JP2007529614A - リゾチーム−キトサンフィルム - Google Patents
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Abstract
Description
本明細書において開示されているものは、食料品を保護するのに特に有用である抗菌フィルムである。
本出願は、米国特許仮出願第60/554,623号(2004年3月18日出願)の恩典を主張し、これは参照により本明細書に組み入れられる。
固体又は半固体の食料品では、微生物の増殖は主に表面で起こる。熱処理および化学防腐剤は、微生物学的安全性および食物品質を維持するための最も広く使用されてきた方法である。抗菌増強包装フィルムは、担体フィルム構造から食物表面への抗菌物質の徐放により、食品表面の微生物学的安全性を保証する大きな可能性を有する。加えて、合成化学食品保存料に対する消費者の懸念は、代替的な、より「消費者にやさしい」食用保護フィルムへの関心の高まりをもたらしている。
本明細書における開示の一つの局面は、キトサンポリマーマトリックス内に組み込まれているリゾチームを含む複合フィルムを検討する。別の局面では、キトサンと、キトサンの重量に基づいた約10〜約200重量%のリゾチームとを包含するフィルムが開示されている。
理解を容易にするために、本明細書において使用される以下の用語が下記でより詳細に記載される。
下記で記載されている具体例は、説明の目的のためであり、添付されている特許請求項の範囲を限定するものとして考慮されるべきではない。
材料
Vanson Inc.(Redmond, WA)からのエビキトサンを更に精製することなく使用した。エビキトサンを25℃で1%w/wの酢酸水溶液の11cps粘度および89.9%脱アセチル化で特徴づけした。メンドリの卵白リゾチームを、Eiprodukte GmbH und Co.(Germany)から得た。USP(United States Pharmacopeia)等級のグリセロールを、EM Science(Darmstadt, Germany)から得た。試薬等級の氷酢酸を、J.T. Baker(Phillipsburg, NJ)から得た。
被膜形成溶液(FFS)は、キトサン溶液をリゾチーム溶液と混合して調製した。キトサン溶液は、2重量%のキトサンを、25%のグリセロール(キトサンのw/w)の添加によって1重量%の酢酸溶液に溶解することにより調製した。リゾチーム溶液は、10重量%のリゾチームを、25%のグリセロール(リゾチームのw/w)の添加によって蒸留水に溶解することにより調製した。次にリゾチーム溶液を、0%、20%、60%または100%(キトサンの乾燥重量当たりの乾燥重量%)の濃度でキトサン溶液と混合した。得られた混合物を、Model PT 10-35(Kinematica AG, Switzerland)により3,000rpmで60秒間均質化した。FFSのpHを5N水酸化ナトリウムで5.2に調整した。全ての試料溶液をナイロンメッシュを通して濾過し、不溶性残渣を除去して、真空下で脱気した(Model 0211-P204, Gast Mfg. Corp., Benton Harbor, MI)。
各脱気FFSの計算された量を、平滑テフロン被覆ガラスプレート上で260×260mmの領域に流延して、約70μmの厚さの均一フィルムを得た。室温(24±2℃および40±5%相対湿度)で2日間乾燥した後、乾燥フィルムをプレートから剥がして、分析用の切片に切断した。25×25mmの寸法のフィルムセグメントを、密度および含水量の分析に使用した。25×86mmの寸法のフィルムセグメントを、物理学的試験に使用した。70×70mmの寸法のフィルムセグメントを、透湿度試験に使用した。全ての測定の前に、フィルム切片を、25℃および50%の相対湿度に設定した環境室(Model T10RS, Tenney Environmental, Williamsport, PA)で少なくとも2日間条件づけした。
2日間、25℃及び50%の状態にした後、フィルムの厚さを、カリパスマイクロメータ293-766-30型(Mytutoyo Manufacturing Co. Ltd., Japan)を使用して、フィルムの各試験片の無作為の5か所で測定した。フィルムの密度は、フィルム重量をフィルム容量で割って計算した。フィルムの含水量は、フィルム試験片を強制空気乾燥器(Precision Scientific Inc., Chicago, IL)により105℃で18時間乾燥して、重量測定で決定した。含水量の割合は湿量基準で計算した。
リゾチーム-キトサンフィルム試験片の約0.03gの試料を、バイアル中の0.15Mリン酸緩衝液(pH6.2)20mlに沈め、振とう機(New Brunswick Scientific Co. Inc., New Brunswick, NJ)を室温で使用して50rpmで振とうした。凍結乾燥したマイクロコッカス・リゾディクティクスの保存用基質溶液を、0.15Mリン酸緩衝溶液(450nmでの吸光度0.65)で調製した。混合物1μmの試料を0時間、0.25時間、1時間、4時間、12時間、24時間、及び48時間の間隔で採取した。これらの試料をキュベット中でマイクロコッカス・リゾディクティクス基質2.5mlと混合し、次に、直ちにShimadzu UV-Vis 2100 分光光度計(Shimadzu Co., Japan)を使用して、25℃で40秒間読み取った。リゾチームの活性率を、細胞壁基質の加水分解を反映する、450nmでの溶液吸光度の低下を測定することにより決定した。低下する光学密度は、毎分のミレ(Mille)吸光度単位の変化(M吸光度/分)として表わした。活性単位を、0.15Mリン酸緩衝液中の標準化リゾチーム濃度の回帰直線に基づき、mg/lのソチームに変換し、次に乾燥フィルム1g当たり放出されるソチームのgに変換した。
大腸菌および大便レンサ球菌を、ブレインハートインフュージョン(BHI)ブロスおよびMRSブロスのそれぞれにおいて、37℃で一晩増殖させた。これらの微生物の1mlの試料を同じブロス99mlで希釈して、約107 CFU/ml接種材料を得た。フィルムの各試験片約0.03gをペトリ皿(直径85mm)の中に置き、次にその中に接種材料10mlを注いだ。フィルムに曝露しない接種材料を対照として使用した。ペトリ皿を室温、50RPMで振とうした。試料を0時間、6時間、12時間、および24時間で取り、希釈バイアル(Dilu-Lock II(商標) Butterfield's Buffer, Hardy Diagnostics, Santa Maria, CA)で希釈し、二回通り平板培養した。平板培養には、BHIおよびMRS寒天培地を大腸菌および大便レンサ球菌にそれぞれ使用した。コロニーの数を数える前に、各プレートを37℃で48時間インキュベートした。
透湿度(WVP)は、ASTM E96(ASTM2000a)に従って、25℃および100/50%RH勾配でカップ法を使用して決定した。蒸留水11mlを、内径57mmおよび内部深さ15mmの、Plexiglas(登録商標)製の各試験カップの中に入れた。水とフィルムとの間隔は、10.7mmであり、フィルムの有効面積は25.5cm2であった。カップアセンブリを温度および湿度制御チャンバ(25℃および50%RH)の中に置いた。各カップアセンブリを、電子はかり(精度0.0001g)を使用して毎時に6時間計量して、湿度の損失を時間の経過とともに記録した。次に、WVP補正法(Gennadios and others 1994)を使用して、フィルムと水の表面との間の停滞した空気の空隙の抵抗について、WVPを補正した。
フィルムの物理学的特性を、組織分析機(TA.XT2i, Texture Technologies Corp., Scarsdale, NY)を使用して決定した。全ての特性測定は、水分の変化を最小限にするため、フィルム試験片をチャンバから取り出した直後に実施した。引張り強さ(TS)および破断伸び率(EL)を測定するために、ASTM D882法(ASTM2000b)を使用した。フィルムの各試験片を組織分析機のグリップ(TA96)の間に載せ、初期グリップ分離50mmおよびクロスヘッド速度1mm/sで試験した。TS値は、測定した最大積載量(N)をフィルムの断面積(mm2)で割ったものを、Mpaの単位で報告した。EL値は、記録した破断伸びを試験片の最初の長さで割って、100を掛けることで得た。
フィルムの表面および内部構造は、Scanning Electron Microscopy(AmRay 3300FE field emission SEM, AmRay, Bedford, MA)を使用して評価した。フィルム切片をアルミニウムのスタブに載せ、スパッター塗布機(Edwards model S150B Sputter Coater; BOC Edwards Vacuum, Ltd, UK)を使用して金-パラジウム合金を被覆した。各被覆試料を、試料に垂直に向けられた5kVの電圧の電子ビームを使用して試験した。
全ての実験は3回反復した。各反復において、リゾチーム放出および抗菌活性測定に2個のフィルム試験片を使用し、密度、含水量、およびWVP測定に5個のフィルム試料を使用し、物理学的特性の測定に10個のフィルム試料を使用した。一般線形モデル(GLM)手順を、SAS(Statistical Analysis System Institute Inc., Cary, NC)を使用して異なるフィルムの差を試験するのに適用した。分散の分析ためのPROC GLM(ANOVA)を全ての処理で実施した。測定された反応に適合する回帰モデルを見つけるために、PROC REGを実施した。多重平均比較のためにDuncanの多重範囲試験を使用した。有意な差はp<0.05と定義した。
リゾチームをキトサン溶液と一つにまとめると、いずれのFFSにおいても沈殿が観察されなかった。このことは、酢酸溶解キトサン溶液が、水溶性リゾチームと良好な相溶性を有することを実証した。全ての乾燥フィルムは、流延プレートから剥ぎ取ることが容易であった。全ての種類のフィルムの厚さは、FFSの計算された量を流延することによって、72±11μmの範囲に注意深く制御した。これにより、確実にフィルム厚において統計的な差が観察されなかった(p<0.05)。
1 フィルム厚=72.6±8.2μm;L0=リゾチーム0%(キトサンのw/w);L20=リゾチーム20%(キトサンのw/w);L60=リゾチーム60%(キトサンのw/w);L100=リゾチーム100%(キトサンのw/w)
2 FFS中のキトサン重量とリゾチーム重量の総計に基づくグリセロールの重量%
フィルムマトリックスから放出されるリゾチームの量を図1で示す。リゾチームのないキトサンフィルム(L0)は、凍結乾燥されたマイクロコッカス・リゾディクティクスに対してあらゆる溶解活性を示さなかったが、これらの活性は、フィルムマトリックスに組み込まれたリゾチームの濃度の増加に比例して増大した。リゾチーム-キトサン複合フィルムをリン酸緩衝溶液の中に入れた場合、フィルムは、水分子のポリマーフィルム構造内への分散によって膨張し、組み込まれたリゾチームの、フィルムマトリックスから水性環境への放出をもたらした。リゾチームは、時間の経過とともにフィルムマトリックスから対数的に放出した。フィルムマトリックスからのリゾチームの放出は、ポリマーマトリックス中の初期リゾチーム濃度と直線的に相関した。48時間後の各フィルム試験片からのリゾチームの放出量の割合は、L20、L60、およびL100フィルムでそれぞれ約65%、79%、および76%であった。24時間後の各フィルム試験片からのリゾチームの放出量の割合は、L20、L60、およびL100フィルムでそれぞれ約48%、75%、および71%であった。12時間後の各フィルム試験片からのリゾチームの放出量の割合は、L20、L60、およびL100フィルムでそれぞれ約43%、60%、および56%であった。1時間後の各フィルム試験片からのリゾチームの放出量の割合は、L20、L60、およびL100フィルムでそれぞれ約14%、26%、および25%であった。
図2Aおよび2Bは、リゾチーム-キトサンフィルムで処理されたブロス中の大腸菌および大便レンサ球菌の生存を示す。大腸菌に対するリゾチーム-キトサン複合フィルムの抗菌効果は、L100フィルムを除いて、リゾチーム濃度が増加すると増大した。インキュベーションの24時間後、細胞数は、L0、L20、またはL60フィルムのBHIブロスそれぞれで約1.8ログサイクル、2.3ログサイクルおよび2.7ログサイクルで低減した。同時に細胞数は、L100フィルムおよび対照でそれぞれ約0.1ログサイクルおよび2.3ログサイクルで増加した。L100フィルムは、細胞集団が回復した後、6時間まで増殖を阻害した。
フィルムの透湿度(WVP)は、試験濃度レベル(p<0.05)でのリゾチームの組み込みによって、有意に影響を受けなかった(下記の表2を参照すること)。理論に束縛されるものではないが、この結果は、2つの相反する要因の効果によって説明できる。キトサンフィルムは、他の多くのタンパク質または多糖類食用フィルムと同様に、その親水性の性質のため、比較的低い防水性を示す。キトサンフィルムの防水性は、脂肪酸のような疎水性物質の添加により改善できる。リゾチームが疎水性アミノ酸側鎖を含有するので、リゾチーム-キトサン複合フィルムの親水性は、リゾチームの添加によって低下する可能性がある。しかし、キトサンの密な構造、特にその結晶部分が、リゾチーム分子により破壊され、フィルムマトリックスを通る増大したWVPをもたらす可能性がある。これらの2つの相反する要因は、様々なリゾチーム濃度によるリゾチーム-キトサン複合フィルムのWVP特性の変動を相殺するか、または最小限にすることができる。
1 L0=リゾチーム0%(キトサンのw/w);L20=リゾチーム20%(キトサンのw/w);L60=リゾチーム60%(キトサンのw/w);L100=リゾチーム100%(キトサンのw/w)
フィルムの引張り強さ(TS)および破断伸び率(EL)は、リゾチームの添加により有意に低下した(p>0.05)(下記の表3を参照すること)。増加したリゾチーム濃度によるTSとELの両方の低下は、以下の一次方程式により説明できる。
TS=-0.10C1+16.70,R2=0.96
EL=-0.32C1+59.89,R2=0.99
式中、C1は、リゾチーム-キトサンフィルムマトリック中のリゾチームの濃度率(%、キトサンのw/w)である。加えて、ELとTSに直線関係があることが見出された。
EL=3.07TS+8.30,R2=0.98
1:1のキトサンとリゾチームの比(L100)では、TSおよびELの値でそれぞれ43%および48%の低下があった。しかし、そのような低下は、フィルムの食品保護剤としての使用を妨げるのに十分なほど有意なものではない。
1 L0=リゾチーム0%(キトサンのw/w);L20=リゾチーム20%(キトサンのw/w);L60=リゾチーム60%(キトサンのw/w);L100=リゾチーム100%(キトサンのw/w)
キトサンとリゾチームとの優れた生体適合性、およびキトサンマトリックスの全体を通したリゾチームの均質な分布が、SEM顕微鏡写真により確認された。図3A〜3Dは、被膜形成時に空気に曝露されたリゾチーム-キトサン複合フィルムの外面を、1000×の倍率で示す。SEMマクロ写真で示されているように、フィルムの表面構造は、密であり、かつ均質であった。全てのフィルムは均質な外観を有し、マトリックスにいかなる孔または割れ目もない連続構造を示した。L60(3C)およびL100(3D)フィルムの顕微鏡写真は、フィルム表面に輝く大理石模様を示す。この大理石模様は、均一に分布され、リゾチームの濃度が増加すると増大する。白色の領域は、キトサンマトリックス中のリゾチーム微粒子の付着を表わすことができる。
代替的なFFSは、2重量%のキトサンを、50重量%のラウリン酸、25重量%のグリセロール、および100重量%のリゾチーム(キトサンのw/w)の65℃での添加によって、1重量%の酢酸溶液に溶解することより調製できる。次にフィルムを実施例1で記載されているように調製する。脂肪酸(すなわち、ラウリン酸)の、被膜形成溶液への添加は、フィルムの防水性を、その抗菌活性に有意に影響を与えることなく改善することができる。
被覆溶液は、キトサン溶液をリゾチーム溶液と混合することにより調製した。キトサン溶液は、3%のキトサンを、25%のグリセロール(キトサンのw/w)の添加によって1%の酢酸溶液に溶解することにより調製した。リゾチーム溶液は、10%のリゾチームを、25%のグリセロール(リゾチームのw/w)の添加によって蒸留水に溶解することにより調製した。リゾチーム溶液を60%(キトサンの乾燥重量当たりのリゾチームの乾燥重量%)の濃度でキトサン溶液と混合した。得られた混合物を、ホモジナイザー(PT 10-35, Kinematica, Switzerland)を3,000rpmで60秒間使用して、均質化した。リステリア・モノサイトゲネスATCC15313およびラクトバシルス・プランタラムを試験微生物として使用して、食物表面の被覆処理の抗菌効果を評価した。リステリア・モノサイトゲネスおよびラクトバシルス・プランタラムを、ブレインハートインフュージョン(BHI)ブロスおよびMRSブロスのそれぞれにおいて、37℃で一晩増殖させた。
商業的に製造されたミディアム・チェダー・チーズ(Tillamook County Creamery Association, Tillamook, OR)を、リゾチーム-キトサン複合被覆適用の抗菌特性を実証するために他の食物系として使用した。チーズの四角い塊を60mm×26mm×5mmの寸法(約10g)に無菌的に切断して、実施例3で記載された被覆溶液を被覆した。全ての手順は、実施例3と同じであった。表5で示されるように、チーズの薄切りの表面のリステリア・モノサイトゲネスおよびラクトバシルス・プランタラムの増殖は、両方とも阻害された。
リゾチーム-キトサン溶液は、キトサン2%をキトサン3%の代わりに使用する以外は、実施例1で記載されている方法に従って調製した。被膜形成溶液を、平滑テフロン被覆ガラスプレート上で260mm×260mmの領域に流延して、周囲条件下(22.5±1℃および相対湿度{RH}40±5%)で2日間乾燥した。乾燥フィルムをプレートから取り出し、65×30mmの寸法の切片に切断した。製造されたフィルムの厚さは85±9μmであった。フィルム切片を、25℃および50%RHに設定した環境室(T10RS, Tenney Environmental, Williamsport, PA)で2日間保存した。
Claims (32)
- キトサンポリマーマトリックス内に組み込まれているリゾチームを含む複合フィルム。
- フィルムの全ての成分が食用かつ再生可能である、請求項1記載のフィルム。
- キトサンが少なくとも約70%の脱アセチル化度を有する、請求項1記載のフィルム。
- 可塑剤または架橋剤から選択される少なくとも1つの追加的な成分を更に含む、請求項1記載のフィルム。
- 少なくとも1つの可塑剤および少なくとも1つの架橋剤を更に含む、請求項4記載のフィルム。
- 少なくとも1つの架橋剤を更に含む、請求項3記載のフィルム。
- キトサンが、キトサンアセテート、キトサンソルベート、キトサンプロピオネート、キトサンラクテート、キトサングルタメート、キトサンベンゾエート、キトサンシトレート、キトサンマレエート、キトサングルコレート、キトサンアクリレート、キトサンスクシネート、キトサンオキサレート、キトサンアスコルベート、キトサンタータレート、またはこれらの混合物を含む、請求項1記載のフィルム。
- リゾチームが抗菌有効量で存在する、請求項1記載のフィルム。
- フィルムが約1〜約300g mm/m2 d kPaの透湿度を有する、請求項1記載のフィルム。
- フィルムの基材への適用の約24時間後、約30%までのリゾチームがフィルムから放出されないように、ならびに約48時間後、約20%までのリゾチームがフィルムから放出されないように、リゾチームの量が十分である、請求項1記載のフィルム。
- (a)キトサンと、
(b)キトサンの重量に基づいた約10〜約200重量%のリゾチームとを含むフィルム。 - 約10〜約100重量%のリゾチームを含む、請求項11記載のフィルム。
- 可塑剤または架橋剤から選択される少なくとも1つの追加的な成分を更に含む、請求項11記載のフィルム。
- 可塑剤がキトサンの重量に基づいた約1〜約50重量%の量で存在する、請求項13記載のフィルム。
- フィルムを作製する方法であって、以下の段階を含む方法:
キトサンおよびリゾチームを水性媒質に溶解または分散して、被膜形成溶液または分散体を得る段階;
被膜形成溶液または分散体を基材の表面に適用する段階;および
被膜形成溶液または分散体をフィルムに変換する段階。 - キトサンが水性有機酸に溶解される、請求項15記載の方法。
- 水性有機酸が、酢酸、ソルビン酸、プロピオン酸、乳酸、グルタミン酸、安息香酸、クエン酸、マレイン酸、グリコール酸、アクリル酸、コハク酸、シュウ酸、アスコルビン酸、酒石酸、またはこれらの混合物から選択される、請求項16記載の方法。
- リゾチームが水に溶解されてリゾチーム溶液をもたらし、次にリゾチーム溶液がキトサン溶液と混合される、請求項16記載の方法。
- リゾチーム溶液とキトサン溶液の混合が周囲室条件(ambient room condition)下で起こる、請求項18記載の方法。
- リゾチーム溶液が約5〜約20重量%のリゾチームを包含する、請求項18記載の方法。
- 被膜形成溶液または分散体のフィルムへの変換が乾燥を介して起こる、請求項15記載の方法。
- 基材表面が食料品の表面を含む、請求項15記載の方法。
- フィルムがリゾチームの抗菌有効量を含み、フィルムの抗菌活性が少なくとも3週間持続する、請求項22記載の方法。
- 少なくとも1つの他の添加剤を水性媒質中に溶解または分散する段階を更に含む、請求項15記載の方法。
- フィルムを食料品の表面に配置させる段階を更に含む、請求項15記載の方法。
- 被膜形成溶液または分散体が噴霧、はけ塗り、滴下又は浸漬を介して食料品の表面に適用される、請求項22記載の方法。
- 請求項15の方法により製造されるフィルム。
- リゾチームが抗菌有効量でフィルムに存在する、請求項27記載のフィルム。
- キトサンポリマーマトリックス内に組み込まれたリゾチームを包含する抗菌フィルムを食料品の少なくとも一部の表面に包含する食料品。
- リゾチームがキトサンの重量に基づいた約10〜約200重量%の量でフィルムに存在する、請求項29記載の食料品。
- フィルムが約1〜約300g mm/m2 d kPaの透湿度を有する、請求項29記載の食料品。
- フィルムが、
キトサンおよびリゾチームを水性媒質に溶解または分散して、被膜形成溶液または分散体を得る段階と、
被膜形成溶液または分散体を基材の表面に適用する段階と、
被膜形成溶液または分散体をフィルムに変換する段階とを含む方法により作製される、請求項29記載の食料品。
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