JP2007534745A - 化学療法誘発末梢性ニューロパシーの治療のためのｉｌ６ｒ／ｉｌ６キメラ - Google Patents

Abstract

本発明は、化学療法誘発性ニューロパシーにおけるＩＬ−６Ｒ／ＩＬ−６キメラの使用に関する。

Description

本発明は、化学療法誘発性ニューロパシーの分野にある。とりわけ、本発明は、化学療法誘発性ニューロパシーの治療および／または予防のための、ＩＬ−６Ｒ／ＩＬ−６キメラの使用に関する。

末梢性ニューロパシーは、神経の、またはミエリン鞘の損傷に起因する末梢神経系の疾患の集合である。損傷は長期化し、通常、きっかけの傷より長く続く（outlasting）。
化学療法誘発末梢性ニューロパシー（ＣＩＰＮ）は、多くの細胞毒性薬物のよく知られた、潜在的な身体を不能にする副作用（disabling side effect）である。化学療法誘発性ニューロパシーは、蓄積用量または用量−強度に関係する（Ｖｅｒｓｔａｐｐｅｎら ２００３ Ｄｒｕｇｓ ６３：１５４９−６３）。

ビンカ−アルカロイド類（たとえば、ビンクリスチンおよびビンブラスチン）、白金系化合物類（たとえばシスプラチン）およびタキサン類（パクリタキセルおよびドセタキセル）が、末梢神経毒性を誘導する最も重要な薬物の一群である（Ｖｉｓｏｖｓｋｙ Ｃ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｖｅｓｔ．２００３ Ｊｕｎ；２１（３）：４３９−５１）、Ｑｕａｓｔｈｏｆｆ Ｓ，Ｈａｒｔｕｎｇ ＨＰ Ｊ Ｎｅｕｒｏｌ．２００２ Ｊａｎ；２４９（１）：９−１７．総説）。これらの薬物は、卵巣癌、乳癌、および血液性癌のような、種々の悪性物の治療のために広く使用されている（Ｖｅｒｓｔａｐｐｅｎら ２００３ Ｄｒｕｇｓ ６３（１５）：１５４９）。

ビンクリスチン−駆動ニューロパシーは、主に、運動神経および感覚神経不全（ニューロパシーの混合型）によって特徴付けられる。関与する機構がいまだ完全に理解されてはいないが、最終的に軸索変性を導く、順行性軸索輸送の変化が関与することが記述されてきている。現在までのところ効果的な治療法が開発されてきていないので、ビンクリスチン−駆動ニューロパシーの治療は、現在一時しのぎのみである。

現在、ＣＩＰＮは、用量減少によって緩和されるが、これは、化学療法治療の効果を減少させ得る。糖尿病、遺伝性ニューロパシー、または神経毒性化学療法での早期治療によって、神経因性症状をすでに持つ患者は、ＣＩＰＮの発症をより受けやすいと考えられる。

一般的に、末梢性ニューロパシーの治療は、全身性であり、神経への損傷を根底におく有益な効果はない（Ｐｅｌｔｉｅｒ ＡＣ，Ｒｕｓｓｅｌｌ ＪＷ．Ｒｅｃｅｎｔ ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ ｄｒｕｇ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｎｅｕｒｏｐａｔｈｉｅｓ．Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｎｅｕｒｏｌ．２００２ Ｏｃｔ；１５（５）：６３３−８）。たとえば、ピリドキシン（ビタミンＢ６）は、末梢神経損傷に続く栄養サポートの方法として使用され、抗酸化剤類（たとえば、ガンマ−リノール酸、アルファリポ酸、およびＰＫＣ阻害剤およびアルドース還元酵素阻害剤）が、末梢性ニューロパシーに関与しうる毒素を排除するために使用され、抗けいれん剤が、痛み症状を抑制するために使用される。ビタミンＢ１、ビタミンＢ１２、グルタミン酸（Ｂｏｙｌｅら Ｊ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｅｘｐ Ｔｈｅｒ． １９９６ Ｏｃｔ；２７９（１）：４１０−５）、イソアキソニン（Ｌｅ Ｑｕｅｓｎｅら，Ｊ Ｎｅｕｒｏｌ Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ．１９８５ Ｓｅｐ；４８（９）：９３３−５）、ガングリオシドまたは神経成長因子（Ｈａｙａｋａｗａら，Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ．１９９４；５５（７）：５１９−２５．４；Ｌｅｗｉｓら Ｅｘｐ Ｎｅｕｒｏｌ．１９９３ Ｎｏｖ；１２４（１）：７３−８８．）のような推定される神経保護薬剤を用いる、ビンクリスチン−ニューロパシーを予防する試みは、ある程度の成功を示している。

インターロイキン（ＩＬ）−６は、免疫系に影響を与えるだけでなく、種々の器官内で、他の生物学的システムおよび多くの生理学的事象で役割を果たす、多面的サイトカインである。標的細胞内で、ＩＬ−６は、その受容体複合体、ＩＬ−６Ｒアルファおよびｇｐ１３０を介して、機能的に異なる、または時には正反対のシグナルを、同時に引き起こす。最終的な生理学的結果は、所定のリガンドによって引き起こされた多様なシグナル伝達経路の統合の結果であると考えられ得る。シグナル統合モデルというこのコンセプトは、インビボ環境状態に依存して、ＩＬ−６がどのように、炎症促進または抗炎症効果を顕在化させ得るか、を説明し得る。この論点の下にある分子機構の解明が、さらなる研究のためのやりがいのある主題である（Ｊｏｎｅｓら ２００１，Ｈｅｉｎｒｉｃｈら ２００３ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊｏｕｒｎａｌ ３７４，１−２０）。ＩＬ−６の機能的特性は、非常に幅広く、これは、このサイトカインを記述するために本来使用された専門用語によって反映される（Ｈｏｒｓｔ Ｉｂｅｌｇａｕｆｔｓ’ＣＯＰＥ：Ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ Ｏｎｌｉｎｅ Ｐａｔｈｆｉｎｄｅｒ Ｅｎｃｙｃｌｏｐａｅｄｉａ）。

ＩＬ−６の生物学的活性は、２つの異なるタンパク質、１つがＩＬ−６受容体と呼ばれるもの（Ｊｐｎｅｓら ＦＡＳＥＢ Ｊ．２００１ Ｊａｎ；１５（１）：４３−５８、総説によって概説されたＩＬ−６Ｒまたはｇｐ８０）およびもう１つがｇｐ１３０と呼ばれるもの（Ｈｉｒａｎｏら Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ．１９９４ Ｍａｙ；１２（３）：２６２−７７．総説によって概説された）を含む、膜受容体系によって仲介される。ｇｐ８０の細胞外ドメインに相当する、可溶型ＩＬ−６Ｒ（ｓＩＬ−６Ｒ）は、血液および尿内で糖タンパク質として見出されるヒト体内の天然の産物である（Ｎｏｖｉｃｋら，Ｊ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．１９９０ Ｊｕｎｅ ２７；５１０：３３１−７およびＣｙｔｏｋｉｎｅ．１９９２ Ｊａｎ；４（１）：６−１１）。ｓＩＬ−６Ｒ分子の例外的特性は、これらが、ヒト細胞を含む種々の細胞に、ＩＬ−６の強力なアゴニストとして作用することである（Ｔａｇａら，Ｃｅｌｌ．１９８９ Ａｕｇ １１；５８（３）：５７３−８１．Ｎｏｖｉｃｋら １９９２ Ｊａｎ；４（１）：６−１１）。ｇｐ８０の細胞質内ドメインなしでさえ、ｓＩＬ−６Ｒは、ＩＬ−６に応答してｇｐ１３０の二量体化を引き起こすことができ、言い換えれば、続くＩＬ−６−特異的シグナル伝達および生物学的効果を仲介する（Ｍｕｒａｋａｍｉ Ｓｃｉｅｎｃｅ．１９９３ Ｊｕｎ １８；２６０（５１１５）：１８０８−１０）。ｓＩＬ−６Ｒは、ｇｐ１３０との二種類の相互作用を有し、その両方がＩＬ−６特異的生物学的活性に必須である（Ｈａｌｉｍｉら，Ｅｕｒ Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ｎｅｔｗ．１９９５ Ｍａｙ−Ｊｕｎ；６（３）：１３５−４３）、活性ＩＬ−６受容体複合体が、２つのｇｐ１３０鎖、２つのＩＬ−６Ｒおよび２つのＩＬ−６リガンドによって形成される六量体構造であることが提案された（Ｗａｒｄら，１９９４；Ｐａｏｎｅｓｓａら，ＥＭＢＯ Ｊ．１９９５ Ｍａｙ １；１４（９）：１９４２−５１）。

限定的細胞分布を有する同起源ＩＬ−６Ｒの発現（Ｊｏｎｅｓら ２００１により概説される）とは異なり、膜貫通全ｇｐ１３０の発現は、心臓、腎臓、脾臓、肝臓、肺、胎盤および脳などのほとんどすべての器官で見られる（Ｓａｉｔｏら Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９２ Ｊｕｎ １５；１４８（１２）：４０６６−７１）。

インビトロにおいて、可溶性ＩＬ−６Ｒが投与されない限り、ＩＬ−６単独では特定の活性を誘導しないことを示す、多くの異なる実例が存在する。たとえば、ＩＬ−６は、ｓＩＬ−６Ｒと組み合わせた場合のみ、マウス骨髄および骨芽細胞の共培養中で、骨芽細胞形成を誘導する（Ｊｏｎｅｓら ２００１により概説される）。また、多くの神経細胞がＩＬ−６を産生可能であるが、これらは、ＩＬ−６自身による刺激に対して応答しない。しかしながら、神経細胞の分化および生存は、ｓＩＬ−６Ｒの作用を介して仲介され得る（Ｈｉｒｏｔａ Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ．１９９６ Ｊｕｎ １；１８３（６）：２６２７−３４．Ｍａｒｔｚ １９９８）。

健常被験者におけるｓＩＬ−６Ｒ（アンタゴニスト）の循環濃度は、比較的高く、ＩＬ−６の天然アンタゴニストである、可溶性ｇｐ１３０の濃度、１０ｎｇ／ｍｌ以上に匹敵する（Ｃｏｒｂｉら ２０００ Ｅｕｒ Ｊ Ｃａｒｄｉｏｔｈｅｒａｃ Ｓｕｒｇ．１８（１）：９８−１０３，Ｄｉｓｔｈａｂａｎｃｈｏｎｇら Ｃｌｉｎ Ｎｅｐｈｒｏｌ．２００２ Ｏｃｔ；５８（４）：２８９−９５）。反対に、ＩＬ−６の循環濃度は、およそ１０ｐｇ／ｍｌまたはそれ以下である（Ｋａｄｏら １９９９ Ａｃｔａ Ｄｉａｂｅｔｏｌ．Ｊｕｎ ３６（１−２）６７−７２、Ｃｏｒｂｉら ２０００．）。したがって、疾患におけるｓＩＬ−６Ｒとの同時投与なしでの、インビボでのＩＬ−６の単独投与の効果は、有効かもしれないし、有効でないかもしれず、特定の疾患、および体内の特定の場所における、可溶性アゴニスト／アンタゴニストの濃度に依存する。

可溶性ＩＬ−６受容体とＩＬ−６とを一緒に連結するキメラ分子が記述された（Ｃｈｅｂａｔｈら Ｅｕｒ Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ｎｅｔｗ．１９９７ Ｄｅｃ；８（４）：３５９−６５）。これらは、ＩＬ−６Ｒ／ＩＬ−６キメラと名付けられた。キメラＩＬ−６Ｒ／ＩＬ−６分子は、可溶性ＩＬ−６受容体（ｓＩＬ−６Ｒ）およびＩＬ−６をコードしているｃＤＮＡｓの全コード領域を融合することによって産出された。組換えＩＬ−６Ｒ／ＩＬ−６キメラは、ＣＨＯ細胞内で産生された（Ｃｈｅｂａｔｈら，Ｅｕｒ Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ｎｅｔｗ．１９９７，国際公開第９９／０２５５２号パンフレット）。ＩＬ−６Ｒ／ＩＬ−６は、ｓＩＬ−６ＲとＩＬ−６の混合物で行なうよりも、インビトロにおいてｇｐ１３０鎖により高い効率で結合する（Ｋｏｌｌｅｔら，Ｂｌｏｏｄ．１９９９ Ａｕｇ １；９４（３）：９２３−３１）。

ＭＢＰおよびＰ０タンパク質は、通常はシュワン細胞の最終出生後成熟のあいだに誘導され、神経変性中に再誘導される。ＩＬ−６Ｒ／ＩＬ−６キメラは、１４日齢マウス胎児由来の後根神経節（ＤＲＧ）の培養中の、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）およびＰ０遺伝子産物ＭＢＰおよびＰ０ ＲＮＡｓおよびタンパク質の発現を誘導することが示されている（ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．１９９９ Ａｕｇ ２７；４５７（２）：２００−４．ｅｔ ａｌ．，１９９９）。さらに、ＭＢＰおよびＰ０の発現は、神経堤起原の培養腫瘍細胞中でも、ＩＬ６Ｒ／ＩＬ６キメラによって誘導されることがわかった。正常な胚シュワン細胞前駆体中、および神経堤起原の腫瘍細胞中のどちらの場合でも、ＩＬ６Ｒ／ＩＬ６キメラによるＭＢＰおよびＰ０遺伝子の誘導は、Ｐａｘ−３のダウン−レギュレーションを伴う（Ｋａｍａｒａｊｕら ＪＢＣ ２００２ ２７７ １５１３２，Ｓｌｕｔｓｋｙら Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２００３ Ｍａｒ １４；２７８（１１）：８９６０−８，Ｈａｇｇｉａｇら，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｒｅｓ．２００１）。

インビボでの髄鞘形成における、ｇｐ１３０アクチベーターＩＬ６Ｒ／ＩＬ６の促進効果が、座骨神経横断面のラットモデルにおいて示された。ＩＬ６Ｒ／ＩＬ６の注射により、再生神経における有髄線維の数が７倍増加した（Ｈａｇｇｉａｇら，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｒｅｓ．２００１）。

糖尿病−誘発末梢性ニューロパシーの動物モデルにおける、可溶性ＩＬ−６Ｒなしでの、組換えＩＬ−６単独の治療効果は、特許出願、国際公開第０３０３３０１５号パンフレットにて開示されている。しかしながら、ＩＬ６Ｒ／ＩＬ６キメラ単独、またはＩＬ−６単独もしくはｓＩＬ−６Ｒと一緒のＩＬ−６が化学療法によって引き起こされる末梢性ニューロパシーおいて、有益な効果を有するかどうかは明らかでない。事実、他のｇｐ１３０アクチベーターである組換え白血病阻害因子（ＬＩＦ）は、カルボプラチン／パクリタキセルによって引き起こされる末梢性ニューロパシーの予防について臨床試験にて試験され（Ｄａｖｉｓら Ｐｒｏｃ Ａｍ Ｓｏｃ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ ２２：ページ７４０、２００３，要約２９７６）、結果により、ＬＩＦは試験した用量およびレジメにて、ＣＩＰＮを予防することにおいて有効でないことが指摘された。

したがって、化学療法薬剤によって引き起こされる末梢性ニューロパシーを予防する／治療するための、新規の薬物／戦略が必要である。

本発明は、化学療法−誘発末梢性ニューロパシー（ＣＩＰＮ）の予防および／または治療のための医薬の製造における、ＩＬ−６Ｒ／ＩＬ−６キメラ、そのムテイン、アイソフォーム、融合タンパク質、機能性誘導体、円順列誘導体または塩の使用に関する。

本発明は、シスプラチン、ジカルバジン、ストレプトゾシン、シクロホスファミド、カルムスチン、ロムスチン、プロカルバジン、マイトマイシン、シタラビン、メトトレキサート、５−フルオロウラシル、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ブレオマイシン、パクリタキセル、アスパラギナーゼ、ブスルファン、カルボプラチン、ダカルバジン、フルダラビン、ヒドロキシウレア、イフォスファミド、メルカプトプリン、ミトタン、ストレプトゾシン、タキソールなどの化学療法薬剤、またはこれらの２つ以上の薬剤の混合物によって、好ましくはビンクリスチンによって誘発されるＣＩＰＮにおける、本発明のＩＬ６Ｒ／ＩＬ６キメラの使用を提供する。

本発明の１つの側面において、ＩＬ６Ｒ／ＩＬ６キメラは、１つ以上の部位でグルコシル化されていても、またはグルコシル化されていなくてもよく、および／またはその機能性誘導体は、１つ以上の官能基に連結した、ポリエチレン部分のような、少なくとも１つの部分を有し得る。

さらに、本発明は、ＣＩＰＮの治療および／または予防のための医薬の製造において使用される、ＩＬ６Ｒ／ＩＬ６キメラを発現する細胞を提供する。

また、本発明は、ＣＩＰＮの治療および／または予防のための医薬の製造において使用される、ＩＬ６Ｒ／ＩＬ６キメラの発現用ベクター、好ましくはレンチウイルスベクターを提供する。

１つの実施様態において、本発明は、ＣＩＰＮの治療および／または予防方法であって、それを必要としている患者に、任意には薬学的に許容され得る担体と一緒に、ＩＬ６Ｒ／ＩＬ６キメラ、またはそのムテイン、アイソフォーム、融合タンパク質、機能性誘導体、円順列誘導体または塩を投与することを含む方法を提供する。

１つの側面において、本発明による、必要としている患者は、糖尿病、ＡＩＤＳ、遺伝的ニューロパシーを患っている患者、および神経毒性薬物での早期治療を受けた患者のような高リスク患者であり得る。

他の側面において、本発明によるＩＬ６Ｒ／ＩＬ６キメラの投与は、肝臓内、皮内、足底内、経皮、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、経口、硬膜外、局所および鼻腔内経路であり得る。

さらに、本発明は、患者における化学療法薬剤の用量を増加させるまたは延長させる方法であって、それを必要としている患者に、任意に薬理学的に許容可能な担体と一緒に、ＩＬ６Ｒ／ＩＬ６キメラ、またはそのムテイン、アイソフォーム、融合タンパク質、機能性誘導体、円順列誘導体または塩を投与することを含む方法。

本発明のもう１つの観点において、ＩＬ６Ｒ／ＩＬ６キメラは、化学療法薬剤の前、あいだおよび／または後のいずれかで投与される。

さらに、本発明は、ＩＬ６Ｒ／ＩＬ６キメラ、またはそのムテイン、アイソフォーム、融合タンパク質、または機能性誘導体と、１つの化学療法薬剤またはその２つ以上の薬剤の混合物との組み合わせを含む医薬組成物を提供する。

本発明による化学療法薬剤は、シスプラチン、ジカルバジン、ストレプトゾシン、シクロホスファミド、カルムスチン、ロムスチン、プロカルバジン、マイトマイシン、シタラビン、メトトレキサート、５−フルオロウラシル、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ブレオマイシン、パクリタキセル、アスパラギナーゼ、ブスルファン、カルボプラチン、ダカルバジン、フルダラビン、ヒドロキシウレア、イフォスファミド、メルカプトプリン、ミトタン、ストレプトゾシン、タキソール、およびまたはこれらの２つ以上の薬剤の混合物、および好ましくはビンクリスチンを含み得る。

本発明の１つの実施様態において、医薬組成物には、抗酸化剤、ＰＫＣ阻害剤および神経保護薬剤などの追加薬物、好ましくは、グルタミン酸、ピリドキシン、ガンマ−リノール酸、ビタミンＢ１、ビタミンＢ２、イソアキソニン、ガングリオシドおよびＮＧＦがさらに含まれ得る。

本発明は、化学療法誘発末梢性ニューロパシー（ＣＩＰＮ）の予防のための医薬の製造のための、ＩＬ−６Ｒ／ＩＬ−６キメラ、そのムテイン、アイソフォーム、融合タンパク質、機能性誘導体、円順列誘導体または塩の使用に関する。

現在、末梢性ニューロパシーの治療は全身性であり、神経への損傷を根底におく有益な効果はない。典型的には、ＣＩＰＮは、用量減少によって緩和されるが、これは、化学療法治療の効果を減少させ得る。

したがって、本発明は、実質的な前進、すなわち、ＩＬ−６Ｒ／ＩＬ−６キメラが化学療法−誘発損傷発症を予防するために、化学療法薬剤と一緒に使用可能であるということを提示する。さらに、化学療法−誘発損傷の発症後にインビトロで投与されたＩＬ６Ｒ／ＩＬ６キメラが、神経組織を回復できたことが示された。

したがって、本発明は、ＩＬ−６Ｒ／ＩＬ−６キメラの投与による、ビンカ−アルカロイド類（たとえば、ビンクリスチンおよびビンブラスチン）、白金系化合物類（たとえばシスプラチン）、およびタキサン類（パクリタキセルおよびドセタキセル）、またはそれらの１つ以上の薬剤の組み合わせから選択される、広範囲の化学療法薬剤により引き起こされるＣＩＰＮの治療および／または予防に関する。

本発明は、ビンクリスチンとＩＬ６Ｒ／ＩＬ６キメラとの同時投与が、インビトロでのビンクリスチンによる軸索変性の誘導の予防に非常に効果的であった、という発見に基づいている。

たとえば、神経のアウトグロースが、神経成長因子（Nerver Growth Factor）（ＮＧＦ）の添加によって、マウス胚（Ｅ１７日）由来の後根神経節（ＤＲＧ）の培養物において刺激された。続いて、培養物をビンクリスチンに暴露し、これにより、カスパーゼ−３活性化により進行性軸索変性を誘導する。ビンクリスチン処理の２日後、ＤＲＧ神経アウトグロースにおけるカスパーゼ−３活性化および相当の軸索の欠損が観察された（図１、パネルＢ対ＡおよびＤ）。しかしながら、意外にも、ＩＬ−６Ｒ／ＩＬ−６がビンクリスチン処理中に存在した場合、カスパーゼ−３活性化が実質的に存在しなかった（図１、パネルＥ対Ｄ）。ＩＬ−６Ｒ／ＩＬ−６が、軸索変性を予防したことも観察された（図１、パネルＣ対Ｂ）。

本発明は、ＩＬ６Ｒ／ＩＬ６キメラでの処理が、ビンクリスチンによる神経損傷がすでに確立された後に加えた場合でさえも、神経組織を効果的に回復させたという発見にも基づく。

たとえば、軸索ネットワークが５日間のＮＧＦの存在下で形成されたＩＬ−６欠損マウス（ＩＬ−６−／−）由来のＥ１８．５胚のＤＲＧ培養を、ＩＬ−６Ｒ／ＩＬ−６の存在下または非存在下でさらに１１日間続ける（図２、それぞれパネルＡおよびＢ）か、またはビンクリスチンによって４日間処理し、ビンクリスチンを除去し、６日以上培養を続けた（図２、パネルＣ〜Ｆ）。軸索ネットワークの広範囲の変性は、ビンクリスチンを除いた６日後になお存在したことが観察された（図２、パネルＣ）が、ＩＬ−６Ｒ／ＩＬ−６を、ビンクリスチン除去後に加えた場合、軸索の有意な再増殖が観察された（図２、パネルＤ）。グリア線維酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）に関して免疫染色した平行培養物において、ＩＬ−６Ｒ／ＩＬ−６の添加が、ビンクリスチン除去６日後の対照培養物（図２、パネルＥ）と比較して、グリア細胞の明らかな再増殖が引き起こしたことが見られた（図２、パネルＦ）。

いくつかの同様の実験において、ＩＬ−６Ｒ／ＩＬ−６の治療効果が、ＩＬ−６＋／＋マウス由来のＤＲＧ培養物においてみられ、ＩＬ−６Ｒ／ＩＬ−６添加２日後にすでに現れた（示していない）。

要するに、得られた結果は、明白に、ＣＩＰＮにおけるＩＬ６Ｒ／ＩＬ６の予防的および／または治癒力のある治療価値を示している。

本発明によるＩＬ−６Ｒ／ＩＬ−６キメラ、そのムテイン、アイソフォーム、融合タンパク質、機能性誘導体、円順列誘導体または塩は、たとえば、グルコシル化されていなくてもよく、または１つ以上の部位でグルコシル化されていてもよい。

好ましい実施様態において、機能性誘導体は、アミノ酸残基上の１つ以上の側鎖に存在する１つ以上の官能基に連結した、ポリエチレン部分のような、少なくとも１つの部分を含み得る。

他の実施様態において、本発明によるＩＬ−６Ｒ／ＩＬ−６キメラは、ＩＬ−６Ｒ／ＩＬ−６キメラ、またはそのムテイン、アイソフォーム、融合タンパク質、機能性誘導体、または円順列誘導体を発現する細胞によって、またはＩＬ−６Ｒ／ＩＬ−６キメラ、またはそのムテイン、アイソフォーム、融合タンパク質、機能性誘導体、または円順列誘導体をコードする配列を含む発現ベクターによって投与されてよい。好ましい実施様態において、ベクターはレンチベクターである。

本発明はまた、ＣＩＰＮの治療および／または予防方法であって、それを必要とする患者に、任意には薬学的に許容され得る担体と一緒に、ＩＬ−６Ｒ／ＩＬ−６キメラ、またはそのムテイン、アイソフォーム、融合タンパク質、機能性誘導体、円順列誘導体または塩を投与することを含む方法にも関する。

好ましい実施様態において、治療を必要とする患者は、すでに長期間、糖尿病を患っている患者、ＡＩＤＳによる神経因性症状がすでにある患者、遺伝的ニューロパシーを患っている患者、または神経毒性化学療法による早期治療を受けた患者などのような、高リスク患者である。

本発明は、化学療法薬剤の前、後またはあいだに、任意には薬学的に許容され得る担体と一緒に、ＩＬ−６Ｒ／ＩＬ６キメラ、またはそのムテイン、アイソフォーム、融合タンパク質、機能性誘導体、円順列誘導体または塩を投与することを含む、それを必要としている患者への、化学療法薬剤の用量を増加させるための方法にも関する。本発明による化学療法薬剤は、シスプラチン、ジカルバジン、ストレプトゾシン、シクロホスファミド、カルムスチン、ロムスチン、プロカルバジン、マイトマイシン、シタラビン、メトトレキサート、５−フルオロウラシル、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ブレオマイシン、パクリタキセル、アスパラギナーゼ、ブスルファン、カルボプラチン、ダカルバジン、フルダラビン、ヒドロキシウレア、イフォスファミド、メルカプトプリン、ミトタン、ストレプトゾシン、タキソールなどの薬剤、およびまたはこれらの２つ以上の薬剤の混合物から選択し得る。

さらに、本発明は、ＩＬ−６Ｒ／ＩＬ６キメラ、またはそのアイソフォーム、ムテイン、融合タンパク質、機能性誘導体または断片と、化学療法薬剤との組み合わせを含む医薬組成物に関する。より具体的には、本発明による医薬組成物において、化学療法薬剤は、シスプラチン、ジカルバジン、ストレプトゾシン、シクロホスファミド、カルムスチン、ロムスチン、プロカルバジン、マイトマイシン、シタラビン、メトトレキサート、５−フルオロウラシル、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ブレオマイシン、パクリタキセル、アスパラギナーゼ、ブスルファン、カルボプラチン、ダカルバジン、フルダラビン、ヒドロキシウレア、イフォスファミド、メルカプトプリン、ミトタン、ストレプトゾシン、タキソール、およびまたはこれらの２つ以上の薬剤の混合物から選択される。

１つの実施様態において、好ましい化学療法薬剤はビンクリスチンであった。

より好ましい実施様態において、医薬組成物はさらに、たとえばピリドキシン（ビタミンＢ６）、抗酸化剤（たとえば、ガンマ−リノール酸、アルファリポ酸、ＰＫＣ阻害剤およびアルドース還元酵素阻害剤、痛み症状を抑制するために使用する抗けいれん剤、ビタミンＢ１、ビタミンＢ１２、グルタミン酸（Ｂｏｙｌｅら，１９９６）、イソアキソニン（Ｌｅ Ｑｕｅｓｎｅら，１９８５）、ガングリオシドまたは神経成長因子などの神経保護剤のような追加薬物を含む。

本明細書で使用するところの「ＩＬ−６Ｒ／ＩＬ−６キメラ」（「ＩＬ−６Ｒ／ＩＬ−６」または「ＩＬ−６キメラ」とも呼ぶ）は、インターロイキン−６のすべてまたは生物学的に活性な画分に融合したｇｐ１３０の可溶性部分を含むキメラ分子である。キメラタンパク質の部分は、互いに直接融合可能であるか、またはジスルフィド架橋またはポリペプチドリンカーのような任意の好適なリンカーによって連結可能である。リンカーは、長さにして、１〜３アミノ酸残基程度、または長さにして１３または１８アミノ酸残基のより長い、短いリンカーペプチドでありうる。前記リンカーは、可溶性ＩＬ−６レセプターｇｐ１３０のアミノ酸配列とＩＬ−６配列とのあいだに導入される、たとえば配列Ｅ−Ｆ−Ｍ（Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ｍｅｔ）のトリペプチド、またはＧｌｕ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ｐｈｅ−Ｍｅｔを含む１３−アミノ酸リンカー配列であり得る。ＩＬ−６Ｒ／ＩＬ−６キメラの例は、本技術分野で公知であり、たとえば、国際公開第９９／０２５５２号パンフレットまたは同第９７／３２８９１号パンフレットに詳細に記述されてきている。

本明細書で使用するところの語句「治療する（treating）／治癒する（curing）、および予防する」は、化学療法ニューロパシーの１つ以上の症状または原因ならびに化学療法ニューロパシーに伴う症状、疾患または合併症を予防し、阻害し、和らげ、改善しまたは反転することとして理解すべきである。化学療法ニューロパシーを「治療する／治癒する」場合、本発明による物質は、疾患の発症後に与えられ、「予防」は、疾患の兆候が患者で見られ得る前の、物質の投与に関する。

語句「化学療法ニューロパシー」は、任意の形態の化学療法ニューロパシー、または化学療法ニューロパシーに付随するまたは引き起こされる１つ以上の症状または障害、または前記導入部において詳細に記述されたような、神経に影響を与える化学療法の合併症に関する。

語句「用量」は、特定の量の医薬のような、一度に投与される量に関する。

語句「投与量」は、用量のサイズ、頻度および回数の決定および調節に関する。

本明細書で使用するところの語句「ムテイン（muteins）」は、天然に存在するＩＬ６Ｒ／ＩＬ６キメラの成分の１つ以上のアミノ酸残基が、本来のＩＬ６Ｒ／ＩＬ６キメラと比較して得られた産物の活性を著しく変化することなく、異なるアミノ酸残基によって置換されるか、または欠損するか、または１つ以上のアミノ酸残基が本来のＩＬ６Ｒ／ＩＬ６キメラの配列に加えられる、ＩＬ６Ｒ／ＩＬ６キメラの類似体を意味する。これらのムテインは、公知の合成によって、および／または部位特異的変異導入技術によって、または適切な他の任意の公知の技術によって製造される。

本発明によるムテインには、ストリンジェントな条件下で、ＩＬ６Ｒ／ＩＬ６キメラをコードするＤＮＡまたはＲＮＡにハイブリダイズする、ＤＮＡまたはＲＮＡのような核酸によってコードされるタンパク質が含まれる。語句「ストリンジェントな条件」は、当業者が「ストリンジェント」として従来言及した、ハイブリダイゼーションと、それに続く洗浄条件を意味する。Ａｕｓｕｂｅｌら，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、上記、Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎ．Ｙ．，§§６．３および６．４（１９８７，１９９２）、およびＳａｍｂｒｏｏｋら（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．Ｃ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．，ａｎｄ Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ）を参照のこと。

限定はせずに、ストリンジェントな条件の例としては、試験下のハイブリッドの計算Ｔｍより１２〜２０℃低い洗浄条件、たとえば、２×ＳＳＣおよび０．５％ ＳＤＳ ５分間、２×ＳＳＣおよび０．１％ ＳＤＳ １５分間、０．１×ＳＳＣおよび０．５％ ＳＤＳ ３７℃にて３０〜６０分間、ついで、０．１×ＳＳＣおよび０．５％ ＳＤＳ ６８℃にて３０〜６０分間が含まれる。当業者は、ストリンジェントな条件がまた、ＤＮＡ配列の長さ、オリゴヌクレオチドプローブ（１０〜４０塩基など）、または混合オリゴヌクレオチドプローブに依存することを理解する。混合プローブを使用する場合、ＳＳＣのかわりに、塩化テトラメチルアンモニウム（ＴＭＡＣ）を使用することが好ましい。Ａｕｓｕｂｅｌ 上記を参照のこと。

そのような任意のムテインは好ましくは、ＩＬ６Ｒ／ＩＬ６キメラと実質的に同様の、またはよりよい活性を有するような、ＩＬ６Ｒ／ＩＬ６キメラのアミノ酸配列の十分に複製であるアミノ酸配列を有する。

ＩＬ６Ｒ／ＩＬ６キメラの特徴的な活性は、ｇｐ１３０への結合能力である。ムテインが、実質的にｇｐ１３０部位に結合可能である限り、実質的にＩＬ６Ｒ／ＩＬ６キメラと同様の活性を有するとみなすことができる。したがって、任意の所定のムテインがＩＬ６Ｒ／ＩＬ６キメラと少なくとも同等の活性を有するかどうかは、肝細胞にそのようなムテインを作用させ、肝細胞の増殖を誘導するかどうかを、たとえばＢｒｄＵまたは標識化メチオニンの取り込みを測定するか、または単に、未処理対照細胞およびＷＴ ＩＬ６Ｒ／ＩＬ６キメラにて処理した細胞と比較して細胞の数を計測するかによって決定することを含む決まりきった実験によって決定することができる。ＩＬ−６Ｒ／ＩＬ−６キメラのｇｐ１３０への結合を測定するための、ＥＬＩＳＡ型のアッセイが、国際公開第９９／０２５５２号パンフレットの３９頁、実施例７にて詳細に記述されている。

マイクロタイター９６−ウェルプレート（ヌンク（Nunc））を、抗−ヒトｇｐ１３０モノクローナル抗体でコートし、５０ｎｇ／ｍｌのｇｐ１３０を加える（両方ともＲ＆Ｄシステムズ、ミネアポリスより入手）。リン酸緩衝食塩水中での洗浄の後、ＩＬ６Ｒ／ＩＬ６キメラを、異なるウェルに、０．１〜５０ｎｇ／ｍｌの範囲の異なる濃度で加える。４０℃で一晩インキュベーションした後、ウサギポリクローナル抗−ＩＬ−６Ｒ（Ｏｈら，Ｃｙｔｏｋｉｎｅ，８，４０１−４０９，１９９６）を加え、続いて、ホースラディッシュ ペルオキシダーゼ共役ヤギ抗ウサギＩｇを加え、発色反応によって検出する（シグマ（Sigma）、セントルイス）。

変異体が、ｇｐ１３０への実質的な結合活性を有する限り、実質的にＩＬ６Ｒ／ＩＬ６と類似の活性を有するとみなすことができる。

したがって、任意の所定の変異体が、少なくとも実質的に、ＩＬ６Ｒ／ＩＬ６キメラと同一の活性を有するかどうかは、そのような変異体を、たとえば国際公開第９９／０２５５２号パンフレットの実施例７で記述されたような、単純サンドイッチ結合アッセイにかけ、固定化ｇｐ１３０または可溶性ｇｐ１３０（ｇｐ１３０の細胞外断片）に結合するかしないかを決定することを含む、決まりきった実験によって決定することができる。

好ましい実施様態において、任意のそのようなムテインは、成熟ＩＬ−６Ｒ／ＩＬ−６キメラの配列と、少なくとも４０％の同一性または相同性を有する。より好ましくは、任意のそのようなムテインは、成熟ＩＬ−６Ｒ／ＩＬ−６キメラの配列に少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、最も好ましくは少なくとも９０％の同一性または相同性を有する。

同一性は、配列を比較することによって決定される、２つ以上のポリペプチド配列間、または２つ以上のポリヌクレオチド配列間の関係を反映する。一般的に、同一性は、比較している配列の長さにわたって、２つのポリヌクレオチドまたは２つのポリペプチドの、それぞれ、ヌクレオチドに対するヌクレオチドの、またはアミノ酸に対するアミノ酸の正確な対応関係を意味する。

実際、正確な対応関係が存在しない配列に関して、「％同一性」が決定され得る。一般的に、比較されるべき２つの配列を、配列間の最大の相関が得られるように並べる。これには、アライメントの程度を高めるために、いずれか１つまたは両方の配列に、「ギャップ」を挿入することが含まれ得る。％同一性は、比較されている各配列の全長にわたって決定されてもよく（いわゆるグローバルアライメント）（これはとりわけ、同一または非常に類似の長さの配列により適している）、またはより短い、定義された長さにわたって決定されてもよい（いわゆるローカルアライメント）（これは等しくない長さの配列に対してより適している）。

２つ以上の配列の同一性および相同性を比較するための方法は、本技術分野でよく知られている。したがって、たとえば、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐａｃｋａｇｅ，バージョン９．１（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ Ｊら １９８４）にて使用可能なプログラム、たとえば、プログラムＢＥＳＴＦＩＴおよびＧＡＰを、２つのポリヌクレオチド配列間の％同一性、および２つのポリペプチド配列間の％同一性および％相同性を決定するために使用し得る。ＢＥＳＴＦＩＴは、Smith および Waterman(1981)の「ローカル相同性」アルゴリズムを使用し、２つの配列間の類似性の最もよい単一領域を発見する。配列間の同一性および／または類似性を決定するための他のプログラムも、本技術分野で公知であり、たとえば、ＢＬＡＳＴプログラムファミリー（Ａｌｔｓｃｈｕｌ Ｓ Ｆら，１９９０， Ａｌｔｓｃｈｕｌ Ｓ Ｆら，１９９７、ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖにてＮＣＢＩのホームページよりアクセス可能）、およびＦＡＳＴＡ（Ｐｅａｒｓｏｎ Ｗ Ｒ，１９９０；Ｐｅａｒｓｏｎ １９８８）があげられる。

本発明により使用可能であるＩＬ６Ｒ／ＩＬ６キメラのムテイン、またはそれをコードする核酸には、過度の実験をすることなく、本明細書で提示される教示およびガイドラインに基づいて、当業者によって通常得られ得る、置換ペプチドまたはポリヌクレオチドのような、実質的に対応する配列の限定された組が含まれる。

本発明により、ムテインに対する好ましい変化は、「保存的（conservative）」置換として知られるものである。ＩＬ６Ｒ／ＩＬ６キメラの保存的アミノ酸置換には、充分に類似した物理化学的特性を有し、かつ群のメンバー間での置換が分子の生物学的機能を保存している一群内の同義アミノ酸が含まれ得る（Ｇｒａｎｔｈａｍ，１９７４）。特に、挿入または欠失が数個のアミノ酸（たとえば３０個未満、好ましくは１０個未満）のみを伴い、かつ機能的コンホメーションに必須のアミノ酸（たとえば、システイン残基）が除去または置換されない場合、アミノ酸の挿入および欠失もまた、その機能を改変することなく前記規定配列において行なわれ得ることは明白である。かかる欠失および／または挿入によって生じるタンパク質およびムテインは、本発明の範囲に含まれる。

好ましくは、同義アミノ酸群は表Ａに規定されるものである。より好ましくは、同義アミノ酸群は表Ｂに規定されるものであり、最も好ましくは、同義アミノ酸群は表Ｃに規定されるものである。

本発明における使用のため、ＩＬ−６ポリペプチドのムテインを得るのに使用され得るタンパク質内でのアミノ酸置換の生成の例としては、任意の公知の方法の工程（たとえば、Ｍａｒｋらの米国特許第４，９５９，３１４号、同第４，５８８，５８５号および同第４，７３７，４６２号；Ｋｏｔｈｓらの同第５，１１６，９４３号、Ｎａｍｅｎらの同第４，９６５，１９５号；Ｃｈｏｎｇらの同第４，８７９，１１１号；およびＬｅｅらの同第５，０１７，６９１号に示されるものなど）ならびに米国特許第４，９０４，５８４号（Ｓｈａｗら）に示されたリジン置換タンパク質が挙げられる。

用語「融合タンパク質」は、ＩＬ−６Ｒ／ＩＬ−６キメラ、またはそのムテインもしくは断片を、別のタンパク質と融合された状態で含有するポリペプチドをいい、これは、体液中で長期の滞留時間を有する。ＩＬ−６Ｒ／ＩＬ−６キメラは、したがって、別のタンパク質、ポリペプチドなど（たとえば、免疫グロブリンまたはその断片）と融合されていてもよい。

本明細書で使用するところの「機能性誘導体」は、残基の側鎖またはＮまたはＣ末端基として存在する官能基から、当該技術分野において公知の手段により調製され得る、ＩＬ−６Ｒ／ＩＬ−６キメラの誘導体ならびにそのムテインおよび融合タンパク質を包含し、薬学的に許容され得る状態を維持している（すなわち、ＩＬ−６Ｒ／ＩＬ−６キメラの活性に実質的に類似したタンパク質の活性を破壊せず、かつこれを含有する組成物に対して毒性を付与しない）限り、本発明に含まれる。

このような誘導体としては、たとえば、ポリエチレングリコール側鎖が挙げられ得、これは、抗原性部位をマスクし、体液中でのＩＬ−６Ｒ／ＩＬ−６キメラの滞留時間を延長し得る。他の誘導体としては、カルボキシル基の脂肪族エステル、アンモニアもしくは第一級または第二級アミンとの反応によるカルボキシル基のアミド、アシル部分と形成されるアミノ酸残基の遊離アミノ基のＮ−アシル誘導体（たとえば、アルカノイルまたは炭素環式アロイル基）またはアシル部分と形成される遊離ヒドロキシル基のＯ−アシル誘導体（たとえば、セリル残基もしくはスレオニル残基のもの）があげられる。

本明細書において、用語「塩」は、ＩＬ−６Ｒ／ＩＬ−６キメラ分子またはそのアナログのカルボキシル基の塩およびアミノ基の酸付加塩の両方をいう。カルボキシル基の塩は、当該技術分野において公知の手段により形成され得、無機塩（たとえば、ナトリウム、カルシウム、アンモニウム、鉄または亜鉛の塩など）、および有機塩基との塩（たとえば、トリエタノールアミンなどのアミン、アルギニンまたはリジン、ピペラジン、プロカインなどと形成されるものなど）があげられる。酸付加塩としては、たとえば、無機酸（たとえば、塩酸または硫酸など）との塩および有機酸（たとえば、酢酸またはシュウ酸など）との塩があげられる。もちろん、任意のかかる塩は、ＩＬ−６Ｒ／ＩＬ−６キメラの生物学的活性（たとえば、ＣＩＰＮの予防または軽減および／またはｇＰ１３０への結合能力）を維持していなければならない。

ＩＬ−６Ｒ／ＩＬ−６キメラの「アイソフォーム」は、ｇｐ１３０に結合することができるタンパク質、または選択的スプライシングによって生成し得るその断片である。

用語「円順列誘導体」は、本明細書で使用する場合、末端同士を直接またはリンカーを介してのいずれかで互いに結合して環状分子を作製し、次いで該環状分子を別の位置で開裂して末端が元の分子の末端と異なる新たな線状分子が作製された線状分子をいう。円順列誘導体のものとしては、その構造が、環化した後開裂された分子と等価である分子が挙げられる。したがって、円順列誘導体分子は、線状分子として最初から合成され、環化工程および開裂工程を経ないものであってもよい。円順列誘導体の製造は、国際公開第９５／２７７３２号パンフレットに記載されている。

ＩＬ−６キメラは、Ｃｈｅｂａｔｈら（Ｅｕｒ Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ｎｅｔｗ．１９９７ Ｄｅｃ；８（４）：３５９−６５，１９９７）によって記述されたもの、Ｆｉｓｃｈｅｒら（Ｆｉｓｃｈｅｒら、Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９９７ Ｆｅｂ；１５（２）：１４２−５．）による、ハイパー−インターロイキン−６、およびＥｋｉｄａ Ｔｅｉｊｉ，Ｉｄｅ Ｔｅｒｕｈｉｋｏ（国際公開第０００１７３１号パンフレット）による、ＩＬ−６−レセプターのＩＬ−６への直接結合を有する融合タンパク質から選択され得る。

本発明の好ましい実施様態において、ＩＬ−６キメラは１つ以上の部位でグルコシル化される。

ＩＬ６Ｒ／ＩＬ６キメラのグリコシル化された形態は、国際公開第９９／０２５５２号パンフレット（ＰＣＴ／ＩＬ９８／００３２１）に記載されており、これは、本発明による非常に好ましいキメラ分子である。該文献に記載されたＩＬ６Ｒ／ＩＬ６キメラは、組換え糖タンパク質であり、天然に存在する可溶性ＩＬ−６レセプターδ−Ｖａｌ（Novickら，Ｊ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．１９９０ Ｊｕｎ２７；５１０：３３１−７）の全コード配列を、天然に存在する成熟ＩＬ−６の全コード配列（ともにヒト起源に由来）に融合させて得られたものである。

本発明によるＩＬ６Ｒ／ＩＬ６キメラは、酵母細胞、昆虫細胞、細菌などのような、適切な任意の原核または真核細胞中で産出されうる。哺乳動物細胞中で産出されることが好ましく、国際公開第９９／０２５５２号パンフレットにて記述されたような、遺伝子工学的に改変されたＣＨＯ細胞で産生されることが最も好ましい。

本発明のさらなる実施様態において、本発明の物質はグルコシル化されない。有利には、分子はついで、グリコシル残基は合成することができないが、通常、高い収率で組み換えタンパク質を産生する細菌細胞内で産出することができる。非グルコシル化ＩＬ６Ｒ／ＩＬ６キメラの産生は、たとえば、欧州特許第ＥＰ５０４７５１Ｂ１号にて詳しく記述されている、非−グルコシル化ＩＬ−６の産生に関して記述されたように、細菌内で産生可能である。

またさらなる実施様態において、本発明による物質には、免疫グロブリン融合体が含まれ、すなわち、本発明による分子が、免疫グロブリンのすべて、または一部分に融合する。免疫グロブリン融合タンパク質の作製方法は、たとえば、国際公開第０１／０３７３７号パンフレットにて記述されたもののように、本技術分野でよく知られている。当業者は、本発明の得られた融合タンパク質が、ＩＬ６Ｒ／ＩＬ６キメラの生物学的活性を維持することを理解するであろう。得られた融合タンパク質は、理想的に、長期間の体液中の滞留時間（半減期）、特異的活性の増加、発現レベルの増加、または融合タンパク質の精製を容易にするなどの改善された特性を持つ。

好ましくは、本発明による物質はＩｇ分子の定常領域に融合される。たとえば、ヒトＩｇＧ１のＣＨ２およびＣＨ３ドメインのような重鎖領域に融合され得る。たとえば、ＩｇＧ₂またはＩｇＧ₄アイソフォーム、またはＩｇＭまたはＩｇＡのような他のＩｇクラスなどのＩｇＧ分子の他のアイソフォームも本発明による融合タンパク質の産生に適している。融合タンパク質は、単量体または多量体、ヘテロ−またはホモ多量体であり得る。

本発明による物質の機能性誘導体は、安定性、半減期、バイオアベイラビリティー、ヒト体によるトレランスまたは免疫原性のような、タンパク質の特性を改善するために、ポリマーに連結してもよい。

したがって、本発明の好ましい実施様態は、アミノ酸残基上の１つ以上の側鎖に存在する、１つ以上の官能基に連結した、少なくとも１つの部分を含む本発明による物質の機能性誘導体に関する。

非常に好ましい実施様態は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）に連結した、本発明の物質に関する。ＰＥＧ化は、たとえば、国際公開第９２／１３０９５号パンフレットにて記述されたもののような、公知の方法によって実施し得る。

「薬学的に許容され得る」の定義は、活性成分の生物学的活性の有効性を妨げず、かつ投与対象の宿主に対して毒性でない任意の担体を包含することを意味する。たとえば、非経口投与では、ＩＬ−６Ｒ／ＩＬ６キメラは、ビヒクル（たとえば、生理食塩水、デキストロース溶液、血清アルビミンおよびリンガー溶液）中にて注射用の単位投薬形態に製剤化され得る。

その投与の必要性がある患者に、種々の様式で投与され得る。投与経路としては、肝臓内、皮内、経皮（たとえば、低速放出製剤にて）、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、経口、硬膜外、局所および鼻腔内経路が挙げられる。任意の他の治療上有効な投与経路が使用され得、たとえば、上皮または内皮の組織からの吸収、またはＩＬ−６Ｒ／ＩＬ−６キメラをコードするＤＮＡ分子を患者に投与し（たとえば、ベクターにより）、インビボでＩＬ−６Ｒ／ＩＬ−６キメラの発現および分泌を引き起こす遺伝子療法によるものである。加えて、ＩＬ−６Ｒ／ＩＬ−６は、生物学的に活性な薬剤の他の成分（たとえば、薬学的に許容され得る界面活性剤、賦形剤、担体、希釈剤およびビヒクルなど）と共に投与してもよい。

非経口（たとえば、静脈内、皮下、筋肉内）投与のためには、ＩＬ−６Ｒ／ＩＬ−６キメラは、薬学的に許容され得る非経口用ビヒクル（たとえば、水、生理食塩水、デキストロース溶液）ならびに等張性を維持する添加剤（たとえば、マンニトール）または化学的安定性を維持する添加剤（たとえば、保存剤およびバッファー）と組合せて、液剤、懸濁剤、乳剤または凍結乾燥した散剤として製剤化され得る。製剤は、一般的に用いられる手法によって滅菌する。

本発明のさらなる目的は、有効量／用量のＩＬ−６Ｒ／ＩＬ−６キメラ、そのムテイン、融合タンパク質、機能性誘導体、活性画分、円順列誘導体または塩を、任意選択で薬学的に許容され得る担体とともに、必要とする患者に投与することを含む、ＣＩＰＮの治療および／または予防方法を提供することである。

「有効量」は、上記の疾患の経過および重篤度に影響を与え、かかる病理の低減または寛解を導くのに充分な活性成分の量をいう。有効量は、投与経路および患者の状態に依存する。

個体に、単回用量または反復用量として投与される投薬量は、種々の要因（ＩＬ−６Ｒ／ＩＬ−６キメラ薬物動態学的性質、投与経路、患者の状態および特徴（性別、年齢、体重、健康状態、体格）、症状の程度、併用療法、処置の頻度ならびに所望の効果など）に依存して変化する。確立された投薬範囲の調整および操作は、充分、当業者の能力の範囲である。

本発明は、ＣＩＰＮの治療および／または予防のための医薬の製造における、ＩＬ−６Ｒ／ＩＬ−６キメラ、またはそのムテイン、アイソフォーム、融合タンパク質、または円順列誘導体の使用に関する。

ＩＬ−６Ｒ／ＩＬ−６キメラの用量は、化学療法の前、あいだおよび／または後に投与可能である。ＩＬ６Ｒ／ＩＬ６キメラの用量は、ＣＩＰＮが確立する前に予防的に、または確立したＣＩＰＮを治療するために投与可能である。

本発明を充分に記載してきたが、当業者には、広範な均等のパラメータ、濃度および条件の範囲内で、過度の実験をすることなく、本発明の精神および範囲を逸脱することなく本発明を行ない得ることが認識されよう。

本発明を、その特定の実施形態に関して記載したが、さらなる改良が可能であることを理解されたい。本特許出願明細書は、一般的に本発明の原理にしたがう本発明の任意の変形、使用または適応を包含し、本発明が属する技術分野において既知または慣用的な実務の範囲内である場合、および以下の添付の特許請求の範囲に記載された前述の本質的な特徴に適用され得る場合、本開示からのかかる逸脱を含むものとする。

本明細書で引用した参考文献、たとえば、学術論文もしくは要約、公開もしくは未公開の米国もしくは外国の特許出願、発行済の米国もしくは外国の特許、または任意の他の参考文献などは、引用により本明細書に完全に組み込まれる（引用した参考文献に示されたすべてのデータ、表、図および文章を含む）。加えて、参考文献内に引用された参考文献の全内容もまた、引用により本明細書に完全に組み込まれる。

公知の方法の工程、従来の方法の工程、公知の方法または従来の方法を参照することは、決して、本発明の任意の側面、説明または実施態様が関連技術において開示、教示または示唆されているという是認（admission）ではない。

特定の実施様態の以上の記述によって、完全に、他ではなく、本発明の一般的な性質が、（本明細書で引用した参考文献の内容を含む）当業者の知識を適用することによって、余計な実験なしに、本発明の一般的なコンセプトから逸脱することなしに、そのような特定の実施様態への種々の適用のために、簡単に改変および／または適合可能である。したがって、そのような適合および改変が、本明細書で示した協議およびガイダンスに基づいて、開示された実施様態の等価のものの範囲を意味することの範囲内であることが意図される。本明細書の語法または専門用語は、記述の目的であって、制限の目的ではなく、本明細書の専門用語または語法が、当業者の知識と組み合わせて、本明細書で示された協議およびガイドラインに関して、当業者によって解釈されるべきものであることが理解されるべきである。

特定の実施態様の前述の説明では、本発明の一般的本質を充分示したため、当該技術分野の技能の範囲内の知識を適用することにより（本明細書に引用した参考文献の内容を含む）、過度の実験をすることなく、本発明の一般的概念を逸脱することなく、種々の適用用途のために、かかる特定の実施態様は容易に改良および／または適応がなされよう。したがって、かかる適応および改良は、本明細書に示した教示および手引きに基づき、開示した実施態様の均等の範囲の意味に含まれるものとする。また、本明細書における語法または専門用語は、説明の目的のためであって、限定の目的のためではないため、当業者は、本明細書の専門用語または語法を、当業者の知識との組み合わせで、本明細書に示した教示および手引きに鑑みて解釈すべきであることを理解されたい。

次に、以下の非限定的な実施例および添付の図面にしたがって本発明をより詳細に説明する。

実施例１：ビンクリスチンによって中毒化した後根神経節細胞に対するＩＬ−６Ｒ／ＩＬ−６キメラのインビトロ効果
ＩＬ−６Ｒ／ＩＬ−６キメラ（Ｃｈｅｂａｔｈら，１９９７）を使用して、インビトロにおけるビンクリスチン中毒化に対する予防を調査した。本目的のために、神経アウトグロースを神経成長因子（ＮＧＦ）によって刺激した、マウス胚（Ｅ１７日）由来の後根神経節（ＤＲＧ）の培養物を、その後、進行性軸索変性プロセスを誘導する１０ｎＭビンクリスチンに暴露した（Ｗａｎｇら，Ｊ Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ Ｅｘｐ Ｎｅｕｒｏｌ．２０００ Ｊｕｌ；５９（７）：５９９−６０６．）。２日後、ＤＲＧアウトグロースにおける軸索の多量の損失が、βＩＩＩ−チューブリンに関して免疫染色した後に明らかとなった（図１、パネルＢ対Ａ）。ビンクリスチンによる治療のあいだのＩＬ−６Ｒ／ＩＬ−６の添加が、軸索変性を予防した（パネルＣ）。種々のニューロパシーにおけるアポトーシスの早期段階を意味する、カスパーゼ−３のタンパク質分解活性化をモニターすることにより（Ｒｕｓｓｅｌｌら，Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ Ｄｉｓ．１９９９ Ｏｃｔ；６（５）：３４７−６３．）、神経変性をさらに調べた。活性化カスパーゼ−３に対する抗体への陽性反応が、ビンクリスチンで５日間処理した、ＤＲＧ培養物で観察された（パネルＤ）。しかしながら、ＩＬ−６Ｒ／ＩＬ−６がビンクリスチン処理のあいだに存在した場合、実質的にカスパーゼ−３活性化は存在しなかった（パネルＥ）。

実施例２：ビンクリスチンによって中毒化した後根神経節細胞に対するＩＬ−６Ｒ／ＩＬ−６キメラのインビトロ効果
本発明者はさらに、ＩＬ−６Ｒ／ＩＬ−６が、ビンクリスチンの作用がおこった後に、ＩＬ−６Ｒ／ＩＬ−６を加えることによって神経再生効果を有するかどうかを調査した。ＩＬ−６欠損マウス（ＩＬ−６−／−）由来のＥ１８．５胚のＤＲＧで実施した１つのそのような実験を、図２に示す。軸索ネットワークが、５日間のＮＧＦの存在下で形成された培養物を、ＩＬ−６Ｒ／ＩＬ−６が存在する場合またはしない場合で、さらに１１日間続けるか（それぞれパネルＡおよびＢ）、またはビンクリスチンによって５日間処理し、ビンクリスチンを除去した時点で、さらに６日間培養を続けた（パネルＣ〜Ｆ）。軸索ネットワークの広範囲な変性が、ビンクリスチン除去の６日後になお観察されたが（パネルＣ）、ビンクリスチン除去後、ＩＬ−６Ｒ／ＩＬ−６を加えた場合、軸索の有意な再増殖が観察された（パネルＤ）。平行して、グリア繊維酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）に対して免疫染色した培養物中で、ＩＬ−６Ｒ／ＩＬ−６の添加が、ビンクリスチンの除去６日後の対照培養物（パネルＥ）と比較して、グリア細胞の明らかな再増殖を引き起こすことがわかった（パネルＦ）。いくつかの同様の実験において、ＩＬ−６Ｒ／ＩＬ−６の神経再生効果が、ＩＬ−６＋／＋マウス由来のＤＲＧ培養物中でみられ、ＩＬ−６Ｒ／ＩＬ−６添加後２日ですでに現れた（示していない）。これらの実験は、ＩＬ−６Ｒ／ＩＬ−６キメラが、化学療法薬剤への暴露後に加えた場合、神経およびグリア細胞の再生を促進したことを示す。

実施例３：後根神経節（ＤＲＧ）培養物、ビンクリスチンおよびＩＬ−６Ｒ／ＩＬ−６処理
ＤＲＧｓを、（Ｃ５７ＢＬ／６ｘ１２９Ｓｖ）Ｆ１マウスの胚から、以前に詳述されたように（Ｈａｇｇｉａｇら，１９９９，２００１）調製した。いくつかの実験において、相当するＩＬ−６−／−突然変異マウスを使用した（Ｍｅｎｄｅｌら，１９９８）。ＤＲＧｓを、（２０μｇ／ｍｌポリ−Ｄ−リジン、２５０μｇ／ｍｌフィブロネクチンの溶液で事前にコートした）ガラスカバースリップ上にまき、１２−ウェルコースター（Ｃｏｓｔａｒ）プレート中においた。標準培養培地は、１％ Ｎ２サプリメント、１０％ ウシ胎児血清、２％ウマ血清、１．４ｍＭ グルタミン（すべてギブコ／インビトロジェン（Gibco/Invitrogen）より）、および５０ｎｇ／ｍｌ ＮＧＦ（２．５Ｓ；アロモン ラボズ（Alomone Labs）、エルサレム、イスラエル）を含む、０．５ｍｌ ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地であった。培養物を、３７℃、５％ ＣＯ２にて維持し、培地を、３０日ごとに交換した。５日目に、いくつかのウェルに、１０ｎＭビンクリスチン硫酸塩（シグマ、セントルイス、ＭＯ）を、または記述されたように（Ｃｈｅｂａｔｈら，１９９７）調製した２００ｎｇ／ｍｌ純粋組み換えＩＬ−６Ｒ／ＩＬ−６とともにビンクリスチンを加えた。２〜５日後、培養物を、４％パラホルムアルデヒド中で、室温（ＲＴ）で１０分間固定し、ＰＢＳで洗浄し、ついで、０．５％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、およびＰＢＳ中１０％正常ヤギ血清にて、ＲＴで３分間処理し、１％ ＮＧＳで３回洗浄した。治療効果を研究するために、５日目にビンクリスチン（５ｎＭ）にて処理した同様のＤＲＧ細胞培養物を１０日目に洗浄し、ビンクリスチンを除去し、単独または２００ｎｇ／ｍｌ ＩＬ−６Ｒ／ＩＬ−６を加えた前記標準培地を補充し、培養を固定化の前にさらに６日間続けた。

実施例４：免疫染色
免疫染色を、マウスモノクローナル抗体ＴＵＪ１抗−神経βＩＩＩ−チューブリン抗体（コバンス（Covance）、バークリー、ＣＡ；ＭＭＳ−４３５Ｐ、希釈１：５００）およびＡｂ−４抗−カスパーゼ−３活性化型（オンコジーン リーサーチ プロダクツ（Oncogene Research Products）、サンディエゴ、ＣＡ；ＡＭ６５、希釈１：２００）で、ＲＴにて一晩行なった。第二抗体は、チューブリン用には、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８に共役したヤギ抗−マウスＩｇＧ（モレキュラー プローブス（Molecular Probes）、ユージーン、ＯＲ；Ａ１１０２９、希釈１：２００）、そしてカスパーゼ用には、Ｃｙ３−共役アフィニティー精製ヤギ抗−マウスＩｇＧ、Ｆ（ａｂ’）２断片特異的（ジャクソン イムノリサーチ ラボラトリーズ（Jackson ImmunoResearch Laboratories）、ウエストグローブ、ＰＡ；希釈１：６００）であった。マウスモノクローナル抗−ＧＦＡＰ−Ｃｙ３共役抗体（シグマ−アルドリッチ（Sigma-Aldrich）；Ｃ９２０５、希釈１：４００）をＲＴにて１時間適用した。ＰＢＳでの洗浄後、カバースリップをＭｏｗｉｏｌ（カルビオケム（Calbiochem）、ラ・ジョラ（LaJolla）、ＣＡ）中に載せ、ＤＶＣ−１３１０Ｃデジタルカメラ（ＤＶＳ、オースチン、ＴＸ）を備えるオリンパス ＩＸ−７０ ＦＬＡ顕微鏡で写真を撮り、フォトショップにて画像を処理した。

ＩＬ−６シグナル伝達の活性化による、ビンクリスチンに対するインビトロでの神経保護を示す。（Ａ）ＮＧＦ−含有培地における７日後のＤＲＧ培養物での、βＩＩＩ−チューブリンに関して染色した増大（outgrowing）軸索ネットワーク。（Ｂ）１０ｎＭビンクリスチンで、最後の２日間処理した同様の培養物。（Ｃ）ビンクリスチンおよび２００ｎｇ／ｍｌ ＩＬ−６Ｒ／ＩＬ−６で、最後の２日間処理した同様の培養物。軸索ネットワークの有意な保護が観察される。パネルＡ〜Ｃは、同倍率であり、サイズバー：１００μｍ。（Ｄ）最後の５日間は１０ｎＭビンクリスチンを添加した、ＮＧＦ−含有培地中で１０日間培養したＤＲＧのアウトグロース。アポトーシスを受けている細胞を、活性化カスパーゼ−３に対する抗体で染色することによって視覚化した。（Ｅ）２００ｎｇ／ｍｌ ＩＬ−６Ｒ／ＩＬ−６をビンクリスチンとともに加えた同様の培養物。アポトーシスは観察されない。（Ｄ’、Ｅ’）光位相差下、Ｄ、Ｅと同じ領域。パネルＤ〜Ｅ’は同倍率；サイズバー：１００μｍ。 ビンクリスチン中毒の後の再生の刺激を示す。（Ａ）ＮＧＦ−含有培地における１６日後のＤＲＧ培養物での、βＩＩＩ−チューブリンに関して染色した増大軸索ネットワーク。（Ｂ）５日目〜１６日目まで２００ｎｇ／ｍｌ ＩＬ−６Ｒ／ＩＬ−６を追加した同様の培養物。（Ｃ）５日目〜１６日目まで５ｍＭビンクリスチンで処理したＡと同様の培養物。薬物の除去後、培養をさらに６日間続けた。（Ｄ）５日目〜１０日目まで５ｍＭビンクリスチンで処理し、ついで、薬物の除去後さらに６日間ＩＬ−６Ｒ／ＩＬ−６で処理したＡと同様の培養物。（Ｅ）５日目〜１０日目までビンクリスチンで処理し、薬物なしで６日間さらに培養したＣと同様のＤＲＧ培養物。（Ｆ）５日目〜１０日目までビンクリスチンで処理し、ＩＬ−６Ｒ／ＩＬ−６で６日間さらに培養した、Ｄと同様の培養物。ＧＦＡＰ陽性細胞の再増殖に注目。パネルＡ〜ＤおよびＥ〜Ｆは、それぞれ同倍率；サイズバー：１００μｍ。

Claims (21)

1. 化学療法誘発末梢性ニューロパシー（ＣＩＰＮ）の予防および／または治療のための医薬の製造における、ＩＬ−６Ｒ／ＩＬ−６キメラ、またはそのムテイン、アイソフォーム、融合タンパク質、機能性誘導体、円順列誘導体または塩の使用。
2. 末梢性ニューロパシーが、シスプラチン、ジカルバジン、ストレプトゾシン、シクロホスファミド、カルムスチン、ロムスチン、プロカルバジン、マイトマイシン、シタラビン、メトトレキサート、５−フルオロウラシル、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ブレオマイシン、パクリタキセル、アスパラギナーゼ、ブスルファン、カルボプラチン、ダカルバジン、フルダラビン、ヒドロキシウレア、イフォスファミド、メルカプトプリン、ミトタン、ストレプトゾシン、タキソール、またはこれらの２つ以上の薬剤の混合物から選択される化学療法薬剤によって引き起こされる請求項１記載の使用。
3. 前記薬剤がビンクリスチンである請求項２記載の使用。
4. 前記ＩＬ６Ｒ／ＩＬ６キメラ、またはそのムテイン、アイソフォーム、融合タンパク質、機能性誘導体、円順列誘導体または塩が、１つ以上の部位でグルコシル化されている請求項１〜３のいずれか１項に記載の使用。
5. 前記ＩＬ６Ｒ／ＩＬ６キメラ、そのムテイン、アイソフォーム、融合タンパク質、機能性誘導体、円順列誘導体または塩がグルコシル化されていない請求項１〜３のいずれか１項に記載の使用。
6. 前記機能性誘導体が、１つ以上の官能基に連結した、少なくとも１つの部分を含む請求項１〜５のいずれか１項に記載の使用。
7. 前記部分が、ポリエチレン部分である請求項６記載の使用。
8. 前記医薬が、ＩＬ６Ｒ／ＩＬ６キメラ、またはそのムテイン、アイソフォーム、融合タンパク質、機能性誘導体または円順列誘導体を発現する細胞を含む請求項１〜７のいずれか１項に記載の使用。
9. 前記医薬が、ＩＬ６Ｒ／ＩＬ６キメラ、またはそのムテイン、アイソフォーム、融合タンパク質、機能性誘導体または円順列誘導体のコード配列を含む発現ベクターを含む請求項１〜８のいずれか１項に記載の使用。
10. 前記ベクターが、レンチウイルスベクターである請求項９記載の使用。
11. ＣＩＰＮの治療および／または予防方法であって、それを必要としている患者に、任意には薬学的に許容され得る担体と一緒に、ＩＬ６Ｒ／ＩＬ６キメラ、またはそのムテイン、アイソフォーム、融合タンパク質、機能性誘導体、円順列誘導体または塩を投与することを含む方法。
12. 前記必要としている患者が高リスク患者である請求項１１記載の方法。
13. 前記高リスク患者が、糖尿病、ＡＩＤＳ、遺伝的ニューロパシーを患っている患者、および神経毒性薬物での早期治療を受けた患者から選択される請求項１２記載の方法。
14. 前記投与が、肝臓内、皮内、足底内、経皮、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、経口、硬膜外、局所および鼻腔内経路から選択される請求項１１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
15. 患者における化学療法薬剤の用量を増加させる方法であって、それを必要としている患者に、任意には薬学的に許容され得る担体と一緒に、ＩＬ６Ｒ／ＩＬ６キメラ、またはそのムテイン、アイソフォーム、融合タンパク質、機能性誘導体、円順列誘導体または塩を投与することを含む方法。
16. 前記ＩＬ６Ｒ／ＩＬ６キメラが、化学療法薬剤の前、あいだおよび／または後のいずれかで投与される請求項１５記載の方法。
17. ＩＬ６Ｒ／ＩＬ６キメラ、またはそのムテイン、アイソフォーム、融合タンパク質または機能性誘導体と、１つの化学療法薬剤またはその２つ以上の薬剤の混合物との組み合わせを含む医薬組成物。
18. 前記化学療法薬剤が、シスプラチン、ジカルバジン、ストレプトゾシン、シクロホスファミド、カルムスチン、ロムスチン、プロカルバジン、マイトマイシン、シタラビン、メトトレキサート、５−フルオロウラシル、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ブレオマイシン、パクリタキセル、アスパラギナーゼ、ブスルファン、カルボプラチン、ダカルバジン、フルダラビン、ヒドロキシウレア、イフォスファミド、メルカプトプリン、ミトタン、ストレプトゾシン、タキソール、またはこれらの２つ以上の薬剤の混合物から選択される請求項１７記載の医薬組成物。
19. 前記化学療法薬剤がビンクリスチンを含む請求項１８記載の医薬組成物。
20. さらに、抗酸化剤、ＰＫＣ阻害剤および神経保護剤から選択される追加薬物を含む請求項１７〜１９のいずれか１項に記載の医薬組成物。
21. 前記追加薬物が、グルタミン酸、ピリドキシン、ガンマ−リノール酸、ビタミンＢ１、ビタミンＢ２、イソアキソニン、ガングリオシドおよびＮＧＦから選択される請求項２０記載の医薬組成物。

Images