JP2007525166A - 樹状細胞に対する感染性が増大したアデノウイルス粒子と、肝細胞に対する感染性が低下した粒子 - Google Patents

樹状細胞に対する感染性が増大したアデノウイルス粒子と、肝細胞に対する感染性が低下した粒子 Download PDF

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Abstract

アデノウイルス・ベクターと、そのようなベクターの製造法が提供される。特に、樹状細胞を標的とにするために改変ファイバー・タンパク質または異種ファイバー・タンパク質を含むアデノウイルスが提供される。

Description

この明細書に記載して権利を主張する仕事は、国防総省前立腺がん研究プログラムDAMD17-01-1-0098と、国防総省乳がん研究プログラムDAMD17-01-1-0391の支援を受けた。政府は、このテーマに関して所定の権利を有する。
関連する出願
Daniel J. von Seggernが「アデノウイルス粒子を標的に向かわなくすることと、その利用法」という名称で2003年3月28日に出願したアメリカ合衆国仮出願シリアル番号第60/459,000号と、Daniel J. von Seggernが「樹状細胞に対する感染性が増大した、シュードタイピングしたアデノウイルス・ベクター」という名称で2003年5月1日に出願したアメリカ合衆国仮出願シリアル番号第60/467,500号の優先権の恩恵を主張する。
本出願は、Daniel J. von Seggernによって「樹状細胞に対する感染性が増大した、シュードタイピングしたアデノウイルス・ベクター」という名称で同じ日に出願されたアメリカ合衆国出願シリアル番号（弁理士ケース番号22908-1239）にも関係がある。本出願は、Michael Kaleko、Glen R. Nemerow、Theodore Smith、Susan C. Stevensonによって「効率的に標的に向かわせるためのファイバーのシャフト改変」という名称で2003年3月27日に出願されたアメリカ合衆国出願シリアル番号第10/403,337号と2003年1月24日に出願されたアメリカ合衆国出願シリアル番号第10/351,890号にも関係がある。本出願は、Susan C. Stevenson、Michael Kaleko、Theodore Smith、Glen R. Nemerowによって「効率的に標的に向かわせるためのファイバーのシャフト改変」という名称で2002年1月24日に出願されたアメリカ合衆国仮出願シリアル番号第60/350,388号と、Stevenson, Susan C.、Kaleko, Michael、Smith, Theodore、Nemerow, Glen R.によって「効率的に標的に向かわせるためのファイバーのシャフト改変」という名称で2002年6月26日に出願されたアメリカ合衆国仮出願シリアル番号第60/391,967号にも関係がある。本出願は、Michael Kaleko、Glen R. Nemerow、Theodore Smith、Susan C. Stevensonによって「効率的に標的に向かわせるためのファイバーのシャフト改変」という名称で2003年1月24日に出願された国際PCT出願PCT/US03/02295にも関係がある。
許される場合には、これらの出願、仮出願、国際出願のそれぞれにおけるテーマは、参考としてこの明細書に組み込まれているものとする。
本発明は、全体として、アデノウイルス・ベクターとそのようなベクター製造の分野に関する。標的に向かうアデノウイルス・ベクターと、標的に向かわないアデノウイルス・ベクターが提供される。特に、樹状細胞を標的とするアデノウイルス・ベクターが提供される。
免疫系は、多数の病原体や腫瘍を、免疫病理を最少にして根絶させるように設計されている。しかし免疫系が欠陥状態になると、多数の疾患状態が発生する。免疫療法は、ヒト免疫系が疾患を治療する能力を利用しようとして生まれた治療法である。免疫療法は、免疫抑制を特徴とする疾患を持つ対象における細胞免疫応答を増大させること、および／または過剰な細胞免疫応答を特徴とする疾患を持つ対象における細胞免疫応答を抑制すること、および／または病原体または腫瘍に対する免疫応答を起こさせることを目的として設計されている。免疫療法の改良されたプロトコルが必要とされている。
さらに、多数の伝染病薬の特徴が詳しくわかり、ワクチンが利用できるにもかかわらず、臨床的に重要な病原体によって起こる結核やマラリア（Plebanski他、2002年、J. Clin. Invest.、第110巻、295〜301ページ）などの疾患から保護するため、あるいはそのような疾患状態を改善するための新しいワクチンと、多数のウイルスから保護するための新しいワクチンが必要とされている。ウイルスとしては、例えばヒト免疫不全ウイルス（HIV）、単純ヘルペス・ウイルス（HSV）、ヒト・パピローマ・ウイルス（HPV）、エプスタイン-バー・ウイルス（EBV）、C型肝炎ウイルス（HCV）、呼吸器シンシチアル・ウイルス（RSV）、パラインフルエンザ・ウイルス、ヒト・メタプヌーモウイルス（Letvin、2002年、J. Clin. Invest.、第110巻、15〜20ページ；WhitleyとRoizman、2002年、J. Clin. Invest.、第110巻、145〜151ページ；MurphyとCollins、2002年、J. Clin. Invest.、第110巻、21〜27ページ）などがある。インフルエンザや炭素菌に対するワクチンは開発されているが、そのワクチンによって起こる疾患を防いだり軽くしたりする、より効果のあるワクチンが必要とされている（例えばPaleseとGarcia-Sastre、2002年、J. Clin. Invest.、第110巻、9〜13ページ；Leppla他、2002年、J. Clin. Invest.、第110巻、141〜144ページ；SteinmanとPope、2002年、J. Clin. Invest.、第109巻、1519〜1526ページを参照のこと）。
ワクチンと免疫療法は、多彩ながん細胞や腫瘍をなくすことによってがんを治療するのに利用されてきた。ヒトのがんの多くは特定のタンパク質（例えば腫瘍抗原）の発現と関係しているため、そのタンパク質が、正常な細胞からがん細胞を見分ける手段と免疫療法の標的になる。免疫系は、そのような腫瘍抗原を認識できるため、その腫瘍抗原を提示している細胞に対する免疫応答を誘導する（van der Bruggen他、1991年、Science、第254巻、1643〜1647ページ；Sahin他、1995年、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、第92巻、11810〜11813ページ；Kaplan他、1998年、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、第95巻、7556〜7561ページ）。腫瘍抗原が同定されたことで、ワクチンと、がん治療のための免疫療法が開発されている（ScanlanとJager、2001年、Breast Cancer Res.、第3巻、95〜98ページ；YuとRestifo、2002年、J. Clin. Invest.、第110巻、28〜94ページ）。
しかし有効な免疫療法の開発にはまだ多くの課題が残っている。それは例えば、（i）抗体を増大させ、T細胞を媒介とした免疫記憶を向上させる必要性、（ii）T細胞の応答（CD4+Tヘルパー細胞とCD8+CTL）を増大させる必要性、（iii）多数ある性行為感染症に対するワクチンとして重要な粘膜免疫を確立する必要性、（iv）自己免疫疾患の治療にとって重要な、免疫応答を低下させることのできるワクチン開発の必要性（SteinmanとPope、2002年、J. Clin. Invest.、第109巻、1519〜1526ページ）、（v）その他の課題である。
アデノウイルス・ベクターを媒介とした（すべてではないにせよ）たいていの遺伝子治療は、特定の組織（例えば腫瘍や器官）または特定のタイプの細胞（免疫細胞などの細胞）に形質導入することを目的としている。全身に送達するには、正常なウイルスの親和性の除去と、新しい特異性の付加が必要となろう。細胞に効率的に入るようにするには、アデノウイルス粒子と宿主細胞の間で相互作用が多く起こる必要がある（Nemerow、2000年、Virology、第274巻、1〜4ページ）。アデノウイルスの侵入経路は、細胞表面での2つの独立した出来事と関係していると考えられている。第1に、アデノウイルスのファイバーのノブが、特異的細胞表面受容体（アデノウイルスのたいていの血清型ではコクサッキー-アデノウイルス受容体（CAR）だが、必ずしもそうとは限らない）との高親和性相互作用を通じてアデノウイルス粒子が標的細胞に付着するための媒介となる。その後、細胞表面のインテグリンαvβ3とαvβ5（共受容体として機能する）にペントンが結合すると、ウイルスの内部化が促進される。CAR以外にも、サブグループBのアデノウイルス（例えばAd3）およびサブグループCのアデノウイルス（例えばAd5）と相互作用する複数のアデノウイルスのファイバー受容体が存在しているとはいえ、どちらのサブグループも、内部化のためにはインテグリンとの相互作用を必要としているようである。
生体内に遺伝子を導入するためのCAR相互作用の役割ははっきりしていない。CARを除去したところで、アデノウイルス・ベクターの生体内分布も、生体内での毒性も変化しない（Alemany他、2001年、Gene Therapy、第8巻、1347〜1353ページ；2001年5月30日に出願され、アメリカ合衆国出願公開第20020137213号として公開されたアメリカ合衆国特許出願第09/870,203号）。発表された論文には、互いに矛盾する結果が記載されている（Alemany他、2001年、Gene Therapy、第8巻、1347〜1353ページ；Leissner他、2001年、Gene Therapy、第8巻、49〜57ページ；Einfeld他、2001年、J. Virology、第75巻、11284〜11291ページ）。例えば、Ad5ファイバーのABループにS408E突然変異を含むベクターは、培養中の細胞への形質導入の効率が非常に低かったにもかかわらず、マウスの肝臓には効率的な形質導入がなされることがわかった（Leissner他、2001年、Gene Therapy、第8巻、49〜57ページを参照のこと）。これとは逆に、ファイバーのABループにより多くの突然変異を有するベクターは、肝臓での遺伝子発現が1/10に低下した（Einfeld他、2001年、J. Virology、第75巻、11284〜11291ページを参照のこと）。
二重に機能を喪失したアデノウイルスは、ファイバーのループ中のCAR結合領域と、ペントン・ベース中のインテグリン結合領域とを変化させることによって調製される（Einfeld他、2001年、J. Virology、第75巻、11284〜11291ページ）。この二重に機能を喪失したアデノウイルスは、CAR相互作用とインテグリン相互作用を欠いており、試験管内でさまざまなタイプの細胞に形質導入する能力が欠けているだけでなく、生体内で肝細胞に形質導入する能力も欠けていることが報告されている。特に、二重に機能を喪失したアデノウイルスは、機能を喪失していないアデノウイルスと比較すると、肝臓への形質導入が1/700になることが報告されている。しかしこの結果は、第三者によって再現されていない。
多くの用途において、臨床的に最も有用なアデノウイルス・ベクターは、全身に送達すること（例えば末梢静脈に送ること）ができ、体内の望む位置または望むタイプの細胞を標的とすることができ、他の部位を標的とすることで生じる望ましくない副作用を持たないであろう。生体内でアデノウイルス・ベクターを標的に向かわせることは、遺伝子療法における1つの大きな目的であり、この目的を達成するための方法を開発することに多大な努力が払われてきている。うまくいくターゲティング法では、投与した全ベクターを適切な部位に向かわせることで毒性のより少ないベクターをより少なく投与できるため、ベクターの安全性プロファイルが向上するであろう。すると潜在的に免疫原性もより少なくすることができる。したがって生体内でまったく標的に向かわないアデノウイルスを開発し、それを、再び標的に向かうアデノウイルスを作る基礎ベクターとして使用する必要がある。
したがってこの明細書の目的の1つは、標的に向かわないアデノウイルス・ベクターと、その調製方法と、その利用法を提供することである。さらに、免疫療法とそのための組成物を提供することも、この明細書の1つの目的である。
免疫療法と、免疫療法での活性を有する組成物が提供される。特に、抗原を樹状細胞に送達してプロセシングとT細胞への提示をさせるアデノウイルス・ベクターが提供される。樹状細胞への抗原の送達には、予防、診断、治療の用途がある。
標的に向かわないか、まったく向かわない、血清型C（例えばアデノウイルス2やアデノウイルス5）からのアデノウイルス粒子が提供され、そのような粒子を作るためのアデノウイルス・ベクターが提供され、そのようなベクターと粒子の製造方法と、そのようなベクターと粒子の利用法が提供される。
この粒子は元からある所定の受容体（例えばAd5やAd2のコクサッキー・アデノウイルス受容体（CAR））との結合の標的とはならず、樹状細胞で発現している受容体を標的とすることができる。さらに、ウイルス粒子の中でも、HSP（ヘパラン硫酸プロテオグリカン；ヘパラン硫酸グリコサミノグリカンとも呼ばれる）との結合が存在しないか少ないためにHSPを発現する肝細胞への結合が少ないか存在しない粒子が提供される。
アデノウイルス粒子と、そのような粒子および／またはゲノム（ウイルス核酸分子）をコードしているゲノム、そのような粒子を産生する細胞系、方法が提供される。特に、Ad5粒子またはタイプCの他のウイルス粒子で、アデノウイルスのサブグループDまたはB（例えばAd19p、Ad30、Ad37、Ad16、Ad35）からのファイバー（または改変ファイバー）を発現するものが提供される。ファイバーは、改変して粒子に組み込めるようにする。この明細書で提供されるウイルス粒子は、肝細胞への結合が少なくなるために肝臓毒性が低下する。
異種ファイバーまたはその一部を含んでいるために樹状細胞に対するウイルス粒子の結合が増加し、ヘパラン硫酸プロテオグリカン（HSP）とCARへの結合が、ネイティブのファイバーを発現する粒子と比べて少ないか存在しないアデノウイルス粒子が提供される。アデノウイルス（Ad）粒子は、ファイバーを除いてサブグループCからのものであり、ファイバーはサブグループDのアデノウイルス（Ad19p）からのものである。別の一実施態様では、異種ファイバーはAd30からのものである。別の実施態様では、ファイバーはキメラであり、サブグループCのAdウイルスのファイバーからのN末端部を含んでいる。このN末端部があるだけで、それが存在していないときと比べて粒子への組み込みが増大する。例えばファイバーは、アデノウイルスAd19p、Ad30、Ad37、Ad16、Ad35からのものが可能である。ファイバー・タンパク質はさらに、得られるファイバーが、HSPに加え、1つ以上の細胞表面タンパク質（例えばCAR）と相互作用するのを減らすかなくす1つ以上の改変を含むことができる。
アデノウイルス粒子は、キャプシドのCAR結合領域における突然変異および／またはキャプシドのαvインテグリン結合領域における突然変異を含むこともできる。そのためインテグリンへの結合がなくなるか少なくなる。キャプシドの改変されたCAR結合領域は、ファイバーのノブに存在することができる。
いくつかの実施態様では、キメラ・ファイバーは、配列ID番号34に示したAd19pファイバーのアミノ酸のうちで、樹状細胞に粒子を向かわせ、場合によっては粒子とHSPの結合を減らすかなくすのに少なくとも十分な数のアミノ酸を含んでいる。例えばAd19pファイバーを、少なくともN末端の15個、または16個、または17個のアミノ酸をAd2ファイバーまたはAd5ファイバーの15個、または16個、または17個のアミノ酸で置換することによって改変する。別の実施態様では、キメラ・ファイバーは、配列ID番号30に示したAd30ファイバーのアミノ酸のうちで、樹状細胞に粒子を向かわせ、場合によっては粒子とHSPの結合を減らすかなくすのに少なくとも十分な数のアミノ酸を含んでいる。例えばAd30ファイバーを、少なくともN末端の15個、または16個、または17個のアミノ酸をAd2ファイバーまたはAd5ファイバーの15個、または16個、または17個のアミノ酸で置換することによって改変する。
したがって改変ファイバーを発現するアデノウイルス粒子と、改変ファイバーと改変ペントンの組み合わせを発現するアデノウイルス粒子を製造する方法と利用する方法が提供される。ファイバーのシャフトが改変されると、特にファイバーのノブの改変とペントンの改変が組み合わせると、アデノウイルス粒子は天然の細胞受容体に結合しなくなる（すなわち標的にならなくなる）。さらに、サブグループDのファイバーを選択することにより、得られる粒子が樹状細胞に向かう。粒子は、ウイルスのキャプシドにリガンドを付加することによって特定のタイプの細胞に“再び向かわせる”ことができる。するとウイルスがそのような細胞と結合してその細胞に感染する。リガンドは、例えばキャプシド・タンパク質遺伝子を遺伝子操作することによって付加することができる。
核酸、タンパク質、アデノウイルス粒子、アデノウイルス・ベクターには、数多くの用途がある。用途としては、生体内と試験管内で核酸を特定の細胞や組織に向かわせ、治療（例えば遺伝子治療）を行なうことや、細胞表面受容体の同定と研究を行なうことや、ウイルスが細胞と相互作用する方式を同定することといった用途がある。
キャプシド・タンパク質（例えばファイバー）をコードしている核酸も提供される。核酸は、ベクターとして、中でもアデノウイルス・ベクターとして、提供することができる。多数のアデノウイルス・ベクターが知られており、必要に応じてこの明細書の記述に従って改変することができる。アデノウイルス・ベクターとしては、初期世代アデノウイルス・ベクター（例えばE1欠損ベクター）、中身のないアデノウイルス・ベクター、条件付き複製アデノウイルス・ベクター（例えばがん溶解アデノウイルス・ベクター）などがある。アデノウイルス・ベクターは、腫瘍抗原や、免疫応答を誘導する病原体からの抗原といった産物をコードしている異種核酸、またはそのような産物を提供する核酸を含むこともできる。その結果、そのような病原体の感染が予防されたり、感染症状が軽減されたりする。異種核酸は、ポリペプチドをコードすること、あるいはプロモータまたはRNA（例えばRNAi、小さなRNA、他の二本鎖DNA、アンチセンスRNA、リボザイム）などの調節配列を含むかコードすることができる。プロモータとしては、例えば構成的プロモータ、調節プロモータ、組織特異的プロモータ（例えば腫瘍特異的プロモータ）などがある。プロモータは、例えばアデノウイルスの複製にとって不可欠な遺伝子と機能上リンクさせることができる。
核酸分子を含む細胞と、ベクターを含む細胞も提供される。そのような細胞としてパッケージング細胞がある。細胞としては原核細胞または真核細胞が可能であり、その中には、哺乳動物の細胞、例えばヒト細胞などの霊長類の細胞が含まれる。
この明細書に記載した改変キャプシド・タンパク質を含むアデノウイルス粒子も提供される。この粒子は樹状細胞に対する親和性が増大しており、改変キャプシド・タンパク質を含まない粒子と比べてHSPとの相互作用または結合も変化している。この粒子は、HSPおよび樹状細胞に対する結合が変化していることに加え、さらに別の変化を含むことができる。それは例えば、上記のようにキャプシド・タンパク質と他の受容体の相互作用が変化していることである。特に、この粒子は、CAR、および／またはαvインテグリン、および／または他の受容体との相互作用が変化している（一般に減少しているか存在しない）可能性がある。突然変異としては、ファイバーのノブ、ペントン、ヘキソンにおける突然変異がある。ファイバーのノブの突然変異は、ABループまたはCDループにおける突然変異（例えばKO1またはKO12）である。そのような突然変異としては、例えばPD1、KO1、KO12、S*などがある（例えばアメリカ合衆国仮出願シリアル番号第60/459,000号と、同時係属中のアメリカ合衆国出願シリアル番号第10/351,890号を参照のこと）。さらに、この粒子は、選択された受容体を再び標的とするための別のリガンドを含むことができる。アデノウイルス粒子は、あらゆる血清型とサブグループからのものが可能である。
細胞内で異種核酸を発現させる方法も提供される。その方法では、この明細書に記載したアデノウイルス・ベクターを用いて細胞に形質導入し、核酸および／またはコードされた産物を送達する。形質導入は、生体内、試験管内、生体外のいずれでも行なうことが可能であり、さまざまな目的（例えば遺伝子発現や遺伝子治療の研究）で実施できる。細胞としては、原核細胞も可能だが、一般には真核細胞（例えば哺乳動物の細胞で、その中にはヒト細胞などの霊長類の細胞が含まれる）である。細胞としては、特定のタイプのもの（例えば腫瘍細胞）や特定の組織中の細胞が可能である。
A．定義
B．アデノウイルス-細胞相互作用
1．ファイバー・タンパク質
2．シュードタイピング
C．樹状細胞ターゲティング
1．樹状細胞
2．樹状細胞療法
3．アデノウイルス粒子を樹状細胞に向かわせる
a．ファイバーの置換
b．効率的ターゲティング
4．追加の改変
D．アデノウイルス・ベクターを標的に向かわせない
E．核酸、アデノウイルス・ベクター、その核酸を含む細胞、そのベクターを含む細胞
1．ウイルス粒子の調製
2．アデノウイルス・ベクターとアデノウイルス粒子
a．中身のないベクター
b．がん溶解ベクター
3．パッケージング
4．増殖とスケール・アップ
F．アデノウイルス発現ベクター系
1．核酸遺伝子発現カセット
2．プロモータ
G．異種ポリヌクレオチドと治療用核酸
H．製剤と投与
1．製剤
2．投与
I．疾患、異常、治療用産物
J．実施例
A．定義
特に断わらない限り、この明細書で使用するすべての科学技術用語は、本発明が属する分野の当業者が一般的に理解しているのと同じ意味を持つ。この明細書全体を通じて引用されるすべての特許、特許出願、公開された出願や発表物、GenBankの配列、ウェブサイト、ならびに他の公開された材料は、特に断わらない限り、参考としてその全体がこの明細書に組み込まれているものとする。この明細書に現われる用語に複数の定義がある場合には、このセクションにおける定義を優先する。URLなどのサイトやアドレスを参照する場合には、そのようなサイトは変わることがあり、またインターネット上の特定の情報は掲載されたり削除されたりしうるが、例えばインターネット上および／または適切なデータベースを検索することにより、同等な情報を知ったり、同等な情報に容易にアクセスしたりできることがわかるであろう。そのようなものを参照するというのは、そのような情報が利用可能で広く普及していることを証明している。
この明細書では、“アデノウイルス”または“アデノウイルス粒子”という用語に、アデノウイルスに分類しうるあらゆるウイルスが含まれる。その中には、ヒトまたは動物に感染するあらゆるグループ、サブグループ、血清型のあらゆるアデノウイルスが含まれる。文脈によっては、“アデノウイルス”にアデノウイルス・ベクターも含まれる。少なくとも51種類の血清型のアデノウイルスがあり、それがいくつかのサブグループに分類される。例えばサブグループAにはアデノウイルス血清型12、18、31が含まれる。サブグループCにはアデノウイルス血清型1、2、5、6が含まれる。サブグループDにはアデノウイルス血清型8、9、10、13、15、17、19、19p、20、22〜30、32、33、36〜39、42〜49が含まれる。サブグループEにはアデノウイルス血清型4が含まれる。サブグループFにはアデノウイルス血清型40と41が含まれる。最後の2つの血清型は、長いファイバー・タンパク質と短いファイバー・タンパク質を有する。例えばこの明細書では、アデノウイルスまたはアデノウイルス粒子は、パッケージされたベクターまたはゲノムである。
この明細書では、“ウイルス”、“ウイルス粒子”、“ベクター粒子”、“ウイルス・ベクター粒子”、“ビリオン”は同じ意味で使用され、感染性ウイルス粒子を意味する。この感染性ウイルス粒子は、このような粒子を作ることを目的として、ウイルスのゲノムのすべてまたは一部を含むベクターによって適切な細胞または細胞系に形質導入されたときなどに形成される。得られるウイルス粒子にはさまざまな用途があり、例えば試験管内または生体内で核酸を細胞内に移す。この明細書での目的のためのウイルスはアデノウイルスである。その中には、アデノウイルス・ベクター（例えばこの明細書に記載した任意のもの）がアデノウイルスのキャプシドの中に封入されたときに形成される組み換えアデノウイルスが含まれる。したがってウイルス粒子は、パッケージされたウイルスのゲノムである。アデノウイルス粒子は、ウイルスの最少構造または機能単位である。ウイルスは、単一の粒子、粒子群、ウイルスのゲノムのいずれかを意味することができる。アデノウイルス（Ad）粒子は比較的複雑であり、さまざまな下部構造に分けることができる。
アデノウイルスとアデノウイルス粒子には、アデノウイルスに分類しうるあらゆるウイルスが含まれる。その中には、ヒトまたは動物に感染するあらゆるグループ、サブグループ、血清型のあらゆるアデノウイルスが含まれる。文脈によっては、“アデノウイルス”にアデノウイルス・ベクターも含まれる。したがってこの明細書では、“アデノウイルス”と“アデノウイルス粒子”は、特に断わらない限り、ウイルスそのものとその誘導体を意味し、あらゆる血清型とサブタイプ、天然形態と組み換え形態を含んでいる。アデノウイルスは野生型のものが可能であり、従来技術で知られているさまざまな方法で、あるいはこの明細書に開示したようにして改変することができる。改変としては、感染性ウイルスにするために粒子にパッケージされたアデノウイルスのゲノムに対して行なう改変などがある。具体的な改変としては、従来技術で知られている欠損（例えばE1aコード領域、E1bコード領域、E2aコード領域、E2bコード領域、E3コード領域、E4コード領域のうちの1つ以上の欠損）などがある。改変の別の具体例としては、アデノウイルスのゲノムの全コード領域の欠損がある。このようなアデノウイルスは、“中身のない”アデノウイルスとして知られている。この用語には、条件付き複製アデノウイルスが含まれる。これは、所定のタイプのタイプの細胞または組織において好んで複製されるが、他のタイプでは複製がより少ないかまったく複製されないウイルスである。例えばこの明細書に記載したアデノウイルス粒子の1つに、異常に増殖している組織（例えば固形腫瘍やそれ以外の新生物）において複製されるアデノウイルス粒子がある。例えばアメリカ合衆国特許第5,998,205号、第5,801,029号に開示されているウイルスが挙げられる。このようなウイルスは、“細胞溶解性”ウイルス（またはベクター）または“細胞変性”ウイルス（またはベクター）と呼ばれることがあり、そのウイルスが腫瘍細胞に対してもそのような効果を有する場合には、“がん溶解性”ウイルス（またはベクター）と呼ばれる。
この明細書では、“ベクター”、“ポリヌクレオチド・ベクター”、“ポリヌクレオチド・ベクター構造体”、“核酸ベクター構造体”、“ベクター構造体”という用語は同じ意味で使用され、当業者によって理解されているように、遺伝子導入に利用できるあらゆる核酸構造体を意味する。
この明細書では、“ウイルス・ベクター”という用語は、従来技術での意味で用いられる。この用語は、ウイルスの少なくとも1つの起点エレメントを含む核酸構造体を意味し、ウイルス・ベクター粒子の中にパッケージすることができる。ウイルス・ベクター粒子は、DNA、RNA、またはこれら以外の核酸を試験管内または生体内で細胞内に移すのに用いることができる。ウイルス・ベクターとしては、レトロウイルス・ベクター、ワクシニアウイルス・ベクター、レンチウイルス・ベクター、ヘルペスウイルス・ベクター（例えばHSV）、バキュロウイルス・ベクター、サイトメガロウイルス（CMV）ベクター、パピローマウイルス・ベクター、サル・ウイルス（SV40）ベクター、シンドビス・ベクター、セムリキ森林ウイルス・ベクター、ファージ・ベクター、アデノウイルス・ベクター、アデノ随伴ウイルス（AAV）ベクターなどがある。適切なウイルス・ベクターは、例えばアメリカ合衆国特許第6,057,155号、第5,543,328号、第5,756,086号に記載されている。この明細遺書で提供されるベクターは、アデノウイルス・ベクターである。
この明細書では、“アデノウイルス・ベクター”と“アデノウイルス性ベクター”は同じ意味で用いられ、アデノウイルスのゲノムのすべてまたは一部を含むポリヌクレオチドを意味すると従来技術では理解されている。アデノウイルス・ベクターは、完全なゲノムをコードしている核酸、または改変されたゲノムをコードしている核酸を意味する。すなわち細胞内に入れたときに、特に粒子としてパッケージしたときに、異種核酸を導入するのに使用できるゲノムをコードしている核酸を意味する。アデノウイルス・ベクターは、いくつかある形態のうちの任意の形態を取ることができる。例えば裸のDNA、アデノウイルスのキャプシドに封入されたDNA、別のウイルスまたはウイルス様の形態（例えば単純ヘルペスウイルスやAAV）の中にパッケージされたDNA、リポソームの中に封入されたDNA、ポリリシンとの複合体になったDNA、合成ポリカチオン分子との複合体になったDNA、トランスフェリンとの複合体になったDNA、免疫学的に分子を“マスク”するため、および／または半減期を長くするためにPEGなどの化合物との複合体になったDNA、非ウイルス・タンパク質と共役したDNAなどがある。
この明細書では、がん溶解アデノウイルスは、腫瘍細胞の中で選択的に複製されるアデノウイルスを意味する。
この明細書には、異なる要求と目的を持った多彩なベクターを記載してある。例えばあるベクターは、特定の核酸分子をパッケージング細胞系の中に送達して染色体に安定に組み込む。このタイプのベクターは、補足プラスミドとも呼ばれる。別のタイプのベクターは、この明細書では送達プラスミドとも呼ぶことができる。第3のタイプのベクターは、ウイルスの核酸を封入したウイルス粒子の形態をしていて、この明細書に記載したように改変したキャプシドを含むベクターである。このようなベクターは、特定のポリペプチド（例えば治療を必要としている対象の特定の細胞または特定のタイプの細胞に対する治療用ポリペプチド、調節タンパク質、調節配列）をコードしている異種核酸分子を含むこともできる。
この明細書では、“モチーフ”という用語は、特定の機能に関係するタンパク質の一次配列の一部（連続していてもよいし、不変であるか保存されていて、所定の位置に並べることができてもよい）を形成するアミノ酸のあらゆる集合を指すのに用いる。モチーフは、一次配列が理由で生じるだけでなく、三次元折り畳みの結果としても生じる可能性がある。例えばアデノウイルスのファイバーは三量体であるため、三量体構造がモチーフの形成に寄与することができる。あるいはモチーフは、タンパク質の1つのドメインと考えることもできる。その場合ドメインは、分子下部構造の知識もなく分子下部構造とも関係なしに機能に基づいて規定されるタンパク質の領域（例えばタンパク質で受容体と結合する部分）である。この明細書に示したように、モチーフKKTKは、ファイバーのシャフトがHSPと相互作用するためのコンセンサス配列を構成する。
この明細書では、細胞療法は、生きた細胞の投与を含む治療法である。養子免疫療法は、対象から細胞を取り出し、生体外で何らかの方法によってその細胞を処理し、処理した細胞を治療として同じ対象または異なる対象に輸液する操作を含む治療法である。
この明細書では、細胞治療薬は、活性成分のすべてまたは一部が生きた細胞である薬として調製した細胞組成物を意味する。
この明細書では、免疫細胞は、白血球として知られる血液細胞の一部である。白血球には、単核細胞であるリンパ球、単球、マクロファージ、顆粒球が含まれる。
この明細書では、T細胞は、CD3抗原を発現するリンパ球である。
この明細書では、ヘルパー細胞は、CD4+リンパ球である。
この明細書では、調節細胞は、免疫応答を促進または抑制できるT細胞の一部（最も一般的にはCD4+T細胞）である。調節免疫細胞は、主にその細胞のサイトカイン分泌プロファイルによって免疫応答を調節する。調節免疫細胞の中には、その細胞の表面に発現する抗原によって免疫応答を促進または抑制し、その効果を細胞-細胞接触を通じて伝えることのできるものもある。Th1細胞とTh2細胞は、調節細胞の具体例である。
この明細書では、エフェクター細胞は、直接的相互作用（例えば食作用、パーフォリン、および／またはグランザイムの分泌、アポトーシスの誘導など）を通じて腫瘍または病原体をなくす働きを主にする免疫細胞である。エフェクター細胞は、一般に、機能するのに調節細胞の助けを必要とし、遅延タイプの過敏反応や細胞傷害機能のメディエータとしても機能する。エフェクター細胞の具体例は、Bリンパ球、マクロファージ、細胞傷害性リンパ球、LAK細胞、NK細胞、好中球である。
この明細書では、プロ抗原提示細胞（APC）として、樹状細胞、B細胞、マクロファージなどが挙げられる。
この明細書では、“結合する”または“結合”という用語は、リガンドとそれに対応する受容体の結合を指すのに用いる。その一例はAd5のノブ・ドメインとCAR（コクサッキー-アデノウイルス受容体）の結合であり、Kdは、10-2〜10-15モル／リットルの範囲である（一般には10-6〜10-15、10-7〜10-15、典型的には10-8〜10-15（および／またはKaが10+5〜1012、107〜1012、108〜1012リットル／モル））。
この明細書では、特異的結合または選択的結合は、特定のリガンドと1つの受容体の結合（KaまたはKeq）が、他の受容体との結合と比べて少なくとも2倍、一般には5倍、10倍、50倍、100倍、またはそれ以上強いことを意味する。特定のウイルス・ベクターがある細胞または組織を標的とするという表現は、宿主細胞内または試験管内のその細胞または組織に対する親和性が、その宿主細胞内または試験管内の条件下にある他の細胞または組織に対する親和性と比べて少なくとも約2倍、一般には5倍、10倍、50倍、100倍、またはそれ以上であることを意味する。
この明細書では、“なくす”または“なくされた”という用語は、特定の細胞受容体への結合能力が、対応する野生型アデノウイルスと比べて小さいか消えている（一般には実質的に消えている、すなわち1/10、1/100またはそれ以下である）アデノウイルス、アデノウイルス・ベクター、アデノウイルス粒子を意味する。結合能力が消えたアデノウイルス、アデノウイルス・ベクター、アデノウイルス粒子は、標的に向かわない（すなわち改変されたアデノウイルス、アデノウイルス・ベクター、アデノウイルス粒子が、野生型アデノウイルスが元々有する親和性を持たない）とも言われる。突然変異したアデノウイルスのファイバー・タンパク質が細胞受容体と結合する能力が、対応する野生型ファイバー・タンパク質と比べて小さくなるか消えていることは、細胞受容体を有する細胞への形質導入効率（遺伝子導入とマーカー遺伝子の発現）を、突然変異したファイバー・タンパク質を含むアデノウイルス粒子と、野生型ファイバー・タンパク質を含むアデノウイルス粒子の間で比較することによって明らかにすること、または評価することができる。
この明細書では、アデノウイルスに関する親和性は、キャプシド・タンパク質（例えばファイバー・タンパク質および／またはペントン）によって粒子に与えられる選択的な感染性または結合性を意味する。
この明細書では、“ペントン”または“ペントン複合体”は、ペントン・ベースとファイバーの間の複合体を指すのに用いる。“ペントン”という用語は、ペントン・ベースとペントン複合体を指すのに用いることもできる。“ペントン”という用語だけでも、その意味は、用いられている文脈から明らかなはずである。
この明細書では、“実質的に消えた”という表現は、ヒーラ細胞に関し、形質導入の効率が、ウイルスを含む野生型ファイバーの効率の約11％未満であることを意味する。ヒーラ細胞に関する形質導入の効率は、測定可能である（例えば2001年5月30日にアメリカ合衆国特許出願シリアル番号第09/870,203号として出願され、アメリカ合衆国出願公開第20020137213号として公開されるとともに、2001年6月1日に国際特許出願PCT/EP01/06286として出願され、WO 01/92299として公開された出願の実施例1を参照のこと）。簡単に述べると、突然変異したファイバー・タンパク質を含むアデノウイルス・ベクターをヒーラ細胞に感染させ、ファイバーのアミノ酸の突然変異がCAR相互作用とそれに続く遺伝子発現に及ぼす効果を評価する。例えば2％FBSを含む合計が例えば0.35mlのDMEMの中で、12ウエルのプレートに入れた単層ヒーラ細胞に例えば1細胞につき100粒子を37℃にて2時間にわたって感染させる。次にこの感染培地を単層から吸引し、10％FBSを含む完全DMEMをウエル1つにつき1ml添加する。細胞を十分な時間（一般には約24時間）インキュベートしてβ-ガラクトシダーゼを発現させ、その発現を、化学発光レポータ・アッセイまたは発色基質を用いた組織化学的染色で測定する。β-ガラクトシダーゼ活性の相対レベルを適切な系（例えばガラクト-光化学ルミネッセンス・レポータ・アッセイ系（トロピックス社、ベッドフォード、マサチューセッツ州））を用いて測定する。単層細胞をPBSで洗浄し、製造者のプロトコルに従って処理する。細胞ホモジェネートをマイクロフュージ管に移して遠心分離することにより、細胞残滓を除去する。全タンパク質濃度を測定する。それには、例えばアッセイの基準としてウシ血清アルブミンを用いたビシンコニン酸（BCA）タンパク質アッセイ（ピアース社、ロックフォード、イリノイ州）を利用する。次に各サンプルのアリコートを96ウエルのプレートの中でトロピックス社のβ-ガラクトシダーゼ基質とともに45分間にわたってインキュベートする。サンプルから放射される相対的光単位（RLU）をルミノメータを用いて測定した後、各サンプル中の全タンパク質の量で規格化する（RLU／μg全タンパク質）。組織化学的染色の手続きとしては、単層細胞をPBSの中で0.5％グルタルアルデヒドを用いて固定した後、0.5mlのPBSの中に1mlにつき1mgの5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリル-β-D-ガラクトシド（X-gal）と、5mMのフェロシアン化カリウムと、5mMのフェリシアン化カリウムと、2mMのMgCl2を含む混合物とともにインキュベートした。単層をPBSで洗浄し、青い細胞を光学顕微鏡（例えばツァイスID03顕微鏡）で可視化する。一般に、効率は約9％未満、典型的には約8％未満である。
この明細書では、“減る”または“低下”という用語は、ヒーラ細胞に関し、突然変異したファイバーまたは異種ファイバーを含むアデノウイルスによる形質導入の効率の変化が、野生型ファイバーを含むアデノウイルスと比べて約75％以下のレベルであることを意味する。一般に、効率は、野生型の約65％以下のレベルに変化する。効率は一般に約55％以下に変化する。この系を用いると、ウイルス粒子において、望む親和性を持つ改変ファイバー・タンパク質および／または改変ペントン・タンパク質を素早く分析することができる。
この明細書では、“突然変異する”や“突然変異”、あるいは同様の用語は、興味の対象であるタンパク質（例えばファイバーのシャフト領域でHSPと相互作用している部分）の少なくとも1つのアミノ酸の欠失、挿入、変化のいずれかを意味する。アミノ酸を置換または修飾によって変化させて誘導体化することができる。
この明細書では、“ポリヌクレオチド”という用語は、ポリヌクレオチドをコードしている核酸分子（例えばDNA、RNA）を意味する。この分子は一般にDNAであり、調節配列を含むことができる。このようなポリヌクレオチドは、当業者に知られている方法にその分野での知識を組み合わせることによって調製または取得される。
この明細書では、“ウイルス・ベクター”という用語は、従来技術で認められている意味で用いる。この用語は、ウイルス起源の少なくとも1つのエレメントを含む核酸ベクター構造体を意味し、ウイルス・ベクター粒子の中にパッケージングすることができる。ウイルス・ベクター粒子は、例えば試験管内または生体内でDNAを細胞内に移すのに用いることができる。
この明細書では、アデノウイルスのゲノムに、改変ファイバー・タンパク質を含むあらゆるアデノウイルス・ベクターまたは核酸配列が含まれるものとする。この明細書に記載したベクターと方法では、アデノウイルスのすべての血清型を利用することを考える。
この明細書では、パッケージング細胞系は、ウイルス粒子を作る際のアデノウイルスのゲノムまたは改変ゲノムをパッケージすることのできる細胞系である。パッケージング細胞系は、失われた遺伝子産物またはその等価物を提供することができる。したがってパッケージング細胞は、アデノウイルスのゲノムに欠けている遺伝子を補う機能（例えば改変ファイバー・タンパク質をコードしている核酸）を提供することができ、アデノウイルスのゲノムをパッケージングしてアデノウイルス粒子にすることができる。このような粒子を製造するには、ゲノムが複製されることと、感染性ウイルスを組み立てるのに必要なタンパク質が産生されることが必要である。粒子は、ウイルス粒子の成熟に必要なある種のタンパク質も必要とする可能性がある。そのようなタンパク質は、ベクターまたはパッケージング細胞によって提供できる。
この明細書では、標的に向かわないアデノウイルス粒子は、元の粒子が相互作用する受容体との相互作用がなくなって（減って、または消えて）いる。生体内では、どの粒子も、どの細胞とも相互作用しないほど完全には機能をなくしていないことがわかる。標的に向かわない粒子は、元の受容体との相互作用が減っている（一般には顕著に減っている）か、なくなっている。この明細書での目的を考えると、標的に向かわない粒子は、CARまたは別の元の受容体との結合が減っている（1/2、1/5、1/10、1/100またはそれ以下）か、ほとんど結合がない。粒子はそれでも細胞と結合しているが、細胞の種類と相互作用は減っている。
この明細書では、シュードタイピングは、改変キャプシド・タンパク質を有するアデノウイルス・ベクター、またはベクターそのものの血清型とは異なる血清型からのキャプシド・タンパク質を有するアデノウイルス・ベクターの製造を意味する。一例は、Ad37またはAd35のファイバー・タンパク質を含むアデノウイルス5ベクター粒子の製造である。これは、さまざまなファイバー・タンパク質を発現するパッケージング細胞系の中でアデノウイルス・ベクターを製造することによって実現できる。
この明細書では、受容体は、生物活性のある分子のうち、他の分子に特異的または選択的に結合するものを意味する。“受容体タンパク質”という用語は、特異的受容体が持つタンパク質としての性質をより明確に示すのに用いることができる。
この明細書では、“異種ポリヌクレオチド”という用語は、あるアデノウイルスとは別の生物供給源に由来するポリヌクレオチド、または異なる株のアデノウイルスに由来するポリヌクレオチドを意味し、野生型ウイルスとは異なる遺伝子座にあるポリヌクレオチドであってもよい。異種ポリヌクレオチドは、毒素や治療用タンパク質などのポリペプチドをコードすることができる。異種ポリヌクレオチドは、プロモータ領域（例えば特定の細胞または組織（例えばがん溶解アデノウイルスに見られる腫瘍組織）において活性なプロモータ）などの調節領域を含むことができる。あるいは異種ポリヌクレオチドは、ポリペプチドをコードすることができ、さらに、コード領域と機能上リンクしたプロモータ領域を含むことができる。
この明細書では、“サイクリックRGD”（またはcRGD）という用語は、細胞表面にあるαvインテグリンと結合するとともに、配列RGD（アルギニン-グリシン-アスパラギン酸）を含むあらゆるアミノ酸を意味する。
この明細書では、KO突然変異は、ファイバー内にあってCARへの結合をノックアウトする突然変異を意味する、例えばKO突然変異は、Ad5ファイバー中の突然変異と、他のファイバー・タンパク質にある対応する突然変異を意味する。Ad5では、この突然変異によってファイバーのアミノ酸408と409に置換が起こり、それぞれセリンとプロリンからグルタミン酸とアラニンへと変化する。この明細書では、KO12突然変異は、Ad5ファイバー中の突然変異と、他のファイバー・タンパク質にある対応する突然変異を意味する。Ad5では、この突然変異は、R512S、A515G、E516G、K517Gという4つのアミノ酸置換である。他のKO突然変異は、経験的に同定することができるか、当業者に知られている。
この明細書では、PD突然変異は、三ペプチドRGDを置換することによってαvインテグリンへの結合がなくなる、ペントン遺伝子における突然変異を意味する。この明細書に記載したPD1突然変異により、Ad5ペントン・タンパク質のアミノ酸337〜344にあるHAIRGDTF（配列ID番号49）がアミノ酸SRGYPYDVPDYAGTS（配列ID番号50）で置換されるため、三ペプチドRGDが置換される。
この明細書では、アデノウイルスのタンパク質のアミノ酸、またはアデノウイルスのゲノム中のヌクレオチドに言及するときは、特に断わらない限りAd5のことである。当業者であれば、他のアデノウイルス株や改変された株、またはベクターに含まれる対応するアミノ酸とヌクレオチドを同定することができよう。したがって突然変異について述べるときは、対応する遺伝子座を有するすべてのアデノウイルス株が対象となるものとする。
この明細書では、腫瘍抗原は、腫瘍細胞の表面で発現するか、腫瘍細胞の表面に位置する細胞表面タンパク質を意味する。
この明細書では、治療は、状態、異常、疾患を改善するか、そうでなくとも好ましい方向にさせるあらゆる方法を意味する。
この明細書では、治療に有効な産物は、異種DNAによってコードされている産物であって、そのDNAが宿主に導入されたときに発現して、先天的または後天的な疾患の現われである症状を効果的に改善または解消するか、その疾患を治癒させるものである。
この明細書では、対象は動物であり、例えば哺乳動物、一般にはヒトが挙げられ、その中に患者も含まれる。
この明細書では、遺伝子治療は、その療法を適用しようとする疾患または状態を有する哺乳動物（特にヒト）の所定の細胞や標的細胞に異種DNAを移す操作を含んでいる。選択した標的細胞にその異種DNAを導入し、そのDNAが発現してそのDNAによってコードされている治療用産物が産生されるようにする。あるいは異種DNAは、治療用産物をコードしているDNAの発現を何らかの形で媒介すること、または治療用産物の発現を何らかの形で直接的または間接的に媒介する産物（例えばペプチドまたはRNA）をコードすることができる。遺伝子治療は、遺伝子産物をコードしている核酸を送達して欠陥のある遺伝子と交換すること、またはその核酸が導入された哺乳動物または細胞が産生する遺伝子産物を補うこともできる。導入された核酸は、通常は哺乳動物宿主では産生されなかったり、治療に有効な量が産生されなかったり、治療に役立つときに産生されなかったりする治療用化合物（例えばその成長因子阻害剤）や腫瘍壊死因子またはその阻害剤（例えばその受容体）をコードすることができる。治療用産物をコードしている異種DNAを改変してからそれを侵された宿主に導入し、産物またはその発現を増大または変化させることができる。
この明細書では、治療用核酸は、治療用産物をコードしている核酸である。この産物は、核酸（例えば調節配列または調節遺伝子）であること、あるいは治療活性または治療効果を有するタンパク質をコードすることが可能である。例えば治療用核酸としては、リボザイム、アンチセンスRNA、二本鎖RNA、タンパク質をコードしている核酸などが可能である。
この明細書では、“相同な”は、核酸配列の約25％を超える割合（例えば25％、40％、60％、70％、80％、90％、95％）が一致していることを意味する。必要な場合には、％ホモロジーを指定することになる。“ホモロジー”および“一致”という用語は、しばしば同じ意味で用いられる。一般に配列は、互いに最もよく一致するようにアラインメントする（例えば、『計算分子生物学』、Lesk, A.M.編、オックスフォード大学出版、ニューヨーク、1988年；『バイオコンピューティング：インフォマティックスとゲノム計画』、Smith, D.W.編、アカデミック出版、ニューヨーク、1993年；『配列データのコンピュータ解析、パート1』、Griffin, A.M.とGriffin, H.G.編、ヒューマナ出版、ニュージャージー州、1994年；『分子生物学における配列分析』、von Heinje, G.、アカデミック出版、ニューヨーク、1987年；『配列分析プライマー』、Gribskov, M.とDevereux, J.編、M.ストックトン出版、ニューヨーク、1991年；Carillo他、1988年、SIAM J. Applied Math.、第48巻、1073ページを参照のこと）。配列一致では、保存されているアミノ酸の数が標準的なアラインメント・アルゴリズム・プログラムによって明らかになり、その数が、そのプログラムの提供者が決めたデフォルトのギャップ・ペナルティとともに用いられる。実質的に相同な核酸分子は、一般に中程度に厳しい条件または非常に厳しい条件で、興味の対象である核酸分子の全長または少なくとも約70％、80％、90％とハイブリダイズするであろう。ハイブリダイズする核酸分子のコドンの代わりに縮重したコドンを含む核酸分子も考える。
任意の2つの核酸分子の核酸配列が例えば少なくとも80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％“一致している”かどうかは、公知のコンピュータ・アルゴリズムを用いて（例えばPearson他（Proc. Natl. Acad. Sci. USA、第85巻、2444ページ）のようにFAST Aプログラムを例えばデフォルト・パラメータで用いて）調べることができる（他のプログラムとしては、GCGプログラム・パッケージ（Devereux, J.他、Nucleic Acids Research、第12巻(1)、387ページ、1984年）、BLASTP、BLASTN、FASTA（Altschul, S.F.、J. Molec. Biol.、第215巻、403ページ、1990年）；『巨大コンピュータへのガイド』、Martin J. Bishop編、アカデミック出版、サン・ディエゴ、1994年、Carillo他、1988年、SIAM J. Applied Math.、第48巻、1073ページなどがある）。例えば国立バイオテクノロジー情報データベース・センターのBLAST関数を用いて一致を調べることができる。市販または公開されている他のプログラムとして、DNAスターの“MegAlign”プログラム（マディソン、ウィスコンシン州）やウィスコンシン大学遺伝学コンピュータ・グループ（UWG）の“ギャップ”プログラム（マディソン、ウィスコンシン州）などがある。タンパク質および／または核酸分子のパーセント・ホモロジーまたはパーセント一致は、例えばギャップ・コンピュータ・プログラムを用いて配列情報を比較することによって明らかにできる（例えばNeedleman他、1970年、J. Mol. Biol.、第48巻、443ページ。その改良版は、SmithとWaterman、1981年、Adv. Appl. Math.、第2巻、482ページ）。簡単に述べるならば、ギャップ・プログラムは、アラインメントによって並んだ記号（すなわちヌクレオチドまたはアミノ酸）の数を、2つの配列のうちの短いほうに含まれる記号の総数で割った値として類似度を定義する。ギャップ・プログラムのデフォルト・パラメータとしては、（1）単項比較マトリックス（一致した場合には1、一致しない場合には0という値を含む）と、Gribskovら（1986年、Nucl. Acids Res.、第14巻、6745ページ）の重み付き比較マトリックス（SchwartzとDayhoff編、『タンパク質の配列と構造の地図』、国立生体臨床医学研究財団、353〜358ページ、1979年に説明がある）；（2）各ギャップに対する3.0というペナルティと、各ギャップの各記号に対する追加の0.10というペナルティ；（3）末端のギャップに対するペナルティなし、がある。したがってこの明細書では、“一致”という用語は、調べるポリペプチドまたはポリヌクレオチドと、参照するポリペプチドまたはポリヌクレオチドの比較結果を示している。
この明細書では、“少なくとも90％一致する”という表現は、参照ポリペプチドと90〜99.99％のパーセント一致であることを意味する。90％以上のレベルでの一致は、具体例として調べるポリペプチドと参照ポリペプチドを比較するとき長さがアミノ酸100個であると仮定したとき、調べるポリペプチドのアミノ酸が参照ポリペプチドのアミノ酸と10％（すなわち10/100）以下しか異なっていないことを示している。同様の比較を、調べるポリヌクレオチドと参照ポリヌクレオチドの間で行なうことができる。このような違いは、アミノ酸配列の全長にわたってランダムに分布した点突然変異として現われることもあれば、許容可能な最大値（例えば10/100のアミノ酸の違い（約90％一致））までの長さで異なる1つ以上の位置にクラスター化されていることもある。違いは、核酸またはアミノ酸の置換または欠失として定義される。約85〜90％を超えるホモロジーまたは一致のレベルでは、結果は、プログラムやギャップ・パラメータの集合とは独立でなくてはならない。このような高いレベルの一致は、しばしばソフトウエアに頼ることなく、容易に見つけることができる。
この明細書では、ミスマッチの割合を調べるためのハイブリダイゼーションの厳しさは、以下の通りである。
1）非常に厳しい：0.1×SSPE、0.1%SDS、65℃
2）中程度の厳しさ：0.2×SSPE、0.1%SDS、50℃
3）あまり厳しくない：1.0×SSPE、0.1%SDS、50℃
当業者であれば、洗浄ステップによって安定なハイブリッドが選択されることを知っているはずであるし、SSPEの成分も知っているはずである（例えば『分子クローニング、実験室マニュアル』（コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー出版、1989年）第3巻のSambrook、E.F. Fritsch、T. ManiatisによるB.13ページを参照のこと。実験室で一般に用いられている溶液について記載してある多数のカタログも参照のこと）。SSPEは、0.18MのNaClを含むpHが7.4のリン酸緩衝液である。さらに、当業者であれば、ハイブリッドの安定性はTmによって決まることを認識しているはずである。Tmはナトリウム・イオンの濃度と温度の関数（Tm = 81.5℃ + 16.6(log10 [Na+]) + 0.41 (％G+C) - 600/L）であるため、洗浄条件におけるパラメータのうちでハイブリッドの安定性にとって極めて重要なパラメータは、SSPE（またはSSC）中のナトリウム・イオンの濃度と温度だけである。
同等な厳しさは、別の緩衝液、塩、温度を利用して実現できることがわかるであろう。あまり厳しくない条件での手続きの具体例は以下の通りである（ShiloとWeinberg、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、第78巻、6789〜6792ページ、1981年も参照のこと）：DNAを含むフィルタを、35％ホルムアミドと、5×SSCと、50mMのトリス-HCl（pH7.5）と、5mMのEDTAと、0.1％PVPと、0.1％フィコールと、1％BSAと、500μg/mlの変性したサケ***DNAとを含む溶液の中で40℃にて6時間にわたって予備処理する（10×SSCは、1.5Mの塩化ナトリウムと0.15Mのクエン酸ナトリウムをpH7に調節したもの）。
以下のように変更した同じ溶液の中でハイブリダイゼーションを実施する：0.02％PVP、0.02％フィコール、0.2％BSA、100μg/mlの変性したサケ***DNA、10％(wt/vol)の硫酸デキストラン、5〜20×106cpmの32Pで標識したプローブ。フィルタをハイブリダイゼーション混合物の中で40℃にて18〜20時間にわたってインキュベートした後、2×SSCと、25mMのトリス-HCl（pH7.4）と、5mMのEDTAと、0.1％のSDSとを含む溶液中で55℃にて1.5時間にわたって洗浄する。洗浄溶液を新鮮な溶液と交換し、60℃にてさらに1.5時間インキュベートする。フィルタをブロットして乾燥させ、放射能写真撮影する。必要であれば、フィルタの3回目の洗浄を65〜68℃にて行ない、再度フィルムに露出する。利用可能なあまり厳しくない他の条件は、従来技術においてよく知られている（例えば種交差ハイブリダイゼーションで利用されている条件）。
中程度に厳しい条件での手続きの具体例は以下の通りである：DNAを含むフィルタを、6×SSCと、5×デンハルト溶液と、0.5％SDSと、100μg/mlの変性したサケ***DNAとを含む溶液の中で55℃にて6時間にわたって予備処理する。ハイブリダイゼーションは同じ溶液中で実施し、5〜20×106cpmの32Pで標識したプローブを用いる。フィルタを55℃にて18〜20時間にわたってハイブリダイゼーション混合物の中でインキュベートした後、1×SSCと0.1％のSDSを含む溶液の中で60℃にて30分間にわたって2回洗浄する。フィルタをブロットして乾燥させ、放射能写真撮影する。利用可能なあまり厳しくない他の条件は、従来技術においてよく知られている。フィルタの洗浄は、2×SSCと0.1％のSDSを含む溶液の中で37℃にて1時間にわたって行なう。
非常に厳しい条件での手続きの具体例は以下の通りである：DNAを含むフィルタの予備ハイブリダイゼーションを、6×SSCと、50mMのトリス-HCl（pH7.5）と、1mMのEDTAと、0.02％PVPと、0.02％フィコールと、0.02％BSAと、500μg/mlの変性したサケ***DNAとからなる緩衝液の中で65℃にて8時間から一晩にわたって実施する。100μg/mlの変性したサケ***DNAと5〜20×106cpmの32Pで標識したプローブを含む予備ハイブリダイゼーション混合物の中で65℃にて48時間にわたってフィルターをハイブリダイズさせる。フィルタの洗浄を、2×SSCと、0.01％PVPと、0.01％フィコールと、0.01％BSAとを含む溶液の中で37℃にて1時間にわたって行なう。次いで0.1×SSCの中で50℃にて45分間にわたって洗浄した後、放射能写真撮影する。利用可能な非常に厳しい他の条件は、従来技術においてよく知られている。
実質的に一致、実質的に相同または似ているという表現は、当業者であればわかるように文脈によって決まり、一般に、少なくとも60％または70％一致することを意味する。一致度は、少なくとも80％、85％であることが好ましく、少なくとも90％であることがより好ましく、少なくとも95％であることが最も好ましい。
この明細書では、産物と実質的に一致とは、十分に似ているため、その産物の代わりにその実質的に同じ産物を使用できるくらいに興味の対象である性質が変化していないことを意味する。
この明細書では、実質的に純粋であるとは、当業者が純度を評価するのに利用する標準的な分析方法（例えば薄膜クロマトグラフィ（TLC）、ゲル電気泳動、高性能液体クロマトグラフィ（HPLC））で測定される容易に検出可能な不純物がないように見えるほど均一であるか、十分に純粋であるためにさらに精製してもその物質の物理的・化学的な性質（例えば酵素活性や生物活性）に検出可能なほどの変化がないことを意味する。化合物を精製して化学的に実質的に純粋な化合物を得る方法は、当業者に知られている。しかし化学的に実質的に純粋な化合物は、複数の立体異性体または異性体の混合物であってもよい。そのような場合、さらに精製するとその化合物の特異的活性が増大する可能性がある。
特に断わらない限り、この明細書で提供する産物の調製方法では、当業者に知られている化学、分子生物学、微生物学、組み換えDNA、遺伝学、免疫学、細胞生物学、細胞培養、トランスジェニック生物学の一般的な技術を利用する（例えばManiatis他、1982年、『分子クローニング：実験室マニュアル』、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー出版、コールド・スプリング・ハーバー、ニューヨーク州；Sambrook他、1989年、『分子クローニング：実験室マニュアル』、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー出版、コールド・スプリング・ハーバー、ニューヨーク州；Ausbel他、1992年、『分子生物学における最新プロトコル』、ワイリー＆サンズ社、ニューヨーク；Glover、1985年、『DNAのクローニングIとII』、オックスフォード出版；Anand、1992年、『複雑なゲノムの分析技術』、アカデミック出版；GuthrieとFink、1991年、『酵母の遺伝学と分子生物学の入門』、アカデミック出版；HarlowとLane、1988年、『抗体：実験室マニュアル』、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー出版、コールド・スプリング・ハーバー、ニューヨーク州；JakobyとPastan編、1979年、『細胞培養。酵素学における方法、58』、アカデミック出版、ハーコート・ブレース・ジャオヴァノヴィッチ、ニューヨーク州；『核酸のハイブリダイゼーション』（B.D. HamesとS.J. Higgins編、1984年）；『動物細胞の培養』（R.I. Freshney、アラン R.リス社、1987年）；『固定化した細胞と酵素』（IRL出版、1986年）；B. Perbal、1984年、『分子クローニングの実践ガイド』；『哺乳動物の細胞のための遺伝子導入ベクター』（J.H. MillerとM.P. Calos編、1987年、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー出版）；『酵素学における方法』、第154巻と第155巻（Wu他編）；『細胞と分子生物学における免疫化学的方法』（MayerとWalker編、アカデミック出版、ロンドン、1987年）；『実験免疫学ハンドブック』、第I〜IV巻（D.M. WeirとC.C. Blackwell編、1986年）；Hogan他、1986年、『マウスの胚操作』、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー出版、ニューヨーク州を参照のこと）。
B．アデノウイルス-細胞相互作用
アデノウイルスの異なるサブグループが特定のタイプの細胞および／または特定の受容体と相互作用する能力または相互作用しない能力を開発し、望む特異性を有するアデノウイルスを得ることができる。例えばアデノウイルスを改変し、特定のタイプの細胞および／または組織により効率的に向かうようにすることができる。アデノウイルスの血清型を変化させて天然の受容体との相互作用を小さくするかなくすことにより、アデノウイルスと特定のタイプの細胞および／または組織との相互作用を小さくするかなくすこともできる。したがってこの明細書では、ウイルスのキャプシドを変化させ、アデノウイルスと、天然の受容体および／またはさまざまなタイプの細胞の間の相互作用を変化させることと、アデノウイルスが他の受容体および／またはさまざまなタイプの細胞と相互作用するように変化させることが行なわれる。特に、樹状細胞を標的とするようになる改変が提供される。特に生体内でのアデノウイルスと他のタイプの細胞の間の相互作用が減少または消失する結果となる改変も提供される。
異なる血清型のアデノウイルスは、異なるタイプの細胞に感染する。それは、アデノウイルスのファイバーが別々の受容体と結合するからである（Defer他、1990年、J. Virol.、第64巻、3661〜3673ページ；Stevenson他、1995年、J. Virol.、第69巻、2850〜2857ページ；Arnberg他、2000年、J. Virol.、第74巻、42〜48ページ）。サブグループCのウイルス（Ad2とAd5が含まれる）では、コクサッキーウイルスとアデノウイルスの受容体（CAR）が細胞受容体として機能する（TomkoとPhilipson、1997年、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、第94巻、3352〜3356ページ；Bergelson他、1997年、Science、第275巻、1320〜1323ページ）。他のいくつかのサブグループからのアデノウイルスもCARと結合する（Roelvink他、1998年、J. Virol.、第72巻、7909〜7915ページ）が、感染と競合の研究によると、そのアデノウイルスは主要な受容体として他のタンパク質を利用している（Arnberg他、2000年、J. Virol.、第74巻、42〜48ページ；Huang他、1999年、J. Virol.、第73巻、2798〜2802ページ；Segerman他、2000年、J. Virol.、第74巻、1457〜1467ページ；Wu他、2001年、Virology、第279巻、78〜89ページ；Shayakhmetov他、2000年、J. Virol.、第74巻、2567〜2584ページ）。
1．ファイバー・タンパク質
アデノウイルスのファイバー・タンパク質は、62kDaの3つのポリペプチドを含むホモ三量体タンパク質である。Adファイバー・タンパク質は、二十面体をしたウイルス粒子の12ある頂点のそれぞれに位置する（Chroboczek他、1995年、Curr. Top. Microbiol. Immunol.、第199巻、163〜200ページ）。アデノウイルス血清型2（Ad2）、Ad5、Ad3、Ad12、Ad35、Ad40、Ad41など、さまざまな血清型からのファイバー遺伝子の配列が知られている。GenBankには、異なる少なくとも21種類のファイバー遺伝子がある。アデノウイルスの異なるいくつかの血清型からのファイバー・タンパク質の配列分析（Hong他、1988年、Virology、第167巻、545〜553ページ；Kidd他、1990年、Virology、第179巻、139〜150ページ；Signas他、1985年、J. Virol.、第53巻、672〜678ページ）と、Ad2ファイバーの結晶構造（van Raaij他、1999年、Nature、第401巻、935〜938ページ）から、ファイバー中に3つのドメインが同定されている。ファイバー・タンパク質のN末端領域はペントン・ベース・タンパク質と相互作用し、ファイバーをウイルス粒子に係留する。C末端ノブ領域は、ウイルスが宿主組織と結合する上で重要である。これら2つの領域は、長くて薄い中央のシャフト領域によって結合されている。シャフト領域は、数の決まっていないシャフトの反復を含んでおり、それぞれの繰り返し単位は、a-oと表記される15残基からなる。ファイバーのシャフトの繰り返しドメインは、位置jに常にグリシンまたはプロリンがあることと、疎水性残基の保存されたパターンがあることを特徴とする（van Raaij他、1999年、Nature、第401巻、935〜938ページ）。配列TLWT（配列ID番号46）を含む保存されたアミノ酸配列は、シャフト内のβ構造の繰り返し単位と球状ヘッド・ドメインの境界となっている。Adファイバー内でシャフトが繰り返されている数は、アデノウイルスの血清型が何であるかによって異なる。例えばAd2とAd5のファイバー・タンパク質では、シャフトの繰り返しが22回あるのに対し、Ad3では、繰り返しがわずか5回である（Chroboczek他、1995年、Curr. Top. Microbiol. Immunol.、第199巻、163〜200ページ）。
C末端のファイバーのノブは、CARに付着するための手がかりとなる。CARは、異なる多くのタイプの細胞で見られる免疫グロブリン・スーパーファミリーの46kDaタンパク質である（Bergelson他、1997年、Science、第275巻、1320〜1323ページ）。CARとの複合体中のAd12ファイバーの結晶構造から、ファイバーのノブ中の配列、中でもABループが、CARの第1のIg様ドメインと相互作用することがわかる（Bewley他、1999年、Science、第286巻、1579〜1583ページ）。Adペントン・ベース・タンパク質は、CARに付着した後、αvインテグリンと結合することで内部化が可能となり、ウイルスが細胞の中に侵入できるようになる。
アデノウイルスと特定のタイプの細胞の間の相互作用は、HSPに結合する能力の影響を受ける。すでに指摘したように、ファイバーのシャフトがHSPと相互作用しないアデノウイルスとしては、（a）サブグループBのアデノウイルス（例えばAd3、Ad35、Ad7、Ad11、Ad16、Ad21）、（b）サブグループFのアデノウイルス（例えばAd40、Ad41、特に短いファイバー）、（c）サブグループDのアデノウイルス（その中にはアデノウイルス血清型8、9、10、13、15、17、19、20、22〜30、32、33、36〜39、42〜49が含まれる）。血清型19には変種がある。Ad19pはAd19の非病原性変種である（Arnberg他、1998年、Virology、第227巻、239〜244ページ）が、Ad19aは、Ad8およびAd37とともに、EKCの主要な原因となる。Ad19aとAd37は同じファイバー・タンパク質を持っており（Arnberg他、1998年、Virology、第227巻、239〜244ページ）、生体内で似た親和性を有する。
2．シュードタイピング
アデノウイルス・ベクターをさまざまに改変（例えばウイルスのキャプシド、特にファイバー・タンパク質を改変）して特定の組織および／または特定のタイプの細胞に向かわせることができる。この明細書における改変としては、異種ファイバー・タンパク質および／またはキメラ・ファイバー・タンパク質を用いたウイルス粒子のシュードタイピングなどがある。
非CAR受容体を利用するファイバーは、タイプの異なる多彩な細胞に感染することができる（Shayakhmetov他、2000年、J. Virol.、第74巻、2567〜2584ページ；Seggern他、2000年、J. Virol.、第74巻、354〜362ページ；LawとDavidson、2002年、J. Virol.、第76巻、656〜661ページ；Havenga他、2002年、J. Virol.、第76巻、4612〜4620ページ；Gall他、1996年、J. Virol.、第70巻、2116〜2123ページ；Chillon他、1999年、J. Virol.、第73巻、2537〜2540ページ）ため、アデノウイルス・ベクターを標的に向かわせる手段となる。アデノウイルス・パッケージング細胞系を用いると、ファイバー欠損ウイルスの相互補足性を通じ、実質的に望む任意のファイバー・タンパク質を有するウイルス粒子を作ることができる（von Seggern他、2000年、J. Virology、第74巻、354〜362ページ；von Seggern他、1999年、J. Virology、第73巻、1601〜1608ページ）。この方法（シュードタイピングと呼ばれている）により、試験管内と生体内における親和性の研究に使用できる標的となるウイルス粒子を作り出すことと、通常はAdの増殖に用いられるプロデューサ細胞と結合しないファイバーを持つウイルスの構築と増殖が可能になる。
この明細書に記載したように、シュードタイピングを利用し、サブグループDのアデノウイルスからのファイバーで樹状細胞の感染性を増大させるものを同定することができる。異なる血清型からのファイバー・タンパク質を用いてファイバーなしのアデノウイルス・ベクターをシュードタイピングし、異種ファイバー・タンパク質を持つアデノウイルス粒子を作ることができる。シュードタイピングは、例えばシュードタイピング用ファイバーをコードしている発現プラスミドを含む細胞の中で発現させることによって実現できる。このようなベクターとプラスミドは、この明細書に記載したようにして、あるいは当業者に知られている任意の方法で作ることができる。
したがってこの明細書では、標的に向かわせるための改変ファイバーと、標的に向かわないようにするための改変ファイバーと、そのようなファイバー・タンパク質およびそのファイバー・タンパク質を含むアデノウイルスの製造方法が提供される。アデノウイルスの標的となるこの明細書に示したタイプの細胞の1つが、樹状細胞である。
C．樹状細胞ターゲティング
樹状細胞は、免疫療法の望ましい標的となるだけの生理学的特徴を多数備えている。樹状細胞は抗原を捕えて身体の組織からリンパ様組織へと移す。そこでは樹状細胞が、MHCタンパク質に結合した外来エピトープを提示することによってリンパ器官内の抗原を提示し、体液性免疫応答と細胞性免疫応答を開始させる。樹状細胞は、異なるタイプの病原体（例えばウイルス、細菌、真菌）を識別する能力を持っており、その病原体だけに対する特異的な免疫反応のスイッチを入れる。樹状細胞は抗原提示細胞であり、Tリンパ球を刺激して感染源を攻撃させる。したがって樹状細胞が提示するために異種抗原を送達することは、そのような抗原に対する体液性免疫と細胞性免疫を開始させる手段となる。やはりすでに指摘したことだが、樹状細胞における特定の産物の発現も、例えばアレルギー、自己免疫疾患、炎症応答において起こるような不適切な免疫応答または望ましくない免疫応答を抑制または減少させることができる。
1．樹状細胞
免疫系において多くの重要な生理学的特徴を持つ樹状細胞（DCと略する）は、免疫療法やワクチンを開発するための標的となりうる。樹状細胞は、免疫応答を確立する際に重要な役割を果たす。樹状細胞は、リンパ組織でT細胞が豊富な領域に見いだされ、そこで抗原をT細胞に対して提示して適応免疫応答を促進する（JanewayとTravers、1997年、『免疫生物学：健康と疾患における免疫系』、第3版、カレント・バイオロジー社、ニューヨーク、ニューヨーク州）。
抗原提示細胞としての樹状細胞は、外来性抗原と自己抗原を捕獲し、それを処理してペプチドにし、MHC（主要組織適合性遺伝子複合体）の文脈でそのペプチドをTリンパ球に提示する役割がある。樹状細胞は高度に特化していて効率的なAPCであり、その樹状細胞が開始させる適応免疫の大きさ、量、記憶を制御する（SteinmanとPope、2002年、J. Clin. Invest.、第109巻、1519〜1526ページ）。抗原を提示する樹状細胞によって活性化されるT細胞としては、TヘルパーCD4+細胞（特にTh1と表記される細胞）やCD8+細胞傷害性Tリンパ球（CTL）などがある。活性化されたTh1細胞は、IFN-γを産生し、抗体の増殖と抗原特異的Bリンパ球の産生を誘導する。樹状細胞によって活性化されるCTLは、細胞傷害性顆粒を細胞の中に放出することにより、抗原を提示している細胞（例えばウイルスに感染した細胞）を殺す（例えばSteinmanとPope、2002年、J. Clin. Invest.、第109巻、1519〜1526ページを参照のこと）。
すでに指摘したように、樹状細胞は、抗原を提示するためのMHC分子を高レベルに発現し、その分子を高効率のAPCにする。さらに、樹状細胞は、免疫応答を増大させる上で重要な共刺激分子も高レベルに発現する。樹状細胞は、多彩な免疫刺激性サイトカインも産生し（ScanlanとJager、2001年、Breast Cancer Res.、第3巻、95〜98ページ）、免疫応答に関与して免疫応答を強化するため、ワクチンを開発するための標的として用いられてきた。腫瘍の免疫療法への1つのアプローチとして、樹状細胞を操作して腫瘍抗原を発現させることが研究されてきた。例えば特定の抗原（例えば腫瘍抗原）を発現する遺伝子改変樹状細胞は、ワクチンとして用いることができる。さらに、生体内でそのような細胞を標的とする遺伝子治療を利用し、免疫療法において生体内でAPCを発生させることができる。
樹状細胞は、免疫応答を低下させることもできる。自己免疫、アレルギー、移植拒絶（これらはすべて、免疫応答が制御されていないこと、またはチェックされていないことから生じる）に対するワクチン接種を補助する樹状細胞を開発することができる（Hawiger他、2001年、J. Exp. Med.、第194巻、769〜779ページ；Steinman他、2003年、Annual Rev. Immunol.、第21巻、685〜711ページ）。樹状細胞は、例えば末梢T細胞寛容にとって重要であるように見える（例えばSteinman他、2000年、J. Exp. Med.、第191巻、411〜416ページを参照のこと）。抗原に対する寛容または非応答は、自己免疫を避ける上で非常に重要である。樹状細胞は、末梢リンパ組織における有意な抗原特異的寛容を誘導すること（Hawiger他、2001年、J. Exp. Med.、第194巻、769〜779ページ）と、移植抗原に対する寛容（Fu他、1996年、Transplantation、第62巻、659〜665ページを参照のこと）と接触アレルゲン（Steinbrink他、1997年、J. Immunol.、第159巻、4772〜4780ページを参照のこと）に対する寛容を誘導することができる。
したがって樹状細胞が関係するワクチンと免疫療法は、臨床的に重要な多彩な自己免疫疾患と関連疾患（例えば全身性エリテマトーデス、重症筋無力症、関節リウマチ、インスリン依存性糖尿病、グレーブス病など）の治療、ならびに病原体によって起こるがんや疾患のワクチン接種または治療にとって重要である。
2．樹状細胞療法
抗原遺伝子を樹状細胞に送達するためのさまざまな方法が開発されているが、それらは一般に、細胞を生体外（例えばトランスフェクション）で操作した後、その細胞を輸液で生体に戻す操作を含んでいる。これは複雑でコストがかかり、患者専用の試薬を製造する必要がある。
樹状細胞療法ではアデノウイルスを使用できる。さまざまな血清型のアデノウイルスが特定のタイプの細胞（例えば樹状細胞）に感染する能力の一部は、CARとの相互作用、またはCARとの相互作用の欠如に帰することができる。例えば樹状細胞（DC）への形質導入にAd5を多く必要とすることは、樹状細胞の表面にCARが発現していることで説明できる（Linette他、2000年、J. Immunol.、第164巻、3402〜3412ページ；Tillman他、1999年、J. Immunol.、第162巻、6378〜6383ページ）。アデノウイルスをDCによりよく感染させるのにいくつかの方法が利用されてきた。樹状細胞を標的とするのに、ファイバーのノブと、（DCの表面に発現する）CD40に結合する二重特異性抗体（Ab）とが使用された（Tillman他、1999年、J. Immunol.、第162巻、6378〜6383ページ）。この研究により、DC結合アデノウイルスが効率的に感染できるよう、細胞がαvインテグリンを十分に発現することがわかった。この方法では、ウイルス・ベクターと抗体を作ることと、複合体を精製して臨床的に許容可能な形態にすることが必要とされる。これは、スケール・アップと製造に問題があり、アデノウイルス・ベクターの多くの利点（最も注目すべき点は、製造と精製が簡単で、ベクターが安定であること）を損なう。
したがってこうした制約に打ち勝つため、この明細書では、効率的に樹状細胞を標的とするように改変したアデノウイルス・ベクターが提供される。免疫療法において生体内または生体外でそのような細胞を標的とするため、また樹状細胞を試験管内で研究するため、アデノウイルス・ベクターを用いることができる。
3．アデノウイルス粒子を樹状細胞に向かわせる
多くの研究により、アデノウイルス（Ad）を利用した樹状細胞への送達により抗腫瘍応答が起こる可能性のあることがわかっているが、遺伝子治療で一般に用いられるAdベクターは、樹状細胞の感染能力が非常に低い血清型（Ad5）に基づいている。Adを生体内投与した後、かなり少数の樹状細胞にしか感染しないことが直接明らかにされている（Zhang他、2001年、Mol. Therapy、第3巻、697〜707ページ；Oberholzer他、2002年、J. Immunol.、第168巻、3412〜3418ページ；Jooss他、1998年、J. Virol.、第72巻、4212〜4223ページ）が、この感染が、観察された細胞免疫応答に主として関係しているように思われる（Zhang他、2001年、Mol. Therapy、第3巻、697〜707ページ；Jooss他、1998年、J. Virol.、第72巻、4212〜4223ページ）。Ad5は樹状細胞にあまり感染しない（Dietz他、1998年、Blood、第91巻、393〜398ページ；Wan他、1997年、Human Gene Ther.、第8巻、1355〜1363ページ；Jonuleit他、2000年、Gene Therapy、第7巻、249〜254ページ；Linette他、2000年、J. Immunol.、第164巻、3402〜3412ページ；Tillman他、1999年、J. Immunol.、第162巻、6378〜6383ページ）ため、何度も感染させる必要がある。
たいていのテストは、サイトカイン（通常はGM-CSFとIL-4）とともにインキュベートした末梢血または骨髄に由来する樹状細胞の初代培養物を用いて行なわれてきた（『免疫学における最新プロトコル』（1998年、ジョン・ワイリー＆サンズ社、フィラデルフィア）の3.7.1〜3.7.15、Inaba他、「樹状細胞の単離」）。樹状細胞を生体外で感染させた後、再び輸液すると、効果的な抗腫瘍応答が発生することが見いだされている（Wan他、1997年、Human Gene Ther.、第8巻、1355〜1363ページ；Linette他、2000年、J. Immunol.、第164巻、3402〜3412ページ；Inoue他、1999年、Innunol. Lett.、第70巻、77〜81ページ；Sonderbye他、1998年、Exp. Clin. Immunogenet.、第15巻、100〜111ページ；Ranieri他、1999年、J. Virol.、第73巻、10416〜10425ページ；Ribas他、1997年、Cancer res.、第57巻、2865〜2869ページ；Miller他、2000年、Human Gene Ther.、第11巻、53〜65ページ）。生体外感染は、ワクチン接種や免疫療法の理想的な手段ではない。
さらに、サブグループBのウイルスAd16とAd35からのファイバー・タンパク質を有する組み換えアデノウイルスは、ヒト樹状細胞への感染能力が増大していることが見いだされている（Havenga他、2002年、J. Virol.、第76巻、4612〜4620ページ；Rea他、2001年、J. Immunol.、第166巻、5236〜5244ページ）。しかしサブグループBのウイルスは、親和性の幅が広いように見える。そのウイルスは、例えば多彩な培養細胞系と、さまざまなタイプの組織からの一次細胞とを形質転換する（Havenga他、2002年、J. Virol.、第76巻、4612〜4620ページ）。これは、そのように広い親和性であることの証拠である。サブグループBで明らかになった細胞特異性のこのような明らかな欠如（広い親和性）は、AdサブグループBのファイバーを有するシュードタイピングAd5ウイルスまたはAd2ウイルスが有利でないことを示している。
a．ファイバーの置換
この明細書では、文献における報告とは異なり、サブグループDのウイルスが樹状細胞を標的にできることを示す。サブグループDのウイルスは、サブグループBのウイルスよりも狭い親和性を示す。この明細書では、CARを使用しないある種のAd血清型（特にAdサブグループDのウイルス）からのファイバーが、樹状細胞上の受容体を効率的に標的とすることを示す。
改変したアデノウイルス粒子は、樹状細胞親和性ファイバー（例えばサブグループDのファイバー）またはその一部でAdサブグループC（または異種ファイバー（例えばAd5またはAd2のファイバー）を有する他のAdサブグループ（BやCなど））を置換することにより、標的に向かわないウイルス粒子（CAR、HSPへの結合が減少）と再び標的（樹状細胞）に向かうウイルス粒子を作ることによって得られる。
ファイバーの任意の部分をサブグループDのファイバーの一部で置換できるが、そのためには、サブグループDのファイバーのその部分が、樹状細胞を標的とすることと、そのファイバーがウイルスのキャプシドに組み込まれることが条件になる。一実施態様では、ファイバー・タンパク質の全体をサブグループDのファイバーで置換する。別の一実施態様では、N末端を除くファイバー全体を置換する。例えば元のファイバーのN末端の少なくとも約16個、17個またはそれ以上のアミノ酸、多い場合には約60個、70個、80個、90個、100個またはそれ以上のアミノ酸を残したままにし、そのファイバーが元の粒子に組み込まれやすくする。
この明細書で提示する改変アデノウイルスには、アデノウイルス粒子（特にサブグループCの粒子）上で発現するサブグループBとD（Ad19p、Ad37、Ad30、Ad8、Ad9、Ad10、Ad13、Ad15、Ad17、Ad19、Ad20、Ad16、Ad35と、アデノウイルス血清型22〜30、32、33、36〜39、42〜49）からのファイバー・タンパク質を有するアデノウイルスが含まれる。この明細書で提供される改変キャプシド・タンパク質としては、配列ID番号32、34、36、38、40いずれかのアミノ酸配列を含むファイバー；または配列ID番号32、34、36、38、40いずれかのアミノ酸配列と60％、70％、80％、90％、95％またはそれ以上が一致するアミノ酸配列を含むファイバー；または配列ID番号32、34、36、38、40いずれかのアミノ酸配列をコードしているヌクレオチド配列と非常に厳しい条件下で少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％にわたってハイブリダイズするヌクレオチド配列によってコードされているアミノ酸配列を含むファイバーを含有するタンパク質がある。ファイバー・タンパク質を例えばこの明細書に記載したようにしてN末端を置換することにより改変し、異なるサブグループ（特にサブグループC）に容易に組み込めるようにすることができる。このような改変は、一般に、元のファイバーのN末端からの連続した少なくとも16個または17個のアミノ酸〜約60個、61個またはそれ以上のアミノ酸を含めることであり、その結果として樹状細胞を標的とするようになる。
一実施態様では、細胞をパッケージングする方法を利用し、サブグループB（Ad3、Ad16、Ad35）、サブグループC（Ad5）、サブグループD（Ad19p、Ad30、Ad37）のAdからのファイバー・タンパク質を含むファイバー欠損Ad5ベクターの粒子を作る。Adファイバーのヌクレオチド配列とアミノ酸配列は、配列ID番号41〜44（キメラ・ファイバーの具体例）と31〜40（N末端の置換によって改変できる野生型ファイバーの具体例）に示してある。得られる粒子は、樹状細胞に対する親和性に関して有意差を示す。そのことは、その粒子が試験管内でネズミ類の骨髄に由来する一次DCに感染する能力からわかる。さらに、その粒子はサブグループDの粒子で効率的にシュードタイピングされ、樹状細胞を特異的に標的とする。この明細書に記載したように（例えば実施例を参照のこと）、サブグループBのファイバーは、サブグループDのファイバーが結合する受容体とは異なってより広く発現している受容体と結合しているように見える。
Ad5ファイバーを有する粒子は樹状細胞にあまり感染しないが、サブグループDのファイバー（例えばAd19p、Ad37）またはその一部でシュードタイピングしたベクター粒子は特に効果的であった。したがってサブグループDのファイバーの全体または一部を発現するように改変したアデノウイルス粒子（特にサブグループCの粒子）は、効率的に樹状細胞を標的とし、異種核酸を生体内または生体外でそのような細胞に送達するのに用いることができる。さらに、そのような粒子は、改変していないサブグループBのウイルス粒子と比較すると、HSPを発現している細胞（例えば肝細胞）やCARを発現している細胞への結合が減少している。
b．効率的ターゲティング
この明細書では、樹状細胞を標的とする、親和性が限定された組み換えアデノウイルスが提供される。組み換えアデノウイルスは、遺伝子治療および／またはワクチン接種に用いることができる。生体内（例えば全身）に投与すること、または樹状細胞が豊富な細胞または樹状細胞を含む細胞と接触させることによる生体外投与を行なうことができる。
この明細書で提供される組み換えアデノウイルスは、有利な多くの特性を有する。この明細書で提供される粒子は、Ad5粒子、またはサブグループBのファイバーを発現するAd5粒子よりも効率的に樹状細胞に感染するため、生体内に直接投与した後の免疫原性がより大きい。この明細書で提供する効率的に樹状細胞を標的とするベクターにより、生体外送達だけでなく直接的生体内投与が可能になるため、細胞の取り出し、生体外での細胞培養、輸液が必要なくなる。
4．追加の改変
この明細書で提供する改変アデノウイルスは、樹状細胞に対する親和性が向上しているだけでなく、肝細胞で発現するHSPへの結合も減っている。以下に説明する方法または当業者によく知られている方法のいずれかでキャプシドを突然変異させることによって改変粒子をさらに改変し、CAR、HSP、αvインテグリン、あるいは他の元からある受容体を標的としないようにすることができる。
ファイバー・タンパク質にRGDペプチドを組み込むことにより、この明細書で提供するベクターを改変することもできる。RGDペプチドをファイバー・タンパク質に組み込むと、ネズミ類のDC系の感染が約2倍になることがわかっている（例えばOkada他、Cancer Res.、第61巻、7913〜7919ページ、2001年を参照のこと）。次に、その細胞系／Ad系を用いてマウス異種移植腫瘍モデルにおける抗腫瘍応答を評価した。野生型ベクター粒子と改変ベクター粒子を同数用いて生体外でDCに感染させた後、マウスに再び輸液すると、改変ベクターのほうが、モデル抗原に対するはるかに大きな免疫応答を促進することができた。
治療用産物を提供する異種核酸を組み込むことにより、この明細書で提供する粒子をさらに改変し、ワクチンとして投与するための製剤にすることもできる。アデノウイルス粒子とベクターは、異種核酸を樹状細胞に送達し、樹状細胞による抗原提示やサイトカインの産生を行なわせたり、樹状細胞の他の機能を変化させたりすることができる。
D．アデノウイルス・ベクターを標的に向かわせない
ウイルスのキャプシドを改変し、アデノウイルスと、ウイルスのキャプシドの天然の受容体の間の相互作用をなくすことについて以下に説明する。特に、ファイバーを改変した結果としてアデノウイルスとHSPの相互作用がなくなることについて説明する。ファイバーの改変と他のキャプシド・タンパク質（例えば他のファイバーの改変および／またはペントンの改変および／またはヘキソンの改変）を組み合わせ、ウイルス粒子の表面で発現したときにウイルスと天然の受容体の間の相互作用を完全になくすことができる。この改変は、三量体の形成や、核へのファイバーの輸送を妨げてはならない。HSPに結合する血清型のファイバー全体を、HSPと結合しないファイバーの全体または一部で置換することができる。そのような場合には、一般に、置換するファイバーのN末端を改変して置換されたファイバーと似ているか一致するようにし、ウイルス粒子への組み込みを改善する。N末端に必要なアミノ酸の数は経験的に決めることができ、一般には約5〜20個、10〜17個、10〜20個、10〜50個、10〜70個、10〜100個であるが、場合によってはより多くのアミノ酸を含めることができる。厳密な数は、コードしている核酸に存在する好ましい制限部位と、他の考慮事項によって決まる可能性がある。一般に、少なくとも約5〜20個（例えば16、17、18個）のアミノ酸が必要とされる。
アデノウイルスのファイバー・タンパク質は、アデノウイルスの親和性を決める主要な要素である（Gall他、1996年、J. Virol.、第70巻、2116〜2123ページ；Stevenson他、1995年、J. Virol.、第69巻、2850〜2857ページ）。この分野におけるドグマは、CARおよびインテグリンへの結合を通じてアデノウイルスの侵入が起こるというものであった。そのことが、公開されているデータで強調されている（Einfeld他、2001年、J. Virology、第75巻、11284〜11291ページ）。公開されている経路は、生体内での作用に関して中心的なものではない。生体内の肝細胞への主要な侵入経路には、ファイバーのシャフトを媒介としたヘアピン状の硫酸プロテオグリカンの結合を通じたメカニズムが関与する（公開アメリカ合衆国出願第2004-0002060号と第2003-0215948号を参照のこと）。
この結合がなくなると、HSPの結合を通じた（例えば肝細胞への）侵入がなくなる。アデノウイルスのファイバーのシャフトを改変してウイルスとHSPの相互作用をなくすことに関しては、後出の実施例と、公開アメリカ合衆国出願第2004-0002060号と第2003-0215948号に記載されている。したがって、適切に設計されたファイバー・タンパク質により、生体内でアデノウイルスを標的に向かわなくすることを効率的に実現できる。野生型がHSPと相互作用するあらゆるアデノウイルスに関し、この明細書に記載したような適切な改変を行なうことができる。アデノウイルス・ベクターがHSPと相互作用する能力は、ファイバー・タンパク質または少なくともその結合部を、HSPと結合しないファイバー（またはその対応部）で置換してHSPへの結合を減らすかなくすことによって変化する。HSPへの結合の減少または消失は、生体内で、得られるウイルス粒子を投与した動物の肝細胞への形質導入が非改変粒子を投与した場合と比べて減っているか消えている状態として出現する可能性がある。改変としては、挿入、欠失、個々のアミノ酸の突然変異や、ファイバーのシャフト構造が変化した結果、改変ファイバー・タンパク質のHSPへの結合が、野生型ファイバー・タンパク質のHSPへの結合と比べて消えるような他の突然変異などがある。
アデノウイルスのファイバー・タンパク質は、HSPと相互作用するアミノ酸が1個以上突然変異することによって変化する。例えば改変ファイバー・タンパク質のHSP結合モチーフは、細胞表面のHSPともはや相互作用しないため、ウイルスとHSPの相互作用が消える。例えばアデノウイルスのファイバーは、サブグループCのアデノウイルスからのものである。ファイバーのシャフトを突然変異させることによってHSPへの結合をなくすか減らし、HSP結合モチーフ（例えばAd5ファイバー（配列ID番号2）のアミノ酸残基91〜94に位置するKKTK配列（配列ID番号45））がHSPと相互作用する能力を変化させることができる。ファイバー・タンパク質は、当業者に知られている化学的な方法や生物学的な方法（例えばファイバーをコードしている核酸の部位指定突然変異誘発）、またはこの明細書に記載した他の方法で変化させる。
この実施態様の別の側面では、ファイバーがHSPと相互作用する能力は、野生型ファイバーのシャフトを、HSPと相互作用しないアデノウイルスのファイバー・シャフトまたはその一部で置換してキメラ・ファイバー・タンパク質を作ることによって変化させる。その部分は、HSPとの相互作用を減らすかなくすのに十分なものである。HSPと相互作用しないファイバー・シャフトを有するアデノウイルスの具体例としては、（a）HSPと相互作用しないサブグループBのアデノウイルス（例えばAd3、Ad7、Ad11、Ad16、Ad21、Ad34、Ad35）、（b）サブグループFのアデノウイルス（例えばAd40とAd41）で、特に短いファイバー、（c）サブグループDのアデノウイルス（例えばAd19p、Ad30、Ad37、Ad46）などがある。
別の一実施態様では、アデノウイルスのファイバーのシャフト改変および／またはファイバーのシュードタイピングによってHSPとの相互作用をなくすことと、アデノウイルスのファイバーのノブ改変によってCARとの相互作用をなくすことの組み合わせが提供される。アデノウイルスのファイバーの適切な改変としては、後出の実施例に記載したファイバー・ノブの改変や、当業者に知られている改変（公開アメリカ合衆国特許出願第2004-0002060号と第2003-0215948号を参照のこと；2001年5月30日に出願され、アメリカ合衆国出願公開第20020137213号として公開されたアメリカ合衆国特許出願第09/870,203号と、WO 01/92299として公開された国際特許出願PCT/EP01/06286も参照のこと）などが挙げられる。ファイバーの改変としては、サブグループC（例えばAd2またはAd5）、サブグループD（例えばAd19p、Ad30、Ad37）、サブグループEからのアデノウイルスの野生型ファイバー・タンパク質のCDループ、またはサブグループFからのアデノウイルスの長い野生型ファイバーのCDループに含まれる少なくとも1つのアミノ酸の突然変異が挙げられる。その改変により、ファイバー・タンパク質がCARに結合する能力が低下するか、実質的になくなる。CARと相互作用しないファイバー・タンパク質は、当業者に知られている化学的な方法や生物学的な方法、またはこの明細書に記載した方法で変化させたものである。
あるいはアデノウイルスのファイバーの改変は、野生型ファイバーのノブを、CARと相互作用しないアデノウイルスのファイバーのノブで置換することによってなされる。ファイバー・タンパク質は、HSPとも相互作用しないものを選択する。CARと相互作用しないファイバーのノブを有するアデノウイルスの具体例としては、（a）サブグループBのアデノウイルス（例えばAd3、Ad7、Ad11、Ad16、Ad21、Ad34、Ad35）；（b）サブグループFのアデノウイルス（例えばAd40、Ad41）、特に短いファイバーがある。
別の一実施態様では、アデノウイルスのファイバーのシャフト改変および／またはファイバーのシュードタイピングによってHSPとの相互作用をなくすことと、ペントンの改変によってウイルスとαvインテグリンの相互作用をなくすことの組み合わせが提供される。アデノウイルスのペントンの適切な改変としては、以下の実施例に記載したファイバーのノブ改変や、当業者によく知られているペントンの改変（例えばアメリカ合衆国特許第5,731,190号を参照のこと；Einfeld他、2001年、J. Virology、第75巻、11284〜11291ページ；Bai他、1993年、J. Virology、第67巻、5198〜5205ページも参照のこと）がある。
例えばペントンとαvインテグリンの相互作用は、αvインテグリンとの相互作用に必要なペントン中のRGDペプチド・モチーフを、αvインテグリンと相互作用しない別のトリペプチドで置換することによって消失させる（減少させる、またはなくす）ことができる。αvインテグリンと相互作用しないペントン・タンパク質は、当業者に知られている化学的方法や生物学的方法で改変したものである（例えばアメリカ合衆国特許第6,731,190号や、この明細書に記載してある方法）。
アデノウイルスのファイバーのシャフト改変またはファイバーのシュードタイピングによってHSPとの相互作用をなくすことと、アデノウイルスのファイバーのノブ改変によってウイルスとCARの相互作用をなくすことならびにペントンの改変によってウイルスとαvインテグリンの相互作用をなくすことの組み合わせが提供される。この改変は上に説明したものであり、当業者に知られている化学的方法や生物学的方法、またはこの明細書に記載した方法で実現される。
HSPとの相互作用がないか減少するように改変したファイバーと、他の受容体や細胞表面タンパク質との相互作用が変化するように改変したファイバーの調製についても、後出の実施例に記載してある。具体的な改変ファイバーの核酸配列および／またはアミノ酸配列を配列ID番号3〜30に示してあり、その構造は以下のようになっている。
配列ID番号3と4は、5FKO1と名づけた改変ファイバーのコード・ヌクレオチド配列とアミノ酸配列を示している。5Fはアデノウイルス5のファイバーを表わし、KO1は、この明細書に記載したCAR相互作用部位の突然変異の一例である。
配列ID番号5と6は、5FKO1RGDと名づけた改変されたファイバーのコード・ヌクレオチド配列とアミノ酸配列を示している。これは、再び標的に向かわせるRGDリガンドをさらに含んでいる。
配列ID番号7と8は、5FKO12と名づけた改変ファイバーのコード・ヌクレオチド配列とアミノ酸配列を示している。5Fはアデノウイルス5のファイバーを表わし、KO12は、この明細書に記載したCAR相互作用部位の突然変異の別の一例である。
配列ID番号9と10は、5FS*nucと名づけた改変ファイバーのコード・ヌクレオチド配列とアミノ酸配列を示している。5Fはアデノウイルス5ファイバーを表わし、S*は、シャフトの突然変異でHSPへの結合を変化させるものの一例である。
配列ID番号11と12は、5FS*RGDnucと名づけた改変ファイバーのコード・ヌクレオチド配列とアミノ酸配列を示している。これは、RGDリガンドをさらに含んでいる。
配列ID番号13と14は、5FKO1S*と名づけた改変ファイバーのコード・ヌクレオチド配列とアミノ酸配列を示している。これは、KO1突然変異とS*突然変異を含んでいる。
配列ID番号15と16は、5FKO1S*RGDと名づけた改変ファイバーのコード・ヌクレオチド配列とアミノ酸配列を示している。これは、RGDリガンドをさらに含んでいる。
配列ID番号17と18は、Ad35ファイバーのコード・ヌクレオチド配列とアミノ酸配列を示している。
配列ID番号19と20は、35FRGDと名づけた改変ファイバーのコード・ヌクレオチド配列とアミノ酸配列を示している。これは、RGDリガンドを有する35Fファイバーである。
配列ID番号21と22は、Ad41短ファイバーのコード・ヌクレオチド配列とアミノ酸配列を示している。
配列ID番号23と24は、41sFRGDと名づけた改変ファイバーのコード・ヌクレオチド配列とアミノ酸配列を示している。これは、RGDリガンドを有する41F短ファイバーである。
配列ID番号25と26は、Ad5ペントンのコード・ヌクレオチド配列とアミノ酸配列を示している。
配列ID番号27と28は、5TS35Hと名づけた改変ファイバーのコード・ヌクレオチド配列とアミノ酸配列を示している。これは、Ad5ファイバーの尾領域とシャフト領域（5TS；アミノ酸1〜403）がAd35ファイバーの頭部領域（35H；アミノ酸137〜323）に接続されて5TS35Hキメラを形成しているキメラ・ファイバーである。
配列ID番号29と30は、35TS5Hと名づけた改変ファイバーのコード・ヌクレオチド配列とアミノ酸配列を示している。これは、Ad35ファイバーの尾領域とシャフト領域（35TS；アミノ酸1〜136）がAd5ファイバーの頭部領域（5H；アミノ酸404〜581）に接続されて35TS5Hキメラを形成しているキメラ・ファイバーである。
改変ファイバーは、ファイバー・タンパク質を改変し、場合によっては別のタンパク質も改変することにより、ウイルス粒子の表面に提示される。これは、改変キャプシド・タンパク質を発現するとともに改変ファイバーを有する粒子を作り出すアデノウイルス・ベクターを調製することによって、あるいは、アデノウイルス・ベクター（特に適切なパッケージ系に1つ以上のキャプシド・タンパク質をコードしていないベクター）をパッケージングすることによって実現できる。したがって以下に詳しく説明するように、HSPと結合しない改変ファイバーを有するアデノウイルス・ベクターおよびウイルス粒子が提供される。
標的に向かわなくなったファイバーを再び標的に向かわせる
上記のように標的に向かわなくなったウイルス粒子は、キャプシドに適切なターゲティング・リガンドを含めることにより、選択された細胞および／または組織を再び標的にすることができる。リガンドは、任意のキャプシド・タンパク質（例えばファイバー、ヘキソン、ペントン）に含めることができる。ターゲティング・リガンドをコードしている核酸を含めるための遺伝子座は、いろいろなアデノウイルスの血清型について当業者に知られている。必要であれば、適切な遺伝子座と他のパラメータを経験的に決めることができる。
リガンドは、キャプシド・タンパク質をコードしている核酸の中にコード配列を含めることによって融合体として作ること、あるいはキャプシドに（例えばイオン相互作用、共有相互作用、または他の相互作用を通じて）化学的に共役させるか、（例えばAb-リガンド融合体（ただしAbはキャプシド・タンパク質と結合する）；あるいはジスルフィド結合または他の架橋部や化学物質によって）キャプシドに結合させることによって作ることができる。
したがって、例えば改変ファイバーの核酸は、ターゲティング・リガンドをコードしている核酸配列を含むことができるため、キャプシドにターゲティング・リガンドを含むウイルス粒子を作ることができる。ターゲティング・リガンドと、そのようなリガンドをウイルスのキャプシドに入れる方法は周知である。例えばファイバー・タンパク質へのターゲティング・リガンドの組み込みは、アメリカ合衆国特許第5,543,328号、第5,756,086号と、アメリカ合衆国出願公開第2002137213号として公開されたアメリカ合衆国特許出願シリアル番号第09/870,203号、WO 01/92299として公開された国際特許出願PCT/EP01/06286に記載されている。アデノウイルスのさまざまな血清型と菌株について、ターゲティング・リガンドを挿入する遺伝子座を経験的に決めることができる。血清型や菌株が異なると、そのような遺伝子座は異なる可能性がある。
アデノウイルスのファイバーは三量体構造を有するため、リガンドは三量体構造を有するものを選択または指定することにより、リガンドの3つの分子までが成熟したファイバーに存在できるようにする。このようなリガンドは、従来技術で知られている方法を利用してファイバー・タンパク質に組み込むことができる（例えばアメリカ合衆国特許第5,756,086号を参照のこと）。ターゲティング・リガンドをファイバーではなくペントン・タンパク質またはヘキソン・タンパク質に組み込むことができる。ペントンへのターゲティング・リガンドの組み込み（例えばアメリカ合衆国特許第5,731,190号と第5,965,431号を参照のこと）とヘキソンへのターゲティング・リガンドの組み込み（例えばアメリカ合衆国特許第5,965,541号を参照のこと）は公知である。
一実施態様では、リガンドは、この明細書に記載したようにして突然変異させたファイバー・タンパク質に含まれる。ターゲティング・リガンドは、例えばファイバー・タンパク質のHIループの中に入れることができる。HIループにフィットし、しかも機能的ウイルスになるあらゆるリガンドを、この明細書では考える。そのようなリガンドの長さは、アミノ酸80〜100個またはそれ以上でもよい（例えばBelousova他、2002年、J. Viol.、第76巻、8621〜8631ページを参照のこと）。このようなリガンドは、従来技術で知られている方法で付加される（例えば公開された国際特許出願WO 99/39734と、アメリカ合衆国特許出願第09/482,682号を参照のこと）。他のリガンドは、当業者に知られている方法を通じて発見することができる。そうした方法の具体例として、ファージ提示ライブラリや、他のタイプのライブラリのスクリーニングなどがある。そのようなリガンドとしては、樹状細胞を標的とする任意のリガンドが挙げられる。
ターゲティング・リガンドとしては、アデノウイルス粒子を望むタイプの細胞および／または組織（例えば樹状細胞）に選択的に向かわせる任意の化合物の一部が挙げられる。そのようなリガンドのカテゴリーとして、ペプチド、ポリペプチド、一本鎖抗体、多量体タンパク質などがある。特異的リガンドとしては、TNFスーパーファミリーのリガンド（例えば腫瘍壊死因子（TNF）であるTNFα、TNFβ、リンホトキシン（LT）であるLT-α、LT-β、Fas抗原に結合するFasリガンド；Bリンパ球のCD40受容体と結合するCD40リガンド；ホジキン・リンパ腫の腫瘍細胞のCD30受容体と結合するCD30リガンド；CD27リガンド、NGFリガンド、OX-40リガンド；腫瘍細胞、活性化したT細胞、神経組織細胞の表面にあるトランスフェリン受容体と結合するトランスフェリン；肝細胞のLDL受容体と結合するアポB；肝細胞のLRP受容体と結合するα2-マクログロブリン；肝臓のアシアロ糖タンパク質と結合するα1酸性糖タンパク質；マクロファージのマンノース受容体と結合するマンノース含有ペプチド；活性化した内皮細胞のELAM-1受容体と結合するシアリル-ルイス-X抗原含有ペプチド；造血前駆細胞のCD34受容体と結合するCD34リガンド；リンパ球のLFA-1（CD11b/CD18）受容体またはマクロファージのMac-1（CD11a/CD18）受容体と結合するICAM-1；脾臓と骨髄のマクロファージのc-fmsと結合するM-CSF；肝細胞の肝プラスモジウム・ファルシパルム受容体と結合するサーカムスポロゾイト・タンパク質；活性化した内皮細胞のVCAM-1受容体と結合するVLA-4；ヘルパーT細胞のCD4受容体と結合するHIV gp120とクラスII MHC抗原；アポリポタンパク質E（アポE）分子のLDL受容体結合領域；CSF受容体と結合するコロニー刺激因子（CSF）；IGF-I受容体、IGF-II受容体とそれぞれ結合するIGF-I、IGF-IIなどのインスリン様増殖因子；それぞれインターロイキン1〜14受容体と結合するインターロイキン1〜14；免疫グロブリンのFv抗原結合ドメイン；ゼラチナーゼ（MMP）インヒビター；ボンベシン、ガストリン放出ペプチド；サブスタンスP；ソマトスタチン；黄体ホルモン放出ホルモン（LHRH）；血管作動性ペプチド（VIP）；ガストリン；メラノサイト刺激ホルモン（MSH）；サイクリックRGBペプチドや、他のあらゆるリガンドまたは細胞表面タンパク質結合（または標的）分子などがある。このようなリガンドは、サブグループDのアデノウイルスのファイバー（例えばAd19p、Ad30、Ad37のファイバー）でシュードタイピングしたAd5粒子とともに用いるとうまくいく。
E．核酸、アデノウイルス・ベクター、その核酸を含む細胞、そのベクターを含む細胞
改変（キメラおよび／または異種）キャプシド・タンパク質をコードしているポリヌクレオチドと、この明細書で提供する改変キャプシド・タンパク質を発現するアデノウイルスを調製するためのベクターをコードしているポリヌクレオチドも提供される。アデノウイルスの異なる多くの血清型からの野生型アデノウイルス・タンパク質の配列は従来技術において周知であり、この明細書に記載したようにして、あるいは適切な方法で変化させる。
この明細書で提供するポリヌクレオチドを含むベクターも提供される。そのようなベクターとしては、アデノウイルスのゲノムやプラスミドの一部または全体が挙げられる。このようなベクターは、当業者に知られている方法やこの明細書に示した方法で構成する。ファイバー・タンパク質の全体または一部を、より効率的に樹状細胞に向かう別の血清型のアデノウイルスからのファイバー・タンパク質またはその適切な一部で置換することによって改変したアデノウイルス・ベクターも提供される。樹状細胞を標的とするアデノウイルスは、明細書に記載した方法を用いて同定できる。次に、そのアデノウイルスのファイバー・コード遺伝子を用いてウイルス（例えばAd5またはAd2）をシュードタイピングし、異種ファイバーまたはキメラ・ファイバーを有するアデノウイルスの感染と遺伝子送達を検出することができる。この明細書で提供されるアデノウイルス・ベクターとしては、ファイバーのノブと、ファイバーのシャフト・ドメインの一部または全体をコードしている核酸が、サブグループDのアデノウイルス（Ad19p、Ad30、Ad37）からのファイバーまたはその適切な一部をコードしている核酸で置換されたサブグループC（例えばAd2、Ad5）のアデノウイルス・ベクターがある。
したがってアデノウイルスのファイバーの改変または置換は、ファイバー・タンパク質の全体または一部を、樹状細胞上の受容体とより効率的に結合するアデノウイルスのファイバー・タンパク質で置換することによって実現できる。一般に異種アデノウイルスのファイバーは、サブグループDのアデノウイルス（Ad19p、Ad30、Ad37）に由来する。置換されたファイバーのノブを有するサブグループC（Ad2、Ad5）のアデノウイルス・ベクターは、従来技術でよく知られている方法やこの明細書に記載した方法を利用して調製する。
特に、この明細書では、樹状細胞を標的とする具体的な異種ファイバーおよび／または改変ファイバーの核酸配列および／またはアミノ酸配列を配列ID番号31〜44に示してあり、それは以下の通りである。
配列ID番号31と32は、Ad37ファイバーのコード・ヌクレオチド配列とアミノ酸配列を示している。
配列ID番号33と34は、Ad19pファイバーのコード・ヌクレオチド配列とアミノ酸配列を示している。
配列ID番号35と36は、Ad30ファイバーのコード・ヌクレオチド配列とアミノ酸配列を示している。
配列ID番号37と38は、Ad16ファイバーのコード・ヌクレオチド配列とアミノ酸配列を示している。
配列ID番号39と40は、Ad35ファイバーのコード・ヌクレオチド配列とアミノ酸配列を示している。
配列ID番号41と42は、Ad5/Ad16キメラ・ファイバーのコード・ヌクレオチド配列とアミノ酸配列を示している。このキメラ・ファイバーは、Ad5からのN末端の17個のアミノ酸を含んでおり、配列の残りはAd16に由来する。
配列ID番号43と44は、Ad5/Ad35キメラ・ファイバーのコード・ヌクレオチド配列とアミノ酸配列を示している。このキメラ・ファイバーは、Ad5からのN末端の17個のアミノ酸を含んでおり、配列の残りはAd35に由来する。
1．ウイルス粒子の調製
この明細書で提供するウイルスを作るのに用いるパッケージング細胞は、キャプシド（すなわちファイバー、ペントン、ヘキソン）タンパク質をコードしている核酸を含んでいる。このような核酸を一般にプラスミドの一部として細胞にトランスフェクトすること、またはこのような核酸をウイルス・ベクターを用いて細胞に感染させることができる。核酸は細胞のゲノムに安定に組み込むことができるため、安定な細胞系が得られる。あるいは異種キャプシド・タンパク質または突然変異したキャプシド・タンパク質をコードしている核酸をゲノムから取り出すことができる。この場合には、一時的補足細胞を利用する。
パッケージングするアデノウイルスのゲノムは、当業者に知られている方法で補足細胞に移す、その方法としては、アデノウイルスのトランスフェクションまたは感染がある。突然変異したファイバー・タンパク質または異種ファイバー・タンパク質をコードしている核酸は、パッケージング細胞ではなくこのゲノムに存在することができる。
パッケージングするゲノム中の核酸が突然変異したファイバー・タンパク質または異種ファイバー・タンパク質をコードしている場合、パッケージング細胞がファイバー・タンパク質もコードしていると望ましいことがある。そのようなタンパク質は、感染粒子の成熟とパッケージングを助けることができる。そのタンパク質は、野生型ファイバー・タンパク質でもよいし、ペプトン・ベース・タンパク質に付着できないように改変されているファイバー・タンパク質でもよい。このタンパク質は、例えばそのファイバーが含まれているプロデューサ細胞で利用されてパッケージング機能を果たし、ベクターは完全長ファイバーをコードする。
パッケージング細胞は、望むウイルス粒子の産生を可能にする条件下で培養する。ウイルス粒子は、標準的な方法で回収する。この明細書で提供するアデノウイルス粒子の製造法の一例は次の通りである。標準的な方法を利用し、突然変異したキャプシド・タンパク質または異種キャプシド・タンパク質をコードしている核酸を、アデノウイルス・シャトル・プラスミドの中で作る。このプラスミドは、ウイルスの右端、特にE3領域の末端から右側ITRまでを含んでいる。このプラスミドを、アデノウイルスのゲノムの残部でE1領域がなく、ときにはE2領域もない部分を含むとともに、対応する相同領域も含むプラスミドと同時に大腸菌株（例えばよく知られている大腸菌株BJ5183（例えばDegryse、1996年、Gene、第170巻、45〜50ページを参照のこと））のコンピテント細胞にトランスフェクトする。2つのプラスミドの間の相同的組み換えにより、アデノウイルスのゲノム全体をコードしている完全長プラスミドが得られる。
次に、この完全長アデノウイルス・ベクター・ゲノム・プラスミドを補足細胞系にトランスフェクトする。このトランスフェクションは、アデノウイルス粒子をプロデューサ細胞に入らせる試薬の存在下で行なうことができる。そのような試薬としては、この明細書に記載したようなポリカチオン試薬や二官能性試薬などがある。それは、例えば、アデノウイルスE1遺伝子を含むPER.C6細胞系の細胞（例えばオランダのクルーセル社からのPER.C6が利用できる；PER.C6は、ECACC登録番号96022940として寄託されている；Fallaux他、1998年、Hum. Gene Ther.、第9巻、1909〜1917ページも参照のこと；アメリカ合衆国特許第5,994,128号も参照のこと）またはAE1-2a細胞（Gorziglia他、1996年、J. Virology、第70巻、4173〜4178ページ；von Seggern他、1998年、J. Gen. Virol.、第79巻、1461〜1468ページを参照のこと）である。
AE1-2a細胞は、プラスミドpGRE5-2.E1（GRE5-E1-SV40-Hygro構造体とも呼ばれ、配列ID番号47に示してある）とpMNeoE2a-3.1（MMTV-E2a-SV40-Neo構造体とも呼ばれ、配列ID番号48に示してある）の染色体が挿入されたA549肺癌系（ATCC#CCL185）の誘導体である。なおそれぞれのプラスミドは、アデノウイルスのE1とE2aの機能を補足する。
補足細胞の別の具体例は633細胞系（von Seggern他、2000年、J. Virology、第74巻、354〜362ページを参照のこと）である。この細胞系はAE1-2a細胞に由来し、アデノウイルス血清型5の野生型ファイバー・タンパク質を安定に発現する。細胞系が633細胞系である場合には、アデノウイルス・ベクターの最終継代培養は、野生型Ad5ファイバーを発現しない別の補足細胞系（例えばPER.C6）で行なう。
トランスフェクションの済んだ補足細胞は、標準的な細胞培養条件下に維持する。アデノウイルス・プラスミドは、組み換えにより、パッケージされるアデノウイルス・ゲノムを形成する。粒子は感染性であるが、ゲノムには少なくともE1遺伝子が欠けているので複製能力がない。633細胞を用いる場合には、粒子は野生型のファイバー・タンパク質と、突然変異したファイバー・タンパク質または異種ファイバー・タンパク質とを含んでいる。粒子は標準的な方法で粗ウイルス・ライセートから回収し、増幅し、精製する。
回収した粒子は、PER.C6細胞またはAE1-2a細胞に感染させるのに使用できる。そうすることにより、キャプシドに望む突然変異ファイバーだけが含まれる粒子を回収することができる。この二段階の手続きにより、この明細書で提供する高力価のアデノウイルス粒子のバッチが得られる。アデノウイルス粒子は、複製能力を持っている場合もあれば、持っていない場合もある。
一実施態様では、粒子は所定の標的組織の中で選択的に複製されるが、他の細胞や組織の中では複製能力がない。特別な一実施態様では、アデノウイルス粒子は異常に増殖している組織（例えば固形腫瘍やそれ以外の新生物）で複製される。条件付き複製がなされるアデノウイルスでは、複製に不可欠な遺伝子を、細胞または組織に特異的な異種プロモータの制御下に置く。例えばE1a遺伝子を腫瘍細胞において活性なプロモータの制御下に置き、腫瘍溶解性アデノウイルスまたは腫瘍溶解性アデノウイルス・ベクターを作る。腫瘍溶解性アデノウイルス・ベクターを腫瘍細胞に投与すると、その腫瘍細胞が死ぬ。このような条件付き複製がなされるアデノウイルス粒子やアデノウイルス・ベクターは、当業者に知られている方法（例えば上記のアメリカ合衆国特許第5,998,205号、第5,801,029号に開示されている方法）で作ることができる。このような粒子やベクターは、すでに開示したアデノウイルス・パッケージング細胞の中で産生させることができる。一般に、パッケージング細胞は、野生型アデノウイルス粒子になる可能性のある相同的組み換えを制御するように設計した細胞である。このような細胞はよく知られており、例えばPER.C6（例えばアメリカ合衆国特許第5,994,128号と第6,033,908号を参照のこと；ECACC登録番号96022940として寄託されている）として知られているパッケージング細胞が挙げられる。
2．アデノウイルス・ベクターとアデノウイルス粒子
アデノウイルス・ベクターやアデノウイルス粒子を作るのにこの明細書で用いるアデノウイルスは、任意の血清型のもの、例えばAd5またはAd2が可能である。アデノウイルスまたはアデノウイルス・コート・タンパク質（例えばファイバーおよび／またはペントン・ベース）の供給源として使用できるアデノウイルスのストックは、アメリカ基準培養物コレクション（ATCC、ロックヴィル、メリーランド州）から現在のところ入手できるアデノウイルス血清型1〜51から増幅すること、あるいは他の任意の供給源から入手できるアデノウイルスの他の任意の血清型から増幅することができる。例えばアデノウイルスは、サブグループA（例えば血清型12、18、31）、サブグループB（例えば血清型3、7、11、14、16、21、34、35、50）、サブグループC（例えば血清型1、2、5、6）、サブグループD（例えば血清型8、9、10、13、15、17、19、20、22〜30、32、33、36〜39、42〜49、51）、サブグループE（例えば血清型4）、サブグループF（例えば血清型40、41）のもの、あるいはアデノウイルスの他の任意の血清型のものが可能である。いくつかの実施態様では、アデノウイルスは、サブグループCのアデノウイルスである。この明細書に記載したようにして改変したサブグループCのアデノウイルスとして、Ad2やAd5などがある。
この明細書で提供するアデノウイルス・ベクターを利用し、試験管内やさまざまなモデル動物で細胞の形質導入と遺伝子の発現を研究することができる。モデル動物の場合には、試験管内で細胞に形質導入した後、動物に投与するという生体外技術が含まれる。この技術は、ヒトその他の動物で遺伝子治療を行なうのにも利用できる。このような遺伝子治療は、生体外または生体内で実施することができる。生体内遺伝子治療では、薬理学的に許容可能な基剤に含まれたアデノウイルス粒子を治療に有効な量だけヒトに投与してそのヒトの細胞に治療用タンパク質をコードしている異種遺伝子を導入することにより、そのヒトの疾患や他の臨床症状を予防、治療、改善する。アデノウイルスは、体重1kgにつき約1個〜約1014個の範囲の粒子を投与する。一般に、アデノウイルスは、体重1kgにつき約106個〜1013個、典型的には約108個〜約1012個の範囲の粒子を投与する。
当業者に知られている任意のベクターを利用し、樹状細胞への結合と感染が増大するように改変したファイバーを含むウイルス粒子を作ることができる。
a．中身のないベクター
中身のないアデノウイルス・ベクターは、ウイルス遺伝子の大部分またはすべてが除去されたベクターである。このアデノウイルス・ベクターは、プロデューサ細胞に（例えばE1欠損Adベクターを用いて）“ヘルパー”ウイルスを同時に感染させて増殖させる。するとそのプロデューサ細胞ではパッケージング細胞がE1遺伝子産物を発現する。ヘルパー・ウイルスは、失われたAd機能を移して補足する。その機能の中には、粒子の組み立てに必要なウイルス構造タンパク質の産生が含まれる。キャプシドの改変を中身のないアデノウイルス・ベクターのキャプシドに組み込むため、この明細書に記載したようにしてヘルパー・ウイルスを変化させる必要がある。改変キャプシド・タンパク質を含む必要なすべてのAdタンパク質が改変ヘルパー・ウイルスから提供されると、中身のないアデノウイルス粒子には、宿主細胞が発現する特定の改変キャプシドが備わる。ウイルスの複製とパッケージングには、一般にE1a、Eb、E2a、E2b、E4が必要である。これら遺伝子がない場合には、パッケージング細胞がこれらの遺伝子またはそれと同等な機能を提供せねばならない。
ヘルパー・アデノウイルス・ベクターのゲノムと中身のないアデノウイルス・ベクターのゲノムがパッケージング細胞に供給される。この細胞は、標準的な細胞維持条件下または増殖条件下に維持され、そうすることにより、ヘルパー・ベクターのゲノムとパッケージング細胞が合わさってアデノウイルス・ベクター粒子をパッケージングするためのタンパク質を補足する。中身のないアデノウイルス・ベクター粒子は、標準的な方法で回収する。ヘルパー・ベクターのゲノムは、標準的なトランスフェクション法によってプラスミドまたはそれと同様の構造体の形態で供給すること、あるいはゲノムを含むウイルス粒子の感染を通じて供給することができる。このようなウイルス粒子は一般にヘルパー・ウイルスと呼ばれる。同様に、中身のないアデノウイルス・ベクターのゲノムは、トランスフェクションまたはウイルス感染によって細胞に送達することができる。
ヘルパー・ウイルスのゲノムとしては、この明細書に開示したような改変アデノウイルス・ベクターのゲノムが可能である。アデノウイルスのE1Aタンパク質とE1Bタンパク質をコードしている遺伝子が欠けているようなゲノムを調製または設計することもできる。さらに、このゲノムは、アデノウイルスのE3タンパク質をコードしている遺伝子が欠けていてもよい。あるいはこれらタンパク質をコードしている遺伝子は、存在しているが改変されていて、機能的なE1Aタンパク質、E1Bタンパク質、E3タンパク質をコードしていないようにすることもできる。さらに、このようなベクターのゲノムは、他の機能的初期タンパク質（例えばE2Aタンパク質、E2B3タンパク質、E4タンパク質）をコードすることができない。あるいは、これらの初期タンパク質をコードしている遺伝子は、存在しているが改変されていて、機能的なタンパク質をコードしていないようにすることもできる。
中身のないベクターを作るには、ヘルパー・ウイルスのゲノムもパッケージングしてヘルパー・ウイルスを作る。作るヘルパー・ウイルスの量を最少にし、中身のないベクター粒子の量を最大にするため、ヘルパー・ウイルスのゲノム中のパッケージング配列を除去するか改変し、ヘルパー・ウイルスのゲノムのパッケージングがなされないか制限されるようにする。中身のないベクターのゲノムは変化していないパッケージング配列を持つことになるため、パッケージングすることが好ましかろう。
そのための1つの方法は、パッケージング配列を含む1つ以上のヌクレオチドを除去するか、パッケージング機能を不活化または妨害するためにその配列を突然変異させることである。具体的な1つの方法は、ヘルパー・ゲノムを操作して組み換え酵素の標的部位をパッケージング配列に隣接させるとともに、組み換え酵素をパッケージング細胞の中に入れるというものである。組み換え酵素がそのような部位に作用する結果、ヘルパー・ウイルスのゲノムからパッケージング配列が除去される。組み換え酵素は、パッケージング細胞の中にあって組み換え酵素をコードしているヌクレオチド配列によって与えることができる。このような配列は、パッケージング細胞のゲノムに安定に組み込むことができる。当業者にはさまざまな種類の組み換え酵素が知られており、例えば（すでに説明したように、操作してパッケージング配列のいずれかの側に存在している）いわゆるlox部位に作用するCre組み換え酵素が挙げられる（例えばアメリカ合衆国特許第5,919,676号と第6,080,569号を参照のこと；例えばMorsyとCaskey、Molecular Medicine Today、1999年1月、18〜24ページも参照のこと）。
中身のないベクターの一例はpAdARSVDys（Haecker他、1996年、Hum. Gene Ther.、第7巻、1907〜1914ページ）である。このプラスミドは、Ad逆方向末端反復配列とパッケージ・シグナルに隣接していてRSVプロモータによって制御される完全長ヒト・ジストロフィンcDNAを含んでいる。293細胞にヘルパー・ウイルスとして機能する第1世代のAdを感染させた後、精製したpAdARSVDysのDNAをトランスフェクトする。ヘルパーAdゲノムとpAdARSVDysのDNAはAdの染色体として複製され、ヘルパー・ウイルスが産生したウイルス・タンパク質を利用して粒子内にパッケージングされる。粒子を分離すると、pAdARSVDys含有粒子が、ゲノム・サイズがより小さいためにCsCl勾配上で密度が異なるヘルパーから分離する。中身のないアデノウイルス・ベクターの別の具体例も知られている（例えばSandig他、2000年、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、第97巻(3)、1002〜1007ページを参照のこと）。
b．がん溶解ベクター
腫瘍溶解アデノウイルスは、腫瘍細胞の中で選択的に複製されるウイルスである。そのようなベクターは、一般には樹状細胞が悪性ではない限り樹状細胞を標的とするのに有用ではない。要するに、腫瘍溶解ベクターは、腫瘍内でウイルスが複製されることが原因となって投与したウイルスが増えるように設計する。するとウイルスは、腫瘍の塊全体に広がる。アデノウイルスがその場で複製されると、細胞の溶解が起こる。このその場での複製により、腫瘍細胞の選択的除去に極めて有効な、比較的少ない非毒性の投与量にすることが可能になる。選択性を実現するための1つの方法は、ウイルスの遺伝子に、標的ではない細胞においては増殖に不可欠だが、腫瘍細胞においてはそうではない機能喪失突然変異を導入するというものである（例えばアメリカ合衆国特許第5,801,029号を参照のこと）。この方法では、例えばE1b-55kD遺伝子に欠損を有するAddl1520を用いる。正常な細胞では、アポトーシスを避けようとしてp53と結合するのに、アデノウイルスのE1b-55kDタンパク質が必要とされる。p53が欠けている腫瘍細胞では、E1b-55kDがp53と結合する必要がない。したがってE1b-55kDの欠損により、p53が欠けている腫瘍細胞では、ベクターの複製が制限されるはずである。
別の方法は、複製に必要な初期ウイルス遺伝子の発現を制御する腫瘍選択的プロモータを用いるというものである（例えば国際PCT出願WO 96/17053、WO 99/25860を参照のこと）。したがってこの方法では、複製に不可欠な遺伝子が、腫瘍選択的なプロモータまたは他の転写調節エレメントの制御下にある場合には、アデノウイルスが選択的に複製されて腫瘍細胞を溶解させる。
例えば、アデノウイルスの複製に不可欠なアデノウイルスの遺伝子と機能上リンクしている癌選択的調節領域を含む腫瘍溶解性アデノウイルス・ベクターが知られている（例えばアメリカ合衆国特許第5,998,205号を参照のこと）。複製に不可欠なアデノウイルスの遺伝子としては、E1a、E1b、E2a、E2b、E4などがある。例えばがん溶解アデノウイルス・ベクターの1つは、E1a遺伝子と機能上リンクしたがん選択的制御領域を含んでいる。別の実施態様では、がん溶解アデノウイルス・ベクターは、E1a遺伝子と機能上リンクした1つのがん選択的制御領域と、E4遺伝子と機能上リンクした第2のがん選択的制御領域を含んでいる。ベクターは、少なくとも1つの治療用導入遺伝子（例えば、腫瘍細胞に対する全身免疫応答を促進できるサイトカイン（例えばGM-CSF）をコードしているポリヌクレオチド）も含むことができる。
腫瘍溶解性アデノウイルス・ベクターの別の具体例としては、複製に不可欠なアデノウイルスの遺伝子の発現が、がん細胞において選択的にトランス活性化されるE2F応答プロモータによって制御されるベクターが挙げられる。例えばベクターは、アデノウイルスの核酸骨格として順番に、左側ITRと、アデノウイルス・パッケージング・シグナルと、終止シグナル配列と、組み換えウイルス・ベクターの複製に不可欠なE1aなどの第1の遺伝子と機能上リンクしたE2F応答プロモータと、右側ITRとを含んでいる（公開された国際PCT出願WO 02/06786と、アメリカ合衆国特許第5,998,205号を参照のこと）。
別の実施態様では、腫瘍溶解性アデノウイルス・ベクターは、E1a遺伝子と機能上リンクしたがん選択的調節領域と、E4遺伝子と機能上リンクした第2のがん選択的調節領域とを含んでいる。ベクターは、少なくとも1つの治療用導入遺伝子（例えば、腫瘍細胞に対する全身免疫応答を促進できるサイトカイン（例えばGM-CSF）をコードしているポリヌクレオチド）も含むことができる。
3．パッケージング
この明細書で提供するウイルス粒子は、当業者に知られている任意の方法で作ることができる。一般に、ウイルス粒子は、改変キャプシド・タンパク質または異種キャプシド・タンパク質をコードしている核酸を含むアデノウイルス・ベクターを標準的なアデノウイルス・パッケージング細胞の中で増殖させることによって得る。するとその改変キャプシド・タンパク質または異種キャプシド・タンパク質を発現する粒子が産生される。このようなベクターをプロデューサ細胞の中にパッケージングし、改変ファイバー・タンパク質を発現する粒子を作る。
すでに説明したように、組み換えアデノウイルス・ベクターは、一般に、第1のウイルス初期遺伝子領域（E1と呼ばれ、E1a領域とE1b領域が含まれる）に少なくとも1つの欠損を有する。ウイルスのE1領域が欠損していることで、組み換えアデノウイルスは複製に欠陥を抱えることになり、感染性ウイルス粒子に感染する標的細胞は感染性ウイルス粒子を産生できなくなる。したがってE1欠損アデノウイルスのゲノムの複製を可能にし、ウイルス粒子が産生されるようにするには、失われたE1遺伝子産物を提供する補足系が必要とされる。E1の補足は、一般に、E1を発現する細胞系（例えばヒト胚性腎臓パッケージング細胞系、すなわち293と呼ばれる上皮細胞系）によってなされる。293細胞系は、その細胞系でE1欠損ウイルスの増殖を“サポートする”E1遺伝子領域産物を提供するアデノウイルスのE1領域を含んでいる（例えばGraham他、J. Gen. Virol.、第36巻、59〜71ページ、1977年を参照のこと）。さらに、アデノウイルスE4領域の一部を有する欠陥アデノウイルスを作るのに使用できる細胞系が報告されている（WO 96/22378）。欠陥アデノウイルス・ベクターと補足細胞系の増殖についても報告されている（WO 95/34671と、アメリカ合衆国特許第5,994,106号）。
例えば、同時係属中のアメリカ合衆国出願シリアル番号第09/482,682号（2000年1月14日に国際PCT出願PCT/EP00/00265としても出願され、国際PCT出願WO 00/42208として公開されている）には、ウイルスのゲノムの主要部が欠けたウイルス・ベクターをヘルパー・ウイルスなしにサポートするパッケージング細胞系のほか、ヘルパー依存性ベクターとともに用いる細胞系とヘルパー・ウイルスも提示されている。パッケージング細胞系は、細胞のゲノムの染色体に安定に組み込まれた異種DNAを有する。この異種DNA配列は、複製されてパッケージングされることになるアデノウイルス・ベクターのゲノム中で欠損または突然変異している遺伝子を補足する1つ以上のアデノウイルス調節ポリペプチドおよび／または構造ポリペプチドをコードしている。
パッケージング細胞系は、例えば、アデノウイルスの1つ以上の構造タンパク質、ポリペプチド、またはその断片（例えばペントン・ベース、ヘキソン、ファイバー、ポリペプチドIIIa、ポリペプチドV、ポリペプチドVI、ポリペプチドVII、ポリペプチドVIII、ならびにこれらの生物学的に活性な断片）を発現する。発現は、構成的にすること、または調節可能なプロモータの制御下に置くことができる。これらの細胞系は、特に、治療用産物の送達を目的とした組み換えアデノウイルスを発現するように設計する。この明細書で使用するため、このようなパッケージング細胞系は、改変キャプシド・タンパク質または異種キャプシド・タンパク質（例えば樹状細胞への結合と感染が増大したファイバー・タンパク質）を発現することができる。
特定のパッケージング細胞系が、アデノウイルスの構造タンパク質、および／または調節ポリペプチドE1AとE1B、および／または調節タンパク質または調節ポリペプチドE2A、E2B、E3、E4、L4のうちの1つ以上またはその断片をコードしているDNA配列に欠損または突然変異を有するウイルス・ベクターを補足する。
パッケージング細胞系は、各DNA分子を細胞内に導入した後、別の補足プラスミドを通じてゲノムの中に導入することによって得られる。あるいは補足タンパク質をコードしている複数のDNA分子を単一の補足プラスミドを通じて導入することもできる。この明細書で興味深いのは、補足プラスミドが、サブグループDのAdウイルス（例えばAd19pまたはAd37）からのアデノウイルス・ファイバー・タンパク質（またはそのキメラ変異体または改変変異体）をコードしているDNAを含んでいる変異である。
応用のため（例えば治療のため）、送達用プラスミドは、異種ポリペプチドをコードしているヌクレオチド配列をさらに含むことができる。送達用プラスミドの具体例としては、pDV44、pΔE1Bβ-gal、pΔE1sp1B（マイクロビックス・バイオシステムズ社；アメリカ合衆国特許第6,140,087号と第6,379,943号も参照のこと）などがある。同様にして、治療用核酸（例えば治療用遺伝子をコードしている核酸）を導入することができる。
細胞は、この明細書で考えているファイバーや他のキャプシド・タンパク質をコードしている補足プラスミドをさらに含んでいる。そしてそのプラスミドまたはその一部は、細胞のゲノムの染色体と一体化する。
一般に、パッケージング細胞系は、キャプシド・タンパク質または改変キャプシド・タンパク質をコードしている核酸を含んでおり、その核酸が、細胞のゲノム中の1本または複数本の染色体に安定に組み込まれることになる。パッケージング細胞系は、原核細胞系に由来するものでも、真核細胞系に由来するものでもよい。いろいろな実施態様では、哺乳動物の細胞と上皮細胞系（特に上皮細胞系）を用いることが勧められているが、他のいろいろな非上皮細胞系がさまざまな実施態様で用いられている。したがっていろいろな実施態様において、293細胞系、A594細胞系、W162細胞系、ヒーラ細胞系、ベロ細胞系、211細胞系、211A細胞系の中から選択した細胞系を用いることが開示されているが、そのような用途に適した他の任意の細胞系もこの明細書では考えることができる。
4．二重に機能を喪失したアデノウイルス・ベクターの増殖とスケール・アップ
ファイバーおよび／またはペントン・キャプシド・タンパク質に突然変異を含む二重に機能を喪失したアデノウイルス・ベクターは、細胞への結合が不十分になり、CAR／αvインテグリン侵入経路を通じた侵入も不十分になるため、スケール・アップ技術によってそのようなベクターの増殖を改善し、臨床で利用するための高力価アデノウイルス・ベクターを作る。したがって、標的に向かわないアデノウイルス・ベクターの産生をスケール・アップする方法も提供される。標的に向かわないアデノウイルス・ベクターは、野生型ベクターと比較すると、そのベクターと少なくとも1つの宿主の受容体との相互作用が消えるように改変したアデノウイルス・ベクターを含んでいる。標的に向かわないアデノウイルス・ベクターは、そのベクターと、宿主の1つ、2つ、3つまたはそれ以上の受容体との相互作用が消えるように改変したアデノウイルス・ベクターを含むことができる。したがってこの方法は、この明細書に開示した標的に向かわないアデノウイルス・ベクターを作るのに適している。
すでに指摘したように、二重かつ完全に機能を喪失したアデノウイルス・ベクターの増殖は、新しいスケール・アップ技術によって増大する。二重に機能を喪失したベクターは、ファイバー・タンパク質とペントン・キャプシド・タンパク質に突然変異を含んでいるため、細胞への結合が不十分になり、CARとインテグリンを利用した通常の細胞侵入経路を通じた侵入も不十分になる。これらベクターは、試験管内ではまったく標的に向かわないため、別の細胞侵入法により、高力価製剤の効率的な増殖と生成が可能になる。
ファイバーおよび／またはペントンの改変によって標的に向かわなくなったベクターをスケール・アップするのに2つの方法が考えられている。それは、（a）ベクター上に提示されるリガンドと結合する表面受容体を発現するように操作した擬受容体細胞系の利用（例えば国際PCT出願WO 98/54346を参照のこと）と、（b）元のファイバーを発現するように操作してあり、さらに元のファイバーとペントンを発現するように操作することが可能な補足細胞系の利用（例えば国際PCT出願WO 00/42208を参照のこと）である。これらの系は機能を喪失したアデノウイルス・ベクターのスケール・アップにとって有望であることがわかっているが、治療を目的とした完全に標的に向かわないアデノウイルス・ベクターを簡単かつ効率的に作る系を開発する必要がある。
この明細書では、標的に向かわないアデノウイルス・ベクターの増殖をスケール・アップする方法が提供される。この方法では、組織培地に添加したとき、アデノウイルス粒子と結合してプロデューサ細胞の中に直接入るポリカチオンおよび／または二官能性試薬を用いる。
標的に向かわないアデノウイルス・ベクターが感染することになるプロデューサ細胞を含む組織培地に試薬（培地添加物とも呼ばれる）も含めることができる。あるいは試薬をウイルスとあらかじめ混合し、その混合物を組織プロデューサ細胞に添加することもできる。プロデューサ細胞を含む組織培地に試薬を添加すること、またはプロデューサ細胞を、試薬を含む組織培地に添加することができる。当業者に知られている適切な任意のプロデューサ細胞をこの方法で用いることができる。試薬は、標的に向かわないアデノウイルス・ベクターをプロデューサ細胞に感染させるのと同時に添加することができる。一般に、試薬は、標的に向かわないアデノウイルス・ベクターを感染させる前に組織培地の中に存在している。培地添加物は、ベクターの増殖、拡散の間を通じて組織培地の中に維持する。この方法により、アデノウイルス・ベクターが高い収率で得られる。
この方法で有用な試薬は、アデノウイルス粒子をプロデューサ細胞に入れることのできる試薬である。そのような試薬として、ポリカチオン試薬と二官能性試薬が挙げられる。適切なポリカチオンとしては、ポリエチレンイミン；プロタミン硫酸；ポリ-L-リシンヒドロブロミド；ポリ(ジメチルジアリルアンモニウム)クロリド（メルクワット(r)-100、メルクワット(r)-280、メルクワット(r)-550）；ポリ-L-アルギニンヒドロクロリド；ポリ-L-ヒスチジン；ポリ(4-ビニルピリジン)、ポリ(4-ビニルピリジン)ヒドロクロリド；架橋したポリ(4-ビニルピリジン)、メチルクロリド第4級塩；ポリ(4-ビニルピリジン-コ-スチレン)；ポリ(4-ビニルピリジニウムポリ(フッ化水素))；ポリ(4-ビニルピリジニウム-硫酸p-トルエン)；ポリ(4-ビニルピリジニウム-トリブロミド)；ポリ(4-ビニルピロリドン-コ-2-ジメチルアミノ-メタクリル酸エチル)；架橋したポリビニルピロリドン；ポリビニルピロリドン、ポリ(メラミン-コ-ホルムアルデヒド)；一部メチル化されたもの；ヘキサジメトリンブロミド；ポリ(グルタミン酸、リシン)1：4ヒドロブロミド；ポリ(リシン、アラニン)3：1ヒドロブロミド；ポリ(リシン、アラニン)2：1ヒドロブロミド；スクシニル化したポリ-L-リシン；ポリ(リシン、アラニン)1：4ヒドロブロミド；ポリ(リシン、トリプトファン)1：4ヒドロブロミドなどがある。
適切な二官能性試薬としては、アデノウイルスのキャプシドと結合するとともに、プロデューサ細胞の特異的細胞表面受容体と相互作用できるリガンドも含む抗体またはペプチドなどがある。二官能性試薬の具体例としては、（a）抗ファイバー-抗体リガンド融合体、（b）抗ファイバー-Fab-FGF共役体、（c）抗ペントン-抗体リガンド融合体、（d）抗ヘキソン-抗体リガンド融合体、（e）ポリリシン-ペプチド融合体などがある。リガンドは、プロデューサ細胞上に見られる任意の細胞表面受容体と結合するあらゆるリガンドである。
F．アデノウイルス発現ベクター系
ウイルス粒子の中に収められていて遺伝子治療の場で外来性遺伝子を発現するアデノウイルス・ベクターのゲノムが提供される。組み換えアデノウイルス・ベクターのゲノムの構成要素は、アデノウイルスの選択された構造遺伝子を発現すること、望む外来性タンパク質を発現すること、ゲノムを遺伝子送達ベクター粒子の中にパッケージングするのに十分な複製シグナルとパッケージング・シグナルを含むことができる。複製シグナルの一例は、アデノウイルスの複製起点を含むアデノウイルス逆方向末端反復配列である。これはよく知られており、この明細書にも記載してある。アデノウイルスは多くのタンパク質を含んでいるが、組み換えアデノウイルス粒子（ベクター）を構成するのにアデノウイルスのすべてのタンパク質が必要なわけではない。例えばAdベクターから適切な遺伝子が欠けていると、より大きな“外来”DNAセグメントを収容することさえできる。
1つの組み換えアデノウイルス・ベクターのゲノムは“ヘルパーとは独立である”ため、第2の補足ヘルパー・ウイルスの助けなしにゲノムを複製してパッケージングすることができる。補足は、パッケージング細胞によってなされる。この明細書で特に考慮するのは、ヘルパーに依存した系である。一実施態様では、アデノウイルス・ベクターのゲノムが機能的アデノウイルス・ファイバー・タンパク質をコードしていない。機能しないファイバー遺伝子とは、アデノウイルスのファイバー遺伝子に欠損、突然変異、あるいは他の改変があるためにその遺伝子がアデノウイルスのファイバー・タンパク質をまったく発現しないか不十分にしか発現しないため、補足プラスミドまたはパッケージング細胞系がファイバー遺伝子を補足することなしにはファイバー含有アデノウイルス粒子のパッケージングがなされないことを意味する。このようなゲノムは、ファイバーなし粒子と混同しないよう、“ファイバーなし”ゲノムと呼ぶ。あるいはファイバー・タンパク質をコードしていてもよいが、不十分にしか発現しない場合も、ファイバー含有粒子である。
例えば使用を考慮するのは、ヘルパーとは独立なファイバーなし組み換えアデノウイルス・ベクターのゲノムであって、（a）アデノウイルスの構造遺伝子の産物をすべて発現するが、アデノウイルスのファイバー・タンパク質は不十分にしか発現しないため、そのファイバー遺伝子を補足することなしにはファイバー含有アデノウイルス粒子がパッケージングされない遺伝子と、（b）外来タンパク質を発現する遺伝子と、（c）アデノウイルス・パッケージング・シグナルと、アデノウイルスの複製起点を含む逆方向末端反復配列とを含む遺伝子を含有するものである。
アデノウイルス・ベクターのゲノムは、試験管内ではゲノムを含むrDNAプラスミドの形態で増殖し、適切な宿主の中に導入されると、プラスミドに基づく増殖ではなく、ウイルスの遺伝エレメントが、ウイルスのゲノムの複製とパッケージングを行なう。Adベクターのゲノムを調製する具体的な方法は実施例に記載してある。
この明細書におけるベクターとしては、細胞内の自律的な複製が可能な核酸分子（例えばDNA）であって、その核酸分子にDNAセグメント（例えば遺伝子またはポリヌクレオチド）を機能上リンクさせ、付加されたそのセグメントを複製させることのできるものなどがある。この明細書の目的のため、ベクター配列と機能上リンクさせるヌクレオチド・セグメントの1つは、治療用核酸分子の少なくとも一部をコードしている。すでに指摘したように、治療用核酸分子としては、タンパク質をコードしている核酸分子や、樹状細胞内で遺伝子産物の発現へ、あるいは発現の抑制または変化へとつながる可能性のある調節因子をコードしている核酸分子などがある。
1．核酸遺伝子発現カセット
さまざまな実施態様では、治療用遺伝子のペプチド・コード配列が発現ベクターに挿入されて発現するが、いくつかの非コード配列も含む発現ベクターを構成することもできる。しかし一般には、非コード配列は除外される。あるいは可溶形態になったポリペプチドのための核酸配列を利用することもできる。別の治療用ウイルス・ベクターとしては、治療用ヌクレオチド配列内にあってその治療用ヌクレオチド配列のコード配列を発現させるための発現ベクターと機能上リンクしている部分の少なくとも一部をコードしているヌクレオチド配列が挙げられる。
治療用核酸分子と機能上リンクした状態にするウイルス・ベクターの選択は、従来技術で知られているように、望む機能的特性が何であるか（例えばベクターの複製、タンパク質の発現）と、形質転換する宿主細胞が何であるかとに直接依存する。これらは、組み換えDNA分子を構成する技術における固有の制約である。この明細書ではアデノウイルスのいくつかの血清型を特別な実施例として引用するが、アデノウイルスのあらゆる血清型（その中には、そのハイブリッドや誘導体も含まれる）の利用が考えられることを理解すべきである。特に興味深いのは、得られるウイルス粒子を樹状細胞に向かわせるファイバーの利用である。
2．プロモータ
この明細書の別の箇所で指摘したように、Ad由来のベクターに含まれる発現核酸は、プロモータ、特に組織特異的プロモータまたは細胞特異的プロモータ（例えば樹状細胞で発現するプロモータ）も含んでいる。プロモータは、そのプロモータの3'側、すなわち下流に位置する遺伝子の発現を制御するDNA配列を含む核酸断片である。プロモータは、RNAポリメラーゼが特異的に結合して、一般にそのプロモータの3'側に位置するその遺伝子のRNA合成（転写）を開始させるDNA配列である。プロモータには、転写の開始を指示するDNA配列（例えばRNAポリメラーゼが特異的に結合するDNA配列）も含まれる。特定のポリペプチドまたはタンパク質をコードしている2つ以上の核酸配列が治療用ウイルス・ベクターまたはヌクレオチド配列に含まれている場合には、2つ以上のプロモータまたはエンハンサーが含まれることで特に発現の効率を大きくなるようであれば、2つ以上のプロモータまたはエンハンサーが含まれていてもよい。制御可能な（誘導）プロモータと構成的プロモータを使用することができ、両者は別々のベクターに乗っていてもよいし、同じベクター上にあってもよい。例えば有用ないくつかの制御可能なプロモータは、CREB調節遺伝子ファミリー（例えばインヒビン、ゴナドトロピン、シトクロムc、グルカゴンなど）のプロモータである（例えば国際PCT出願WO 96/14061を参照のこと）。選択するプロモータは、樹状細胞特異的遺伝子（例えばNFκB）の中から選択することができる。
制御可能なプロモータまたは誘導的プロモータは、RNAポリメラーゼの結合と転写開始の速度が外部刺激によって変化するプロモータである（例えばアメリカ合衆国特許第5,750,396号、第5,998,205号を参照のこと）。そのような刺激としては、さまざまな化合物や組成物、光、熱、ストレス、化学的エネルギー源などがある。誘導的プロモータ、抑制可能プロモータ、抑圧可能なプロモータは、制御可能なプロモータと考えられる。制御可能なプロモータには組織特異的プロモータも含まれる。組織特異的プロモータは、そのプロモータが特定のタイプの細胞と機能上リンクしている遺伝子の発現を指示する。組織特異的プロモータは、そのプロモータが内在性遺伝子を発現させた特定の細胞内で、そのプロモータの3'側に位置する遺伝子を独占的ではないにせよ優勢に発現させる。一般に、組織特異的プロモータがそのプロモータの3'側に位置する遺伝子を発現させる場合には、その遺伝子は正しいタイプの細胞内で適切に発現するように見える（例えばPalmitier他、1986年、Ann. Rev. Genet.、第20巻、465〜499ページを参照のこと）。
G．異種ポリヌクレオチドと治療用核酸
パッケージングされたアデノウイルス・ゲノムは、興味の対象である産物（例えば治療用タンパク質）をコードしている異種ポリヌクレオチドを含むこともできる。異種ポリヌクレオチドを含むアデノウイルス・ゲノムは周知である（例えばアメリカ合衆国特許第5,998,205号、第6,156,497号、第5,935,935号、第5,801,029号を参照のこと）。これらは、試験管内と生体内で異種ポリヌクレオチドの産物、または異種ポリヌクレオチドを送達するのに使用することができる。
この明細書で提供するアデノウイルス粒子は、細胞を操作して、そうでない場合には発現しないか十分な量は発現しないタンパク質を発現させるのに用いることができる。この遺伝子操作は、望む異種ポリヌクレオチドをゲノム内に含むアデノウイルス粒子を望む細胞に感染させることによって実現する。すると異種ポリヌクレオチドは、遺伝子操作したその細胞内で発現する。この明細書で使用する細胞は一般に哺乳動物の細胞であり、典型的には霊長類の細胞（ヒトの細胞も含む）である。細胞は、動物の体内にあってもよいし（生体内）、体外にあってもよい（試験管内）。異種ポリヌクレオチド（異種核酸配列とも呼ばれる）は、粒子内のアデノウイルスのゲノムに含まれており、従来技術で知られている方法でそのゲノムに付加される。興味あるあらゆる異種ポリヌクレオチド（例えばアメリカ合衆国特許第5,998,205号に開示されているポリヌクレオチド）を付加することができる。なおこの特許の内容は、参考としてこの明細書に組み込まれているものとする。
AdゲノムまたはAdベクターに導入されるポリヌクレオチドとしては、興味の対象であるタンパク質をコードしている任意のポリヌクレオチド、または調節配列が可能である。ゲノムは、特に、提示するために樹状細胞の中で発現させる産物、または樹状細胞の活性を変化させる産物をコードしている異種核酸を含むことができる。この明細書が目的とするタンパク質には腫瘍抗原などがある。腫瘍抗原としては、癌胎児性抗原、NY-BR1、NY-ESO-1、MAGE-1、MAGE-3、BAGE、GAGE、SCP-1、SSX-1、SSX-2、SSX-4、CT-7、Her2/Neu、NY-BR-62、NY-BR-85、腫瘍タンパク質D52などがある（ScanlanとJager、2001年、Breast Cancer Res.、第3巻、95〜98ページ；YuとRestifo、2002年、J. Clin. Invest.、第110巻、28〜94ページ）。以下の表には、腫瘍抗原と、その抗原を発現する組織の具体的なリストを示してある。
Figure 2007525166
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タンパク質としては、治療用タンパク質である免疫刺激タンパク質（例えばインターロイキン、インターフェロン、コロニー刺激因子（顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF；5,908,763Fを参照のこと）が挙げられる。一般にはGM-CSFは霊長類のGM-CSFであり、その中にヒトのGM-CSFが含まれる。他の免疫刺激遺伝子としては、サイトカインであるIL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IFN、TNF、IL-12、IL-18、flt3をコードしている遺伝子、免疫細胞との相互作用を促進するタンパク質をコードしている遺伝子（B7、CD28、MHCクラスI、MHCクラスII、TAP）、腫瘍関連抗原（MART-1、gp100（pmel-17）、チロシナーゼ、チロシナーゼ関連タンパク質1、チロシナーゼ関連タンパク質2、メラノサイト刺激ホルモン受容体、MAGE1、MAGE2、MAGE3、MAGE12、BAGE、NY-ESO-1、-カテニン、MUM-1、CDK-4、カスパーゼ8、KIA 0205、HLA-A2R1701、-フェトプロテイン、テロメラーゼ触媒タンパク質、G-250、MUC-1、癌胎児タンパク質、p53、Her2/neu、トリオースリン酸イソメラーゼ、CDC-27、LDLR-FUT、テロメラーゼ逆転写酵素、PSMAからの免疫原配列）をコードしている遺伝子、抑制シグナルを阻止する（CTLA4ブロッケード）抗体のcDNAをコードしている遺伝子、ケモカイン（MIP1、MIP3、CCR7リガンド、カルレチクリン）をコードしている遺伝子、これら以外のタンパク質をコードしている遺伝子などが挙げられる。
他のポリヌクレオチド（興味の対象である治療用遺伝子などの治療用核酸を含む）としては、抗血管形成遺伝子や自殺遺伝子がある。抗血管形成遺伝子としては、METH-1、METH-2、TrpRSの断片、プロリフェリン関連タンパク質、プロラクチンの断片、PEDF、バソスタチン、細胞外マトリックス・タンパク質のさまざまな断片、増殖因子／サイトカインのインヒビターをコードしている遺伝子などがある。細胞外マトリックス・タンパク質のさまざまな断片としては、アンギオスタチン、エンドスタチン、キニノスタチン、フィブリノーゲン-Eの断片、トロンボスポンジン、タムスタチン、カンスタチン、レスチンなどがある。増殖因子／サイトカインのインヒビターとしては、VEGF/VEGFRアンタゴニスト、sFlt-1、sFlk、sNRP1、アンギオポエチン／タイ・アンタゴニスト、sTie-2、ケモカイン（IP-10、PF-4、Gro-β、IFN-γ（Mig）、IFN、FGF/FGFRアンタゴニスト（sFGFR）、エフリン/Ephアンタゴニスト（sEphB4とセフリンB2）、PDGF、TGF、IGF-1などがある。
“自殺遺伝子”は、ジフテリア毒素Aの発現などで細胞死へと導くことのできるタンパク質をコードしている。タンパク質の発現により、細胞がある種の薬に対して選択的に感受性を持つようになる可能性がある（例えば単純ヘルペスのチミジンキナーゼ遺伝子（HSV-TK）は、アシクロビル、ガンシクロビル、FIAU（1-(2-デオキシ-2-フルオロ-β-D-アラビノフラノシル)-5-ヨードウラシル）といった抗ウイルス化合物に対して細胞が感受性を持つようにする）。他の自殺遺伝子としては、カルボキシペプチダーゼG2（CPG2）、カルボキシルエステラーゼ（CA）、シトシンデアミナーゼ（CD）、シトクロムP450（cyt-450）、デオキシシチジンキナーゼ（dCK）、ニトロレダクターゼ（NR）、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ（PNP）、チミジンホスホリラーゼ（TP）、水痘ウイルスのチミジンキナーゼ（VZV-TK）、キサンチン-グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（XGPRT）などをコードしている遺伝子が挙げられる。あるいは治療用核酸は、例えばアンチセンス・メッセージまたはリボザイムをコードすることにより、あるいはスプライシングまたは3'プロセシング（例えばポリアデニル化）に影響を与えるタンパク質をコードすることにより、あるいは例えばmRNAの蓄積速度変化、mRNAの輸送速度の変化、転写後調節の変化を媒介することによって細胞内の別の遺伝子の発現のレベルに影響を与えるタンパク質をコードすることにより、RNAのレベルで効果を及ぼすことができる。ウイルスに治療用核酸を付加すると、抗腫瘍作用が追加されたウイルスになる。したがって単一の構造体（すなわち治療用導入遺伝子を有するウイルス）が、多数の抗腫瘍メカニズムを誘導できる。コードされた他のタンパク質としては、安全スイッチとして有用な単純ヘルペス・ウイルスのチミジンキナーゼ（HSV-TK）（1997年11月19日に出願され、PCT公開番号WO 99/25860として公開されたアメリカ合衆国特許出願第08/974,391号を参照のこと）のほか、Nos、FasL、sFasR（可溶性Fas受容体）などがある。
この明細書では、相乗的な毒性、および／または相補的な毒性、および／または重複しない毒性を有する2つ以上の導入遺伝子の組み合わせを考えるとともに、作用させる方法も考える。得られるアデノウイルスは、ウイルスのがん溶解機能を保持できる上、例えば免疫応答と抗血管形成応答や、望む他の応答を誘導する能力をさらに与えられる。
治療用ポリヌクレオチドと異種ポリヌクレオチドには、RNAまたはタンパク質のレベルで効果を及ぼすポリヌクレオチドも含まれる。そのようなポリヌクレオチドとしては、アポトーシスを開始させることのできる因子、RNA（例えばRNAiや他の二本鎖RNA）、アンチセンス、リボザイムなどがあり、これらは、増殖に不可欠なタンパク質（例えば、構造タンパク質、転写因子、ポリメラーゼ）をコードしているmRNA、細胞傷害性タンパク質をコードしている遺伝子、ヌクレアーゼ（例えばRNアーゼA）またはプロテアーゼ（例えばトリプシン、パパイン、プロテイナーゼK、カルボキシペプチダーゼ）を遺伝子操作した細胞質変異体をコードしている遺伝子に向けることができる。他のポリヌクレオチドとしては、がん溶解アデノウイルスで使用されているような細胞特異的プロモータまたは組織特異的プロモータがある（例えばアメリカ合衆国特許第5,998,205号を参照のこと）。
ポリペプチドをコードしている異種ポリヌクレオチドは、コード領域と機能上リンクしているプロモータも含むことができる。一般に、プロモータは、プロモータと転写因子を含む調節された発現系（例えば公開されている、テトラサイクリンで調節される系や別の調節可能な系（WO 01/30843））であり、コードされたポリペプチドを制御された状態で発現させることができる。他の具体的なプロモータは、アメリカ合衆国特許第5,998,205号に記載されているような組織選択的プロモータである。調節可能なプロモータ系の一例は、Tetオン（とTetオフ）系であり、現在はクロンテック社（パロ・アルト、カリフォルニア州）から入手できる。このプロモータ系により、テトラサイクリンまたはテトラサイクリン誘導体（例えばドキシサイクリン）によって制御される導入遺伝子の調節された発現が可能になる。この系を利用すると、ウイルス粒子とこの明細書で提供する核酸にコードされているポリペプチドの発現を制御できる。調節可能な他のプロモータ系も知られている（例えば、「一本鎖モノマーでリガンド依存性のポリペプチド・スイッチを用いた遺伝子発現調節」という名称の公開アメリカ合衆国出願第20020168714号を参照のこと。この出願には、例えばホルモン受容体に由来するリガンド結合領域と転写調節領域を含む遺伝子スイッチが記載されている）。使用可能な他の適切なプロモータとしては、アデノウイルス・プロモータ（例えばアデノウイルス主要後期プロモータおよび／またはE3プロモータ）；ヘテロ・プロモータ（例えばサイトメガロウイルス（CMV）プロモータ）；ラウス肉腫ウイルス（RSV）プロモータ；誘導性プロモータ（例えばMMTプロモータ、メタロチオネイン・プロモータ）；熱ショック・プロモータ；アルブミン・プロモータ；アポA1プロモータなどがある。
治療用導入遺伝子は、ウイルス構造体と得られる粒子の中に含めることができる。その中には、“武装した”ウイルスになるものがある。例えばこの明細書に記載したいくつかの実施態様でのようにE3領域を除去するのではなく、E3領域の全体または一部を腫瘍溶解性アデノウイルス・ベクターの中に保存または再挿入することができる（すでに説明した）。E3領域の全体または一部が存在していると、アデノウイルス・ベクターの免疫原性を低下させることができる。また、E3領域の全体または一部が存在していると、腫瘍細胞における細胞傷害効果が増大するとともに、正常な細胞に対する毒性が低下する。一般に、このようなベクターは、E3タンパク質の半分以上を発現する。
治療用アデノウイルスは、ヒトの治療用のものも含め、公知である。そのような公知のウイルスをこの明細書に記載したようにして改変し、樹状細胞への感染および／または樹状細胞上に発現している受容体への結合を増大させることができる。ウイルス粒子を作るのに用いるアデノウイルス・ベクターは、他の改変も含むことができる。改変としては、アデノウイルス・ベクターを作るため、粒子の中にパッケージングされているアデノウイルスのゲノムに対する改変がある。すでに説明したように、多彩な改変がなされたアデノウイルス・ベクターとアデノウイルス粒子が利用できる。アデノウイルス・ベクターに対する改変としては、従来技術で知られている欠損（例えばE1コード領域、E2aコード領域、E2bコード領域、E3コード領域、E4コード領域のうちの1つ以上における欠損）がある。このようなアデノウイルスは初期世代アデノウイルスと呼ばれることがあり、具体例として、アデノウイルスのゲノムのコード領域がすべて欠損したもの（すでに説明した“中身のない”アデノウイルス）や、条件付き複製アデノウイルスなどがある。後者は、複製に不可欠なアデノウイルス遺伝子が異種プロモータの制御下に置かれているため、所定の細胞または組織で複製されるが、他のタイプの細胞または組織では複製されないウイルスである（すでに説明した；アメリカ合衆国特許第5,998,205号、第5,801,029号、アメリカ合衆国特許出願第60/348,670号とそれに対応する公開国際PCT出願WO 02/06786も参照のこと）。このようなウイルスとして、細胞溶解性、細胞傷害性ウイルス（またはベクター）があり、その中には、すでに説明した腫瘍溶解性ウイルスが含まれる。
あるいはベクターは、すでに説明したように、E1b遺伝子の中に突然変異または欠損を含むことができる。一般に、E1b遺伝子におけるこのような突然変異または欠損により、E1b-19kDタンパク質が機能しなくなる。E1b領域のこの変化に、E3領域の全体または一部が存在しているベクターを組み合わせることができる。
H．製剤と投与
1．製剤
治療用遺伝子産物を標的細胞および／または組織（すなわち樹状細胞）に送達するための組み換えアデノウイルス送達ベクターを治療に有効な濃度で含む組成物。投与経路としては、筋肉内、非経口、局所のほか、樹状細胞を標的にできる他の経路などがある。
組み換えウイルス組成物は、徐放製剤（例えばコラーゲン製のスポンジなどの吸着支持体や、生物分解可能な支持体）またはリポソームの形態にすることもできる。徐放製剤は、複数回投与の形態にすることができる。すると選択した期間（例えば1ヶ月から約1年まで）を通じて何回か投与が行なわれる。そこで例えばリポソームを調製し、1回の注射で1回分の用量を投与することを合計で約2回〜約5回以上にわたって行なう。ベクターは、薬理学的に許容可能な基剤の中に入れて製剤化する。
組成物は、投与したときに十分な量のウイルス粒子が供給される量を殺菌バイアルに入れて封印したものを提供することができる。この場合、1μlに少なくとも約107または108プラーク形成単位（pfu）が含まれた約50〜150μlを与えることで、少なくとも109〜1010pfuを供給する。
組成物を調製するためには、ウイルス粒子を適切な基剤の中に透析すること、あるいはウイルス粒子を濃縮物および／または基剤と混合することができる。得られる混合物は、溶液、懸濁液、エマルジョンのいずれかである。さらに、ウイルス粒子は、組成物中の薬理学的に活性な唯一の成分として製剤化すること、あるいは治療する特定の疾患用の他の活性剤と組み合わせることができる。
適切な基剤としては、生理食塩水、リン酸緩衝液（PBS）、平衡塩類溶液（BSS）、乳酸リンゲル液、増粘剤と可溶剤（例えばグルコース、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ならびにこれらの混合物）を含む溶液などがある。リポソーム懸濁液も、薬理学的に許容可能な基剤として適切である可能性がある。これらは、当業者に知られている方法で調製することができる。
組成物は、その組成物が身体から急速に排出されないように保護する基剤とともに製剤化し、例えば徐放製剤またはコーティング剤にすることができる。そのような基剤としては、徐放製剤（例えばマイクロカプセル封入送達系）や生物分解性、生体適合性ポリマー（例えばエチレン酢酸ビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、ポリオルトエステル、ポリ酢酸、ならびに体内に直接留置することのできる他のタイプのインプラント）などがある。組成物は、ペレット（例えばエルヴァックス・ペレット（エチレン-酢酸ビニル・コポリマー樹脂））の形態で投与することもできる。
リポソーム懸濁液（例えば組織を標的とするリポソーム）は、薬理学的に許容可能な基剤としても適している。例えばリポソーム製剤は、当業者に知られている方法で調製することができる（Kimm他、1983年、Bioch. Bioph. Acta、第728巻、339〜398ページ；Assil他、1987年、Arch. Ophthalmol.、第105巻、400ページ；アメリカ合衆国特許第4,522,811号を参照のこと）。ウイルス粒子は、リポソーム系の水相に封入することができる。
活性材料は、望む作用を損なわない他の活性材料と混合すること、または望む作用を補足したり他の作用を持っていたりする材料（例えば粘弾性材料であるヒアルロン酸（ヒアルロン酸ナトリウムが約300万分画という高分子量（MW）溶液が商標名HEALONとして市販されている。ファルマシア社が製造；例えばアメリカ合衆国特許第5,292,362号、第5,282,851号、第5,273,056号、第5,229,127号、第4,517,295号、第4,328,803号を参照のこと））と混合することもできる。追加の活性剤も含めることができる。
組成物は、アンプルや使い捨て注射器、あるいはガラス、プラスチック、または他の適切な材料でできた1回または複数回用量のバイアルに封入することができる。このように封入された組成物は、キットで提供することができる。特に、バイアル、アンプル、あるいは他の容器を含むキットが提供される。
最後に、ベクターをパッケージングし、パッケージング材料（一般にはバイアル）と、ウイルス粒子を含む薬理学的に許容可能な組成物と、この組成物が治療用であることを示すラベルとを含む商品にすることができる。
この明細書に記載した方法を実施するためのキットも提供される。このキットは、1種類以上の容器（例えば封印したバイアル）と、1回分の用量として十分な組成物と、必要に応じて他の試薬と、場合によっては使用指示書とを含んでいる。
組成物の投与は、一般に静脈内注射または筋肉内注射によるが、他の投与方法も有効である可能性がある。
2．投与
化合物を含む組成物は一般に全身に投与される。特定の対象のため、個人の必要と、組み換えウイルスを投与したり組み換えウイルスの投与を管理したりする医師の判断とに応じ、特別な投与計画を立てる必要があること、また、この明細書で設定した濃度範囲は単なる例示であり、それがこの明細書の方法、用途、産物の範囲や取り扱いを制限するものではないことがさらに理解できよう。
この明細書で提供するウイルス粒子は、生体内投与に加え、生体外療法で使用することもできる。この生体外療法では、樹状細胞を含むか樹状細胞を豊富にした細胞混合物（例えば骨髄細胞）をウイルス粒子と接触させ、樹状細胞に選択的に感染させる。得られる細胞は、場合によっては試験管内で培養した後、対象となるレシピエント（一般にはドナー）に輸液する。
I．疾患、異常、治療用産物
この明細書に提示したアデノウイルス粒子で改変した樹状細胞は、提示可能な異種タンパク質、または樹状細胞の機能を変化させることのできる異種タンパク質を発現する。すでに指摘したように、アデノウイルス粒子は、対象に投与すること、またはドナーから得た樹状細胞と生体外で接触させた後、対象（一般にドナー）に輸液することができる。樹状細胞を標的としたファイバーを発現するウイルス粒子は、選択的に樹状細胞に感染することになる。特定の抗原を発現するように改変した樹状細胞は、提示された抗原に対する免疫応答を促進することにより、ワクチンとして機能する。この細胞は、ほとんどあらゆる細菌、原生動物、寄生虫、真菌の感染や、これら以外の感染症の治療または予防に用いることができる。さらに、腫瘍抗原の提示により、そのような細胞が、がんの治療または予防に効果を持つようになる。
樹状細胞の機能を妨げる産物が発現して例えば遺伝子（例えばNKκBやRe1Bをコードしている遺伝子）の発現が阻止されることにより、樹状細胞がT細胞を刺激できなくなる。このような粒子や得られる細胞を用い、喘息、アレルギー、自己免疫疾患（例えば若年性糖尿病、関節リウマチ、ループス）、炎症疾患などの疾患を治療することができる。
病原体としては、細菌（例えば大腸菌、炭疸菌）、ウイルス（例えばワクシニアウイルス（すなわち天然痘、水痘）、ヘルペスウイルス、サイトメガロウイルス（CMV）、パピローマウイルス）、寄生虫、真菌などがある。選択した抗原は、モデル系（例えば囓歯類モデル）で免疫防御応答を発生させるのに有効な抗原を同定することにより、経験的に決めることができる。
粒子を用いた生体内または生体外の治療は、予防でも、疾患の治療でもよい。予防の場合には、投与（ワクチン接種）によって免疫が発生する。
J．実施例
以下の実施例は、単に説明のために含まれているのであり、本発明の範囲がその実施例に制限されることは意図していない。
ファイバーのABループのKO1突然変異と、ペントンのPD1突然変異を含むAd5ベクターとその誘導体の構成
ファイバーのKO1突然変異またはペントン・ベースのPD1突然変異を単独で、または組み合わせで含む3種類の組み換えアデノウイルス・ベクターを調製した。これらのベクターは、Av3nBgFKO1、Av1nBgPD1、Av1nBgFKO1PD1と名づけた。これらベクター構造体について以下に説明する。各ベクターの一般的な説明は表1に示してある。
Figure 2007525166
Av1nBg
これはよく知られたベクターであり、その配列を配列ID番号51に示す。
Av3nBg
これはよく知られたベクターであり、その配列を配列ID番号52に示す。
Av3nBgFKO1
KO1ファイバー突然変異を遺伝子に組み込んでAv3nBgFKO1を作る
アデノウイルス血清型5のゲノムに基づき、E1、E2a、E3が欠損した骨格の中でアデノウイルス・ベクターAv3nBgFKO1を作った。このベクターは、E1領域の代わりに、核に局在していてRSVをプロモータとするβ-ガラクトシダーゼ遺伝子を含んでいる。さらに、ファイバー遺伝子がKO1突然変異を含んでいる。この突然変異により、ファイバーのアミノ酸408と409が置換され、それぞれセリンとプロリンからグルタミン酸とアラニンになる。
ベクターを以下のようにして構成した。まず最初に、プラスミドpSKO1（図1）を制限酵素SphIとMunIで消化させた。得られたDNA断片をアガロース・ゲル上の電気泳動で分離した。ファイバー遺伝子の5'末端を除くすべてを含む1601bpの断片をアガロース・ゲルから切除し、DNAを単離して精製した。次にこの断片を、SphIとMunIで消化させておいたp5FloxHRFRGDの9236bpの断片と連結させた。得られたプラスミドp5FloxHRFKO1をSphIとPacIで消化させ、ファイバー遺伝子を含む6867bpの断片を単離した。この断片を、pNDSQ3.1の24,630bpのSphI-PacI断片と連結させた。得られたプラスミドpNDSQ3.1KO1（図2）をpAdmireRSVnBg（図3A）とともに用い、完全長アデノウイルス・ベクターのゲノムをコードしているプラスミドを作った。しかしpAdmireRSVnBg（図3A）を用いた組み換えを行なう前にpNDSQ3.1KO1（図2）からPacI部位を除去し、最終的なプラスミドが、5'ITRに隣接する単一のPacI部位を含むようにする必要があった。pNDSQ3.1KO1に存在するPacI部位をPacIを用いた消化により除去した後、T4 DNAポリメラーゼを用いた平滑化と再連結を行なった。得られたプラスミドをpNDSQ3.1KO1ΔPac.と名づけた。
アデノウイルスの全ゲノムを含む完全長プラスミドを作るため、pAdmireRSVnBg（図3A）をSalIで消化させ、大腸菌株BJ5183のコンピテント細胞に、BstBIで消化させておいたpNDSQ3.1KO1ΔPacと同時にトランスフェクトした。2つのプラスミドの間での相同的組み換えにより、アデノウイルス・ベクターの全ゲノムをコードしている完全長プラスミドを作り、それをpFLAv3nBgFKO1と名づけた。
プラスミドpFLAv3nBgFKO1をPacIを用いて線状化し、633細胞にトランスフェクトした。ファイバーを補足する633細胞系において、得られるKO1突然変異含有ウイルスDNAは、野生型ファイバー・タンパク質と突然変異ファイバー・タンパク質の混合物を含む感染性ウイルス粒子の中にパッケージングすることができる。633細胞の中で5回増幅を行なった後、細胞傷害効果を観察した。633細胞の中でさらに3回増幅を行なった後、標準的なCsCl遠心分離手続きによってウイルスを精製した。このウイルス調製物をAE1-2a細胞に感染させると、この細胞はファイバーを発現しない。得られるウイルスは、キャプシドに突然変異ファイバー・タンパク質しか含んでいなかった。ウイルス粒子は、標準的なCsCl遠心分離手続きによって精製した。
Av1nBgFKO1
上記のAv3nBgFKO1と同様にしてベクターAv1nBgFKO1を作る。
Av1nBgFKO12
ファイバーのさらに別のABループ突然変異（Einfeld他、2001年、J. Virology、第75巻、11284〜11291ページ）をAv1nBgのゲノムに組み込んだ。このABループ突然変異は、R512S、A515G、E516G、K517Gという4個のアミノ酸置換であり、KO12と呼ばれる。KO12突然変異は、プラスミドpSQ1（図3B）を鋳型として使用し、PCR遺伝子重複伸長によってファイバー遺伝子に組み込んだ。プラスミドpSQ1は、Ad5のゲノムの大部分を含んでおり、pBR322骨格中を塩基対3329から右側ITRまで延びている。まず最初に、プラスミドpSQ1を鋳型として使用し、Ad5のゲノムでE3領域の中からファイバー遺伝子の中へと延びているセグメントをPCRで増幅した。用いたプライマーは、5FFというプライマー：5'-GAA CAG GAG GTG AGC TTA GA-3'（配列ID番号53）と、5FRというプライマー：5'-TCC GCC TCC ATT TAG TGA ACA GTT AGG AGA TGG AGC TGG TGT G-3'（配列ID番号54）である。プライマー5FRは、改変ファイバーABループのアミノ酸512〜517をコードしている18塩基の5'延長部を含んでいる。pSQ1を鋳型として用いた2回目のPCRにより、 ABループ置換のすぐ3'側にあって、ファイバー遺伝子終止コドンから40塩基対だけ3'側に位置するMunI部位を超えて延びる領域を増幅した。この反応で用いた2つのプライマーは、3FF：5'-TCA CTA AAT GGA GGC GGA GAT GCT AAA CTC ACT TTG GTC TTA AC-3'（配列ID番号55）と、3FR：5'-GTG GCA GGT TGA ATA CTA GG-3'（配列ID番号56）であった。プライマー3FRは、改変ファイバーABループのアミノ酸512〜517をコードしている18塩基の5'延長部を含んでいる。予想されたサイズの増幅産物が得られ、それを末端プライマー5FFおよび3FRとともに2回目のPCRで使用して、断片同士を接合した。KO12のPCR断片をXbalとMunIで消化させてクローニングし、ファイバー・シャトル・プラスミドpFBshuttle(EcoRI)に直接入れてプラスミドpFBSEKO12を作った。このpFBSEKO12は、pSQ1の8.8kBのEcoRI断片を含んでいる。プラスミドpFBSEKO12をXbalとEcoRIで消化させてクローニングし、三者連結を利用してpSQ1に入れてpSQ1KO12（図3C）を作った。ClaIで線状化したpSQ1KO12と、SalIとPacIで消化させたpAdmireRSVnBgの間の相同的組み換えによってKO12のcDNAをAv1nBg（E1とE3が欠損したアデノウイルス・ベクターであり、β-ガラクトシダーゼをコードしている）のゲノムに組み込み、Av1nBgKO12を作った。このKO12ベクターを633細胞にトランスフェクトし、非ファイバー発現細胞上でスケール・アップし、精製するという操作を、上にKO1について説明したようにして行なった。
Av1nBgPD1
ペントンPD1突然変異を遺伝子に組み込んでAv1nBgPD1を作る
アデノウイルス・ベクターAv1nBgPD1は、アデノウイルス血清型5のゲノムに基づいた、E1とE3が欠損したベクターである。このベクターは、核に局在していてRSVをプロモータとするβ-ガラクトシダーゼ遺伝子をE1領域に含んでおり、ペントン遺伝子の中にPD1突然変異も含んでいる。PD1突然変異により、ペントン・タンパク質のアミノ酸337〜344に位置するHAIRGDTF（配列ID番号49）が、アミノ酸SRGYPYDVPDYAGTS（配列ID番号50）で置換されるため、RGDトリペプチドが置換される（Einfeld他、2001年、J. Virology、第75巻、11284〜11291ページを参照のこと）。ペントン遺伝子中のこの突然変異は、アデノウイルス血清型5のペントン遺伝子を含むプラスミドpGEMpen5の中に発生させた。突然変異を起こさせるため、4種類のオリゴヌクレオチドを合成した。これらオリゴヌクレオチドの配列は以下の通りであった。ペントン1：5'-CGC GGA AGA GAA CTC CAA CGC GGC AGC CGC GGC AAT GCA GCC GGT GGA GGA CAT GAA-3'（配列ID番号57）；ペントン2：5'-TAT CGT TCA TGT CCT CCA CCG GCT GCA TTG CCG CGG CTG CCG CGT TGG AGT TCT CTT CC-3'（配列ID番号58）；ペントン3：5'-CGA TAG CCG CGG CTA CCC CTA CGA CGT GCC CGA CTA CGC GGG CAC CAG CGC CAC ACG GGC TGA GGA GAA GCG CGC-3'（配列ID番号59）；ペントン4：5'-TCA GCG CGC TTC TCC TCA GCC CGT GTG GCG CTG GTG CCC GCG TAG TCG GGC ACG TCG TAG GGG TAG CCG CGG C-3'（配列ID番号60）。相補的なオリゴヌクレオチド・ペントン1とペントン2を互いにアニールし、ペントン3とペントン4も同様にした。ペントン3とペントン4のアニーリングによって生まれる二本鎖は、上記のアミノ酸337〜344の置換をコードしていた。ペントン1とペントン2のアニーリングによって生まれる二本鎖は、5塩基からなる5'張出部を備えていた。この張出部は、ペントン3とペントン4のアニーリングによって生まれる二本鎖の5塩基からなる5'張出部と適合性があった。ペントン1とペントン2のアニーリングによって生まれる二本鎖の反対側の端部は、適合性のあるEarI張出部を含んでいた。ペントン3とペントン4のアニーリングによって生まれる二本鎖の反対側の端部は、適合性のあるBbvCI張出部を含んでいた。2つの二本鎖を互いに連結し、以下のようにしてpGEMpen5骨格に再び連結させる。まず最初に、pGEMpen5をBbcCIとPstIで消化させ、得られたDNA断片をアガロース・ゲル上の電気泳動で分離した。3360bpの断片をゲルから切り出して精製した。プラスミドpGEMpen5はPstIとEarIでも消化させ、得られた断片をアガロース・ゲル上の電気泳動で分離した。955bpの断片をゲルから切り出して精製した。プラスミドpGEMpen5からのこれら2つの断片を、アニールしたオリゴヌクレオチドの2つのペアと連結させ、プラスミドpGEMpen5PD1を作った。
五者間連結を利用し、突然変異したペントン遺伝子をpGEMpen5PD1からpSQ1に以下のようにして移した。まず最初に、PvuIとAscIで消化させることにより、ペントン遺伝子でPD1突然変異を含む領域をpGEMpen5PD1から切り出した。PD1突然変異を含む974bpの断片を精製した。4つのDNA断片をプラスミドpSQ1（図3B）から以下のようにして調製した。このプラスミドをCsp45IとFseIで消化させ、9465bpの断片を精製した。さらに、pSQ1をFseIとPvuIで消化させ、2126bpの断片を精製した。プラスミドpSQ1をAscIとBamHIで消化させ、5891bpの断片を精製した。最後に、pSQ1をBamHIとCsp45Iで消化させ、14610bpの断片を精製した。精製したこれら5つのDNA断片を互いに連結させ、プラスミドpSQ1PD1（図4）を形成した。
アデノウイルス・ベクターを作るため、ClaIで消化させることによってpSQ1PD1を線状化し、SalIとPacIで消化させておいたpAdmireRSVnBg（図3A）と同時にトランスフェクトした。ヘキサジメトリンブロミドを培地内で4μg/mlに維持した。細胞傷害効果が観察されたとき、粗ウイルス・ライセートをPerC6細胞上でさらに増殖させた。ウイルスを標準的なCsCl遠心分離法で精製した。
Av1nBgFKO1PD1
ファイバーのKO1突然変異またはKO12突然変異と、ペントンのPD1突然変異を組み合わせて遺伝子に組み込み、Av1nBgFKO1PD1を作る
E1とE3が欠損したアデノウイルス血清型5ゲノムの中でアデノウイルス・ベクターAv1nBgFKO1PD1とAv1nBgFKO12PD1を作った。どちらのベクターも、核に局在していてRSVをプロモータとするβ-ガラクトシダーゼ遺伝子をE1領域に含んでおり、ファイバー遺伝子の中にKO1突然変異またはKO12突然変異を含むとともに、ペントン遺伝子の中にPD1突然変異も含んでいる。これらのベクターは以下のようにして構成した。まず最初に、プラスミドpSQ1PD1をCsp45IとSpeIで消化させ、PD1突然変異のあるペントン遺伝子を含む23976bpの断片を精製した。さらに、プラスミドpSQ1KO1またはpSQ1KO12（図3B）をCsp45IとSpeIで消化させ、KO1突然変異またはKO12突然変異のあるファイバー遺伝子を含む9090bpの断片を精製した。適切な精製がなされたこれら断片を互いに連結させ、KO1（またはKO12）突然変異のあるファイバー遺伝子と、PD1突然変異のあるペントン遺伝子とを含むプラスミドpSQ1FKO1PD1（図5A）またはpSQ1KO12PD1（図5B）を形成した。ウイルスを作るため、pSQ1FKO1PD1またはpSQ1KO12PD1をClaIで線状化し、SalIとPacIで消化させておいたpAdmireRSVnBg（図3A）と同時にトランスフェクトした。633細胞の中で3回増幅した後、細胞傷害効果を観察し、次いで粗ウイルス・ライセートをPerC6細胞上で増幅した。ヘキサジメトリンブロミドを培地内で4μg/mlに維持した。各ウイルスを標準的なCsCl遠心分離法で精製した。
KO1突然変異とPD1突然変異を含むアデノウイルス・ベクターの試験管内における評価
いくつかの組み換えアデノウイルス・ベクターをこの研究で使用し、ファイバーのKO1突然変異の機能を明らかにした。このベクターは、上記のAv1nBg、Av1nBgFKO1、Av1nBgPD1、Av1nBgFKO1PD1を含んでいた。KO1突然変異および／またはPD1突然変異を含むアデノウイルス・ベクターの形質導入効率を、肺胞上皮細胞系A549の細胞で評価した。形質導入効率を、野生型のファイバーとペントンを含むアデノウイルス・ベクターAv1nBgの場合と比較した。
感染させる前日、細胞を24ウエルのプレートに、ウエル1つにつき約1×105個の細胞となる密度で入れた。感染の直前、代表的な1つのウエルの細胞を数えることにより、ウエル1つ当たりの細胞の正確な数を調べた。それぞれのベクターAv1nBg、Av1nBgFKO1、Av1nBgFKO1PD1を用いてA549細胞に形質導入を行なった。そのときの細胞1個当たりの粒子の比（PPC）は、それぞれ100、500、1000、2500、5000、10,000にした。感染24時間後に単層細胞をX-galで染色し、β-ガラクトシダーゼを発現している細胞の割合を、顕微鏡で観察して細胞を数えることによって明らかにした。形質導入は3回行ない、各ウエルのランダムな3つの領域でカウントした。したがって合計でベクター1つにつき9つの領域のカウントを行なった。
PPC比が500のときの結果を図6に示してある。この図から、KO1突然変異だけを含むベクターを用いるか、PD1突然変異と組み合わせたときには、Av1nBgと比べてA549細胞への形質導入効率が有意に低下していることがわかる。PD1突然変異だけを含むベクターは、試験管内でのA549細胞へのアデノウイルス形質導入に効果を及ぼさなかった。
KO1突然変異とPD1突然変異を含むアデノウイルス・ベクターの生体内における評価
この実施例では、KO1突然変異とPD1突然変異を含むアデノウイルス・ベクターの生体内分布と、そのアデノウイルス・ベクターがアデノウイルスを媒介とした肝臓への形質導入に及ぼす効果を評価する実験結果を示す。結果から、CARおよび／またはインテグリンとウイルスの相互作用が消えることは、アデノウイルス・ベクターが肝臓をまったく標的としなくなるのに十分ではないことがわかる。
正の対照コホートはAv1nBgを受け取り、負の対照コホートはHBSSを受け取った。さらに、ベクターAv1nBgFKO12とAv1nBgFKO12PD1を生体内で分析した。これらベクターは、ABループに4個のアミノ酸置換を有するファイバー・タンパク質をそれぞれ含んでいる。さらに、Av1nBgFKO12PD1は、ペントン・ベースに突然変異を1つ含んでいる。これら突然変異のどちらも公知であり（Einfeld他、2001年、J. Virology、第75巻、11284〜11291ページ）、それぞれ肝臓への形質導入を1/10〜1/700にするとされている。5匹のC57BL/6マウスからなるコホートに、尾の静脈への注射を通じて各ベクターを、体重1kg当たり1×1013粒子となる投与量で与えた。ベクターの投与から約72時間後に二酸化炭素で窒息させてマウスを安楽死させた。肝臓、心臓、肺、脾臓、腎臓を各マウスから回収した。β-ガラクトシダーゼの免疫組織化学分析のため、肝臓の中葉を中性緩衝ホルマリンの中に入れてサンプルを保管した。さらに、各器官からの組織を凍結して保管し、ヘキソンのPCR分析を行なってベクターの含有量を調べた。各マウスからの肝臓の別のサンプルを凍結して保管し、化学発光β-ガラクトシダーゼ活性アッセイを行なった。
β-ガラクトシダーゼの免疫組織化学分析を行なうため、約2〜3mmの厚さにした肝臓の切片を10％中性緩衝ホルマリンの中に入れた。サンプルを固定した後、パラフィンに包埋し、切断し、β-ガラクトシダーゼの発現を免疫組織化学分析した。ウサギ抗β-ガラクトシダーゼ抗体（ICNファーマシューティカルズ社、コスタ・メサ、カリフォルニア州）を1200倍に希釈したものをベクタステインABCキット（ベクター・ラボラトリーズ社、バーリンゲーム、カリフォルニア州）と組み合わせ、反応がプラスの細胞を可視化した。
ガラクト-ライト・プラスTM化学発光アッセイ（トロピックス社、フォスター・シティ、カリフォルニア州）系を使用し、化学発光β-ガラクトシダーゼ活性アッセイを行なった。組織サンプルを、セラミック球（ビオ101社、カールスバッド、カリフォルニア州）を2個入れた溶解マトリックス・チューブの中に回収し、氷の上で凍結させた。組織を解凍し、ガラクト-ライト・プラス・キットからの溶解緩衝液500μlを各試験管に添加した。ファーストプレップ・システム（バイオ101社、カールスバッド、カリフォルニア州）を利用し、組織を30秒間にわたって均質化した。肝臓サンプルをさらに30秒間にわたって均質化した。製造者のプロトコルに従い、肝臓ホモジェネートにおけるβ-ガラクトシダーゼの活性を調べた。
ヘキソンのPCR分析を行なうため、キアジェン血液・細胞培養DNAミディ・キットまたはミニ・キット（キアジェン社、チャッツワース、カリフォルニア州）を利用し、組織からDNAを単離した。凍結した組織を部分的に解凍し、使い捨て殺菌スカルペルを用いて細片にした。次に、0.2mg/mlのRNアーゼAと0.1mg/mlのプロテアーゼを含むキアジェン緩衝液G2の中で55℃にて一晩にわたってインキュベートすることにより、組織を溶解させた。ライセートを短時間撹拌した後、キアジェン-ティップ100または、キアジェン-ティップ25というカラムに装填した。製造者の指示書に記載されているようにしてカラムを洗浄し、DNAを溶離させた。沈澱後、DNAを水に溶かし、濃縮物をDU-600（ベックマン・コールター社、フラートン、カリフォルニア州）またはスペクトラマックス・プラス（モレキュラー・デバイシーズ社、サニーヴェイル、カリフォルニア州）スペクトロメータ2.3.2で分光測光した（A260とA280）。
プライマー・エクスプレス・ソフトウエア（バージョン1.0）（アプライド・バイオシステムズ社、フォスター・シティ、カリフォルニア州）を利用し、アデノウイルスのヘキソン配列に対して特異的なPCRプライマーとタックマン・プローブを設計した。プライマーとプローブの配列は以下の通りであった。
ヘキソン順プライマー（配列ID番号61）：5'-CTTCGATGATGCCGCAGTG-3'
ヘキソン逆プライマー（配列ID番号62）：5'-GGGCTCAGGTACTCCGAGG-3'
ヘキソン・プローブ（配列ID番号63）：5'-FAM-TTACATGCACATCTCGGGCCAGGAC-TAMRA-3'
反応体積50μlの中で増幅させた。そのときの条件は以下の通りである：DNAサンプル10ng（腫瘍）または1μg（肝臓と肺）、1×タックマン・ユニバーサルPCRマスター・ミックス（アプライド・バイオシステムズ社）、600nMの順プライマー、900nMの逆プライマー、100nMのヘキソン・プローブ。熱サイクルの条件は、50℃にて2分間インキュベーション、95℃にて10分間インキュベーション、その後、95℃にて15秒間、60℃にて1分間という連続インキュベーションを35サイクルである。データを回収し、7700配列検出システム・ソフトウエア（バージョン1.6.3）（アプライド・バイオシステムズ社）を用いて分析した。細胞ゲノムDNAの適切なバックグラウンドの中にアデノウイルスのDNAを1,500,000コピー〜15コピーにしたいろいろな希釈液を含む標準的な曲線を利用し、アデノウイルスのコピー数の定量を行なった。腫瘍組織を分析するため、10ngのヒトDNAというバックグラウンドの中で標準曲線を得た。マウスの肝臓組織と肺組織を分析するため、1μgのCD-1マウス・ゲノムDNAというバックグラウンドの中で同じアデノウイルスのDNA希釈液を用いて標準曲線を得た。サンプルを増幅して3通り用意した後、入れたDNAの重量と6×109bpというゲノム・サイズとに基づき、全コピーの平均数を細胞1個当たりのコピー数に規格化した。
β-ガラクトシダーゼ活性アッセイの結果と、肝臓への形質導入に用いるアデノウイルス・ベクターのヘキソンDNA含有量の結果を図7Aと図7Bに示してある。KO1突然変異またはKO12突然変異だけを含むベクターは、平均として、Av1nBgと比べて肝臓への形質導入がわずかな増加を示した。これは、以前のいくつかの実験と一致している。PD1突然変異を単独で、あるいはKO1突然変異またはKO12突然変異と組み合わせて含むベクターは、Av1nBgと比べて肝臓への形質導入がわずかに低下した。これは、肝臓へのアデノウイルス・ベクターの取り込みにインテグリンがある程度関係していることを示唆している。
β-ガラクトシダーゼを調べるために肝臓切片を免疫組織化学染色した結果は、活性アッセイの結果（データは示さない）と一致しており、遺伝子の発現が特に肝細胞に局在していることを示している。KO1突然変異またはKO12突然変異だけを含むベクターは、肝臓への形質導入がわずかに増加した。そのことは、免疫組織化学染色パターンがより強くて頻度が多くなっていることからわかる。PD1突然変異を単独で、あるいはKO1突然変異またはKO12突然変異と組み合わせて含むベクターは、Av1nBgと比べて形質導入にほとんど違いが見られなかった。これらの結果は、ウイルスとCARおよび／またはインテグリンの相互作用が消えることは、アデノウイルス・ベクターが肝臓をまたく標的としなくなるのに十分ではないことを示している。
要約すると、Av1nBgFKO1またはAv1nBgKO12に含まれるファイバーのABループ突然変異によって試験管内におけるヒトおよびマウスのCARとの相互作用が消え、試験管内での形質導入が減少する。しかし生体内では、ファイバーのABループ突然変異は予想外の振る舞いをした。なぜなら、このような突然変異が、アデノウイルスを媒介とした肝臓への遺伝子導入を増やすことが見いだされ、その結果としてベクターの能力が増大するからである。アデノウイルスの内部化に関与する第2の受容体との相互作用を消すペントン・ベースのPD1突然変異は、試験管内での影響はなく、生体内での影響もほとんどなかった。この研究から、生体内では、アデノウイルス遺伝子の肝臓への導入に他の受容体が重要であることがわかった。
ファイバーのシャフトにあるヘパラン硫酸結合ドメインにアミノ酸置換を有するAファイバーを含むアデノウイルス・ベクターの説明
Ad5ファイバーのシャフトに含まれる4個のアミノ酸からなるモチーフ（残基91〜94、KKTK；配列ID番号45）の4つすべてに置換を含むベクターを作り、HSPと相互作用する能力が消えるようにした。この突然変異をHSPと名づける。なぜならこの突然変異は、ヘパラン硫酸プロテオグリカンへの結合がなくなる可能性があるからである。HSP突然変異だけを含むベクターと、HSP突然変異にKO1突然変異（ファイバーのノブのABループ突然変異であり、CARと結合しなくする）を組み合わせたベクターと、HSP突然変異にPD1突然変異（ペントンの突然変異であり、RGD／インテグリン相互作用をなくす）を組み合わせたベクターと、三重ノックアウト・ベクター（HSP、KO1、PD1）を作った。
HSPファイバー突然変異の生成：重複伸長による遺伝子のスプライシングというPCRに基づいた方法（PCR SOEイング）を利用し、HSP突然変異をファイバー遺伝子に組み込んだ。まず最初に、鋳型としてのプラスミドpSQ1（図3B）と、5FFおよび5HSPRと名づけたプライマーとを用い、Ad5のゲノムでE3領域の中からファイバー遺伝子の5'末端中へと延びているセグメントをPCRで増幅した。5FFのDNA配列は、5'-GAA CAG GAG GTG AGC TTA GA-3'（配列ID番号53）である。この配列は、pSQ1の塩基対25,199〜25,218に対応している。5HSPRのDNA配列は、5'-GGC TCC GGC TCC GAG AGG TGG GCT CAC AGT GGT TAC ATT T-3'（配列ID番号64）である。5HSPRは5FFの逆プライマーであり、ファイバーのシャフト内でKKTK（配列ID番号45）領域に隣接する領域に対応している。このプライマーは、（配列ID番号45によってコードされている）元のKKTKアミノ酸配列に対するGAGA置換をコードしている5'延長部を含んでいる。pSQ1を鋳型として用いた2回目のPCRにより、KKTK（配列ID番号45）部位のすぐ3'側にあって、ファイバー遺伝子終止コドンから40塩基対だけ3'側に位置するMunI部位を超えて延びる領域を増幅した。この反応で用いた2つのプライマーは、3HSPFと3FRであった。3HSPFのDNA配列は、5'-GGA GCC GGA GCC TCA AAC ATA AAC CTG GAA AT-3'（配列ID番号16）である。この配列は、5HSPRの5'延長部と相補的な5'延長部を含んでいる。3FRのDNA配列は、5'-GTG GCA GGT TGA ATA CTA GG-3'（配列ID番号56）である。
プライマー5FFと3FRを用いたPCR SOEイングにより、2つのPCR産物を接合した。得られたPCR産物を制限酵素XbaIとMunIで消化させた。2355bpの断片をゲル精製し、プラスミドpFBshuttle(EcoRI)（図8）のXbaIからMunIまでの6477bpの断片と連結させ、プラスミドpFBSEHSPを作った。プラスミドpFBshuttle(EcoRI)は、プラスミドpSQ1をEcoRIで消化させた後、ゲル精製し、ファイバー遺伝子を含む8.8kbの断片を自己連結させることによって作った。次に、三者間連結を利用し、HSP突然変異を含むファイバー遺伝子をpFBSEHSPからpSQ1に移した。pSQ1のEcoRIからNdeIまでの16,431bpの断片と、pSQ1のNdeIからXbaIまでの9043bpの断片と、pFBSEHSPのXbaIからEcoRIまでの7571bpの断片とを単離し、連結させてpSQ1HSP（図9）を作った。
ファイバー遺伝子にHSP突然変異を含む組み換えアデノウイルス・ベクターを作るため、pSQ1HSPをClaIで消化させ、pAdmireRSVnBg（図3A）をSalIとPacIで消化させた後、消化させた2つのプラスミドを633細胞（von Seggern他、2000年、J. Virology、第74巻、354〜362ページ）に同時にトランスフェクトした。2つのプラスミド間の相同的組み換えにより、633細胞中での複製が可能な完全長アデノウイルス・ゲノムを作った。633細胞は、Ad5 E1Aを誘導的に発現し、野生型ファイバー・タンパク質を構成的に発現する。633細胞上での増殖後、ウイルスのキャプシドは、野生型ファイバー・タンパク質と突然変異したファイバー・タンパク質を含んでいた。HSP突然変異を有する改変ファイバーだけを含むウイルス粒子を得るため、ウイルス調製物を用い、ファイバーを発現しないPerC6細胞に感染させた。得られたウイルス（Av1nBgFS*と呼ぶ）を標準的なCsCl遠心分離手続きで精製した。
HSP突然変異とKO1突然変異を含むベクターの作製
ファイバーにHSP突然変異とKO1突然変異を含むアデノウイルス・ベクターを作るため、プラスミドpSQ1FK01を鋳型として使用した以外は、上に説明したのと同じPCR SOEイング法を利用した。PCR SOEイングの産物をXbaIとMunIで消化させ、pFBshuttle(EcoRI)のXbaIからMunIへの6477bpの断片と連結させてpFBSEHSPKO1を作った。HSP突然変異だけがある場合について上に説明した三者間連結法を利用し、HSP突然変異とKO1突然変異を含むファイバー遺伝子をpFBSEHSPKO1からpSQ1骨格に移してプラスミドpSQ1HSPKO1を作った（図10）。ClaIで消化させたpSQ1HSPKO1と、SalIおよびPacIで消化させたpAdmireRSVnBgを同時にトランスフェクトすることにより、ファイバー遺伝子にHSP突然変異とKO1突然変異を含む組み換えアデノウイルス・ベクターを作った。HSP突然変異だけを含むベクターについて上で説明したようにして、アデノウイルスを増殖させて精製した。得られたウイルスをAv1nBgFKO1S*と名づけた。
HSP突然変異とPD1突然変異を含むベクターの作製
以下の方法を利用し、ファイバーHSP突然変異とペントンPD1突然変異を含む組み換えアデノウイルス・ベクターを作った。プラスミドpSQ1PD1（図4）を制限酵素Csp45IとSpeIで消化させ、23,976bpの断片を単離して精製した。さらに、プラスミドpSQ1HSPもCsp45IとSpeIで消化させ、9090bpの断片を単離して精製し、23,976bpの断片と連結させてプラスミドpSQ1HSPPD1（図11）を作った。このプラスミドpSQ1HSPPD1は、ファイバーHSP突然変異とペントンPD1突然変異を含んでいる。アデノウイルス・ベクターを作り、増殖させ、精製する操作を、上記のようにして実施した。得られたウイルスをAv1nBgS*PD1と名づけた。
HSP突然変異と、KO1突然変異と、PD1突然変異とを含むベクターの作製
HSP突然変異と、KO1突然変異と、PD1突然変異とを含むアデノウイルス・ベクターを作るため、以下の方法を用いた。まず最初に、プラスミドpSQ1PD1をCsp45IとSpeIで消化させ、23,976bpの断片を単離して精製した。さらに、プラスミドpSQ1HSPKO1をCsp45IとSpeIで消化させ、9090bpの断片を単離して精製した。これら2つのDNA断片を連結させ、プラスミドpSQ1HSPKO1PD1を形成した（図12）。上に説明したようにして組み換えアデノウイルス・ベクターを作り、増殖させ、精製した。得られたウイルスをAv1nBgFKO1S*PD1と名づけた。
HSPファイバー突然変異を含むアデノウイルス・ベクターの試験管内における評価
ファイバー遺伝子にHSP突然変異を単独で、あるいはKO1突然変異および／またはPD1突然変異と組み合わせて含むアデノウイルス・ベクターの形質導入効率を、A549細胞とヒーラ細胞で評価した。形質導入効率を、野生型のファイバーとペントンを含むAv1nBgの場合と比較した。感染させる前日、細胞を24ウエルのプレートに、ウエル1つにつき約1×105個の細胞となる密度で入れた。感染の直前、代表的な1つのウエルの細胞を数えることにより、ウエル1つ当たりの細胞の正確な数を調べた。それぞれのベクターAv1nBg（Stevenson他、1997年、J. Virology、第71巻、4782〜4790ページ）、Av1nBgS*、Av1nBgFKO1S*、Av1nBgS*PD1、Av1nBgFKO1S*PD1を用いてA549細胞に形質導入を行なった。そのときの細胞1個当たりの粒子の比（PPC）は、それぞれ100、500、1000、2500、5000、10,000にした。ヒーラ細胞への形質導入を、上記の各ベクターと、KO1突然変異だけを含むベクター（Av1nBgFKO1）と、PD1突然変異だけを含むベクター（Av1nBgPD1）とを用いて行なった。そのときのPPCは2000である。感染24時間後に単層細胞をX-galで染色し、β-ガラクトシダーゼを発現している細胞の割合を、顕微鏡で観察して細胞を数えることによって明らかにした。形質導入は3回行ない、各ウエルのランダムな3つの領域でカウントした。したがって合計でベクター1つにつき9つの領域のカウントを行なった。
（図13Aと図13Bに示した）結果から、HSP突然変異を含むベクターを用いると、Av1nBgと比べてA549細胞とヒーラ細胞への形質導入効率が有意に低下していることがわかる。しかしHSP突然変異を含むベクターは、A549細胞に関して投与量に依存する応答を示した。すなわち、PPC比を大きくすると、形質導入が増大した。
競合実験を行ない、どの受容体分子との相互作用がさまざまなベクターによるA549細胞への形質導入に関係しているかを調べた。さまざまな競合物質（例えば、Ad5ファイバーのノブや、アデノウイルス血清型2のペントン・ベースに由来し、RGDトリペプチド領域にまたがる50個のアミノ酸からなるオリゴペプチドや、ヘパリン（インヴィトロジェン・ライフ・テクノロジーズ社、ゲサースバーグ、メリーランド州））の存在下と不在下で形質導入を行なった。単層のA549細胞を、10％FBSを補足したリヒター培地の中で培養し、感染培地（IM、リヒター培地+2％FBS）の中でAv1nBg、Av1nBgS*、Av1nBgFKO1S*、Av1nBgS*PD1、Av1nBgFKO1S*PD1のいずれかを用いて形質転換した。さまざまなベクターでさまざまなPPC比を用いて測定可能な形質転換のレベルを実現した。PPC比は以下の通りであった：Av1nBg：500PPC、Av1nBgS*：10,000PPC、Av1nBgFKO1S*：20,000PPC、Av1nBgS*PD1：10,000PPC、Av1nBgFKO1S*PD1：20,000PPC。ファイバーのノブの競合は、ファイバーのノブを16μg/ml含むIMの中で細胞を室温にて10分間にわたってあらかじめインキュベートした後、ウイルスを感染させることによって実現した。ペントン・ベース・ペプチドの競合は、このペプチドを500nM含むIMの中で細胞を室温にて10分間にわたってあらかじめインキュベートした後、ウイルスを感染させることによって実現した。ヘパリンの競合は、ヘパリンを3mg/ml含むIMの中で各アデノウイルス・ベクターを室温にて20分間にわたってあらかじめインキュベートした後、ウイルスを感染させることによって実現した。すべての場合において、競合物質は、5％CO2の中で37℃にてウイルスを単層細胞上で揺らしていた1時間にわたってIMの中に留まっていた。感染後、単層をPBSで洗浄し、ウエル1つにつき1mlの完全培地を添加し、細胞をさらに24時間にわたってインキュベートすると、β-ガラクトシダーゼを発現させることができた。次に単層細胞を固定し、X-Galで染色した。形質導入された細胞の割合を上に説明したようにして光学顕微鏡で明らかにした。各条件のものを3通り用意し、ウエル1つにつきランダムな3つの領域でカウントした。したがって合計で1つの条件で9つの領域のカウントを行なった。高パワーの領域1つ当たりの形質導入の割合の平均値を明らかにした。
競合実験の結果（図13C）から、ファイバーのノブが、KO1突然変異を含むベクターを除く他のすべてのベクターによる細胞への形質導入を抑制したことがわかる。ペントン・ペース・ペプチドだけが、Av1nBgFKO1S*による形質導入を抑制した。ヘパリンは、Av1nBgFKO1S*とAv1nBgFKO1S*PD1による形質導入を抑制したが、他のどのウイルスによる形質導入にも影響を与えなかった。これは、アデノウイルスのキャプシドには別のヘパリン結合部位が存在しているが、シャフトはそれよりも優勢な部位を含んでいることを示している。
HSPファイバー突然変異を含むアデノウイルス・ベクターの生体内における評価
この研究の目的は、HSP突然変異を含むアデノウイルス・ベクターの生体内分布を評価することと、シャフトのこの改変がアデノウイルスを媒介した肝臓への形質導入に影響を与えるかどうかを調べることであった。さらに、HSP突然変異とKO1突然変異またはPD1突然変異を組み合わせて含むベクター、あるいは3つの突然変異をすべて組み合わせたベクターの評価と、KO1突然変異だけを含むベクター、PD1突然変異だけを含むベクターの評価を行なった。正の対照コホートはAv1nBgを受け取り、負の対照コホートはHBSSを受け取った。5匹のC57BL/6マウスからなるコホートに、尾の静脈への注射を通じて各ベクターを、体重1kg当たり1×1013粒子となる投与量で与えた。ベクターの投与から約72時間後に二酸化炭素で窒息させてマウスを安楽死させた。肝臓、心臓、肺、脾臓、腎臓を各マウスから回収した。β-ガラクトシダーゼの免疫組織化学分析のため、肝臓の中葉を中性緩衝ホルマリンの中に入れてサンプルを保管した。さらに、各器官からの組織を凍結して保管し、ヘキソンのリアルタイムPCR分析を行なってベクターの含有量を調べた。各マウスからの肝臓の別のサンプルを凍結して保管し、化学発光β-ガラクトシダーゼ活性アッセイを行なった。β-ガラクトシダーゼ免疫組織化学分析、ヘキソンのリアルタイムPCR分析、化学発光β-ガラクトシダーゼ活性アッセイは、実施例3に記載したようにして実施した。
β-ガラクトシダーゼ活性アッセイの結果（図14A）とアデノウイルスのヘキソンDNAの含有量（図14B）の結果から、HSP突然変異を含むベクターによる肝臓への形質導入が劇的に低下することがわかった。HSP突然変異だけを含むベクターにより、アデノウイルスを媒介とした肝臓遺伝子の発現が約1/20に減少した。KO1突然変異と組み合わせると（HSP、KO1、PD1）、肝臓ではβ-ガラクトシダーゼの活性が対照ベクターAv1nBgと比べて1/1000になった。KO1突然変異だけを含むベクターは、平均として、肝臓への形質導入がAv1nBgと比べてわずかに増加した。これは、以前のいくつかの実験結果と一致している。PD1突然変異だけを含むベクター、またはKO1突然変異と組み合わせたベクターは、肝臓への形質導入がAv1nBgと比べてわずかに低下したが、低下は統計的に有意ではなかった。肝臓でのアデノウイルスのヘキソンDNAの含有量（図14B）を分析した結果から、こうした結果が確認された。
β-ガラクトシダーゼを調べるため肝臓切片を免疫組織化学染色した結果は、活性アッセイの結果（データは示さない）と一致しており、遺伝子の発現が特に肝細胞に局在していることを示している。HSP突然変異を単独で、あるいはKO1突然変異および／またはPD1突然変異と組み合わせて含むベクターは、肝細胞への形質導入が劇的に低下した。KO1突然変異だけを含むベクターは、肝臓への形質導入がわずかに増加した。そのことは、免疫組織化学染色パターンがより強くて頻度が多くなっていることからわかる。PD1突然変異を単独で、あるいはKO1突然変異と組み合わせて含むベクターは、Av1nBgと比べて形質導入にほとんど違いが見られなかった。
ファイバーのシャフトのHSP突然変異を含んでいて、さらにファイバーのKO1突然変異を含む場合と含まない場合、ファイバーのノブのHIループにcRGDターゲティング・リガンドを含む場合と含まない場合のアデノウイルス・ベクターの説明
ファイバーのシャフトのHSP突然変異を含み、HIループにcRGDリガンドを含むベクターの作製。以下の方法で、ファイバーのシャフトのHSP突然変異を含み、HIループにcRGDリガンドを含むアデノウイルス・ベクターを作った。プラスミドp5FloxHRFRGDを制限酵素BstXIとKpnIで消化させ、1157bpの断片を単離して精製した。さらに、上記の実施例1に記載したファイバー・シャトル・プラスミドpFBSEHSPをBstXIとKpnIで消化させ、4549bpと3156bpの断片を単離して精製した。これら3つの断片を連結させ、HSP突然変異を含み、HIループにcRGDを含むファイバーをコードしているプラスミドpFBSEHSPRGDを作った。このプラスミドからのファイバー遺伝子を、以下のようにしてpSQ1骨格に移した。プラスミドpFBSEHSPRGDをEcoRIとXbaIで消化させ、7601bpの断片を単離して精製した。プラスミドpSQ1（図3B）を制限酵素EcoRI、NdeI、XbaIで消化させ、EcoRIからNdeIまでの16,431bpの断片と、NdeIからXbaIまでの9043bpの断片を単離して精製した。これら3つのDNA断片を連結させ、プラスミドpSQ1HSPRGD（図15A）を作った。
ファイバー遺伝子にHSP突然変異を含み、HIループにcRGDリガンドを含む組み換えアデノウイルス・ベクターを作るため、プラスミドpSQ1HSPRGDをClaIで消化させ、SalIとPacIで消化させておいたpAdmireRSVnBgとともに633細胞に同時にトランスフェクトした。633細胞上で増殖させた後、ウイルスのキャプシドは、野生型ファイバー・タンパク質と突然変異したファイバー・タンパク質を含んでいた。HSP突然変異とcRGDリガンドを有する改変ファイバーだけを含むウイルス粒子を得るため、ウイルス調製物を用い、ファイバーを発現しないPerC6細胞に感染させた。得られたウイルス（Av1nBgS*RGDと呼ぶ）を標準的なCsCl遠心分離手続きで精製した。
ファイバーのシャフトのHSP突然変異と、ファイバーのノブのKO1突然変異とを含み、HIループにcRGDリガンドを含むベクターの作製
以下の方法で、ファイバーのシャフトのHSP突然変異と、ファイバーのノブのKO1突然変異とを含み、HIループにcRGDリガンドを含むアデノウイルス・ベクターを作った。プラスミドp5FloxHRFRGDを制限酵素BstXIとKpnIで消化させ、1157bpの断片を単離して精製した。さらに、上記の実施例1に記載したファイバー・シャトル・プラスミドpFBSEHSPをBstXIとKpnIで消化させ、4549bpと3156bpの断片を単離して精製した。これら3つの断片を連結させ、HSP突然変異と、KO1突然変異とを含み、HIループにcRGDを含むファイバーをコードしているプラスミドpFBSEHSPKO1RGDを作った。このプラスミドからのファイバー遺伝子を、以下のようにしてpSQ1骨格に移した。プラスミドpFBSEHSPKO1RGDをEcoRIとXbaIで消化させ、7601bpの断片を単離して精製した。プラスミドpSQ1（図3B）を制限酵素EcoRI、NdeI、XbaIで消化させ、EcoRIからNdeIまでの16,431bpの断片と、NdeIからXbaIまでの9043bpの断片を単離して精製した。これら3つのDNA断片を連結させ、プラスミドpSQ1HSPKO1RGD（図15B）を作った。
ファイバー遺伝子にHSP突然変異を含み、HIループにcRGDリガンドを含む組み換えアデノウイルス・ベクターを作るため、プラスミドpSQ1HSPKO1RGDをClaIで消化させ、SalIとPacIで消化させておいたpAdmireRSVnBgとともに633細胞に同時にトランスフェクトした。633細胞上で増殖させた後、ウイルスのキャプシドは、野生型ファイバー・タンパク質と突然変異したファイバー・タンパク質を含んでいた。HSP突然変異とKO1突然変異とcRGDリガンドとを有する改変ファイバーだけを含むウイルス粒子を得るため、ウイルス調製物を用い、ファイバーを発現しないPerC6細胞に感染させた。得られたウイルス（Av1nBgFKO1S*RGDと呼ぶ）を標準的なCsCl遠心分離手続きで精製した。
ファイバーのシャフトのHSP突然変異を含んでいて、さらにファイバーのKO1突然変異を含む場合と含まない場合、ファイバーのノブのHIループにcRGDターゲティング・リガンドを含む場合と含まない場合のアデノウイルス・ベクターの試験管内での評価
ファイバーのシャフトのHSP突然変異を含んでいて、さらにファイバーのKO1突然変異を含む場合と含まない場合、ファイバーのノブのHIループにcRGDターゲティング・リガンドを含む場合と含まない場合のアデノウイルス・ベクターの形質導入効率を、A549細胞について評価した。形質導入効率を、野生型ファイバーを含むアデノウイルス・ベクターAv1nBgの場合と比較した。感染させる前日、細胞を24ウエルのプレートに、ウエル1つにつき約1×105個の細胞となる密度で入れた。感染の直前、代表的な1つのウエルの細胞を数えることにより、ウエル1つ当たりの細胞の正確な数を調べた。それぞれのベクターAv1nBg、Av1nBgS*、Av1nBgFKO1S*、Av1nBgS*RGD、Av1nBgFKO1S*RGDを用いてA549細胞に形質導入を行なった。そのときの細胞1個当たりの粒子の比は6250にした。感染24時間後に単層細胞をX-galで染色し、β-ガラクトシダーゼを発現している細胞の割合を、顕微鏡で観察して細胞を数えることによって明らかにした。形質導入は3回行ない、各ウエルのランダムな3つの領域でカウントした。したがって合計でベクター1つにつき9つの領域のカウントを行なった。結果（図16）は、cRGDリガンドが、HSP突然変異だけを含むベクター、またはHSP突然変異にKO1突然変異を組み合わせたベクターの形質導入効率を劇的に増大させることを示していた。Av1nBgS*では、プラスの細胞が約22％になり、Av1nBgS*RGDでは、プラスの細胞が約95％になった。同様に、Av1nBgFKO1S*ではプラスの細胞が4％しかなかったのに対し、Av1nBgFKO1S*RGDではプラスの細胞が85％になった。したがってシャフトの突然変異を含むベクターは生きており、リガンドの添加で再び標的に向かわせることができる。
Ad35ファイバーを含むAd5ベクターとその誘導体の構成
Ad5ファイバー・タンパク質（5F）の中に上記のKO1突然変異とHSP突然変異を設計し、Ad5ウイルスの正常な親和性にとって重要な相互作用を消した。ウイルスが標的に向かわなくする別の方法は、Ad5ファイバーを、CARと結合せず、シャフト内にヘパラン硫酸プロテオグリカン（HSP）結合ドメイン（KKTK；配列ID番号45）も持たない別の血清型からのファイバーで置換するというものである。アデノウイルス血清型35のファイバー（35F）はCARと結合せず、シャフト内にHSP結合ドメインも持っていない。5Fを35Fで置換すると、肝臓を標的としなくすることができ、ベクターを望む組織に再び向けるための適切なプラットフォームが提供される。
AdをベースとしていてAd35ファイバーを含むベクターの作製。PCR SOEイング法を利用し、Ad5血清型をベースとしているが、Ad5ファイバーの代わりにAd35ファイバーを含むベクターを作った。まず最初に、PCRを利用し、プラスミドpSQ1の塩基位置25,309にあるXbaI部位と、ファイバー遺伝子の開始位置とに挟まれた領域を増幅した。この反応に用いたプライマーは、P-0005/UとP-0006/Ｌであった。P-0005/UのDNA配列は、5'-C TCT AGA AAT GGA CGG AAT TAT TAC AG-3'（配列ID番号65）であった。この配列は、pSQ1の塩基位置25,308〜25,334に対応している。P-0006/ＬのDNA配列は、5'-TCT TGG TCA TCT GCA ACA ACA TGA AGA TAG TG-3'（配列ID番号66）であった。この配列は、Ad35ファイバー遺伝子の開始部と相補的な10塩基対からなる5'延長部を含んでいるのに対し、プライマーの残り部分は、pSQ1中のファイバー遺伝子の開始コドンATGのすぐ5'側にある配列とアニールする。予想された583bpというサイズのPCR産物が得られ、DNAをゲル精製した。2回目のPCRでは、野生型Ad35ウイルスから抽出したDNAを鋳型として利用し、Ad35ファイバー遺伝子を増幅した。この反応で使用したプライマーは、P-0007/Uと35FMunであった。P-0007/UのDNA配列は、5'-GT TGT TGC AG ATG ACC AAG AGA GTC CGG CTC A-3'（配列ID番号67）であった。この配列は、Ad5のファイバー遺伝子の開始コドンATGの直前にある10塩基対と相同な10塩基対からなる5'延長部を含んでいる。このプライマーの残り部分は、Ad35ファイバー遺伝子の開始部とアニールする。35FMunのDNA配列は、5'-AG CAA TTG AAA AAT AAA CAC GTT GAA ACA TAA CAC AAA CGA TTC TTT A GTT GTC GTC TTC TGT AAT GTA AGA A-3'（配列ID番号68）であった。この配列は、Ad5ゲノムでファイバーの末端部とファイバー遺伝子の40bp下流にあるMunI部位とに挟まれた領域と相補的な46塩基対からなる5'延長部を含んでいる。さらに、この5'延長部は、Ad5ファイバー遺伝子の最終アミノ酸と終止コドンをコードしている。この領域は、ファイバー遺伝子のポリアデニル化部位を含んでいるためにベクター内で保持されていた。このプライマーの残り部分は、Ad35ファイバー遺伝子の3'末端と、最終アミノ酸のコドンの隣の位置までアニールする。予想された1027bpというサイズのPCR産物が得られ、DNAをゲル精製した。2つのPCR産物を混合し、プライマーP-0005/UとP-0009を用いたPCR SOEイング法によって接合した。P-0009のDNA配列は、5'-AG CAA TTG AAA AAT AAA CAC GTT G-3'（配列ID番号69）であった。この配列は、pSQ1の塩基位置27,648〜27,669に対応しており、この領域にあるMunI部位と重なっている。予想された1590bpというサイズのPCR産物が得られ、ゲル精製した。このPCR産物をクローニングし、インヴィトロジェン社のゼロ・ブラントTOPO PCRクローニング・キットを用いてプラスミドpCR4blunt-TOPO（インヴィトロジェン社、カールスバッド、カリフォルニア州）に入れた。この中間クローニング・ステップにより、PCR SOEイング産物のDNAのシークエンシングが簡単になった。得られたプラスミド（pTOPOAd35Fと呼ぶ）をXbaIとMunIで消化させ、1585bpの消化産物をゲル精製し、pFBshuttle(EcoRI)をXbaIとMunIで消化させて得られた6477bpの断片と連結させ、プラスミドpFBshuttleAd35Fを作った。Ad35ファイバー遺伝子を、以下のようにしてpFBshuttleAd35FからpSQ1に移した。プラスミドpSQ1をEcoRIで消化させ、24,213bpの断片をゲル精製した。プラスミドpFBshuttleAd35FをEcoRIで線状化し、pSQ1からの24,213bpの断片と連結させた。制限診断を実施し、pSQ1骨格にAd35ファイバー遺伝子が正しい向きに挿入されている構造体をスクリーニングした。Ad35ファイバー遺伝子を正しい向きで含んでいるプラスミドpSQ1をpSQ1Ad35ファイバーと名づけた（図17A）。Ad35ファイバーを含むアデノウイルス・ベクターを作るため、pSQ1Ad35ファイバーをClaIで消化させ、SalIとPacIで消化させておいたpAdmireRSVnBgとともに633細胞に同時にトランスフェクトした。633細胞上で増殖させた後、得られたウイルスは、Ad5ファイバーとAd35ファイバーをキャプシド上に含んでいた。このウイルスをPerC6細胞上で増殖させ、キャプシド上にAd35ファイバーだけを含むウイルスを得た。得られたウイルス調製物をAv1nBg35Fと名づけた。
Ad5とAd35からのキメラ・ファイバーを含むアデノウイルス・ベクターの作製。Ad5またはAd35ファイバーの完全長cDNAを含むプラスミドを鋳型として用いたPCR遺伝子重複延長により、2つのキメラ・ファイバー構造体を調製した。Ad5ファイバーの尾領域とシャフト領域（5TS；アミノ酸1〜403）をAd35ファイバーのヘッド領域（35H；アミノ酸137〜323）と接続し、5TS35Hキメラを形成した。Ad35ファイバーの尾領域とシャフト領域（35TS；アミノ酸1〜136）をAd5ファイバーのヘッド領域（5H；アミノ酸404〜581）と接続し、35TS5Hキメラを形成した。これら融合体は、ファイバーのシャフト-ヘッド接合部にある保存されたTLWT配列の位置で作った。
5TS35Hキメラを構成するため、pFBshuttle(EcoRI)を鋳型として用い、プライマーP1とP2で5'断片を作った。3'断片は、プラスミドpFBshuttleAd35を鋳型として用い、プライマーP3とP4で作った。これらキメラ・ファイバーを構成するのに用いた各プライマーの配列を表2に示してある。予想されたサイズの増幅PCR産物が得られ、ゲル精製した。末端プライマーP1とP4を用いた2回目のPCRを行ない、2つの断片を接合した。2回目のPCRで生成したDNA断片をXbaIとMunIで消化させ、クローニングして直接pFBshuttle(EcoRI)に入れ、ファイバー・シャトル・プラスミドpFBshuttle5TS35Hを作った。
Figure 2007525166
35TS5Hキメラを構成するため、プラスミドpFBshuttleAd35を鋳型として用い、プライマーP1とP5で5'断片を作った。3'断片は、pFBshuttle(EcoRI)を鋳型として用い、プライマーP6とP4で作った。上に説明したのと同じ手続きに従い、ファイバー・シャトル・プラスミドpFBshuttle35TS5Hを作った。
Ad35ファイバーを含むベクターについて上に説明したようにして、35TS5Hキメラと5TS35Hキメラに関し、ファイバー遺伝子をpFBshuttle(EcoRI)骨格からpSQ1に移した。得られたプラスミドをpSQ135T5H（図18A）およびpSQ15T35H（図18B）と名づけた。さらに、上に説明した同時トランスフェクション法を利用し、アデノウイルス・ベクターを作った。
35FファイバーのノブのHIループにcRGD標的ペプチドを有するAd35ファイバーを含むAd5ベクターの構成。cRGDターゲティング・ペプチドをAd35ファイバーのHIループに組み込むため、10個のアミノ酸からなる配列HCDCRGDCFC（配列ID番号78）をコードしているオリゴヌクレオチド・プライマーP7とP8を合成した。P1プライマーとP7プライマーのペア、またはP4プライマーとP8プライマーのペアを用いたPCR反応で完全長Ad35ファイバーcDNAを含むプラスミドpFBshuttleAd35を鋳型として用い、5'PCR断片と3'PCR断片を作った。次に、末端プライマーP1とP4を用いた2回目のPCRを行ない、2つの断片を接合した。得られたPCR断片をXbaIとMunIで消化させ、クローニングしてpFBshuttle(EcoRI)に入れ、ファイバー・シャトル・プラスミドpFBshuttleAd35cRGDを作った。EcoRIクローニング法を利用して改変Ad35ファイバー遺伝子をpSQ1に移し、pSQ1Ad35FcRGD（図17B）を作った。上に説明した同時トランスフェクション法を利用し、アデノウイルス・ベクターを作った。
35Fを含むアデノウイルス・ベクターとその誘導体の試験管内での評価
35Fを含むアデノウイルス・ベクターまたはその誘導体の形質導入効率をA549細胞について評価した。形質導入効率を、5Fファイバーを含むアデノウイルス・ベクターAv1nBgの場合と比較した。感染させる前日、細胞を24ウエルのプレートに、ウエル1つにつき約1×105個の細胞となる密度で入れた。感染の直前、代表的な1つのウエルの細胞を数えることにより、ウエル1つ当たりの細胞の正確な数を調べた。それぞれのベクターAv1nBg、Av1nBg35F、Av1nBg5T35H、Av1nBg35T5Hを用いてA549細胞に形質導入を行なった。そのときの細胞1個当たりの粒子の比（PPC）は0〜1,000にした。感染24時間後に単層細胞をX-galで染色し、β-ガラクトシダーゼを発現している細胞の割合を、顕微鏡で観察して細胞を数えることによって明らかにした。形質導入は3回行ない、各ウエルのランダムな3つの領域でカウントした。したがって合計でベクター1つにつき9つの領域のカウントを行なった。結果（図19）は、Av1nBg35FベクターとAv1nBg5T35Hベクターを用いた場合に、A549細胞でAv1nBgと同様の形質導入効率になることを示していた。Av1nBg35T5Hは、Ad35のシャフト・ドメインのためにAv1nBgと比べてA549細胞ではるかに低い形質導入効率になった。Ad35のシャフト・ドメインはHSP結合モチーフを含んでいないため、Av1nBg35T5Hベクターは、試験管内でも生体内でもAv1nBgS*ベクターと同じように振る舞う。これらの研究は、HSP結合部位のないファイバー・タンパク質を含むベクターが完全に生きていることも示している。
35Fを含むアデノウイルス・ベクターとその誘導体の生体内での評価
この研究の目的は、35Fファイバーを含むアデノウイルス・ベクターとその誘導体の生体内分布を評価し、このファイバーを含むベクターがそのシャフト領域のために肝臓への形質導入を行なわなくなるかどうかを明らかにすることであった。正の対照コホートはAv1nBgを受け取り、負の対照コホートはHBSSを受け取った。5匹のC57BL/6マウスからなるコホートに、尾の静脈への注射を通じて各ベクターを、体重1kg当たり1×1013粒子となる投与量で与えた。ベクターの投与から約72時間後に二酸化炭素で窒息させてマウスを安楽死させた。肝臓、心臓、肺、脾臓、腎臓を各マウスから回収した。β-ガラクトシダーゼの免疫組織化学分析のため、肝臓の中葉を中性緩衝ホルマリンの中に入れてサンプルを保管した。さらに、各器官からの組織を凍結して保管し、ヘキソンのPCR分析を行なってベクターの含有量を調べた。各マウスからの肝臓の別のサンプルを凍結して保管し、化学発光β-ガラクトシダーゼ活性アッセイを行なった。β-ガラクトシダーゼの免疫組織化学分析、ヘキソンのリアルタイムPCR分析、化学発光β-ガラクトシダーゼ活性アッセイは、実施例3に記載したようにして実施した。
β-ガラクトシダーゼ活性アッセイの結果は、Ad35ファイバーを含むベクターまたは35T5H誘導体による肝臓への遺伝子導入が劇的に低下し、対照ベクターAv1nBgと比べて肝臓でのβ-ガラクトシダーゼ活性が約1/4〜1/24になることを示していた（図20）。このデータは、HSP結合部位のないシャフト・ドメインが生体内で半双への遺伝子導入を効果的に減らせることを示している。特に、HSPは、生体内の肝臓にとって主要な侵入メカニズムである。CARとの結合はマイナーな侵入経路である。
Ad血清型41短ファイバーを含むAd5ベクターとその誘導体の構成
ヒト・アデノウイルス血清型41は、隣り合った2つの遺伝子によってコードされている異なる2つのファイバーをキャプシド上に含んでいる。一方のファイバーは分子量が60kDaであり、長さが約315オングストロームであるため長いファイバーと呼ばれる。他方のファイバーは分子量が40kDaであり、長さが約250オングストロームであるため短いファイバーと呼ばれる。Ad41短ファイバーはCARと結合せず、シャフトにヘパラン硫酸プロテオグリカン結合ドメイン（KKTK）を持っていない。したがってこのファイバーは、アデノウイルス・ベクターが標的とする有用なプラットフォームとなる。
Ad5をベースとしているがAd41短ファイバーを含むアデノウイルス・ベクターの構成。PCR SOEイング法を利用し、Ad5のゲノムをベースとしているが、Ad41短（Ad41s）ファイバーを含むベクターを作った。まず最初に、PCRを利用し、pSQ1の塩基位置25,309にあるXbaI部位と、ファイバー遺伝子の開始位置とに挟まれた領域を増幅した。PCRに用いたプライマーは、P-0005/UとP-0010/Ｌであった。P-0005/UのDNA配列は、5'-C TCT AGA AAT GGA CGG AAT TAT TAC AG-3'（配列ID番号65）であった。この配列は、pSQ1の塩基位置25,308〜25,334に対応しており、この領域内のXbaI部位と重なっている。P-0010/ＬのDNA配列は、5'-TTC TTT TCA T CTG CAA CAA CAT GAA GAT AGT G-3'（配列ID番号79）であった。この配列は、Ad41sファイバー遺伝子の最初の10bpに対応する5'延長部を含んでいる。このプライマーの残り部分は、pSQ1中のファイバー遺伝子の開始コドンATGのすぐ5'側にある部分とアニールする。PCR産物は予想されたサイズ（583bp）であった。2回目のPCRでは、プラスミドpDV60Ad41sFを鋳型として利用し、Ad41sファイバーを増幅した。使用したプライマーは、P-0011/UとP-0012/Lであった。P-0011/UのDNA配列は、5'-GT TGT TGC AG ATG AAA AGA ACC AGA ATT GAA G-3'（配列ID番号80）であった。この配列は、pSQ1内にあるファイバー遺伝子の開始コドンATGのすぐ5'側にあるDNA配列に対応する10bpからなる5'延長部を含んでいる。このプライマーの残り部分は、pDV60Ad41sF内にあるAd41sファイバー遺伝子の最初の部分とアニールする。P-0012/LのDNA配列は、5'-TG CAA TTG AAA AAT AAA CAC GTT GAA ACA TAA CAC AAA CGA TTC TTT ATT C TTC AGT TAT GTA GCA AAA TAC A-3'（配列ID番号81）であった。この配列は、pSQ1内にあってファイバー遺伝子の最後のコドンとファイバー遺伝子の40bp下流にあるMunI部位とに挟まれた配列に対応する51塩基対からなる5'延長部を含んでいる。このプライマーの残り部分は、pDV60Ad41sF内にあるAd41sファイバー遺伝子の3'末端とアニールする。PCR産物は予想されたサイズ（1219bp）であった。プライマーP-0005/UとP-0009/Ｌを用い、2つのPCR産物をPCR SOEイングによって接合した。P-0009/ＬのDNA配列は上に示した。PCR SOEイング反応により、予想された1782bpの産物が得られた。この産物をクローニングしてpCR4blunt-TOPOに入れ、pCR4blunt-TOPOAd41sFを作った。次に、pCR4blunt-TOPOAd41sFをXbaIとMunIで消化させ、Ad41sファイバー遺伝子を含む1773bpの断片をゲル精製した。この断片をプラスミドpFBshuttle(EcoRI)のXbaIからMunIまでの6477bpの断片と連結させ、プラスミドpFBshuttleAd41sFを作った。Ad41sファイバー遺伝子を次のようにしてpSQ1骨格の中に移した。まず最初に、プラスミドpFBshuttleAd41sFをEcoRIで線状化し、この断片をpSQ1からの24,213bpのEcoRI断片と連結させてpSQ1Ad41sFを作った（図21A）。上記の同時トランスフェクション法を利用し、Ad41sファイバーを含むアデノウイルス・ベクターを作った。
Ad41短ファイバーを含み、HIループにcRGDターゲティング・リガンドを含むAd5アデノウイルス・ベクターの構成。PCR SOEイング法を利用し、Ad41sファイバーを含み、HIループにcRGDリガンドを含む構造体を作った。プラスミドpFBshuttleAd41sFをPCR増幅の鋳型として用いた。まず最初に、プライマー5FFと41sRGDRを用いて1782bpの断片を増幅した。プライマー5FFは上に示した。このプライマーは、ファイバー遺伝子の上流にあるXbaI部位でpFBshuttleAd41sFとアニールする。プライマー41sRGDRのDNA配列は、
5'-AGT ACA AAA ACA ATC ACC ACG ACA ATC ACA GTT TAT CTC GTT GTA GAC GAC ACT GA-3'（配列ID番号82）であった。この配列は、cRGDターゲティング・リガンドをコードしている30bpの5'延長部を含んでいる。このプライマーの残部は、pFBshuttleAd41sFの塩基位置2878〜2903とアニールする。2回目のPCRにより、プライマー3FRと41sRGDFを用いてpFBshuttleAd41sFの277bpの領域を増幅した。プライマー3FRについてはすでに説明した。このプライマーは、ファイバー遺伝子の下流にあるMunI部位でpFBshuttleAd41sFとアニールする。41sRGDFのDNA配列は、5'-TGT GAT TGT CGT GGT GAT TGT TTT TGT ACT AGT GGG TAT GCT TTT ACT TTT-3'（配列ID番号83）であった。この配列はcRGDターゲティング・リガンドをコードしている30bpの5'延長部を含んでおり、41sRGDR上の延長部と相補的になっている。このプライマーの残部は、pFBshuttleAd41sFの塩基位置2904〜2924とアニールする。2つのPCR産物をPCR SOEイングによって接合し、プライマー5FFと3FRを用いて2059bpの断片を作った。この産物をXbaIとMunIで消化させ、1803bpのDNA断片をゲル精製した。この断片を、XbaIとMunIを用いてプラスミドpFBshuttle(EcoRI)を消化させて得られた6477bpの断片と連結させた。得られたプラスミドをpFBshuttleAd41sRGDと名づけた。EcoRIによる消化でこのプラスミドを線状化し、pSQ1の24,213bpのEcoRI断片と連結させてpSQ1Ad41sRGD（図21B）を作った。
Ad41短ファイバーを含むAd5ベクターとその誘導体の生体内での評価
この実施例では、Ad41sFファイバーを含むアデノウイルス・ベクターとその誘導体の生体内分布を評価し、このファイバーを含むベクターが改変シャフト領域のために肝臓への形質導入を行なわなくなるかどうかを明らかにする。正の対照コホートはAv3nBg（Gorziglia他、1996年、J. Virology、第70巻、4173〜4178ページ）またはAd5.βgal.ΔF/5Fを受け取り、負の対照コホートはHBSSを受け取った。Ad5.βgal.ΔF/5Fは、ファイバーなしベクターAd5.βgal.ΔF（ATCC登録番号VR2636）の誘導体で、Ad5ファイバーを発現するようにしたものである（例えば国際PCT出願WO 01/83729を参照のこと）。
Ad5.βgal.ΔFベクターをAd41sFファイバー・タンパク質でシュードタイピングし、生体内に注入した。5匹のC57BL/6マウスからなるコホートに、尾の静脈への注射を通じて各ベクターを、体重1kg当たり1×1013粒子となる投与量で与えた。ベクターの投与から約72時間後に二酸化炭素で窒息させてマウスを安楽死させた。肝臓、心臓、肺、脾臓、腎臓を各マウスから回収した。β-ガラクトシダーゼの免疫組織化学分析のため、肝臓の中葉を中性緩衝ホルマリンの中に入れてサンプルを保管した。さらに、各器官からの組織を凍結して保管し、ヘキソンのPCR分析を行なってベクターの含有量を調べた。各マウスからの肝臓の別のサンプルを凍結して保管し、化学発光β-ガラクトシダーゼ活性アッセイを行なった。β-ガラクトシダーゼの免疫組織化学分析、ヘキソンのリアルタイムPCR分析、化学発光β-ガラクトシダーゼ活性アッセイは、実施例3に記載したようにして実施した。
ヘキソンDNA分析の結果は、Ad41sFファイバーを含むベクターによる肝臓への形質導入が劇的に低下し、どの対照ベクターと比べても肝臓でのアデノウイルスのDNA含有量が約1/5になることを示していた（図22）。
ここまでに示した実施例では、ベクターの正常な親和性をなくすように設計したさまざまな改変を有するファイバーを含むいくつかの新規なアデノウイルス・ベクターを作った（表3を参照のこと）。ファイバーのシャフト内のヘパラン硫酸結合ドメインにアミノ酸置換があるベクターを作った。HSPと名づけたこの突然変異は、KO1突然変異（ファイバーのノブのABループ突然変異で、CARとの結合をなくす）およびPD1突然変異（ペントンの突然変異で、RGD／インテグリン相互作用をなくす）とも組み合わせた。さらに、3つすべての突然変異（HSP、KO1、PD1）を含むベクターを作った。HSP突然変異を単独で含むベクター、またはキャプシドの他の改変と組み合わせて含むベクターはすべて、A549細胞とヒーラ細胞において形質導入の効率が劇的に低下した。さらに、同じベクターが、マウスへの全身投与後の肝臓への形質導入に関して劇的な低下を示した。Ad5をベースとしたベクターの正常な親和性をなくす別の方法として、Ad5ファイバーを、CARと結合せず、シャフトにヘパラン硫酸プロテオグリカン結合ドメインも含んでいない別のアデノウイルス血清型からのファイバーで置換した。そこでAd35ファイバーとAd41短ファイバーを含むベクターを作った。これら2つのベクターの別バージョンとして、ファイバーのHIループにcRGDターゲティング・リガンドを含むものも作った。さらに、キメラ・ファイバーを含むベクターを作った。Ad5ファイバーのノブ・ドメインと融合したAd35ファイバーの尾領域とシャフト領域を含むベクターと、Ad35ファイバーのノブ・ドメインと融合したAd5ファイバーの尾領域とシャフト領域を含むベクターを構成した。完全なAd35ファイバーまたはAd41短ファイバーのいずれかを含むベクターは、マウスの尾の静脈を通じた投与後に肝臓への形質導入が有意に低下した。HSP突然変異、Ad35ファイバー、Ad41短ファイバーのいずれかを含むベクターを用いると肝臓への形質導入が低下するという観察結果は、生体内でアデノウイルス・ベクターを標的に向かわなくできる可能性のあることを示している。Ad35ファイバーまたはAd41短ファイバーとcRGDを用いた試験管内のデータ（実施例14を参照のこと）は、ウイルスが完全に生きていること、すなわちHSP結合部位の不在によるダメージがなく、再び標的に向かえることを示している。これらのデータを合わせて考えると、これらベクターは、再び標的に向かわせるための適切なプラットフォームとなることを示している。
Figure 2007525166
Ad41短ファイバーを含み、HIループにcRGDリガンドを含むAd5ベクターの試験管内での評価
Ad41sFファイバーを含み、HIループにcRGDリガンドを含むアデノウイルス・ベクターの形質導入効率を、A549細胞について評価した。形質導入効率を、野生型ファイバーを含むアデノウイルス・ベクターAv1nBg、またはKO1突然変異にHIループ内のcRGDリガンドを組み合わせて含むアデノウイルス・ベクターAv1nBgFKO1RGDの場合と比較した。感染させる前日、細胞を24ウエルのプレートに、ウエル1つにつき約1×105個の細胞となる密度で入れた。感染の直前、代表的な1つのウエルの細胞を数えることにより、ウエル1つ当たりの細胞の正確な数を調べた。それぞれのベクターAv1nBg、Av1nBgFKO1RGD、Av1nBg41sFRGDを用いてA549細胞に形質導入を行なった。そのときの細胞1個当たりの粒子の比は0〜10,000にした。感染24時間後に単層細胞をX-galで染色し、β-ガラクトシダーゼを発現している細胞の割合を、顕微鏡で観察して細胞を数えることによって明らかにした。形質導入は3回行ない、各ウエルのランダムな3つの領域でカウントした。したがって合計でベクター1つにつき9つの領域のカウントを行なった。結果（図23）は、Av1nBg41sFRGDベクターを用いると、調べたすべてのベクター投与量において、Av1nBgFKO1RGDと同じレベルの形質導入効率になることを示している。FKO1も、Ad41sFもCARと結合できない。Ad41sFは、通常はCARと相互作用せず、シャフト・ドメイン内にHSF結合モチーフを含んでもいない。これらのデータは、KO1やAd41sFのファイバーのノブのループ領域に挿入された標的ペプチドにより、標的となる受容体を通じて標的細胞への形質導入が可能になることを示している。驚くべくことに、CARやインテグリンではなくHSPが生体内では主要な侵入経路であり、HSPとの結合がなくなることで、アデノウイルス・ベクターを標的に向かわせることが可能になる。
シャフトの改変がアデノウイルス・ベクターの生体内分布に及ぼす効果
ファイバーとペントンの改変が、ファイバーのヘッドとシャフトの突然変異ならびにペントン突然変異を含むアデノウイルス・ベクターの生体内分布に及ぼす影響を調べた。HSP突然変異とKO1突然変異またはPD1突然変異を組み合わせて含むベクター、あるいは3つの突然変異をすべて組み合わせたベクターの評価と、KO1突然変異だけを含むベクター、PD1突然変異だけを含むベクターの評価を行なった。これらのアデノウイルス・ベクターを、上記のC57BL/6マウスに全身投与した。正の対照コホートはAv1nBgを受け取り、負の対照コホートはHBSSを受け取った。5匹のC57BL/6マウスからなるコホートに、尾の静脈への注射を通じて各ベクターを、体重1kg当たり1×1013粒子となる投与量で与えた。ベクターの投与から約72時間後に二酸化炭素で窒息させてマウスを安楽死させた。肝臓、心臓、肺、脾臓、腎臓を各マウスから回収した。β-ガラクトシダーゼの免疫組織化学分析のため、肝臓の中葉を中性緩衝ホルマリンの中に入れてサンプルを保管した。さらに、各器官からの組織を凍結して保管し、ヘキソンのリアルタイムPCR分析を行なってアデノウイルスのヘキソンDNAの含有量を調べた。各マウスからの肝臓の別のサンプルを凍結して保管し、化学発光β-ガラクトシダーゼ活性アッセイを行なった。ヘキソンのリアルタイムPCR分析と化学発光β-ガラクトシダーゼ活性アッセイは、実施例3に記載したようにして実施した。
肝臓での結果は実施例6（図14A、図14B）に説明してあり、図26にも対照Av1nBgに対する割合として示してある。S*シャフトの改変が他の器官へのアデノウイルスの生体分布に及ぼす効果を図25に示してある。アデノウイルスのDNA含有量の平均値は、細胞1個当たりのアデノウイルス・ゲノムのコピー数として明らかにし、対照であるAv1nBg(+)に対する割合（％）として表現した。調べた各組織について、対照に対する平均値（％）+標準偏差（各グループでn=5）を示してある（図25）。
Ad5をベースとしていて野生型ファイバーを有するベクターの全身投与により、ベクターのDNAが肝臓に選択的に蓄積し、細胞1個当たり64コピーになる。これは、他の器官で見られるDNAよりも有意に多い。例えば肺では細胞1個当たり1.32コピー、脾臓では細胞1個当たり2.18コピー、心臓では細胞1個当たり0.47コピー、腎臓では細胞1個当たり0.72コピーである。PD1、S*、KO1PD1、KO1S*、S*PD1、KO1S*PD1で見られた対照Av1nBg(+)とのあらゆる違いは、対応のないt検定分析を利用すると有意であった（P値が0.024）。各突然変異の影響は、個別であれ、組み合わせてであれ、対照Av1nBgに対する％値として表現すると明らかになる。S*突然変異は、4つの器官すべてへの遺伝子導入を劇的に低下させたのに対し、KO1突然変異はそうではなかった。したがって生体内形質導入におけるシャフトの重要性は、肝臓以外の器官にも拡張される。最後に、肺、心臓、腎臓への遺伝子導入は、PD1で減少した。これは、これら器官にベクターが侵入する際にインテグリンとの結合がどのような役割を果たしているかを示唆している。
改変シャフトS*と41sFファイバーを含むベクターを生体内で再び標的に向かわせる
HSP突然変異を含むベクターは、生体内でアデノウイルス・ベクターを実質的に標的に向かわせないことを示した（実施例6と15を参照のこと）。この研究の目的は、改変S*またはAd41sFを含むベクターを生体内で再び標的に向かわせる能力を評価することであった。cRGDペプチドをファイバーのHIループに組み込み、試験管内で評価した（実施例8と14）。次に、同じベクターを、腫瘍を持つマウスの生体内で評価した。無胸腺のメスnu/nuマウスの右後部わき腹にA549細胞を8×108個注入した。腫瘍が約100mm3のサイズに達したとき、マウスをランダム化して複数の治療群に分けた。6匹のマウスからなるコホートに、尾の静脈への注射を通じて各ベクターを、体重1kg当たり1×1013粒子となる投与量で与えた。ベクターの投与から約72時間後に二酸化炭素で窒息させてマウスを安楽死させた。腫瘍、肝臓、心臓、肺、脾臓、腎臓を各マウスから回収した。各器官からの組織を凍結して保管し、ヘキソンのリアルタイムPCR分析を行なってアデノウイルスのヘキソンDNAの含有量を調べた。ヘキソンのリアルタイムPCRは、実施例3に記載したようにして実施した。各マウスからの肝臓の別のサンプルを凍結して保管し、化学発光β-ガラクトシダーゼ活性アッセイを行なった。ヘキソンのリアルタイムPCRと、化学発光β-ガラクトシダーゼ活性アッセイは、実施例3に記載したようにして実施した。
各治療群に関し、アデノウイルス・ベクターの肝臓と腫瘍への生体分布を図27に示してある。S*ファイバー、KO1S*ファイバー、41sFファイバーを含むベクターは実質的に肝臓と腫瘍を標的とはしないため、各組織に見いだされるアデノウイルスDNAの量は対照であるAv1nBgと比べて有意に低下した。cRGDターゲティング・リガンドを含むベクターは、腫瘍の形質転換を、標的を持たないベクターで実現したのと同程度のレベルに回復させた。
これらのデータは、肝臓を標的としなくすることと、腫瘍を再び標的とすることがうまくいくことを示している。腫瘍を再び標的とすることがどの程度うまくいくかは、使用するリガンドの親和性とタイプに関係している。これらのデータは、標的に向かう全身投与可能なアデノウイルス・ベクターで、生体内で腫瘍を標的とするものの開発が成功することを示している。
標的に向かわないアデノウイルス・ベクターを増殖させるためのスケール・アップ法
二重または三重に機能を喪失したアデノウイルス・ベクターの増殖には、新たなスケール・アップ技術が必要とされる。高力価の調製物を効率的に増殖、生成させるためには、標的に向かわないこのベクターが細胞に侵入する別の経路を必要とする。標的に向かわないあらゆるベクターに一般に適用でき、新しい細胞系の開発を必要とせず、標的に向かうベクターの生成にも使用できるベクター増殖法がこの明細書では提供される。
ファイバーまたはペントンに単一の突然変異を含むベクター、あるいは1つのベクターに両方の突然変異を組み合わせて含むベクターとして、3つの組み換えアデノウイルス・ベクターを調製した。これらベクターは、それぞれAv3nBgFKO1、Av1nBgPD1、Av1nBgFKO1PD1と名づけた。これらベクターの構成は上に説明した通りであり、各ベクターの全体的な説明は上記の表1に見ることができる。
標的に向かわないアデノウイルス・ベクターのスケール・アップ。ポリカチオン、特にヘキサジメトリンブロミドをシグマ・ケミカル社（セントルイス、ミズーリ州、カタログ番号52495）から入手し、トランスフェクションと感染の間を通じて4μg/mlに維持した。標的に向かわないベクターの収率にヘキサジメトリンブロミドが及ぼす効果を調べるため、以下の実験を行なった。AE1-2aアデノウイルス・プロデューサ細胞（Gorziglia他、1996年、J. Virology、第70巻、4173〜4178ページ）を入れた7つのプレートに、細胞1個につき上記の各ベクター（表4を参照のこと）10粒子を導入した。それぞれのベクターを、ヘキサジメトリンブロミドを4μg/ml含む培地（2％HI-FBSを含むリヒター培地）とともに室温にて30分間にわたってインキュベートした後、感染させた。感染は、2時間にわたって行なった。4μg/mlのヘキサジメトリンブロミドを含む完全培地を各プレートに添加した。すべての実験におけるヘキサジメトリンブロミドの最終濃度を4μg/mlに維持した。A260nmにおける1×1012個の粒子当たりの10Dの変換率を利用し、力価を分光測光で測定した（Mittereder他、1996年、J. Virology、第70巻、7498〜7509ページ）。次に、全粒子の収量を、形質導入に用いたプレートの数で規格化した。
感染時に培地にヘキサジメトリンブロミドを含めることにより、ファイバー突然変異とペントン突然変異を単独で、または組み合わせて含む、標的に向かわないアデノウイルス・ベクターを効率的に増殖させることができる。ヘキサジメトリンブロミドがベクターの収量に及ぼす効果を表4に示してある。培地にヘキサジメトリンブロミドを含めると、Av3nBgFKO1の収量が35倍になり、プレート1つにつきベクターの収量が1.30×1010から4.60×1011個へと増加したことがわかる。ヘキサジメトリンブロミドがペントンPD1突然変異を含むアデノウイルス・ベクターAv1nBgPD1の収量に及ぼす効果は小さく、わずかに1.2倍になるだけである。ヘキサジメトリンブロミドを用いる最大の効果は、二重に機能を喪失したアデノウイルス・ベクターAv1nBgFKO1PD1の増殖に関して見られ、ベクターの収量が、わずかに検出できるレベルから、プレート1つにつき4.53×1010ベクターに増加した。これらのデータは、非特異的侵入メカニズムを利用することにより、標的に向かわないアデノウイルス・ベクターを効率的にスケール・アップできることを示している。
Figure 2007525166
プロタミン硫酸やポリ-リシンなどの別のポリカチオンと、二官能性タンパク質（例えば抗ペントン：TNFα融合タンパク質）を用いることについて調べた。図24には、テストしたすべての試薬が、ベクターAv3nBgFKO1による形質導入の増大に関して何らかの効果があったという結果が示してある。これらの化合物はすべて、感染時に培地の中に維持されている場合には、標的に向かわないアデノウイルス・ベクターAv3nBgFKO1による形質導入を増大させた。
二官能性試薬。標的に向かわないアデノウイルス・ベクターを増殖させるための二官能性試薬の使用について、抗ペントン：TNFα融合タンパク質を用いて調べた。この特別な試薬は、安定なトランスフェクションがなされた昆虫細胞を用いて作った、Ad5ペントンとTNFαタンパク質の間の融合タンパク質である。この試薬は、ペントン・ベースを通じてアデノウイルスのキャプシドと特異的に結合することになるため、細胞表面のTNF受容体との結合が可能になる。標的に向かわないベクターAv3nBgFKO1の増殖にこの試薬を使用した結果は、表5に示してある（図24にも示してある）。1μg/mlの抗ペントン：TNFα融合タンパク質の存在下または不在下で、単層のS8細胞に、細胞1個につきAv3nBgFKO1を10〜100粒子、または対照ベクターを感染させた。この単層を時間をかけて目で検査し、細胞傷害効果（CPE）の程度を示すベクターの広がりを調べた。各時刻におけるCPEの割合を示してある。この二官能性試薬の使用により、ベクターAv3nBgFKO1の広がりが明らかに単層全体に増大する。
Figure 2007525166
この実施例と次の実施例では、異種ファイバーを発現するアデノウイルスAd5粒子の構成について説明する。ファイバーのN末端を改変し、Ad5粒子への組み込みを増大させる。N末端（一般に最初の少なくとも16個または17個のアミノ酸）を変化させ、配列がAd5の末端と似ているようにする。
ヒト・アデノウイルスのサブグループB、C、Dからのファイバー・タンパク質の発現
いくつかのアデノウイルス血清型（例えばタイプ16、30、35（サブグループB）や、タイプ19p、37（サブグループD））からのファイバーを発現させるための構造体を作った。
Ad37、Ad19p、Ad30ファイバー発現プラスミドの構成
Ad37ファイバー・タンパク質（配列ID番号31）、Ad19pファイバー・タンパク質（配列ID番号33）、Ad30ファイバー・タンパク質（配列ID番号35）のオープン・リーディング・フレーム（ORF）をPCRで増幅した。そのとき用いたプライマーは以下の通りである。
順プライマー（L37）：TGT CTT GGA TCC AAG ATG AAG CGC GCC CGC CCC AGC GAA GAT GAC TTC（配列ID番号84）
逆プライマー（37FR）：AAA CAC GGC GGC CGC TCT TTC ATT CTT G（配列ID番号85）
プライマーL37と37FRは、サブクローニングを容易にするためにそれぞれBamHI部位とNotI部位（太字）を含んでいる。さらに、プライマーL37は各ファイバー・タンパク質の5'末端に突然変異を導入することになるため、得られるファイバー・タンパク質は、Ad5粒子上に組み立てるためのAd5ファイバーのN末端配列により近くなる。Ad37では、元のN末端と変化したN末端は、以下のアミノ酸配列を有する。
Ad37の元のN末端：MSKRLRVE（配列ID番号86）
Ad37の変化したN末端：MKRARPSE（配列ID番号87）
増幅したファイバーをクローニングし、プラスミドpCDNA3.1zeo(+)（インヴィトロジェン社）のBamHI部位とNotI部位に入れた。プラスミドpDV55に由来し、BamHI部位（配列ID番号88）に隣接するAd5三者間リーダー（TPL）配列（実施例20と配列ID番号88を参照のこと）をサブクローニングし、各ファイバー発現プラスミドのBamHI部位に入れ、プラスミドpDV121（Ad37）、pDV145（Ad19p）、pDV164（Ad30）を作った。プラスミドpDV55の構成は、実施例20に示してある（同時係属中のアメリカ合衆国出願シリアル番号第09/482,682号（国際PCT出願PCT/US00/00265としても出願）と；アメリカ合衆国出願シリアル番号第09/562,934号（国際PCT出願PCT/EP01/04863としても出願）も参照のこと）。プラスミドpCDNA3.1zeo(+)に存在するCMVプロモータとpDV55からのTPL配列（配列ID番号88）を組み合わせると、ウイルスのタンパク質が高レベルで発現する。
Ad16ファイバー発現プラスミドとAd35ファイバー発現プラスミドの構成
Ad16ファイバー発現プラスミドとAd35ファイバー発現プラスミドを同様にして作ったが、以下の改変を行なった。Ad16ファイバー（配列ID番号37）とAd35ファイバー（配列ID番号39）をPCRで増幅するため、順プライマーを設計し、Ad5ファイバー（配列ID番号1）のヌクレオチド48の位置に存在するが、Ad16ファイバー配列とAd35ファイバー配列には存在しないNdeI部位（太字）を組み込んだ。逆プライマーは、NotI部位（太字）を含んでいた。
Ad16/Ad35順プライマー（F16 5'）：CCG GTC TAC CCA TAT GAA GATG（配列ID番号89）
Ad16逆プライマー（F16 3'）：TGG TGC GGC CGC TCA GTC ATC TTC TCTG（配列ID番号90）
Ad35逆プライマー（F35 3'）：TGG TGC GGC CGC TTA GTT GTC GTC TTC TGT AAT G（配列ID番号91）
Ad16 PCR産物とAd35 PCR産物をクローニングし、プラスミドpCDNA3.1zeo(+)のNdeI部位とNotI部位に入れると、プラスミドpDV147（Ad16）とpDV165（Ad35）になった。pCDNA3.1zeo(+)のNdeI部位はこのプラスミドのCMVプロモータ領域に含まれているため、得られたプラスミドは、CMVプロモータ領域の3'部分を欠いていた。さらに、挿入されたファイバー配列は、ファイバー配列で操作したNdeI部位の5'側の部分を欠いていた。必要な調節配列とN末端ファイバー配列を挿入するため、プラスミドpDV67（実施例22と、アメリカ合衆国出願シリアル番号第09/562,934号に記載されており、ATCCから登録番号PTA-1145として入手できる）をNdeIで消化させ、CMVプロモータの3'部分と、完全なAd5 TPL配列と、Ad5ファイバー配列の5'部分とを含む断片を除去した。このNdeI断片をサブクローニングし、プラスミドpDV147とpDV165に入れ、完全なAd16発現プラスミドpDV156とAd35発現プラスミドpDV166を作った。これら構造体が発現することにより、Ad5ファイバー（配列ID番号2）のN末端のアミノ酸17個と、Ad16またはAd35からのファイバー配列の残りとを含むキメラ・ファイバー・タンパク質になる。キメラ・ファイバーのヌクレオチド配列は、配列ID番号41（Ad5／Ad16）と配列ID番号43（Ad5／Ad35）に示してある。
組み換えAdファイバー・タンパク質の発現と三量体化
組み換えタンパク質の発現と三量体化を確認するため、得られたプラスミドを293T細胞にトランスフェクトした。293T細胞は、一体化されたSV40のラージT抗原遺伝子を発現することを除いて293細胞と同じである。293細胞は、アデノウイルスで形質転換したヒト胚性腎臓細胞系であり、ATCC（登録番号CRL 1573として寄託されている）から入手した。293T細胞は、CARとαvインテグリンを発現する。ファイバーの発現は、異なる血清型のファイバーで保存されているエピトープを認識する4D2モノクローナル抗体（リサーチ・ディアグノスティックス社、フランダース、ニュージャージー州）を用いた細胞ライセートの免疫ブロッティングによって検出した。安定な細胞系を作るため、構造体を、電気穿孔により、AdのE1a機能とE2a機能を補足するA549由来の細胞系（Gorziglia他、1996年、J. Virology、第70巻、4173〜4178ページ）に入れ、ゼオシンを用いた選択によって安定なクローンを得た。4D2抗体を用いた免疫ブロッティングにより、ファイバー・タンパク質を高レベルに発現するクローンを同定した。
サブグループB、C、DのAdファイバー・タンパク質でシュードタイピングしたアデノウイルス粒子の作製
異なるファイバー・タンパク質または改変ファイバー・タンパク質を有するために親和性が変化した（シュードタイピング）Adベクター粒子を作るための系は公知である（例えばvon Seggern他、2000年、J. Virology、第74巻、354〜362ページ；Wu他、2001年、Virology、第279巻、78〜89ページを参照のこと）。簡単に述べるならば、E1欠損Adベクターを、ファイバー遺伝子をさらに欠損させることによって改変し、このウイルスがもはやファイバー・タンパク質を産生しなくする。ファイバー・タンパク質を発現するとともに、E1の欠損を補足するパッケージング細胞内でファイバー欠損ウイルスを増殖させることにより、望む任意のファイバーを有する粒子を作ることができる。
興味の対象であるファイバーのための発現構造体を、E1とE2aを補足したA549由来の細胞系（Gorziglia他、1996年、J. Virology、第70巻、4173〜4178ページ）に安定にトランスフェクトすることにより、パッケージング細胞系を作り（von Seggern他、2000年、J. Virology、第74巻、354〜362ページ）、ファイバーを高レベルで発現したクローンを選択した。得られた系はE1とファイバーの欠損が補なわれており、Ad5.GFP.ΔF（欠損したE1配列の代わりにGFP導入遺伝子を有するファイバー欠損Ad5ベクター）を増殖させるのに使用した（von Seggern他、2000年、J. Virology、第74巻、354〜362ページ）。さまざまな細胞系の中で増殖させることによって得た粒子は、ファイバー・タンパク質以外は同じである。ウイルス粒子をCsCl勾配を用いた遠心分離によって分離し、モノクローナル抗体Ab 4D2を用いた免疫ブロッティングによってファイバーが存在しているかどうかを調べた。等しくローディングされたことを調べるため、Adペントン・ベース・タンパク質に対するポリクローナル抗体を用いてブロットを再度調べた。すべての組み換えファイバーをAd5粒子上に組み立てることができた。
ゲノム・ファイバーの置換を有するアデノウイルス粒子の構成と増殖
実施例18で説明したファイバー欠損系により、ファイバー・タンパク質の感染性を素早く評価することができる。得られた粒子は、対応する第1世代のベクターよりも感染性が弱い（von Seggern他、2000年、J. Virology、第74巻、354〜362ページ）。したがってAd5ファイバー遺伝子がサブグループB、C、Dいずれかのファイバーで置換されたウイルス骨格を構成した。これらベクターを容易に構成できるようにするため、AdEasy系（アメリカ合衆国特許第5,922,576号を参照のこと；He他、1998年、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、第95巻、2509〜2514ページも参照のこと；この系は、著者その他の供給源から公に入手することができる）を改変した。この系は、Ad5のゲノムの大部分を含む大きなプラスミド（pAdEasy）と、ウイルスのゲノムの左端を含んでいて、E1の欠損と導入遺伝子を挿入するためのポリリンカーがあるより小さなシャトル・プラスミドとを含んでいる。大腸菌の中でのpAdEasyとシャトル・プラスミドの間の組み換えにより、感染性のある完全長Adゲノムが再構成される。使用したすべてのプラスミドは、Ad5ファイバーがいろいろなファイバー・タンパク質で置換されたpAdEasy1の誘導体であった。
pDV153の構成
p5FloxHRF（配列ID番号92）は、右ITRの代わりにPacI部位を有するAd5のゲノム右端部を含んでいる。ファイバーの終止コドンの約30ヌクレオチド下流には唯一の（Ad5に天然に存在する）MunI部位が存在している。ファイバーの置換が容易になるよう、ファイバーのORFのすぐ下流へと、この部位を移動させた。こうすることにより、ファイバー遺伝子の周囲の配列と、このファイバー遺伝子とアデノウイルスの他の遺伝子の相対的間隔とが保持された。
オリゴMunITOP（AAT TGT GTT ATG TTT AAA CGT GTT TAT TTT TG；配列ID番号93）と
MunIBOTTOM（AAT TCA AAA ATA AAC ACG TTT AAA CAT AAC AC；配列ID番号94）をアニールし、p5FloxHRFの唯一のMunI部位と連結させ、プラスミドpDV153を作った。このオリゴを挿入することにより、5'末端の1つの塩基が変化して元のMunI部位が破壊されたが、元のMunI部位よりも32塩基対だけファイバーのORFに近い新しいMunI部位が挿入された。
キメラad5/Ad37ファイバー遺伝子を有するAdベクターの構成
pDV153のAd5ファイバー配列をAd37で置換するため、pDV153をSphIとMunIで消化させた。こうすることにより、Ad5ファイバーのN末端の183ヌクレオチド以外が除去される（配列ID番号1を参照のこと）。次に、SphIを付加する5'プライマー（F37 5'SphI）TAC CAA TGG CAT GCT ATC CCT CAA GG（配列ID番号95）と、EcoRI制限部位を付加する3'プライマー（F37 3'EcoRI）AAA CAC GGG AAT TCG TCT TTC ATT C（配列ID番号96）を用い、Ad37ファイバーをPCRで増幅した。Ad37ファイバー配列がMunI制限部位を含んでいるため、3'プライマーはEcoRI部位を持つように設計した。EcoRIとMunIを用いた消化で残ったヌクレオチド張出部は適合性があるため、PCR産物をクローニングし、SphIとMunIで消化させたpDV153に入れることができる。すると、Ad5ファイバー（配列ID番号2）からのN末端の61個のアミノ酸とAd37からのタンパク質の残部（Ad37ファイバーのアミノ酸62から末端までに対応；配列ID番号32）とを有するキメラAd5/Ad37ファイバー・タンパク質が発現した。
Ad37ファイバーをpDV153と連結させた後、SpeI/PacI断片を用いてpAdEasyのSpeI/PacI断片を置換するとプラスミドpDV158になった。次に、プラスミドpDV158を、CMVに制御されるEGFPレポータ遺伝子を含むシャトル・プラスミドpAdTrack（He他、1998年、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、第95巻、2509〜2514ページ；アメリカ合衆国特許第5,922,576号）と再び接合させた。得られたAdベクター（Ad5.GFP.37F）は、E1欠損部位にあるEGFPレポータと、ウイルスの染色体中のキメラAd5/Ad37ファイバー遺伝子とを備えており、CARではなくAd37受容体を通じて細胞に感染する。pDV158を利用し、ファイバー・タンパク質は同じだが異なる導入遺伝子を有するアデノウイルス粒子を容易に作ることができる。
633細胞内でのAd5.GFP.37Fの増殖
Ad5.GFP.37Fゲノムは感染性があり、ウイルスとしてただちに複製を開始する。Adの増殖に通常使用される293細胞（ATCC登録番号CRL 1573）はAd37受容体を高レベルで発現しないため、このウイルスは効率的に増殖しない。ウイルスの増殖を容易にするため、ウイルスのストックを、野生型Ad5ファイバーを発現する633細胞系（ATCC登録番号PTA-1145）（von Seggern他、2000年、J. Virology、第74巻、354〜362ページ）の中に維持した。したがって粒子は、この細胞が産生したAd5ファイバーと、ウイルスがコードしているキメラAd5/Ad37ファイバー・タンパク質とを含んでいる。ウイルスは、Ad5ファイバーにより、ウイルスの増殖に使用した細胞系に再び感染することができる。（ファイバー・タンパク質を発現しない）293細胞の中での最終回の増殖により、ベクターがコードしているAd37ファイバーだけを有する粒子が得られる。Ad5.GFP.37F粒子中のAd5ファイバーとAd37ファイバーの含有量を調べるため、633細胞または293細胞の中で産生されたウイルス粒子を抗ファイバー・モノクローナル抗体を用いて免疫ブロットした。633細胞の中で増殖した粒子は、Ad5ファイバーとAd5/Ad37ファイバーを含んでいたのに対し、293細胞の中で産生されたウイルスは、Ad5/Ad37キメラ・ファイバーだけを含んでいた。野生型Ad5ファイバーだけを含む第1世代AdベクターAd5.βgal.wtの粒子（Wu他、2001年、Virology、第279巻、78〜89ページ）は、正の対照として含まれていた。ローディングの対照として、ウイルスのペントン・ベース・タンパク質に対するポリクローナル抗体を用いて同じブロットを再度調べた。
異種ファイバーをコードしている追加Ad5ゲノムの調製
同じ手続きを利用し、19pファイバー（配列ID番号33）、16ファイバー（配列ID番号37）、30ファイバー（配列ID番号35）、35ファイバー（配列ID番号39）を含むAd5ゲノムを構成することができる。得られた粒子へのファイバーの組み込みを改善するため、各ファイバーを改変し、Ad5のN末端の61個のアミノ酸（配列ID番号2、または配列ID番号1のヌクレオチド1〜183を参照のこと）が含まれるようにした。そうなるようにするため、各異種ファイバーの対応するアミノ酸（すなわち最初の61個のアミノ酸）による置換を行なった。同様の構造体は、他の異種ファイバーとゲノム（例えばAd2）を用いて作ることができる。
例えばAd5/Ad16キメラ・ファイバー・ベクターを構成するため、プラスミドpDV153をSphIとMunIで消化させ、Ad5ファイバーの最初の183個のヌクレオチド以外をすべて除去した。Ad16ファイバー（配列ID番号37）をPCRで増幅した。そのとき用いたのは、SphI部位を含む5'プライマーF16 5'SphI：GCC AGC GGC ATG CTC CAA CTT AAA（配列ID番号97）と、MunIを含む3'プライマーF16 3'MunI：TTT ATC AAT TGT GTT GTC AGT CAT CTT C（配列ID番号98）である。PCR産物をプラスミドpDV153と連結させ、プラスミドpDV182を作った。その結果、Ad5ファイバー（配列ID番号2）からのN末端の61個のアミノ酸と、Ad16からのタンパク質の残部（Ad16ファイバーのアミノ酸62から末端までに対応；配列ID番号38）とを有するAd16キメラAd5/Ad16ファイバー・タンパク質が発現した。
アデノウイルス遺伝子送達ベクターの調製に使用するため、補足アデノウイルス・タンパク質（特にファイバー・タンパク質）の発現増大に有効な三者間リーダー配列（TPL）を提供する。PCR断片を組み立てることによって完全Ad5 TPLを構成した。まず最初に、合成オリゴヌクレオチド・プライマー5'-CTCAACAATTGTGGATCCGTACTCC-3'（配列ID番号99）と5'-GTGCTCAGCAGATCTTGCGACTGTG-3'（配列ID番号100）を用い、Ad5ゲノムDNAからの第3TPLエキソン（エキソン3）（Ad5ゲノムのnt9644〜9731）を増幅した。得られた生成物をクローニングし、プライマーの中の（太字で示した）部位を利用してpΔE1Sp1a（マイクロビックス・バイオシステムズ社；アメリカ合衆国特許第6,140,087号、第6,379,943号も参照のこと）のBamHI部位とBglII部位に入れ、プラスミドpDV52を作った。次に、プライマー5'-GGCGCGTTCGGATCCACTCTCTTCC-3'（配列ID番号101）と5'-CTACATGCTAGGCAGATCTCGTTCGGAG-3'（配列ID番号102）を利用して、第1TPLエキソン（エキソン1）に対応する断片と、天然の第1イントロン（イントロン1）と、第2TPLエキソン（エキソン2）（Ad5のnt6049〜7182）とに対応する断片を増幅し、クローニングして（やはりプライマーの中の太字で示した部位を利用して）pDV52のBamHIに入れ、pDV55を作った。
このプラスミドは、第1のTPLエキソンと、天然の第1のイントロンと、融合した第2と第3のエキソンとを含む1.2kbのBamI/BglII断片を含んでいる。上記の5'制限部位と3'制限部位を含む完全なTPLのヌクレオチド配列を配列ID番号103に示してある。このヌクレオチド配列では、以下のヌクレオチド領域が同定された：1〜6ntのBamHI部位；7〜47ntの第1リーダー・セグメント（エキソン1）；48〜1068ntの天然の第1イントロン（イントロン1）；1069〜1140ntの第2リーダー・セグメント（エキソン2）；1141〜1146ntの融合したBamHI部位とBglII部位；1147〜1234ntの第3リーダー・セグメント（エキソン3）；1235〜1240ntのBglII部位。
アデノウイルス・パッケージング細胞系を用いたアデノウイルス遺伝子送達ベクターの調製
E1/ファイバーとE4/ファイバーの組み合わせを別々に欠くアデノウイルス送達ベクターを調製する。そのようなベクターは、複数のウイルス遺伝子を欠いているため、以前に使用したものと比べて複製により多くの欠陥を有する。好ましいアデノウイルス送達ベクターは、複製能力を持つが、非ファイバー手段のみを通じてであり、ファイバー遺伝子だけを欠いているが、アデノウイルスの機能的な残りの調節遺伝子と構造遺伝子は含んでいるものである。さらに、このようなアデノウイルス送達ベクターは、外来DNAの挿入能力がより大きい。
A．特定の遺伝子が欠損したアデノウイルス遺伝子送達ベクターの調製と、その利用法
LacZレポータ遺伝子を含むE1／ファイバー欠損ウイルス・ベクターを構成するため、新しいプラスミドを2つ作った。プラスミドpΔE1Bβgalを以下のようにして作った。VspIで消化させることによってSV40調節配列と大腸菌β-ガラクトシダーゼ遺伝子を含むDNA断片をpSVβgal（プロメガ社）から分離し、dNTPの存在下でDNAポリメラーゼIのクレノウ・フラグメントで処理することによって張出末端部を埋め、BamIで消化させた。得られた断片をクローニングし、pΔE1sp1B（マイクロビックス・バイオシステムズ社；アメリカ合衆国特許第6,140,087号、第6,379,943号）のポリリンカーにあるEcoRI部位とBamI部位に入れ、pΔE1Bβgalを形成した。したがってpΔE1Bβgalは、E1a領域がpSVβgalのLacZカセット（ヌクレオチド6690〜4151）で置換されたアデノウイルスのゲノムの左側末端部を含んでいた。プラスミドDNAは、プラスミドDNAを増殖させるのに用いる形質転換された細胞から、アルカリ溶解法（BirnboimとDoly、Nuc. Acids Res.、第7巻、1513〜1523ページ、1978年に記載されている）で調製すること、またはキアジェン社の方法で製造社の指示に従って調製することができる。次に、プラスミドDNAを、CsCl-臭化エチジウム密度勾配遠心分離によって精製した。あるいはプラスミドDNAは、従来技術で知られている標準的な方法によって大腸菌から精製することもできる（例えばSambrook他を参照のこと）。
この明細書に記載したようにして調製した第2のプラスミド（pDV44）は、pBHG10に由来する。pBHG10は、当業者によく知られた方法を利用し、Bett他、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、第91巻、8802〜8806ページ、1994年（国際PCT出願WO 95/00655も参照のこと）に記載されているようにして調製される。このベクターはマイクロビックス・バイオシステムズ社からも市販されている。このベクターは、左端のパッケージ・シグナルが欠損し、E3領域（ヌクレオチド28133：30818）が、制限酵素PacIのための唯一の部位を有するリンカーで置換されたAd5ゲノムを含んでいる。アデノウイルスのゲノムの右端を含む11.9kbのBamHI断片をpBHG10から分離し、クローニングしてpBS/SK(+)のBamHI部位に入れ、約14,658bpのプラスミドp11.3を作った。次にこのプラスミドp11.3をPacIとSalIで消化させ、ファイバーと、E4と、逆方向末端反復配（ITR）とを除去した。
この断片を、ITRセグメントとE4遺伝子を含む3.4kbの断片で置換した。3.4kbの断片は、オリゴヌクレオチド配列：5'-TGTACACCG GATCCGGCGCACACC-3'（配列ID番号104）と5'-CACAACGAGCTC AATTAATTAATTGCCACATCCTC-3'（配列ID番号105）を用いてpBHG10からPCR増幅によって作った。これらプライマーは、PacI部位とBamHI部位を含んでいた。この断片をクローニングし、p11.3のPacI部位と末端が平滑なSalI部位に入れると、pBHG10に存在するITRと、E4領域と、ファイバー遺伝子とが融合した領域が、ITRとE4領域でだけ置換された。次に、ITRとE4領域を含む得られたプラスミドp11.3（プラスミドpDV43aと呼ぶ）をBamHIで消化させた。次に、このBamHI断片を用いてpBHG10内のBamHI断片と置き換えると、pBHG10骨格の中にpDV44ができた。
制限クローニング部位を容易に組み込むための追加サブクローニング・ステップを有する別のpDV44調製法では、以下のクローニング手続きを実施した。pBHG10（マイクロビックス・バイオシステムズ社；アメリカ合衆国特許第6,140,087号も参照のこと）からファイバー遺伝子といくつかの残留E3配列とを除去することにより、上記のpDV44を構成した。上記のように、操作を簡単にするため、Ad5ゲノムの最右端部を含む11.9kbのBamHI断片をpBHG10から取り出し、pBS/SKに挿入した。得られたプラスミドをp11.3と名づけた。上記のオリゴヌクレオチドを用い、アデノウイルスのタイプ5のE4領域と両方のITRに対応する3.4kbのDNA断片をpBHG10から上記のようにして増幅し、サブクローニングしてベクターpCR2.1（インヴィトロジェン社）に入れてpDV42を作った。このステップが追加クローニング・ステップであり、SalI制限部位の組み込みを容易にする。次にpDV42をPacIで消化させて一方のPCRプライマーに含まれる唯一の部位を切断し、次いでSalIで消化させてpCR2.1に含まれる唯一の部位を切断する。この断片を用いてp11.3の対応するPacI/XhoI断片（AdのこのDNA断片に隣接するpBSポリリンカーは、唯一のXhoI部位を含んでいる）を置換し、pDV43を作った。pBHG10の11.9kbのBamHI断片をpDV43の同様のBamHI断片と置換することにより、pDV44と名づけたプラスミドを構成した。最初の手続きで作られたものと同様、pDV44は、pBHG10とは、Ad5のヌクレオチド30819：32743（残留E3配列と、ファイバーのオープン・リーディング・フレームの最も3'側の41個のヌクレオチド以外のすべて）が欠損している点が異なっている。
まとめると、上記のクローニング手続きにより、pBHG10からファイバー遺伝子といくつかの残留E3配列を除去することによって構成したファイバー欠損Ad5ゲノム・プラスミド（pDV44）が得られる。pDV44は、野生型E4領域のうちでファイバーのORFの最後の41個のヌクレオチドだけを含んでいる（この配列が保持されて、隣接するE4転写単位の発現に影響を与えないようになっていた）。プラスミドpBHG10とpDV44は、パッケージングできないAd5のゲノムを含んでいるため、同時トランスフェクションと、それに続く機能的パッケージング・シグナルを有するDNAとの相同的組み換えによって救う必要がある。レポータ遺伝子で印をつけたベクターを作るため、pDV44またはpBHG10を、E1領域の代わりに挿入されていてSV40によって制御されるβ-ガラクトシダーゼ・レポータ遺伝子を有するAd5のゲノムの左端を含むpΔE1Bβgalと同時にトランスフェクトする。
一般に、そして以下に説明するように、プラスミドの組み換えによってウイルスを作った後、細胞培養物の中で補足を行なう方法は、任意のアデノウイルス・パッケージング細胞系（すなわち211A細胞、211B細胞、211R細胞、A549細胞、ベロ細胞など）を、ウイルス遺伝子送達ベクターに対応する配列を有するプラスミドと同時にトランスフェクトすることによって組み換えウイルスを分離する操作を含んでいる。
選択した細胞系をプレートの中に入れ、Betty他、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、第91巻、8802〜8806ページ、1994年に記載されているリン酸カルシウム法を利用してpDV44とpE1Bβ-galを同時にトランスフェクトする。2つのプラスミドで重複しているアデノウイルス配列の間で組み換えが起こり、完全長ウイルス染色体ができる。そのときpDV44とpΔE1Bβgalが組み換えられ、多数の欠損を有する組み換えアデノウイルス・ベクターが形成される。ウイルスの遺伝子におけるE1とファイバー遺伝子の欠損は、パッケージング細胞のゲノムと一体化する配列によって補償され、感染性ウイルス粒子が作られる。このようにして作られたプラークを分離し、組み換えウイルスのストックを標準的な方法で作る。
ファイバーが欠損が原因でpDV44由来のウイルスは複製に欠陥を持っているため、このウイルスを増殖させる細胞は、この欠陥を補足する必要がある。211B細胞系（293細胞の誘導体で、野生型（wt）Ad5ファイバーを発現し、ATCCに寄託されている211Aと同等である）を、この明細書に記載したウイルスのレスキューと増殖に使用した。pDV44とpΔE1Bβgalを同時に211B細胞にトランスフェクトし、単層を観察して細胞傷害効果（CPE）の証拠を探した。簡単に述べるならば、ウイルスを構成するため、ギブコ社のリン酸カルシウム・トランスフェクション系を製造者の指示に従って利用して細胞に上記のプラスミドをトランスフェクトし、CPEの証拠を毎日観察した。
合計で58あるトランスフェクトしたプレートの1つが、15日目に細胞死の広がる証拠を示した。粗凍結解凍ライセートをこの細胞から調製し、得られたウイルス（Ad5.βgal.ΔFと名づける）のプラーク精製を2回行なった後、増殖させた。精製されたウイルス調製物を調製するため、細胞に上記のAdを感染させ、CPEの完了を観察した。簡単に述べると、0日目、211B細胞を、面積が150cm2のフラスコに約1×107細胞という密度、またはそれと同等な密度になるようにして、DMEM+10％ウシ胎仔血清の中に入れた。1日目、培地を、元の体積の半分の量だけ、上記のAd（この場合にはAd5.βgal.ΔF）を約100粒子／細胞の割合で含む新鮮なDMEMと交換した。2日目、同じ量の培地を各フラスコに添加し、細胞のCPEを観察した。感染から2〜5日後、細胞を回収し、4回の急速凍結-解凍サイクルを通じて溶解させることによってウイルスを分離した。次にウイルスを、15〜40％CsCl勾配を利用した遠心分離（4℃にて111,000×gで3時間）によって精製した。バンドを回収し、貯蔵緩衝液（10mMのトリス（pH8.1）、0.9％NaCl、10％グリセロール）の中に透析し、アリコートを作り、-70℃で保管した。ヒト・アデノウイルスAd5.βgal.ΔFゲノム（以下に詳しく説明する）を含む精製Ad5.βgal.ΔFウイルス粒子は、1999年1月15日にATCCに寄託してある。
ウイルスの滴定を行なうため、Ad調製物を、211B細胞上でのプラーク・アッセイによって滴定した。ポリリシンでコーティングした6ウエルのプレートに細胞を1.5×106細胞／ウエルの割合で入れた。ウイルスのストックの2倍希釈液を、完全DMEMをウエル1つにつき1ml入れたプレートに添加した。37℃にて2時間インキュベートした後、ウイルスを取り出し、ウエルに0.6％低融点アガロースを含む培地199（ギブコ社）を2ml追加した。5日間の間隔で1mlを上から追加した。
対照として、第1世代ウイルスAd5.βgal.wt（ファイバーが欠損している以外はAd5.βgal.ΔFと同じもの）を、pBHG10とpΔE1Bβgalを同時にトランスフェクトすることによって構成した。ファイバーなしゲノムの回復効率が低い（58プレートのうちの1つ）のとは対照的に、pΔE1BβgalとpBHG10を同時にトランスフェクトした9つのプレートすべてがウイルスを生み出した。
別の一実施態様では、送達プラスミドの調製には、ファイバー遺伝子が欠損したウイルス・ベクターを調製するための上記の組み換えを必要としない。一実施態様では、パッケージングに必要なアデノウイルスの全ゲノムを含んでいるが、ファイバー遺伝子は欠けている単一の送達プラスミドを、完全長Ad5を含むプラスミドpFG140（マイクロボックス社から市販されている）から調製する。次に、得られる送達プラスミド（pFG140-fと呼ぶ）を、pCLF（ATCC登録番号97737；同時係属中のアメリカ合衆国出願シリアル番号第09/182,682号（2000年1月14日に国際PCT出願PCT/US00/00265としても出願されている））とともに用いる。pCLFは、上記のように、ファイバーが欠けたウイルス・ベクターを調製するための安定に一体化された細胞である。遺伝子療法のためには、ファイバー遺伝子を興味の対象である治療用遺伝子で置換して治療用送達アデノウイルス・ベクターを調製することができる。
望む任意の遺伝子（好ましくは治療用遺伝子）を送達するベクターは、上記のpE1Bβgalを調製するのと同様の方法で、興味の対象である遺伝子をクローニングし、市販されているpΔE1sp1B（マイクロビックス・バイオシステムズ社；アメリカ合衆国特許第6,140,087号も参照のこと）のポリリンカーに含まれている複数のクローニング部位に入れることによって調製する。その後、この明細書に記載したようにして同じ同時トランスフェクションと組み換えの手続きを行ない、ウイルス遺伝子送達ベクターを得る。
1．Ad5.βgal.ΔFゲノムのキャラクタリゼーション
ベクターのゲノムが適切な構造を持っていること、またAd5.βgal.ΔFの染色体にファイバー遺伝子が存在していないことを確認するため、ウイルス粒子から分離したDNAを分析した。簡単に述べるならば、アデノウイルス含有培養物の上澄800μlに、10mg/mlのプロテイナーゼKを10μlと、0.5MのEDTAを40μlと、10％SDSを50μlを添加することにより、精製したウイルスDNAを得た。次にこの懸濁液を55℃にて60分間にわたってインキュベートした。次にこの溶液の抽出を、クロロホルム：イソアミルアルコールが24：1の混合物400μlを用いて行なった。次に水相を取り出し、酢酸ナトリウム／エタノールを用いて沈澱させた。ペレットを70％エタノールで1回洗浄し、わずかに乾燥させた。次にペレットを40μlの10mMのトリス-HCl（pH8.0）と1mMのEDTAの中に懸濁させた。Ad5.βgal.wtとAd5.βgal.ΔFからのゲノムDNAは、EcoRIまたはNdeIのいずれかで消化させた後に予想された制限パターンを示した。標識したファイバーDNAをプローブとして用いて標準的な方法でサザン・ブロッティングを実施することにより、Ad5.βgal.wtのDNAにはファイバー配列が存在しているが、Ad5.βgal.ΔFのDNAにはファイバー配列が存在していないことがわかった。正の対照として、ブロットをはがし、標識したE4配列を用いて再度調べた。pCLFとpE4/Hygroからの標識した挿入体を用いることにより、それぞれファイバー配列とE4配列が検出された。E4シグナルは両方のゲノムで容易に検出でき、同じ強度であった。Ad5.βgal.ΔFの完全なヌクレオチド配列を配列ID番号106に示してある。この配列は、ATCCに寄託したウイルス粒子に含まれている。
2．ファイバーなしアデノウイルスAd5.βgal.ΔFのキャラクタリゼーション
Ad5.βgal.ΔFにファイバーが欠けていることを確認するため、293細胞（E1欠損Adベクターの増殖は許すが、ファイバーは発現しない）にAd5.βgal.ΔFまたはAd5.βgal.wtを感染させた。感染させてから24時間後、ファイバー・タンパク質またはペントン・ベース・タンパク質に対するポリクローナル抗体で細胞を染色した。いずれかのウイルスに感染した細胞は抗ペントン・ベース抗体で染色されたのに対し、Ad5.βgal.wt対照ウイルスを感染させた細胞だけが、抗ファイバー抗体と反応した。このことから、ファイバー欠損Ad突然変異体は、ファイバー・タンパク質の合成を指示しないことが確認される。
3．補足細胞におけるファイバー欠損Ad5.βgal.ΔFベクターの増殖
Ad5.βgal.ΔFは、211B細胞の中で容易に増殖することがわかった。タンパク質の濃度を調べると、CsClで精製したAd5.βgal.ΔFまたはAd5.βgal.wtいずれかのストックは、似たような数のウイルス粒子を含んでいた。粒子は、CsCl勾配上に正常なバンドを作るように見えた。Ad5.βgal.ΔF粒子の感染性は、対照であるAd5.βgal.wtよりも低かった。そのことは、粒子／PFUの比が大きくなることでわかる。Ad5.βgal.ΔFはまた、対照ウイルスよりもゆっくりとプラークを形成することが見いだされた。211B細胞の上に置くと、Ad5.βgal.wtのプラークは5〜7日以内に出現したのに対し、Ad5.βgal.ΔFのプラークは、感染後15〜18日目まで出現し続けた。Ad5.βgal.ΔFのプラークは、形成がより遅いにもかかわらず。形状は実質的に正常であった。
4．ファイバーなしAd5.βgal.ΔF粒子の産生
Ad5.βgal.ΔFは本当のファイバーなし突然変異であり、そのストックはヘルパー・ウイルスを含んでいないため、ファイバー突然変異表現型を容易に調べることができた。ファイバーを作らない細胞（例えば293細胞）内で1回増殖させてファイバーなしAdの均一な調整物を作ることにより、そのような粒子が安定である、および／または感染性であるかどうかを明らかにすることができた。Ad5.βgal.wtまたはAd5.βgal.ΔFを293細胞または211B細胞の中で増殖させ、得られた粒子を上記のようにしてCsCl勾配上で精製した。Ad5.βgal.ΔF粒子は293細胞の中で対照ウイルスとほぼ同じレベルで簡単に作られ、CsCl勾配上で同様の振る舞いをした。これは、ファイバーなしキャプシドの形態形成に大きな欠陥がなかったことを示している。
ウイルス粒子は、どのタイプの細胞の中で増殖したかに関係なく、ペントン・ベースを似たような量含んでいた。これは、ペントン・ベース複合体を組み立ててビリオンにするのにファイバーが必要ないことを示している。293細胞の中で産生されたAd5.βgal.ΔF粒子はファイバー・タンパク質を含んでいなかった。211B細胞の中で増殖したAd5.βgal.ΔFも、Ad5.βgal.wt対照ウイルスよりファイバーが少なかった。異なるウイルス調製物の上皮細胞への感染性は、存在するファイバー・タンパク質の量と相関していた。ファイバーなしAd粒子は、1粒子当たりの感染性が第1世代の対照ベクターの数千分の1であったのに対し、211B細胞の中で増殖させたAd5.βgal.ΔFの感染性は、Ad5.βgal.wtのほんの1/50〜1/100になっただけであった。これらの研究により、ファイバーの決定的な役割が、CARとの結合を通じた上皮細胞への感染であることが確認された。
5．ファイバーなしAd5.βgal.ΔF粒子の組成と構造
293細胞の中で増殖させたAd5.βgal.ΔFの粒子に含まれるタンパク質をAd5.βgal.wtに含まれるタンパク質と比較し、このファイバーなし変異体においてタンパク質分解または粒子の組み立てに欠陥があるかどうかを調べた。ファイバーなし粒子中のタンパク質群の全体的パターンは、第1世代のベクターの場合と非常によく似ていることが観察されたが、タンパク質IIIaとIV（ファイバー）からの複合バンドの強度が低下している点が異なっていた。ファイバーなし粒子は、タンパク質VIIのレベルも低下していた。タンパク質VI、VII、VIIIになる開裂していない前駆体の実質的な量は調べていないが、タンパク質VIIよりも前方を移動する低分子量のバンドが、異常な開裂をしたウイルス・タンパク質またはその分解産物を表わしている可能性がある。
低温電子顕微鏡を利用し、293細胞の中で増殖させたAd5.βgal.ΔFとAd5.βgal.wtの構造をより詳しく調べた。柄が延びていてその端部にノブを有するファイバーは、野生型Ad5粒子が好ましい向きになっているときにはわずかに見えたが、ファイバーなし粒子の画像の中にはなかった。自由なウイルスDNAに対応していると思われるフィラメント状材料が、ファイバーなし粒子の顕微鏡写真に見られた。この材料は、第1世代の対照ウイルスの顕微鏡写真にも、はるかに低いレベルだが存在していた。
ファイバーなし粒子と野生型粒子を約20オングストロームの解像度で三次元画像に再構成すると、サイズと全体的な特徴が似ていたが、ファイバーなし粒子は、ファイバー・タンパク質に対応する濃密部が欠けている点が異なっていた。他のキャプシド・タンパク質（タンパク質IIIa、VI、IX）に対応する濃密部は、2つの構造で同等であった。これは、ファイバーがないと、これら要素が組み立てられてビリオンになるのが妨げられることの証拠である。野生型構造では、ファイバーは、可撓性のあるシャフトの下部だけが二十面体対称性に従うために先端が切れていた。ファイバーなしペントン・ベース上のRGD突起部は、野生型構造の場合と比べてわずかに内側に向かって曲がっていた。2つのペントン・ベース・タンパク質間の別の違いは、ファイバーなしペントン・ベースにおいて、通常はファイバーが存在する5回軸のまわりに直径が約30オングストロームの凹部が存在していたことである。Ad5を再構成することにより、ファイバーがまったく存在していなくてもキャプシドの組み立て（頂点へのペントン・ベースの付加も含む）が可能であることが確認される。
6．ファイバーなしAd5.βgal.ΔF粒子のインテグリンに依存した感染性
ウイルスのファイバー・タンパク質を通じた付着が上皮細胞の感染における非常に重要なステップであるが、肝細胞の感染には別の経路が知られている。この場合、ペントン・ベースが、（β2インテグリンを通じた）細胞との結合と（αvインテグリンとの相互作用を通じた）内部化を媒介する。したがってファイバーのない粒子は、粒子1つで見ると上皮細胞に対する感染性が正常なAdベクターの数千分の1であるが、その細胞に感染する能力を有することが予想される。
そのことを調べるため、THP-1単細胞に、ファイバーなしで増殖させたAd5.βgal.wtまたはAd5.βgal.ΔFを感染させた。0.5mlの完全RPMIの中で指示されたm.o.i（感染多重度）にて2×105個の細胞を感染させることにより、THP-1細胞の感染を調べた。感染させてから48時間後、細胞をグルタルアルデヒドで固定し、X-galで染色し、染色された細胞の割合を光学顕微鏡で調べた。この感染アッセイの結果は、THP-1細胞に関してファイバーなし粒子では第1世代のAdと比べて感染性がほんの数分の1になったことを示していた。上皮（211B）細胞上でのプラーク形成効率に大きな違いが見られた。Ad5.βgal.ΔFまたはAd5.βgal.wtによるTHP-1細胞の感染は、過剰な可溶性組み換えファイバー・タンパク質によっては阻止されず、組み換えペントン・ベースの添加によって抑制することができた。この結果は、THP-1細胞に感染するのにファイバーなしAd粒子がファイバーとは独立な経路を利用していることを示している。さらに、ファイバー・タンパク質が欠如していても、Ad5.βgal.ΔFが細胞に内部化されてそのゲノムが核に送達されることは妨げられなかった。これは、ファイバーなし粒子が適切に組み立てられることと、ファイバーなし粒子のコーティングをなくせることを示している。
このようにして作った組み換えウイルスでの上記の結果は、その組み換えウイルスを培養細胞と生体内で遺伝子送達ツールとして使用できることを示している。例えば複数の機能を喪失したベクターの効果と相対的免疫原性を研究するため、パッケージング系の中で増殖させることによってウイルス粒子を作り、CsCl勾配遠心分離によって精製する。滴定後、全身注入、局所注入、肺へのエーロゾル送達いずれかの方法でウイルス粒子をマウスに投与する。LacZレポータ遺伝子により、うまく形質転換された細胞の数とタイプを調べることができる。導入遺伝子の発現期間を調べ、複数の機能を喪失した組み換えアデノウイルスを用いた治療の長期有効性を、これまで臨床試験で用いられてきた標準的な方法と比べる。この明細書に記載した改良型ベクターの免疫応答を、炎症、ベクターに対する細胞傷害性Tリンパ球の産生、ウイルス・タンパク質に対する抗体応答の性質と大きさなどのパラメータを評価することによって調べる。
治療用遺伝子（例えば嚢胞性線維症を治療するためのCFTR）やがんを治療するためのがん抑制遺伝子を含むさまざまなベクターを、安全性と、遺伝子の導入および発現の効率とに関して動物系で評価する。この評価の後、ヒトでの臨床試験において実験的治療薬として使用する。
B．さまざまなファイバー・タンパク質または改変ファイバー・タンパク質を含むウイルス粒子を作ることによってアデノウイルス遺伝子送達ベクターを再び標的に向かわせる
アデノウイルスが標的細胞と結合する際の特異性はかなりの程度ファイバー・タンパク質によって決まるため、改変ファイバー・タンパク質または異なるアデノウイルス血清型からのファイバー・タンパク質を含むウイルス粒子（シュードタイピングされたベクター）は異なる特異性を有する。したがって、上に説明したようにしてアデノウイルス・パッケージング細胞の中で元のAd5ファイバー・タンパク質を発現させる方法が、異なるファイバー・タンパク質を産生させるのにも適用できる。
キメラ・ファイバー・タンパク質は、公知の方法で作ることができる（例えばStevenson他、1995年、J. Virol.、第69巻、2850〜2857ページを参照のこと）。ファイバーが受容体と結合する活性の決定因子は、ファイバーの頭部ドメインに位置しており、分離した頭部ドメインは、三量体化と細胞受容体への結合が可能である。アデノウイルスのタイプ3（Ad3）とAd5の頭部ドメインを交換してキメラ・ファイバー・タンパク質を作った。この明細書の方法で使用するため、キメラ・ファイバー・タンパク質をコードしている同様の構造体を考えることができる。例えばアデノウイルス・パッケージング細胞中の補足用ウイルス・ベクターとして（上記のようにして、あるいはアメリカ合衆国出願シリアル番号第09/482,682号のようにして調製した）完全なAd5ファイバーをコードしている構造体を用いる代わりに、この明細書に記載した構造体と、E4および／またはE1をコードしている構造体とを細胞にトランスフェクトする。
簡単に述べるならば、精製したアデノウイルスのゲノムDNAを鋳型として、完全長のAd5ファイバー遺伝子とAd3ファイバー遺伝子を増幅した。Ad5とAd3のヌクレオチド配列は、それぞれGenBank登録番号M18369およびM12411として入手できる。オリゴヌクレオチド・プライマーは、開始コドンATGから始まって終止コドンTAAで終わるまでの完全長ファイバー遺伝子の全コード配列が増幅されるように設計する。5'プライマーと3'プライマーは、クローニングしてプラスミドpcDNAに入れるため、それぞれ制限部位BamHIとNotIを含んでいる。PCRは、上記のようにして実施する。
次に、得られた産物を用い、PCR遺伝子重複伸長により、キメラ・ファイバー構造体を構成する（Horton他、1990年、BioTechniques、第8巻、525〜535ページ）。Ad5ファイバーの尾領域とシャフト領域（5TS；アミノ酸残基位置1〜403をコードしているヌクレオチド領域）をAd3ファイバーのヘッド領域（3H；アミノ酸残基位置136〜319をコードしているヌクレオチド領域）と接続し、5TS3Hキメラ・ファイバーを形成する。逆に、Ad3ファイバーの尾領域とシャフト領域（3TS；アミノ酸残基位置1〜135をコードしているヌクレオチド領域）をAd5ファイバーのヘッド領域（5H；アミノ酸残基位置404〜581をコードしているヌクレオチド領域）と接続し、3TS5Hキメラ・ファイバーを形成する。これら融合体は、ファイバーのシャフト-ヘッド接合部にある保存されたTLWT配列（配列ID番号46）の位置で作った。
次に、得られたキメラ・ファイバーPCR産物をBamHIとNotIで消化させて別々の方向に連結し、別の同様に消化させたpcDNA3.1に入れる。次にTPL配列をサブクローニングしてBamHIに入れ、あとで211細胞または別のパッケージング細胞系へのトランスフェクションに用いる発現ベクターを調製する。次に、得られたキメラ・ファイバー構造体含有アデノウイルス・パッケージング細胞系を用い、すでに説明したようにしてアデノウイルス送達ベクターを補足する。他のキメラ・ファイバー構造体は、アデノウイルスのさまざまな血清型を用いて同様の方法で得られる。
別の一実施態様では、改変エピトープを含む改変タンパク質を用いる（例えばMichael他、1995年、Gene Therapy、第2巻、660〜668ページと、国際PCT出願公開WO 95/26412を参照のこと。これらの文献には、新しい結合特異性がウイルスに組み込まれていると同時に内在性ウイルス結合特異性が破壊された、細胞のタイプに特異的な治療用ウイルス・ベクターの構成が記載されている）。特に、著者は、Ad5ファイバー遺伝子のコード配列の3'末端に位置してガストリン放出ペプチド（GPR）をコードしているアデノウイルスの製造について記載している。得られたファイバー-GPR融合タンパク質が発現し、合成後にヒーラ細胞の核に正しく輸送されて機能的ファイバー三量体が組み立てられることがわかった。
標的に向かわせることができ、複製能力がなく、免疫原性がより少ない新しいアデノウイルス送達ベクターを作るための補足アデノウイルス・パッケージング細胞系において、同様の構造体を使用することが考えられる。ファイバーの特異性を変えるためにこの明細書で使用することを考える異種リガンドは、サイズがわずか10個のアミノ酸から、大きな球状構造までの範囲にわたる。そのうちのいくつかは、スペーサ領域を付加することにより、ファイバに対する異種リガンドの立体障害を減らすか取り除くかしたり、ファイバー・タンパク質の三量体化を防いだりする必要がある。リガンドは、リンカー領域の末端または内部に挿入される。好ましいリンカーとしては、特定の細胞受容体を標的とするもの、あるいは他の部分（例えばビオチンやアビジン）とカップリングさせるのに用いられるものなどがある。
好ましいスペーサとしては、当業者に知られている定型的な手続きを利用し、セリンとアラニンの繰り返しに隣接してプロリン残基がそれぞれの端部に来る構成にした短い12アミノ酸のペプチド・リンカーが挙げられる。当業者であれば、リンカーを調製することによってタンパク質の十分な提示を実現し、ウイルスを内部化した後の細胞イベントを損なうことなしにファイバー・タンパク質の結合特異性を変えることができよう。さらに、この説明の文脈では、以下に説明するようにしてファイバー・タンパク質の内部に位置するリガンドとカルボキシ末端に位置するリガンドを有する改変ファイバーを調製し、この明細書に記載した方法で利用することが考えられる。
異種結合リガンドを有するファイバーは、本質的に上記の論文に記載されているようにして調製する。簡単に述べるならば、選択したリガンドについて、部位指定突然変異誘発を利用してリンカーのコード配列を、pCLF内のAd5ファイバー構造体の3'末端に挿入する。
3'オリゴヌクレオチド、またはアンチセンス・オリゴヌクレオチド、または突然変異誘発オリゴヌクレオチドは、プロリン-セリン-アラニン-セリン-アラニン-セリン-アラニン-セリン-アラニン-プロリン-グリシン-セリン（配列ID番号107）という好ましいリンカー配列をコードしており、その後にそれぞれ唯一の制限部位と2つの終止コドンが続いているため、選択した異種リガンドをコードしている配列を挿入し、翻訳を適切に停止させることが保証される。このリンカー配列に隣接する突然変異誘発オリゴヌクレオチドは、ベクター配列と重複する配列を含んでいるため、そのオリゴヌクレオチドを構造体の中に組み込むことができる。リンカー配列と終止コドン配列を付加するpCLF配列に突然変異誘発が起きると、あらかじめ選択したリガンドをコードするヌクレオチド配列が得られる。この改変構造体に含まれる唯一の制限部位に対応するリンカーを付着させ、次いでその配列をクローニングし、線状化した対応する制限部位に入れる。次に、得られるファイバー-リガンド構造体を用いて211細胞またはすでに説明した別のパッケージング系にトランスフェクトし、補足ウイルス・ベクター・パッケージング系を作る。
さらに別の一実施態様では、異なるAd血清型からの完全なファイバー遺伝子を211細胞または別のパッケージング系で発現させる。興味の対象であるファイバー・タンパク質をコードしている遺伝子をまずクローニングしてpCLFと似たプラスミドを作り、Ad5ファイバーについて上に説明したようにして、ファイバー・タンパク質を産生する安定な細胞系を作る。次に、ファイバー遺伝子を欠くアデノウイルス・ベクターを、目的に関係するファイバー・タンパク質を産生する細胞系の中で増殖させる。存在する唯一のファイバー遺伝子はパッケージング細胞に存在するものであるため、作られるアデノウイルスは興味の対象であるファイバー・タンパク質だけを含んでおり、その結果として補足タンパク質によって与えられる結合特異性を有する。上記のようなウイルス粒子を研究で使用し、実験動物系においてその性質を明らかにする。
別のTPLを含むプラスミドを含有するアデノウイルス・パッケージング細胞系の調製と利用
三者間リーダー（TPL）を含むプラスミドを構成した。さまざまな選択マーカー（例えばゼオシン）を含む得られたプラスミドを用い、アデノウイルス・ベクターの調製に用いる安定なファイバー補足細胞系を調製した。
A．pDV60
ネオマイシン選択プラスミドであるpcDNA3/ファイバー中でAd5ファイバー遺伝子の上流にあるBamHI部位に配列ID番号88のTPLカセットを挿入することにより、プラスミドpDV60を構成した（例えばアメリカ合衆国出願シリアル番号第09/482,682号（2000年1月14日に国際PCT出願PCT/US00/00265としても出願されている）を参照のこと；von Seggern他、1998年、J. Gen. Virol.、第79巻、1461〜1468ページも参照のこと）。pDV60のヌクレオチド配列を配列ID番号108に示してある。プラスミドpDV60は、ATCCから登録番号PTA-1144として入手できる。
B．pDV61
pDV61を構成するため、CMVプロモータと、Ad5のTPLの一部と、野生型Ad5ファイバー遺伝子と、ウシ成長ホルモンのターミネータとを含むAsp718/NotI断片を、pCLF（ATCC登録番号97737；同時係属中のアメリカ合衆国出願シリアル番号第09/482,682号（2000年1月14日に国際PCT出願PCT/US00/00265としても出願されている）に記載されている）から、pcDNA3.1/Zeo(+)（インヴィトロジェン社から市販されており、配列が公知である）と呼ばれるゼオシン選択クローニング・ベクターに移した。
C．pDV67
同様の方法で、pDV60からのAsp718/XbaI断片をpcDNA3.1/Zeo(+)骨格に移すことにより、完全なTPLを含むpDV67を構成した。pDV67のヌクレオチド配列は配列ID番号109に示してある。プラスミドpDV67は、ATCCから登録番号PTA-1145として入手できる。
D．pDV69
改変ファイバー・タンパク質を含むpDV69を調製するため、プライマー5'-ATGGGATCAAGATGAAGCGCGCAAGACCG-3'（配列ID番号110）と5'-CACTATAGCGGCCGCATTCTCAGTCATCTT-3'（配列ID番号111）を利用してキメラAd3/Ad5ファイバー遺伝子をpGEM5TS3H（Stevenson他、1995年、J. Virol.、第69巻、2850〜2857ページ）から増幅し、クローニングし、遺伝子操作によってプライマーに組み込んだBamHI部位とNotI部位を通じてpcDNA3.1/Zeo(+)のBamHI部位とNotI部位に入れてpDV68を作った。最後に、上記の完全なTPL断片をpDV68の唯一のBamHI部位に付加してpDV69を作った。pDV69のヌクレオチド配列は配列ID番号112に示してあり、このプラスミドは、ATCCから登録番号PTA-1146として入手できる。
E．安定なアデノウイルス・パッケージング細胞系の調製
E1-2a S8細胞は、A549肺癌系（ATCC登録番号CCL 185）の誘導体であり、プラスミドpGRE5-2.E1（GRE5-E1-SV40-Hygro構造体とも呼ばれ、配列ID番号47に示してある）とpMNeoE2a-3.1（MMTV-E2a-SV40-Neo構造体とも呼ばれ、配列ID番号48に示してある）の染色体が挿入されている。なおこれらプラスミドは、それぞれ、アデノウイルスのE1機能とE2a機能を補足する。この系とその誘導体を、リヒター改変培地（バイオホイッテイカー社）+10％FCSの中で増殖させた。以前に報告されているように電気穿孔でpDV61、pDV67、pDV69のいずれかをE1-2a S8細胞に入れ（von Seggern他、1998年、J. Gen. Virol.、第79巻、1461〜1468ページ）、ゼオシン（600μg/ml）を用いて安定な系を選択した。
pDV61を用いて作った細胞系を601と名づける。pDV67を用いて作った細胞系を633と名づけ、pDV69を用いて作った細胞系を644と名づける。Ad2ファイバーに対するポリクローナル抗体を用いた免疫蛍光染色によって候補クローンを評価した。ファイバー・タンパク質を最高レベルで発現した系の特徴をさらに調べた。
S8細胞補足細胞系に関しては、E1の発現を誘導するため、0.3μMのデキサメタゾンを細胞培養物に添加してから16〜24時間後、最適な増殖速度を調べるためにウイルスによるチャレンジを行なった。ウイルスのプラークを調製するため、6ウエルのプレートにウエル1つにつき5×105個の細胞を用意し、ウイルスを感染させる前日に、感染後の寒天オーバーレイ中に最終濃度として含まれるのと同じ0.5μMの濃度のデキサメタゾンであらかじめ誘導した。
F．E1/E2aベクターを補足するための細胞系
アデノウイルス5のゲノムを酵素ScaIで消化させ、アガロース・ゲル上で分離し、ウイルスのゲノムの左端を含む6,095bpの断片を単離した。完全なアデノウイルス5のゲノム（参考としてこの明細書に組み込まれているものとする）は、GenBank登録番号M73260（または配列ID番号1を参照のこと）として登録されており、ウイルスは、アメリカ基準培養物コレクション（マナサス、バージニア州、アメリカ合衆国）から登録番号VR-5として入手できる。6,095bpのScaI断片をさらにbp917の位置でClaIを用いて消化させ、bp3,328の位置でBglIIを用いて消化させた。得られたClaIからBglIIまでの2,411bpの断片をアガロース・ゲルから精製し、スーパーリンカー・シャトル・プラスミドpSE280（インヴィトロジェン社、サン・ディエゴ、カリフォルニア州）と連結させ、それをClaIとBglIIで消化させてpSE280-Eを形成した。
ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）を実施し、アデノウイルス5のDNAのbp552〜924と連続していてXhoI制限部位とSalI制限部位をコードしているDNAを合成した。使用したプライマーは以下の通りである。
5'末端、Ad5のbp552〜585：
5'-GTCACTCGAGGACTCGGTC-GACTGAAAATGAGACATATTATCTGCCACGGACC-3'（配列ID番号113）；
3'末端、Ad5のbp922〜891：
5'-CGAGATCGATCACCTCCGGTACAAGGTTTGGCATAG-3'（配列ID番号114）
増幅したこのDNA断片（この明細書では断片Aとも呼ぶ）をXhoIとClaI（元のClaI部位（bp917）で開裂させる）で消化させpSE280-EのXhoI部位およびClaI部位と連結させた。するとATGコドンの8bp上流から始まるE1領域の5'末端が再構成された。次にPCR増幅を実施し、Ad5のDNAでEcoRI制限部位に隣接するbp3,323〜4,090を増幅した。使用したプライマーは以下の通りである。
5'末端、Ad5のbp3323〜3360：
5'-CATGAAGATCTGGAAGGTGCTGAGGTACGATGAGACC-3'（配列ID番号115）；
3'末端、Ad5のbp4090〜4060：
5'-GCGACTTAAGCAGTCAGCTG-AGACAGCAAGACACTTGCTTGATCCAAATCC-3'（配列ID番号116）
増幅したこのDNA断片（この明細書では断片Bとも呼ぶ）をBglII（この制限酵素を用いると、アデノウイルス5のBglII部位（bp3,382）で切断される）とEcoRIで消化させ、pSE280-AEのBglII部位およびEcoRI部位と連結させてアデノウイルス5のbp552〜4,090から完全なE1a領域とE1b領域を再構成した。得られたプラスミドをpSE280-E1と名づけた。
合成プロモータGRE5の制御下にある完全なE1a/b領域を含む構造体を以下のようにして調製した。XhoIとBamHIで消化させることによってE1遺伝子の3'側にBamHI部位を含むようにあらかじめ改変したpSE280-E1から、完全なE1a/b領域を切除した。E1a/b断片を含むXhoIからBamHIまでの断片をクローニングし、pGRE5-2/EBV（U.S.バイオケミカルズ社、クリーヴランド、オハイオ州）の唯一のXhoI部位とBamHI部位に入れてpGRE5-E1を形成した。
最終的な構造体を含む形質転換細菌細胞を同定した。プラスミドDNAを調製し、CsTFAの中で帯状にすることによって精製した後、細胞のトランスフェクションに使用した。
G．アデノウイルス5のE2A配列を含むプラスミドの構成
アデノウイルス5のゲノムを、bp21,562の位置で切断するBamHIと、bp27,080の位置で切断するSpeIで消化させた。断片をアガロース・ゲル上で分離し、BamHIからSpeIまでの5,518bpの断片を分離した。BamHIからSpeIまでの5,518bpのこの断片をさらに、bp23,912の位置で切断するSmaIで消化させた。得られたBamHIからSpeIまでの2,350bpの断片をアガロース・ゲルから精製し、スーパーリンカー・シャトル・プラスミドpSE280と連結させ、それをBamHIとSmaIで消化させてpSE280-E2 BamHI-SmaIを形成した。
次にPCRを実施し、アデノウイルス5のDNAでbp23,912の位置にあるSmaIから、NheI制限部位およびEcoRI制限部位と連続したbp24,730の位置までを増幅した。使用したプライマーは以下の通りである。
5'末端、Ad5のbp24,732〜24,708：
5'-CACGAATTCGTCAGCGCTTCTCGTCGCGTCCAAGACCC-3'（配列ID番号117）；
3'末端、Ad5のbp23,912〜23,934：
5'-CACCCCGGGGAGGCGGCGGCGACGGGGACGGG-3'（配列ID番号118）
増幅したこのDNA断片をSmaIとEcoRIで消化させ、pSE280-E2 BamHI-SmaIのSmaI部位およびEcoRI部位と連結させ、Ad5のbp24,730〜21,562から完全なE2a領域を再構成した。得られた構造体はpSE280-E2aである。
E2aの3'末端にあるBamHI部位をSalI部位に変換するため、BamHIとNheIを用いてE2a領域をpSE280-E2aから切除し、再びクローニングしてpSE280の唯一のBamHI部位とNheI部位に入れた。その後、NheIとSalIを用いてE2a領域をこの構造体から切除し、クローニングしてpMAMneo（クロンテック社、パロ・アルト、カリフォルニア州）の5'から3'に向かう多重クローニング部位であるNheI部位とSalI部位に入れた。得られた構造体はpMAMneo-E2aである。
最終的なpMAMneo-E2aを含む形質転換細菌細胞を同定した。プラスミドDNAを調製し、CsTFAの中で帯状にすることによって精製した。環状プラスミドDNAを、pMAMneo-E2aのアンピシリン抵抗遺伝子内にあるXmnI部位の位置で線状化し、フェノール／クロロホルム抽出によってさらに精製し、エタノール沈降を行なった後、細胞のトランスフェクションに使用した。
H．細胞のトランスフェクションと選択
一般に、このプロセスは、それぞれが異なるウイルス遺伝子を有する2つのプラスミド構造体を、リン酸カルシウム沈降法または他のDNA送達手段によって順番に単一の組織培養細胞の中に導入する操作を含んでいる。細胞に第1の構造体をトランスフェクトし、関連する薬剤耐性遺伝子の発現に関して選択を行ない、安定に一体化したものを確立した。個々の細胞クローンを確立し、導入されたウイルス遺伝子の機能を調べた。次に適切な候補クローンに、第2のウイルス遺伝子と第2の選択マーカーとを含む第2の構造体をトランスフェクトした。次にトランスフェクトされた細胞を選択し、第2の構造体が安定に一体化したものを確立し、細胞クローンを確立した。細胞クローンについて両方のウイルス遺伝子の機能的発現を調べた。
A549（ATCC登録番号CCL-185）を用いてトランスフェクションを行なった。G418とハイグロマイシンBに関して標準的な殺傷曲線を決定することにより、適切な選択条件を設定した。
I．E1領域とE2a領域を含むプラスミドのA549細胞へのトランスフェクション
pMAMneo-E2aを、Amp（登録商標）遺伝子を有するXmnIで線状化し、トランスフェクションによって細胞の中に導入し、このプラスミドが安定に一体化した細胞を、薬剤耐性コロニーが生じるまでG418選択によって選択した。クローンを単離し、ポリクローナル抗血清を用いて染色した後、免疫蛍光によって可視化することにより、E2aの発現をスクリーニングした。E2a遺伝子の中に温度感受性突然変異が含まれた温度感受性突然変異体Ad5ts125ウイルス（Van Der Vliet他、J. Virology、第15巻、348〜354ページ、1975年）を補足することにより、E2aの機能をスクリーニングした。E2a遺伝子を発現するプラスのクローンを同定し、pGRE5-E1からのEcoRVからXmnIまでの7kbの断片（GRE5をプロモータとするE1a/b領域と、ハイグロマイシン（登録商標）遺伝子とを含んでいる）とともにトランスフェクションに使用した。ハイグロマイシン耐性に関して細胞を選択し、E1タンパク質に対するモノクローナル抗体（オンコジーン・サイエンシーズ社、ユニオンデール、ニューヨーク州）を用いた染色によってE1a/bの発現を調べた。E1欠損ベクターを補足する能力という観点からE1の機能を調べた。この時点で、E2aの発現と機能を上記のようにして確認し、プラスの細胞クローンにおいてE1a/bとE2aの発現を確立した。
トランスフェクトされたA549（A549（ATCC登録番号CCL-185））細胞系ではE1a/bとE2aの発現が良好であり、この細胞系を選択してさらに特徴を調べた。この細胞系をS8細胞系と名づけた。
J．S8ファイバー補足細胞系のAd5.βgal.ΔFゲノムを含むアデノウイルス・ベクターの調製
ファイバー・タンパク質の発現を増大させるために別の形態のTPLを含むS8細胞のAd5.βgal.ΔF（Ad5.βgal.ΔFは、ATCCに登録番号VR2636として寄託された）を含むアデノウイルス・ベクターを調製するため、211B細胞の中でAd5.βgal.ΔFを調製するための実施例21に記載したプロトコルに従ったが、上に説明したようにして0.3μMのデキサメタゾンを用いて24時間にわたって予備処理した点が異なっている。例えば、野生型Ad5ファイバー・タンパク質を表面に持ち、ファイバーなしAd5.βgal.ΔFゲノムを含むウイルス粒子を633細胞に産生させた。644細胞の中で産生された粒子もファイバーなしAd5.βgal.ΔFゲノムを含んでいたが、Ad3ファイバーのノブを有するキメラ5T3Hファイバー・タンパク質を表面に含んでいた。これらウイルス調製物を利用すると、Ad5.βgal.ΔF、Ad5.GFP.ΔF、または同様に構成された他のファイバーなしゲノムを、野生型ファイバーまたは改変ファイバーとともに標的に送達することができる。
シュードタイピングしたアデノウイルス粒子によって増大する樹状細胞への感染
メスのBalb/Cマウスからの骨髄細胞をGM-CSFおよびIL-4とともに培養することにより、骨髄由来の樹状細胞を得た（『免疫学における最新のプロトコル』（1998年、ジョン・ワイリー＆サンズ社、フィラデルフィア）の3.7.1〜3.7.15にあるInaba他、「樹状細胞の単離」）。培養した細胞が樹状細胞に特徴的な表面マーカーを発現したことを確認するため、その培養細胞を、CD11c、CD80、CD86に対する抗体に蛍光体を共役させたもので染色し、蛍光活性化セル・ソーティング（FACS）分析で調べた。樹状細胞マーカーCD11c、CD80、CD86に対する抗体は、例えばeバイオサイエンス社から市販されている。
初代樹状細胞培養物に、Ad5ファイバー、Ad16ファイバー、Ad19pファイバー、Ad30ファイバー、Ad35ファイバー、Ad37ファイバーのいずれかでシュードタイピングしたAd5.βgal.ΔFを細胞1個につき100,000ウイルス粒子の割合で感染させた。ウイルスによって誘導されるGFPの発現に関してプラスの細胞の割合を、感染してから48時間後にFACS分析で調べた。どの感染操作も3回実施し、平均±標準偏差を求めた。
以前の実験と一致する結果だが、Ad5ファイバーでシュードタイピングしたAd5.βgal.ΔFはあまり樹状細胞に感染せず、GFPの発現に関してプラスの細胞は約10％であった。これは、樹状細胞の表面にCARの発現が欠けているためであろう。それとは逆に、Ad16ファイバー、Ad19pファイバー、Ad30ファイバー、Ad35ファイバー、Ad37ファイバーのいずれかを有するウイルスは、樹状細胞への感染が増大した（細胞の約49％、46％、37％、26％、50％がGFPプラスだった）。これは、これら血清型に対するファイバーの受容体が樹状細胞で発現していることを示している。
サブグループDのアデノウイルスは選択的感染性を示す
アデノウイルスのファイバーのDNAとアミノ酸配列の配列と系統発生を分析することにより、サブグループBとDのウイルスが、異なる細胞受容体と結合することが示唆される（Havenga他、2002年、J. Virol.、第76巻、4612〜4620ページ）。さらに、サブグループBのウイルス（例えばAd16、Ad35、Ad50）は多彩ながん細胞系や一次細胞（例えば上皮細胞、平滑筋細胞、滑膜細胞、線維芽細胞、羊膜細胞、樹状細胞、骨髄支質細胞、軟骨細胞、筋芽細胞、メラノサイト、濾胞皮膚乳頭細胞、造血幹細胞（Havenga他、2002年、J. Virol.、第76巻、4612〜4620ページ）など）に感染できるのに対し、サブグループDのウイルスはより選択的な親和性を有する。
選択されたサブグループB（Ad3、Ad16、Ad35）とサブグループD（Ad19p、Ad30、Ad37）のアデノウイルスが同じ細胞親和性を示すかどうかを調べるため、一群のがん細胞系でAd遺伝子の送達をサポートする能力をテストした。使用した細胞系は、PC-3細胞、HepG2細胞、LNCaP細胞、DU145細胞であった。これらの細胞系は、ATCCから、それぞれ登録番号CRL-1435、HB-8065、CRL-10995、HTB-81として入手できる。
各細胞系に、Ad5（サブグループC）ファイバー、Ad3ファイバー、Ad16ファイバー、Ad19pファイバー、Ad30ファイバー、Ad35ファイバー、Ad37ファイバーのいずれかでシュードタイピングしたAd5.βgal.ΔFを、細胞1個につき1000、5000、100,000ウイルス粒子いずれかの割合で感染させた。48時間後、FACS分析でウイルスによるGFPの発現を調べた。細胞1個につき1000粒子を感染させたPC-3細胞に関しては、サブグループD（Ad19p、Ad30、Ad37）のファイバーでシュードタイピングしたウイルスを感染させた場合に、GFPの発現がほとんど、またはまったく検出されなかった。それとは逆に、Ad16ファイバーまたはAd35ファイバーを含むウイルスを感染させたPC-3細胞の約40％でGFPの発現が検出された。同様のGFP発現パターンが、より大きな感染多重度（m.o.i）で感染させた細胞で見られた。Ad16ファイバーまたはAd35ファイバーでシュードタイピングしたアデノウイルスを細胞1個につき5000粒子の割合で感染させたPC-3細胞の約80％でGFPがプラスだったのに対し、Ad19pファイバーまたはAd30ファイバーでシュードタイピングしたウイルスを感染させたときには、わずか2％のPC-3細胞がGFPプラスだった。
同様に、HepG2細胞では、Ad16ファイバーまたはAd35ファイバーでシュードタイピングしたウイルスを細胞1個につき5000粒子の割合で感染させたとき、約80％の細胞がGFPプラスだったが、Ad19pファイバーまたはAd30ファイバーでシュードタイピングしたウイルスを感染させたときには、25％未満がGFPプラスだった。さらに、Ad19pファイバー、Ad30ファイバー、Ad37ファイバーのいずれかを含むアデノウイルスを細胞1個につき5000粒子または10,000粒子の割合で感染させたときには10％未満のLNCaP細胞がGFPプラスだったのに対し、Ad16ファイバーまたはAd35ファイバーは、約65％のLNCaP細胞でGFPを発現させた。同様の感染パターンが、DU145細胞で見られた。これらの結果からはさらに、サブグループBのアデノウイルスはサブグループDのアデノウイルスよりも広い細胞親和性を持っていることがわかるため、サブグループBとサブグループDのアデノウイルスが細胞への結合と感染に異なる受容体を用いていることの別の証拠となる。
Ad37ファイバーを用いてシュードタイピングしたアデノウイルス粒子による免疫化でT細胞が刺激される
以下の実験を行ない、サブグループDアデノウイルスからのファイバー・タンパク質を用いてシュードタイピングしたアデノウイルス粒子によるマウスの免疫化がCD8+T細胞を刺激するかどうかを調べた。マウス（各実験群に8匹、ビヒクル（対照）群に4匹）にAd5.GFP.WT（Ad5ファイバーでシュードタイピングしたAd5粒子）またはAd5.GFP.F37（Ad37ファイバーでシュードタイピングしたAd5粒子）を1×1010粒子皮下注射することによって免疫化した。接種してから4週間後、脾臓を回収し、IFN-γがプラスのCD8+T細胞の数を測定することによってT細胞の刺激状態を定量した。
免疫化したマウスの体内で活性化したCD8+T細胞の割合を調べるため、脾臓を分離し、機械で破壊した。赤血球細胞の溶解後、1×106個の脾臓細胞を、0.1μg/mlのEGFPエピトープ・ペプチドHYLSTQSALまたは対照としての無関係なOVAペプチド（SIINFEKL）の存在下または不在下にて、RPMI+10％ウシ胎仔血清とゴルジプラグ（BDバイオサイエンシーズ社）の中で3時間にわたって培養した。次に細胞を、APCが共役した抗CD8抗体（eバイオサイエンス社）で染色し、固定し、サイトフィックス／サイトパーム・キット（BDバイオサイエンシーズ社）を用いて浸透化し、IFN-γに対するPE共役抗体で染色した。細胞を蛍光活性化セル・ソーティング（FACS）法で分析し、IFN-γに関してプラスであるCD8+細胞の割合を明らかにした（（IFN-γに関してプラスのCD8+細胞の数を、CD8+T細胞の合計数で割った値）×100）。
Ad5ファイバーまたはAd37ファイバーでシュードタイピングしたアデノウイルス粒子を用いた免疫化により、CD8+T細胞が刺激された。そのことは、その細胞でIFN-γが産生されたことからわかる。この結果は、Ad37ファイバーを有するアデノウイルス粒子が、CD8+T細胞を刺激する能力を持つ一方で肝臓細胞の形質転換が避けられるために優れたワクチンの候補であることを示している。
いろいろな改変は当業者には明らかであろうゆえ、本発明は、添付の請求項の範囲によってのみ決まる。
pSKO1のプラスミド地図である。 pNDSQ3.1KO1のプラスミド地図である。 pAdmireRSVnBgのプラスミド地図である。 pSQ1のプラスミド地図である。 pSQ1KO12のプラスミド地図である。 pSQ1PD1のプラスミド地図である。 pSQ1FKO1PD1のプラスミド地図である。 pSQ1KO12PD1のプラスミド地図である。 ファイバーのABループのノブ突然変異および／またはペントンのPD1突然変異を含むアデノウイルス・ベクターを用いて試験管内でA549細胞に形質導入する効率を示している。この研究では、以下のアデノウイルス・ベクターを使用した：Av1nBg、Av1nBgFKO1（FKO1と呼ぶ）、Av1nBgPD1（PD1と呼ぶ）、Av1nBgFKO1PD1（FKO1PD1と呼ぶ）。 ファイバーのABループのノブ突然変異および／またはペントンのPD1突然変異を含むアデノウイルス・ベクターを用いたときの、生体内におけるアデノウイルスを媒介とした肝臓遺伝子の発現（図7A）とヘキソンDNAの含有量（図7B）である。この研究では、以下のアデノウイルス・ベクターを使用した：Av1nBg、Av1nBgFKO1（FKO1と呼ぶ）、Av1nBgPD1（PD1と呼ぶ）、Av1nBgFKO1PD1（FKO1PD1と呼ぶ）、Av1nBgKO12（KO12と呼ぶ）、Av1nBgKO12PD1（KO12PD1と呼ぶ）。 pFBshuttle(EcoRI)のプラスミド地図である。 pSQ1HSPのプラスミド地図である。 pSQ1HSPKO1のプラスミド地図である。 pSQ1HSPPD1のプラスミド地図である。 pSQ1HSPKO1PD1のプラスミド地図である。 ファイバーのシャフト、および／またはノブ、および／またはペントンに突然変異を含むアデノウイルス・ベクターを用いてA549細胞とヒーラ細胞に形質導入する効率を示している。図13Aは、A549細胞への形質導入効率が投与量に応答してどのように変化するかを示している。図13Bは、2000PPCにおけるヒーラ細胞への形質導入効率である。 図13Cは、ファイバーのシャフトに突然変異を含むアデノウイルス・ベクターの競合分析の結果を示している。 ファイバーのシャフトの突然変異が生体内でアデノウイルスを媒介とした肝臓遺伝子の発現に及ぼす効果（図14A）と、ヘキソンDNAの含有量（図14B）を示している。 pSQ1HSPRGDのプラスミド地図である。 pSQ1HSPKO1RGDのプラスミド地図である。 RGDターゲティング・リガンドの挿入により、HSPと結合するシャフトS*に突然変異を含むベクターの形質導入を回復できることを示している。 pSQ1Ad35Fiberのプラスミド地図である。 pSQ1Ad35FcRGDのプラスミド地図である。 35Fキメラ・ファイバーをコードしているプラスミド地図であり、図18AはpSQ135T5Hのプラスミド地図、図18BはpSQ15T35Hのプラスミド地図である。 35Fキメラ・ファイバーをコードしているプラスミド地図であり、図18AはpSQ135T5Hのプラスミド地図、図18BはpSQ15T35Hのプラスミド地図である。 Ad35ファイバーを含むAd5ベクターとその誘導体を試験管内で分析した結果を示している。 Ad35ファイバーを含むAd5ベクターとその誘導体を生体内で分析した結果を示している。 pSQ1Ad41sFのプラスミド地図である。 pSQ1Ad41sFRGDのプラスミド地図である。 Ad41短ファイバーを含むAd5ベクターとその誘導体を生体内で分析した結果を示している。 HIループにcRGDリガンドを含むように再度遺伝子操作したAd41短ファイバーを含むAd5ベクターを試験管内で分析した結果を示している。 ヘキサジメトリンブロミド（HB）とプロタミン硫酸（PS）とポリ-リシン-RGD（K14）を用いると、あるいは抗ペントン-TNFα二機能タンパク質（αpen-TNF）を用いると、標的に向かわないアデノウイルス・ベクターAv3nBgFKO1によるAE1-2a細胞への形質導入が増大することを示している。 HSP相互作用をなくすことで、アデノウイルスを媒介とした他の器官への遺伝子導入が少なくなることを示している。 β-ガラクトシダーゼをコードしていて、ファイバー・タンパク質および／またはペントン・タンパク質にさまざまな突然変異を含むいろいろなアデノウイルス・ベクターを用いた場合の、生体内での肝臓への形質導入を示している。結果は、野生型と比べたときの形質導入の割合（％）としてプロットしてある。形質導入のレベルを測定する2つの異なる方法での結果を、それぞれのベクターについて示してある。 S*ファイバー、KO1S*ファイバー、41sFファイバーのいずれかを含むアデノウイルス・ベクター生体内分布を、肝臓と腫瘍について示してある。

Claims (58)

  1. 異種ファイバーまたはその一部を含んでいて、樹状細胞に対する結合が、元のファイバーを発現する粒子と比べて増大しているアデノウイルス粒子であって、
    そのアデノウイルス（Ad）粒子のうちでファイバーを除く部分がサブグループCのアデノウイルスに由来し；
    ファイバーは、樹状細胞と結合するためのサブグループD由来のファイバーを含んでおり、サブグループDのアデノウイルスは、アデノウイルス血清型8、9、10、13、15、17、19a、19p、20、22〜30、32、33、36、38、39、42〜49からなるグループの中から選択される、アデノウイルス粒子。
  2. 異種ファイバーまたはその一部を含んでいて、ヘパラン硫酸プロテオグリカン（HSP）に対する結合が、元のファイバーを発現する粒子と比べて低下または消失しているアデノウイルス粒子であって、
    そのアデノウイルス（Ad）粒子のうちでファイバーを除く部分がサブグループCのアデノウイルスに由来し；
    ファイバーはAd19pまたはAd30由来のファイバーを含んでおり、そのためにHSPとの相互作用が減少する、アデノウイルス粒子。
  3. 異種ファイバーまたはその一部を含んでいて、樹状細胞に対する結合が、元のファイバーを発現する粒子と比べて増大しているアデノウイルス粒子であって、
    そのアデノウイルス（Ad）粒子のうちでファイバーを除く部分がサブグループCのアデノウイルスに由来し；
    ファイバーは、樹状細胞と結合するためのサブグループB由来のファイバーを含んでおり、サブグループBのアデノウイルスは、アデノウイルス血清型7、11、14、21、34、50からなるグループの中から選択される、アデノウイルス粒子。
  4. 上記ファイバーがキメラであってサブグループCのアデノウイルスのファイバーからのN末端部を含んでおり；
    そのN末端部があることで、存在しないときと比べて粒子への組み込みを増大させている、請求項1〜3のいずれか1項に記載のアデノウイルス粒子。
  5. 上記ファイバーがキメラであって、サブグループDのアデノウイルスのファイバーのうちで樹状細胞を標的とするのに十分な部分を含んでいる、請求項1または2に記載のアデノウイルス粒子。
  6. サブグループCのアデノウイルスが、アデノウイルス血清型1、2、5、6からなるグループの中から選択される、請求項1〜5のいずれか1項に記載のアデノウイルス粒子。
  7. CARとのあらゆる相互作用が減少するように上記ファイバーがさらに改変されている、請求項1〜6のいずれか1項に記載のアデノウイルス粒子。
  8. ヘパラン硫酸プロテオグリカン（HSP）とのあらゆる相互作用が減少するように上記ファイバーがさらに改変されている、請求項1と3〜7のいずれか1項に記載のアデノウイルス粒子。
  9. キャプシドが、αvインテグリンとの相互作用を変化させる改変をさらに含む、請求項1〜8のいずれか1項に記載のアデノウイルス粒子。
  10. アデノウイルス（Ad）粒子のうちでファイバーを除く部分がサブグループCのアデノウイルスに由来し；
    上記ファイバーがAd19pに由来する、請求項1と4〜9のいずれか1項に記載のアデノウイルス粒子。
  11. Ad19pファイバーが、配列ID番号34に示したアミノ酸のうちで樹状細胞を標的とするのに少なくとも十分な数のアミノ酸を含む、請求項2または10に記載のアデノウイルス粒子。
  12. Ad19pファイバーが、配列ID番号34に示したアミノ酸のうちで樹状細胞を標的とするのに少なくとも十分な数のアミノ酸を含むが、サブグループCのファイバーと比べてHSPへの結合が減少する、請求項11に記載のアデノウイルス粒子。
  13. 上記ファイバーがキメラであり、サブグループCのアデノウイルスの一部を含む、請求項10〜12のいずれか1項に記載のアデノウイルス粒子。
  14. アデノウイルス（Ad）粒子のうちでファイバーを除く部分がサブグループCのアデノウイルスに由来し；
    上記ファイバーがAd30に由来する、請求項1と4〜9のいずれか1項に記載のアデノウイルス粒子。
  15. Ad30ファイバーが、配列ID番号36に示したアミノ酸のうちで樹状細胞を標的とするのに少なくとも十分な数のアミノ酸を含む、請求項14に記載のアデノウイルス粒子。
  16. Ad30ファイバーが、配列ID番号36に示したアミノ酸のうちで樹状細胞を標的とするのに少なくとも十分な数のアミノ酸を含むが、サブグループCのファイバーと比べてHSPへの結合が減少する、請求項14に記載のアデノウイルス粒子。
  17. 上記ファイバーがキメラであり、サブグループCのアデノウイルスの一部を含む、請求項14〜16のいずれか1項に記載のアデノウイルス粒子。
  18. キャプシドのCAR結合領域に突然変異を含んでいるためにCARとの結合が減少している、請求項8〜17のいずれか1項に記載のアデノウイルス粒子。
  19. キャプシドのαvインテグリン結合領域に突然変異を含んでいるためにインテグリンとの結合が消失または減少している、請求項1〜18のいずれか1項に記載のアデノウイルス粒子。
  20. N末端の15個、または16個、または17個のアミノ酸が、Ad2ファイバーまたはAd5ファイバーの15個、または16個、または17個のアミノ酸で置換されることによってAd19pファイバーが改変されている、請求項1、2、4〜13、18、19のいずれか1項に記載のアデノウイルス粒子。
  21. N末端の15個、または16個、または17個のアミノ酸が、Ad2ファイバーまたはAd5ファイバーの15個、または16個、または17個のアミノ酸で置換されることによってAd30ファイバーが改変されている、請求項14〜17のいずれか1項に記載のアデノウイルス粒子。
  22. キャプシドの改変されたCAR結合領域がファイバーのノブ上にある、請求項7または18に記載のアデノウイルス粒子。
  23. 上記ファイバー・タンパク質がさらに1つ以上の改変を含んでいて、その結果として得られるファイバーとHSPの相互作用が減少または消失する、請求項22に記載のアデノウイルス粒子。
  24. キャプシドがさらにリガンドを含んでいて、そのリガンドのための受容体と結合する、請求項23に記載のアデノウイルス粒子。
  25. 上記リガンドがファイバーのノブ領域に含まれる、請求項24に記載のアデノウイルス粒子。
  26. 上記リガンドがファイバーに挿入されているか、ファイバーの一部と置換されている、請求項24に記載のアデノウイルス粒子。
  27. ゲノム中に異種核酸をさらに含んでおり、その異種核酸が、樹状細胞の活性を変化させる抗原または産物をコードしている、請求項1〜26のいずれか1項に記載のアデノウイルス粒子。
  28. 上記抗原が、腫瘍抗原、または病原体からの抗原である、請求項27に記載のアデノウイルス粒子。
  29. 対象に投与するために製剤化した、請求項1〜28のいずれか1項に記載のアデノウイルス粒子を含む組成物。
  30. 筋肉内投与、または静脈内投与、または非経口投与するために製剤化した、請求項29に記載の組成物。
  31. ワクチンである、請求項29または30に記載の組成物。
  32. 請求項29〜31のいずれか1項に記載の組成物を対象に投与する操作を含む免疫療法。
  33. ウイルス粒子を樹状細胞に送達する方法であって、
    請求項1、3〜28のいずれか1項に記載のウイルス粒子を含む組成物、または樹状細胞を標的とするためにAd37からのファイバーを備えていて、そのファイバー以外はサブグループCのアデノウイルスに由来するアデノウイルス（Ad）粒子を含む組成物を、樹状細胞を含む細胞と接触させることによってウイルス粒子を樹状細胞と結合させ；
    その組成物を対象に輸液する操作を含む方法。
  34. 上記細胞を対象から取り出した後に接触させる、請求項33に記載の方法。
  35. 上記細胞が免疫細胞を含む、請求項33に記載の方法。
  36. 上記細胞が骨髄細胞である、請求項33に記載の方法。
  37. 請求項1〜28のいずれか1項に記載のアデノウイルス粒子をコードしている核酸分子。
  38. アデノウイルス・ベクターを含む、請求項37に記載の核酸分子。
  39. 異種核酸を含む、請求項37または38に記載の核酸分子。
  40. 請求項37〜39のいずれか1項に記載の核酸を含む細胞。
  41. 樹状細胞である、請求項40に記載の細胞。
  42. 免疫細胞の異常、がん、感染症のいずれかを有する対象に細胞を投与する操作を含む治療法において、その細胞は、請求項41に記載の細胞であるか、樹状細胞を標的とするためにAd37からのファイバーを備えていて、そのファイバー以外はサブグループCのアデノウイルスに由来するアデノウイルス（Ad）粒子を含む樹状細胞であることを特徴とする治療法。
  43. 上記対象が、病原体に感染しているか、腫瘍、炎症疾患、アレルギー、喘息、自己免疫疾患のいずれかを有する、請求項32または42に記載の治療法。
  44. アデノウイルス粒子を樹状細胞に向かわせる方法であって、そのアデノウイルスの元のファイバーの全体または一部をサブグループDのアデノウイルスのファイバーで置換する操作を含む方法。
  45. 上記アデノウイルス（Ad）粒子のうちでファイバーを除く部分がサブグループCのアデノウイルスに由来し；
    サブグループDのアデノウイルスが、アデノウイルス血清型8、9、10、13、15、17、19a、19p、20、22〜30、32、33、36、37、38、39、42〜49からなるグループの中から選択される、請求項44に記載の方法。
  46. アデノウイルス粒子を樹状細胞に向かわせる方法であって、そのアデノウイルスの元のファイバーの全体または一部をサブグループBのアデノウイルスのファイバーで置換する操作を含む方法。
  47. 上記アデノウイルス（Ad）粒子のうちでファイバーを除く部分がサブグループCのアデノウイルスに由来し；
    サブグループBのアデノウイルスが、アデノウイルス血清型3、7、11、14、16、21、34、35、50からなるグループの中から選択される、請求項46に記載の方法。
  48. サブグループCのウイルスが、アデノウイルス血清型1、2、5、6からなるグループの中から選択される、請求項45または47に記載の方法。
  49. CARとのあらゆる相互作用が減少するように上記ファイバーがさらに改変されている、請求項45または47に記載の方法。
  50. ヘパラン硫酸プロテオグリカン（HSP）とのあらゆる相互作用が減少するように上記ファイバーがさらに改変されている、請求項49に記載の方法。
  51. キャプシドが、αvインテグリンとの相互作用を変化させる改変をさらに含む、請求項50に記載の方法。
  52. アデノウイルス粒子を利用して異常または疾患を治療する方法において、そのアデノウイルス粒子が、請求項1〜28のいずれか1項に記載の粒子であるか、樹状細胞を標的とするためにAd37からのファイバーを備えていて、そのファイバー以外はサブグループCのアデノウイルスに由来するアデノウイルス（Ad）粒子であることを特徴とする方法。
  53. 上記疾患または異常が、免疫細胞の異常、がん、感染症のいずれかである、請求項52に記載の方法。
  54. アデノウイルス粒子を利用して免疫細胞の異常、がん、感染症のいずれかを治療するための薬を調製する方法において、そのアデノウイルス粒子が、請求項1〜28のいずれか1項に記載の粒子であるか、樹状細胞を標的とするためにAd37からのファイバーを備えていて、そのファイバー以外はサブグループCのアデノウイルスに由来するアデノウイルス（Ad）粒子であることを特徴とする方法。
  55. 免疫細胞の異常、がん、感染症の中から選択した疾患または異常を治療するために細胞を利用する方法において、その細胞が、請求項41の細胞であるか、樹状細胞を標的とするためにAd37からのファイバーを備えていて、そのファイバー以外はサブグループCのアデノウイルスに由来するアデノウイルス（Ad）粒子を含む樹状細胞であることを特徴とする方法。
  56. 上記異常が、腫瘍、炎症疾患、アレルギー、喘息、自己免疫疾患のいずれかである、請求項55に記載の方法。
  57. 細胞を利用して免疫細胞の異常、がん、感染症の中から選択した疾患または異常を治療するための薬を調製する方法において、その細胞が、請求項41に記載の粒子であるか、樹状細胞を標的とするためにAd37からのファイバーを備えていて、そのファイバー以外はサブグループCのアデノウイルスに由来するアデノウイルス（Ad）粒子を含む樹状細胞であることを特徴とする方法。
  58. 上記疾患または異常が、腫瘍、炎症疾患、アレルギー、喘息、自己免疫疾患のいずれかである、請求項57に記載の方法。
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