CN102703442A - 一种检测犬细小病毒的生物条形码及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了用于检测犬细小病毒的生物条形码、与条形码配合使用的互补探针NP链，其核苷酸序列分别如SEQ ID No.1，SEQID No.2所示，本发明还提供了对犬细小病毒的生物条形码进行荧光定量检测的方法和检测试剂盒。本发明的检测方法具有检测准确，灵敏度高、特异性强，简便快速的优点，具有良好的标本检测能力。

Description

一种检测犬细小病毒的生物条形码及其应用

技术领域

本发明涉及条形码检测方法，特别是涉及用于检测犬细小病毒的生物条形码检测技术所用的引物、探针及其荧光定量PCR检测试剂盒的组装。

背景技术

生物条形码检测技术(bio-bar codes assay，BCA)是美国西北大学Mirkin教授于2003年首次报道的一种新型标记免疫测定技术，其突出特点是具有极高的灵敏度，可达常规ELISA方法的106倍。BCA技术的基本原理是利用被检物单抗标记的磁性微球探针(magnetic microparticles，MMPs)和被检物多抗及特异DNA双链标记的金纳米颗粒探针(nanoparticle，NP)，通过形成MMP-被检物-NP三明治复合物后再利用去杂交将NP探针上标记的特异DNA链释放出来，通过常规PCR方法或芯片检测方法(金标银染法)鉴定这些释放的DNA链就可确定被检物的存在。

NP探针即是金纳米颗粒包被有双链DNA和抗被检物的多克隆抗体，双链DNA其中的一条和胶体金颗粒通过Au-S键相连，另一条和前者互补是用来指示被检物的条形码DNA；MMP探针即是对应于分选磁场的直径约为1μm的磁性微球探针，其表面包被有抗被检物的单克隆抗体。

从BCA技术的检测程序可以看出，其基本原理类似于双抗体夹心ELISA抗原检测法。通过检测条形码DNA而实现对被检物的间接检测，由于PCR反应和芯片检测的放大效应，使检测灵敏度得到极大提高。

生物条形码检测过程可以分为条形码DNA的获取和条形码DNA的检测两大方面。条形码DNA的获取过程包括三步，第一步：抗原抗体作用，先用抗被检物的单抗功能化的MMP探针特异性地结合标本中可能的被检物，加上磁场固定MMP探针，用PBS溶液反复冲洗，除去未连结的被检物和不相关的杂质；第二步：洗脱和去杂交，加入被双链DNA和抗被检物的多抗修饰的NP探针，将被检物夹在中间，形成一个三明治结构，接着加上磁场，用磁铁固定MMP探针的同时，反复冲洗，除去未连接的NP探针；第三步：DNA分离，此步是一个去杂交步骤，三明治结构被磁场固定，在高温低盐条件下，NP探针上结合的数以百计的条形码DNA释放到溶液中，接着对条形码DNA链进行定量，从而间接检测被检物。条形码DNA链的检测现在有两种方式：一是对获取的条形码DNA链作普通的PCR扩增，然后凝胶电泳检测；二是通过芯片检测，芯片检测***需要三种不同作用的核酸：1)与固相支持物(玻片等)连接的捕获探针(捕获DNA修饰的玻片)；2)产生信号的检测探针(DNA修饰的胶体金)；3)靶核酸(条形码DNA)，靶核酸在这个体系中起连接捕获探针和信号检测探针的作用。如体系中存在上述三种成分，靶核酸能与上述两种核苷酸杂交，洗脱去除杂质后能得到一个清晰的检测信号，如果靶核酸不与上述两种探针杂交，则信号探针无法连接在固相物上，洗脱后固相物上无信号应答，得到的信号可以用普通的平板扫描仪进行分析。

BCA技术已在某些病原标志物的检测上取得了很好的进展。Nam等人首先利用BCA技术对***特异抗原(prostate specificantigen，PSA)进行了检测，利用BCA技术检测PSA的检测下限可达3a mol/L，检测下限比现有的传统ELISA方法低6个数量级；Georganopoulou等人利用BCA技术对β-淀粉样蛋白源性播散性配基(amyloid β-derived diffusible ligands，ADDL)进行了检测，其检测极限能在15μL脑脊液中检测到50个ADDL分子；Stoeva等人利用BCA技术对血清中的三种肿瘤标志物PSA、人体绒毛膜***(humanchorionic gonadotropin，HCG)和α胎儿球蛋白(α-fetoprotein，AFP)进行了联合检测，检测结果显示检测限度可达170fmol/L。

综上所述，BCA技术与ELISA技术相比，具有非常显著的优点，具体表现在以下几个方面：1)BCA技术显示了比常规的ELISA方法高出六个数量级(100万倍)的敏感性；2)针对不同的被检物设计不同长度和序列的条形码DNA，可分析复杂样本中的多种物质；3)具有较高的特异性，其特异性决定于检测***使用的单克隆抗体的特异性，只要使用高特异的抗目标检物的单克隆抗体就能保证检测***的高特异性；4)检测范围广，只要被检物具有单抗和多抗，就可对其进行检测，这使得它在检测一些不适宜用PCR技术检测的微量物质方面具有很大的优势。

但是，从BCA技术检测的过程和显示体系可以看出，这种技术存在着明显的缺陷，主要体现在对条形码DNA的检测上，具体有：1)传统的PCR检测是应用终点PCR来定量样品中模板的量，通常用凝胶电泳分离，并用荧光染色来检测PCR反应的最终扩增产物。但在PCR反应中，由于模板、试剂、焦磷酸盐分子的聚集等因素影响聚合酶反应，最终导致PCR反应不再以指数形式进行而进入“平台期”，一些反应的终产物比另一些要多，因此终点PCR反应方法定量不准确；其次终点PCR容易交叉污染，产生假阳性；2)条形码DNA的芯片检测由于银染试剂自身的缺点而易产生假阳性，阴阳性不易界定，染色结果因时间、环境因素变化很大；3)PCR检测体系和芯片检测体系都不能对被检物进行有效定量，这与现今免疫检测技术的发展要求及发展方向：不但能定性，而且能定量相比是落伍的，因此对常规BCA技术进行改进使之能克服上述缺点并能对被检物确切定量就显得很重要。

将BCA技术与实时荧光定量PCR(Real-time fluorescentquantitative PCR，FQ-PCR)技术结合，在分析优化关键数据基础上，建立荧光定量型生物条形码检测技术即可克服上述缺陷和不足。

FQ-PCR技术创立于1996年，由美国Applied Biosystems公司推出，是一种在PCR定性技术基础上发展起来的核酸定量技术。FQ-PCR技术是通过在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，通过Ct值和标准曲线的分析对起始模板进行定量分析。FQ-PCR技术融合PCR技术和DNA探针杂交技术的优点，直接探测PCR过程中荧光信号的变化使PCR的扩增及其分析过程均在同一封闭***下完成，并在电脑分析软件支持下实现对PCR扩增产物的动态监测和自动定量，其特点主要有以下几个方面：1)定量原理独特，用产生荧光信号的多少来显示扩增产物的量，动态实时连续荧光监测，具有很好的可视性；2)荧光信号通过荧光染料嵌入双链DNA，或双重标记的序列特异性荧光探针或能量信号转移探针等方法获得，大大地提高了检测的灵敏度、特异性和精确性；3)只须在加样时打开一次盖子，其后的过程完全是闭管操作，免除了标本和产物的污染，且无复杂的产物后续处理过程，高效、快速；4)结果重现性好，定量动态范围高达五个数量级。FQ-PCR作为PCR技术的发展，自1996年已来，在科研及临床诊断的许多领域显现出它的优越性，现在已广泛应用于生物学、基础医学、疾病诊断、食品、水质环保、药物开发等领域，被认为是核酸定量的金标准。

犬细小病毒(Canine Parvovirus，CPV)可引起犬细小病毒病，是犬的一种高度接触性的烈性传染病，临床症状以出血性肠炎或非化脓性心肌炎为主要特征，是当前危害我国养犬业最严重的疫病之一。CPV属于细小病毒科，细小病毒属，线状负链单股DNA病毒，基因组长5323bp，编码结构蛋白VP1、VP2和VP3和非结构蛋白NS1、NS2。VP2是CPV的主要衣壳蛋白，编码CPV的主要抗原决定簇，可以诱导机体产生中和抗体，也被认为是受体的结合蛋白。VP2在病毒感染过程中起着极为重要的作用，CPV宿主范围由其结合细胞表面的受体或其他细胞配体的能力决定。VP2是病毒核心颗粒上的主要暴露蛋白，提示VP2可作为利用抗体检测犬细小病毒的理想靶位。

发明内容

本发明的目的在于提供用于检测犬细小病毒的生物条形码及其应用。

本发明的另一目的在于提供一种荧光定量型生物条形码检测技术。

本发明提供的一种用于检测犬细小病毒(Canine Parvovirus，CPV)的生物条形码，其具有SEQ ID No.1所示的核苷酸序列或其特异性片段。

本发明提供了用于扩增上述生物条形码的特异性引物，其核苷酸序列为：

引物1：5’-CTTACACTGTTGCTGCTGCC-3’(SEQ ID No.3)，

引物2：5’-TCCTCTACTTCGGGTGGGAA-3’(SEQ ID No.4)。

本发明提供了与上述生物条形码配合使用的互补探针NP链，其核苷酸序列为：

5’-TCCTCTACTTCGGGTGGGAAGTCGGGGTTCA₁₀-(CH₂)₆-SH-3’(SEQ ID No.2)。

本发明提供了一种犬细小病毒的生物条形码检测方法，包括以下步骤，

1)NP探针的制备：用常规方法将金纳米颗粒、抗VP2蛋白的多克隆抗体、核苷酸序列为SEQ ID No.1的条形码DNA链和核苷酸序列为SEQ ID No.2的互补探针NP链制备NP探针；

2)MMP探针的制备：用磁性微球和抗VP2蛋白的单克隆抗体制备MMP探针；

3)犬细小病毒的生物条形码检测：利用NP探针、MMP探针和犬细小病毒通过抗原、抗体作用制备NP-VP2-MMP三明治复合物，然后在高温低盐条件下，释放条形码DNA链，最后对获得的条形码DNA链进行荧光定量PCR方法检测。

其中，步骤1)所述的金纳米颗粒直径为30nm。

其中，步骤2)所述的磁性微球直径为1μm。

其中所述荧光定量PCR方法所用引物分别如SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所述的核苷酸序列。

本发明还提供一种犬细小病毒的生物条形码检测试剂盒，包括包被有抗VP2蛋白的单克隆抗体的MMP探针和抗VP2蛋白的多克隆抗体的NP探针。

进一步的，上述试剂盒的NP探针连接的条形码DNA链具有SEQ ID No.1所示的核苷酸序列，互补探针NP链具有SEQ ID No.2所示的核苷酸序列。

进一步的，上述试剂盒还包括一对引物，其核苷酸序列分别如SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示。

本发明利用荧光定量PCR技术代替普通PCR检测和芯片检测，从而实现对被检物进行精确定量。本发明建立的荧光定量型生物条形码检测技术与常规生物条形码检测方法相比，能对条形码DNA链进行精确定量，从而对犬细小病毒抗原进行精确定量，克服了常规生物条形码检测方法的阴阳性界限不清等问题。本发明的检测方法及检测试剂盒具有检测准确，灵敏度高、特异性强，简便快速的优点，具有良好的标本检测能力。

附图说明

图1为荧光定量型生物条形码技术检测CPV VP2蛋白的灵敏度图，从左至右VP2蛋白浓度依次为：1：1pg/mL；2：100fg/mL；3：10fg/mL；4：1fg/mL；5：100ag/mL。

图2为荧光定量型生物条形码技术的灵敏度检测结果(犬细小病毒)从左至右犬细小病毒滴度依次为：1：10^-1TCID₅₀/0.1mL；2：10^-2TCID₅₀/0.1mL；3：10^-3TCID₅₀/0.1mL；4：10^-4TCID₅₀/0.1mL；5：10^-5TCID₅₀/0.1mL。

具体实施方式

以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。若未特别指明，实施例中所用的试剂为市售。

实施例1检测犬细小病毒的生物条形码的设计与合成

本发明检测方法中使用的寡核苷酸链如下：

条形码DNA链：

5′-ACACTGTTGCTGCTGCCTCTACGTTCAATGGCTTCCAGAGGCCGACGATCTACTATGTGATGTCAGGGCCTGCGTGGCAACTCATGCAGCAATTCCAGAACCCCGACTTCCCACCCGAAGTAGAGGA-3′(SEQ ID No.1)；

互补探针NP链：

5’-TCCTCTACTTCGGGTGGGAAGTCGGGGTTCA₁₀-(CH₂)₆-SH-3’(SEQ ID No.2)。

以上条形码DNA由北京三博远志生物公司合成，互补探针NP链由大连宝生物工程有限公司合成。

实施例2犬细小病毒的生物条形码检测方法的建立

1、金纳米颗粒的制备

本实施例选择使用直径30nm的金纳米颗粒。采用柠檬酸钠还原法制备金纳米颗粒。

取500mL 0.01％HAuCl4溶液在搅动的情况下加热至沸腾后迅速准确加入7.5mL的1％柠檬酸三钠水溶液，继续加热煮沸15min，整个过程始终用磁力搅拌器进行搅拌；当溶液的颜色渐渐加深，最后为深***，停止加热；将制备好的纳米金用0.45μm的尼龙膜过滤，冷却至室温，放置于4℃避光保存。

2、犬细小病毒多抗的制备

利用纯化的犬细小病毒，所用毒株CPV-2a为本实验室分离并鉴定，免疫新西兰大白兔(购于北京维通利华实验动物技术有限公司)制备抗犬细小病毒多克隆抗体。

每只雄性新西兰大白兔免疫前，都由耳缘静脉取血2mL，静置分离血清，-20℃保存，以作为阴性对照用。首次免疫，每只家兔注射2mL的乳化抗原，于足掌及肘窝***周围，背部两侧、颈下、耳后等处皮下多点注射，对照兔子注射等量生理盐水。2周后以同样的剂量(含等体积弗氏不完全佐剂)加强免疫，背部多点注射，2周后再次加强免疫。10天后进行第3次加强免疫，约10天以后进行末次免疫，直接用2mL乳化抗原静脉注射。每次加强免疫后7～10天从兔耳缘静脉采血2～3mL，用间接ELISA法检测抗体效价，末次免疫后7天即用颈动脉放血法采血，4℃静置过夜，次日4000rpm离心10min，收集上清，分装后-20℃保存。

3、金纳米颗粒-犬细小病毒多抗复合物的制备

分别取1mL的金纳米颗粒和适量的抗犬细小病毒多抗，用0.1mol/L K₂CO₃调节至pH9.0。在搅拌下将金纳米颗粒和抗体混合，10min后再加入一定量的稳定剂为5％BSA，使其最终浓度为1％；或加入1％聚乙二醇(PEG，分子量20kD)至标记物总量的1/10，以防止抗体蛋白和金纳米颗粒的聚合和发生沉淀。

4、NP探针的制备

将实施例1的互补探针NP链(终浓度为2μmol/L)加入被抗犬细小病毒多抗修饰的金纳米颗粒(浓度为4.5nmol/L)中，室温放置16小时；再以磷酸盐缓冲液调整pH至7.0，增强离子浓度至0.1mol/LNaCl，室温放置40小时，10,000g离心30min得到含互补探针NP链修饰的金纳米颗粒；得到的深红色沉淀用0.1M NaCl，10mM PBS(pH7.0)溶液洗涤3次，去除未标记的金纳米颗粒；将实施例1得到的条形码DNA链(终浓度为2μmol/L)加入上述标记有互补探针NP链修饰的金纳米颗粒中，室温杂交4小时，14,000g离心30分钟，得到NP探针。

5、抗犬细小病毒单抗的制备

利用纯化的CPV初次免疫、再次免疫、加强免疫Balb/c小鼠后取脾与SP20细胞融合制备杂交瘤细胞，用重组表达的VP2蛋白包被酶标板，通过有限稀释法克隆筛选阳性细胞株。鉴定的阳性杂交瘤细胞免疫BALB/c小鼠制备抗犬细小病毒单克隆抗体。

采用6-8周雌性Balb/c小鼠，在注射杂交瘤细胞前7天，预先腹腔注射0.5mL灭菌液体石蜡；每只鼠腹腔注射含1～5×10⁶杂交瘤细胞的0.5mL的培养液；当小鼠产生腹水时(1～3周)，腹部穿刺放出腹水(1～5mL)，隔天穿刺直至小鼠死亡；3000rpm离心15min，除去腹水中的细胞；上清无菌储存或加0.01％叠氮钠置于-70℃冰箱保存备用。

6、MMP探针的制备

将100μg单抗溶于20mL PBS中，将其加入到激活的磁珠(Dynabeads M-280磁珠购于Invitrogen公司)中，剧烈振荡，然后将烧瓶置于混合器上反应16～24小时；磁性分离，扔掉上清；在40mL PBS中重悬磁珠；加入20mL淬灭剂(甘氨酸)，剧烈振荡，将其放在混合器上反应30min；磁性分离，扔掉上清；用PBS洗3次，磁性分离；用50mL洗液重悬磁珠，4℃保存。

7、检测探针的制备

将探针NP链(互补探针链与条形码DNA链的杂交组合双链)(终浓度为2μmol/L)加入金纳米颗粒(浓度为4.5nmol/L)中，室温放置16小时；再以磷酸盐调整pH至7.0，增强离子浓度至0.1mol/LNaCl，室温放置40小时，10,000g离心30min得到检测探针；用0.3mol/L NaCl，10mmol/L pH7.0的PBS混悬，离心洗涤两次，最后用一定量的0.3mol/L的PBS溶解，即为检测探针。

8、犬细小病毒荧光定量型生物条形码检测方法的建立

将50μL抗VP2抗原的单抗功能化的磁性微球(5mg/mL)加入10μL已知浓度的VP2蛋白和已知滴度的犬细小病毒中，37℃下剧烈震荡1小时；加上磁场固定MMP探针，用PBS溶液反复冲洗，除去未连结的VP2抗原和不相关的蛋白；加入被双链DNA和抗VP2蛋白的多抗修饰的0.1nmol/L金纳米颗粒探针50μL，剧烈震荡30分钟，形成三明治结构；加上磁场，在用磁铁固定MMPs的同时，用500μL的PBS缓冲液反复冲洗4次，除去未连接的NP探针。

形成三明治结构后，接着加上磁场，在用磁铁固定MMPs的同时，用500μL的PBS缓冲液反复冲洗4次，除去未连接的NP探针；加入50μL超纯水到三明治结构中，60℃剧烈震荡30分钟，使条形码DNA链去杂交。三明治复合物被磁性分离，收集上清液，内含条形码DNA链，用荧光定量PCR进行定性定量检测。

9、条形码DNA链的荧光定量PCR检测

对获得的条形码DNA链进行荧光PCR检测。检测采用SYBRGreen I染料法，所用试剂购于大连宝生物工程有限公司。

反应体系为25μL：

反应条件如下：

引物1：5’-CTTACACTGTTGCTGCTGCC-3’，

引物2：5’-TCCTCTACTTCGGGTGGGAA-3’。

10、数据分析

分析结果时，基线(baseline)和阈值(threshold)可取仪器默认值。一般情况下取前6～15循环的荧光信号为基线。在进行数据分析时，一般需要进行托运设置，把数据纵轴改为线性(图1、图2)。通过对图1及图2的分析，表明建立的方法可以检测100ag/mL的VP2蛋白及10-5TCID₅₀/0.1mL的CPV病毒滴度数，且呈现良好的线性关系。表明建立的方法可用于微量CPV病毒及蛋白的检测。

实施例3犬细小病毒的生物条形码检测方法特异性验证

用建立的检测方法同时检测狂犬病毒(为本实验室保存CTN株)、犬瘟热病毒(本实验室保存制苗毒株)，检测Ct值均大于40，结果均为阴性，CPV检测为阳性，表明本方法与犬其它感染病毒不反应，特异性较好。

实施例4犬细小病毒的生物条形码荧光定量检测试剂盒的制备

将实施例2的步骤4制得的NP探针和步骤6制得的MMP探针，步骤9的引物对共同包装，得到犬细小病毒的生物条形码荧光定量检测试剂盒。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种用于检测犬细小病毒(Canine Parvovirus)的生物条形码，其具有SEQ ID No.1所示的核苷酸序列或其特异性片段。

2.用于扩增权利要求1所述生物条形码的特异性引物，其核苷酸序列为：

引物1：5’-CTTACACTGTTGCTGCTGCC-3’，

引物2：5’-TCCTCTACTTCGGGTGGGAA-3’。

3.与权利要求1所述生物条形码配合使用的互补探针NP链，其核苷酸序列为：

5’-TCCTCTACTTCGGGTGGGAAGTCGGGGTTCA₁₀-(CH₂)₆-SH-3’。

4.一种犬细小病毒的生物条形码检测方法，包括以下步骤，

1)NP探针的制备：用常规方法将金纳米颗粒、抗VP2蛋白的多克隆抗体、权利要求1所述的条形码DNA链和权利要求3所述的互补探针NP链制备NP探针；

2)MMP探针的制备：用磁性微球和抗VP2蛋白的单克隆抗体制备MMP探针；

3)犬细小病毒的生物条形码检测：利用NP探针、MMP探针和犬细小病毒通过抗原、抗体作用制备NP-VP2-MMP三明治复合物，然后在高温低盐条件下，释放条形码DNA链，最后对获得的条形码DNA链进行荧光定量PCR方法检测。

5.如权利要求4所述的生物条形码检测方法，其特征在于，步骤1)所述的金纳米颗粒直径为30nm。

6.如权利要求4所述的生物条形码检测方法，其特征在于，步骤2)所述的磁性微球直径为1μm。

7.如权利要求4-6任一所述的检测方法，其特征在于，所述荧光定量PCR方法所用引物如权利要求2所述。

8.一种犬细小病毒的生物条形码检测试剂盒，包括包被有抗VP2蛋白的单克隆抗体的MMP探针和抗VP2蛋白的多克隆抗体的NP探针。

9.如权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述NP探针连接的条形码DNA链具有SEQ ID No.1所示的核苷酸序列，互补探针NP链具有SEQ ID No.2所示的核苷酸序列。

10.如权利要求9所述的试剂盒，其还包括权利要求2所述的引物。

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