CN1946837B - 使用酶消化粪便残渣纯化卵囊的方法 - Google Patents

使用酶消化粪便残渣纯化卵囊的方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了纯化原生动物卵囊的方法和组合物。在具体的实施方案中，卵囊为艾美尔球虫属卵囊。该方法包括在足以减少粪便物质的量的条件下将包含粪便物质和原生动物卵囊的组合物与多糖酶接触。

Description

使用酶消化粪便残渣纯化卵囊的方法
相关申请信息
本申请要求2004年3月31日提交的美国临时申请第60/558,348号的权益，它通过引用整体结合到本文中。
发明领域
本发明提供了纯化原生动物卵囊的方法和组合物，具体而言，本发明提供了纯化可用于疫苗生产的艾美尔球虫属(Eimeria)卵囊的方法和组合物。
发明背景
家禽的球虫病是由艾美尔球虫属的原生动物寄生虫引起的疾病。环境中普遍存在着艾美尔球虫的卵囊，其在家禽垃圾中存活数月。摄取卵囊导致肠道各区域以种特异性方式受到感染。该生物在肠道内增殖多天，致使下一代的卵囊***在粪便中。多个感染循环导致了免疫性，当早期一群家禽受到感染并以均匀剂量递呈给家禽时，经过数个暴露循环发展的免疫性可相当强。
相反，当禽类没有以均匀方式呈现感染时，可出现幼禽突然受到大量感染的情况，导致了饲料转化、体重增加方面很差的表现和高继发性感染风险。目前，在养禽业中用于控制球虫病的最常用方法并非接种疫苗，而是在饲料中给予抗球虫药物。疫苗的低比例通常是由于在生长设备中经饲料或水给药或在孵卵器中喷洒疫苗不能确定均匀剂量，而它们是给药的常规途径和机会。对改善孵卵器中给药期间的递药均匀性的兴趣正在提高。
最近，已发现了卵内(in ovo)疫苗接种技术可应用于给予基于活卵囊的球虫病疫苗(参见例如美国专利第6,500,438号；美国专利第6,495,146号；美国专利第6,627,205号；都为辉瑞公司所有)。给药的卵内途径提供了递送均匀剂量的疫苗给仍在卵中的各胚胎的方便方法。每年美国生产90亿只肉鸡，大约85％目前采用卵内递送鸟类疫苗，并且每年在美国之外生产的210亿只肉鸡中采用卵内递送鸟类疫苗的比例在增加(参见例如美国专利第4,458,630号；为美国政府所有)。因此，卵内递送活球虫病疫苗的潜在市场显著超过了目前孵化后递送球虫病疫苗的市场。
用于活球虫病疫苗的卵囊来自粪便，其最初大量含有污染微生物。典型地是，调节剂要求卵内递送疫苗显示出基本没有污染微生物。为了保证终产物中生物负荷水平完全最小化，有益的是在卵囊生产过程的各个阶段使用有效控制污染微生物水平的组合物和方法。减少无关固体可增加生物负荷减少方法的效率。
因此，在本领域中需要纯化原生动物卵囊的改进方法，尤其用于疫苗制造。
发明概述
本发明涉及纯化原生动物卵囊(如艾美尔球虫属卵囊)的改进方法和组合物，例如用于疫苗制造。具体关于家禽疫苗，本发明适合生产孵化后或卵内用途的疫苗。同样，该疫苗可用于肉鸡、蛋鸡、种禽、火鸡、业余爱好者和/或家禽业。
本发明部分基于以下发现：含有卵囊的粪便物质可被多糖酶酶消化而不会过分损害卵囊的活力和/或回收。因此，本发明提供了改进的方法，通过使用多糖酶消化粪便物质减少含有卵囊的组合物中的粪便物质。本发明也提供了从含有粪便物质的组合物中纯化卵囊的方法，所述方法包括使用多糖酶消化组合物中的粪便物质。多糖酶将固体、不溶性的植物残渣裂解为可被清除的可溶性亚组分。例如，可通过分离、经诸如离心或切向流过滤的技术分离和浓缩卵囊，去除可溶性的酶消化产物。
通过减少粪便负荷和便于使用较小生产规模，本发明的方法和组合物有利于商业化卵囊生产方法(如用于疫苗)。将组合物中无关的粪便残渣减少到最低限度有利于控制污染微生物，假如需要，生产无菌的终产物。此外，酶消化可大量减少组合物中的固体量，从而导致相应地降低了所有下游工艺的操作规模。生产规模的降低可使得该方法更加有效经济。
酶消化可与较大的纯化方案相结合，可用于与目前纯化卵囊的技术结合，或取代目前的技术(如过筛、浮选、离心等)。假如浮选法为酶消化所取代，则优点包括(1)从纯化过程中去除和减少了腐蚀设备的盐；和/或(2)改善了过程的稳健性。假如在浮选步骤之前使用酶消化，益处可包括减少浮选溶液的体积，浮选溶液的体积通常与粪便物质的起始体积成正比。
因此，第一方面，本发明提供了从包含粪便物质的组合物中纯化卵囊的方法(如有活力的卵囊)，所述方法包括在足以减少组合物中粪便物质的量的条件下使组合物与多糖酶接触。在具体的实施方案中，多糖酶包含纤维素酶、基本由或由纤维素酶组成。在其它实施方案中，多糖酶包含纤维素酶和果胶酶，或基本由或由纤维素酶和果胶酶组成。在再其它的代表性实施方案中，多糖酶包含纤维素酶、果胶酶和淀粉酶，或基本由或由纤维素酶、果胶酶和淀粉酶组成。
再一方面，本发明提供了从包含粪便物质的组合物中纯化艾美尔球虫属卵囊的方法(如有活力的艾美尔球虫属卵囊)，所述方法包括在足以减少组合物中粪便物质的量的条件下，使组合物与包含纤维素酶的多糖酶接触。
本发明也提供了纯化艾美尔球虫属卵囊的方法(如有活力的艾美尔球虫属卵囊)，其用于生产疫苗，所述方法包括在足以减少组合物中粪便物质的量的条件下，使组合物与包含纤维素酶的多糖酶接触。
仍在另一方面，本发明提供了包含多糖酶的组合物，用于使用本发明的方法纯化原生动物卵囊(例如为制造疫苗)。
本发明的这些和其它方面在本发明的以下描述中得到更加详细地阐述。
附图简述
图1显示使用20％(v/v)纤维素酶和4％(v/v)果胶酶消化粪便残渣的时间过程。
发明详述
参考本发明优选的实施方案描述本发明。然而本发明可以以各种不同形式体现，不应当被解释为限于本文阐述的实施方案。而且，提供这些实施方案使得本公开彻底和完全，完全将本发明的范围传达至本领域技术人员。
除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语与本发明所属领域中普通技术人员通常理解的意义相同。本发明的说明书中使用的命名法只是为了描述具体的实施方案，并非为了限制本发明。
本文提及的所有出版物、专利申请、专利和其它参考通过引用整体结合到本文中。
本发明的说明书使用的命名法只是为了描述具体的实施方案，并非为了限制本发明。本发明说明书和后附的权利要求中使用的单数形式也包括了复数形式，除非在上下文中另有清楚说明。
本发明适合于纯化用于医药和兽医用途的卵囊。术语“动物”和“动物对象”包括但不限于哺乳动物和/或禽类对象。
适合的哺乳动物对象包括但不限于人类对象、非人类的灵长类对象如猿、猪、牛(如家牛)、山羊、马、猫、绵羊、犬、鼠(如小鼠和大鼠)和兔对象。
本文使用的术语“禽”和“禽类对象”(即“鸟”和“鸟类对象”)，包括任何鸟类物种的雄性和雌性，但主要包括为蛋、肉或作为宠物而商业饲养的家禽。因此，术语“禽”或“禽类对象”具体包括但不限于雏鸡、火鸡、鸭、鹅、鹌鹑、雉、长尾小鹦鹉、鹦鹉、美冠鹦鹉、澳洲鹦鹉、鸵鸟、鸸鹋等。在具体的实施方案中，禽类对象为雏鸡或火鸡对象。在另外的实施方案中，鸟类对象为雏鸡。本文使用的“禽”或“禽类对象”可以指卵内的禽胚胎或孵化后的禽鸟。
本发明通常涉及纯化原生动物卵囊的方法和组合物。这种方法和组合物，例如，在制造疫苗的方法中找到用途。此外，本发明方法可用于纯化卵囊，其已被遗传修饰，例如用于重组蛋白生产。许多原生动物形成称为“卵囊”的生命期。可实施本发明以纯化任何原生动物物种的卵囊，包括但不限于艾美尔球虫属、隐孢子虫属(Cryptosporidium)、疟原虫属(Plasmodia)、弓形体属(Toxoplasma)和等孢子球虫属(Isospora)。在本发明的实施方案中，本发明的方法和组合物用于纯化艾美尔球虫属卵囊。
术语“原生动物”、“卵囊”、“孢子囊”、“子孢子”、“裂殖子”具有本领域可接受的意义。尽管本领域技术人员理解，可使用死的原生动物、卵囊、孢子囊、子孢子和裂殖子制成疫苗，但除非另有说明，这些术语是指活的(即有活力的)原生动物、卵囊、孢子囊、子孢子和裂殖子，包括减毒形式。本领域技术人员应理解的是，通常首先通过纯化活的生物体制备死的疫苗。通常也包括遗传修饰的原生动物、卵囊、孢子囊、子孢和裂殖子。卵囊可以是孢子形成的或非孢子形成的。
术语“艾美尔球虫属”表明一个或多个艾美尔球虫属的种。术语“艾美尔球虫属”包括但不限于感染禽类(如雏鸡、火鸡)或哺乳动物(如牛、绵羊或兔)物种的艾美尔球虫属的各株或种。这种艾美尔球虫属的种包括在雏鸡中发现的种，包括柔嫩艾美尔球虫(E.tenella)、堆形艾美尔球虫(E.acervulina)、巨型艾美尔球虫(E.maxima)、毒害艾美尔球虫(E.necatrix)、和缓艾美球(E.mitis)、基前艾美尔球虫(E.praecox)、变位艾美尔球虫(E.mivati)和布氏艾美尔球虫(E.brunetti)；也包括在火鸡中发现的，包括火鸡和缓艾美尔球虫(E.meleagrimitis)、腺型艾美尔球虫(E.adenoeides)、火鸡孔雀艾美尔球虫(E.gallopavonis)、分散艾美尔球虫(E.dispersa)、无害艾美尔球虫(E.innocua)和近圆艾美尔球虫(E.subrotunda)；以及感染牛的种，包括牛艾美尔球虫(E.bovis)和邱氏艾美尔球虫(E.zuernii)；感染绵羊的艾美尔球虫属的种，如阿萨塔艾美尔球虫(E.ahsata)、巴库艾美尔球虫(E.bakuensis)、槌形艾美尔球虫(E.crandallis)、浮氏艾美尔球虫(E.faurei)、颗粒艾美尔球虫(E.granulosa)、错乱艾美尔球虫(E.intricata)、马氏艾美尔球虫(E.marsica)、类绵羊艾美尔球虫(E.ovinoidalis)、苍白艾美尔球虫(E.pallida)、小艾美尔球虫(E.parva)、温布里吉艾美尔球虫(E.weybridgensi)；感染兔的种，包括肠艾美尔球虫(E.intestinalis)、E.vejdovskyi、梨形艾美尔球虫(E.piriformis)、盲肠艾美尔球虫(E.coecicola)、无残艾美尔球虫(E.irresidua)、黄艾美尔球虫(E.flavescens)、小型艾美尔球虫(E.exigua)、大型艾美尔球虫(E.magna)、穿孔艾美尔球虫(E.perforans)、中型艾美尔球虫(E.media)和斯氏艾美尔球虫(E.stiedai)。另外，术语“艾美尔球虫属”包括上述艾美尔球虫属的种的所有株，包括但不限于野生型菌株、早熟或另外选择的菌株、减毒株和已通过辐射、化学处理等减毒的卵囊。此外，术语“艾美尔球虫属”也包括新发现的艾美尔球虫属的株或种。最后，术语“艾美尔球虫属”包括活的和死的艾美尔球虫属，尽管预期使用活的艾美尔球虫属，除非另有说明。
例如，可通过测定卵囊在宿主中的传染力，评估成活力。在具体的实施方案中，依据本发明方法纯化的“有活力的”卵囊具有未经本发明酶处理的卵囊的至少约60％、70％、80％、90％、95％、99％的传染力。
发现包含艾美尔球虫属卵囊的组合物用于免疫鸟类抗球虫病的方法。免疫接种鸟类抗球虫病的方法为本领域所已知，包括卵内(如美国专利第6,500,438号，第6,495,146号，第6,627,205号，辉瑞公司)和孵化后(如美国专利第3,147,186号，Auburn研究基金会；美国专利第5,055,292号和第4,438,097号，国家研究发展公司(NationalResearch Development Corporation))的疫苗接种方法。
本领域技术人员理解，还可进一步处理卵囊以释放其它生命期(如子孢子或孢子囊)，用于最终的疫苗组合物，或生产用于疫苗接种目的的抽提物或蛋白。
术语“原生动物”包括野生株、早熟或另外选择的株、减毒株和已通过辐射、化学处理等减毒的卵囊。此外，术语“原生动物”也包括任何新发现的原生动物的株或种。最后，术语“原生动物”包括活的或死的原生动物，尽管预期使用活的原生动物，除非另有说明。
术语卵囊的“生产”、“产生”等通常是指从动物收获卵囊和从粪便物质中纯化卵囊的过程。
除非另有说明，本文使用的关于卵囊制备的术语“纯化”是指从含有卵囊的制品中分离或去除粪便残渣和其它不需要的物质。这些术语是为了说明卵囊与存在于粪便中的其它物质的隔离或分离程度有所增加，而不是将绝对所有(或甚至绝大多数)无关物质都从卵囊制品中去除。同样，卵囊制品可含有一定程度的微生物污染物，只要最终的制品适合于预期用途(如作为孵化后的疫苗)。在具体的实施方案中，预期用于卵内给予鸟类的疫苗基本上没有可检测的不希望微生物(即目标原生动物卵囊外的微生物)引起的污染。具体而言，污染微生物为对胚胎致病的微生物(即引起显著的疾病或死亡)。
依据上下文，“纯化”过程可指从粪便中纯化卵囊，生产适合用于疫苗接种目的制品的整个过程。或者，“纯化”过程可指整个纯化方案内的任何步骤的子集或甚至是单个步骤。
本发明提供了纯化卵囊(如艾美尔球虫属卵囊)的方法和组合物。本发明的消化方法可与一个或多个作为纯化方案一部分的其它纯化步骤组合。例如，本发明方法可与本领域已知的其它方法结合使用。
生产卵囊如艾美尔球虫属卵囊的方法为本领域所已知(参见例如美国专利第3,147,186号，Auburn研究基金会；美国专利第4,544,548号，Internationale Octrooi Maatschappij″Octropa″B.V.；美国专利第4,863,731号，Unilever Patent Holdings；国际专利公开WO 00/50072，辉瑞公司；WO 03/020917，Embrex，Inc.；WO 02/37961，NovusInternational，Inc.；Hammond等，(1944)Amer.J.Vet.Res.5：70；Hill等，(1961)J.Parasit 47：357；Jackson，(1964)Parasitology 54：87；Lotze et a！.，(1961)J.Parasit.47：588；Schmatz等，(1984)J. Protozool.31：181；Whitlock，(1959)Aust.Vet J.35：310)。
如本文使用的，假如一个步骤或过程在另一步骤或过程“之前进行”或“之后进行”或相当的语言，就意味着第一步步骤或过程分别发生在纯化方案中第二步步骤或过程的之前或之后，并不排除中间步骤的可能性。
术语“微生物污染”、“由微生物引起的污染”和类似术语是为了表明存在可检测的不希望的有活力微生物，包括但不限于细菌、霉菌、真菌、酵母和病毒(即目标原生动物卵囊之外的微生物)。在具体的实施方案中，卵囊制品基本上没有可检测的微生物污染，意味着在制品中没有检测到显著的微生物污染水平，或卵囊制品中没有任何可检测的微生物污染。检测微生物污染的方法为本领域所已知，取决于所要检测的微生物的种类。
“消毒”或“消毒的”(等术语)是指卵囊制品中微生物污染(即如上定义的有活力的污染微生物)的降低。不是必须卵囊制品中绝对不含微生物污染，只要最终制品适合于它的预期用途(如作为疫苗)。对于欲供卵内给予鸟类的组合物，制品通常基本没有可检测的微生物污染(即没有检测到显著水平的污染微生物)或没有任何可检测的微生物污染，即是无污染的。
缩写“v/v”是指“体积/体积”。缩写“w/v”是指“重量/体积”。
本发明的各个方面在以下得到更加详细的描述。
通过酶消化粪便残渣纯化原生动物的卵囊
本发明发明人发现，使用多糖酶进行酶消化可用于减少粪便残渣而不会过分降低原生动物卵囊的活力和/或回收。多糖酶用作将不溶性植物物质降解为可轻易从卵囊中去除的可溶性形式(如在水溶液中)。因此，本发明提供了从包含粪便物质的组合物中纯化卵囊的方法，其中该方法包括在足以减少组合物中粪便物质的量的条件下(即溶解，因此容易去除一些或所有的固体粪便物质)，使组合物与多糖酶接触。在具体的实施方案中，卵囊为有活力的卵囊。
可使用任何包含粪便物质和卵囊的组合物实施本发明的方法。为了说明，卵囊可收集自受感染动物的粪便、盲肠、肠内层或其它组织等。为商业目的，卵囊典型地收集自受感染动物的粪便。
依据本发明，多糖酶可包括一种或多种多糖降解酶。当两种或更多种多糖降解酶用于本发明方法时，可同时或按任何顺序连续使用酶。多糖酶为本领域已知，包括但不限于纤维素酶、果胶酶、淀粉酶、木聚糖酶、***糖酶、α-半乳糖苷酶、半纤维素酶、β-葡聚糖酶、β-葡糖苷酶和淀粉葡糖苷酶。
在本发明的一个代表性实施方案中，多糖酶包含纤维素酶，或基本由或由纤维素酶组成。“基本由纤维素酶组成”是指多糖酶只含有不明显水平的纤维素酶以外的多糖酶。
在另外的代表性实施方案中，组合物与纤维素酶和果胶酶接触。在另外的示例性实施方案中，组合物为纤维素酶、果胶酶和淀粉酶所消化。在一个这样的实施方案中，首先使用纤维素酶和果胶酶消化组合物，然后使用淀粉酶消化(例如使用纤维素酶和果胶酶的酶降解完成或大体上完成后，如至少完成70％、80％或90％)。
可选择并优化酶消化的特异性反应条件，以获得任何希望的终点如纯化程度、卵囊的回收率、卵囊的活力、生产规模、时间效率、成本效率、与方法中其它步骤的兼容性、与设备的兼容性等。
选择加入到组合物中的酶量以获得希望的纯化水平，而没有对卵囊的回收和/或活力产生不利影响。本领域技术人员应理解，完成酶消化所需要的时间周期依赖于温度、酶浓度和所使用的具体酶。因此，较低的酶浓度、较长的反应时间和/或较高的反应温度典型地用于获得相同程度的消化。
在具体的实施方案中，各种酶存在的浓度为至少约0.25×103单位/升、约0.5×103单位/升、约1×103单位/升、约2×103单位/升、约5×103单位/升、约1×104单位/升、约2×104单位/升、约4×104单位/升、约5×104单位/升、约1×105单位/升、约2×105单位/升或约3×105单位/升，少于约2×104单位/升、约3×104单位/升、约5×104单位/升、约8×104单位/升、约10×104单位/升、约12×104单位/升、约15×104单位/升、约20×104单位/升、约25×104单位/升、约30×104单位/升、约40×104单位/升、约50×104单位/升、约10×105单位/升、约15×105单位/升、约20×105单位/升、约35×105单位/升、约50×105单位/升、约10×106单位/升、约20×106单位/升、约25×106单位/升或约30×106或更多，上限和下限任意组合。
对于纤维素酶，在说明性实施方案中，纤维素酶存在的量为约0.5×104至35×105单位/升、约1×104至15×105单位/升、约2×104至50×104单位/升、约3×104至30×104单位/升、约4×104至25×104单位/升、或约8×104至20×104单位/升或更多。
对于果胶酶，在代表性实施方案中，果胶酶存在的量为约5×104至20×106单位/升、约1×105至10×106单位/升、约2×105至5×106单位/升或约3×105至2.5×106单位/升或更多。
对于淀粉酶，在代表性实施方案中，淀粉酶存在的量为约0.25×103至15×104单位/升、约0.5×103至8×104单位/升、约1×103至5×104单位/升、或约2×103至3×104单位/升或更多。
选择酶消化的持续时间以获得希望的粪便残渣减少，而不对卵囊的回收和活力产生不利影响。如上说讨论的，酶反应速率通常取决于反应温度、酶浓度和具体使用的多糖酶。在具体的实施方案中，消化反应进行至少约30分钟、45分钟、1小时、2小时或3小时，长至约3、4、6、8、10、12、15、18、20、24、30或36小时或更长，上限和下限任意组合。进行酶消化的说明性时间范围为约30分钟至24小时，约1小时至20小时，约1至15小时，约2至10小时，约2至8小时，约2至5小时。在某些情况下，进行酶消化的时间比完成反应需要的时间更长。例如，为了方便进行消化过夜，技术反应在较短的时间内完成。
酶消化的过程典型地在获得希望反应速率的温度下进行(即反应时间)，但对卵囊的回收和/或活力不产生不利影响。一般而言，温度通常小于约31℃或32℃。在本发明的实施方案中，温度为至少12、15、18、20、21、22或24℃，小于约26、27、28、29或30℃，上限和下限任意组合。酶消化说明性温度在约15℃至30℃、约18℃至29℃、约21℃至27℃之间的范围内。
相似地，可常规选择反应pH以获得希望的酶活水平和卵囊纯化。在示例性实施方案中，使用纤维素酶和/或果胶酶的消化在约pH 1至pH 7.5、约pH 2至pH 6.5、约pH 3至pH 6或约pH 4至pH 5.5或6的pH范围内进行。对于淀粉酶的情况，反应通常从约pH 4至pH7.5下进行，部分取决于淀粉酶的来源(如来自细菌或真菌)。在具体的实施方案中，进行反应的pH范围为约pH 4.5至pH 7、约pH 6至pH 8或约pH 6.5至pH 7.5。
假如使用不止一种酶进行消化，可针对各酶反应调节溶液的pH。在示例性方法中，首先使用纤维素酶和/或果胶酶在约pH 3至pH6或约pH 4至pH 5.5或6的pH范围内消化组合物。然后，通过添加碱或通过用期望pH范围内的溶液交换(例如通过离心沉淀并重新悬浮于新溶液中)，调节溶液的pH到约pH 4至pH 7.5或约pH 6.5至pH 7.5，用于淀粉酶消化。
在温度和pH“范围”内实现反应，是指反应可分别在上述温度和pH范围内的一个或不止一个的温度或pH下进行。
在获得希望水平的酶消化后，可任选将酶去除(例如，通过诸如离心或切向流过滤等标准技术将卵囊从液体物质中分离出来)或灭活(例如通过改变温度和/或pH，和/或通过化学灭活)。因此，在具体的实施方案中，该方法还包括除去酶与卵囊的接触，并任选收集卵囊(例如，通过离心、浮选或切向流过滤)，以用于纯化方案的下一步，用于消毒，或用于最终用途如制造疫苗。
本发明的一个示例性酶消化方法如下说明。依据此实施方案，组合物包含艾美尔球虫属卵囊。使用纤维素酶和任选的果胶酶消化该组合物约2至18小时，温度在约21℃至27℃的范围内，pH在约pH 4至pH 6的范围内。纤维素酶的浓度在约8×104至20×104单位/升的范围内，假如存在，果胶酶的浓度在约1×105至10×106单位/升的范围内。
本发明的酶消化方法可单独使用，或可并入较大的卵囊纯化方案。生产卵囊的方法为本领域所已知，包括生产艾美尔球虫属卵囊的方法，如以下所描述的：Auburn研究基金会的美国专利第3,147,186号；Internationale Octrooi Maatschappij″Octropa″B.V的美国专利第4,544,548号；Unilever Patent Holdings的美国专利第4,863,731号；辉瑞公司的国际专利申请WO 00/50072；Embrex公司的WO03/020917；Novus International的WO 02/37961；Hammond等，(1944)Amer.J.Vet.Res.5：70；Hill等，(1961)J.Parasit.47：357；Jackson，(1964)Parasitology 54：87；Lotze等，(1961)J.Parasit.47：588；Schmatz等，(1984)J.Protozooi.31：181；Whitlock，(1959)Aust.Vet.J.35：310(以上的公开出版物通过引用整体结合到本文中)。
一般而言，这些方法包括使用目标原生动物感染动物，收集来自受感染动物的含有卵囊的粪便，通过一系列的分离过程如过筛、离心、过滤或密度浮选从粪便物质中纯化卵囊，使卵囊形成孢子，任选另外的分离步骤，并且假如需要，消毒形成孢子的卵囊以灭活污染微生物。然后可组合不同的卵囊制品(例如来自不同的种或株)以形成终产物，例如抗多种原生动物种(如艾美尔球虫属)的疫苗。
可在卵囊纯化过程内的任何点实现酶消化。在收集粪便期间或接近完成时，在上游纯化过程如过筛之前，可进行酶消化。在其它的代表性实施方案中，在上游纯化步骤如过筛或离心后实现酶消化。一般而言，有利的是在下游纯化步骤如浮选之前使用酶消化以减小生产规模。在其它实施方案中，酶消化在下游纯化步骤之前进行或代替下游纯化步骤如浮选。此外，卵囊的孢子形成可发生在酶消化之前、同时或之后。在一些实施方案中，经离心沉淀或通过如切向流过滤技术去除液体，可在形成孢子之前或之后浓缩卵囊。可将酶消化过程合并到该浓缩步骤之前或之后。在本发明的一个说明性实施方案中，将粪便组合物中的卵囊进行上游纯化步骤(如离心和/或过筛)，然后形成孢子。依据本实施方案，在形成孢子步骤之后和下游纯化步骤如密度浮选之前(或代替其)进行酶消化。
在具体的实施方案中，纯化步骤还包括密度浮选步骤，例如，在盐(如硫酸镁)或甘油(甘油-精氨酸)溶液中浮选。在国际专利公开WO 00/50072(辉瑞公司)和WO 03/020917(Embrex，Inc.)中描述了盐和非离子密度浮选溶液以及使用盐和非离子溶液进行密度浮选的方法，它们通过引用整体结合到本文中。在代表性实施方案中，在酶消化过程后进行密度浮选法。
进行卵囊的密度浮选的方法为本领域所已知。在具体的实施方案中，密度浮选包括：在足以导致卵囊浮选的条件下，将含有卵囊的制品悬浮于包含高密度液体的组合物中以形成悬浮液，从悬浮液中回收卵囊。通常，将含有卵囊的物质与浮选溶液混合，允许分离溶液，将卵囊保留在上清部分中，粪便残渣形成沉淀。可使用离心以便于或改善分离。
通过本领域已知的任何合适的方法，包括离心/洗涤步骤、透析和过滤(如切向流过滤)，可将浮选介质从卵囊中去除。
假如需要，可消毒纯化的卵囊，产生无菌溶液。消毒步骤为任选步骤，典型地应用于生产卵内鸟类疫苗的方法中，有时也用于孵化后鸟类疫苗。如本领域所已知的，用于疫苗制品的卵囊常规使用次氯酸钠溶液消毒。其它消毒卵囊的方法描述于WO 03/020917(Embrex，Inc.)，其公开内容通过引用整体结合到本文中。
在本发明的实施方案中，在抗微生物溶液中实现酶消化(任选其它纯化步骤)。多糖酶释放出单糖的作用可潜在增加污染微生物的生长速率。合适的抗微生物溶液的实例公开于国际专利公开WO03/020917(Embrex，Inc.)；其公开内容通过引用整体结合到本文中。
在具体的实施方案中，将包含粪便物质和卵囊的组合物与多糖酶以外的其它酶如脂酶和/或蛋白酶接触(例如同时或以任何顺序)。
本发明发明人还发现，酶消化粪便残渣的效率可受到喂给动物的饲料的影响，粪便物质从上述动物收集。在具体的实施方案中，在收集卵囊期间和/或之前，喂食动物具有大平均颗粒尺寸的饲料。示例性大颗粒饲料含有全粒，如大麦、玉米(例如破碎的玉米)、小麦、燕麦、粟粒和/或高梁。例如，喂给禽类含有大麦的饲料，显示出产生了更有效被消化的组合物。大麦可以是任何适合用于家禽饲料的形式，如蒸熟片状(steamed-flaked)大麦。因此，喂食禽类含有大麦的饲料，例如大麦-大豆饲料，从上述禽类中收集含有卵囊的粪便物质，可进行本发明的方法。说明性饲料含有至少约15％、20％、25％、30％、35％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或更多大麦(w/w)。其它示例性饲料含有约15％至70％(w/w)、约20％至60％(w/w)、约20％至50％(w/w)、约25％至45％(w/w)或约25％至40％(w/w)的大麦。一种代表性饲料含有约35％(w/w)蒸熟片状大麦、约35％(w/w)的高蛋白大豆粉、约10％(w/w)的燕麦片、约6％(w/w)的米糠和其它支持禽类健康的脂肪、矿物质、维生素和添加物。
在WO 03/020917(Embrex，Inc.)中描述了具有大平均颗粒尺寸的动物饲料，其通过引用整体结合到本文中。
喂食禽类酶以改善含多糖饲料的消化率(参见例如U.S.RE38.047；半纤维素酶)、增加生长速率(参见例如U.S.6,333,062；α-半乳糖苷酶)、治疗吸收不良(参见例如U.S.WO 91/04673；纤维素酶或木聚糖酶)和/或糊状***综合症(pasty vent syndrome)的方法为本领域已知。因此，可喂给动物(如禽类)多糖酶，从该动物中收集粪便物质并收获卵囊。多酶制品可商业获得，例如和
Figure G2005800098225D00152
可进行本发明的酶消化方法，以获得希望的粪便物质减少，例如，减少至少约30％、40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％(v/v)、(w/w)或(w/v)或更高。
另外，在具体的实施方案中，来自酶消化过程的卵囊回收率(任选有活力的卵囊)为至少约60％、70％、80％、85％、90％、95％、98％(v/v)、(w/w)或(w/v)或更高。测定卵囊活力的方法为本领域已知，例如通过评估卵囊的感染力(参见例如实施例7)。
免疫原性组合物
可给予动物对象使用本发明方法生产的免疫原性组合物，进行抗原生动物疾病的免疫接种。可给予含有使用本发明方法生产的卵囊的免疫原性组合物(例如疫苗)以引起免疫应答。典型地，免疫原性组合物包含免疫原性量的本文公开的卵囊和药物可接受的载体。“免疫原性量”为足以引出或引起给予免疫原性组合物的对象中免疫应答的卵囊量。本领域那些技术人员理解的是，可用活的、减毒和/或死的生物体配制免疫原性组合物。这种方法也适用于其它寄生生命期，如子孢子或孢子囊。
“药物可接受的”是指非生物学上或其它不期望的物质，即可将该物质给予对象而不引起不期望的生物效应。因此，这种药物组合物可用于，例如，制备免疫组合物。药物可接受的载体可含有其它化合物，包括但不限于稳定剂、盐、缓冲剂、佐剂和/或防腐剂(例如抗菌剂、抗真菌剂和抗病毒剂)，如本领域所已知。药物可接受的载体不需要是无菌的，尽管它通常用于禽类胚胎的卵内给药。
可应用任何本领域已知的免疫原性组合物的给药途径，只要引起抗原生动物的主动免疫应答(优选保护性免疫应答)。当对象为禽时，可卵内或孵化后给予免疫原性组合物。给药的示例性途径为孵化后口服给药或卵内注射(例如注入羊膜)。在本发明具体的实施方案中，使用自动注射设备进行卵内给药。
术语“接种”或“免疫”为本领域所熟知。例如，术语接种或免疫可理解为导致和/或增强对象对抗原的免疫反应的方法，因此能抵抗或克服感染。接种禽类抗艾美尔球虫属的卵内方法为本领域已知(例如美国专利第6,500,438号、美国专利第6,495,146号和美国专利第6,627,205号；辉瑞公司)。
本文使用的术语“保护性免疫”或“保护性免疫应答”意指宿主动物对疫苗产生了主动免疫应答，以至对于随后的暴露或攻击，动物能对抗对感染。因此，保护性免疫应答将在处理动物中降低随后暴露于病原体的发病率和死亡率。本领域技术人员理解，在商业化的动物饲养环境中，可通过评估免疫对整体群体或兽群的接种效果，评估保护性免疫应答的产生，例如，在少数已接种动物中仍然有疾病体症或发病和死亡。
“主动免疫应答”是指对随后暴露于原生动物或原生动物抗原的任何水平的保护，这种保护有利于对象群体，无论是否以降低死亡率、降低损伤、改善饲料转化率或降低疾病的任何其它有害效应等的形式，不管是否这种保护是部分的还是完全的。“主动免疫应答”或“主动免疫”特征为遭遇免疫原之后宿主组织和细胞的参与。其包括淋巴网状组织内免疫活性细胞的分化和增殖，导致抗体的合成或细胞介导反应的发展，或两者皆有。Herbert B.Herscowitz，Immunophysiology：Cell Function and Cellular Interactions in AntibodyFormation，in IMMUNOLOGY：BASIC PROCESSES 117(Joseph A.Bellanti ed.，1985)。或者说明的是，通过感染或在本种情况下通过接种暴露于免疫原后，宿主产生主动免疫应答。主动免疫可与被动免疫对比，被动免疫需要“将预形成的物质(抗体、转移因子、胸腺移植物、白细胞介素-2)从主动免疫宿主传递到无免疫的宿主”。
实施例如下所示，是为了说明本发明而不应解释为限制本发明。
实施例1
酶测试
进行最初的试验以测试使用消化酶纯化艾美尔球虫属卵囊的可行性。在肉鸡中生产巨型艾美尔球虫卵囊。在接种后5-8天，将含有卵囊的粪便收集入由10％柠檬酸、0.75-3％过氧化氢和0.25％丙酸组成的抗微生物溶液。将物质过筛去除大的残渣，在10％柠檬酸、0.75-3％过氧化氢和0.25％丙酸中搅拌通气至少48小时形成孢子。孢子形成后取一份物质样品，进行各种酶处理(见表1)。用于本次试验的酶(纤维素酶和淀粉酶)从两种商业来源获得(Novozymes和Genencor)。向各制品中添加20％(v/v)的酶。调节样品的pH，对于纤维素酶处理或纤维素酶+淀粉酶处理调节至约pH 4.5，对于单独的淀粉酶处理调节至pH 7.0。温和搅拌下温育物质最多3天，对进行卵囊计数和残渣测定。通过McMasters的方法计数卵囊(Hodgson，J.N.，(1970)Coccidiosis：oocysts counting technique for coccidiostat evaluation.Exper.Parasitol.28：99-102)。通过在1800x g将代表性子样品离心10分钟，测量沉淀固体的体积，计算每体积样品的可沉淀固体的体积，测定残渣值。然后通过将每毫升样品可沉淀固体的值乘以总样品体积，测定总固体。结果显示在下面的表1中。
在此实施例和随后的实施例中，从制造商处获得的酶制剂的比活如下：纤维素酶(8.4×105单位/升)；果胶酶(2.6×107单位/升)；淀粉酶(3×105单位/升)。如各个实验所标明的，以v/v为基础稀释物质。
表1使用酶处理含有形成孢子的巨型艾美尔球虫卵囊的雏鸡粪便
  处理命名   酶   来源   温育天数   总卵囊数   总沉淀(mL)   残渣减少百分数   卵囊总收率(％)
  对照1   无   N/A   1   3.75E+06   4.100   0.00   100.0
  对照2   无   N/A   2   4.19E+06   4.500   -9.76   111.7
  对照3   无   N/A   3   4.40E+06   4.00   2.44   117.3
  A1   淀粉酶   Novozymes   1   ND   3.800   -15.85   ND
  A2   淀粉酶   Novozymes   2   ND   3.400   -3.66   ND
  A3   淀粉酶   Novozymes   3   2.42E+06   2.500   23.78   80.7
  B1   纤维素酶   Novozymes   1   3.02E+06   0.900   72.56   100.7
  处理命名   酶   来源   温育天数   总卵囊数   总沉淀(mL)   残渣减少百分数   卵囊总收率(％)
  B2   纤维素酶   Novozymes   2   2.85E+06   0.900   72.56   95.0
  B3   纤维素酶   Novozymes   3   2.70E+06   0.800   75.61   90.0
  AB1   淀粉酶和纤维素酶   Novozymes   1   1.63E+06   1.000   59.35   72.4
  AB2   淀粉酶和纤维素酶   Novozymes   2   1.78E+06   0.900   63.41   79.1
  AB3   淀粉酶和纤维素酶   Novozymes   3   1.55E+06   0.900   63.41   68.9
  C1   淀粉酶   Genencor   1   ND   3.900   -18.90   ND
  C2   淀粉酶   Genencor   2   ND   3.100   5.49   ND
  C3   淀粉酶   Genencor   3   1.75E+06   3.000   8.54   58.3
  D1   纤维素酶   Genencor   1   ND   2.900   11.59   ND
  D2   纤维素酶   Genencor   2   ND   2.200   32.93   ND
  D3   纤维素酶   Genencor   3   3.05E+06   2.700   17.68   101.7
  CD1   淀粉酶和纤维素酶   Genencor   1   2.42E+06   1.500   39.02   107.6
  CD2   淀粉酶和纤维素酶   Genencor   2   2.23E+06   1.400   43.09   99.1
  CD3   淀粉酶和纤维素酶   Genencor   3   1.47E+06   1.200   51.22   65.3
ND：没有测定
结果：
对照样品表现正常。使用Novozymes的纤维素酶在温育1天时观察到最佳结果。获得卵囊的基本定量回收率，卵囊具有正常外观。经温育1天后约73％的残渣变可溶了。更长的温育并没有太多改变残渣减少。基于这些结果，进行了另外的研究，聚焦在纤维素酶和/或淀粉酶处理上。
实施例2
多酶实验I：使用已去除卵囊的粪便固体的研究
使用巨型艾美尔球虫卵囊感染肉鸡，在感染5-8天后收集含有卵囊的粪便。将粪便收集入10％柠檬酸、0.75-3％过氧化氢和0.25％丙酸中。将该悬浮液过筛去除大的颗粒，在10％柠檬酸、0.75-3％过氧化氢和0.25％丙酸中搅拌通气至少48小时，使卵囊形成孢子。在形成孢子之后，将该悬浮液离心，沉淀卵囊和粪便残渣，弃去上清液。将沉淀重新悬浮于密度调节到1.2g/mL的硫酸镁浮选溶液中，1800x g离心约10分钟。用水稀释含在上清液中的卵囊，进一步处理用于其它实验。剩余的沉淀物质代表了来自生产禽类的未消化粪便物质，将其重新悬浮于10％柠檬酸和0.25％丙酸中。这些固体代表来自粪便的目标不可溶残留植物碎片，通过酶消化使其溶解。该固体可用于一系列的实验以评估各种酶消化条件。如实施例1中所述评估残渣减少。
使用纤维素酶和纤维素酶+木聚糖酶处理
通过离心上述固体部分，制备9份15mL沉淀的重复。使用PBS洗涤沉淀一次。然后离心悬浮液，将沉淀重新悬浮于合适的处理溶液中。
表2：纤维素酶和木聚糖酶处理
  处理#   描述   重复   每份重复的起始沉淀体积(mL)
  1   缓冲对照。调节PBS至pH 5.0   3   15
  2   调节至pH 5.0的PBS中的20％纤维素酶   3   15
  3   每mL溶液中20％纤维素酶加17单位的木聚糖酶   3   15
在室温下将所有的重复温和搅拌温育过夜。然后在3000rpm下将悬浮液离心10分钟，测量沉淀固体的体积。
表3：多酶实验I的结果：已去除卵囊的粪便固体的酶处理
  处理   管1残渣(mL沉淀)   管2残渣(mL沉淀)   管3残渣(mL沉淀)   平均沉淀(mL)   沉淀减少步骤百分比
  1-缓冲对照   15   15   15   15.00   0.00
  2-纤维素酶   4.5   5   5   4.83   67.8
  3-纤维素酶+木聚糖酶   4.5   5   5   4.83   67.8
结果
纤维素酶处理提供了残渣减少67％。纤维素酶加木聚糖酶处理没有表现出超过单独纤维素处理的任何优势。
使用3份来自实验I处理2-纤维素酶的重复管进行了另外的实验。向纤维素酶处理中直接加入果胶酶、淀粉葡糖苷酶或β-葡糖苷酶，温和搅拌下温育过夜。
表4：纤维素酶处理后使用果胶酶、淀粉葡糖苷酶或β-葡糖苷酶处理
  处理   起始沉淀体积(mL)   最终沉淀体积(mL)   备注
  2-纤维素酶；然后加入果胶酶   4.5   4.5   澄清的上清液
  2-纤维素酶；然后加入淀粉葡糖苷酶   5   5   没有可见变化
  2-纤维素酶；然后加入β-葡糖苷酶   5   5   没有可见变化
结果：
纤维素酶+果胶酶处理在大量残渣沉淀之上产生了澄清的上清液。淀粉葡糖苷酶和β-葡糖苷酶处理都不能提供任何超过单独纤维素酶处理的可见优势。
实施例3
多酶实验II：使用含有艾美尔球虫属卵囊的粪便物质的研究
使用任何堆形艾美尔球虫、巨型艾美尔球虫或柔嫩艾美尔球虫卵囊接种肉鸡雏鸡。在各个种产出卵囊的高峰期收集含卵囊的粪便。将粪便收集入由10％柠檬酸、约0.75-3％过氧化氢和0.25％丙酸组成的抗微生物溶液。将样品过筛去除大的残渣颗粒，离心沉淀残渣。
3份重复样品各自由5mL沉淀固体重新悬浮于pH 5.0的PBS中组成，作为每次处理的对照。制备各酶处理的3份重复样品。将样品重新悬浮于20％的纤维素酶pH 5.0的PBS溶液中，或重新悬浮于含有4％果胶酶的20％纤维素酶pH 5.0的PBS溶液中，室温下温和搅拌温育至少4小时。使用McMasters方法计数对照和处理样品中的卵囊，通过实施例1中所述的方法测定固体。相对于对照样品计算残渣减少和卵囊的回收率。
固体的制备
从各样品制备9份约5mL沉淀的重复。使用PBS洗涤沉淀一次。将洗涤过的沉淀重新悬浮于合适的酶处理溶液，用于下表5所指的处理1-3。
表5：使用纤维素酶+果胶酶处理
 处理#   描述  #重复   每份重复的起始沉淀体积(mL)
  1   缓冲对照。调节PBS至pH 5.0   3   5
  2   1.5LPBS中20％纤维素酶，调节至pH 5.0   3   5
  3   20％纤维素酶加4％木聚糖酶，pH 5.0   3   5
方法
在制备处理1-3时，对处理1缓冲对照进行了卵囊计数和残渣测量。温和搅拌温育处理2和3过夜。温育后，对处理2和3进行卵囊计数和残渣测量。
然后如表6中所示，使用来自处理2和3的残留物质制备处理2-淀粉酶和3-淀粉酶。
表6：使用纤维素酶或纤维素酶+果胶酶处理后使用淀粉酶处理
  处理#   描述  #重复   每重复起始沉淀体积(mL)
  2-淀粉酶   20％纤维素酶；随后在pH 7处2％淀粉酶   3   5
  3-淀粉酶  20％纤维素酶加4％果胶酶；随后在pH 7处2％淀粉酶   3   5
将含有来自处理2和3残留物质的管离心，使用PBS洗涤沉淀一次。将洗涤过的沉淀重新悬浮于淀粉酶溶液。室温下温和搅拌，温育过夜后，对卵囊计数(Hodgson，J.N.，(1970)Coccidiosis：oocystscounting technique for coccidiostat evaluation.Exper.Parasitol.28：99-102)，并对处理#2和3进行残渣测定。
表7：使用含有堆形艾美尔球虫的雏鸡粪便的酶测试结果
  处理#   平均沉淀(mL)   步骤沉淀减少％   总沉淀减少％   平均总卵囊   步骤卵囊回收率％   卵囊总收率
  1-缓冲对照   3.50   0   0   1.29E+07   100.0   100.0
  2-纤维素酶   1.77   50   50   7.33E+06   57.0   57.0
  3-纤维素酶+果胶酶   1.50   57   57   8.73E+06   67.8   67.8
  2-纤维素酶；随后淀粉酶   1.27   28   64   8.75E+06   119.3   68.0
  3-纤维素酶+果胶酶；随后淀粉酶   0.73   51   79   8.22E+06   94.2   63.9
结果
纤维素酶加果胶酶处理比单独使用纤维素酶处理产生了更佳的残渣减少。当首先使用纤维素酶+果胶酶处理样品时，淀粉酶处理产生了较好的残渣减少。使用纤维素酶+果胶酶处理后使用淀粉酶处理，去除了大约79％的残渣。这些处理的总卵囊回收率在57％和68％之间变化。酶处理提供了可接受的卵囊回收率，可与典型通过标准浮选技术获得的50％-90％卵囊回收率相比，或优于此。
表8：使用含有柔嫩艾美尔球虫的雏鸡粪便的酶测试结果
  处理   平均沉淀(mL)   步骤沉淀减少％   总沉淀减少％   平均总卵囊   步骤卵囊回收率％   卵囊总收率
  1-缓冲对照   5.00   0   0   1.82E+07   100.0   100.0
  2-纤维素酶   3.50   30   30   1.90E+07   104.5   104.5
  3-纤维素酶+果胶酶   2.00   60   60   1.36E+07   74.9   74.9
  2-纤维素酶；随后淀粉酶   2.43   30   51   1.46E+07   76.9   80.3
  3-纤维素酶+果胶酶；随后淀粉酶   1.33   33   73   1.68E+07   123.4   92.4
结果
纤维素酶+果胶酶产生了更佳的残渣减少，大约2倍于单独的纤维素酶处理。当首先使用纤维素酶+果胶酶处理样品时，淀粉酶处理产生了较好的残渣减少。使用纤维素酶+果胶酶处理后使用淀粉酶处理，去除了大约73％的残渣。在这组实验中总卵囊回收率基本上是定量的。
表9：使用含有巨型艾美尔球虫的雏鸡粪便的酶测试结果
  处理   平均沉淀(mL)   步骤沉淀减少％   总沉淀减少％   平均总卵囊   步骤卵囊回收率％   卵囊总收率
  1-缓冲对照   3.93   0   0   1.59E+06   100.0   100.0
  2-纤维素酶   2.00   49   49   1.85E+06   116.6   116.6
  3-纤维素酶+果胶酶   1.60   59   59   1.44E+06   90.8   90.8
  2-纤维素酶；随后淀粉酶   1.73   13   56   1.12E+06   60.2   70.2
  3-纤维素酶+果胶酶；随后淀粉酶   0.73   54   81   1.15E+06   79.8   72.5
结果
纤维素酶+果胶酶处理比单独的纤维素酶处理产生了更佳的残渣减少。当首先使用纤维素酶+果胶酶处理样品时，淀粉酶处理产生了较好的残渣减少(～4倍高)。使用纤维素酶+果胶酶处理后使用淀粉酶处理，去除了大约81％的残渣。在这组实验中总卵囊回收率大约为70％。
总结论
纤维素酶+果胶酶处理比单独的纤维素酶处理生产了更佳的残渣减少。当样品首先使用纤维素酶+果胶酶处理时，淀粉酶处理产生了较好的残渣减少(～5倍高)。使用纤维素酶+果胶酶处理后使用淀粉酶处理，去除了大约80％的残渣。在这组实验中总卵囊回收率大约为75％-95％。
总结
对于所有疫苗株，在孢子形成之后，使用纤维素酶和果胶酶的组合在pH 5下进行酶消化，减少了大约60％的残渣水平；卵囊回收率平均为约82％。
在孢子形成后，纤维素酶+果胶酶处理后使用淀粉酶在pH 7下消化，产生了总的大约80％的残渣减少；在淀粉酶处理后，该步骤的卵囊回收率平均为94.4％。使用酶连续处理的总卵囊回收率平均为76％。
实施例4
使用纤维素酶和果胶酶对三种艾美尔球虫种的酶消化
使用任何堆形艾美尔球虫、巨型艾美尔球虫和柔嫩艾美尔球虫接种肉鸡幼雏。在各个种的卵囊***高峰期收集含有卵囊的粪便。将粪便收集入由10％柠檬酸、约0.75-3％过氧化氢和0.25％丙酸组成的抗微生物溶液中。将样品过筛去除大的残渣颗粒，离心沉淀残渣。
三份重复样品各由5ml沉淀固体重新悬浮于pH 5.0的PBS中组成，作为各处理对照。对每种酶处理制备三份重复样品。将样品重新悬浮于20％纤维素酶溶液或具有4％果胶酶的20％纤维素酶溶液(pH5的PBS中)，室温下温和搅拌温育至少4小时。在对照和处理样品中使用标准的显微镜技术对卵囊进行计数，通过离心样品测定固体，测量沉淀体积。相对对照样品，计算残渣减少和卵囊的回收率。结果显示于下表10中。
表10：单独使用纤维素酶或与果胶酶组合对三种艾美尔球虫种的残渣消化
Figure G2005800098225D00251
结果表明纤维素酶与果胶酶组合比单独的纤维素酶处理产生了更高的残渣减少。任一种酶处理提供了可接受的卵囊回收率，可与典型通过标准浮选技术获得的50％-90％卵囊回收率相比，或优于此。
实施例5
使用20％纤维素酶和4％果胶酶消化粪便残渣的时间过程
使用巨型艾美尔球虫卵囊接种肉鸡幼雏。接种后5-8天收集含有卵囊的粪便。将粪便收集入由10％柠檬酸、约0.75-3％过氧化氢和0.25％丙酸组成的抗微生物溶液。将该样品过筛去除大的残渣颗粒，离心沉淀残渣。
制备20份重复的5mL沉淀固体样品。调节样品的pH至约pH5.0。离心样品，沉淀固体。将2份对照样品重新悬浮于调节至pH 5.0的PBS中。离心2份样品沉淀固体，测量固体的体积。将剩余的18份样品重新悬浮于20％纤维素酶加4％果胶酶的PBS溶液中(pH调节至5.0)。室温下温和搅拌温育样品。以约半小时的间隔离心1份样品，测量沉淀的体积。相对于两份对照样品的平均沉淀体积，计算残渣的减少百分率。结果显示于图1中。
结果表明使用纤维素酶和果胶酶的组合对残渣进行酶消化，约1小时内约完成90％，3-5小时内约完成99％。总之，纤维素酶和果胶酶溶解了样品中大约57％的残渣。
实施例6
饲料中使用酶
已知在雏鸡饲料中使用酶有助于饲料的完全消化。对饲料中的酶也可减少卵囊收集时粪便固体水平的可能性进行了评估。在配方中存在或不存在添加酶时测试了玉米/大豆饲料。含有酶的饲料中包括了三种商业酶制品的组合(和
Figure G2005800098225D00262
)。每栏中放置9只肉鸡，2种饲料处理各自使用5个重复栏。使用巨型艾美尔球虫卵囊接种禽类。接种后5-8天收集含有卵囊的粪便。将粪便收集入由10％柠檬酸、约0.75-3％过氧化氢和0.25％丙酸组成的抗微生物溶液。将每份重复样品调节至8L总体积，温和搅拌，分成子样。从每个样品中取～50mL的2份子样，存储在4℃。分析样品的残渣含量和卵囊浓度。将两个重复的8L样品混合，过筛去除大的残渣颗粒，离心沉淀残渣。此研究中评估的变量包括最初的残渣水平和每只禽的卵囊产出量。
表11显示了接种5-8天后收集的粪便中每只禽的平均沉淀物质，和每只禽的平均卵囊。对于发生死亡的栏，基于死亡的天数计算禽类的平均数。使用独立样品t检验比较各处理，发现每只禽的沉淀或每只禽的卵囊产出量并没有显著的处理差别，尽管每只禽的沉淀在数量上低于饲料中添加了酶的禽。
在添加酶或不添加酶实验饲料间，每只禽的沉淀体积或每只禽的卵囊产出量没有显著差别。
表11：巨大艾美尔球虫攻击后使用不同饲料的每只禽的平均卵囊数和平均沉淀数的比较
Figure G2005800098225D00271
饲料的主要作用不显著(p＞0.5)
将来自加有酶或不加酶的玉米/大豆饲料的粪便物质样品过筛，比较结果。对于每个处理，将代表总共18只禽的2份重复样品混合，连续通过18、60和230目的筛。记录体积，在过筛的各个阶段取出代表性子样。分析样品的残渣含量和卵囊浓度。计算通过过筛过程的卵囊回收率和残渣减少率。
表12：使用玉米/大豆饲料的过筛结果分析
  描述   体积(mL)   总卵囊数   总沉淀(mL)   残渣减少百分率(步骤)   残渣减少百分率(总体)   总卵囊回收百分率(步骤)   总产率(％)
  起始物质   16   5.84E+08   3200   0.00   0.00   100.00   100.000
  18目后   21   6.15E+08   2100   34.38   34.38   105.36   105.4
  60目后   23   5.36E+08   1380   34.29   56.88   87.10   91.8
  230目后   25.5   4.59E+08   1020   26.09   68.13   85.65   78.6
表13：使用玉米/大豆加酶饲料的过筛结果分析
  描述   体积(mL)   总卵囊数   总沉淀(mL)   残渣减少百分率(步骤)   残渣减少百分率(总体)   总卵囊回收百分率(步骤)   总产率(％)
  起始物质   16   6.93E+08   2560   0.00   0.00   100.00   100.0
  18目后   19   6.27E+08   1710   33.20   33.2   90.50   90.5
  60目后   22   5.59E+08   1320   22.81   48.44   89.12   80.7
  230目后   24   5.11E+08   840   36.36   67.19   91.48   73.8
结果表明两种饲料的卵囊回收率和最终的沉淀水平是相似的。在过筛过程中，在品质上应注意到，从玉米/大豆加酶饲料获得的样品比非酶处理的样品较不粘稠，更易于倾倒过筛。
总之，在饲料中使用酶不能显著减少收集或过筛后的固体体积。然而，观察到使禽类食用了含有酶的饲料缓解了糊状***物的问题，这可能归因于酶降低粘度的效果。而饲料中的酶并不能成功减少起始固体的数量，在卵囊生产期间在饲料中加入酶可提供另外的好处，如改善总体禽类健康，改善过筛性质。
还测试了使用加酶或不加酶的玉米/大豆饲料以及加酶或不加酶的大麦/大豆饲料所生产的物质，使用具有酶和不具有酶的下游过程，随后使用两种不同的浮选溶液进行浮选。
只有浮选
将3L过筛物质的样品在3000rpm下离心10分钟使其沉淀。倒出上清，估计沉淀体积。使用3体积的浮选溶液(硫酸镁或甘油-精氨酸)重新悬浮沉淀。将该样品3000rpm下离心10分钟以悬浮卵囊。将包含悬浮卵囊的全部上清倒入另一个容器，使用4体积水稀释。3000rpm下离心该样品10分钟沉淀卵囊。倒出上清，弃去。将卵囊沉淀重新悬浮于200ml 5％的柠檬酸中。
酶处理后浮选
将3L过筛物质的样品在3000rpm下离心10分钟使其沉淀。倒出上清，估计沉淀体积。使用2体积水重新悬浮该沉淀。加入磷酸氢二钾调节pH至5.0。加入纤维素酶至20％，加入果胶酶至4％。室温下温育样品，搅拌约4小时。3000rpm下离心样品10分钟。倒出上清，估计沉淀体积。使用3体积的浮选溶液(硫酸镁或甘油-精氨酸)重新悬浮该沉淀。将该样品3000rpm下离心10分钟悬浮卵囊。将包含悬浮卵囊的全部上清倒入另一个容器，使用4体积水稀释。将稀释的样品3000rpm离心10分钟以沉淀卵囊。弃去上清，将卵囊沉淀重新悬浮于200ml 5％的柠檬酸中。
表14：卵囊的纯化：饲料、加工中酶处理和浮选溶液组成对残渣去除和卵囊回收的作用
Figure G2005800098225D00291
与其它处理相比，加工中酶处理随后使用甘油-精氨酸进行浮选较好的去除了残渣。一般而言，使用基于大麦的饲料改善了卵囊的回收率。
实施例7
使用酶生产的卵囊的活力
测试了在饲料中或在加工中使用酶对巨型艾美尔球虫卵囊的活力的效果。巨型艾美尔球虫卵囊产生自饲料中添加或不加酶的肉鸡。然后在纯化过程中使用和不使用酶纯化使用两种饲料产生的卵囊。
为了测试如上述生产的纯化卵囊的活力，在多层鸡笼中每栏放5只肉鸡，每个处理5栏。在整个实验中所有的肉鸡都喂食正常肉鸡的幼雏饲料。经口腔强饲法给予肉鸡适当处理的1000个形成孢子的巨型艾美尔球虫卵囊。在给予时卵囊小于2月龄。在攻击后第5天取出纸，向各盘中加入2L收集液(10％柠檬酸和0.25％丙酸)。在攻击后的第8天对肉鸡进行安乐死，分别从各盘中收集粪便。各样品用水调节至4L总体积，在商业混合器中以中等速度简单混合，分成子样。使用McMasters方法测定卵囊浓度。结果在下表中所示。
表15：来自使用酶生产和/或加工的卵囊的卵囊产出结果对比
  处理#   卵囊生产时在饲料中使用酶   在加工中使用酶   每只鸡的总卵囊   CV(％)
  1   否   否   3.88E+07   11.0
  2   否   是   3.98E+07   14.5
  3   是   否   3.70E+07   8.7
4 是   是   3.62E+07   5.0
结论
如卵囊产出所测，在饲料或加工或两者中使用酶对卵囊的活力没有影响。
实施例8
酶在卵囊纯化方法中的生产规模用途
使用艾美尔球虫感染雏鸡，在各个种产出高峰期，将所得富含卵囊的粪便收集入10％柠檬酸、0.75％过氧化氢和0.25％丙酸的溶液中。将粪便过筛，去除大的颗粒，使卵囊形成孢子。离心该悬浮液以沉淀卵囊，弃去无卵囊的上清。将含有卵囊的沉淀物质重新悬浮于pH～5的磷酸盐缓冲液中。以体积为基础添加约5-10％的纤维素酶和果胶酶，室温下将该悬浮液搅拌过夜。在酶处理之前和之后测定总卵囊数和总固体量。
结果
结果显示在下表16中。
表16：在卵囊纯化中酶的生产规模用途的结果
  批数   艾美尔球虫   卵囊回收率(％)   酶消化之前的总固体(L)   酶消化之后的总固体(L)   固体减少百分率
  1   柔嫩艾美尔球虫   93.3   14.39   5.58   61.2
  2   柔嫩艾美尔球虫   85.3   12.10   4.29   64.5
  批数   艾美尔球虫   卵囊回收率(％)   酶消化之前的总固体(L)   酶消化之后的总固体(L)   固体减少百分率
  3   巨大艾美尔球虫   125.3   21.13   9.75   53.9
  4   巨大艾美尔球虫   100.0   15.90   5.18   67.4
  5   巨大艾美尔球虫   106.0   12.50   6.48   48.2
酶消化成功地平均减少59％的固体体积。在每种情况下卵囊的回收率基本上是定量的。
减少要处理的固体量对处理过程有某些积极效果，包括：1)减少了下游加工需要的试剂量，2)减少了下游加工需要的设备规模，3)改善了后续纯化步骤的效率。
尽管为了清楚和理解的目的，已经通过说明和实施例详细描述上述发明的某些细节，但很明显，在后附权利要求和其等价的范围内可以实施例某些变化和修改。

Claims (36)

1.一种从包含粪便物质的组合物中纯化艾美尔球虫属(Eimeria)卵囊的方法，所述方法包括在足以减少组合物中粪便物质的量的条件下使组合物与多糖酶接触，其中所述组合物首先接触含有纤维素酶和果胶酶的多糖酶，然后接触含有淀粉酶的多糖酶。
2.权利要求1的方法，所述方法还包括去除卵囊与所述多糖酶的接触。
3.权利要求2的方法，所述方法还包括与多糖酶接触后收集所述卵囊。
4.权利要求1的方法，其中所述多糖酶包含选自纤维素酶、果胶酶、淀粉酶、木聚糖酶、***糖酶、α-半乳糖酶、半纤维素酶、β-葡聚糖酶、β-葡糖苷酶、淀粉葡糖苷酶和其任何组合的酶。
5.权利要求4的方法，其中所述多糖酶包含纤维素酶。
6.权利要求5的方法，其中所述多糖酶包含纤维素酶和果胶酶。
7.权利要求5的方法，其中所述纤维素酶存在的量为2×104至50×104单位/升的范围内。
8.权利要求5的方法，其中所述纤维素酶存在的量为4×104至25×104单位/升的范围内。
9.权利要求1的方法，其中所述卵囊为形成孢子的卵囊。
10.权利要求1的方法，其中所述艾美尔球虫属卵囊选自巨型艾美尔球虫卵囊(E.maxima)、和缓艾美球虫卵囊(E.mitis)、柔嫩艾美尔球虫卵囊(E.tenella)、堆形艾美尔球虫卵囊(E.acervulina)、布氏艾美尔球虫卵囊(E.brunetti)、毒害艾美尔球虫卵囊(E.necatrix)、基前艾美尔球虫卵囊(E.praecox)、变位艾美尔球虫卵囊(E.mivati)和其任何组合。
11.权利要求1的方法，其中所述艾美尔球虫属卵囊选自火鸡和缓艾美尔球虫(E.meleagrimitis)卵囊、腺型艾美尔球虫(E.adenoeides)卵囊、火鸡孔雀艾美尔球虫(E.gallopavonis)卵囊、分散艾美尔球虫(E.dispersa)卵囊、无害艾美尔球虫(E.innocua)卵囊、近圆艾美尔球虫(E.subrotunda)卵囊和其任何组合。
12.权利要求1的方法，其中所述艾美尔球虫属卵囊选自邱氏艾美尔球虫(E.zuernii)卵囊、牛艾美尔球虫(E.bovis)卵囊和其任何组合。
13.权利要求1的方法，其中所述艾美尔球虫属卵囊选自阿萨塔艾美尔球虫(E.ahsata)卵囊、巴库艾美尔球虫(E.bakuensis)卵囊、槌形艾美尔球虫(E.crandallis)卵囊、浮氏艾美尔球虫(E.faurei)卵囊、颗粒艾美尔球虫(E.granulosa)卵囊、错乱艾美尔球虫(E.intricata)卵囊、马氏艾美尔球虫(E.marsica)卵囊、类绵羊艾美尔球虫(E.ovinoidalis)卵囊、苍白艾美尔球虫(E.pallida)卵囊、小艾美尔球虫(E.parva)卵囊、温布里吉艾美尔球虫(E.weybridgensi)卵囊和其任何组合。
14.权利要求1的方法，其中所述艾美尔球虫属卵囊选自肠艾美尔球虫卵囊(E.intestinalis)、E.vejdovskyi卵囊、梨形艾美尔球虫(E.piriformis)卵囊、盲肠艾美尔球虫(E.coecicola)卵囊、无残艾美尔球虫(E.irresidua)卵囊、黄艾美尔球虫(E.flavescens)卵囊、小型艾美尔球虫(E.exigua)卵囊、大型艾美尔球虫(E.magna)卵囊、穿孔艾美尔球虫(E.perforans)卵囊、中型艾美尔球虫(E.media)卵囊、斯氏艾美尔球虫(E.stiedai)卵囊和其任何组合。
15.权利要求1的方法，其中所述组合物与多糖酶接触30分钟至24小时。
16.权利要求13的方法，其中所述组合物与多糖酶接触2小时至10小时。
17.权利要求1的方法，其中所述组合物在15℃至30℃之间的温度范围内与多糖酶接触。
18.权利要求17的方法，其中所述组合物在21℃至27℃之间的温度范围内与多糖酶接触。
19.权利要求1的方法，其中所述组合物在pH 1至pH 7.5之间的pH范围内与多糖酶接触。
20.权利要求19的方法，其中所述组合物在pH 4至pH 6之间的pH范围内与多糖酶接触。
21.权利要求1的方法，其中所述方法包括两步酶消化步骤，其在不同pH下进行。
22.权利要求21的方法，其中所述方法包括：
将所述组合物与包含纤维素酶和淀粉酶的多糖酶在pH 4至pH5.5的pH范围内接触，然后将所述组合物与包含淀粉酶的多糖酶在pH 4至pH 7.5的范围内接触。
23.权利要求1的方法，其中所述方法还包括密度浮选过程。
24.权利要求23的方法，其中所述密度浮选过程在组合物与多糖酶接触后进行。
25.权利要求23的方法，其中所述密度浮选溶液为盐溶液。
26.权利要求23的方法，其中所述密度浮选溶液为硫酸镁溶液。
27.权利要求23的方法，其中所述密度浮选溶液为甘油溶液。
28.权利要求27的方法，其中所述甘油溶液为甘油-聚精氨酸溶液。
29.权利要求1的方法，其中所述粪便物质收集自动物，所述动物在收集阶段之前已喂食具有大平均颗粒尺寸的饲料。
30.权利要求29的方法，其中所述大颗粒饲料包含大麦。
31.权利要求30的方法，其中所述大颗粒饲料包含大麦-大豆。
32.一种从包含粪便物质的组合物中纯化艾美尔球虫属卵囊的方法，所述方法包括在足以减少组合物中粪便物质的量的条件下使组合物与包含纤维素酶的多糖酶接触。
33.权利要求32的方法，其中所述方法包括去除多糖酶与卵囊的接触。
34.权利要求33的方法，其中所述方法还包括接触多糖酶后收集卵囊。
35.权利要求32的方法，其中所述多糖酶还包含果胶酶。
36.一种从包含粪便物质的组合物中纯化艾美尔球虫属卵囊的方法，所述方法包括在足以减少组合物中粪便物质的量的条件下使组合物与包含纤维素酶和果胶酶的多糖酶接触。
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