP-3. The exact affinity may not be determined due to lack of saturation.

（考察）
上記ミニＢＰ−３融合体は、ＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩに対して結合親和性を有する。この親和性は、他のＩＧＦＢＰ−３のＮ末端フラグメントの親和性に比して低減している。それにもかかわらず、上記ミニＢＰ−３融合体は、少なくとも一部のｂｐ１５ペプチド結合部位を含む。ＩＧＦＢＰ−３のＮ−末端フラグメントはまた、ＩＧＦＢＰ−３のＩＧＦ−非依存性作用と関連している。例えば、Ａｎｇｅｌｌｏｚ−Ｎｉｃｏｕｄら、ＧｒｏｗｔｈＨｏｒｍｏｎｅ＆ＩＧＦＲｅｓｅａｒｃｈ、８：７１−７５（１９９０）；Ｌａｌｏｕら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，１３７（８）：３２０６−３２１２（１９９６）；Ｙａｍａｎａｋａら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，１４０（３）：１３１９−１３２８（１９９９）；Ｍａｉｌｅら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，１４０（９）：４０４０−４０４５（１９９９）；Ｓａｌａｈｉｆａｒら、ＧｒｏｗｔｈＨｏｒｍｏｎｅ＆ＩＧＦＲｅｓｅａｒｃｈ，１０：３６７−３７７（２０００）；およびＢｅｒｎａｒｄら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．，２９３：５５−６０（２００２）を参照のこと。 (Discussion)
The miniBP-3 fusion has binding affinity for IGF-I and IGF-II. This affinity is reduced compared to the affinity of other IGFBP-3 N-terminal fragments. Nevertheless, the miniBP-3 fusion contains at least a partial bp15 peptide binding site. The N-terminal fragment of IGFBP-3 is also associated with the IGF-independent action of IGFBP-3. See, eg, Angeloz-Nicoud et al., Growth Hormone & IGF Research, 8: 71-75 (1990); Lalou et al., Endocrinology, 137 (8): 3206-3212 (1996); Yamanaka et al., Endocrinolo 13: -1328 (1999); Maile et al., Endocrinology, 140 (9): 4040-4045 (1999); Salahifar et al., Growth Hormone & IGF Research, 10: 367-377 (2000); and Bernard et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 293: 55-60 (2002).

ミニＢＰ−３またはＩＧＦＢＰ−３フラグメントを含む融合タンパク質を用いる細胞ベースのアッセイは、これらのＩＧＦ非依存性の事象を検出するために開発され得る。従って、Ｇｉｌｌら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：２５６０２−２５６０７（１９９７）およびＦｏｗｌｅｒら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，８８：４４８−４５３（２０００）により実行された実験において、乳癌細胞は、ＩＧＦＢＰ−３を用いて２４時間処理され、その後、パクリタキセル（およびＩＧＦＢＰ−３）を添加した。ＩＧＦＢＰ−３のみを用いた細胞の処理では、アポトーシスを誘導するのに十分ではないが、ＩＧＦＢＰ−３で前処理を行うと、パクリタキセル処理により誘導されるアポトーシスが増強される。ミニＢＰ−３融合タンパク質、ＩＧＦ−ＩもしくはＩＧＦ−ＩＩおよびこれらの融合体タンパク質に結合するＩＧＦＢＰ−３のフラグメントは、これらが細胞死の増強の原因である活性を含む場合、このアッセイにおいて、野生型ＩＧＦＢＰ−３に代わって有用であると予想されている。この融合タンパク質またはフラグメントを使用する利点は、これらが上に述べられたようなインタクトなＩＧＦＢＰ−３に比べて、大量に作製しやすいことにある。 Cell-based assays using fusion proteins comprising miniBP-3 or IGFBP-3 fragments can be developed to detect these IGF-independent events. Thus, Gill et al. Biol. Chem. 272: 25602-25607 (1997) and Fowler et al., Int. J. et al. In an experiment performed by Cancer, 88: 448-453 (2000), breast cancer cells were treated with IGFBP-3 for 24 hours, after which paclitaxel (and IGFBP-3) was added. Treatment of cells with IGFBP-3 alone is not sufficient to induce apoptosis, but pretreatment with IGFBP-3 enhances apoptosis induced by paclitaxel treatment. A fragment of IGFBP-3 that binds to the miniBP-3 fusion protein, IGF-I or IGF-II, and these fusion proteins, if they contain activity responsible for enhanced cell death, It is expected to be useful in place of type IGFBP-3. The advantage of using this fusion protein or fragment is that they are easier to make in large quantities compared to intact IGFBP-3 as described above.

これらのアポトーシスアッセイに加えて、細胞ベースのアッセイが、ＩＧＦ依存性ＫＩＲＡアッセイおよび放射標識されたＩＧＦ結合阻害のために使用され得る。なぜなら、野生型のＩＧＦＢＰ−３は、任意の一つの理論に限定されることはないが、恐らくは、その固有のレセプターに対する結合のためにいくつかの細胞上の結合を阻害しない。例示的な細胞ベースのＩＧＦ−１ＫＩＲＡアッセイにおいて、ヒト１型ＩＧＦ−１レセプターの活性化を測定するためのＫＩＲＡは、ヒトＭＣＦ−７細胞を用いて行われる。細胞を、一晩９６ウェルプレート中で、培地（５０：５０のＦ１２／ＤＭＥＭ、Ｇｉｂｃｏ）を用いて培養（ｇｒｏｗ）する。上清を、デカントし、そしてコントロール（野生型ＩＧＦＢＰ−１もしくは野生型ＩＧＦＢＰ−３で前培養した２ｎＭのＩＧＦ−１）または実験サンプル（３０分間２ｎＭのＩＧＦ−１で前培養したミニＢＰ−３を含む融合タンパク質）のいずれかを含む刺激培地（ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎｍｅｄｉａ）（２５ｍＭのＨＥＰＥＳおよび２．０％のＢＳＡを含有する５０：５０のＦ１２／ＤＭＥＭ）が添加される。１５分の刺激の後、この細胞を溶解し、そしてイムノソルベントプレートに一晩被覆したポリクローナル抗ＩＧＦ−１Ｒ（３Ｂ７；ＳａｎｔａＣｒｕｚＢｉｏｔｅｃｈ）を加えた。検出ＥＬＩＳＡを行い、そしてＫＩＲＡの結果は、野生型ＩＧＦＢＰ−３の阻害とほぼ同程度の、ミニＢＰ−３を含む融合タンパク質の阻害、またはＩＧＦ−Ｉレセプター結合よりも恐らく大きな阻害を示すことが予想され、そしてこの阻害は、ミニＢＰ−３フラグメントがファージディスプレイもしくは当業者に公知の他の手段によりアフィニティーマチュレーションされる場合、改善される可能性がある。 In addition to these apoptosis assays, cell-based assays can be used for IGF-dependent KIRA assays and radiolabeled IGF binding inhibition. Because wild-type IGFBP-3 is not limited to any one theory, but probably does not inhibit binding on some cells due to binding to its native receptor. In an exemplary cell-based IGF-1 KIRA assay, KIRA to measure human type 1 IGF-1 receptor activation is performed using human MCF-7 cells. Cells are grown overnight in 96 well plates with medium (50:50 F12 / DMEM, Gibco). The supernatant was decanted and control (2 nM IGF-1 pre-cultured with wild-type IGFBP-1 or wild-type IGFBP-3) or experimental sample (mini-BP-3 pre-cultured with 2 nM IGF-1 for 30 minutes) Stimulation media (50:50 F12 / DMEM containing 25 mM HEPES and 2.0% BSA) is added. After 15 minutes of stimulation, the cells were lysed and an immunosorbent plate coated overnight with polyclonal anti-IGF-1R (3B7; Santa Cruz Biotech). A detection ELISA was performed and the KIRA results show inhibition of fusion protein containing miniBP-3, or perhaps greater inhibition than IGF-I receptor binding, to approximately the same extent as inhibition of wild-type IGFBP-3. As expected, this inhibition may be improved if the miniBP-3 fragment is affinity matured by phage display or other means known to those skilled in the art.

本発明は、特定の方法および材料を参照することにより、本明細書中でやむを得ず考察される。これらの特定の方法および材料の考察が、本発明の範囲を限定するものとは決して解釈されず、これは、本発明の目的を達成するのに適した、いずれかおよびすべての代替の物質および方法に拡張することが理解されるべきである。 The present invention is inevitably discussed herein by reference to specific methods and materials. These discussions of specific methods and materials are in no way to be construed as limiting the scope of the invention, which may be any and all alternative materials and materials suitable to achieve the objectives of the invention It should be understood that the method extends.

図１は、ミニＢＰ−３融合タンパク質の概略図を示す。これは、配列番号７（これは、カスパーゼ３切断部位（配列番号２）を含み、これには下線が引かれている）を有する切断可能なリンカーを用いた、Ｚドメイン（配列番号１０）のミニＢＰ−３（ネイティブ配列ヒトＩＧＦＢＰ−３の残基４７−残基９９（配列番号１））への融合体である。FIG. 1 shows a schematic diagram of a miniBP-3 fusion protein. This consists of the Z domain (SEQ ID NO: 10) with a cleavable linker having SEQ ID NO: 7 (which contains the caspase 3 cleavage site (SEQ ID NO: 2), which is underlined). Fusion to miniBP-3 (residue 47-residue 99 (SEQ ID NO: 1) of native sequence human IGFBP-3). 図２は、ミニＢＰ−３融合タンパク質および切断されたタンパク質ミニＢＰ−３の、種々のクロマトグラフィーの画分のクマシーブルー染色を用いた、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。FIG. 2 shows an SDS-PAGE analysis of the miniBP-3 fusion protein and the cleaved protein miniBP-3 using Coomassie blue staining of various chromatographic fractions. 図３は、固定化されたネイティブ配列ヒトＩＧＦＢＰ−３へのネイティブ配列ヒトＩＧＦ−Ｉ結合のバイオセンサー分析を示す。FIG. 3 shows a biosensor analysis of native sequence human IGF-I binding to immobilized native sequence human IGFBP-3. 図４は、固定化されたネイティブ配列ヒトＩＧＦＢＰ−３へのネイティブ配列ヒトＩＧＦ−ＩＩ結合のバイオセンサー分析を示す。FIG. 4 shows biosensor analysis of native sequence human IGF-II binding to immobilized native sequence human IGFBP-3. 図５は、固定化されたミニＢＰ−３融合タンパク質へのネイティブ配列ヒトＩＧＦ−Ｉ結合の分析を示す。FIG. 5 shows the analysis of native sequence human IGF-I binding to immobilized miniBP-3 fusion protein. 図６は、固定化されたミニＢＰ−３融合タンパク質へのネイティブ配列ヒトＩＧＦ−ＩＩ結合の分析を示す。FIG. 6 shows the analysis of native sequence human IGF-II binding to immobilized miniBP-3 fusion protein. 図７は、ＢＩＡｃｏｒｅ^ＴＭ分析機で行われたペプチドｂｐ１５（ＳＥＥＶＣＷＰＶＡＥＷＹＬＣＮ）（配列番号１１）の競合実験の結果を示す。全部で１５ｎＭ〜１００μＭのｂｐ１５ペプチドおよび２０ｎＭのネイティブ配列ヒトＩＧＦＢＰ−３を、１時間室温でインキュベートし、その後、固定化されたビオチン化ネイティブ配列ヒトＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩ上に注入した。FIG. 7 shows the results of a competition experiment of peptide bp15 (SEEVCPWPAEWYLCN) (SEQ ID NO: 11) performed on a BIAcore ^™ analyzer. A total of 15 nM-100 μM bp15 peptide and 20 nM native sequence human IGFBP-3 were incubated for 1 hour at room temperature and then injected onto immobilized biotinylated native sequence human IGF-I and IGF-II. 図８は、ＢＩＡｃｏｒｅ^ＴＭ分析機で行われたペプチドｂｐ１５（配列番号１１）の競合実験の結果を示す。全部で１．１７μＭ〜３００μＭのｂｐ１５ペプチドおよび１μＭのミニＢＰ−３融合タンパク質を、１時間室温でインキュベートし、その後、固定化されたビオチン化ネイティブ配列ヒトＩＧＦ−Ｉ上に注入した。FIG. 8 shows the results of a competition experiment of peptide bp15 (SEQ ID NO: 11) performed on a BIAcore ^™ analyzer. A total of 1.17 μM to 300 μM bp15 peptide and 1 μM miniBP-3 fusion protein were incubated for 1 hour at room temperature and then injected onto immobilized biotinylated native sequence human IGF-I.

Claims

融合タンパク質であって、該融合タンパク質は、配列番号１０に連結されている、ネイティブ配列ヒトＩＧＦＢＰ−３（配列番号１）の残基４７〜残基９９からなる、インスリン様増殖因子結合タンパク質３（ＩＧＦＢＰ−３）のフラグメントを含む、融合タンパク質。 A fusion protein comprising an insulin-like growth factor binding protein 3 consisting of residues 47 to 99 of native sequence human IGFBP-3 (SEQ ID NO: 1) linked to SEQ ID NO: 10 A fusion protein comprising a fragment of IGFBP-3).

請求項１に記載の融合タンパク質であって、ファージ上にあらわにされた、融合タンパク質。 The fusion protein of claim 1, which is revealed on a phage.

請求項１に記載の融合タンパク質であって、ここで、前記フラグメントは、切断可能な連結ペプチドを介して配列番号１０に連結されている、融合タンパク質。 2. The fusion protein of claim 1, wherein the fragment is linked to SEQ ID NO: 10 via a cleavable linking peptide.

請求項３に記載の融合タンパク質であって、ここで、前記連結ペプチドが、配列ＤＬＶＤ（配列番号２）、ＤＥＭＤ（配列番号３）、ＤＡＶＤ（配列番号４）、ＥＦＧＧＤＤＤＫ（配列番号５）、ＥＦＧＧＬＶＰＲＧＳ（配列番号６）、ＥＦＧＧＤＬＶＤ（配列番号７）、ＥＦＧＧＤＥＭＤ（配列番号８）またはＥＦＧＧＤＡＶＤ（配列番号９）を含む、融合タンパク質。 4. The fusion protein of claim 3, wherein the connecting peptide comprises the sequences DLVD (SEQ ID NO: 2), DEMD (SEQ ID NO: 3), DAVD (SEQ ID NO: 4), EFGGDDDK (SEQ ID NO: 5), EFGGLVPRGS. A fusion protein comprising (SEQ ID NO: 6), EFGGDLVD (SEQ ID NO: 7), EFGGDEMD (SEQ ID NO: 8) or EFGGDAVD (SEQ ID NO: 9).

請求項３に記載の融合タンパク質であって、ここで、前記連結ペプチドが、ＥＦＧＧＤＬＶＤ（配列番号７）である、融合タンパク質。 The fusion protein according to claim 3, wherein the connecting peptide is EFGGDLVD (SEQ ID NO: 7).

請求項３に記載の融合タンパク質であって、ここで、前記配列番号１０のＮ末端が、配列ＡＳＡである、融合タンパク質。 4. The fusion protein of claim 3, wherein the N-terminus of SEQ ID NO: 10 is the sequence ASA.

請求項１に記載の融合タンパク質であって、ここで、前記フラグメントが、アフィニティーマチュレーションされた、融合タンパク質。 2. The fusion protein of claim 1, wherein the fragment is affinity maturated.

前記請求項１に記載の融合タンパク質を、キャリア中に含有する、組成物。 A composition comprising the fusion protein according to claim 1 in a carrier.

前記請求項１に記載の融合タンパク質をコードする、核酸分子。 A nucleic acid molecule encoding the fusion protein of claim 1.

前記請求項９に記載の核酸分子を含む、ベクター。 A vector comprising the nucleic acid molecule of claim 9.

前記請求項９に記載の核酸分子を含む、宿主細胞。 A host cell comprising the nucleic acid molecule of claim 9.

ＩＧＦＢＰ−３融合タンパク質を生み出す方法であって、該方法は、前記請求項１１の宿主細胞を、該融合タンパク質を発現させるのに適切な条件下で培養する工程、および該融合タンパク質を、該宿主細胞培養物から回収する工程を包含する、方法。 A method of producing an IGFBP-3 fusion protein comprising culturing the host cell of claim 11 under conditions suitable for expressing the fusion protein, and the fusion protein comprising the host Recovering from the cell culture.

請求項１２に記載の方法であって、ここで、前記宿主細胞が、原核細胞である、方法。 13. The method of claim 12, wherein the host cell is a prokaryotic cell.

請求項１２に記載の方法であって、ここで、前記宿主細胞が、細菌である、方法。 13. The method of claim 12, wherein the host cell is a bacterium.

請求項１２に記載の方法であって、ここで、前記宿主細胞が、Ｅ．ｃｏｌｉである、方法。 13. The method of claim 12, wherein the host cell is E. coli. a method.

ネイティブ配列ヒトＩＧＦＢＰ−３の生物学的活性、ネイティブ配列ヒトＩＧＦ−Ｉの生物学的活性、もしくはネイティブ配列ヒトＩＧＦ−ＩＩの生物学的活性、または該ＩＧＦ−Ｉもしくは該ＩＧＦ−ＩＩのアゴニストの生物学的活性を細胞ベースのアッセイにおいて決定し、そしてネイティブ配列ヒトＩＧＦＢＰ−３、ネイティブ配列ヒトＩＧＦ−Ｉ、またはネイティブ配列ヒトＩＧＦ−ＩＩ、または該ＩＧＦ−ＩもしくはＩＧＦ−ＩＩのアゴニストに寄与し得る生物学的活性が観察されるかを決定するための方法であって、該アッセイは、ネイティブ配列ヒトＩＧＦＢＰ−３ではなく、ＩＧＦ−ＩもしくはＩＧＦ−ＩＩに結合するＩＧＦＢＰ−３フラグメントに連結したペプチドを含む融合タンパク質と細胞とを接触させる工程を包含する、方法。 Of biological activity of native sequence human IGFBP-3, biological activity of native sequence human IGF-I, or biological activity of native sequence human IGF-II, or agonist of said IGF-I or of said IGF-II Biological activity is determined in a cell-based assay and contributes to native sequence human IGFBP-3, native sequence human IGF-I, or native sequence human IGF-II, or an agonist of said IGF-I or IGF-II A method for determining whether the resulting biological activity is observed, wherein the assay was linked to an IGFBP-3 fragment that binds to IGF-I or IGF-II, but not to native sequence human IGFBP-3. Includes the step of contacting a cell with a fusion protein containing a peptide That, way.

請求項１６に記載の方法であって、ここで、前記融合タンパク質のペプチドが、配列番号１０である、方法。 17. The method of claim 16, wherein the peptide of the fusion protein is SEQ ID NO: 10.

請求項１６に記載の方法であって、ここで、前記ＩＧＦＢＰ−３フラグメントが、ネイティブ配列ヒトＩＧＦＢＰ−３（配列番号１）の残基４７〜残基９９のフラグメントである、方法。 17. The method of claim 16, wherein the IGFBP-3 fragment is a fragment from residue 47 to residue 99 of native sequence human IGFBP-3 (SEQ ID NO: 1).

請求項１６に記載の方法であって、ここで、前記生物学的活性が、ＩＧＦ−Ｉとは無関係なネイティブ配列ヒトＩＧＦＢＰ−３のアポトーシスである、方法。 17. The method of claim 16, wherein the biological activity is apoptosis of native sequence human IGFBP-3 independent of IGF-I.

請求項１６に記載の方法であって、ここで、前記方法は、ＩＧＦ−依存的なＫＩＲＡリン酸化方法である、方法。 17. The method of claim 16, wherein the method is an IGF-dependent KIRA phosphorylation method.

請求項１６に記載の方法であって、ここで、前記生物学的活性が、放射標識したＩＧＦ−ＩまたはＩＧＦ−ＩＩの前記細胞への結合の阻害である、方法。 17. The method of claim 16, wherein the biological activity is inhibition of radiolabeled IGF-I or IGF-II binding to the cell.

アポトーシスの増強を決定するための方法であって、該方法は、乳癌細胞をアポトーシス因子で処理する前に少なくとも約２４時間、ＩＧＦ−ＩまたはＩＧＦ−ＩＩに結合する、ＩＧＦＢＰ−３フラグメントまたはその融合タンパク質、およびネイティブ配列ヒトＩＧＦＢＰ−３もしくは該ＩＧＦＢＰ−３フラグメントもしくは融合タンパク質で乳癌細胞を前処理する工程、および該前処理または処理が、該アポトーシス因子を用いた処理により誘導されるアポトーシスを増強するか、あるいは該量の前処理または処理がその目的に対して有効であるかを決定する工程、を包含する、方法。 A method for determining enhancement of apoptosis comprising binding to IGFBP-3 fragment or fusion thereof that binds to IGF-I or IGF-II for at least about 24 hours prior to treating breast cancer cells with an apoptosis factor. Pretreating breast cancer cells with a protein and native sequence human IGFBP-3 or the IGFBP-3 fragment or fusion protein, and the pretreatment or treatment enhances apoptosis induced by treatment with the apoptosis factor Or determining whether the amount of pretreatment or treatment is effective for that purpose.

請求項２２に記載の方法であって、ここで、前記アポトーシス因子が、デキソルビシンまたはパクリタキセルである、方法。 24. The method of claim 22, wherein the apoptotic factor is dexorubicin or paclitaxel.