JP2007531531A - 糞便残渣の酵素消化を用いてオーシストを精製する方法 - Google Patents
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Abstract
Description
本願は、2004年3月31日に出願された米国仮出願第60/558,348号の利益を主張し、前記仮出願は参照することによりそのまま完全な形で本明細書に組み入れられる。
本発明者らは、多糖分解酵素による酵素消化を使って、オーシストの生存能および/または回収率を甚だしく減少させずに、糞便残渣を減少させることができるという発見をした。多糖分解酵素は、不溶性植物材料を、オーシストから容易に除去することができる可溶(例えば水溶液に可溶)な形態に分解するように働く。したがって本発明は、糞便材料を含む組成物からオーシストを精製する方法であって、組成物中の糞便材料の量を減少させる(すなわち固形糞便材料の一部または全てを可溶化することによって、容易に除去できるようにする)のに十分な条件下で、組成物を多糖分解酵素に接触させることを含む方法を提供する。特定の実施形態では、オーシストは、生存可能なオーシストである。
本発明の方法を使って生産される免疫原組成物は、原虫疾患に対するワクチン接種を行なうために、動物対象に投与することができる。本発明の方法を使って生産されたオーシストを含有する免疫原組成物(例えばワクチン)は、免疫応答を誘発するために投与することができる。通例、免疫原組成物は、本明細書に開示する免疫原量のオーシストを、薬学的に許容される担体と一緒に含む。「免疫原量」とは、免疫原組成物を投与する対象において免疫応答を開始または惹起するのに十分であるようなオーシストの量である。当業者には理解されるとおり、免疫原組成物は、生きた生物、弱毒化された生物および/または死滅した生物を使って製剤化することができる。このアプローチは、スポロゾイトまたはスポロシストなどの他の寄生生活段階にも適用可能である。
消化酵素を使ったアイメリアオーシスト精製の実現可能性を調べるために、初期実験を行なった。アイメリア・マキシマのオーシストをブロイラーで生産させた。オーシストを含有する糞便を接種の5〜8日後に、10%クエン酸、0.75〜3%過酸化水素、および0.25%プロオピン酸からなる抗微生物溶液中に収集した。材料を篩い分けして大きな残渣を除去し、10%クエン酸、0.75〜3%過酸化水素、および0.25%プロピオン酸中で撹拌および曝気しながら少なくとも48時間にわたって胞子形成させた。胞子形成後に材料の試料を採取し、さまざまな酵素処理に付した(表1参照)。この実験に使用するために二つの供給業者(NovozymesおよびGenencor)から酵素(セルラーゼおよびアミラーゼ)を入手した。酵素は各調製物に20%(v/v)の濃度で加えた。セルラーゼ処理またはセルラーゼ+アミラーゼ処理の場合は試料のpHを約4.5に調節し、アミラーゼ処理だけの場合はpH7.0に調節した。材料を穏やかに撹拌しながら最高3日間インキュベートし、オーシスト数および残渣決定を行なった。オーシストはMcMastersの方法で数えた(Hodgson,J.N.,(1970)「Coccidiosis:oocysts counting technique for coccidiostat evaluation」Exper.Parasitol.28:99−102)。残渣値は、代表的副次試料を1800×gで10分間遠心分離し、ペレット化した固形物の体積を測定し、試料の単位体積あたりのペレット化可能な固形物の体積を計算することによって決定した。次に、試料1mLあたりのペレット化可能な固形物に関する値に総試料体積を掛けることによって、総固形物を決定した。結果を下記の表1に記載する。
対照試料は正常であるように見えた。最善の結果は1日インキュベーション時のNovozymesセルラーゼで観察された。本質的に定量的なオーシストの回収が得られ、オーシストは正常な外観を持っていた。残渣の約73%は1日間のインキュベーション後に可溶性になった。残渣の減少はさらにインキュベーションを行なってもあまり変化しなかった。これらの結果に基づき、セルラーゼおよび/またはアミラーゼ処理に焦点を合わせて、さらなる研究を行なった。
ブロイラー鳥にアイメリア・マキシマのオーシストを感染させ、オーシスト含有糞便を感染の5〜8日後に収集した。糞便は10%クエン酸、0.75〜3%過酸化水素および0.25%プロピオン酸中に収集した。その懸濁液を篩い分けして、大きな粒子を除去し、10%クエン酸、0.75〜3%過酸化水素、および0.25%プロピオン酸中で撹拌および曝気しながら少なくとも48時間にわたってオーシストを胞子形成させた。胞子形成後に、懸濁液を遠心分離してオーシストおよび糞便残渣をペレット化し、上清を捨てた。密度1.2g/mLに調節した硫酸マグネシウム浮上分離溶液にペレットを再懸濁し、1800×gで約10分間遠心分離した。上清に含有されるオーシストを水で希釈し、他の実験で使用するためにさらに加工した。生産鳥からの未消化糞便材料に相当する残りのペレット化した材料を、10%クエン酸および0.25%プロピオン酸に再懸濁した。これらの固形物は、酵素消化によって可溶化されるべき糞便由来の標的不溶性植物残渣に相当する。これらの固形物を一連の実験で使用することにより、さまざまな酵素消化条件を評価した。残渣の減少は実施例1に記載したように評価した。
上述した固形物の一部を遠心分離することによって9個のレプリケート15mLペレットを調製した。ペレットをPBSで1回洗浄した。次にその懸濁液を遠心分離し、ペレットを適切な処理溶液に再懸濁した。
セルラーゼ処理により残渣が67%減少した。セルラーゼ+キシラナーゼ処理には、セルラーゼ処理だけの場合と比較して、何も利点はないようだった。
セルラーゼ+ペクチナーゼ処理は、重い残渣ペレットの上に清澄な上清を与えた。アミログルコシダーゼ処理およびベータ−グルコシダーゼ処理には、セルラーゼ処理だけの場合と比較して、どちらも目に見える利点がなかった。
ブロイラーニワトリにアイメリア・アセルブリナ、アイメリア・マキシマまたはアイメリア・テネラのいずれかのオーシストを接種した。オーシストを含有する糞便はそれぞれの種のピークオーシスト排出期間中に収集した。10%クエン酸、約0.75〜3%過酸化水素、および0.25%プロピオン酸からなる抗微生物溶液中に、糞便を収集した。試料を篩い分けして大きな残渣粒子を除去し、遠心分離して残渣をペレット化した。
各試料から約5mLのレプリケートペレットを9個調製した。PBSを使ってペレットを1回洗浄した。下記表5に示す処理1〜3用の適切な酵素溶液に、洗浄したペレットを再懸濁した。
処理1〜3を調製したら、処理1緩衝液対照についてオーシスト数の計数および残渣決定を行なった。処理2および処理3は穏やかに撹拌しながら終夜インキュベートした。インキュベーション後に、処理2および処理3について、オーシスト数を数え、残渣決定を行なった。
セルラーゼ+ペクチナーゼ処理では、セルラーゼ処理だけの場合よりも高い残渣減少率が得られた。アミラーゼ処理は、試料をまずセルラーゼ+ペクチナーゼで処理すると、より良い残渣減少を与えた。セルラーゼ+ペクチナーゼ処理後のアミラーゼ処理により、残渣の約79%が除去された。これらの処理では総オーシスト回収率が57〜68%の間で変動した。酵素処理では、標準的な浮上分離技術によって通例達成される50〜90%の回収率に匹敵するかそれを上回るという、許容できるオーシスト回収率が得られた。
セルラーゼ+ペクチナーゼでは、セルラーゼ処理だけの場合の約2倍という、はるかに高い残渣減少率が得られた。アミラーゼ処理は、試料をまずセルラーゼ+ペクチナーゼで処理すると、より良い残渣減少を与えた。セルラーゼ+ペクチナーゼ処理後のアミラーゼ処理により、残渣の約73%が除去された。この実験セットでは、総オーシスト回収率は本質的に定量的だった。
セルラーゼ+ペクチナーゼでは、セルラーゼ処理だけの場合よりも高い残渣減少率が得られた。アミラーゼ処理は、試料をまずセルラーゼ+ペクチナーゼで処理すると、はるかに良好な減少(約4倍高い減少率)を与えた。セルラーゼ+ペクチナーゼ処理後のアミラーゼ処理により、残渣の約81%が除去された。この実験セットでは、総オーシスト回収率は約70%だった。
セルラーゼ+ペクチナーゼでは、セルラーゼ処理だけの場合よりも高い残渣減少率が得られた。アミラーゼ処理は、試料をまずセルラーゼ+ペクチナーゼで処理すると、はるかに良好な減少(約5倍高い減少率)を与えた。セルラーゼ+ペクチナーゼ処理後のアミラーゼ処理により、残渣の約80%が除去された。この実験セットでは、総オーシスト回収率は約75〜95%だった。
pH5でセルラーゼとペクチナーゼの組合せを使った酵素消化では、胞子形成後の残渣レベルが、全てのワクチン株について約60%減少し、オーシスト回収率は平均約82%だった。
ブロイラーニワトリに、アイメリア・アセルブリナ、アイメリア・マキシマまたはアイメリア・テネラのオーシストを接種した。オーシストを含有する糞便はそれぞれの種のピークオーシスト排出期間中に収集した。10%クエン酸、約0.75〜3%過酸化水素、および0.25%プロピオン酸からなる抗微生物溶液中に、糞便を収集した。試料を篩い分けして大きな残渣粒子を除去し、遠心分離して残渣をペレット化した。
ブロイラーニワトリにアイメリア・マキシマのオーシストを接種した。オーシストを含有する糞便を接種の5〜8日後に収集した。糞便は、10%クエン酸、約0.75〜3%過酸化水素、および0.25%プロピオン酸からなる抗微生物溶液中に収集した。試料を篩い分けして大きな残渣粒子を除去し、遠心分離して残渣をペレット化した。
ニワトリ飼料への酵素の使用は、飼料の総合的消化性に寄与することが知られている。試料中の酵素がオーシスト収集時の糞便固形物レベルも低下させる可能性を評価した。製剤中に酵素を添加して、および製剤中に酵素を添加せずに、トウモロコシ/ダイズ飼料を試験した。酵素含有飼料には3種類の市販酵素調製物(Natugrain(登録商標)、Selfeed(登録商標)、およびHemicell(登録商標))の組合せを含めた。2つの飼料処置のそれぞれについて、5つのレプリケートペンを使用し、ブロイラーを1つのペンにつき9羽ずつ配置した。鳥にアイメリア・マキシマオーシストを接種した。オーシストを含有する糞便を、接種の5〜8日後に収集した。10%クエン酸、約0.75〜3%過酸化水素、および0.25%プロピオン酸からなる抗微生物溶液中に糞便を収集した。各レプリケート飼料を総体積8mLに調節し、よく撹拌し、副次試料を採取した。各試料から約50mLの副次試料を2個採取し、4℃で保存した。試料を残渣含量およびオーシスト濃度について分析した。2個のレプリケート8L試料をプールし、篩い分けして大きな残渣粒子を除去し、遠心分離して残渣をペレット化した。この研究で評価した変量には、1羽あたりの初期残渣レベルおよびオーシスト排出量を含めた。
篩い分けした材料の試料3Lを3000rpmで10分間の遠心分離によってペレット化した。上清を捨て、ペレット体積を見積った。3体積の浮上分離溶液(硫酸マグネシウムまたはグリセロール−アルギニン)を使ってペレットを再懸濁した。試料を3000rpmで10分間遠心分離して、オーシストを浮上させた。浮上させたオーシストを含む上清全体をもう一つの容器にデカントし、4体積の水で希釈した。試料を3000rpmで10分間遠心分離してオーシストをペレット化した。上清をデカントして捨てた。オーシストペレットを5%クエン酸200mLに再懸濁した。
篩い分けした材料の試料3Lを3000rpmで10分間の遠心分離によってペレット化した。上清をデカントし、ペレット体積を見積った。2体積の水を使ってペレットを再懸濁した。リン酸二カリウムを加えてpHを5.0に調節した。セルラーゼを20%になるように加え、ペクチナーゼを4%になるように加えた。試料を室温でインキュベートし、約4時間撹拌した。試料を3000rpmで10分間遠心分離した。上清をデカントし、ペレット体積を見積った。3体積の浮上分離溶液(硫酸マグネシウムまたはグリセロール−アルギニン)を使ってペレットを再懸濁した。試料を3000rpmで10分間遠心分離してオーシストを浮上させた。浮上させたオーシストを含む上清全体をもう一つの容器に移し、4体積の水で希釈した。希釈した試料を3000rpmで10分間遠心分離することにより、オーシストをペレット化した。上清を捨て、オーシストペレットを5%クエン酸200mLに再懸濁した。
飼料または加工に酵素を使用することがアイメリア・マキシマオーシストの生存能に及ぼす影響を調べた。アイメリア・マキシマオーシストを、飼料中に酵素を使用して、または飼料中に酵素を使用せずに、ブロイラーで生産した。次に、どちらかの飼料を使って生産されたオーシストを、精製工程に酵素を使用して、または酵素を使用せずに、精製した。
飼料中もしくは加工時またはその両者に酵素を使用しても、オーシスト排出量によって決定されるオーシストの生存能には影響がない。
ニワトリをアイメリアに感染させ、その結果得られるオーシストに富む糞便を、各種のピーク排出期間中に、10%クエン酸、0.75%過酸化水素、および0.25%プロピオン酸の溶液に収集した。糞便を篩い分けして大きな粒子を除去し、オーシストを胞子形成させた。その懸濁液を遠心分離してオーシストをペレット化し、オーシストを含まない上清を捨てた。ペレット化したオーシスト含有材料をpH約5のリン酸緩衝液に再懸濁した。セルラーゼおよびペクチナーゼ酵素を、体積ベースでそれぞれ約5〜10%の濃度で加え、その懸濁液を室温で終夜撹拌した。総オーシスト数および総固形物を酵素処理の前後に決定した。
結果を以下の表16に示す。
Claims (38)
- 糞便材料を含む組成物からオーシストを精製する方法であって、組成物中の糞便材料の量を減少させるのに十分な条件下で、組成物を多糖分解酵素に接触させるステップを含む方法。
- 多糖分解酵素をオーシストとの接触から引き離すステップをさらに含む、請求項1に記載の方法。
- 多糖分解酵素との接触後にオーシストを収集するステップをさらに含む、請求項2に記載の方法。
- 多糖分解酵素が、セルラーゼ、ペクチナーゼ、アミラーゼ、キシラナーゼ、アラビナーゼ、アルファ−ガラクトシダーゼ、ヘミセルラーゼ、ベータ−グルカナーゼ、ベータ−グルコシダーゼ、アミログルコシダーゼ、およびそれらの任意の組合せからなる群より選択される酵素を含む、請求項1に記載の方法。
- 多糖分解酵素がセルラーゼを含む、請求項4に記載の方法。
- 多糖分解酵素がセルラーゼおよびペクチナーゼを含む、請求項5に記載の方法。
- セルラーゼが2×104〜50×104単位/リットルの範囲内の量で存在する、請求項5に記載の方法。
- セルラーゼが4×104〜25×104単位/リットルの範囲内の量で存在する、請求項5に記載の方法。
- 組成物を、セルラーゼおよびペクチナーゼを含む多糖分解酵素に接触させるステップと、
次に、組成物を、アミラーゼを含む多糖分解酵素と接触させるステップと
を含む、請求項1に記載の方法。 - オーシストが胞子形成オーシストである、請求項1に記載の方法。
- オーシストがアイメリア(Eimeria)オーシストである、請求項1に記載の方法。
- アイメリアオーシストが、アイメリア・マキシマ(E.maxima)オーシスト、アイメリア・ミチス(E.mitis)オーシスト、アイメリア・テネラ(E.tenella)オーシスト、アイメリア・アセルブリナ(E.acervulina)オーシスト、アイメリア・ブルネッチ(E.brunetti)オーシスト、アイメリア・ネカトリックス(E.necatrix)オーシスト、アイメリア・プレコックス(E.praecox)オーシスト、アイメリア・ミバチ(E.mivati)オーシスト、およびそれらの任意の組合せからなる群より選択される、請求項11に記載の方法。
- アイメリアオーシストが、アイメリア・メレアグリミティス(E.meleagrimitis)オーシスト、アイメリア・アデノイデス(E.adenoeides)オーシスト、アイメリア・ガロパボニス(E.gallopavonis)オーシスト、アイメリア・ディスパーサ(E.dispersa)オーシスト、アイメリア・イノキュア(E.innocua)オーシスト、およびアイメリア・サブロタンダ(E.subrotunda)オーシスト、ならびにそれらの任意の組合せからなる群より選択される、請求項11に記載の方法。
- アイメリアオーシストが、アイメリア・ツェルニィ(E.zuernii)オーシスト、アイメリア・ボビス(E.bovis)オーシスト、およびそれらの任意の組合せからなる群より選択される、請求項11に記載の方法。
- アイメリアオーシストが、アイメリア・アーサーター(E.ahsata)オーシスト、アイメリア・バクエンシス(E.bakuensis)オーシスト、アイメリア・クランダリス(E.crandallis)オーシスト、アイメリア・ファウレイ(E.faurei)オーシスト、アイメリア・グラニュローサ(E.granulosa)オーシスト、アイメリア・イントリカータ(E.intricata)オーシスト、アイメリア・マルシカ(E.marsica)オーシスト、アイメリア・オビノイダリス(E.ovinoidalis)オーシスト、アイメリア・パリダ(E.pallida)オーシスト、アイメリア・パルバ(E.parva)オーシスト、アイメリア・ウェイブリジェンシス(E.weybridgensis)オーシスト、およびそれらの任意の組合せからなる群より選択される、請求項11に記載の方法。
- アイメリアオーシストが、アイメリア・インテスチナリス(E.intestinalis)オーシスト、アイメリア・ベイドフスキイ(E.vejdovskyi)オーシスト、アイメリア・ピリフォルミス(E.piriformis)オーシスト、アイメリア・コエシコラ(coecicola)オーシスト、アイメリア・イレシドゥア(E.irresidua)オーシスト、アイメリア・フラベセンス(E.flavescens)オーシスト、アイメリア・エキシグア(E.exigua)オーシスト、アイメリア・マグナ(E.magna)オーシスト、アイメリア・パーフォランス(E.perforans)オーシスト、アイメリア・メディア(E.media)オーシスト、アイメリア・スティダイ(E.stiedai)オーシスト、およびそれらの任意の組合せからなる群より選択される、請求項11に記載の方法。
- 組成物を多糖分解酵素に30分〜24時間接触させる、請求項1に記載の方法。
- 組成物を多糖分解酵素に2時間〜10時間接触させる、請求項15に記載の方法。
- 組成物を多糖分解酵素に15℃〜30℃の範囲内の温度で接触させる、請求項1に記載の方法。
- 組成物を多糖分解酵素に21℃〜27℃の範囲内の温度で接触させる、請求項19に記載の方法。
- 組成物を多糖分解酵素にpH1〜pH7.5の範囲内のpHで接触させる、請求項1に記載の方法。
- 組成物を多糖分解酵素にpH4〜pH6の範囲内のpHで接触させる、請求項21に記載の方法。
- 異なるpHで行なわれる2つの酵素消化ステップを含む、請求項1に記載の方法。
- 組成物を、セルラーゼおよびアミラーゼを含む多糖分解酵素に、pH4〜pH5.5の範囲内のpHで接触させるステップと、
次に 組成物を、アミラーゼを含む多糖分解酵素に、pH4〜pH7.5の範囲内のpHで接触させるステップと
を含む、請求項23に記載の方法。 - 密度浮上分離工程をさらに含む、請求項1に記載の方法。
- 密度浮上分離工程が、組成物を多糖分解酵素に接触させた後に行なわれる、請求項25に記載の方法。
- 密度浮上分離溶液が塩溶液である、請求項25に記載の方法。
- 塩溶液が硫酸マグネシウム溶液である、請求項25に記載の方法。
- 密度浮上分離溶液がグリセロール溶液である、請求項25に記載の方法。
- グリセロール溶液がグリセロール−ポリアルギニン溶液である、請求項29に記載の方法。
- 糞便材料が、収集期間前に大きな平均粒径を持つ飼料が与えられていた動物から収集されたものである、請求項1に記載の方法。
- 大きな粒径を持つ飼料がオオムギを含む、請求項31に記載の方法。
- 大きな粒径を持つ飼料がオオムギ−ダイズを含む、請求項32に記載の方法。
- 糞便材料を含む組成物からアイメリアオーシストを精製する方法であって、組成物中の糞便材料の量を減少させるのに十分な条件下で、組成物を、セルラーゼを含む多糖分解酵素に接触させることを含む方法。
- 多糖分解酵素をオーシストとの接触から引き離すことをさらに含む、請求項34に記載の方法。
- 多糖分解酵素との接触後にオーシストを収集するステップをさらに含む、請求項35に記載の方法。
- 多糖分解酵素がペクチナーゼをさらに含む、請求項34に記載の方法。
- 糞便材料を含む組成物からアイメリアオーシストを精製する方法であって、組成物中の糞便材料の量を減少させるのに十分な条件下で、組成物を、セルラーゼおよびペクチナーゼからなる多糖分解酵素と接触させるステップを含む方法。
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