DE19757250A1 - Insulin-like growth factor binding protein and its use - Google Patents

Insulin-like growth factor binding protein and its use

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DE19757250A1
DE19757250A1 DE19757250A DE19757250A DE19757250A1 DE 19757250 A1 DE19757250 A1 DE 19757250A1 DE 19757250 A DE19757250 A DE 19757250A DE 19757250 A DE19757250 A DE 19757250A DE 19757250 A1 DE19757250 A1 DE 19757250A1
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Wolf-Georg Prof Dr Forssmann
Ludker Dr Staendker
Hossein Dr Mostafavi
Maik Dr Obendorf
Lothar Dr Kling
Hans-Georg Dr Opitz
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FORSSMANN WOLF GEORG PROF DR
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Abstract

The invention relates to peptides which are characterized in that the amino acid sequence parts thereof correspond to the amino acid sequence of insulin-like growth factor binding protein. The invention also relates to cyclic, glycosylated, phosphorylated, acetylated, amidated and/or sulfatized derivatives.

Description

Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind Peptide mit zellproliferativen und zellprotektiven Eigenschaften, Kom­ plexe der Peptide mit humanem Insulin-like growth factor I und II sowie die damit in Verbindung stehenden Nucleinsäuren, Antisensenucleotide, Antikörper und Inhibitoren.The present invention relates to peptides cell proliferative and cell protective properties, com plexes of the peptides with human insulin-like growth factor I and II and the associated nucleic acids, Antisense nucleotides, antibodies and inhibitors.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind Peptide mit der Aminosäuresequenz der Formel
The present invention relates to peptides with the amino acid sequence of the formula

R1-C-X1-PNC-X2-QC-X3-CWCV-X4-C-R2 (IBP)
R 1 -CX 1 -PNC-X 2 -QC-X 3 -CWCV-X 4 -CR 2 (IBP)

worin
R1 NH2, eine Aminosäure oder ein Peptid mit einer Amino­ säuresequenz umfassend bis zu 41 Aminosäuren, X1 ein Peptid mit einer Aminosäuresequenz umfassend 24 bis 31 Aminosäuren, X2 ein Peptid mit einer Aminosäuresequenz umfassend 9 Amino­ säuren, X3 ein Peptid mit einer Aminosäuresequenz umfassend 10 Aminosäuren, X4 ein Peptid mit einer Aminosäuresequenz um­ fassend 18 bis 24 Aminosäuren, R2 COOH, CONH2 oder ein Peptid mit bis zu 12 Aminosäuren darstellt und cyclische, glycosy­ lierte, phosphorylierte, acetylierte, amidierte, sulfatierte Derivate sowie Fragmente mit der physiologischen Fähigkeit des IBP.wherein
R 1 NH 2 , an amino acid or a peptide with an amino acid sequence comprising up to 41 amino acids, X 1 a peptide with an amino acid sequence comprising 24 to 31 amino acids, X 2 a peptide with an amino acid sequence comprising 9 amino acids, X 3 a peptide with an amino acid sequence comprising 10 amino acids, X 4 represents a peptide with an amino acid sequence comprising 18 to 24 amino acids, R 2 COOH, CONH 2 or a peptide with up to 12 amino acids and cyclic, glycosylated, phosphorylated, acetylated, amidated, sulfated derivatives and Fragments with the physiological ability of the IBP.

Das Peptid weist zellproliferative und zellprotektive Eigen­ schaften auf.The peptide has cell proliferative and cell protective properties create up.

Diese Peptide werden als Insulin-like growth factor binding protein (IBP) bezeichnet.These peptides are called insulin-like growth factor binding protein (IBP).

Die erfindungsgemäßen Peptide können Disulfidbrücken auf­ weisen, so daß sie der allgemeinen Formel
The peptides according to the invention can have disulfide bridges so that they have the general formula

entsprechen.correspond.

In einer bevorzugten Ausführungsform weisen die Peptide an einer oder mehrerer der folgenden Positionen der Aminosäure­ sequenz ein Glycin auf. X2 an Position 4, X3 an Position 9, X4 an Position 4 oder 5 und/oder X4 an Position 9 oder 10.In a preferred embodiment, the peptides have a glycine at one or more of the following positions in the amino acid sequence. X 2 at position 4, X 3 at position 9, X 4 at position 4 or 5 and / or X 4 at position 9 or 10.

Es ist weiter bevorzugt, daß X1 an der Position 8 L oder V ist und/oder X1 an der Position 11 L oder I ist und/oder X2 an der Position 1 D oder N ist und/oder X2 an der Position 9 K oder R ist und/oder X3 an der Position 3 S oder A ist und/oder an der Position 8 R oder A ist.It is further preferred that X 1 at position 8 is L or V and / or X 1 at position 11 is L or I and / or X 2 at position 1 is D or N and / or X 2 at the position 9 is K or R and / or X 3 at position 3 is S or A and / or at position 8 is R or A.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform wird R1 aus­ gewählt aus
APSEEDHSILWDAISTYDGSKALHVTNIKKWKEP,
GGKHHLGLEEPKKLRPPPARTP
GKGGKHHLGLEEPKKLRPPPARTP,
GHAKDSQRYKVDYESQSTDTQNFSSESKRETEYGP,
KVNGAPREDARPVPQGS,
LTQSKFVGGAENTAHPRIISAPEMRQESEQGP,
PQAGTARPQDVNRRDQQRNPGTSTTPSQPNSAGVQDTEMGP und/oder
X1 ausgewählt aus
RIELYRVVESLAKAQETSGEEISKFYL,
QQELDQVLERISTMRLPDERGPLEHLYSLHI,
RREMEDTLNHLKFLNVLSPRGVHI,
QSELHRALERLAASQSRTHEDLYIIPI,
RRHMEASLQELKASPRMVPRAVYL,
RRHLDSVLQQLQTEVYRGAQTLYV,
X2 ausgewählt aus
NKNGFYHSR,
DKHGLYNLK,
DKKGFYKKK,
DRNGNFHPK,
DRKGFYKRK,
DHRGFYRKR und/oder
X3 ausgewählt aus
ETSMDGEAGL,
KMSLNGQRGE,
RPSKGRKRGF,
HPALDGQRGK,
KPSRGRKRGI,
RSSQGQRRGP und/oder
x4 ausgewählt aus
YPWNGKRIPGSPEIRGDPN,
NPNTGKLIQGAPTIRGDPE,
DKYGQPLPGYTTKGKEDVH,
DRKTGVKLPGGLEPKGELD,
DKYGMKLPGMEYVDGDFQ,
DRMGKSLPGSPDGNGSSS und/oder
R2 ausgewählt aus
QIYFNVQN,
HLFYNEQQEARGVHTQRMQ,
HLFYNEQQE,
YSMQSK,
HQLADSFRE,
HTFDSSNVE,
PTGSSG.In a particularly preferred embodiment, R 1 is selected from
APSEEDHSILWDAISTYDGSKALHVTNIKKWKEP,
GGKHHLGLEEPKKLRPPPARTP
GKGGKHHLGLEEPKKLRPPPARTP,
GHAKDSQRYKVDYESQSTDTQNFSSESKRETEYGP,
KVNGAPREDARPVPQGS,
LTQSKFVGGAENTAHPRIISAPEMRQESEQGP,
PQAGTARPQDVNRRDQQRNPGTSTTPSQPNSAGVQDTEMGP and / or
X 1 selected from
RIELYRVVESLAKAQETSGEEISKFYL,
QQELDQVLERISTMRLPDERGPLEHLYSLHI,
RREMEDTLNHLKFLNVLSPRGVHI,
QSELHRALERLAASQSRTHEDLYIIPI,
RRHMEASLQELKASPRMVPRAVYL,
RRHLDSVLQQLQTEVYRGAQTLYV,
X 2 selected from
NKNGFYHSR,
DKHGLYNLK,
DKKGFYKKK,
DRNGNFHPK,
DRKGFYKRK,
DHRGFYRKR and / or
X 3 selected from
ETSMDGEAGL,
KMSLNGQRGE,
RPSKGRKRGF,
HPALDGQRGK,
KPSRGRKRGI,
RSSQGQRRGP and / or
x 4 selected from
YPWNGKRIPGSPEIRGDPN,
NPNTGKLIQGAPTIRGDPE,
DKYGQPLPGYTTKGKEDVH,
DRKTGVKLPGGLEPKGELD,
DKYGMKLPGMEYVDGDFQ,
DRMGKSLPGSPDGNGSSS and / or
R 2 selected from
QIYFNVQN,
HLFYNEQQEARGVHTQRMQ,
HLFYNEQQE,
YSMQSK,
HQLADSFRE,
HTFDSSNVE,
PTGSSG.

Die erfindungsgemäßen Peptide lassen sich durch Aufreinigung aus humanem Blutfiltrat oder Urin, durch Festphasenpeptid­ synthese oder durch Expression in rekombinanten Mikro­ organismen erhalten.The peptides according to the invention can be purified from human blood filtrate or urine, by solid phase peptide synthesis or by expression in recombinant micro preserve organisms.

Gegenstand der Erfindung sind weiterhin die Komplexe der erfindungsgemäßen Peptide mit humanem Insulin-like growth factor-I und/oder humanem Insulin-like growth factor-II sowie dessen physiologisch aktiven Fragmenten und/oder Derivaten, insbesondere amidierte, acetylierte, sulfatierte, phosphory­ lierte und/oder glykosylierte Derivate.The invention further relates to the complexes of Peptides according to the invention with human insulin-like growth factor-I and / or human insulin-like growth factor-II as well its physiologically active fragments and / or derivatives, in particular amidated, acetylated, sulfated, phosphory lated and / or glycosylated derivatives.

Gegenstand der Erfindung sind darüber hinaus Nucleinsäuren, die für die erfindungsgemäßen Peptide kodieren, Antisense­ nucleotide, die unter stringenten Bedingungen an eine Nucleinsäure binden, die für das erfindungsgemäße Peptid kodiert, Antikörper, die an die erfindungsgemäßen Peptide binden, Inhibitoren, die die biologische Aktivität der erfindungsgemäßen Peptiden hemmen, Inhibitoren, die die Expression von IBP hemmen.The invention also relates to nucleic acids, which code for the peptides according to the invention, antisense nucleotides attached to a Binding nucleic acid for the peptide of the invention encodes antibodies to the peptides of the invention bind inhibitors that inhibit the biological activity of the Inhibit peptides according to the invention, inhibitors that the Inhibit expression of IBP.

Die erfindungsgemäßen Peptide, Komplexe, Nucleinsäuren, Antisensenucleotide, Antikörper und Inhibitoren eignen sich insbesondere zur Herstellung eines Arzneimittels zur Be­ handlung der Über- oder Unterexpression von IBP, zur Be­ handlung von Muskelschwund, Osteoporose, Diabetes, amyloidaler lateraler Sklerose, peripheren und zentralen Neuropathien, entzündlichen Prozessen, gestörten Ent­ zündungsreaktionen, Tumorerkrankungen, entzündlichen und neo­ plastischen Erkrankungen, Wachstumsstörung, Erkrankung der Muskulatur, Erkrankung des Knochenapparates und/oder zur Wund- und Knochenheilung.The peptides, complexes, nucleic acids according to the invention, Antisense nucleotides, antibodies and inhibitors are suitable in particular for the manufacture of a medicament for loading treatment of over- or under-expression of IBP, for loading  act of muscle wasting, osteoporosis, diabetes, amyloidal lateral sclerosis, peripheral and central Neuropathies, inflammatory processes, disturbed ent ignition reactions, tumor diseases, inflammatory and neo plastic diseases, growth disorders, disease of Muscles, disease of the bone apparatus and / or for Wound and bone healing.

Die erfindungsgemäßen Peptide und die Komplexe der Peptide mit Insulin-like growth factor weisen eine zellproliferative Aktivität auf.The peptides according to the invention and the complexes of the peptides with insulin-like growth factor exhibit a cell proliferative Activity on.

Die erfindungsgemäßen Peptide regulieren die Freisetzung des IGF-I und IGF-II aus den Komplexen an ihrem Wirkort. Die Coadministration der erfindungsgemäßen Peptide mit IGF-I oder IGF-II verlängert die biologische Halbwertzeit und damit die Verfügbarkeit der letztgenannten. Die durch Injektion von freiem IGF-I oder IGF-II induzierte Hypoglykämie wird durch die Coadministration der erfindungsgemäßen Peptide ver­ hindert.The peptides according to the invention regulate the release of the IGF-I and IGF-II from the complexes at their site of action. The Co-administration of the peptides according to the invention with IGF-I or IGF-II extends the biological half-life and thus the Availability of the latter. The by injection of Free IGF-I or IGF-II induced hypoglycemia is caused by the co-administration of the peptides according to the invention prevents.

Die erfindungsgemäßen Peptide haben desweiteren eine wachs­ tumsfördernde Wirkung auf Knochenzellen und führen zu einer Verstärkung oder Modulation der Wirkung von Wachstums­ hormonen.The peptides according to the invention also have a wax stimulating effect on bone cells and lead to a Enhance or modulate the effects of growth hormones.

In einer bevorzugten Ausführungsform sind die erfindungs­ gemäßen Peptide, Komplexe, Nucleinsäuren, Antisense­ nucleotide, Antikörper und Inhibitoren in einer pharma­ zeutisch üblichen Darreichungsform in einem Arzneimittel enthalten. Sie eignen sich zur oralen, intravenösen, intra­ muskulären, intracutanen, intrathekalen Anwendung oder als Aerosol zur transpulmonalen Applikation. Die Menge an zu verabreichenden Peptid beträgt 1 µg bis 1 g pro Darreichungs­ einheit pro Tag.In a preferred embodiment, the invention peptides, complexes, nucleic acids, antisense nucleotides, antibodies and inhibitors in one pharma dosage form usual in a drug contain. They are suitable for oral, intravenous, intra muscular, intracutaneous, intrathecal use or as Aerosol for transpulmonary application. The amount of too administering peptide is 1 µg to 1 g per administration unit per day.

Die erfindungsgemäßen Nucleinsäuren und/oder Antisense­ nucleotide eignen sich auch zur Herstellung eines Medikamen­ tes zur Behandlung somatischer oder nicht-somatischer Gen­ erkrankungen.The nucleic acids and / or antisense according to the invention  nucleotides are also suitable for the manufacture of a medicament for the treatment of somatic or non-somatic genes diseases.

Das erfindungsgemäße Diagnostikmittel enthält die erfindungs­ gemäßen Peptide, Komplexe, Nucleinsäuren, Antisense­ nucleotide, Antikörpern und/oder Inhibitoren.The diagnostic agent according to the invention contains the fiction peptides, complexes, nucleic acids, antisense nucleotides, antibodies and / or inhibitors.

Bevorzugterweise enthält das Diagnostikmittel poly- oder monoklonale Antikörper gegen das erfindungsgemäße Peptid, wobei die Antikörper fluoreszenz- oder radioaktiv-markiert sein können, um in den bekannten ELISA oder RIA eingesetzt werden zu können. Jedoch kann das Diagnostikmittel auch Nucleinsäuren enthalten, die in modifizierter oder markierter Form in dem Fachmann bekannten Tests wie PCR oder Finger- Printing zum Einsatz kommen.The diagnostic agent preferably contains poly- or monoclonal antibodies against the peptide according to the invention, the antibodies being fluorescence or radioactive labeled can be used in the well known ELISA or RIA to be able to. However, the diagnostic agent can also Contain nucleic acids that are modified or labeled Form in tests known to those skilled in the art, such as PCR or finger Printing are used.

Die erfindungsgemäßen Diagnostikmittel eignen sich insbe­ sondere zur Diagnose von Funktionsstörungen des Knochens, der Muskeln, des Nervensystems, der Lymphorgane, des Magen- Darm-Traktes, des Immunsystems, von Diabetes, inflammato­ rischen und neoplastischen Prozessen sowie als Marker bei Krebs.The diagnostic agents according to the invention are particularly suitable especially for the diagnosis of functional disorders of the bones, of the muscles, the nervous system, the lymph organs, the gastric Tract, immune system, diabetes, inflammato and neoplastic processes as well as a marker Cancer.

Die Aufreinigung des erfindungsgemäßen Peptids bzw. seine Komplexes wird durch die nachfolgenden Beispiele erläutert:The purification of the peptide according to the invention or its Complexes are explained by the following examples:

Beispiel 1example 1 Aufreinigung und peptidchemische Analyse des IBP-2-13Purification and peptide chemical analysis of the IBP-2-13

Die erfindungsgemäßen Peptide sind durch ein Reinigungsver­ fahren ausgehend vom humanem Hämofiltrat erhältlich. Dieses patentierte Verfahren (Forssmann, W.-G. (1988), Offenlegungs­ schrift DE 36 33 707 A1), welches für die Gewinnung von Eiweißstoffen aus Hämofiltrat entwickelt wurde, wurde in modifizierter Form auch zur Aufreinigung des Peptidkomplexes eingesetzt.The peptides according to the invention are by a cleaning ver drive starting from human hemofiltrate available. This patented process (Forssmann, W.-G. (1988), Offenlegungs document DE 36 33 707 A1), which for the extraction of Proteins from hemofiltrate was developed in modified form also for the purification of the peptide complex  used.

Hämofiltrat-Batch-ExtraktionHemofiltrate batch extraction

Hämofiltrat fällt bei der Ultrafiltration des Blutes von Nierenkranken in großen Mengen an.Hemofiltrate falls from the ultrafiltration of the blood Kidney patients in large quantities.

800 bis 1000 l Hämofiltrat werden mit HCl auf einen pH-Wert von 2,7 eingestellt und mit Wasser auf eine Leitfähigkeit von 5,5 mS/cm verdünnt und mit einer Flußrate von 3 l/min auf einen starken Kationenaustauscher aufgetragen.800 to 1000 l hemofiltrate are brought to pH with HCl set from 2.7 and with water to a conductivity diluted by 5.5 mS / cm and with a flow rate of 3 l / min applied to a strong cation exchanger.

ChromatographiebedingungenChromatography conditions

Säule: Vantage VA 250 (Amicon, Witten)
Säulenmaterial: Fractogel TSK SP 650 (M), 25 cm × 20 cm
Fluß: 3 l/min
Detektion: 280 nm, pH, Leitfähigkeit
Puffer A: Hämofiltrat pH 2,7, Leitfähigkeit 5,5 mS/cm
Puffer B: 0,5 M Ammoniumacetat
Anlage: Autopilot Chromatographiesystem, (PerSeptive Biosystems, Wiesbaden)Column: Vantage VA 250 (Amicon, Witten)
Column material: Fractogel TSK SP 650 (M), 25 cm × 20 cm
Flow: 3 l / min
Detection: 280 nm, pH, conductivity
Buffer A: Hemofiltrate pH 2.7, conductivity 5.5 mS / cm
Buffer B: 0.5 M ammonium acetate
Attachment: Autopilot Chromatography System, (PerSeptive Biosystems, Wiesbaden)

Nach Auftragung der insgesamt 1.000 l Flüssigkeit über Nacht wird mit mehreren Säulenvolumina 5 mM HCl gespült. Die Elution der gebundenen Peptide erfolgt als Batch-Elution mit 0,5 M Ammoniumacetat. Hierbei wird eine komplette Elution der Peptide über steigenden pH-Wert (6,8 bis 7,2) und steigende Leitfähigkeit (56 mS/cm) in etwa 5 l Eluat er­ reicht.After applying the total of 1,000 l of liquid overnight is rinsed with several column volumes of 5 mM HCl. The The bound peptides are eluted as a batch elution 0.5 M ammonium acetate. This is a complete elution of the peptides via increasing pH (6.8 to 7.2) and increasing conductivity (56 mS / cm) in about 5 l of eluate enough.

Erste Präparative AuftrennungFirst preparative separation

Die Ammoniumacetat-Eluate der Batch-Extraktion werden in Mengen von 5000 bis 10 000 l Hämofiltrat-Peptid vereinigt. Nach pH-Einstellung auf 2,7 wird das Peptidextrakt unter Zumischung von VE-Wasser mit einer Leitfähigkeit von 5,5 mS/cm auf den präparativen Kationenaustauscher aufgetragen.The ammonium acetate eluates of the batch extraction are in Amounts of 5000 to 10,000 liters of hemofiltrate peptide combined. After pH adjustment to 2.7, the peptide extract is under Mixing of demineralized water with a conductivity of 5.5  mS / cm applied to the preparative cation exchanger.

ChromatographiebedingungenChromatography conditions

Säule: Vantage 250 VA
Säulenmaterial: Fractogel TSK SP 650 (M), 25 cm × 20 cm
Fluß: bis zu 3 l/min während des Auftrages, 0,5 bis 1 l während der Elution
Detektion: 280 nm, pH, Leitfähigkeit
Probe: Hämofiltrat pH 2,7, Leitfähigkeit 5,5 mS/cm
Anlage: Autopilot Chromatographiesystem, (PerSeptive Biosystems, Wiesbaden).Column: Vantage 250 VA
Column material: Fractogel TSK SP 650 (M), 25 cm × 20 cm
Flow: up to 3 l / min during the application, 0.5 to 1 l during the elution
Detection: 280 nm, pH, conductivity
Sample: Hemofiltrate pH 2.7, conductivity 5.5 mS / cm
System: Autopilot chromatography system, (PerSeptive Biosystems, Wiesbaden).

Nach Auftrag des Rohextraktes über 240 min wird die Säule mit 0,01 M HCl gespült, bis die Leitfähigkeit unter 1 mS/cm ist. Die Elution erfolgt dabei in mehreren Stufen mit den im folgenden angegebenen Puffern
After applying the crude extract over 240 min, the column is rinsed with 0.01 M HCl until the conductivity is below 1 mS / cm. The elution is carried out in several stages using the buffers specified below

Die Eluate 1-7 werden als pH-Pool I-VII bezeichnet. Sie werden separat gesammelt und abschließend mit VE-Wasser gespült. Die Elution erfolgt bis zum Erreichen einer neuen Basislinie, wobei für die einzelnen pH-Pools I bis VII Elutionsvolumina von 10 bis 25 l erreicht werden.Eluates 1-7 are referred to as pH pool I-VII. she are collected separately and finally with demineralized water rinsed. Elution takes place until a new one is reached Baseline, whereby for the individual pH pools I to VII Elution volumes of 10 to 25 l can be achieved.

Zweite präparative AuftrennungSecond preparative separation

Die einzelnen pH-Pools werden zur Fraktionierung und gleich­ zeitigen Entsalzung über eine Reverse Phase Chromatographie getrennt. The individual pH pools are used for fractionation and the same early desalination using a reverse phase chromatography Cut.  

ChromatographiebedingungenChromatography conditions

Säule: FineLine 100 (Pharmacia, Freiburg)
Säulenmaterial: Source RPC, 15 µm 10 × 12,5 cm (FineLine 100)
Fluß: 150 mL/min (FineLine 100)
Detektion: 280 nm, Leitfähigkeit, pH
Puffer A: 10 mM HCl
Puffer B: 80% Acetonitril in 10 mM HCl
Gradient: 0 bis 60% Puffer B in 5 Säulenvolumen.Pillar: FineLine 100 (Pharmacia, Freiburg)
Column material: Source RPC, 15 µm 10 × 12.5 cm (FineLine 100)
Flow: 150 mL / min (FineLine 100)
Detection: 280 nm, conductivity, pH
Buffer A: 10 mM HCl
Buffer B: 80% acetonitrile in 10 mM HCl
Gradient: 0 to 60% buffer B in 5 column volumes.

Nach Auftrag der pH-Pools wird die Säule mit Puffer A ge­ spült. Während der Elution werden Fraktionen zu 200 ml gesammelt. Aliquots der Fraktionen werden im Bioassay ge­ testet. Die Fraktionen werden gefriergetrocknet und bei -20°C gelagert.After application of the pH pools, the column with buffer A is ge rinses. Fractions become 200 ml during the elution collected. Aliquots of the fractions are ge in the bioassay tests. The fractions are freeze-dried and at -20 ° C stored.

Semipräparative Reverse-Phase C18-ChromatographieSemi-preparative reverse phase C18 chromatography

Die im Assay bioaktiven Fraktionen 11 und 12 aus pH-Pool V wurden über eine semipräparative Reverse-Phase Säule aufge­ trennt. Die Fraktionen 21 bis 25 enthielten die erfindungs­ gemäße Substanz.The bioactive fractions 11 and 12 from pH pool V were set up on a semi-preparative reverse phase column separates. Fractions 21 to 25 contained the Invention appropriate substance.

ChromatographiebedingungenChromatography conditions

Säule: 4,7 cm × 30 cm Stahlsäule
Füllmaterial: Vydac RP-C18 15-20 µm, 300 Å
Puffer A: 0,1% TFA
Puffer B: 0,1% TFA, 80% Acetonitril
Gradient: 5 bis 50% B in 45 min, 50 bis 100% B in 10 min
Fluß: 42 ml/min
Detektion: 214 nm und 280 nm
Chromatographieanlage: BioCad
Fraktionen: á 1,5 min ab Start des Gradienten Column: 4.7 cm × 30 cm steel column
Filling material: Vydac RP-C18 15-20 µm, 300 Å
Buffer A: 0.1% TFA
Buffer B: 0.1% TFA, 80% acetonitrile
Gradient: 5 to 50% B in 45 min, 50 to 100% B in 10 min
Flow: 42 ml / min
Detection: 214 nm and 280 nm
Chromatography system: BioCad
Fractions: á 1.5 min from the start of the gradient

Semipräparative Reverse-Phase C18-ChromatographieSemi-preparative reverse phase C18 chromatography

Die bioaktiven Fraktionen 21 bis 25 aus der vorhergehenden Chromatographie wurden über die gleiche semipräparative Reverse Phase Säule aufgetrennt. Als Laufmittel wurde jedoch Methanol verwendet. Die Fraktion 24 enthielt die erfindungs­ gemäße Substanz.The bioactive fractions 21 to 25 from the previous one Chromatography were done using the same semi-preparative Reverse phase column separated. However, as a solvent Methanol used. Fraction 24 contained the fiction appropriate substance.

ChromatographiebedingungenChromatography conditions

Säule: 4,7 cm × 30 cm Stahlsäule
Füllmaterial: Vydac RP-C18 15-20 µm, 300 Å
Puffer A: 0,1% TFA, 20% Methanol
Puffer B: 0,1% TFA, 100% Methanol
Gradient: 0 bis 20% B in 6,5 min, 20 bis 80% B in 55 min, 80 bis 100% B in 13 min
Fluß: 30 ml/min
Detektion: 214 nm und 280 nm
Chromatographieanlage: BioCad
Fraktionen: á 1,5 min ab Start des GradientenColumn: 4.7 cm × 30 cm steel column
Filling material: Vydac RP-C18 15-20 µm, 300 Å
Buffer A: 0.1% TFA, 20% methanol
Buffer B: 0.1% TFA, 100% methanol
Gradient: 0 to 20% B in 6.5 min, 20 to 80% B in 55 min, 80 to 100% B in 13 min
Flow: 30 ml / min
Detection: 214 nm and 280 nm
Chromatography system: BioCad
Fractions: á 1.5 min from the start of the gradient

KationenaustauschchromatographieCation exchange chromatography

Die bioaktiven Fraktionen 19 und 20 aus der vorhergehenden Chromatographie wurden über eine Kationenaustauscher-Säule aufgetrennt. Die Fraktionen 45 bis 47 enthielten die er­ findungsgemäße Substanz.The bioactive fractions 19 and 20 from the previous one Chromatography were over a cation exchange column separated. Fractions 45 to 47 contained it substance according to the invention.

ChromatographiebedingungenChromatography conditions

Säule: 1 cm × 5 cm Stahlsäule
Füllmaterial: Pepkat, Biotek 5 µm, 300 Å
Puffer A: 20 mM Natriumphosphat, pH 3,0
Puffer B: 20 mM Natriumphosphat, pH 3,0, 1,5 M NaCl
Gradient: 0 bis 50% B in 50 min, 50 bis 100% B in 10 min
Fluß: 3 ml/min
Detektion: 280 nm
Chromatographieanlage: BioCad Sprint
Fraktionen: á 1,5 min ab Start des GradientenColumn: 1 cm × 5 cm steel column
Filling material: Pepkat, Biotek 5 µm, 300 Å
Buffer A: 20 mM sodium phosphate, pH 3.0
Buffer B: 20 mM sodium phosphate, pH 3.0, 1.5 M NaCl
Gradient: 0 to 50% B in 50 min, 50 to 100% B in 10 min
Flow: 3 ml / min
Detection: 280 nm
Chromatography system: BioCad Sprint
Fractions: á 1.5 min from the start of the gradient

Analytische Reverse-Phase ChromatographieAnalytical reverse phase chromatography

Die bioaktiven Fraktionen 45 bis 47 aus der vorhergehenden Chromatographie wurden sukzessive in mehreren identischen Läufen über eine Reverse Phase - Säule aufgetrennt. Die Fraktion 56 enthielt die erfindungsgemäße Substanz.The bioactive fractions 45 to 47 from the previous one Chromatography was successively carried out in several identical ones Runs separated on a reverse phase column. The Fraction 56 contained the substance according to the invention.

ChromatographiebedingungenChromatography conditions

Säule: 1 cm × 25 cm Stahlsäule
Füllmaterial: Vydac RP-C18 5 µm, 300 Å
Puffer A: 0,1% TFA
Puffer B: 0,1% TFA, 80% Acetonitril
Gradient: 5 bis 50% B in 45 min, 50 bis 100% B in 10 min
Fluß: 2 ml/min
Detektion: 220 nm
Chromatographieanlage: Kontron
Fraktionen: á 1 min ab Start des GradientenColumn: 1 cm × 25 cm steel column
Filling material: Vydac RP-C18 5 µm, 300 Å
Buffer A: 0.1% TFA
Buffer B: 0.1% TFA, 80% acetonitrile
Gradient: 5 to 50% B in 45 min, 50 to 100% B in 10 min
Flow: 2 ml / min
Detection: 220 nm
Chromatography system: Kontron
Fractions: á 1 min from the start of the gradient

Zweite Analytische Reverse-Phase C18-ChromatographieSecond analytical reverse phase C18 chromatography

Die bioaktive Fraktion 56 aus dem vorhergehenden Trennschritt wurde auf einer analytischen Reverse-Phase Säule weiter auf­ gereinigt.The bioactive fraction 56 from the previous separation step was continued on an analytical reverse phase column cleaned.

ChromatographiebedingungenChromatography conditions

Säule: 0,46 cm × 25 cm Stahlsäule
Füllmaterial: YMC RP-C18, 5 µm, 300 Å
Puffer A: 0,1% TFA
Puffer B: 0,1% TFA, 80% Acetonitril
Gradient: 15 bis 50% B in 75 min, 75 bis 100% B in 10 min
Fluß: 0,7 ml/min
Detektion: 214 nm
Chromatographieanlage: KontronColumn: 0.46 cm × 25 cm steel column
Filling material: YMC RP-C18, 5 µm, 300 Å
Buffer A: 0.1% TFA
Buffer B: 0.1% TFA, 80% acetonitrile
Gradient: 15 to 50% B in 75 min, 75 to 100% B in 10 min
Flow: 0.7 ml / min
Detection: 214 nm
Chromatography system: Kontron

Dritte Analytische Reverse-Phase C3-ChromatographieThird analytical reverse phase C3 chromatography

Ein Teil der bioaktiven Fraktion 45 aus dem vorhergehenden Trennschritt wurde direkt der Massen- und Sequenzanalyse unterzogen. Ein anderer Teil wurde reduziert und alkyliert (wie unter Beispiel 2 beschrieben) und dann auf einer analytischen Reverse-Phase Säule weiter aufgereinigt.Part of bioactive fraction 45 from the previous one Separation step was directly the mass and sequence analysis subjected. Another part was reduced and alkylated (as described in example 2) and then on one analytical reverse phase column further purified.

ChromatographiebedingungenChromatography conditions

Säule: 0,1 cm × 15 cm Stahlsäule
Füllmaterial: Zorbax RP-C3, 5 µm, 300 Å Analytik verwandt wird, deutlich.Column: 0.1 cm × 15 cm steel column
Filling material: Zorbax RP-C3, 5 µm, 300 Å analytics is used, clearly.

MassenbestimmungenMass determinations

Alle Massenbestimmungen der unmodifizierten und modifizierten Peptide wurden auf einem MALDI-TOF Massenspektrometer durch­ geführt. Die Molekülmassen der Peptide wurden als
IGF-II, 7471 Da;
IBP-2, 12 681 Da;
IBP-2, 12 865 Da
bestimmt.All mass determinations of the unmodified and modified peptides were carried out on a MALDI-TOF mass spectrometer. The molecular weights of the peptides were as
IGF-II, 7471 Da;
IBP-2, 12,681 Da;
IBP-2, 12 865 Da
certainly.

Bestimmung von Cysteinen/Modifizierung von PeptidenDetermination of cysteines / modification of peptides

Cysteine lassen sich nach vorheriger chemischer Derivati­ sierung, zum Beispiel nach Reduktion mit β-Mercaptoethanol und Carboxamidomethylierung mit Iodacetamid, in der Peptid- Sequenzierung nachweisen. Nach der Derivatisierung schließt sich eine Entsalzung vorzugsweise über eine analytische Reverse-Phase Chromatographie mit einer Vydac RP-C18 Säule (4,6 mm × 25 cm) an. Ein Teil der so modifizierten Peptide werden der Sequenzanalyse zugeführt, mit dem anderen Teil ergeben die Massenbestimmungen ein entsprechendes Molekular­ gewicht. Aus der Massendifferenz zum nativen Peptid wird geschlossen, daß die Peptide aus Hämofiltrat sechs Cysteine enthalten, welche zudem mit drei Disulfidbrücken unter­ einander verbunden sind.Cysteines can be made according to previous chemical derivatives sation, for example after reduction with β-mercaptoethanol and carboxamidomethylation with iodoacetamide, in the peptide Prove sequencing. After derivatization closes desalination is preferably an analytical one Reverse phase chromatography with a Vydac RP-C18 column  (4.6 mm × 25 cm). Part of the modified peptides are fed to the sequence analysis, with the other part the mass determinations give a corresponding molecular Weight. The mass difference to the native peptide becomes concluded that the peptides from hemofiltrate six cysteines included, which also with three disulfide bridges under are connected.

SequenzbestimmungSequence determination

Sowohl die aufgereinigten nativen als auch die carboxamido­ methylierten Peptide werden mittels Edman-Abbau auf einem ABI 473 A Sequenzer unter Verwendung des Standard-Programms analysiert.Both the purified native and the carboxamido Methylated peptides are broken down by Edman on a ABI 473 A sequencer using the standard program analyzed.

Die Proben werden auf eine Polybrene-Membran in Mengen zwischen 100 und 400 pmol aufgetragen. In Übereinstimmung mit den Ergebnissen der Massenbestimmungen ergaben sich folgende N-terminale Sequenzen:The samples are placed on a polybrene membrane in quantities applied between 100 and 400 pmol. In accordance with the results of the mass determinations resulted following N-terminal sequences:

IBP-2-13, MW 12 681
(reduziertes und mit Jodacetamid modifiziertes Molekül, MW 13 045)
Aminosäuren
GGKHHLGLEEPKKLRPPPARTPCQQELDQV . . .IBP-2-13, MW 12 681
(Reduced molecule modified with iodoacetamide, MW 13 045)
amino acids
GGKHHLGLEEPKKLRPPPARTPCQQELDQV. . .

IBP-2-13, MW 12 865
(reduziertes und mit Jodacetamid modifiziertes Molekül, MW 13 223)
Aminosäuren
GKGGKHHLGLEEPKKLRPPPARTPCQQELDQV . . .IBP-2-13, MW 12 865
(Reduced molecule modified with iodoacetamide, MW 13 223)
amino acids
GKGGKHHLGLEEPKKLRPPPARTPCQQELDQV. . .

IGF-II, MW 7471
Aminosäuren
AYRPSETLCGGEL. . . .IGF-II, MW 7471
amino acids
AYRPSETLCGGEL. . . .

Der C-Terminus wurde durch den Vergleich der gemessenen Molekularmasse mit der aus der Sequenz berechneten Masse bestimmt. Die Übereinstimmung dieser Massen liegt in der Meßgenauigkeit des MALDI-TOF-Massenspektrometers von 0,1% der Gesamtmasse.The C-terminus was measured by comparing it  Molecular mass with the mass calculated from the sequence certainly. The agreement of these masses lies in the Measuring accuracy of the MALDI-TOF mass spectrometer of 0.1% the total mass.

DatenbankvergleichDatabase comparison

Ein Datenbankvergleich wurde mit Hilfe des HUSAR-Programm­ pakets an den SwissProt und EMBL-Nucleinsäure Datenbanken durchgeführt. Die Peptidsequenzen besitzt eine hundert­ prozentige Identität zu den aus der cDNA abgeleiteten Amino­ säuren des humanen IBP-2 bzw. zur Aminosäuresequenz von IGF-II.A database comparison was made using the HUSAR program packages at the SwissProt and EMBL nucleic acid databases carried out. The peptide sequence has a hundred percent identity to the amino derived from the cDNA acids of human IBP-2 or the amino acid sequence of IGF-II.

IBP-2 wurde bisher als ein 34 kD großes Bindungsprotein be­ schrieben, dessen vollständige Sequenzanalyse durch Analyse der zugehörigen cDNA (Binkert, C. et al., EMBO Journal Vol. 8 (1989), Seiten 2497 bis 2502) erfolgte. IGF-II und auch IGF-I, welches ebenfalls an IBP-2 bindet, wurden dagegen in ihrer Struktur auf Protein- und DNA-Sequenzebene schon umfangreich beschrieben (als Review: Rechler, M.M., & Nissley, S.P. (1990) Insulin-like growth factors In: Peptide growth factors and their receptors (Spori, M.B., Roberts, A.B. eds.), Seiten 263 bis 367, Springer-Verlag, Berlin).So far, IBP-2 has been described as a 34 kD binding protein wrote whose complete sequence analysis by analysis the associated cDNA (Binkert, C. et al., EMBO Journal Vol. 8 (1989), pages 2497 to 2502). IGF-II and also IGF-I, which also binds to IBP-2, were, however, in their structure at the protein and DNA sequence level extensively described (as a review: Rechler, M.M., & Nissley, S.P. (1990) Insulin-like growth factors In: Peptides growth factors and their receptors (Spori, M.B., Roberts, FROM. eds.), pages 263 to 367, Springer-Verlag, Berlin).

Beispiel 2Example 2 Bestimmung der biologischen Aktivität des IGF/IBP-2-13Determination of the biological activity of the IGF / IBP-2-13

Die Isolierung des IGF/IBP-2-13 erfolgte anhand seiner biologischen Aktivität in einem Überlebensassay der PC-12 (Pheochromocytbm-Zellen)-Zellinie. Dazu wurden jeweils Aliquots der unter Beispiel 1 beschriebenen einzelnen Chromatographiestufen gefriergetrocknet und anschließend dem biologischen Assay zugeführt. Die Fraktionen, die jeweils ein positives Signal ergaben, wurden der weiteren Auf­ reinigung unterzogen. IGF / IBP-2-13 was isolated on the basis of its biological activity in a PC-12 survival assay (Pheochromocytbm cells) cell line. To do this, each Aliquots of the individual described in Example 1 Chromatography stages freeze-dried and then the biological assay. The factions, each gave a positive signal, were the further up subjected to cleaning.  

Der Assay mißt das Überleben der Zellen, nachdem sie serum­ frei gehalten wurden, indem 24 Stunden nach Serumentzug die Aktivität mitochondrialer Enzyme bestimmt wird. Als Positiv- Kontrolle wird in diesem Assay Nervenwachstumsfaktor (NGF) oder fötales Kälberserum (FCS) eingesetzt.The assay measures cell survival after serum were kept free by removing the Mitochondrial enzyme activity is determined. As a positive Control is in this assay nerve growth factor (NGF) or fetal calf serum (FCS) is used.

In 96 Loch-Platten werden 10 000 PC-12 Zellen pro Loch in serumfreien Medium ausgesät. Es erfolgt die Zugabe von Aliquots (ca. 100 ml Äquivalent des Ausgangsmaterials) in die wells. 20 Stunden später wird die Überlebensrate der Zellen mittels eines Wst-1 Substrats gemessen. Dieses Substrat wird von mitochondrialen Enzymen umgesetzt. Die entstehende Farbstoffintensität wird bei 405 nm im ELISA- Keader gemessen, die Referenzwellenlänge liegt dabei bei über 600 nm.In 96 well plates, 10,000 PC-12 cells are made per well sown serum-free medium. The addition of Aliquots (approx. 100 ml equivalent of the starting material) in the wells. 20 hours later, the survival rate of the Cells measured using a Wst-1 substrate. This Mitochondrial enzymes convert substrate. The resulting dye intensity is measured at 405 nm in an ELISA Keader measured, the reference wavelength is over 600 nm.

Der IGF/IBP-2-13 Komplex besitzt in dosisabhängigerweise eine überlebensförderende Wirkung auf PC-12 Zellen. Diese Zellen entsprechen neuronalen Vorläuferzellen, so daß man davon aus­ gehen kann, das IGF/IBP-2-13 ein neuroprotektiver Faktor ist.The IGF / IBP-2-13 complex has one depending on the dose survival-promoting effect on PC-12 cells. These cells correspond to neuronal progenitor cells so that one can assume IGF / IBP-2-13 is a neuroprotective factor.

Beispiel 3Example 3 Aufreinigung des erfindungsgemäßen Peptids IBP-4-11Purification of the peptide IBP-4-11 according to the invention

Die Aufreinigung des erfindungsgemäßen Peptid IBP-4-11 erfolgte bis zur Stufe der zweiten präparativen Auftrennung völlig analog zu der unter Beispiel 1 beschriebenen Auf­ reinigung des IBP-2-13. Die weitere Aufreinigung erfolgte durchThe purification of the peptide IBP-4-11 according to the invention took place up to the stage of the second preparative separation completely analogous to that described in Example 1 cleaning the IBP-2-13. The further purification took place by

Analytische Reverse-Phase C18-ChromatographieAnalytical reverse phase C18 chromatography

Die im Assay bioaktive Fraktion 33 aus pH-Pool IV wurden über eine analytische Keverse-Phase-Säule aufge­ trennt. Die Fraktion 34 enthielt die erfindungsgemäße Substanz. The bioactive fraction 33 from pH pool IV in the assay were set up on an analytical keverse phase column separates. Fraction 34 contained the one according to the invention Substance.  

ChromatographiebedingungenChromatography conditions

Säule: 1 cm × 25 cm Stahlsäule
Füllmaterial: Vydac RP-C4 5 ym, 300 Å
Puffer A: 0,1% TFA
Puffer B: 0,1% TFA, 80% Acetonitril
Gradient: 0-80% B in 80 min, 80-100% B in 10 min
Fluß: 2,5 ml/min
Detektion: 230 nm
Chromatographieanlage: Kontron
Fraktionen: á 1 min ab Start des GradientenColumn: 1 cm × 25 cm steel column
Filling material: Vydac RP-C4 5 ym, 300 Å
Buffer A: 0.1% TFA
Buffer B: 0.1% TFA, 80% acetonitrile
Gradient: 0-80% B in 80 min, 80-100% B in 10 min
Flow: 2.5 ml / min
Detection: 230 nm
Chromatography system: Kontron
Fractions: á 1 min from the start of the gradient

MassenbestimmungenMass determinations

Die Massenbestimmungen wurden auf einem Elektrospray-Massen­ spektrometer durchgeführt. Die Molekülmasse des Peptids wurden als
IBP-4-11, 11 344 Da
bestimmt.The mass determinations were carried out on an electrospray mass spectrometer. The molecular weight of the peptide was as
IBP-4-11, 11 344 Da
certainly.

SequenzbestimmungSequence determination

Die Amionsäuresequenz des aufgereinigten nativen, biologisch aktiven Peptids IBP-4-11 wurde wie unter Beispiel 1 auf der Seite 13 beschrieben durchgeführt.The amino acid sequence of the purified native, biological active peptide IBP-4-11 was as in Example 1 on the Page 13.

Es ergab sich die folgende N-terminale Sequenz:
IBP-4-11, MW 11 344 Da
KVNGAPREDARPVPQGSXQSELIIRALERL . . . .The following N-terminal sequence resulted:
IBP-4-11, MW 11 344 Da
KVNGAPREDARPVPQGSXQSELIIRALERL. . . .

Der C-Terminus wurde durch den Vergleich der gemessenen Molekularmasse mit der aus der Sequenz berechneten Masse bestimmt. Die Übereinstimmung dieser Massen liegt in der Meßgenauigkeit des Elektrospray-Massenspektrometers von 0,1% der Gesamtmasse.The C-terminus was measured by comparing it Molecular mass with the mass calculated from the sequence certainly. The agreement of these masses lies in the  Measuring accuracy of the electrospray mass spectrometer from 0.1% of the total mass.

DatenbankvergleichDatabase comparison

Ein Datenbankvergleich wurde mit Hilfe des HUSAR-Programm­ pakets an den SwissProt und EMBL-Nucleinsäuredatenbanken durchgeführt. Die Peptidsequenz besitzt eine hundert­ prozentige Identität zu den aus der cDNA abgeleiteten Amino­ säuren des humanen IBP-4.A database comparison was made using the HUSAR program packages at the SwissProt and EMBL nucleic acid databases carried out. The peptide sequence has a hundred percent identity to the amino derived from the cDNA acids of human IBP-4.

Bestimmung der Schwefelbrückenverknüpfung des IBP-4-11Determination of the sulfur bridge linkage of the IBP-4-11

Die Analyse der Schwefelbrückenverknüpfung erfolgte, indem das native Peptid IBP-4-11 parallel in zwei verschiedenen Ansätzen mit den Endoproteasen Chymotrypsin und Arg-C ge­ spalten wurde. Die erhaltenen Spaltfragmente wurden dann mittels analytischer Reverse Phase Chromatographie von­ einander getrennt und der Molekularmassen- und Sequenzanalyse unterzogen. Folgende Fragmente, welche jeweils zwei Cysteine und eine Schwefelbrücke enthalten, wurden erhalten:
The sulfur bridge linkage was analyzed by cleaving the native peptide IBP-4-11 in parallel in two different batches with the endoproteases chymotrypsin and Arg-C. The cleavage fragments obtained were then separated from one another by means of analytical reverse phase chromatography and subjected to the molecular mass and sequence analysis. The following fragments, each containing two cysteines and a sulfur bridge, were obtained:

Daraus ist ersichtlich, daß im nativen IBP-4-11 die Schwefel­ brücken zwischen Cystein 1 und 2, zwischen Cystein 3 und 4 sowie zwischen Cystein 5 und 6 ausgebildet sind.It can be seen from this that in the native IBP-4-11 the sulfur bridge between cysteine 1 and 2, between cysteine 3 and 4 and between cysteine 5 and 6 are formed.

Beispiel 4Example 4 Bestimmung der biologischen Aktivität des IBP-4-11Determination of the biological activity of the IBP-4-11

Die Isolierung des IBP-4-11 erfolgte anhand seiner bio­ logischen Aktivität in einem Proliferationsassay mit primären Knochenzellen (Osteoblasten), die zunächst aus Schädeldecken von Rattenembryonen isoliert werden.The IBP-4-11 was isolated based on its bio logical activity in a proliferation assay with primary Bone cells (osteoblasts), which initially originate from the skullcap be isolated from rat embryos.

Dazu wurden jeweils Aliquots der unter Beispiel 3 be­ schriebenen einzelnen Chromatographiestufen gefriergetrocknet und anschließend dem biologischen Assay zugeführt. Die Fraktionen, die jeweils ein positives Signal ergaben, wurden der weiteren Aufreinigung unterzogen. Der Assay mißt die Proliferation der Zellen, indem 48 oder 72 Stunden nach Zugabe der Fraktionen der Einbau von radioaktivem Thymidin, also die DNA-Syntheserate, bestimmt wird. Als Positiv- Kontrolle wird in diesem Assay Transforming Growth Factor­ beta (TGF-beta) oder fötales Kälberserum (FCS) eingesetzt. In 96 Loch-Platten werden 5000 Osteoblasten-Zellen pro Loch in serumhaltigem Medium ausgesät. Es erfolgt die Zugabe von Aliquots (ca. 100 ml Äquivalent des Ausgangsmaterials) in die wells. 48 oder 72 Stunden später wird die Proliferations­ rate (DNA-Syntheserate) der Zellen mittels der Zugabe und des Einbaus von radioaktivem Thymidins gemessen. Das Peptid IBP-4-11 besitzt in dosisabhängigerweise eine proliferations­ förderende Wirkung auf diese primären Osteoblasten. Diese Zellen entsprechen typischen Knochenzellen, so daß man davon ausgehen kann, das IBP-4-11 ein osteoanaboler Faktor ist. For this purpose, aliquots of the example 3 be written individual chromatography steps freeze-dried and then sent to the biological assay. The Fractions, each giving a positive signal, were subjected to further purification. The assay measures that Proliferation of cells by 48 or 72 hours after Adding the fractions incorporating radioactive thymidine, that is, the rate of DNA synthesis. As a positive Control is used in this transforming growth factor assay beta (TGF-beta) or fetal calf serum (FCS). In 96 well plates there are 5000 osteoblast cells per well Sown in medium containing serum. The addition of Aliquots (approx. 100 ml equivalent of the starting material) in the wells. 48 or 72 hours later the proliferation rate (DNA synthesis rate) of the cells by means of the addition and the incorporation of radioactive thymidine measured. The peptide IBP-4-11 has proliferations in a dose-dependent manner promoting effects on these primary osteoblasts. This Cells correspond to typical bone cells, so that one of them can assume that IBP-4-11 is an osteoanabolic factor.  

SEQUENZPROTOKOLL SEQUENCE LOG

Claims (24)

1. Peptide mit der Aminosäuresequenz der Formel
R1-C-X1-PNC-X2-QC-X3-CWCV-X4-C-R2 (IBP)
worin
R1 NH2, eine Aminosäure oder ein Peptid mit einer Amino­ säuresequenz umfassend bis zu 41 Aminosäuren, X1 ein Peptid mit einer Aminosäuresequenz umfassend 24 bis 31 Aminosäuren, X2 ein Peptid mit einer Aminosäuresequenz umfassend 9 Aminosäuren, X3 ein Peptid mit einer Amino­ säuresequenz umfassend 10 Aminosäuren, X4 ein Peptid mit einer Aminosäuresequenz umfassend 18 bis 24 Amino­ säuren, R2 COOH, CONH2 oder ein Peptid mit bis zu 12 Aminosäuren darstellt und cyclische, glycosylierte, phosphorylierte, acetylierte, amidierte, sulfatierte Derivate sowie Fragmente mit der physiologischen Fähig­ keit des IBP.1. Peptides with the amino acid sequence of the formula
R 1 -CX 1 -PNC-X 2 -QC-X 3 -CWCV-X 4 -CR 2 (IBP)
wherein
R 1 NH 2 , an amino acid or a peptide with an amino acid sequence comprising up to 41 amino acids, X 1 a peptide with an amino acid sequence comprising 24 to 31 amino acids, X 2 a peptide with an amino acid sequence comprising 9 amino acids, X 3 a peptide with a Amino acid sequence comprising 10 amino acids, X 4 is a peptide with an amino acid sequence comprising 18 to 24 amino acids, R 2 COOH, CONH 2 or a peptide with up to 12 amino acids and cyclic, glycosylated, phosphorylated, acetylated, amidated, sulfated derivatives and fragments with the physiological ability of the IBP. 2. Peptide gemäß Anspruch 1 mit Disulfidbrücken der Formel
2. Peptides according to claim 1 with disulfide bridges of the formula
3. Peptide gemäß einem der Ansprüche 1 und/oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß X2 an Position 4 seiner Aminosäure­ sequenz ein Glycin aufweist und/oder X3 an der Position 9 seiner Aminosäuresequenz ein Glycin aufweist und/oder X4 an der Position 4 oder 5 seiner Aminosäuresequenz ein Glycin aufweist und/oder X4 an der Position 9 oder 10 seiner Aminosäuresequenz ein Glycin aufweist.3. Peptides according to one of claims 1 and / or 2, characterized in that X 2 has a glycine at position 4 of its amino acid sequence and / or X 3 has a glycine at position 9 of its amino acid sequence and / or X 4 at the position 4 or 5 of its amino acid sequence has a glycine and / or X 4 has a glycine at position 9 or 10 of its amino acid sequence. 4. Peptide gemäß mindestens einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß X1 an der Position 8 oder V ist und/oder X1 an der Position 11 oder I ist und/oder X2 an der Position 1 D oder N ist und/oder X2 an der Position 9 K oder R ist und/oder X3 an der Position 3 S oder A ist und/oder an der Position 8 R oder A ist.4. Peptides according to at least one of claims 1 to 3, characterized in that X 1 at position 8 or V and / or X 1 at position 11 or I and / or X 2 at position 1 is D or N. and / or X 2 at position 9 is K or R and / or X 3 at position 3 is S or A and / or at position 8 is R or A. 5. Peptide gemäß mindestens einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß K1 ausgewählt wird aus
APSEEDHSILWDAISTYDGSKALHVTNIKKWKEP,
GGKHHLGLEEPKKLRPPPARTP,
GKGGKHHLGLEEPKKLRPPPARTP,
GHAKDSQRYKVDYESQSTDTQNFSSESKRETEYGP,
KVNGAPREDARPVPQGS,
LTQSKFVGGAENTAHPRIISAPEMRQESEQGP,
PQAGTARPQDVNRRDQQRNPGTSTTPSQPNSAGVQDTEMGP.5. Peptides according to at least one of claims 1 to 4, characterized in that K 1 is selected from
APSEEDHSILWDAISTYDGSKALHVTNIKKWKEP,
GGKHHLGLEEPKKLRPPPARTP,
GKGGKHHLGLEEPKKLRPPPARTP,
GHAKDSQRYKVDYESQSTDTQNFSSESKRETEYGP,
KVNGAPREDARPVPQGS,
LTQSKFVGGAENTAHPRIISAPEMRQESEQGP,
PQAGTARPQDVNRRDQQRNPGTSTTPSQPNSAGVQDTEMGP. 6. Peptide gemäß mindestens einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß X1 ausgewählt wird aus
RIELYRVVESLAKAQETSGEEISKFYL,
QQELDQVLERISTMRLPDERGPLEHLYSLHI,
RREMEDTLNHLKFLNVLSPRGVHI,
QSELHRALERLAASQSRTHEDLYIIPI,
RRHMEASLQELKASPRMVPRAVYL,
RRHLDSVLQQLQTEVYRGAQTLYV.6. Peptides according to at least one of claims 1 to 5, characterized in that X 1 is selected from
RIELYRVVESLAKAQETSGEEISKFYL,
QQELDQVLERISTMRLPDERGPLEHLYSLHI,
RREMEDTLNHLKFLNVLSPRGVHI,
QSELHRALERLAASQSRTHEDLYIIPI,
RRHMEASLQELKASPRMVPRAVYL,
RRHLDSVLQQLQTEVYRGAQTLYV. 7. Peptide gemäß mindestens einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß X2 ausgewählt wird aus
NKNGFYHSR,
DKHGLYNLK,
DKKGFYKKK,
DRNGNFHPK,
DRKGFYKKK,
DHRGFYRKR.7. Peptides according to at least one of claims 1 to 6, characterized in that X 2 is selected from
NKNGFYHSR,
DKHGLYNLK,
DKKGFYKKK,
DRNGNFHPK,
DRKGFYKKK,
DHRGFYRKR. 8. Peptide gemäß mindestens einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß X3 ausgewählt wird aus
ETSMDGEAGL,
KMSLNGQRGE,
RPSKGRKRGF,
HPALDGQRGK,
KPSRGRKRGI,
RSSQGQRRGP.8. Peptides according to at least one of claims 1 to 7, characterized in that X 3 is selected from
ETSMDGEAGL,
KMSLNGQRGE,
RPSKGRKRGF,
HPALDGQRGK,
KPSRGRKRGI,
RSSQGQRRGP. 9. Peptide gemäß mindestens einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß X4 ausgewählt wird aus
YPWNGKRIPGSPEIRGDPN,
NPNTGKLIQGAPTIRGDPE,
DKYGQPLPGYTTKGKEDVH,
DRKTGVKLPGGLEPKGELD,
DKYGMKLPGMEYVDGDFQ,
DRMGKSLPGSPDGNGSSS.9. Peptides according to at least one of claims 1 to 8, characterized in that X 4 is selected from
YPWNGKRIPGSPEIRGDPN,
NPNTGKLIQGAPTIRGDPE,
DKYGQPLPGYTTKGKEDVH,
DRKTGVKLPGGLEPKGELD,
DKYGMKLPGMEYVDGDFQ,
DRMGKSLPGSPDGNGSSS. 10. Peptide gemäß mindestens einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß R2 ausgewählt wird aus
QIYFNVQN,
HLFYNEQQEARGVHTQRMQ,
HLFYNEQQE,
YSMQSK,
HQLADSFRE,
HTFDSSNVE,
PTGSSG.10. Peptides according to at least one of claims 1 to 9, characterized in that R 2 is selected from
QIYFNVQN,
HLFYNEQQEARGVHTQRMQ,
HLFYNEQQE,
YSMQSK,
HQLADSFRE,
HTFDSSNVE,
PTGSSG. 11. Verfahren zur Herstellung der Peptide gemäß mindestens einem der Ansprüche 1 bis 10 durch Aufreinigung aus humanem Blutfiltrat oder Urin, durch Festphasenpeptid­ synthese oder durch Expression in rekombinanten Mikro­ organismen.11. The method for producing the peptides according to at least one of claims 1 to 10 by purification human blood filtrate or urine, by solid phase peptide synthesis or by expression in recombinant micro organisms. 12. Komplexe von Peptiden gemäß mindestens einem der An­ sprüche 1 bis 10 mit hIGF-I (humaner Insulin-like growth factor-I, MW 7649) oder hIGF-II (humaner Insulin-like growth factor-II, MW 7491) sowie dessen biologisch aktive Fragmenten und/oder Derivaten, ins­ besondere amidierten, acetylierten, sulfatierten, phosphorylierten und/oder glykosylierten Derivaten.12. Complexes of peptides according to at least one of the an say 1 to 10 with hIGF-I (human insulin-like growth factor-I, MW 7649) or hIGF-II (human  Insulin-like growth factor-II, MW 7491) and its biologically active fragments and / or derivatives, ins special amidated, acetylated, sulfated, phosphorylated and / or glycosylated derivatives. 13. Nucleinsäure, dadurch gekennzeichnet, daß sie für Peptide gemäß mindestens einem der Ansprüche 1 bis 10 kodiert.13. Nucleic acid, characterized in that it is for Peptides according to at least one of claims 1 to 10 encoded. 14. Antisensenucleotid, dadurch gekennzeichnet, daß es unter stringenten Bedingungen eine Nucleinsäuresequenz bindet, die für ein Peptid gemäß mindestens einem der Ansprüche 1 bis 10 kodiert.14. Antisense nucleotide, characterized in that it a nucleic acid sequence under stringent conditions binds for a peptide according to at least one of the Claims 1 to 10 encoded. 15. Antikörper, dadurch gekennzeichnet, daß er an ein Peptid gemäß mindestens einem der Ansprüche 1 bis 10 bindet.15. Antibody, characterized in that it is attached to a Peptide according to at least one of claims 1 to 10 binds. 16. Inhibitor, dadurch gekennzeichnet, daß er die bio­ logische Aktivität von Peptiden gemäß mindestens einem der Ansprüche 1 bis 10 hemmt.16. Inhibitor, characterized in that it is the bio logical activity of peptides according to at least one of claims 1 to 10 inhibits. 17. Inhibitor, dadurch gekennzeichnet, daß er die Ex­ pression von Peptiden gemäß mindestens einem der Ansprüche 1 bis 10 hemmt.17. Inhibitor, characterized in that it ex pression of peptides according to at least one of the Claims 1 to 10 inhibits. 18. Verwendung von Peptiden gemäß mindestens einem der Ansprüche 1 bis 10, Komplexen gemäß Anspruch 12, Nucleinsäuren gemäß Anspruch 13, zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung der Unterexpression von IBP.18. Use of peptides according to at least one of the Claims 1 to 10, complexes according to claim 12, Nucleic acids according to claim 13, for the production of a Medicinal product used to treat the underexpression of IBP. 19. Verwendung von Antisensenucleotiden gemäß Anspruch 14, Antikörpern gemäß Anspruch 15, Inhibitoren gemäß An­ spruch 16 und/oder Inhibitoren gemäß Anspruch 17 zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung der Überexpression IBP. 19. Use of antisense nucleotides according to claim 14, Antibodies according to claim 15, inhibitors according to An saying 16 and / or inhibitors according to claim 17 Manufacture of a medicinal product for the treatment of Overexpression IBP.   20. Verwendung von Peptiden gemäß mindestens einem der An­ sprüche 1 bis 10, Komplexen gemäß Anspruch 12, Nuclein­ säuren gemäß Anspruch 13, Antisensenucleotiden gemäß Anspruch 14, Antikörpern gemäß Anspruch 15, Inhibitoren gemäß Anspruch 16 und/oder Inhibitoren gemäß Anspruch 17 zur Behandlung von Muskelschwund, Osteoporose, Diabetes, amyloidaler lateraler Sklerose, peripheren und zentralen Neuropathien, entzündlichen Prozessen, gestörten Entzündungsreaktionen, Tumorerkrankungen, entzündlichen und neoplastischen Erkrankungen, Wachs­ tumsstörung, Erkrankung der Muskulatur, Erkrankung des Knochenapparates und/oder zur Wund- und Knochenheilung.20. Use of peptides according to at least one of the An claims 1 to 10, complexes according to claim 12, nuclein acids according to claim 13, antisense nucleotides according to Claim 14, antibodies according to claim 15, inhibitors according to claim 16 and / or inhibitors according to claim 17 for the treatment of muscle wasting, osteoporosis, Diabetes, amyloidal lateral sclerosis, peripheral and central neuropathies, inflammatory processes, disturbed inflammatory reactions, tumor diseases, inflammatory and neoplastic diseases, wax disorder of the muscles, musculoskeletal disorders, Bone apparatus and / or for wound and bone healing. 21. Arzneimittel enthaltend Peptide gemäß mindestens einem der Ansprüche 1 bis 10, Komplexe gemäß Anspruch 12, Nucleinsäuren gemäß Anspruch 13, Antisensenucleotiden gemäß Anspruch 14, Antikörpern gemäß Anspruch 15, Inhibitoren gemäß Anspruch 16 und/oder Inhibitoren gemäß Anspruch 17 in einer pharmazeutisch üblichen Dar­ reichungsform zur oralen, intravenösen, intramusku­ lären, intracutanen, intrathekalen Anwendung oder als Aerosol zur transpulmonalen Applikation.21. Medicament containing peptides according to at least one of claims 1 to 10, complexes according to claim 12, Nucleic acids according to claim 13, antisense nucleotides according to claim 14, antibodies according to claim 15, Inhibitors according to claim 16 and / or inhibitors according to claim 17 in a pharmaceutical standard Dar dosage form for oral, intravenous, intramuscular lara, intracutaneous, intrathecal use or as Aerosol for transpulmonary application. 22. Verwendung der Nucleinsäure gemäß Anspruch 13 und/oder der Antisensenucleotide gemäß Anspruch 14 zur Her­ stellung eines Medikamentes zur Behandlung somatischer oder nicht-somatischer Generkrankungen.22. Use of the nucleic acid according to claim 13 and / or of the antisense nucleotides according to claim 14 provision of a medicament for the treatment of somatic or non-somatic genetic disorders. 23. Diagnostikmittel enthaltend Peptide gemäß mindestens einem der Ansprüche 1 bis 10, Komplexe gemäß Anspruch 12, Nucleinsäuren gemäß Anspruch 13, Antisense­ nucleotide gemäß Anspruch 14, Antikörpern gemäß An­ spruch 15, Inhibitoren gemäß Anspruch 16 und/oder Inhibitoren gemäß Anspruch 17 sowie weitere Hilfs­ mittel.23. Diagnostic agent containing peptides according to at least one of claims 1 to 10, complexes according to claim 12, nucleic acids according to claim 13, antisense nucleotides according to claim 14, antibodies according to An claim 15, inhibitors according to claim 16 and / or Inhibitors according to claim 17 and further auxiliaries medium. 24. Verwendung der Diagnostikmittel gemäß Anspruch 23 zur Diagnose von Funktionsstörungen des Knochens, der Muskeln, des Nervensystems, der Lymphorgane, des Magen- Darm-Traktes, des Immunsystems, von Diabetes, inflamma­ torischen und neoplastischen Prozessen sowie als Marker bei Krebs.24. Use of the diagnostic agent according to claim 23 for  Diagnosing functional disorders of the bone, the Muscles, the nervous system, the lymphatic organs, the gastric Tract, immune system, diabetes, inflamma toric and neoplastic processes as well as a marker in cancer.
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