JP2007532618A - 治療用ペプチド - Google Patents
治療用ペプチド Download PDFInfo
- Publication number
- JP2007532618A JP2007532618A JP2007507850A JP2007507850A JP2007532618A JP 2007532618 A JP2007532618 A JP 2007532618A JP 2007507850 A JP2007507850 A JP 2007507850A JP 2007507850 A JP2007507850 A JP 2007507850A JP 2007532618 A JP2007532618 A JP 2007532618A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- peptide
- binding
- ceacam1
- ceacam
- receptor
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Images
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/04—Peptides having up to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
- A61P1/02—Stomatological preparations, e.g. drugs for caries, aphtae, periodontitis
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
- A61P27/16—Otologicals
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/04—Antibacterial agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
- C07K14/21—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Pseudomonadaceae (F)
- C07K14/212—Moraxellaceae, e.g. Acinetobacter, Moraxella, Oligella, Psychrobacter
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
- C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Oncology (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Heart & Thoracic Surgery (AREA)
- Pulmonology (AREA)
- Cardiology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
【選択図】なし
Description
QHSSDIKTLK
NVEEGLLDLSGRLIDQKADLTKDIK
NVEEGLLDLSGRLIDQKADIAKNQA
DIAQNQT
DIQDLAAYNELQD
QTEAIDALNKASS
TAELGIAENKKDAQIAKAQANENKDGIAK
NQADIQLHDKKITNLGILHSMVARAVGNNTQGVATNKADIAK
NQADIANNIKNIYELA
NQADIANNI
NIYELA
本発明におけるポリペプチドリガンドは、N末端もしくはC末端のどちらか一方または両末端において、ここに列挙した配列に対するアミノ酸の付加または欠失により修飾を施された配列の受容体結合ドメインであって、CEACAM受容体への結合能が保持されるドメインを含むことが理解されるであろう。従って、本発明はさらに、50、40、30、20、10、5、3もしくは1アミノ酸残基を、N末端もしくはC末端のどちらかまたは両末端において、ここに列挙したアミノ酸配列に加えたか、またはここに列挙したアミノ酸配列から削ったポリペプチドを含むか、または前記ポリペプチドから成るリガンドであって、該の修飾されたポリペプチドがCEACAM受容体への結合能を保持し、および/または、非修飾のペプチドに対する免疫応答を誘発するようなリガンドを提供する。好ましくは、560番目のアミノ酸は修飾を受けたペプチド中において保持されることが望ましい。
NVEEGLLDLSGRLIDQKADLTKDIK
NVEEGLLDLSGRLIDQKADIAKNQA
DIAQNQT
DIQDLAAYNELQD
QTEAIDALNKASS
TAELGIAENKKDAQIAKAQANENKDGIAK
NQADIQLHDKKITNLGILHSMVARAVGNNTQGVATNKADIAK
NQADIANNIKNIYELA
NQADIANNI
NIYELA
ここに記されたポリペプチドリガンドを含む融合タンパク質の作製は都合がよい。従って、別の実施態様において、本発明は、本発明によるポリペプチドリガンドを含む融合タンパク質に関するものである。好ましくは、この実施態様による融合タンパク質は、その全長が、あらゆる既知の全長の配列にたいして50%未満の同一であることが望ましい。
NVEEGLLDLSGRLIDQKADLTKDIK
NVEEGLLDLSGRLIDQKADIAKNQA
DIAQNQT
DIQDLAAYNELQD
QTEAIDALNKASS
TAELGIAENKKDAQIAKAQANENKDGIAK
NQADIQLHDKKITNLGILHSMVARAVGNNTQGVATNKADIAK
NQADIANNIKNIYELA
NQADIANNI
NIYELA
好ましくは、疾病は、感染症、呼吸器疾患、腫瘍性疾患やその関連症状、血管新生から選択されるものである。
本実験に用いたMoraxella catarrhalis(Mx)は、American Type Culture Collectionから購入した参考株(ATCC25238、このクローン培養株をMX2と名付けた)はもちろん、臨床分離株(MX3とMX4)を含む。
M. catarrhalisとCEACAM1の相互作用を評価するため、細菌(約4-8 x 106)をニトロセルロースに塗布し、空気乾燥し3% BSA-PBSTにて非特異的な結合部位をブロッキングした。ニトロセルロース片を、CEACAM1-Fc(1-2μg/ml)のみ、またはCEACAM1-Fc(1-2μg/ml)とCEACAM1 N-domain抗体YTH71.3で覆った。CD33-Fc(1-2μg/ml)をネガティブコントロールとして用いた。キメラのタンパク質コンストラクトを以前に記述された方法11に従って作製した。キメラの受容体の結合を、西洋わさびペルオキシダーゼまたはアルカリフォスファターゼが融合したヤギの抗ヒトFc抗体によって検出した。ブロットは、ジアミノベンジデン(diamino benzidene)と過酸化水素、またはニトロブルー・テトラゾリウム(nitroblue tetrazolium)と5-ブロモ-4-クロロ-3-インドイルフォスフェート(5-bromo-4-chloro-3-indoylphosphate)を、それぞれ基質に用いて現像した。Mxの全ての株においてCEACAM1-Fcに結合したが、CD33-Fcには結合しなかった(図1)。受容体の結合は、モノクローナル抗体YTH71.3の存在下で阻害され、これより菌株は受容体のN末端ドメインに結合することが示唆された。したがって、全ての株が等しく、CEACAM1のNドメインのみを含んだ切断型N-Fcコンストラクトによく結合する(データは示していない)。
Mx(約3 x 107)のホールセルライセート(whole cell lysate)を、前もって熱処理を行わないものと100℃で10分間熱処理したものを、それぞれ10%ビス-トリス ポリアクリルアミドゲル(Invitrogen)の個々のレーンに供し、180Vで45分間電気泳動を行った。標準的なブロット条件により、ゲルからタンパク質をニトロセルロース膜に転写した。ニトロセルロース膜は上述したとおりの可溶性のキメラコンストラクトで覆った。それぞれの場合において、一つのタンパク質がCEACAM1-Fcに特異的に結合する結果が得られた。ゲルにおけるタンパク質の移動度から、MxのUspA1タンパク質であることが示唆された。というのは、細菌のライセートを熱処理せずに泳動した場合、CEACAM1結合タンパク質は見かけの分子量が200kDa以上となり、ライセートをあらかじめ熱処理すると、CEACAM1結合タンパク質は分子量が約92kDaに小さくなったからである(図2)。
公表されているM. catarrhalisのUspA1の配列にしたがって、ペプチドを設計した。すなわち、ETNNRQDQKIDQLGYALKEQGQHFNNR (SEQ ID NO:1; UspA1-ペプチド)、そしてKDEHDKLITANKTAIDANKAS (SEQ ID NO:6; UspA2-ペプチド)である。ペプチドは、組み込まれたN末端システイン残基を介してKLHに結合され、14日ごとにウサギに免疫した(ウサギ一羽あたりペプチド200μg)。このとき、初めにフロイント完全アジュバントにて行い、その後フロイント不完全アジュバントにて行った。免疫化0日目と、免疫化以降の14日ごとに、ウサギから採血した。ポリクローナル抗体を、対応するペプチドを結合させたAminoLink Plusカラム(Pierce)を用いて精製した。UspA特異的抗体を1-10μg/mlの濃度にてウエスタンブロットに用い、アルカリフォスファターゼが融合したヤギの抗ウサギ二次抗体にて検出した。ブロットは先に述べた方法により現像した。Mxの3株のSDS-PAGEによるCEACAM1-Fc結合タンパク質の移動度は、UspA1抗体の結合タンパク質と同じであったが、UspA2抗体の結合タンパク質とは異なった(図3)。
一晩培養した細菌を、プロテアーゼ阻害剤カクテル(PMSF 1mM、E-64 1μM、ペプスタチンA 1μM、ベスタチン 6 nM、EDTA 100μM)を含み、100mMオクチルβDグルコピラノサイド(octyl βD glucopyranoside)の入ったPBSBに懸濁した。サンプルは4℃で一晩回転させて混合した。その間、100μlのプロテインAが結合したセファロースCL-4B(Sigma)を、20μgのCEACAM1-FcまたはCD33-Fc(コントロール)とともに、4℃で一晩インキュベートし、その後PBSBにて3度洗浄して結合しなかった受容体を除いた。細菌の不溶性物質は、15,000gで30分間遠心分離することで除いた。可溶性抽出物は、それぞれの受容体-プロテインAセファロース複合体と4℃で2時間インキュベートした(受容体コンストラクト1μgに対し5 x108細菌の比率)。50mMオクチルβDグルコピラノサイドとPBSBにより十分に洗浄した後、変性条件下でのSDS-PAGE電気泳動とウエスタンブロッティングにより分析した。
(a)ウエスタンオーバーレイサンプル。MX2とMX3のホールセルライセートをトレンチゲルのSDS-PAGEに供し、CEACAM1-Fc結合リガンドに対応するタンパク質バンドをゲルから電気溶出した。サンプルを濃縮し、2つめのゲルの1レーンに移し電気泳動を行った後、タンパク質のゲル内トリプシン消化を行った。生成したペプチドをMALDI-TOF質量分析によって分析した。MX2のCEACAM結合タンパク質のマススペクトルの1例を示した(図4a)。得られたペプチド分子量をProFoundタンパク質特定サイトに入力し、このタンパク質に対する結果を得た(図4b,c)。この場合、10個のペプチドの分子量が、M. catarrhalisのUspA1のトリプシン処理による予想されるペプチドの分子量と一致し、それはタンパク質の約18%に及んだ(図4d)。2.34というZスコアの推定値は、UspA1であることを強く示唆する(1.65より大きいZスコアは、95%以上である。http:/129.85.19.192/profound_bin/webProFound.exe)。加えて、その他のMX2の非結合性の高分子量のバンドは、同様の分析によりUspA2と特定された。MX3も同様にし、CEACAM1結合、非結合タンパク質は、それぞれUspA1とUspA2と特定された。
(a)UspA1のトリプシン処理ペプチドはCEACAM1-Fcに結合する。
MX2細菌懸濁液を1mg/mlのトリプシンにて37℃で10分間処理した。
図6に示した配列の残基1から449のアミノ酸配列を含むよう構築されたN末端組み換えMX2ペプチドはCEACAMに結合しない。このことはさらに、図8に示した残基463から863のアミノ酸配列を含み、N末端配列がALESNVEEGL(SEQ ID NO:4)である約50kDaのトリプシン処理ぺプチドがCEACAM結合ドメインを含むことを意味する。
N. meningitidisとH. influenzaはリガンドを介してヒトのCEACAM分子をターゲッティングするが、CEACAMのオーバーラップする配列に対して結合する。本発明のMxリガンドもまたNドメインをターゲッティングする。これらの発見は、いくつかの粘膜性病原体のリガンドにおいて同様な特徴が、受容体のターゲッティングに関与するという刺激的な可能性を指し示す。
CEACAMのNドメインはOpaタンパク質との相互作用を行うのに十分であるため、本発明者らはCEACAMのNドメインの接着性のエピトープをさらに調べるためファージディスプレイ法を用いている。本発明者らにより研究された受容体のアラニンスキャニング突然変異誘発(alanine scanning mutagenesis)により得られた、受容体におけるリガンド結合領域の知識は、本研究を後押しした。この場合においてもまた、リガンドオーバーレイ法が、受容体配列をもつキメラファージのバイオパニング(biopanning)(アフィニティ濃縮)に用いることが可能である。
〈概要〉
UspAの全長に沿ったいくつかの断片のPCR増幅は、図9に示したプライマーを用いて行った。組み換えタンパク質を後述する方法にて得た。一巡目にて、CEACAM1に結合する組み換えペプチドは、プライマーP4とP8にて増幅されたDNAにコードされ、P1とP5間の領域にはコードされないことがわかった。そのうえ、組み換えP4-P7はCEACAMに結合するがP6-P8は結合しなかった。追加のプライマーをP4とP7の領域に用いた。領域D-7はCEACAM結合能を保持した。断片4-7の配列を図10に示した。
UspA1断片1-5はpBADシステムを用いて作製した。必要なPCR産物をpBADベクターにTAクローニングし、E. coliのTOP10株にて増幅した。残りの手順は、pBADをアラビノースにより誘導する例外を除いて、図11に示した。断片4-7は、pBADとpQE30(図11)システムの両方をもちいて作製し、同様にCEACAM結合能をもつ産物を得た。残りの断片は図11に示した方法を用いて作製した。
ベクターpQE30(図12)を、E. coli M15株と組み合わせて用いた。M15はpQE30に組み込まれたDNAの転写を制限するリプレッサーをコードするpREP4プラスミドを保持している。1mMのIPTGの添加にて、このリプレッサーの発現が抑えられ、そのためpQE30内のクローン化した断片の転写が行われる。
まず、PCRアンプライマー(amplimer)をpCR2.1に組み込んだ。これにより、制限酵素(BamHI/PstI)による切断によりアンプライマーが復帰するような、安定したホストが得られ、遺伝子断片の両端が切断されることを保証する。pQE30を同様に切断しゲル精製により回収し、これにより制限酵素サイトの両方が切断されたこともまた保証された。切断したpQE30とUspA1アンプライマーをT4 DNA リガーゼで、16℃で一晩結合させ、CaCl2コンピテントE. coli M15に形質転換した。形質転換体をアンピシリン(100μg/ml)とカナマイシン(25μg/ml)を添加したLB寒天培地にて選択した。4-8コロニーをひろい、抗生物質を含んだLB培地にて生育した。3-4mlの培養液の細菌を遠心分離により回収しアルカリ溶解ミニプレップ法に供した。精製したベクターを上記方法にて切断しuspA1が組み込まれていることを確認した。正しいサイズの挿入部位を含むpQE30をもった細菌を50ml培養液にて生育し、IPTGにより誘導をおこなった(下記参照)。そして、ウエスタンブロッティングにより組み替えタンパク質の生産を調べた。加えて、挿入部位がDNAの正しい領域であることの決定と何らかの配列エラーがないかを調べるため、ベクターの列決定を行った。
pQE30/uspA1コンストラクトを持つM15をLB培地(100μg/mlのアンピシリンと25μg/mlのカナマイシンを添加)にてOD600=0.5になるまで振盪し、その後1mMになるようIPTGを加えた。培養液をさらに3-4時間インキュベートし、細菌を遠心分離により回収した。細菌のペレットを緩衝液B(8M urea, 50mM Tris, 10% ethanol, 2% Tween, 5mM imidazole, pH 7)にて1-3時間可溶化し、膜画分を20,000gで20分遠心分離することで除いた。上清をニッケルレジンと、ロータリーミキサーにて1-2時間インキュベートし、ポリプロピレンカラムに通した。保持されたレジンを5-10mlの緩衝液Bにて洗浄し、結合タンパク質を100mMイミダゾールを加えた緩衝液B 0.5mlにて溶出した。溶出タンパク質は、SDS-PAGEにて確認した後、透析にて尿素やその他の塩を除いた。
A:断片1-5と1-8。
M. catarrhalisのMX1株と、H. influenzaのRd株は、CEACAM1を形質転換したチャイニーズハムスターの卵巣(Chinese Hamster Ovary, CHO)細胞に結合する。それらの結合は、M. catarrhalisのUspA1組み換えペプチド4-7により阻害されたが、コントロールペプチドには阻害されなかった(図17)。
ペプチドD-7が最も結合力のある組み換えペプチドであることがわかった。それゆえ、MX2の領域D-7(142アミノ酸、図16参照)にCEACAM1結合情報が含まれる。
ペプチドD-7と変異型D-7(K560I)を円偏光二色性(CD)分光法にて分析した。円偏光二色性スペクトルは、室温にてJobin-Yvon CD6 spectropolarimeterにて得た。0.1mg/mlの組み換えD-7とD-7(K560I)のスペクトルを石英キュベットにて測定した。全てのスペクトルはタンパク質の入ってない緩衝液のスペクトルを減算した8回のスキャンの平均であり、Excel(Microsft Inc.)にてプロットした。
上述した結果から、発明者らはMxのUspA1のCEACAM1結合は、α-へリックスベースの構造、特にコイルドコイル構造に加えて、D-7の領域が必要であると結論した。
Mx10株UspA1タンパク質のアミノ酸配列のD-7領域のアラインメントを図20に示した。
{結果}
Mx、Nm、Ng、Hiの同種と異種に対する抗接着薬剤としてのD-7の可能性を、可溶性の受容体を用いて最初に試験した。CEACAM1-Fc(CC1-Fc)をD-7とプレインキュベートし、ニトロセルロースに転写した2種のMxのホールセルライセートに反応させた。組み換えD-7は、異種株MX1と同種株MX2に対するCC1-Fcの結合を濃度依存的に特異的に阻害した(図24a)。阻害は有意で0.01μg/ml以上にてプラトーに達した。CEACAM1に結合しないことがわかった(実施例5)コントロールペプチド(D-8Δ)ではそのような阻害は見られなかった。そのうえ、多数の細菌種に対する阻害効果もわかった。用いた株の大多数が世界中からの臨床分離株である(方法参照)。有意で特異的な阻害が、D-7ではみられたがD-8Δではみられなかった(図24b)。そしてD-7の遮断効果をC、EACAM1を形質移入したチャイニーズハムスターの卵巣(Chinese Hamster Ovary, CHO)細胞(CHO-CEACAM1)を用いて調べた。可溶性受容体と同様に、Mx、Nm、Hi、のCHO-CEACAM1細胞に対する結合の阻害がD-7とのプレインキュベーションを行うことでみられたが、コントロールペプチドとのインキュベーションの場合にはみられなかった(図25a,b)。細菌のCHO-CEACAM1細胞に対する結合の阻害は濃度依存的であり、MxとHiでは0.1μg/ml以上、Nmでは0.2μg/ml以上にて有意であった(図25b)。ほぼ完全な細菌のCHO-CEACAM1細胞に対する結合の抑止が、約2μg/mlの濃度にて得られた(図25a,b)。得られた阻害の度合いから、仮に本実験で用いた細菌のCEACAM相互作用の特異性が、Nm>Mx>Hiであることが示唆される。CEACAM1に加えて、N. meningitidisは、上皮のCEAやCEACAM6(NCA)を含む、その他のヒトCEACAMファミリーのメンバーを標的化することがわかっている9。これは、CEACAM1を優先してターゲッティングする傾向のあるいくつかのMx株やHi株においても同じである(データは示していない)。D-7(2μg/ml)とのプレインキュベーションを行った場合、CEACAM1、6そしてCEAを発現する形質転換HeLa細胞に対するNmの結合の阻害が確認された。
〈細菌分離株と培養〉
MxとNmは10%の加熱したウマ血液を添加したBHI寒天上にて培養し、一方HiはLevinthal base添加のブレイン・ハート・インフュージョン(BHI)寒天上にて培養した。Ng種はGC寒天にて培養した。全ての細菌は、CO2インキュベーターにて37℃で16時間以上培養した。Mx種は、中耳炎とCOPDの症例から得た臨床分離株といくつかの国からの代表的な分離株であった。Eagen、c1、f1はそれぞれb、c、f型のカプセルを持ったHiの株で、Rdはd型由来のカプセルのない株である。A930065とNT1株はNTHiである。A3、F2087、F3035、F1947株は、Hi生物群(biogroup)のアエジプチウス(aegyptius)分離株である。Nm分離株C751A、C751B、C751Dは血清型AのC751株の異なる3種のOpaを発現する分離株である。その他の分離株は続く血清型である:PMC17(A)、C311とMC58(B)、C114(C)、PMC2(29E)、PMC4(W135)、PMC10(Y)。Ng分離株P9-13、16、35はP9の株内のOpa変異株であり、その他の臨床分離株は世界各国から集めた。本実験で用いた大多数の株は、以前に記述している10,26,28。
抗ポリヒスチジンのマウスモノクローナル抗体はQiagenから購入し0.2μg/mlで用いた。Mx、Nm、Hiに対するポリクローナル抗血清は標準的プロトコールに沿って多数の種のホールセルライセートを抗原として用いて、ウサギで産生した。本実験にて用いた抗UspA1抗体(R38)は実施例1と参考文献26に示したとおりである。D-7に対するポリクローナル抗血清はNi-NTAレジン(Qiagen; 一回の免疫化当りペプチド100-200μg)に結合させたペプチドにより免疫化することで作製した。補体は56℃で30分間抗血清を熱処理することにより不活性化した。抗D-7抗体はペプチドD-7を結合させたAminoLink Plusカラム(Pierce)にて、製品プロトコールに従ってアフィニティー精製した。
本実験で用いた可溶性CEACAM-FcとCEACAM1を形質転換したCHO細胞は以前に記述されている11,9。一連のCEACAM分子を発現するHeLa細胞はWolfgang Zimmerman教授(ミュンヘン大学、ドイツ)とScott Gray-Owen博士(トロント大学、カナダ)からいただき、10%ウシ胎児血清(FCS)を含むRPMI 1640にて培養した。A549ヒト肺癌細胞(Flow laboratories)は10%FCSを含むF12 Ham培地にて培養した。CEACAMを高いレベルで発現するHeLa細胞は、Tet-On(商標)(Clontech)遺伝子発現システムにて作製した。ceacam1遺伝子はpTRE-2hyg応答プラスミド(Clontech)に組み込み、制御遺伝子をもったHeLa細胞(Clontech)にFugene-6(Roche)を用いて形質転換した。形質転換体を400μg/mlのハイグロマイシンを用いて選択した。CEACAM発現を行うそれらの形質転換体を、FACSと限界希釈にて選択した。0.25μg/mlドキシサイクリン下のHeLa-CC1Hクローンが最も高い受容体発現を示した。
これらの実験は以前に記述された方法9をもとに以下に示す変更を加えて行った。阻害実験のためにCEACAM1-Fc(0.1μg/ml)をD-7またはコントロールペプチド(0.001-2μg/ml)と室温で1時間プレインキュベートした。続いてブロットにCEACAM1-Fc(0.1μg/ml)を単独、または記述したペプチドとCEACAM1-Fc(0.1μg/ml)をプレインキュベートして反応させた。または、ブロットを精製したウサギの抗D-7抗体(10μg/ml)で1時間反応させた後、受容体(0.1μg/ml)を反応させた。いずれの場合も、受容体結合の度合いをNIH Scion Imageプログラムを用いた濃度分析にて検出した。
集密的な一層の細胞を、2%ウシ胎児血清を添加した199培地にて、ペプチドD-7またはコントロールペプチド(0.1-2μg/ml)存在下、30-60分間37℃で前培養した。一層の細胞は続くペプチドとのプレインキュベーションにて細胞に有害な影響が生じないことを確認した。続いて、一層の細胞を、2%ウシ胎児血清を添加した199培地にて、細胞当り約100-200の割合の細菌を添加して37℃で1時間インキュベートした。非接着の細胞を199培地で4回洗浄して除き、一層の細胞を免疫蛍光検出または、1%サポニンにて溶解し以前に記述されたとおり25に細菌を希釈してプレートアウトしてコロニー形成ユニット(colony forming units,cfu)を検出した。免疫蛍光検出には、細胞を無水メタノールにて10分間固定し、1%ウシ血清アルブミン、0.05%Tweenを含むPBSにて1時間洗浄とブロッキングを行った。接着した細菌は、抗細菌抗血清とローダミン融合二次抗体にて検出した。HeLa-CEACAM発現細胞に接着した細胞の数はオリンパスIX70顕微鏡を拡大率400倍にて直接カウントした。重複した実験からランダムに選んだ20細胞に接着した細菌を数えた後、平均値を求めた。HeLa-CC1Hへの細菌の接着は上述したcfu分析にて検出した。
{結果}
D-7に対するウサギ抗血清は、ホールセルライセートのウエスタンブロットオーバーレイにて、いくつかのMx株のUspA1に交差反応する抗体を含んでいた(データは示していない)。アフィニティー精製した抗体を用いたウエスタンブロッティングから、抗D-7はNmのOpaもしくはHiのP5に結合しないことがわかった(データは示していない)。一連のMx株のホールセルライセートと抗D-7(10μg/ml)をインキュベートした後、CC1-Fcを反応させると、大多数の株で受容体結合に80%を超える顕著な阻害が起こった(図26)。しかしながら、同様の実験でHi、Nm、Ng株では低いレベルの阻害しかみられなかった。このようにD-7に対する抗体はMx感染に対する作用をもつ一方、D-7は幅広いCEACAM標的細菌に対してより一般的な抗細菌ペプチドとなりうる。
内皮細胞におけるD-7の効果を評価するため、集密した一層のHMEC-1細胞を用いた。ヒト毛細血管内皮細胞をD-7または組み換えコントロール分子(ともに1μg/ml)にて60分間プレインキュベートした。細菌(N. meningitidisのOpaD発現分離株)を細胞当り細菌100個の感染の割合で加え37℃で1時間培養した。その後、非接着の細菌を洗浄にて除き、一層の細胞をメタノールにて室温10分間固定した。接着した細菌はN. meningitidisに対するウサギポリクローナル抗血清と、それに続く抗ウサギTRITC融合二次抗体により検出した。
2. van Alphen, L. & van Ham, S. M. . 1994. Rev Med Microbiol 5:245.
3. Foxwell, A. R. et al. 1998. Microbiol Mol Biol Rev 62:294.
4. van Alphen, L. et al. 1995. Am J Respir Crit Care Med 151:2094.
5. Karalus, R. et al. 2000. Microbes & Infection 2:5
6. Kraft, M. 2000. Clin Chest Med 21:301.
7. Virji, M. et al. 1996. Mol Microbiol 22:929.
8. Virji, M. et al. 1996. Mol Microbiol 22:941.
9. Virji, M. et al. 1999. Mol Microbiol 34:538.
10. Virji, M. et al. 2000. Mol Microbiol 36:784.
11. Hill, D. et al. 2001 Mol Microbiol 39: 850.
12. Hammarstroem, S. 1999 Cancer Biol 9:67.
13. Stephens, D. S. 1989. Clin Microbiol Rev 2:S104.
14. Virji, M. et al. 1991. Mol Microbiol 5:1831.
15. Achtman, M. 1995 Trends Microbiol 3:186.
16. Merz, A. J. & So, M. 2000 Annu Rev Cell Dev Biol 16:423.
17. Woods, J. P. & Cannon, J. G. 1990 Infect Immun 58:569.
18. Wang, L-F & Yu, M. 1996 In Methods Mol Biol 66:269 (Morris, G. E. ed). Humana Press.
19. Colman-Lerner. 2000. Trends Guide p. 56 (Wilson, E. ed.).
20. Beauchemin, N., et al., 1999. Exp Cell Res 252: 243-249.
21. Boulton I.C. & Gray-Owen S.D. 2002. Nat Immunol 3(3):229-36.
22. Chen T. et al., 2001. J Leukoc Biol 70(2):335-40.
23. Lafontaine, E.R., et al., 2000. J Bacteriol 182: 1364-1373.
24. Virji, M. 2001. Trends in Microbiology, 9: 258-259.
25. Virji, M. et al. 1995. Mol Microbiol 18: 741-754.
26. Hill, D.J. & Virji, M. 2003. Mol Microbiol 48: 117-129.
27. Holm, M.M., et al. 2004. Infect Immun 72 :1906-1913.
28. Virji, M. et al. 1990. Microb Pathog 9 :441-450.
29. Langermann, S. et al. 1997. Science 276 :607-611.
30. Ofek, I. et al. 2003. FEMS Immunol Med Microbiol 38:181-191.
31. Simon, P.M. et al. 1997. Infect Immun 65:750-757.
32. Idanpaan-Heikkili, I. et al. 1997. J Infect Dis 176:704-712.
33. Kelly, G.C. et al. 1999. Nat Biotechnol 17 :42-47.
34. Gan, B.S. et al. 2002. J Infect Dis 185 :1369-1372.
35. Reid, G. & Burton, J. 2002. Microbes Infect 4:319-324.
36. Pinyon, R.A. et al. 2004. J Infect Dis 189 :1547-1555.
37. Reid, G. et al. 2001. Trends Microbiol 9 :424-428.
38. Toleman, M. et al. 2002. Cell Microbiol 3:33-44.
39. Budt, M. et al. 2002. Biol Chem 383:803-812.
Claims (24)
- 図6に示した配列において残基527から623の配列、および図28に示した配列アラインメントで同定された保存配列からなる群より選択されたアミノ酸配列を含むか、または前記選択されたアミノ酸配列から成る、単離されたポリペプチド。
- 請求項1に記載の単離されたポリペプチドであって、前記保存配列が以下の配列からなる群より選択される単離されたポリペプチド。
QHSSDIKTLK
NVEEGLLDLSGRLIDQKADLTKDIK
NVEEGLLDLSGRLIDQKADIAKNQA
DIAQNQT
DIQDLAAYNELQD
QTEAIDALNKASS
TAELGIAENKKDAQIAKAQANENKDGIAK
NQADIQLHDKKITNLGILHSMVARAVGNNTQGVATNKADIAK
NQADIANNIKNIYELA
NQADIANNI
NIYELA - 請求項1または請求項2に記載の単離されたポリペプチドであって、切断型UspA1タンパク質である単離されたポリペプチド。
- 請求項1から請求項3のいずれか1項に記載の単離されたポリペプチドであって、CEACAM受容体に結合する単離されたペプチド。
- 請求項1から請求項4のいずれか1項に記載のポリペプチドと、1以上の薬剤的に容認可能な補助剤(adjuvant)、媒介物(vehicle)、賦形剤(excipient)、結合剤(binder)、担体(carrier)もしくは防腐剤(preservative)を含む薬剤。
- 感染症の治療もしくは予防のための請求項5に記載の薬剤の使用。
- 病気を引き起こす病原体が細胞を標的化する際にCEACAM受容体が関与する病気の治療もしくは予防のための、請求項5に記載の薬剤の使用。
- 請求項7に記載の使用であって、感染症、呼吸器疾患、腫瘍性疾患とその関連症状、血管新生、虫歯そして歯茎疾患の治療もしくは予防のための使用。
- 請求項6から請求項8のいずれか1項に記載の使用であって、前記感染症が粘膜の感染症、または粘膜を介して生じる感染症である使用。
- 請求項9に記載の使用であって、前記感染症がNeisseria meningitidis、Haemophilus influenzae、もしくはMoraxella catarrhalisにより引き起こされる感染症である使用。
- 請求項9に記載の使用であって、前記感染症がFusobacterium nucleatumにより引き起こされる感染症である使用。
- 請求項5に記載の薬剤の使用であって、中耳炎の予防もしくは治療のための使用。
- 治療薬として用いるための新たな阻害試薬の特定のためのスクリーニング法における請求項1から請求項4のいずれか1項に記載のポリペプチドの使用であって、前記ポリペプチドを擬態する能力、または前記ポリペプチドとの相同性について、潜在的治療薬をスクリーニングすることを含む使用。
- 請求項1から請求項4のいずれか1項に記載のポリペプチドと、1以上の薬剤的に容認可能な補助剤(adjuvant)、媒介物(vehicle)、賦形剤(excipient)、結合剤(binder)、担体(carrier)もしくは防腐剤(preservative)を含むワクチン。
- それを必要としている個体における感染症を治療または予防する方法であって、請求項5に記載の薬剤の有効量を投与することを含む方法。
- 実質的に添付図面の図6を参照して明細書中で説明し、かつ前記図に示されたポリペプチド。
- 請求項16のポリペプチドを含む、実質的に明細書中に記載された薬剤。
- 病気を引き起こす病原体の細胞ターゲッティングにCEACAM受容体が関与する病気の治療もしくは予防のための薬剤の製造におけるCEACAM受容体結合リガンドの使用であって、該リガンドが図6に示した配列において残基527から623の配列、および図28に示した配列アラインメントで同定された保存配列からなる群より選択されたアミノ酸配列、またはCEACAM受容体結合能を保持するそれらの断片もしくは機能的な等価体を含むか、またはこれらから成る使用。
- 請求項18に記載の使用であって、保存された配列が以下の配列からなる群より選択される使用。
QHSSDIKTLK
NVEEGLLDLSGRLIDQKADLTKDIK
NVEEGLLDLSGRLIDQKADIAKNQA
DIAQNQT
DIQDLAAYNELQD
QTEAIDALNKASS
TAELGIAENKKDAQIAKAQANENKDGIAK
NQADIQLHDKKITNLGILHSMVARAVGNNTQGVATNKADIAK
NQADIANNIKNIYELA
NQADIANNI
NIYELA - 請求項18と請求項19に記載の使用であって、前記病気が感染症、呼吸器疾患、腫瘍性疾患とその関連症状、血管新生、虫歯そして歯茎疾患から成る群より選択される病気における使用。
- 請求項18から請求項20のいずれか1項に記載の使用方法であって、前記病原体が粘膜に感染する、もしくは粘膜を介して侵入する使用。
- 請求項18から請求項21のいずれか1項に記載の使用であって、病気を引き起こす病原体が、Neisseria meningitidis、Haemophilus influenzae、およびMoraxella catarrhalisから成る群から選択される使用。
- 請求項18から請求項21のいずれか1項に記載の使用であって、病気を引き起こす病原体がFusobacterium nucleatumである使用。
- 請求項22または請求項23に記載の使用であって、前記病気が中耳炎である使用。
Applications Claiming Priority (5)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
GB0408390.3 | 2004-04-15 | ||
GB0408390A GB0408390D0 (en) | 2004-04-15 | 2004-04-15 | Therapeutic peptides |
GB0419594A GB0419594D0 (en) | 2004-09-03 | 2004-09-03 | Therapeutic peptides |
GB0419594.7 | 2004-09-03 | ||
PCT/GB2005/001465 WO2005099337A2 (en) | 2004-04-15 | 2005-04-15 | Therapeutic peptides |
Related Child Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2011270450A Division JP2012097099A (ja) | 2004-04-15 | 2011-12-09 | 治療用ペプチド |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2007532618A true JP2007532618A (ja) | 2007-11-15 |
JP4960219B2 JP4960219B2 (ja) | 2012-06-27 |
Family
ID=35033424
Family Applications (2)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2007507850A Expired - Fee Related JP4960219B2 (ja) | 2004-04-15 | 2005-04-15 | 治療用ペプチド |
JP2011270450A Withdrawn JP2012097099A (ja) | 2004-04-15 | 2011-12-09 | 治療用ペプチド |
Family Applications After (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2011270450A Withdrawn JP2012097099A (ja) | 2004-04-15 | 2011-12-09 | 治療用ペプチド |
Country Status (11)
Country | Link |
---|---|
EP (2) | EP1735446A2 (ja) |
JP (2) | JP4960219B2 (ja) |
KR (1) | KR20070001274A (ja) |
AU (1) | AU2005232437B2 (ja) |
BR (1) | BRPI0509936A (ja) |
CA (1) | CA2563332A1 (ja) |
IL (1) | IL178517A0 (ja) |
MX (1) | MXPA06011501A (ja) |
NO (1) | NO20065201L (ja) |
NZ (1) | NZ551204A (ja) |
WO (1) | WO2005099337A2 (ja) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2010539917A (ja) * | 2007-09-27 | 2010-12-24 | シャリテ−ウニヴェルジテーツメディツィン・ベルリン | 疾患を診断、治療又はモニタリングするための可溶性ceacam8の使用及びアポトーシスを予防する化合物のスクリーニング方法 |
Families Citing this family (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2008029271A2 (en) | 2006-02-27 | 2008-03-13 | Gal Markel | Ceacam based antibacterial agents |
US20170044268A1 (en) * | 2013-12-23 | 2017-02-16 | OncoMed Pharmaceuticals | Immunotherapy with Binding Agents |
Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2001515467A (ja) * | 1996-12-20 | 2001-09-18 | ボード・オヴ・リージェンツ,ザ・ユニヴァーシティ・オヴ・テキサス・システム | モラクセラ・カタラーリスのuspa1及びuspa2抗原 |
Family Cites Families (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
GB0222764D0 (en) * | 2002-10-02 | 2002-11-06 | Univ Bristol | Therapeutic peptide |
-
2005
- 2005-04-15 CA CA002563332A patent/CA2563332A1/en not_active Abandoned
- 2005-04-15 EP EP05735984A patent/EP1735446A2/en not_active Withdrawn
- 2005-04-15 EP EP11170229A patent/EP2468863A1/en not_active Withdrawn
- 2005-04-15 BR BRPI0509936-6A patent/BRPI0509936A/pt not_active IP Right Cessation
- 2005-04-15 WO PCT/GB2005/001465 patent/WO2005099337A2/en active Application Filing
- 2005-04-15 AU AU2005232437A patent/AU2005232437B2/en not_active Ceased
- 2005-04-15 NZ NZ551204A patent/NZ551204A/en not_active IP Right Cessation
- 2005-04-15 JP JP2007507850A patent/JP4960219B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2005-04-15 KR KR1020067023963A patent/KR20070001274A/ko not_active Application Discontinuation
- 2005-04-15 MX MXPA06011501A patent/MXPA06011501A/es unknown
-
2006
- 2006-10-05 IL IL178517A patent/IL178517A0/en unknown
- 2006-11-13 NO NO20065201A patent/NO20065201L/no not_active Application Discontinuation
-
2011
- 2011-12-09 JP JP2011270450A patent/JP2012097099A/ja not_active Withdrawn
Patent Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2001515467A (ja) * | 1996-12-20 | 2001-09-18 | ボード・オヴ・リージェンツ,ザ・ユニヴァーシティ・オヴ・テキサス・システム | モラクセラ・カタラーリスのuspa1及びuspa2抗原 |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
JPN6010061105, Mol.Microbiol.,2003,48(1),p.117−29 * |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2010539917A (ja) * | 2007-09-27 | 2010-12-24 | シャリテ−ウニヴェルジテーツメディツィン・ベルリン | 疾患を診断、治療又はモニタリングするための可溶性ceacam8の使用及びアポトーシスを予防する化合物のスクリーニング方法 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
NO20065201L (no) | 2006-11-13 |
IL178517A0 (en) | 2007-02-11 |
WO2005099337A3 (en) | 2006-08-10 |
JP4960219B2 (ja) | 2012-06-27 |
NZ551204A (en) | 2010-03-26 |
AU2005232437A1 (en) | 2005-10-27 |
KR20070001274A (ko) | 2007-01-03 |
WO2005099337A2 (en) | 2005-10-27 |
MXPA06011501A (es) | 2007-01-26 |
EP2468863A1 (en) | 2012-06-27 |
AU2005232437B2 (en) | 2011-10-06 |
CA2563332A1 (en) | 2005-10-27 |
EP1735446A2 (en) | 2006-12-27 |
JP2012097099A (ja) | 2012-05-24 |
BRPI0509936A (pt) | 2007-09-25 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Shivshankar et al. | The Streptococcus pneumoniae adhesin PsrP binds to Keratin 10 on lung cells | |
JP2003189879A (ja) | 髄膜炎菌(NeisseriaMeningitidis)のプロテイナーゼK抵抗性表面蛋白質 | |
CN104582722A (zh) | 作为疫苗的艰难梭菌多肽 | |
JP5661744B2 (ja) | 腸球菌由来のポリペプチド、及びワクチン接種のためのその使用 | |
US9310381B2 (en) | Engineered type IV pilin of Clostridium difficile | |
JP4960219B2 (ja) | 治療用ペプチド | |
US9629905B2 (en) | Neisseria meningitidis fHbp variant and its use for vaccination | |
US20100168002A1 (en) | Therapeutic peptides | |
TW201639874A (zh) | 豬胸膜肺炎放線桿菌重組毒素蛋白及其應用 | |
Lobeck et al. | Towards a recombinant vaccine against diphtheria toxin | |
JP2005532789A (ja) | 減少した酵素活性を有する型別不能なインフルエンザ菌(Haemophilusinfluenza)のP4タンパク質の変異体 | |
CN108671228A (zh) | 抗原和抗原组合 | |
AU2002314688B2 (en) | Novel surface exposed immunoglobulin D-binding protein from moraxella catarrhalis | |
JP4763291B2 (ja) | 治療的ペプチド | |
Martin et al. | A common neisserial antigen evidenced by immunization of mice with live Neisseria meningitidis | |
WO2012059556A1 (en) | Novel antigen of enterococcal pathogens and use thereof as vaccine component for therapy and/or prophylaxis | |
US11278609B2 (en) | Polypeptides derived from Enterococcus and their use for vaccination and the generation of therapeutic antibodies | |
WO2012054879A1 (en) | Compositions and methods for the treatment of septic arthritis, osteomyelitis, and bacteremia | |
CN114681601A (zh) | 脑膜炎奈瑟氏球菌疫苗及其应用 | |
CZ200087A3 (cs) | Imunogenní konjugáty obsahující peptin meningokoků skupiny B a polysacharid H. influenzae |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20080219 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20101026 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20110126 |
|
A602 | Written permission of extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602 Effective date: 20110202 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20110426 |
|
A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20110809 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20111209 |
|
A911 | Transfer to examiner for re-examination before appeal (zenchi) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A911 Effective date: 20120124 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20120221 |
|
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20120322 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20150330 Year of fee payment: 3 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |