JP2007523601A - サバイビン発現を調整するためのオリゴマー化合物 - Google Patents

サバイビン発現を調整するためのオリゴマー化合物 Download PDF

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Abstract

本発明は、サバイビンの発現を調整するために、サバイビン遺伝子に対するオリゴヌクレオチドを提供する。本組成物は、サバイビンをコードする核酸を標的とするオリゴヌクレオチド、特にアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む。サバイビン発現の調整、およびサバイビンの過剰発現、突然変異型サバイビンの発現またはその両方に関係する疾患の処置を目的として、これらの化合物を使用する方法を提供する。疾患の例は癌、例えば肺、***、結腸、前立腺、膵臓、肺、肝臓、甲状腺、腎臓、脳、精巣、胃、消化管、腸、脊髄、洞、膀胱、尿路および卵巣の癌である。本オリゴヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオシドもしくは核酸類似体（例：ロックト核酸など）またはそれらの組合せから構成され得る。

Description

発明の詳細な説明
（技術分野）
本発明はサバイビン（survivin）の発現を調整するための組成物および方法を提供する。特に本発明はオリゴマー化合物に関し、好ましいオリゴマー化合物はサバイビンをコードする核酸と特異的にハイブリダイズすることができるオリゴヌクレオチドである。本オリゴヌクレオチド化合物はサバイビンの発現を調整することが示されており、本オリゴヌクレオチド化合物の医薬製剤、および癌疾患の治療剤としてのそれらの使用を開示する。
（背景技術）
世界中で主要な死亡原因である癌は、ゲノムの不安定化に起因する遺伝子障害によって引き起こされる一群の疾患を含む。全ての癌細胞は、正常な細胞増殖およびホメオスタシスを支配するいくつかの調節経路に欠陥を持つと考えられている。これらの欠陥は、癌細胞に特異的な種々の特徴的能力の獲得をもたらす（HanahanおよびWeinberg，2000，Cell 100，57-70）。癌のこれらの特徴の一つは、進化的に保存された細胞自殺のプログラムであるアポトーシスまたはプログラム細胞死の回避である（Hengartner，2000，Nature 407，770-776）。アポトーシスは、もはや必要でなくなった細胞を除去することにより、胎児発生には不可欠であると共に、細胞産生と細胞除去とを釣り合わせることにより、成人組織のホメオスタシスの維持にも不可欠である。また、感染因子または薬物によって誘発される突然変異またはゲノム損傷などの異常な特質を示す細胞も、この方法によって除去される。悪性細胞では、アポトーシスの阻害により、この細胞監視機構が失われており、それが細胞生存能力の延長をもたらし、細胞形質転換、疾患進行の加速および治療抵抗性の危険を増大させる（EvanおよびVousden，2001，Nature 411，342-348）。したがって、癌を処置するための新しい治療戦略としてアポトーシスの操作が浮上している（Nicholson DW，2000，Nature 407，810-816）。
アポトーシスの誘導をもたらす2つのシグナル伝達経路が知られている。すなわち、環境ストレスおよび化学療法剤によって誘発される内在経路またはミトコンドリア経路と、免疫系のエフェクター細胞によって誘発される外来経路またはデス受容体経路である（AshkenaziおよびDixit，1998 Science 281，1305-1308、GreenおよびReed，1998，Science 281，1309-1312）。どちらの経路も最終的には、細胞内システインプロテアーゼファミリーであるカスパーゼを活性化し、それが数分以内に細胞の構造を分解して、迅速な細胞死をもたらす（Cohen，1997，Biochem J 326，1-16）。アポトーシス促進タンパク質とアポトーシス阻害タンパク質はどちらも知られている。Bcl-2タンパク質ファミリーは、アポトーシス促進タンパク質と抗アポトーシスタンパク質の両方を含んでいる。アポトーシス阻害因子のうち、進化上高度に保存されたアポトーシスタンパク質阻害因子（IAP）ファミリーには、ヒトの場合、8つのタンパク質が含まれている。そのうちの一つ、サバイビンは、つい最近同定されたものである（Ambrosiniら，1997，Nat. Med. 3，917-921）。サバイビンは、アポトーシスを担うエフェクター、カスパーゼ-3および-7細胞内プロテアーゼを直接的または間接的に阻害することにより、Bcl-2の下流でアポトーシスを阻害する（Shinら，2001，Biochemistry 40，1117-1123）。最近得られた証拠により、サバイビンは、上流で作用するカスパーゼ9の活性化を直接制御することが示唆されている。サバイビンThr34-Alaドミナントネガティブ突然変異体は、アポトソーム成分Apaf-1またはカスパーゼ9が欠損しているマウス胚線維芽細胞ではアポトーシスを誘導することができない（Blanc-Brudeら，2003，Clin. Cancer Res. 9，2683-2692）。B型肝炎X相互作用タンパク質（HBXIP）は、リン酸化サバイビンの補因子として、リン酸化サバイビンがプロカスパーゼ9に結合してその活性化を抑制することを可能にする作用を持つ（Marusawaら，2003，EMBO J. 22，2729-2740）。他の作用様式も議論されている（Beltramiら，2004，J. Biol. Chem. 279，2077-2084）。
サバイビンは新しい治療標的として大いに注目を集めている。なぜなら、サバイビンは癌細胞中で選択的に発現され、癌細胞の生存にとって必要だからである。サバイビンは常態では胚発生中に発現される。胸腺、CD34+骨髄由来幹細胞、胎盤および基底結腸上皮を除くと、サバイビンを正常成人組織に検出することはできないが、サバイビンは全ての形質転換細胞で、その有糸***状態とは無関係に、基本的に過剰発現している。発現は一般に細胞周期依存的に調節され、有糸***時に最大に達する（Liら 1998，Nature 396，580-584）。G2/M期におけるアップレギュレーションは間期と比較すると40倍を超える場合がある。また、CDC2-サイクリン-B1がThr34をリン酸化することによるタンパク質安定性の増加も、有糸***時にサバイビンレベルが上昇する理由になり得る。間期では、ユビキチン依存的タンパク質分解により、タンパク質レベルが基礎レベルまで低下する（Zhaoら，2000，J Cell Sci. 113，4363-71）。癌細胞におけるサバイビンの過剰発現は、デフォルトのアポトーシス誘導に対抗し、G2/Mチェックポイントを克服することにより、細胞による有糸***の進行を推し進めることが、示唆されている（Liら，1998，Nature 396，580-584）。
細胞培養系ではサバイビンの過剰発現による細胞死の阻害が確立されている（Ambrosiniら 1997，Nat. Med. 3，917-921、Tammら 1998，Cancer Res. 58，5315-5320、Mahotkaら，1999，Cancer Res. 59，6097-6102）。インビボでは、アポトーシス阻害因子としてのサバイビンの役割が、皮膚にサバイビンを発現させるトランスジェニックマウスで実証されており、このサバイビンはケラチノサイトのUVB誘導アポトーシスを阻害した（Grossmanら，2001，J. Clin. Invest. 108，991-999）。細胞アポトーシスにおけるその役割とは別に、サバイビンは有糸***の様々な側面において決定的な役割を果たしている。例えばホモ接合サバイビンノックアウトマウスにおけるサバイビンのノックアウトは100％の致死率をもたらす（Urenら 2000，Curr. Biol. 10，1319-1328、Conwayら，2002，Gastroenterolgy 123，619-631）。サバイビンは、有糸***装置の様々な成分、例えば中心体、微小管および紡錘装置の残留物−中央体−などと会合することがわかっている。微小管会合は、サバイビンの抗アポトーシス作用にとって不可欠である。
サバイビンがアポトーシス阻害因子として、また細胞***における必須因子として持つ二重の役割は、サバイビンに相補的なEPR-1 cDNAをHeLa細胞にトランスフェクトすることによるサバイビンの標的ダウンレギュレーションによって実証された。EPR-1アンチセンスによるサバイビンのダウンレギュレーションは、アポトーシスの増加および細胞増殖の阻害をもたらした（Ambrosiniら，1998，J. Biol. Chem. 273，11177-11182）。サバイビン除去の他の特徴は、有糸***停止、倍数性、欠損中心体複製、微小管形成および有糸***紡錘体の集合/安定性ならびに細胞***の阻害である。p53-/-突然変異体バックグラウンドではこれらの作用の大半が激化する（Beltramiら，2004，J. Biol. Chem. 279，2077-2084、Carvalhoら，2003，J. Cell. Sci. 116，2987-2998、Lensら，2003，EMBOJ. 22，2934-2947）。有糸***におけるサバイビンの中枢的役割は、サバイビンと、中期および後期紡錘体の微小管ならびに中期染色体の動原体を含む有糸***装置との会合によって強調される（Beltramiら，2004，J. Biol. Chem. 279，2077-2084）。サバイビンはINCENPやAurora Bなどの他の染色体パッセンジャータンパク質と共存する（Carvalhoら，2003，J. Cell. Sci. 116，2987-2998、Lensら，2003，EMBOJ. 22，2934-2947）。Aurora Bのキナーゼ活性はサバイビンとの相互作用に依存する（Chenら，2003，J. Biol. Chem. 278，486-490）。Aurora Bキナーゼ活性は細胞質***にとって不可欠であり、サバイビンと細胞***との機構的接点になることが示唆されている（Chenら，2003，J. Biol. Chem. 278，486-490）。姉妹染色分体の動原体における張力の欠如に応答して起こる持続的チェックポイント停止にサバイビンが必要であることは、2つの報文が実証している。サバイビンは、動原体におけるチェックポイントタンパク質BubR1の維持と、動原体における張力欠如状態が長引く中での有糸***停止にとって、不可欠であるらしい。微小管安定化剤タキソールは、動原体への微小管の付着を許すが、張力の発生は妨げる。通常、タキソール処理した細胞は、動原体に結合したBubR1が媒介するチェックポイント活性化により、有糸***を停止する。しかし、タキソール処理したサバイビン枯渇細胞は、遅延時間（この間にBubR1が動原体から失われる）後に、有糸***をなんとか完了する。ノコダゾールも動原体における張力形成を妨げるが、これは微小管付着を妨げることによって行われる。しかし、サバイビンの枯渇は、ノコダゾールによって誘発されたチェックポイント活性化および有糸***停止には、影響を持たない。サバイビンは、微小管による動原体占有の監視に関与するのではなく、動原体に加わる紡錘体張力のチェックポイント監視にとって必要であるらしい（Carvalhoら，2003，J. Cell. Sci. 116，2987-2998、Lensら，2003，EMBO J. 22，2934-2947）。さらにサバイビンは、ゲノムの完全性および細胞保護にとって必要な決定的p53依存性有糸***チェックポイントタンパク質として働くことが示唆されている（Beltramiら，2004，J. Biol. Chem. 279，2077-2084）。したがってサバイビンは細胞死と細胞***の調節との間の重要な接点になり得る。サバイビンは、アポトーシスの阻害因子および細胞***の促進因子として二重の役割を持つので、癌の発症および進行ならびに化学療法剤に対する抵抗性にとって重要な因子である。
癌におけるサバイビンの臨床的役割は、ほとんど全ての腫瘍タイプに高レベルのサバイビンが検出されることにより、強調されてきた。腫瘍におけるサバイビン発現の上昇は、予後不良、癌再発率の増加および治療抵抗性と関係づけられる（Kawasakiら，1998，Cancer Res. 58，5071-5074、Adidaら，1998，Lancet 351，882-883）。興味深いことに、肺腫瘍および乳腫瘍は最も高レベルのサバイビンを発現させる。これらの腫瘍は、早期に転移し、機構的に無関係ないくつかの化学療法剤に対して抵抗性を発達させるので、一般に好ましくない予後と関係づけられる。サバイビンのダウンレギュレーションは、エトポシド（Liら，1999，Nature Cell Biology 1，461-466、Olieら，2000，Cancer Res. 60，2805-2809、Jiangら，2001，J. Cell. Biochem. 83，342-354）、シスプラチン（Pennatiら，2004，Oncogene 23，386-394）、ドキソルビシン（Zhouら，2002，J. Pharmacol. Exp. Ther. 303，124-131）および放射線治療（Pennatiら，2003，J. Invest. Dermatol. 120，648-654、Asanumaら，2002，Jpn. J. Cancer Res. 93，1057-1062）などのDNA損傷因子に対する腫瘍細胞の感受性を高めることが示されている。サバイビン枯渇細胞はテキソール(texol)（タキソール(taxol)もまた真である）に対して特に感受性が高い（Zaffaroniら，2002，Cell. Mol. Life Sci. 59，1406-1412、Lingら，2004，J. Biol. Chem [印刷物に先立つ電子ジャーナルでの公開］）。タキソールおよび放射線治療に対する抵抗性はサバイビンの発現レベルと相関することが示されており（Zaffaroniら，2002，Cell. Mol. Life Sci. 59，1406-1412、Rodelら，2003，Int. J. Radiat. Oncol. Biol. Phys. 55，1341-1347）、亜致死濃度のタキソールは、MCF-7乳癌細胞においてサバイビン発現を有意にアップレギュレートすることが示されている（Lingら，2004，J. Biol. Chem. ［印刷物に先立つ電子ジャーナルでの公開］）。サバイビンは、タキソール処置に応答して起こる紡錘体チェックポイントの機能に必要であるらしい（Carvalhoら，2003，J. Cell. Sci. 116，2987-2998、Lensら，2003，EMBO J. 22，2934-2947）。したがって、サバイビンの不在下では、細胞は、タキソールが有糸***に及ぼす有害作用の修復を可能にする天然の抵抗機構の一つを奪われることになる。
興味深いことにサバイビンは血管新生にも重要な役割を果たす。サバイビンは、インビトロおよびインビボで、血管新生刺激を受けた内皮に、アップレギュレートされた状態で見いだされた（O'Connorら，2000，Am. J. Pathol. 156，393-398、Tranら，1999，Biochem. Biophys. Res. Commun. 264，781-788）。サバイビンのアンチセンスターゲティングは、インビトロで、内皮アポトーシスと、毛細管様脈管の迅速な退縮を引き起こした（Mesriら，2001a，Am. J. Pathol. 158，1757-1765）。ドミナントネガティブ型のサバイビンを発現させるアデノウイルスをヒト乳癌異種移植片に注射したところ、定着した腫瘍の成長が阻害された。これは、腫瘍細胞と内皮細胞との両方のアポトーシスおよび腫瘍由来血管の著しい減少を伴った（Blanc-Brudeら，2003，Clin. Cancer Res. 9，2683-2692）。化学療法および放射線治療は腫瘍細胞と腫瘍脈管構造の増殖内皮細胞との両方を標的にする。血管内皮増殖因子（VEGF）は、血管内皮細胞に対する化学療法のアポトーシス促進効力を著しく低下させることが示されている。薬物毒性に対するこの細胞保護作用は、VEGFが媒介するサバイビン発現のアップレギュレーションに関連づけられている。サバイビン活性の抑制は、微小管の動力学に干渉する薬物（タキソール）およびDNAを損傷する薬物に対するVEGFの細胞保護作用ならびに腫瘍壊死因子αに対する保護作用を打ち消す（Tranら，2002，Proc. Natl. Acad.Sci. USA 99，4349-4354、Mesriら，2001a，Am.J. Pathol. 158，1757-1765）。また、内皮細胞（HUVECCおよびDMVEC）におけるドミナントネガティブサバイビン（T34A）タンパク質の発現は、アポトーシスの著しい誘導をもたらした（Blanc-Brudeら，2003，Clin. Cancer Res. 9，2683-2692）。
サバイビンを標的にすることは、腫瘍細胞アポトーシスを誘発すると共に、腫瘍関連血管新生を抑制することにより、二重の抗癌活性を持つと言われることが増えつつある（Altieri DC，2003，Oncogene 22，8581-8591）。
サバイビンを標的として用いる治療的アプローチがいくつか開始されている。最も有望なものには、ワクチン接種戦略、ドミナントネガティブアンタゴニストとしての突然変異型サバイビンの使用、およびサバイビン特異的アンチセンスオリゴヌクレオチドの適用が含まれる。ドミナントネガティブサバイビン突然変異体タンパク質（Thr34-Ala）を発現させる複製欠損アデノウイルスの適用は、マウスにおける3種類の乳癌異種移植モデルで、腫瘍成長の阻害を引き起こした。このアデノウイルスは乳癌異種移植モデルでインビボ有効性を示し、黒色腫細胞におけるサバイビン（T34A）の誘導的発現は黒色腫異種移植モデルにおける腫瘍成長を阻害した（Blanc-Brudeら，2003，Clin. Cancer Res. 9，2683-2692、Grossmanら，2001 Proc. Natl. Sci. USA 98，635-640）。細胞培養では、CDC2-サイクリン-B1への突然変異型サバイビンの結合により、したがって野生型サバイビンのリン酸化を妨げることにより、アポトーシスが増加した（Mesriら，2001b，J. Clin. Invest 108，981-990）。サバイビンのリン酸化を妨げるプルバラノールA（purvalanol A）やフラボピリドールのような一部のCDC2アンタゴニストについて、タキソールと組み合わせて、現在、臨床試験が行われている（Schwartzら，2002，J. Clin. Oncol. 20，2157-2170）。
アンチサバイビンアンチセンスオリゴヌクレオチドは、細胞培養ではサバイビンをダウンレギュレートし、アポトーシスを誘導し、化学療法剤エトポシドに対する肺癌細胞およびHeLa細胞の感受性を高めることが、アンチセンスオリゴヌクレオチドを用いるいくつかのアプローチによって示されている（Liら，1999，Nature Cell Biology 1，461-466、Olieら，2000，Cancer Res. 60，2805-2809、Jiangら，2001，J. Cell. Biochem. 83，342-354）。アンチセンスオリゴISIS 28599（混成主鎖2'-O-MOEウイングマー（mixed backbone 2'-O-MOE wingmer）によるいくつかの細胞株の阻害は、多核細胞およびアポトーシスの誘導をもたらした（Chenら，2000，Neoplasia 2，235-241）。マウス肝臓再生モデルでは、アンチセンスオリゴヌクレオチドISIS 114926により、サバイビンmRNAが90％減少した（Proceedings of the American Association for Cancer Research，vol.42，2001，abstract #2468）。アンチセンスオリゴヌクレオチドISIS 23722の腫瘍内注射は、マウスにおける攻撃的な非ホジキンリンパ腫異種移植腫瘍の増殖速度における限定された影響を低下する（Ansellら，2004，Leukemia［印刷物に先立つ電子ジャーナルでの公開］）。
現在、サバイビンの合成を効果的に阻害する治療剤はない。したがって、サバイビン発現を減少させることによって腫瘍細胞成長を阻害する薬剤は、長年にわたって求められている。WO9822589には、サバイビンの量または活性を調整する薬剤を使ってアポトーシスを調整する方法、およびそのような薬剤を使って、サバイビンが媒介する病理学的状態の重症度を軽減する方法が開示されている。そのような薬剤は、サバイビンに相補的なEPR-1コード鎖をコードするコンストラクトであるが、特異的アンチセンスオリゴは開示されていない。WO0164741にはサバイビンアンチセンスmRNA転写物を調節する「tet-off」プロモーター系が開示されている。しかしこの出願にはアンチセンスオリゴヌクレオチドは開示されていない。
現在臨床試験を受けているオリゴヌクレオチドの大半は1988年からのホスホロチオエート化学に基づいている。これは最初に開発された有用なアンチセンス化学だった。しかし、この化学はその臨床使用を制限する重大な欠点を持つことが、近年明らかになった。それには、その標的mRNAに対する低い親和性が含まれる。この低い親和性は、効力に悪影響を及ぼし、活性オリゴヌクレオチドをどの程度小さくできるかに制限を加えるので、製造を難しくし、処置コストを増加させる。また、その低い親和性は、結果として標的mRNAへの接近性の低さにつながり、活性化合物の同定を困難にする。最後に、ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドは、その治療濃度域を狭くする一連の副作用も持っている。
これらの問題および他の問題に対処するべく、改善された特性を持つ新規類似体を作り出すことに、多くの努力が注がれた。下記スキーム1に示すように、これには、PNAやモルホリノなどの完全に人工的な類似体と、より従来型のDNA類似体、例えばボラノホスフェート、N3'-P5'ホスホロアミデートや、いくつかの2'修飾類似体、例えば2'-F、2'-O-Me、2'-O-メトキシエチル（MOE）および2-O-(3-アミノプロピル)（AP）などが含まれる。さらに最近になって、ヘキシトール核酸（HNA）、2'-F-アラビノ核酸（2'-F-ANA）およびD-シクロへキセニルヌクレオシド（CeNA）が発表されている。
これらの類似体の多くは、相補的核酸に対する改善された結合、生体安定性の改善を示すか、または多くのアンチセンス化合物の作用様式に関与する細胞性酵素RNAseHを動員する能力を保っている。しかし、これらの利点のすべてを合わせ持つものはなく、多くの場合、特性の一つが改善されると、他の1以上の特性が損なわれる。また、多くの場合、一部の類似体の商業的価値を著しく制限する新たな問題が認められている。これには、低い溶解度、複雑なオリゴマー化化学、極めて低い細胞取り込み、他の化学との不適合などが含まれる。
疾患の処置を目的としてサバイビン発現を調整するためのアンチオリゴヌクレオチドはWO0018781およびWO0157059に開示されている。これらのオリゴヌクレオチドは全て18〜20bp長であり、ホスホロチオエート化学またはMOE化学を使って設計される。
WO014655にはサバイビンを標的とする1つのアンチセンスオリゴヌクレオチドが開示されている。これはいくつかのMOEヌクレオシドを持つ完全に修飾されたホスホロチオエートである。MOE化学にはいくつかの制約がある。これは親和性があまり大きくなく、数個のMOEを一塊にしてオリゴ中に挿入した場合にしか、顕著にならない。MOEは2'-修飾ファミリーに属し、この化合物群については、アンチセンス活性がインビトロでのRNA結合親和性と直接的に相関することは、よく知られている。c-rafを標的とするMOE 20bpギャップマー（gapmer）（5MOE/PO-10PS-5MOE/PO）は、T24細胞で約20nmのIC50を持つと報告されている。また、PKC-aを標的とするMOEギャップマーは、A549細胞で25nmのIC50を持つと報告されている。これに対して、アンチセンス実験で用いられるホスホロチオエート化合物は、典型的には、150nm域のIC50を示す（Stein，Kreig，Applied Antisense Oligonucleotide Technology，Wiley-Liss，1988，p.87-90）。
本発明後に出願されたWO03027244には、サバイビンを標的とする20マーのホスホロチオエートアンチセンスオリゴヌクレオチドであって、極めて高い濃度でダウンレギュレーションを示すものが開示されている（例えば化合物903は200nMで51％のタンパク質減少を示した）。
本発明の主たる目的は、サバイビンmRNAに対する新規オリゴマー化合物を提供することである。本発明の化合物は、低下したIC50（したがって増加した活性）を示し、よって、原因因子または関連因子としてサバイビンの発現が暗示される様々な癌疾患の効果的処置を容易にすることがわかった。以下に説明するように、この目的は、LNA（Locked Nucleic Acid）と呼ばれる超高親和性化学の利用によって、もっともよく達成される。
本発明は、サバイビンをコードする核酸にターゲティングされてサバイビンの発現を調整するオリゴマー化合物、特にLNAアンチセンスオリゴヌクレオチドに向けられる。この調整は、具体的には、サバイビンの極めて強力なダウンレギュレーションおよびアポトーシス応答の惹起だった。本LNA含有オリゴマー化合物はわずか8マーであることができ、サバイビンを標的とする既報告アンチセンス化合物よりもかなり短い16マーでは確実に高い活性を示すことができる。これらの16マーオリゴマー化合物は、ナノモル濃度未満の濃度域にIC50を持つ。本発明は、薬理活性に必要な親和性を損なうことなく、通常の長さのアンチセンスオリゴマーをかなり（20〜25マーから例えば8〜16マーに）短縮することを可能にする。オリゴの固有特異性はその長さに逆相関するので、このような短縮は、それぞれのRNA標的に対するアンチセンス化合物の特異性を、著しく増加させるだろう。さらに、短いオリゴマー化合物は、長いオリゴマー化合物よりも高い生体安定性と高い細胞透過性を持つと予想される。少なくともこれらの理由から、本発明は当技術分野に対して多大な貢献をする。
（発明の概要）
サバイビンは細胞増殖にとって不可欠であり、有糸***の複数の段階に関与する。サバイビンは、有糸***を細胞***およびアポトーシスと結びつけるいくつかのチェックポイントに関与する。サバイビンは、プログラム細胞死（アポトーシス）を抑制するアポトーシス阻害因子（IAP）遺伝子ファミリーの一員である（図6参照）。サバイビン発現の増加は、結腸直腸癌、膀胱癌、肺癌、乳癌、悪性神経膠腫および血液癌を含むほとんどの一般的ヒト新生物に観察される。サバイビンの発現は、いくつかの癌で、進行した悪性度および侵襲性と相関する。正常な分化組織では検出不能であるか、極めて低レベルにしか存在しないことから、サバイビンはいくつかのヒト癌で好ましい標的になる。
本発明の中心的態様は、8〜50個のヌクレオシドからなる化合物であって、前記化合物は少なくとも8ヌクレオシドの部分配列を含み、前記部分配列が表1および表2に記載の配列から選択される配列内に位置する化合物を提供する。
ヒトゲノムの配列を入手することができ、その遺伝子のアノテーションも迅速に進捗しているので、本発明の一実施形態は、標的mRNA中に可能な限り短いユニーク配列を同定することである。本発明のLNA含有オリゴマー化合物を、アンチセンスオリゴマーISIS 23722と等配列であるいくつかのLNAおよび/またはホスホロチオエート含有18マーとも比較した。ISIS 23722（4MOE、10ホスホロチオエート、続いて4MOEの18マー）との比較も行った。
本発明のオリゴマー化合物を含む医薬組成物および他の組成物も提供する。さらに、細胞または組織におけるサバイビンの発現を調整する方法であって、前記細胞または組織を1以上の本発明オリゴマー化合物または組成物と接触させることを含む方法も提供する。また、治療有効量または予防有効量の、1以上の本発明オリゴマー化合物または組成物を投与することにより、サバイビンの発現に関係する疾患もしくは状態を持つと疑われる動物もしくはヒトまたはサバイビンの発現に関係する疾患もしくは状態に陥りやすいと疑われる動物もしくはヒトを処置する方法も開示する。さらに、サバイビンの発現を阻害すること、およびサバイビン活性に関係する疾患を処置することを目的として、本発明のオリゴマー化合物を使用する方法も提供する。そのような疾患の例は、例えば肺、***、結腸、前立腺、膵臓、肺、肝臓、甲状腺、腎臓、脳、精巣、胃、消化管（intestine）、腸（bowel）、脊髄、洞、膀胱、尿路および卵巣などの、様々なタイプの癌である。
（発明の記載）
本発明では、サバイビンをコードする核酸分子の機能を調整するためのオリゴマー化合物、特にアンチセンスオリゴヌクレオチドを使用する。前記調整は、最終的には、産生されるサバイビンの量の変化である。ある実施形態では、サバイビンをコードする核酸と特異的にハイブリダイズするアンチセンス化合物を提供することによって、これが達成される。前記調整は、好ましくは、産生される機能的タンパク質数の減少につながるサバイビン発現の阻害である。
標的の発現を調整する本発明のアンチセンスおよび他のオリゴマー化合物は、実験によって、または標的に関する配列情報と、所望の標的に対するオリゴマー化合物の最適な設計方法に関するノウハウとに基づく合理的設計によって同定される。これらの化合物の配列は、本発明の好ましい実施形態である。また、これらの好ましいオリゴマー化合物が相補性を示す標的中の配列モチーフ（「ホットスポット」という）は、好ましいターゲティング部位である。
本発明は、8〜50個のヌクレオチドおよび/またはヌクレオチド類似体からなる化合物であって、前記化合物は少なくとも8ヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体の部分配列を含み、前記部分配列が、配列番号2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143および144からなる群より選択される配列内に位置する化合物に向けられる。ヌクレオチド類似体は、典型的には、配列番号2〜144の配列のヌクレオチドの類似体である。したがって、本発明の化合物の部分配列は、典型的には、配列番号2〜144からなる群より選択される配列内に位置するか、配列番号2〜144の配列内のヌクレオチドの類似体を含む。好ましい本発明のヌクレオチド類似体はLNAである。
合計8〜50個のヌクレオチドおよび/またはヌクレオチド類似体とは、8〜50個のヌクレオチドもしくは8〜50個のヌクレオチド類似体、またはその組合せであって全部で50ヌクレオシド単位を超えないものを意味するものとする。
この場合、用語「ヌクレオシド」は、その通常の意味で使用される。すなわち、これは、2-デオキシリボース単位またはリボース単位がその1位炭素を介して窒素塩基アデニン（A）、シトシン（C）、チミン（T）、ウラシル（U）またはグアニン（G）の一つに結合しているものを含有する。
同様に、用語「ヌクレオチド」は、2-デオキシリボース単位またはRNA単位がその1位炭素を介して、窒素塩基アデニン（A）、シトシン（C）、チミン（T）またはグアニン（G）、ウラシル（U）の一つに結合していると共に、その5位炭素原子を介してヌクレオシド間リン酸基または末端基に結合しているものを意味する。
本明細書で使用する用語「ヌクレオチド類似体」は、リボース単位が2-デオキシリボースまたはRNAとは異なり、そして/または窒素原子がA、C、TおよびGとは異なり、そして/またはヌクレオシド間ホスフェート連結基が異なっている非天然ヌクレオチドを指す。ヌクレオシド類似体の具体例は、例えばFreierおよびAltmann；Nucl. Acid Res.，1997，25，4429-4443や、Uhlmann；Curr. Opinion in Drug Development，2000，3(2)，293-213などに記載されている。
「対応するヌクレオシド類似体」および「対応するヌクレオシド」という用語は、ヌクレオシド類似体中およびヌクレオシド中の核酸塩基が同一であることを示すものとする。例えば、ヌクレオチドの2-デオキシリボース単位がアデニンに連結されている場合、「対応するヌクレオシド類似体」は、アデニンに連結されたペントース単位（2-デオキシリボースとは異なるもの）を含有する。
用語「核酸」は、2以上のヌクレオチドの共有結合によって形成される分子と定義される。用語「核酸」と用語「ポリヌクレオチド」は、ここでは可換的に使用される。
用語「核酸類似体」は、非天然核酸結合化合物を指す。
ヌクレオチド類似体および核酸類似体は、例えばFreierおよびAltmann（Nucl. Acid Res.，1997，25，4429-4443）や、Uhlmann（Curr. Opinion in Drug & Development，2000，3(2): 293-213）などに記載されている。スキーム1に、核酸の製造に適したヌクレオチド類似体の選り抜きの例を図示する。
用語「LNA」は、1つの二環式ヌクレオシド類似体を含有するヌクレオチド（LANモノマーともいう）、または1以上の二環式ヌクレオシド類似体を含有するオリゴヌクレオチドを指す。LNAモノマーはWO9914226とそれ以降の出願WO0056746、WO0056748、WO0066604、WO00125248、WO0228875、WO2002094250およびPCT/DK02/00488に記載されている。チミジンLNAモノマーの一具体例は、(1S,3R,4R,7S)-7-ヒドロキシ-1-ヒドロキシメチル-5-メチル-3-(チミン-1-イル)-2,5-ジオキサ-ビシクロ[2.2.1]ヘプタンである。
用語「オリゴヌクレオチド」は、本発明においては、オリゴマー（オリゴともいう）または核酸ポリマー（例えばリボ核酸（RNA配列）もしくはデオキシリボ核酸（DNA））または当技術分野で既知の核酸類似体、好ましくはロックト核酸（Locked Nucleic Acid：LNA）、あるいはその混合物を指す。この用語は、天然核酸塩基、糖およびヌクレオシド間（主鎖）結合から構成されるオリゴヌクレオチドを包含すると共に、同様に機能するかまたは改善された特定機能を持つ非天然部分を有するオリゴヌクレオチドを包含する。完全にまたは部分的に修飾または置換されたオリゴヌクレオチドは、多くの場合、天然型よりも好ましい。なぜなら、そのようなオリゴヌクレオチドは、例えば細胞膜を透過する能力、細胞外および細胞内ヌクレアーゼに対する良好な耐性、核酸標的に対する高い親和性および特異性などといった望ましい特性を、いくつか持つからである。LNA類似体は特に好ましく、上述の特性を示す。
Figure 2007523601
「単位」という用語はモノマーと解釈される。
「少なくとも1つ」という用語は、1以上の整数、例えば1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17などを含む。
用語「チオ-LNA」には、スキーム2のXまたはYの少なくとも一方がSまたは-CH2-S-から選択されるロックトヌクレオチド（locked nucleotide）が含まれる。チオ-LNAはベータ-D-立体配置とアルファ-L-立体配置のどちらをとることもできる。
用語「アミノ-LNA」には、スキーム2のXまたはYの少なくとも一方が-N(H)-、N(R)-、CH2-N(H)-、-CH2-N(R)-［式中、Rは水素およびC1-4-アルキルから選択される］であるロックトヌクレオチドが含まれる。アミノ-LNAはベータ-D-立体配置とアルファ-L-立体配置のどちらをとることもできる。
用語「オキシ-LNA」には、スキーム2のXまたはYの少なくとも一方が-O-または-CH2-O-を表すロックトヌクレオチドが含まれる。オキシ-LNAはベータ-D-立体配置とアルファ-L-立体配置のどちらをとることもできる。
用語「エナ(ena)-LNA」は、スキーム2のYが-CH2-O-であるロックトヌクレオチドを含む。
用語「アルファ-L-LNA」は、スキーム3に示すロックトヌクレオチド（右側の構造）を含む。
用語「LNA誘導体」は、例えばチオ-LNA、アミノ-LNA、アルファ-L-オキシ-LNAおよびena-LNAなど、スキーム2に示す全てのロックトヌクレオチド（ベータ-D-メチレン-LNAを除く）を含む。
用語「連結基」は、2つのヌクレオシド、2つのヌクレオシド類似体、ヌクレオシドとヌクレオシド類似体などを一つに共有結合する能力を持つ基を意味するものとする。好ましい具体例にはホスフェート基およびホスホロチオエート基が含まれる。
本明細書において「コンジュゲート」という用語は、本明細書に記載する化合物（すなわちヌクレオシドまたはヌクレオシド類似体の配列を含む化合物）を1以上の非ヌクレオチドまたは非ポリヌクレオチド部分に共有結合することによって形成される外来(heterogenous)分子を示すものとする。非ヌクレオチドまたは非ポリヌクレオチド部分の例には、タンパク質、脂肪酸鎖、糖残基、糖タンパク質、ポリマー、またはその組合せなどの高分子剤が含まれる。典型例としてタンパク質は標的タンパク質の抗体であることができる。典型的ポリマーとしてポリエチレングリコールが挙げられる。
「癌腫」という用語は、上皮由来の悪性腫瘍を示すものとする。上皮組織は体内および体外の体表面を覆ったり、裏打ち(lines)したりしている。上皮組織の例は皮膚、ならびに消化管、膀胱、子宮などの体腔および内臓を裏打ちする粘膜および漿膜である。上皮組織は深部組織層に達して、粘液分泌腺などの腺を形成する場合もある。
「肉腫」という用語は、軟骨、脂肪、筋、腱および骨などの結合組織から増殖する悪性腫瘍を示すものとする。
本明細書で使用する用語「神経膠腫」は、膠細胞から派生する悪性腫瘍を包含するものとする。
ヌクレオシド、ヌクレオシド類似体、配列番号などに関して使用する用語「ある/1つの/一（a）」は、1以上（one or more）を意味するものとする。特に「〜からなる群より選択される（一）成分（ヌクレオシド、ヌクレオシド類似体、配列番号など）」という表現は、列挙した成分を1以上選択し得ることを意味するものとする。したがって「A、BおよびCからなる群より選択される（一）成分」というような表現は、A、BおよびCのあらゆる組合せ、すなわちA、B、C、A＋B、A＋C、B＋CおよびA＋B＋Cを包含するものとする。
本明細書において「C1-4-アルキル」という用語は、直鎖または分枝鎖の飽和炭化水素鎖であって、その鎖が1〜4個の炭素原子を持つもの、例えばメチル、エチル、n-プロピル、イソプロピル、n-ブチル、イソブチル、sec-ブチルおよびtert-ブチルなどを意味するものとする。
本明細書で使用する用語「標的核酸」には、サバイビンをコードするDNA、そのようなDNAから転写されるRNA（プレmRNAおよびmRNAを含む）、さらにそのようなRNAから誘導されるcDNAが包含される。
本明細書で使用する用語「遺伝子」は、エクソン、イントロン、非コード5'および3'領域ならびに調節要素、そしてその既知変異体および今後解明され得る任意の変異体を含む遺伝子を意味する。
本明細書で使用する用語「オリゴマー化合物」は、例えば水素結合によって標的遺伝子に（「キメラプラスト」および「TFO」）、または標的遺伝子のRNA転写物に（「アンチセンス阻害剤」「siRNA」「リボザイム」および「オリゴザイム」）、または標的遺伝子がコードするタンパク質に（「アプタマー」「スピーゲルマー（spiegelmer）」または「デコイ（decoy）」）結合することなどにより、ヒトに所望の治療効果を誘発することができるオリゴヌクレオチドを指す。
本明細書で使用する用語「mRNA」は、標的遺伝子の既知のmRNA転写物と、将来同定され得る任意の転写物を意味する。
本明細書で使用する用語「調整」は、遺伝子発現の増加（刺激）または減少（阻害）を意味する。本発明においては阻害が遺伝子発現調整の好ましい形態であり、mRNAは好ましい標的である。
本明細書において、アンチセンス化合物を特定の標的核酸に「ターゲティングする」という用語は、アンチセンス化合物がその意図する標的に結合し、その機能を調整することができるような形で、アンチセンスオリゴヌクレオチドを細胞、動物またはヒトに提示することを意味する。
本明細書で使用する「ハイブリダイゼーション」とは、相補的ヌクレオシドまたはヌクレオチド塩基間の水素結合を意味し、この水素結合はワトソン-クリック型水素結合、ホルスタイン（Holstein）型水素結合、逆ホルスタイン（reversed Holstein）型水素結合などであることができる。ワトソンとクリックは約50年前に、デオキシリボ核酸（DNA）が、2本の鎖中の相対する相補的核酸塩基間に形成された水素結合によってらせん状にまとまっている2本の鎖から構成されることを明らかにした。DNA中によく見いだされる4つの核酸塩基は、グアニン（G）、アデニン（A）、チミン（T）およびシトシン（C）であり、そのうちG核酸塩基はCと対を成し、A核酸塩基はTと対を成す。RNAでは、核酸塩基チミンが核酸塩基ウラシル（U）で置き換えられ、このウラシルはT核酸塩基と同様にAと対を成す。標準的な二重鎖形成に関与する核酸塩基中の化学基は、ワトソン-クリック面を構成する。フーグスティーンは数年後に、プリン核酸塩基（GおよびA）が、そのワトソン-クリック面の他にも、二重鎖の外側から認識することができるフーグスティーン面を持ち、それを使ってピリミジンオリゴヌクレオチドを水素結合で結合することにより、3重らせん構造を形成し得ることを明らかにした。
本発明に関して「相補的」とは、2つのヌクレオチドまたはヌクレオシド配列間で互いに正確に対形成する能力を指す。例えば、あるオリゴヌクレオチドの決まった位置に存在するヌクレオチドが、あるDNA分子またはRNA分子の対応する位置に存在するヌクレオチドと水素結合する能力を持つ場合、当該オリゴヌクレオチドと当該DNAまたはRNAは、その位置で、互いに相補的であると見なされる。オリゴヌクレオチド中の十分な数のヌクレオチドが標的DNAまたはRNA中の対応するヌクレオチドと水素結合を形成することにより、安定な複合体を形成することができる場合、そのDNAまたはRNAとオリゴヌクレオチドは、互いに相補的であると見なされる。インビトロまたはインビボで安定であるために、アンチセンス化合物の配列がその標的核酸に対して100％相補的である必要はない。したがって「相補的」および「特異的にハイブリダイズ可能」という用語は、アンチセンス化合物が標的分子に対して十分に強くかつ特異的に結合して、非標的mRNAの機能には影響を及ぼさずに、標的の正常な機能を望ましく妨害することを意味する。
本発明のオリゴマー化合物は標的の強力な調整物質である。例えばリアルタイムPCRによって測定した標的のインビトロ阻害を表1に示す。図2はノーザンブロットによって測定した本発明オリゴマー化合物のインビトロ抗力を示す。表3に、オリゴマー化合物の極めて低いIC50値を示す。上記の実験的知見はいずれも、本発明の化合物が医薬組成物中の活性成分を構成し得ることを示している。
本発明の化合物の部分配列は、典型的には、配列番号2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132および133からなる群より選択される配列内に位置する。ヌクレオチドの類似体は、好適には、これらの配列内にあるヌクレオチドの類似体である。
典型的には、本発明の化合物は8〜40個のヌクレオチド、より典型的には8〜35個のヌクレオチド、さらに典型的には8〜30個のヌクレオチド、好適には8〜25個のヌクレオチド、さらに好適には8〜20個のヌクレオチド、最も好適には12〜20個のヌクレオチド、例えば12、13、14、15、16、17、18、19または20個のヌクレオチドを含む。本発明の極めて興味深い実施形態では、本発明の化合物は、14〜18個のヌクレオチド、例えば14、15、16、17または18個のヌクレオチド、好ましくは15〜17個のヌクレオチド、例えば15、16または17個のヌクレオチド、より典型的には15個のヌクレオチド、または16個のヌクレオチド、または17個のヌクレオチドを含む。
本発明の好適な実施形態では、配列番号2〜144の配列内にある部分配列が、典型的には、少なくとも8個のヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体、例えば少なくとも9個の、当該配列内からのヌクレオチドまたは前記配列内のヌクレオチドのヌクレオチド類似体である。より典型的には、部分配列は、前記配列内からの少なくとも12個のヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体、例えば少なくとも14個のヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体、例えば10、11、12、13、14、15または16個のヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体からなる。
ヌクレオチドは、典型的には、ホスフェート基、ホスホロチオエート基およびボラノホスフェート基からなる群より選択される連結基によって、互いに連結される。好適には、ヌクレオチドの一部または全部がホスフェート基によって互いに連結される。好適には、全てのヌクレオチドがホスフェート基によって互いに連結される。
同様に、本発明のヌクレオチドは、典型的には、ホスフェート基、ホスホロチオエート基およびボラノホスフェート基からなる群より選択される連結基によって互いに連結される。
本発明の好ましいオリゴマー化合物は、配列番号2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144であり、それらの配列を表1に記載する。
本発明のもう一つの実施形態では、前記ヌクレオチドがホスホロチオエート基によって互いに連結される（例えば全てのヌクレオチドがホスホロチオエート基によって互いに連結される）。本発明の興味深い一実施形態は、各化合物内の各連結基がホスホロチオエート基である配列番号2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、および144の化合物に向けられる。このような修飾は下付きのSによって表される。言い換えると、本発明の一態様は、配列番号2A、3A、4A、5A、6S、7S、8S、9A、10A、11A、12A、13A、14A、15A、16A、17A、18A、19A、20A、21A、22A、23A、24A、25A、26A、27A、28A、29A、30A、31A、32A、33A、34A、35A、36A、37S、38A、39A、40A、41A、42A、43A、44A、45A、46A、47A、48A、49A、50A、51A、52A、53A、54A、55A、56A、57A、58A、59A、60A、61A、62A、63A、64A、65A、66A、67A、68A、69A、70A、71A、72A、73A、74A、75A、76A、77A、78A、79A、80A、81A、82A、83A、84A、85A、86A、87A、88A、89A、90A、91A、92A、93A、94A、95A、96A、97A、98A、99A、100A、101A、102A、103A、104A、105A、106A、107A、108A、109A、101A、102A、103A、104A、105A、106A、107A、108A、109A、110A、111A、112A、113A、114A、115A、116A、117A、118A、119A、120A、121A、122A、123A、124A、125A、126A、127A、128A、129A、130A、131A、132A、133A、134A、135A、136A、137A、138A、139A、140A、141A、142A、143A、および144Aの化合物に向けられる。
本発明の実施形態の好ましい部分集合は、式2A、4A、6A、9A、15A、118A、120A、123A、128A、129A、および131Aの配列を含む化合物である。
本発明のさらにもう一つの態様は、配列番号2B、3B、4B、5B、6S、7S、8B、9B、10B、11B、12B、13B、14B、15B、16B、17B、18B、19B、20B、21B、22B、23B、24B、25B、26B、27B、28B、29B、30B、31B、32B、33B、34B、35B、36B、37S、38B、39B、40B、41B、42B、43B、44B、45B、46B、47B、48B、49B、50B、51B、52B、53B、54B、55B、56B、57B、58B、59B、60B、61B、62B、63B、64B、65B、66B、67B、68B、69B、70B、71B、72B、73B、74B、75B、76B、77B、78B、79B、80B、81B、82B、83B、84B、85B、86B、87B、88B、89B、90B、91B、92B、93B、94B、95B、96B、97B、98B、99B、100B、101B、102B、103B、104B、105B、106B、107B、108B、109B、101B、102B、103B、104B、105B、106B、107B、108B、109B、110B、111B、112B、113B、114B、115B、116B、117B、118B、119B、120B、121B、122B、123B、124B、125B、126B、127B、128B、129B、130B、131B、132B、133B、134B、135B、136B、137B、138B、139B、140B、141B、142B、143B、および144Bの化合物に向けられる。
本発明の実施形態の好ましい部分集合は、式118B、119B、120B、121B、122B、123B、128B、129B、130B、および131Bの配列を含む化合物である。
本発明のさらにもう一つの態様は、配列番号2C、3C、4C、5C、6S、7S、8C、9C、10、11C、12C、13C、14C、15C、16C、17C、18C、19C、20C、21C、22C、23C、24C、25C、26C、27C、28C、29C、30C、31C、32C、33C、34C、35C、36C、37S、38C、39C、40C、41C、42C、43C、44C、45C、46C、47C、48C、49C、50C、51C、52C、53C、54C、55C、56C、57C、58C、59C、60C、61C、62C、63C、64C、65C、66C、67C、68C、69C、70C、71C、72C、73C、74C、75C、76C、77C、78C、79C、80C、81C、82C、83C、84C、85C、86C、87C、88C、89C、90C、91C、92C、93C、94C、95C、96C、97C、98C、99C、100C、101C、102C、103C、104C、105C、106C、107C、108C、109C、101C、102C、103C、104C、105C、106C、107C、108C、109C、110C、111C、112C、113C、114C、115C、116C、117C、118C、119C、120C、121C、122C、123C、124C、125C、126C、127C、128C、129C、130C、131C、132C、133C、134C、135C、136C、137C、138C、139C、140C、141C、142C、143C、および144Cの化合物に向けられる。
本発明のさらにもう一つの態様は、配列番号2D、3D、4D、5D、6S、7S、8D、9D、10D、11D、12D、13D、14D、15D、16D、17D、18D、19D、20D、21D、22D、23D、24D、25D、26D、27D、28D、29D、30D、31D、32D、33D、34D、35D、36D、37S、38D、39D、40D、41D、42D、43D、44D、45D、46D、47D、48D、49D、50D、51D、52D、53D、54D、55D、56D、57D、58D、59D、60D、61D、62D、63D、64D、65D、66D、67D、68D、69D、70D、71D、72D、73D、74D、75D、76D、77D、78D、79D、80D、81D、82D、83D、84D、85D、86D、87D、88D、89D、90D、91D、92D、93D、94D、95D、96D、97D、98D、99D、100D、101D、102D、103D、104D、105D、106D、107D、108D、109D、101D、102D、103D、104D、105D、106D、107D、108D、109D、110D、111D、112D、113D、114D、115D、116D、117D、118D、119D、120D、121D、122D、123D、124D、125D、126D、127D、128D、129D、130D、131D、132D、133D、134D、135D、136D、137D、138D、139D、140D、141D、142D、143D、および144Dの化合物に向けられる。
本発明のさらにもう一つの態様は、配列番号2E、3E、4E、5E、6S、7S、8E、9E、10E、11E、12E、13E、14E、15E、16E、17E、18E、19E、20E、21E、22E、23E、24E、25E、26E、27E、28E、29E、30、31E、32E、33E、34E、35E、36E、37S、38E、39E、40E、41E、42E、43E、44E、45E、46E、47E、48E、49E、50E、51E、52E、53E、54E、55E、56E、57E、58E、59E、60E、61E、62E、63E、64E、65E、66E、67E、68E、69E、70E、71E、72E、73E、74E、75E、76E、77E、78E、79E、80E、81E、82E、83E、84E、85E、86E、87E、88E、89E、90E、91E、92E、93E、94E、95E、96E、97E、98E、99E、100E、101E、102E、103E、104E、105E、106E、107E、108E、109E、101E、102E、103E、104E、105E、106E、107E、108E、109E、110E、111E、112E、113E、114E、115E、116E、117E、118E、119E、120E、121E、122E、123E、124E、125E、126E、127E、128E、129E、130E、131E、132E、133E、134E、135E、136E、137E、138E、139E、140E、141E、142E、143E、および144Eの化合物に向けられる。
興味深い実施形態では、本発明の化合物は、配列15Eを含む。
好ましい実施形態として、本発明の化合物は8〜50個のヌクレオチドを含み、前記化合物は少なくとも8ヌクレオチドの部分配列(subsequence)を含み、前記部分配列はSEQ ID NO:2〜144からなる群より選択される配列内に位置し、少なくとも1つのヌクレオチドが対応するヌクレオチド類似体で置き換えられている。典型的には、本発明の化合物は、1〜50個のヌクレオチド類似体、例えば2〜45個のヌクレオチド類似体、3〜40個のヌクレオチド類似体、好適には4〜35個のヌクレオチド類似体、5〜30個のヌクレオチド類似体、6〜25個のヌクレオチド類似体、典型的には6〜20個のヌクレオチド類似体、より典型的には6〜14個のヌクレオチド類似体、例えば6〜12個のヌクレオチド類似体、例えば6、7、8、9、10、11または12個のヌクレオチド類似体を含む。
本発明者らは、異なるリボース単位を持つヌクレオチド類似体を6〜16個含んでいる本発明の化合物は、ヌクレオチドよりも改善された親和性を持つのに十分であることを見いだした。したがって、本発明の興味ある一態様は、異なるリボース単位を持つヌクレオチド類似体を6〜10個、例えば6、7、8、9または10個、好ましくは異なるリボース単位を持つヌクレオチド類似体を7、8または9個、最も典型的には異なるリボース単位を持つヌクレオチド類似体を8個含んでいる本発明の化合物に関する。好ましくは、異なるリボース単位を持つヌクレオチド類似体はLNAである。
本発明者らは、異なるリボース単位を持つと共に、修飾されたヌクオシド間連結部を持つヌクレオチド類似体が、アンチセンス修飾の目的にとって、さらに改善された効果を持つことも見いだした。したがって、6〜16個のヌクレオチド類似体は、修飾されたリボース単位、異なる連結基、またはその両方を持ち得る。
好適には、全てのヌクレオチドを対応するヌクレオチド類似体で置き換える。
本発明の好ましいヌクレオチド類似体はLNAである。
本発明のさらにもう一つの好ましいヌクレオチド類似体は、ヌクレオシド間ホスフェート連結部がホスホロチオエートであるものである。
さらにもう一つの好ましいヌクレオチド類似体は、ヌクレオチドがヌクレオシド間ホスホロチオエート連結部を持つLNAであるものである。
興味深い一実施形態では、本発明の化合物は8〜50個のヌクレオチドを含み、前記化合物は少なくとも8ヌクレオチドの部分配列を含み、前記部分配列は配列番号2〜144からなる群より選択される配列内に位置し、少なくとも1つのヌクレオチドが対応するヌクレオチド類似体で置き換えられ、かつ3'末端はヌクレオチド類似体ではなくヌクレオチドを含む。
特に興味深い一実施形態では、上記化合物は少なくとも1つのヌクレオチド類似体を含み、前記ヌクレオチド類似体は式：
Figure 2007523601
 ［式中、ZおよびZ*は独立して、存在しないか、ヌクレオシド間連結部、末端基または保護基の中から選択される。XおよびYは、O、S、NR、CH2、CH（二重結合の一部である場合）、CH2-O、CH2-S、CH2-NR、CH2-CH2、CH2-CH（二重結合の一部である場合）およびCH=CH（式中、Rは水素またはC1-4-アルキルである）からなる群より独立して選択される］
のロックト核酸（LNA）である。結合は連結基への接続を表す。典型的には、XはOであり、YはO、SおよびNR（式中、Rは水素またはC1-4-アルキルである）からなる群より独立して選択される。より典型的には、XはOであり、YはO、SおよびNHからなる群より選択される。最も典型的には、XはOであり、YはOである。LNAヌクレオチドの少なくとも1つが3'末端にある実施形態の場合、その位置では、Zは末端基であり、Z*はヌクレオシド間連結部である。LNAヌクレオチドの少なくとも1つが5'末端にある実施形態の場合、その位置では、Zは存在せず、Z*は末端基である。ヌクレオチド配列内部では、Zは存在せず、Z*はヌクレオシド間連結部である。
ヌクレオチド類似体としてLNAを含む本発明の好適な一実施形態において、前記LNAはβ-D型またはアルファ-L型であり、好ましくはβ-D型である。
少なくとも1つのLNA、例えば1〜50個のLNAヌクレオチド類似体、例えば2〜45個のLNAヌクレオチド類似体、3〜40個のLNAヌクレオチド類似体、好適には4〜35個のLNAヌクレオチド類似体、5〜30個のLNAヌクレオチド類似体、6〜25個のLNAヌクレオチド類似体、典型的には6〜20個のLNAヌクレオチド類似体、より典型的には6〜14個のLNAヌクレオチド類似体、例えば6〜12個のLNAヌクレオチド類似体、例えば6、7、8、9、10、11または12個のLNAヌクレオチド類似体を、ヌクレオチド類似体として含む本発明の実施形態では、前記ヌクレオチドおよび/またはヌクレオチド類似体が、ホスフェート基、ホスホロチオエート基およびボラノホスフェート基からなる群より選択される連結基によって互いに連結される。LNAヌクレオチド類似体を含む本発明の好適な一実施形態では、前記ヌクレオチドおよび/またはヌクレオチド類似体が、ホスフェート基によって互いに連結される。LNAヌクレオチド類似体を含む本発明の好ましい一実施形態では、前記ヌクレオチドおよび/またはヌクレオチド類似体が、ホスホロチオエート基によって互いに連結される。
興味深い実施形態の組合せとして、LNAヌクレオチド類似体を含む本発明の実施形態では、前記ヌクレオチドおよび/またはヌクレオチド類似体が、ホスホロチオエート基によって互いに連結され、XはOかつYはOであり、前記LNAはβ-D型をとる。
8〜50個のヌクレオチドを含む本発明の化合物の実施形態であって、前記化合物が少なくとも8ヌクレオチドの部分配列を含み、前記部分配列が配列番号2〜144からなる群より選択される配列内に位置し、前記ヌクレオチドがLNAヌクレオチド類似体を含む実施形態の場合、部分配列は、典型的には、2〜6LNA（本明細書中に定義するもの）のストレッチと、それに続く4〜12ヌクレオチドのストレッチと、それに続く2〜6LNA（本明細書中に定義するもの）のストレッチとを含み得る。
LNAのストレッチと、それに続くヌクレオチドのストレッチと、それに続くLNAのストレッチとを含む部分配列は、ギャップマーと呼ばれている。
好適には、前記部分配列は、4LNA（本明細書中に定義するもの）のストレッチと、それに続く8ヌクレオチドのストレッチと、それに続く4LNA（本明細書中に定義するもの）のストレッチとを含む。
8〜50個のヌクレオチドを含む本発明の化合物の実施形態であって、前記化合物が少なくとも8ヌクレオチドの部分配列を含み、前記部分配列が配列番号2〜144からなる群より選択される配列内に位置し、前記8〜50個のヌクレオチドがLNAヌクレオチド類似体を含む実施形態の場合、前記部分配列は、2〜6LNA（本明細書中に定義するもの）のストレッチと、それに続く4〜12ヌクレオチドのストレッチと、それに続く2〜5LNA（本明細書中に定義するもの）のストレッチと、それに続く1〜4ヌクレオチド、例えば1または2ヌクレオチド、より典型的には単一ヌクレオシドを含み得る。前記1〜4ヌクレオチド、1もしくは2ヌクレオチド、または単一ヌクレオチドは、典型的には、部分配列の3'末端に位置し、より典型的には当該オリゴマーの3'末端に位置する。
8〜50個のヌクレオチドを含む本発明の化合物の実施形態であって、前記化合物が少なくとも8ヌクレオチドの部分配列を含み、前記部分配列が配列番号2〜144からなる群より選択される配列内に位置し、前記ヌクレオチドがLNAヌクレオチド類似体を含む実施形態の場合、前記部分配列は、典型的には、4LNA（本明細書中に定義するもの）のストレッチと、それに続く8ヌクレオチドのストレッチと、それに続く3LNA（本明細書中に定義するもの）のストレッチと、それに続く単一天然ヌクレオチドとを含み得る。前記単一ヌクレオチドは、典型的には、部分配列の3'末端に位置し、より典型的には当該オリゴマーの3'末端に位置する。
8〜50個のヌクレオチドを含む本発明の化合物の実施形態であって、前記化合物が少なくとも8ヌクレオチドの部分配列を含み、前記部分配列が配列番号2〜144からなる群より選択される配列内に位置し、前記ヌクレオチドがLNAヌクレオチド類似体を含み、前記部分配列が、LNAのストレッチと、それに続くヌクレオチドのストレッチと、それに続くLNAのストレッチを含む実施形態（ここでギャップマーと定義するもの）の場合、前記ヌクレオチドおよび/またはLNAは、ホスフェート基、ホスホロチオエート基およびボラノホスフェート基からなる群より選択される連結基によって、互いに連結される。
好適には、前記ヌクレオチドおよび/または前記LNAは、ホスフェート基によって一つに連結される。典型的には、前記ヌクレオチドおよび/または前記LNAは、ホスホロチオエート基によって互いに一つに連結される。
全部で8〜50個のヌクレオチドおよび/またはヌクレオチド類似体を含む本発明の化合物の実施形態であって、前記化合物が少なくとも8ヌクレオチドの部分配列を含み、前記部分配列が配列番号2〜144からなる群より選択される配列内に位置し、前記部分配列は、前記部分配列内のヌクレオチドとヌクレオチド類似体が合計16個になるように、4LNA（本明細書中に定義するもの）のストレッチと、8ヌクレオチドのストレッチと、4LNA（本明細書中に定義するもの）のストレッチとからなり得る実施形態の場合、前記ヌクレオチドおよび前記LNAは、ホスホロチオエート基によって一つに連結される。
好適な一実施形態では、部分配列が配列番号2aである。好適な一実施形態では、部分配列が配列番号3aである。好適な一実施形態では、部分配列が配列番号4aである。好適な一実施形態では、部分配列が配列番号5aである。好適な一実施形態では、部分配列が配列番号6aである。好適な一実施形態では、部分配列が配列番号7aである。好適な一実施形態では、部分配列が配列番号8aである。好適な一実施形態では、部分配列が配列番号9aである。好適な一実施形態では、部分配列が配列番号10aである。好適な一実施形態では、部分配列が配列番号11aである。好適な一実施形態では、部分配列が配列番号12aである。好適な一実施形態では、部分配列が配列番号13aである。好適な一実施形態では、部分配列が配列番号14aである。好適な一実施形態では、部分配列が配列番号15aである。好適な一実施形態では、部分配列が配列番号117aである。好適な一実施形態では、部分配列が配列番号118aである。好適な一実施形態では、部分配列が配列番号119aである。好適な一実施形態では、部分配列が配列番号120aである。好適な一実施形態では、部分配列が配列番号121aである。好適な一実施形態では、部分配列が配列番号122aである。好適な一実施形態では、部分配列が配列番号123aである。好適な一実施形態では、部分配列が配列番号124aである。好適な一実施形態では、部分配列が配列番号125aである。好適な一実施形態では、部分配列が配列番号126aである。好適な一実施形態では、部分配列が配列番号127aである。好適な一実施形態では、部分配列が配列番号128aである。好適な一実施形態では、部分配列が配列番号129aである。好適な一実施形態では、部分配列が配列番号130aである。好適な一実施形態では、部分配列が配列番号131aである。好適な一実施形態では、部分配列が配列番号132aである。好適な一実施形態では、部分配列が配列番号133aである。すぐ上に挙げた、部分配列が配列番号2a〜144aから選択されるものである個々の好適な実施形態では、部分配列の3'末端LNAを、対応するヌクレオチドで、好適に置き換えることができる。
さらにもう一つの好適な実施形態では、本発明の化合物は、配列番号2〜144からなる群より選択される配列であり、前記配列は、前記化合物中のヌクレオチドとヌクレオチド類似体とが合計16個になるように、4LNA（本明細書中に定義するもの）のストレッチと、8ヌクレオチドのストレッチと、4LNA（本明細書中に定義するもの）のストレッチとからなり、前記ヌクレオチドおよび前記LNAは、ホスホロチオエート基によって一つに連結される。
好適な一実施形態では、化合物が配列番号2aからなる。好適な一実施形態では、化合物が配列番号3aからなる。好適な一実施形態では、化合物が配列番号4aからなる。好適な一実施形態では、化合物が配列番号5aからなる。好適な一実施形態では、化合物が配列番号6aからなる。好適な一実施形態では、化合物が配列番号7aからなる。好適な一実施形態では、化合物が配列番号8aからなる。好適な一実施形態では、化合物が配列番号9aからなる。好適な一実施形態では、化合物が配列番号10aからなる。好適な一実施形態では、化合物が配列番号11aからなる。好適な一実施形態では、化合物が配列番号12aからなる。好適な一実施形態では、化合物が配列番号13aからなる。好適な一実施形態では、化合物が配列番号14aからなる。好適な一実施形態では、化合物が配列番号15aからなる。好適な一実施形態では、化合物が配列番号117aからなる。好適な一実施形態では、化合物が配列番号118aからなる。好適な一実施形態では、化合物が配列番号119aからなる。好適な一実施形態では、化合物が配列番号120aからなる。好適な一実施形態では、化合物が配列番号121aからなる。好適な一実施形態では、化合物が配列番号122aからなる。好適な一実施形態では、化合物が配列番号123aからなる。好適な一実施形態では、化合物が配列番号124aからなる。好適な一実施形態では、化合物が配列番号125aからなる。好適な一実施形態では、化合物が配列番号126aからなる。好適な一実施形態では、化合物が配列番号127aからなる。好適な一実施形態では、化合物が配列番号128aからなる。好適な一実施形態では、化合物が配列番号129aからなる。好適な一実施形態では、化合物が配列番号130aからなる。好適な一実施形態では、化合物が配列番号131aからなる。好適な一実施形態では、化合物が配列番号132aからなる。好適な一実施形態では、化合物が配列番号133aからなる。すぐ上に挙げた、化合物が配列番号2a〜144aから選択されるものである個々の好適な実施形態では、化合物の3'末端LNAを、対応するヌクレオチドで、好適に置き換えることができる。
本発明のさらにもう一つの態様は、本明細書中に定義する化合物と、前記化合物に共有結合した少なくとも1つの非ヌクレオチドまたは非ポリヌクレオチド部分とを含むコンジュゲートに関する。
本発明の関連する一態様では、本発明の化合物は、コンジュゲートが形成されるようにリガンド（細胞によるコンジュゲートの取り込みをアンチセンスオリゴヌクレオチドと比較して増加させるためのリガンド）に連結される。このコンジュゲーションは末端位置の5'/3'-OHで行うことができるが、リガンドは糖部分および/または塩基部分にあってもよい。特に、アンチセンスオリゴヌクレオチドをコンジュゲートし得る増殖因子は、トランスフェリンまたは葉酸を含み得る。高レベルのトランスフェリン受容体または葉酸受容体を発現させる細胞に取り込ませるために、トランスフェリン-ポリリジン-オリゴヌクレオチド複合体または葉酸-ポリリジン-オリゴヌクレオチド複合体を製造することができる。コンジュゲート/リガンドの他の例は、コレステロール部分、アクリジンなどの二重鎖挿入剤(intercalator)、ポリ-L-リジン、1以上のヌクレアーゼ耐性連結基（ホスホロモノチオエートなど）を持つ「エンドキャッピング」である。
細胞へのオリゴヌクレオチド取り込みの担体としてのトランスフェリン複合体の製造は、Wagnerら，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87，3410-3414（1990）に記載されている。葉酸受容体エンドサイトーシスによる葉酸-高分子コンジュゲートの細胞送達は、アンチセンスオリゴヌクレオチドの送達を含めて、Lowらの米国特許第5,108,921号に記載されている。Leamonら，Proc. Natl. Acad. Sci. 88，5572（1991）も参照されたい。
本発明の化合物またはコンジュゲートは、例えばアスピリン、イブプロフェン、サルファ剤、抗糖尿病薬、抗菌剤、化学療法剤または抗生物質などの活性原薬とコンジュゲート（またはさらにコンジュゲート）することもできる。
本発明の特に興味深い一態様は、本明細書中に定義する化合物または本明細書中に定義するコンジュゲートと、医薬的に許容できる希釈剤、担体または佐剤とを含む医薬組成物に向けられる。
本発明は、活性成分として少なくとも1つの本発明アンチセンスオリゴヌクレオチドコンストラクトを含む医薬組成物にも深く関係すると理解すべきである。本発明の医薬組成物は場合により医薬担体を含み、また本医薬組成物は場合によりさらなるアンチセンス化合物、化学療法剤、抗炎症性化合物、抗ウイルス化合物および/または免疫調整化合物を含むと理解すべきである。
上述のように、本発明の医薬組成物は少なくとも1つの化学療法剤をさらに含み得る。化学療法化合物は、典型的には、副腎皮質ステロイド（プレドニゾン、デキサメタゾンまたはデカドロンなど）、アルトレタミン（ヘキサレン（hexalen）、ヘキサメチルメラミン（HMM））、アミフォスチン（エチオール（ethyol））、アミノグルテチミド（シタドレン）、アムサクリン（M-AMSA）、アナストロゾール（アリミデクス）、アンドロゲン（テストステロンなど）、アスパラギナーゼ（エルスパー（elspar））、カルメットゲラン桿菌、ビカルタミド（カソデックス）、ブレオマイシン（ブレノキサン）、ブスルファン（ミレラン）、カルボプラチン（パラプラチン）、カルムスチン（BCNU、BiCNU）、クロラムブシル（リューケラン（leukeran））、クロロデオキシアデノシン（2-CDA、クラドリビン、ロイスタチン）、シスプラチン（プラチノール）、シトシンアラビノシド（シタラビン）、ダカルバジン（DTIC）、ダクチノマイシン（アクチノマイシンD、コスメゲン）、ダウノルビシン（セルビジン（cerubidine））、ドセタキセル（タキソテール）、ドキソルビシン（アドリアマイシン）、エピルビシン、エストラムスチン（emcyt）、エストロゲン（ジエチルスチルベストロール（DES）など）、エトポシド（VP-16、ベプシド、エトポフォス（etopophos））、フルダラビン（フルダラ）、フルタミド（ユーレキシン（eulexin））、5-FUDR（フロクスウリジン）、5-フルオロウラシル（5-FU）、ゲムシタビン（ゲムザール（gemzar））、ゴセレリン（ゾダレックス（zodalex））、ハーセプチン（トラスツズマブ）、ヒドロキシ尿素（ハイドレア）、イダルビシン（イダマイシン）、イホスファミド、IL-2（プロロイキン（proleukin）、アルデスロイキン）、インターフェロン・アルファ（イントロンA、ロフェロンA）、イリノテカン（カンプトサール）、ロイプロリド（ルプロン）、レバミソール（エルガミソール（ergamisole））、ロムスチン（CCNU）、メクロルエタミン（マスターゲン（mustargen）、ナイトロジェンマスタード）、メルファラン（アルケラン）、メルカプトプリン（プリネトール、6-MP）、メトトレキセート（メキセート）、マイトマイシンC（ムタムチン（mutamucin））、ミトキサントロン（ノバントロン）、オクトレオチド（サンドスタチン）、ペントスタチン（2-デオキシコホルマイシン、ニペント（nipent））、プリカマイシン（ミトラマイシン、ミトラシン（mithracin））、プロカルバジン（マチュラン（matulane））、ストレプトゾシン、タモキシフェン（ノルバデックス）、タキソール（パクリタキセル）、テニポシド（ビュウモン、VM-26）、チオテパ、トポテカン（ハイカムチン）、トレチノイン（ベサノイド、全トランス型レチノイン酸）、ビンブラスチン（バルバン（valban））、ビンクリスチン（オンコビン）およびビノレルビン（ナベルビン）からなる群より選択される。
本発明に包含されるオリゴマー化合物またはコンジュゲートは、医薬的に許容できる様々な塩の形で使用することができる。本明細書で使用するこの用語は、本明細書中に同定する化合物の望ましい生物学的活性を保っていて、望ましくない毒性作用をごくわずかしか示さない塩を指す。限定するわけではないが、そのような塩の例は、有機アミノ酸を使って形成することができる他、亜鉛、カルシウム、ビスマス、バリウム、マグネシウム、アルミニウム、銅、コバルト、ニッケル、カドミウム、ナトリウム、カリウムなどの金属カチオンを使って形成される塩基付加塩、またはアンモニア、N,N-ジベンジルエチレン-ジアミン、D-グルコサミン、テトラエチルアンモニウムもしくはエチレンジアミンから形成されるカチオンを使って形成される塩基付加塩、あるいは（c）（a）と（b）との組合せ、例えば亜鉛タンニン酸塩などを挙げることができる。
本発明の一実施形態として、コンジュゲートのオリゴマー化合物は、プロドラッグの形態をとり得る。オリゴヌクレオチドは本質的に負に荷電したイオンである。細胞膜は親油性であるので、細胞によるオリゴヌクレオチドの取り込みは、対応する中性物または親油性物と比べて少なくなる。プロドラッグアプローチを用いることにより、この極性「障害」を回避することができる（例えばCrooke，S.T.「Antisense research and Application」（Springer-Verlag，ドイツ・ベルリン，1998）第131巻の103〜140頁（Crooke，R.M.著）を参照されたい）。このアプローチでは、投与時にはオリゴが中性であるように、オリゴヌクレオチドを保護された形で製造する。これらの保護基は、オリゴが細胞に取り込まれると除去され得るように設計される。そのような保護基の例は、S-アセチルチオエチル（SATE）またはS-ピバロイルチオエチル（t-ブチル-SATE）である。これらの保護基はヌクレアーゼ耐性であり、細胞内で選択的に除去される。
本発明は、本明細書に開示する1以上のオリゴヌクレオチド化合物またはコンジュゲートの製剤も包含する。医薬的に許容できる結合剤および佐剤は、製剤化された薬物の一部を構成することができる。カプセル剤、錠剤および丸剤などは、例えば以下の化合物を含有し得る：結合剤としての微結晶セルロース、ゴムまたはゼラチン、賦形剤としてのデンプンまたはラクトース、潤滑剤としてのステアリン酸塩、種々の甘味剤または着香剤。カプセル剤の場合、投薬単位は脂肪油などの液体担体を含有し得る。また、糖もしくは腸溶剤の外被も、投薬単位の一部になり得る。オリゴヌクレオチド製剤は、活性医薬成分とミセルエマルジョンを形成する脂質とのエマルジョンであることもできる。
本発明のオリゴヌクレオチドは、望ましい作用を損なわない任意の材料または望ましい作用を補足する材料と混合することができる。これらには、他のヌクレオチド化合物を含む他の薬物を含めることができる。
非経口投与、皮下投与、皮内投与または局所外用の場合、製剤は、滅菌希釈剤、緩衝剤、張性調節剤および抗菌剤を含み得る。活性化合物は、徐放性を持つインプラントまたはマイクロカプセルなど、分解または身体からの速やかな排除を防ぐ担体を使って、調製することができる。静脈内投与の場合、好ましい担体は生理食塩水またはリン酸緩衝食塩水である。
好ましくは、オリゴマー化合物は、処置される患者に深刻な副作用を引き起こさずに患者に治療有効量を送達するのに十分な量で、単位製剤に、例えば医薬的に許容できる担体または希釈剤などに含まれる。
本発明の医薬組成物は、局所的処置が望ましいか全身的処置が望ましいかに応じて、また処置すべき領域に応じて、いくつかの方法で投与することができる。投与は（a）経口投与、（b）肺投与、例えば散剤またはエアゾル剤の吸入または吹送などによる投与（噴霧器による投与を含む）、気管内投与、鼻腔内投与、（c）局所外用、表皮投与、経皮投与、点眼および粘膜への投与（膣送達および直腸送達を含む）、または（d）非経口投与（静脈内、動脈内、皮下、腹腔内または筋肉内への注射または注入を含む）、または頭蓋内投与、例えば髄腔内または脳室内投与であることができる。ある実施形態では、活性オリゴをIV投与、IP投与、経口投与、局所投与するか、ボーラス注射として投与するか、または標的器官に直接投与する。
局所外用のための医薬組成物および医薬製剤には、経皮貼付剤、軟膏、ローション剤、クリーム剤、ゲル剤、点滴剤、噴霧剤、坐剤、液剤および散剤が含まれ得る。通常の医薬担体、水性基剤、粉末基剤または油性基剤、増粘剤などが必要であるか、または望ましい場合がある。コーティングされたコンドーム、グローブなども、役立ち得る。好ましい局所外用製剤には、本発明のオリゴヌクレオチドが局所外用送達剤（脂質、リポソーム、脂肪酸、脂肪酸エステル、ステロイド、キレート剤および界面活性剤など）と混合されているものが含まれる。経口投与用の組成物および製剤には、例えば散剤または顆粒剤、マイクロ粒子、ナノ粒子、水または非水性媒質中の懸濁剤または溶液剤、カプセル剤、ゲルカプセル剤、分包（sachet）、錠剤またはミニ錠剤などがあるが、これらに限るわけではない。非経口投与、髄腔内投与または脳室内投与用の組成物および製剤としては、緩衝剤、希釈剤および他の適切な添加剤（例えば浸透促進剤、担体化合物および他の医薬的に許容できる担体または賦形剤などであるが、これらに限らない）をも含有し得る滅菌水溶液剤を挙げることができる。
本発明の医薬組成物には、例えば溶液、エマルジョン、およびリポソーム含有製剤などが含まれるが、これらに限るわけではない。これらの組成物は、例えば既製の液体、自己乳化性固体および自己乳化性半固体などを含む様々な成分から製造することができる。腫瘍組織への薬物の送達は、例えばカチオンリポソーム、シクロデキストリン、ポルフィリン誘導体、分岐鎖デンドリマー、ポリエチレンイミンポリマー、ナノ粒子およびミクロスフェアなどの担体送達によって増進することができる（Dass CR. J Pharm Pharmacol 2002；54(1):3-27）。
単位投薬剤形で便利に提供することができる本発明の医薬製剤は、製薬産業で周知の従来技術に従って製造することができる。そのような技術には、活性成分を医薬担体または医薬賦形剤と混合するステップを含む。一般に製剤は、活性成分を液体担体もしくは微細固形担体またはその両方と均一かつ十分に混合した後、必要であれば製品を成型することによって製造される。
本発明の組成物は、例えば錠剤、カプセル剤、ゲルカプセル剤、液状シロップ剤、ソフトゲル剤および坐剤など（これらに限定されない）考え得る数多くの剤形のどれにでも製剤化することができる。本発明の組成物は、水性媒質、非水性媒質または混合媒質中の懸濁剤として製剤化することもできる。水性懸濁剤は懸濁剤の粘度を増加させる物質、例えばカルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトールおよび/またはデキストランをさらに含有し得る。懸濁液は、安定剤も含有し得る。
LNA含有オリゴマー化合物は、上述したいくつかの治療用途に役立つ。一般に、本発明の治療方法は、治療有効量のLNA修飾オリゴヌクレオチドを哺乳動物、特にヒトに投与することを含む。
ある実施形態では、本発明は、（a）1以上のアンチセンス化合物と（b）非アンチセンス機序によって機能する1以上の他の化学療法剤とを含有する医薬組成物を提供する。本発明の化合物と共に使用する場合、そのような化学療法剤は、個別に（例えばミトラマイシンとオリゴヌクレオチド）、逐次的に（例えばミトラマイシンとオリゴヌクレオチドとを一定期間使用した後、別の薬剤とオリゴヌクレオチドとを使用）、または1以上の前記他の化学療法剤と組み合わせて、もしくは放射線治療と組み合わせて、使用することができる。当業者に知られている化学療法剤は全て、本発明の化合物との併用処置剤として、本明細書中に組み込まれる。
例えば非ステロイド抗炎症薬およびコルチコステロイドなどの抗炎症薬、抗ウイルス薬、および免疫調整薬も、本発明の組成物に組み合わせることができる。2以上の併用化合物を一緒にまたは逐次的に使用することができる。
もう一つの実施形態として、本発明の組成物は、第1核酸にターゲティングされる1以上のアンチセンス化合物、特にオリゴヌクレオチドと、第2核酸標的にターゲティングされる1以上の追加アンチセンス化合物とを含有することができる。2以上の併用化合物は一緒にまたは逐次的に使用することができる。
投薬は処置すべき疾患状態の重症度および応答性に依存し、処置過程は数日から数ヶ月または治癒が達成されるか疾患状態の減退が達成されるまで継続する。最適な投薬スケジュールは、患者の身体における薬物蓄積量の測定値から計算することができる。
最適な投与量は、個々のオリゴヌクレオチドの相対効力に依存して変動し得る。一般に、インビトロモデルおよびインビボ動物モデルで有効であることがわかったEC50に基づいて、見積ることができる。一般的には、投与量は体重1kgあたり0.01μg〜1gであり、毎日、毎週、毎月または毎年1回以上投与するか、2〜10年ごとに1回投与するか、または数時間〜数ヶ月間にわたる持続注入によって投与することができる。投与の反復率は、体液または組織における薬物の滞留時間および濃度の測定値に基づいて見積ることができる。処置が成功した後は、疾患状態が再発しないように患者に維持治療を施すことが望ましい場合がある。
上述のように、本発明の興味深い一実施形態では、オリゴマー化合物がLNA（Locked Nucleic Acid）と呼ばれる化学単位を少なくとも1つは含有している。
国際特許出願WO99/14226とそれ以降の出願WO0056746、WO0056748、WO0066604、WO00125248、WO0228875、WO2002094250およびPCT/DK02/00488（これらはすべて参照により本明細書に組み込まれる）に記載されているように、LNAモノマーとは、通例、ヌクレオシド部分が類似体である二環式ヌクレオチド類似体を指す。本発明の化合物を形成するための好ましいLNAヌクレオチド構造をスキーム2に例示する。
Figure 2007523601
 ［式中、XおよびYは、基：-O-、-S-、-N(H)-、N(R)-、-CH2-または-CH-（二重結合の一部である場合）、-CH2-O-、-CH2-S-、-CH2-N(H)-、-CH2-N(R)-、-CH2-CH2-または-CH2-CH-（二重結合の一部である場合）、-CH=CH-（式中、Rは水素およびC1-4-アルキルである）の中から独立して選択され、ZおよびZ*は独立して、存在しないか、ヌクレオシド間連結部、末端基または保護基の中から選択される］。LNAヌクレオチドの少なくとも1つが3'末端にある実施形態では、その位置では、Zは末端基であり、Z*はヌクレオシド間連結部である。LNAヌクレオチドの少なくとも1つが5'末端にある実施形態では、その位置では、Zは存在せず、Z*は末端基である。ヌクレオチド配列内では、Zは存在せず、Z*はヌクレオシド間連結部である。不斉基はどちらの配向でも見いだされ得る。スキーム2では、4つのキラル中心が、固定された立体配置で示されている。しかし、スキーム2の立体配置は必ずしも固定されない。本発明には、キラル中心が異なる立体配置で見いだされる一般スキーム2の化合物、例えばスキーム3または4に記載の化合物も包含される。したがって、スキーム2の図の意図は、キラル中心の立体配置を限定することではない。スキーム2の各キラル中心はそれぞれR立体配置またはS立体配置で存在することができる。R（rectus）およびS（sinister）の定義はIUPAC1974年勧告、Eの部、基礎立体化学に記載されており、その規則はPure Appl. Chem. 45，13-30（1976）および「Nomenclature of organic Chemistry」（Pergamon，ニューヨーク，1979）に見いだすことができる。
ZおよびZ*は、化合物内でのそのLNAの位置に応じて、すなわち部分配列内部にあるか、部分配列または化合物の3'末端にあるかに応じて、ヌクレオシド間連結部を形成する役割を果たすか、末端基であるか、または保護基である。
ヌクレオシド間連結部は、-O-P(O)2-O-、-O-P(O,S)-O-、-O-P(S)2-O-、-S-P(O)2-O-、-S-P(O,S)-O-、-S-P(S)2-O-、-O-P(O)2-S-、-O-P(O,S)-S-、-S-P(O)2-S-、-O-PO(RH)-O-、O-PO(OCH3)-O-、-O-PO(NRH)-O-、-O-PO(OCH2CH2S-RH)-O-、-O-PO(BH3)-O-、-O-PO(NHRH)-O-、-O-P(O)2-NRH-、-NRH-P(O)2-O-、-NRH-CO-O-、-NRH-CO-NRH-、-O-CO-O-、-O-CO-NRH-、-NRH-CO-CH2-、-O-CH2-CO-NRH-、-O-CH2-CH2-NRH-、-CO-NRH-CH2-、-CH2-NRH-CO-、-O-CH2-CH2-S-、-S-CH2-CH2-O-、-S-CH2-CH2-S-、-CH2-SO2-CH2-、-CH2-CO-NRH-、-O-CH2-CH2-NRH-CO-、CH2-NCH3-O-CH2-であることができる（式中、RHは水素およびC1-4-アルキルから選択される）。
末端基は、水素、アジド、ハロゲン、シアノ、ニトロ、ヒドロキシ、Prot-O-、Act-O-、メルカプト、Prot-S-、Act-S-、C1-6-アルキルチオ、アミノ、Prot-N(RH)-、Act-N(RH)-、モノ-またはジ-(C1-6-アルキル)アミノ、場合により置換されたC1-6-アルコキシ、場合により置換されたC1-6-アルキル、場合により置換されたC2-6-アルケニル、場合により置換されたC2-6-アルケニルオキシ、場合により置換されたC2-6-アルキニル、場合により置換されたC2-6-アルキニルオキシ、モノホスフェート、モノチオホスフェート、ジホスフェート、ジチオホスフェート、トリホスフェート、トリチオホスフェート、DNA挿入剤、光化学活性基、熱化学活性基、キレート基、レポーター基、リガンド、カルボキシ、スルホノ、ヒドロキシメチル、Prot-O-CH2-、Act-O-CH2-、アミノメチル、Prot-N(RH)-CH2-、Act-N(RH)-CH2-、カルボキシメチル、スルホノメチル（式中、Protはそれぞれ-OH、-SHおよび-NH(RH)の保護基であり、Actはそれぞれ-OH、-SHおよび-NH(RH)の活性化基であり、RHは水素およびC1-6-アルキルから選択される）の中から独立して選択される。
ヒドロキシ置換基の保護基には、置換トリチル、例えば4,4'-ジメトキシトリチルオキシ（DMT）、4-モノメトキシトリチルオキシ（MMT）、およびトリチルオキシ、場合により置換された9-(9-フェニル)キサンテニルオキシ（ピキシル（pixyl））、場合により置換されたメトキシテトラヒドロピラニルオキシ（mthp）、シリルオキシ、例えばトリメチルシリルオキシ（TMS）、トリイソプロピルシリルオキシ（TIPS）、tert-ブチルジメチルシリルオキシ（TBDMS）、トリエチルシリルオキシ、およびフェニルジメチルシリルオキシ、tert-ブチルエーテル、アセタール（2つのヒドロキシ基を含む）、アシルオキシ、例えばアセチルまたはハロゲン置換アセチル、例えばクロロアセチルオキシまたはフルオロアセチルオキシ、イソブチリルオキシ、ピバロイルオキシ、ベンゾイルオキシおよび置換ベンゾイル、メトキシメチルオキシ（MOM）、ベンジルエーテルまたは置換ベンジルエーテル、例えば2,6-ジクロロベンジルオキシ（2,6-Cl2Bzl）が含まれる。あるいは、ZまたはZ*がヒドロキシルである場合には、固体支持体への取付け（場合によりリンカーを介した取り付け）によって、それらを保護することもできる。
ZまたはZ*がアミノ基である場合、アミノ保護基の実例は、フルオレニルメトキシカルボニルアミノ（Fmoc）、tert-ブチルオキシカルボニルアミノ（BOC）、トリフルオロアセチルアミノ、アリルオキシカルボニルアミノ（alloc、AOC）、Z ベンジルオキシカルボニルアミノ（Cbz）、置換ベンジルオキシカルボニルアミノ、例えば2-クロロベンジルオキシカルボニルアミノ（2-CIZ）、モノメトキシトリチルアミノ（MMT）、ジメトキシトリチルアミノ（DMT）、フタロイルアミノ、および9-(9-フェニル)キサンテニルアミノ（ピキシル）である。
上記の実施形態において、Actはそれぞれ-OH、-SHおよび-NH(RH)の活性化基を意味する。そのような活性化基は、例えば、場合により置換されたO-ホスホロアミダイト、場合により置換されたO-ホスホロトリエステル、場合により置換されたO-ホスホロジエステル、場合により置換されたH-ホスホネート、および場合により置換されたO-ホスホネートから選択される。
この場合、用語「ホスホロアミダイト」は式-P(ORx)-N(Ry)2の基を意味する（式中、Rxは場合により置換されたアルキル基、例えばメチル、2-シアノエチル、またはベンジルなどを意味し、各Ryは場合により置換されたアルキル基、例えばエチル、またはイソプロピルを意味するか、または基-N(Ry)2がモルホリノ基（-N(CH2CH2)2O）を形成する）。Rxは好ましくは2-シアノエチルを意味し、2つのRyは好ましくは同一であってイソプロピルを意味する。したがって、特に重要なホスホロアミダイトは、N,N-ジイソプロピル-O-(2-シアノエチル)ホスホロアミダイトである。
Bは、天然または非天然の核酸塩基を構成し、アデニン、シトシン、5-メチルシトシン、イソシトシン、プソイドイソシトシン、グアニン、チミン、ウラシル、5-ブロモウラシル、5-プロピニルウラシル、5-プロピニル-6-フルオロウラシル、5-メチルチアゾールウラシル、6-アミノプリン、2-アミノプリン、イノシン、2,6-ジアミノプリン、7-プロピン-7-デアザアデニン、7-プロピン-7-デアザグアニン、2-クロロ-6-アミノプリンの中から選択される。
特に好ましい二環式構造を下記スキーム3に示す。
Figure 2007523601
 ［式中、Yは-O-、-S-、-NH-、またはN(RH)であり、ZおよびZ*は独立して、存在しないか、ヌクレオシド間連結部、末端基または保護基の中から選択される］。
LNAヌクレオチドの少なくとも1つが3'末端にある実施形態の場合、その位置では、Zは末端基であり、Z*はヌクレオシド間連結部である。LNAヌクレオチドの少なくとも1つが5'末端にある実施形態の場合、その位置では、Zは存在せず、Z*は末端基である。ヌクレオチド配列内部では、Zは存在せず、Z*はヌクレオシド間連結部である。
ヌクレオシド間連結部は、-O-P(O)2-O-、-O-P(O,S)-O-、-O-P(S)2-O-、-S-P(O)2-O-、-S-P(O,S)-O-、-S-P(S)2-O-、-O-P(O)2-S-、-O-P(O,S)-S-、-S-P(O)2-S-、-O-PO(RH)-O-、O-PO(OCH3)-O-、-O-PO(NRH)-O-、-O-PO(OCH2CH2S-R)-O-、-O-PO(BH3)-O-、-O-PO(NHRH)-O-、-O-P(O)2-NRH-、-NRH-P(O)2-O-、-NRH-CO-O-であることができる（式中、RHは水素およびC1-4-アルキルから選択される）。
末端基は、水素、アジド、ハロゲン、シアノ、ニトロ、ヒドロキシ、Prot-O-、Act-O-、メルカプト、Prot-S-、Act-S-、C1-6-アルキルチオ、アミノ、Prot-N(RH)-、Act-N(RH)-、モノ-またはジ-(C1-6-アルキル)アミノ、場合により置換されたC1-6-アルコキシ、場合により置換されたC1-6-アルキル、場合により置換されたモノホスフェート、モノチオホスフェート、ジホスフェート、ジチオホスフェート、トリホスフェート、トリチオホスフェート（式中、Protはそれぞれ-OH、-SHおよび-NH(RH)の保護基であり、Actはそれぞれ-OH、-SHおよび-NH(RH)の活性化基であり、RHは水素およびC1-6-アルキルから選択される）の中から独立して選択される。
ヒドロキシ置換基の保護基には、置換トリチル、例えば4,4'-ジメトキシトリチルオキシ（DMT）、4-モノメトキシトリチルオキシ（MMT）、場合により置換された9-(9-フェニル)キサンテニルオキシ（ピキシル）、場合により置換されたメトキシテトラヒドロピラニルオキシ（mthp）、シリルオキシ、例えばトリメチルシリルオキシ（TMS）、トリイソプロピルシリルオキシ（TIPS）、tert-ブチルジメチルシリルオキシ（TBDMS）、トリエチルシリルオキシ、およびフェニルジメチルシリルオキシ、tert-ブチルエーテル、アセタール（2つのヒドロキシ基を含む）、アシルオキシ、例えばアセチルが含まれる。あるいは、ZまたはZ*がヒドロキシルである場合には、固体支持体への取付け（場合によりリンカーを介した取り付け）によって、それらを保護することもできる。
特に好ましいLNA単位をスキーム4に示す。
Figure 2007523601
ZまたはZ*がアミノ基である場合、アミノ保護基の実例は、フルオレニルメトキシカルボニルアミノ（Fmoc）、tert-ブチルオキシカルボニルアミノ（BOC）、トリフルオロアセチルアミノ、アリルオキシカルボニルアミノ（alloc、AOC）、モノメトキシトリチルアミノ（MMT）、ジメトキシトリチルアミノ（DMT）、フタロイルアミノである。
上記の実施形態において、Actはそれぞれ-OH、-SHおよび-NH(RH)の活性化基を意味する。そのような活性化基は、例えば、場合により置換されたO-ホスホロアミダイト、場合により置換されたO-ホスホロトリエステル、場合により置換されたO-ホスホロジエステル、場合により置換されたH-ホスホネート、および場合により置換されたO-ホスホネートから選択される。
この場合、用語「ホスホロアミダイト」は式-P(ORx)-N(Ry)2の基を意味する（式中、Rxは場合により置換されたアルキル基、例えばメチル、2-シアノエチルなどを意味し、各Ryは場合により置換されたアルキル基を意味する）。Rxは好ましくは2-シアノエチルを意味し、2つのRyは好ましくは同一であってイソプロピルを意味する。したがって、特に重要なホスホロアミダイトは、N,N-ジイソプロピル-O-(2-シアノエチル)ホスホロアミダイトである。
スキーム3および4においてBは、天然または非天然の核酸塩基を構成し、アデニン、シトシン、5-メチルシトシン、イソシトシン、プソイドイソシトシン、グアニン、チミン、ウラシル、5-ブロモウラシル、5-プロピニルウラシル、6-アミノプリン、2-アミノプリン、イノシン、ジアミノプリン、2-クロロ-6-アミノプリンの中から選択される。
LNAを含有するオリゴマー化合物を使って、多くの異なる原理によってサバイビン関連疾患を対抗できることは、当業者には理解されるだろう。したがってこれは本発明の思想に包含される。
例えばLNAオリゴマー化合物はアンチセンス阻害剤として設計することができる。これは、病因タンパク質の産生をmRNAレベルで妨害することによって妨げる一本鎖核酸である。また、これをリボザイムまたはオリゴザイムとして設計することもできる。これらは、標的結合ドメインの他に、標的mRNAを分解する触媒活性を含むか（リボザイムの場合）、標的mRNAを分解する内在酵素（RNase P）を動員する外来ガイド配列（external guide sequence：EGS）を含む（オリゴザイムの場合）、アンチセンスオリゴヌクレオチドである。
同様に、LNAオリゴマー化合物は、siRNAとして設計することもできる。これは、特定の内因性遺伝子または外因性遺伝子を未知の「アンチセンス様」機序によってサイレント化するために細胞が用いる小さい二本鎖RNA分子である。
LNAオリゴマー化合物は、アプタマー（およびスピーゲルマーと呼ばれるその変形）として設計することもできる。これは、その生物学的標的に高い親和性および高い特異性で結合してそれらをブロックすることを可能にする三次元構造を、分子内水素結合によってとることができる核酸である。また、LNAオリゴマー化合物はデコイとして設計することもできる。これは、細胞転写因子がその標的遺伝子を活性化するのを、それらのDNA結合部位を選択的にブロックすることによって防ぐ小さい二本鎖核酸である。
さらに、LNA単位オリゴマー化合物はキメラプラストとして設計することができる。これは、標的遺伝子配列と特異的に対を形成して標的遺伝子配列を変化させることができる小さい一本鎖核酸である。したがってこの原理を利用するLNA含有オリゴマー化合物は、サバイビン遺伝子中の突然変異によって起こるサバイビン関連疾患の処置に、とりわけ役立ち得る。
ひとつには、オリゴヌクレオチドがその効力を発揮するために利用することになっている治療原理に応じて、本発明のLNAオリゴマー化合物は、好ましくは約8〜約60個の核酸塩基、すなわち約8〜約60個の連結されたヌクレオチドを含む。特に好ましい化合物は約12〜約30個の核酸塩基を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドであり、最も好ましくは、約12〜20個の核酸塩基を含むアンチセンス化合物である。表1および表2に示す化合物は全て16マーである。
LNAオリゴマー化合物がその治療作用を引き出すことを可能にする上記の原理に関して、本発明の標的はサバイビン遺伝子、そのmRNAまたはタンパク質であることができる。最も好ましい実施形態では、LNAオリゴマー化合物は、サバイビンプレmRNAまたはサバイビンmRNAに対するアンチセンス阻害剤として設計される。これらのオリゴヌクレオチドは、例えば5'非翻訳リーダー、エクソン、イントロンおよび3'非翻訳テールなど、サバイビンプレmRNAまたはサバイビンmRNAに沿ったどの部位にもハイブリダイズし得る。
好ましい一実施形態では、オリゴヌクレオチドは、ヒトサバイビンプレmRNAまたはヒトサバイビンmRNAのうち、翻訳開始部位を含む部分にハイブリダイズする。より好ましくは、サバイビンオリゴヌクレオチドは、サバイビンプレmRNAまたはサバイビンRNAのAUG開始配列に相補的なCAT配列を含む。もう一つの実施形態では、サバイビンオリゴヌクレオチドが、ヒトサバイビンプレmRNAのスプライス供与部位部分にハイブリダイズする。さらにもう一つの実施形態では、サバイビンオリゴヌクレオチドは、ヒトサバイビンプレmRNAのスプライス受容部位部分にハイブリダイズする。もう一つの実施形態では、サバイビンオリゴヌクレオチドは、ヒトサバイビンプレmRNAまたはヒトサバイビンmRNAのうち、ポリアデニル化、輸送または分解に関与する部分にハイブリダイズする。好ましいオリゴヌクレオチドは、処置の特異性が保たれるように、サバイビンプレmRNAまたはサバイビンmRNAのうちその配列が無関係な遺伝子からの転写物には通常存在しないような部分にハイブリダイズするものであることは、当業者には理解されるだろう。本発明のオリゴマー化合物は、標的に対して、所望の臨床応答をもたらすのに十分な相補性を持つように設計される。例えばオリゴマー化合物は、所望の効果を得るのに十分な強さおよび特異性で、その標的に結合しなければならない。ある実施形態では、サバイビンを調整する前記化合物が、サバイビンをコードしない他の特異的核酸も調整するように設計される。
本発明のオリゴマー化合物は、分子内および分子間オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションが回避されるように設計することが好ましい。
多くの場合、インビボでまたは臨床的にサバイビン活性を調整するのに有効なLNAオリゴマー化合物の同定は、標的遺伝子に関する配列情報に基づいて行われる。しかし、そのようなオリゴマー化合物を実験的試験によって同定することもできることは、当業者には理解されるだろう。好ましい実施形態の化合物と比較して、例えば配列相同性が低い、または修飾ヌクレオチド数が多いもしくは少ない、または長さが長いもしくは短いものの、それでもなお臨床処置で応答を示すサバイビンオリゴマー化合物も、本発明の範囲に包含される。
本発明のある実施形態では、オリゴマー化合物は好適なアンチセンス薬物である。強力かつ安全なアンチセンス薬物の設計には、親和性/特異性、生物学的液体中での安定性、細胞による取り込み、作用様式、薬物動態特性および毒性など、多様なパラメータの微調整が必要である。
親和性および特異性：オキシメチレン2'-O、4'-C連結部を持つLNA（β-D-オキシ-LNA）は、DNAおよびRNA標的配列に対して、今までにない結合特性を示す。同様に、アミノ-、チオ-およびα-L-オキシ-LNAなどのLNA誘導体も、相補的RNAおよびDNAに対して、今までにない親和性を示し、チオ-LNAの場合はRNAに対する親和性がβ-D-オキシ-LNAの場合よりもさらに良い。
これらの顕著なハイブリダイゼーション特性の他にも、LNAモノマーは、DNAモノマーおよびRNAモノマーならびに他の核酸類似体、例えば2'-O-アルキル修飾RNAモノマーなどと混合して、協同的に作用させることができる。したがって、本発明のオリゴヌクレオチドはもっぱらβ-D-オキシ-LNAモノマーから構成されていてもよいし、β-D-オキシ-LNAとDNA、RNAまたは現行核酸類似体（これには、例えばアミノ-、チオ-およびα-L-オキシ-LNAなどのLNA誘導体が含まれる）との任意の組合せから構成されていてもよい。LNAがDNAまたはRNA標的配列に対して今までにない結合親和性を持つこと、そしてLNAをDNA、RNAおよび一連の現行核酸類似体と自由に混合できることは、有効かつ安全なアンチセンス化合物の開発にとって、本発明による一連の重要な結果をもたらす。
第1に、本発明のある実施形態では、アンチセンスオリゴの通常の長さを、薬理活性に必要な親和性を損なわずに、かなり（20〜25マーから例えば12〜16マーに）短縮することができる。オリゴの固有特異性はその長さに逆相関するので、このような短縮は、それぞれのRNA標的に対するアンチセンス化合物の特異性を、著しく増加させるだろう。ヒトゲノムの配列を入手することができ、その遺伝子のアノテーションも迅速に進捗しているので、本発明の一実施形態は、標的mRNA中に可能な限り短いユニーク配列を同定することである。
もう一つの実施形態では、オリゴのサイズを減少させるためにLNAを使用することにより、製造方法が容易になり、製造コストが軽減されて、アンチセンス治療が多様な疾患にとって商業的に競争力のある処置になるための基礎を与える。
もう一つの実施形態では、LNAの今までにない親和性を利用して、インビボでそれぞれの標的mRNAにハイブリダイズするというアンチセンスオリゴの能力を著しく高め、よって、他の化学を使った場合と比較して、活性化合物を同定するのに必要な時間と努力を著しく減らすことができる。
もう一つの実施形態では、LNAの今までにない親和性を利用して、アンチセンスオリゴヌクレオチドの効力を高め、よって、現在臨床試験されているものよりも有利な治療域を持つ化合物の開発を可能にする。
アンチセンス阻害剤として設計した場合、本発明のオリゴヌクレオチドは標的核酸に結合し、その同族タンパク質の発現を調整する。好ましくは、そのような調整は、正常発現レベルと比較して少なくとも10％または20％の発現阻害、より好ましくは正常発現レベルと比較して少なくとも30％、40％、50％、60％、70％、80％または90％の阻害をもたらす。
典型的には、本発明のLNAオリゴヌクレオチドは、β-D-オキシ-LNA以外の残基、例えば天然DNAモノマー、RNAモノマー、N3'-P5'ホスホロアミデート、2'-F、2'-O-Me、2'-O-メトキシエチル（MOE）、2'-O-(3-アミノプロピル)（AP）、ヘキシトール核酸（HNA）、2'-F-アラビノ核酸（2'-F-ANA）およびD-シクロヘキセニルヌクレオシド（CeNA）などを含有するだろう。また、β-D-オキシ-LNA修飾オリゴヌクレオチドは、オキシ-LNA基に加えて、またはオキシ-LNA基の代わりに、他のLNA単位も含有し得る。具体的には、好ましい追加LNA単位には、D-β配置またはL-α配置のチオ-LNAモノマーまたはアミノ-LNAモノマー、またはその組合せまたはena-LNAが含まれる。一般に、LNA修飾オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの総ヌクレオチド数に基づいて、少なくとも約5、10、15または20パーセントのLNA単位、より典型的にはオリゴヌクレオチドの総塩基数に基づいて、少なくとも約20、25、30、40、50、60、70、80または90パーセントのLNA単位を含有するだろう。
生物学的液体中での安定性：
本発明の一実施形態には、結果として生成するオリゴマー化合物の生物学的液体における安定性を、例えばヌクレアーゼ（エンドヌクレアーゼおよびエキソヌクレアーゼ）に対する耐性の増加などによって増加させるために、標準的DNAまたはRNAオリゴヌクレオチドにLNAモノマーを組み込むことが含まれる。安定性の程度は、使用するLNAモノマーの数、オリゴヌクレオチドにおけるそれらの位置、そして使用するLNAモノマーのタイプに依存するだろう。DNAおよびホスホロチオエートと比較すると、ヌクレオチド分解に対してオリゴヌクレオチドを安定化する能力について、以下の順序を確立することができる：DNA＜＜ホスホロチオエート〜オキシ-LNA＜α-L-LNA＜アミノ-LNA＜チオ-LNA。
LNAが標準的なDNA合成に適合し、多くの現行核酸類似体と自由に混ざるという事実からして、LNAオリゴマー化合物のヌクレアーゼ耐性は、本発明に従って、増加したヌクレアーゼ安定性を示す他の類似体を組み込むか、あるいはヌクレアーゼ耐性ヌクレオシド間連結部、例えばホスホロモノチオエート、ホスホロジチオエート、およびメチルホスホネート連結部などを利用することによって、さらに増加させることができる。
作用様式：
本発明のアンチセンス化合物は、様々な機序によってその治療効果を引き出すことができ、同じ化合物中にこれらの機序のいくつかを合わせ持つ場合もある。あるシナリオでは、標的（プレmRNAまたはmRNA）へのオリゴヌクレオチドの結合が、その標的の適正な機能にとって必要な他の因子（タンパク質、他の核酸など）の結合を妨げる働きをする（すなわち立体障害によって作動する）。例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、スプライシング、ポリアデニル化、細胞内輸送、RNA中のヌクレオシドの転写後修飾、5'末端のキャッピング、翻訳などに関与するトランス作用性因子の認識および結合にとって重要な、プレmRNAまたはmRNA中の配列モチーフに結合し得る。プレmRNAスプラシングの場合、オリゴヌクレオチドとその標的との相互作用の帰結は、望ましくないタンパク質の発現の抑制、望ましいタンパク質をコードする選択的スプライシングを受けたmRNAの生成、またはその両方であり得る。
もう一つの実施形態では、標的へのオリゴヌクレオチドの結合が、リボソーム機構への物理的障害を生成することによって、翻訳過程を不可能にする（すなわち翻訳停止）。
さらにもう一つの実施形態では、標的へのオリゴヌクレオチドの結合が、RNAの適正な機能にとって重要な二次構造および高次構造をとるというRNAの能力を妨害する（すなわち構造障害）。例えば、オリゴヌクレオチドは、様々な機能（例えばRNAに安定性を追加することや、様々なタンパク質に対して必須認識モチーフをとること）に決定的な役割を果たすステム-ループ構造の形成を妨害し得る。
さらにもう一つの実施形態では、オリゴヌクレオチドの結合が、mRNAを分解する細胞性酵素を動員することにより、さらなる細胞代謝過程に向けて標的を不活化する。例えば、オリゴヌクレオチドは、DNA/RNA二重鎖のRNA部分を分解するリボヌクレアーゼH（RNaseH）を動員する能力を持つヌクレオシドのセグメントを含み得る。同様に、オリゴヌクレオチドは、二本鎖RNAse（例えばRNAseIII）を動員するセグメントを含むか、標的mRNAを分解する内在酵素（RNaseP）を動員する外来ガイド配列を含み得る。さらにオリゴヌクレオチドは、RNAse触媒活性を示す配列モチーフを含んでもよく、あるいは、ハイブリダイゼーションによって標的の近傍に来たときに、標的がさらなる代謝活性を受けないようにする部分をオリゴヌクレオチドに取り付けてもよい。
β-D-オキシ-LNAはRNaseH活性を支持しないことが示されている。しかし、本発明によれば、β-D-オキシ-LNAとDNAとから構成されるギャップマーと呼ばれるキメラオリゴヌクレオチドを作製することによって、これを変えることができる。ギャップマーは、RNaseHによって認識され切断され得る4〜12ntのDNAまたは修飾モノマーの中央ストレッチ（ギャップ）であって、典型的にはその側面に1〜6残基のβ-D-オキシ-LNA（隣接部分）を伴うものに基づいている。この隣接部分は、LNA誘導体で構築することもできる。RNaseHが媒介する機序によって作用することのできる本発明キメラコンストラクトは他にもある。ヘッドマー（headmer）は、5'末端にあるβ-D-オキシ-LNAまたはLNA誘導体の連続したストレッチと、それに続く、RNaseHによって認識され切断され得るDNAまたは修飾モノマーの3'末端に向かう連続したストレッチとによって定義され、テイルマー（tailmer）は、5'末端にある、RNaseHによって認識され切断され得るDNAまたは修飾モノマーの連続したストレッチと、それに続く、β-D-オキシ-LNAまたはLNA誘導体の3'末端に向かう連続したストレッチとによって定義される。RNaseHによって認識され切断され得るDNAまたは修飾モノマーとβ-D-オキシ-LNAおよび/またはLNA誘導体とが交互に現れる組成からなる本発明の他のキメラ（ミックスマー（mixmer）という）も、RNaseH結合および切断を媒介することができ得る。α-L-LNAはRNaseH活性をある程度動員するので、ギャップマーコンストラクトには、RNaseHによって認識され切断され得るDNAまたは修飾モノマーの、より小さなギャップが必要となり得て、ミックスマー構築にはより高い柔軟性を導入し得る。図1に本発明による様々なデザインの概略を示す。
アンチセンスオリゴヌクレオチドの臨床的有効性は、相当程度、その薬物動態、例えば吸収、分布、細胞による取り込み、代謝および排出などに依存する。そしてまたこれらのパラメータは、基礎をなす化学とオリゴヌクレオチドのサイズおよび三次元構造とによって、かなり左右される。
上述のように、本発明のLNAは、単一の化学ではなく、分子的には異なるがいずれも相補的DNAおよびRNAに対して素晴らしい親和性を示す数種類の関連した化学である。したがって、LNA化学ファミリーは、LNAの高い親和性を利用して活性化合物のサイズを調整するか、様々なLNA化学を利用して活性化合物の厳密な分子組成を調整して、要望どおりの薬物動態特性を持つ本発明のオリゴを開発するのに、比類なく適している。後者の場合、例えばオキシ-LNAではなくアミノ-LNAを使用することにより、オリゴ全体の電荷が変化し、取り込みおよび分布挙動に影響するだろう。同様に、オキシ-LNAの代わりにチオ-LNAを使用すると、オリゴヌクレオチドの親油性が増加し、よって、例えば細胞膜などの親油性障壁を通過する能力に影響が及ぶだろう。
本発明のLNAオリゴヌクレオチドの薬物動態特性の調整は、さらに、多種多様な部分の取り付けによって達成することもできる。例えば、オリゴヌクレオチドの細胞膜通過能力は、例えば脂質部分（コレステロール部分など）、チオエーテル、脂肪族鎖、リン脂質およびポリアミンなどをオリゴヌクレオチドに取り付けることによって増加させることができる。同様に、細胞質への輸送を媒介する細胞膜中の分子と相互作用する部分をオリゴヌクレオチドにコンジュゲートすることにより、細胞へのLNAオリゴヌクレオチドの取り込みを増進することもできる。
本発明によれば、オリゴマーの取り込みを改善する基、生体安定性を高める基（例えば分解に対するオリゴマーの耐性を高める基）および/またはオリゴヌクレオチドの標的配列（例えばmRNA配列）とのハイブリダイゼーション特徴の特性および親和性を増加させる基を使って、薬物動態特性を高めることができる。
アンチセンスオリゴに伴う毒性には基本的に2つのタイプ、すなわち塩基配列が関係する配列依存的毒性と、配列非依存的なクラス関連毒性とがある。天然CpG配列モチーフによる免疫刺激に関係する問題を除けば、アンチセンスオリゴヌクレオチドの開発において最も顕著であった毒性は、配列には依存せず、例えばオリゴヌクレオチドの化学、そして投与量、投与様式、投与頻度および投与継続時間などに関係する。ホスホロチオエートクラスのオリゴヌクレオチドは特によく特徴づけられており、例えば補体活性化、PTT（部分トロンボプラスチン時間）の延長、血小板減少症、肝毒性（肝酵素の上昇）、心臓毒性、脾腫および細網内皮細胞の過形成など、いくつかの有害作用を引き出すことがわかっている。
上述のように、LNA化学ファミリーは今までにない親和性、極めて高い生体安定性およびオリゴヌクレオチドの厳密な分子組成を調整する能力をもたらす。本発明の一実施形態では、高い効力を持ち、しかもホスホロチオエート連結部があったとしても少なく、したがって現行のアンチセンス化合物よりも優れた効力および安全性を示すであろうオリゴヌクレオチドの開発が、LNA含有化合物によって可能になる。
本発明のオリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチドは、有機化学の当業者にはよく知られている核酸化学の重合技術を使って製造することができる。一般的には、ホスホロアミダイト法の標準的オリゴマー化サイクル（S.L.BeaucageおよびR.P.Iyer，Tetrahedron，1993，49，6123、S.L.BeaucageおよびR.P.Iyer，Tetrahedron，1992，48、2223）を使用するが、例えばH-ホスホネート化学、ホスホロトリエステル化学なども使用することができる。
本発明の一部のモノマーについては、カップリング時間を延長し、かつ/または新しい試薬によるカップリングを反復し、かつ/または濃度の高いカップリング試薬を使用した。使用したホスホロアミダイトは、＞95％の満足できるステップワイズカップリング収率でカップリングした。ホスフェートのチオール化は、ホスホロジエステルオリゴマーの合成に使用される通常の（例えばヨウ素/ピリジン/H2O）酸化に代えて、ビューケイジ（Beaucage）試薬（市販品）を使った酸化を用いることによって行う。他の硫黄化試薬も包含される。ホスホロチオエートLNAオリゴマーは≧98％のステップワイズカップリング収率で効率よく合成された。
β-D-アミノ-LNA、β-D-チオ-LNAオリゴヌクレオチド、α-L-LNAおよびβ-D-メチルアミノ-LNAオリゴヌクレオチドも、ホスホロアミダイト法により、≧98％のステップワイズカップリング収率で、効率よく合成された。
LNAオリゴマー化合物の精製は使い捨て逆相精製カートリッジおよび/または逆相HPLCおよび/またはエタノールもしくはブタノールからの沈殿を使って行った。キャピラリーゲル電気泳動、逆相HPLC、MALDI-MSおよびESI-MSを使って、合成されたオリゴヌクレオチドの純度を確認した。さらに、LNA（場合により核酸塩基保護され、かつ場合により5'-OH保護されたもの）が固定化されている固体支持体材料は、LNAモノマーが3'末端に含まれているLNA含有オリゴマー化合物を合成するための材料として特に興味深い。この例では、固体支持体材料は、好ましくは、3'が官能化され、場合により核酸塩基が保護され、かつ場合により5'-OHが保護されたLNAが、その材料の供給者によって明示された状況を使って連結されているCPG（例えば容易に入手できる（市販されている）CPG材料）またはポリスチレンである。
もはや明らかであるに違いないが、本発明の興味深い一態様は、医薬として使用するための本発明の化合物または本発明のコンジュゲートに向けられる。そしてまた、今となってはやはり明白であるに違いないが、癌を処置するための医薬の製造を目的とする本発明の化合物または本発明のコンジュゲートの使用も、本発明のとりわけ興味深い態様である。
本発明の医薬組成物は、多種多様な疾患の処置に使用することができる。例えば、サバイビンは、肺（Monzoら，1999，J. Clin. Oncol 17，2100-2104）、***（Tanakaら，2000，Clin. Cancer Res. 6，127-134、Nasuら，2002，Anticancer Res. 22，1839-1844）、結腸/直腸（Kawasakiら，1998，Cancer Res. 58，5071-5074、Roedelら，2002，Strahlenther. Onkol. 8，426-434）、胃（Luら，1998，Cancer Res. 58，1808-1812、Tsuburayaら，2002，Hepatogastroenterology 49，1150-1152）、食道（Katoら，2001，Int. J. Cancer 95，92-95、IkeguchiおよびKaibara，2002，Br. J. Cancer 87，883-887）、膵臓（Satohら，2001，Cancer 92，271-278、Sarelaら，2002，Br. J. Cancer 86，886-892）、肝臓（Ikeguchiら，2002，Clin. Cancer Res. 8，3131-3136）、子宮（Saitohら，1999，Int. J. Oncol. 15，137-141、Takaiら，2002，Cancer Lett. 184，105-116）、卵巣（Yoshodaら，2001，Int. J. Oncol. 19，537-542、Takaiら，2002，Int. J. Mol. Med. 10，211-216）、ホジキン病（Garciaら，2003，Blood 101，681-689）、非ホジキンリンパ腫（Adidaら，2000，Blood 96，1921-1925、Kuttlerら，2002，Leukemia 16，726-735）、白血病（Adidaら，2000，Br. J. Haematol. 111，196-203、Kamihiraら，2001，Br. J. Haematol. 114，63-69、Moriら，2001，Int. J. Haematol. 75，161-165）、神経芽細胞腫（Islamら，2000，Oncogene 19，617-623、Adidaら，1998，Lancet 351，882-883）、褐色細胞腫（Kochら，2002，Eur. J. Endocrinol. 146，381-388）、軟組織肉腫（Wuerlら，2002，Lancet 359，943-945）、神経膠腫（Chakravartiら 2002，J. Clin. Oncol. 20，1063-1068）、黒色腫（Grossmanら，1999，J. Invest. Dermatol. 113，1076-1081）、膀胱（Swanaら，1999，New Engl. J. Med. 341，452-453、Smithら，2001，JAMA 285，324-328）、子宮頚（Kimら，2002，Anticancer Res. 22，805-808、Yoshidaら，2003，Oncol. Rep. 10，45-49）、前立腺（Ambrosiniら，1997，Nat. Med. 3，917-921）のヒト腫瘍において過剰発現することがわかっている。癌細胞と同様に、増殖する血管内皮細胞も、サバイビン発現のダウンレギュレーションに対して感受性である。したがって、本発明の医薬組成物は、血管新生を引き起こす異常疾患を特徴とする疾患の処置に使用することができる。そのような疾患の例は、癌全般と、アテローム性動脈硬化症、乾癬、糖尿病性網膜症、慢性関節リウマチ、喘息、疣贅、アレルギー性皮膚炎およびカポジ肉腫（Karposis sarcoma）である。さらにサバイビンは、HIV-1感染に際して細胞生存の調節にも能動的に関与し得る（Zhuら，2003，Apoptosis 8，71-79）。サバイビンは有糸***の適正な実行および細胞***の完了に不可欠である。したがって、サバイビンのダウンレギュレーションは、無制御または異常な細胞成長を特徴とする任意の疾患の処置に妥当なはずである。
概説すると、本発明の一態様は、異常な血管新生によって起こる疾患を患っている哺乳動物またはそのような疾患に罹りやすい哺乳動物を処置する方法であって、サバイビンを標的とするオリゴヌクレオチドであって1以上のLNA単位を含むオリゴヌクレオチドの治療有効量を、その哺乳動物に投与することを含む方法に向けられる。
本発明の興味深い一態様は、アテローム性動脈硬化症、乾癬、糖尿病性網膜症、慢性関節リウマチ、喘息、疣贅およびアレルギー性皮膚炎を処置するための医薬の製造を目的とする、本明細書中に定義する化合物または本明細書中に定義するコンジュゲートの使用に向けられる。
本発明の方法は、好ましくは、癌によって引き起こされる疾患に対する処置または予防、特に肺、***、結腸、前立腺、膵臓、肝臓、脳、精巣、胃、消化管、腸、脊髄、洞、尿路または卵巣などの組織に生じ得る癌の処置に使用される。
さらに、本願発明は、癌を予防または処置する方法であって、治療有効量のサバイビン調整オリゴマー化合物（例えば高用量のオリゴマー）をそのような治療を必要とするヒトに投与することを含む方法も包含する。さらに本発明は、サバイビン調整オリゴマー化合物投与の短期的使用も包含する。通常、非癌性細胞は、その細胞タイプに特有の頻度で***する。細胞が癌状態に形質転換すると、無制御な細胞増殖および細胞死の減少が起こる。したがって、でたらめな細胞***または細胞成長は癌性細胞タイプの特徴である。癌のタイプの例には、非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫、白血病（例えば急性白血病、例えば急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性リンパ性白血病、多発性骨髄腫）、結腸癌、直腸癌、膵臓癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、腎細胞癌、肝臓癌、胆管癌、絨毛癌、子宮頸癌、精巣癌、肺癌、膀胱癌、黒色腫、頭頚部癌、脳腫瘍、未知の原発部位の癌、新生物、末梢神経系の癌、中枢神経系の癌、腫瘍（例えば線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨原性肉腫、脊索種、血管肉腫、内皮肉腫、リンパ管肉腫、リンパ管内皮肉腫、滑膜種、中皮腫、ユーイング腫、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、扁平上皮癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、脂腺癌、乳頭状癌、乳頭腺癌、嚢胞腺癌、髄様癌、気管支原性癌、精上皮腫、胎児性癌、ウィルムス腫瘍、小細胞肺癌、上皮癌、神経膠腫、星状細胞種、髄芽腫、頭蓋咽頭腫、脳室上衣腫、松果体腫、血液芽細胞腫、聴神経腫、乏突起神経膠腫、髄膜腫、神経芽細胞腫、および網膜芽腫）、重鎖病、転移、または無制御なもしくは異常な細胞成長を特徴とする任意の疾患または障害が含まれるが、これらに限るわけではない。
癌を処置するための医薬の製造を目的とする本発明の化合物または本発明のコンジュゲートの使用において、前記癌は好適には固形腫瘍の形態をとり得る。さらに前記癌は好適には癌腫でもある。癌腫は典型的には、悪性黒色腫、基底細胞癌、卵巣癌、乳癌、非小細胞肺癌、腎細胞癌、膀胱癌、再発性表在性膀胱癌、胃癌、前立腺癌、膵癌、肺癌、子宮頸癌、子宮頚部形成異常、咽頭乳頭腫症、結腸癌、および腎細胞癌からなる群より選択される形態をとる。より典型的には、前記癌腫は、悪性黒色腫、非小細胞肺癌、乳癌、結腸癌および腎細胞癌からなる群より選択される。悪性黒色腫は、典型的には、表在拡大型黒色腫、結節型黒色腫、悪性黒子型黒色腫、先端黒色腫、メラニン欠乏症黒色腫および線維硬化性黒色腫からなる群より選択される。
あるいは、癌は好適には肉腫であることもできる。肉腫は、典型的には、骨肉腫、ユーイング肉腫、軟骨肉腫、悪性線維性組織球腫、線維肉腫およびカポジ肉腫からなる群より選択される形態をとる。
あるいは、癌は好適には神経膠腫であることもできる。
本発明は少なくとも1つの本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドコンストラクトを活性成分として含む医薬組成物にも関係すると理解すべきである。本発明の医薬組成物は場合により医薬担体を含み、本医薬組成物は場合によりさらにアンチセンス化合物、化学療法化合物、抗炎症性化合物、抗ウイルス化合物および/または免疫調整化合物を含むと理解すべきである。
本発明に含まれるオリゴマー化合物は、種々の医薬的に許容できる塩として使用することができる。本明細書で使用するこの用語は、本明細書中に同定する化合物の望ましい生物学的活性を保っていて、望ましくない毒性作用をごくわずかしか示さない塩を指す。限定するわけではないが、そのような塩の例は、有機アミノ酸を使って形成することができる他、亜鉛、カルシウム、ビスマス、バリウム、マグネシウム、アルミニウム、銅、コバルト、ニッケル、カドミウム、ナトリウム、カリウムなどの金属カチオンを使って形成される塩基付加塩、またはアンモニア、N,N-ジベンジルエチレン-ジアミン、D-グルコサミン、テトラエチルアンモニウムもしくはエチレンジアミンから形成されるカチオンを使って形成される塩基付加塩、あるいは（c）（a）と（b）との組合せ、例えば亜鉛タンニン酸塩などを挙げることができる。
本発明の一実施形態では、オリゴマー化合物はプロドラッグの形態をとり得る。オリゴヌクレオチドは本質的に負に荷電したイオンである。細胞膜は親油性であるので、細胞によるオリゴヌクレオチドの取り込みは、対応する中性物または親油性物と比べて少なくなる。プロドラッグアプローチを用いることにより、この極性「障害」を回避することができる（例えばCrooke，S.T.「Antisense research and Application」（Springer-Verlag，ドイツ・ベルリン，1998）第131巻の103〜140頁（Crooke，R.M.著）を参照されたい）。このアプローチでは、投与時にはオリゴが中性であるように、オリゴヌクレオチドを保護された形で製造する。これらの保護基は、オリゴが細胞に取り込まれると除去され得るように設計される。そのような保護基の例は、S-アセチルチオエチル（SATE）またはS-ピバロイルチオエチル（t-ブチル-SATE）である。これらの保護基はヌクレアーゼ耐性であり、細胞内で選択的に除去される。
本発明の一実施態様では、オリゴマー化合物がリガンド/コンジュゲートに連結される。これは、細胞によるアンチセンスオリゴヌクレオチドの取り込みを増加させる方法である。このコンジュゲーションは末端位置5'/3'-OHで行うことができるが、リガンドは糖および/または塩基にあってもよい。コンジュゲート/リガンドの他の例はコレステロール部分、アクリジンなどの二重鎖挿入剤、ポリ-L-リジン、1以上のヌクレアーゼ耐性連結基を持つ「エンドキャッピング」である。
本発明は、本明細書中に開示する1以上のオリゴヌクレオチド化合物の製剤も包含する。医薬的に許容できる結合剤および佐剤は、製剤化された薬物の一部を構成することができる。カプセル剤、錠剤および丸剤などは、例えば以下の化合物を含有し得る：結合剤としての微結晶セルロース、ゴムまたはゼラチン、賦形剤としてのデンプンまたはラクトース、潤滑剤としてのステアリン酸塩、種々の甘味剤または着香剤。カプセル剤の場合、投薬単位は脂肪油などの液体担体を含有し得る。また、糖もしくは腸溶剤の外被も、投薬単位の一部になり得る。オリゴヌクレオチド製剤は、活性医薬成分とミセルエマルジョンを形成する脂質とのエマルジョンであることもできる。本発明のオリゴヌクレオチドは、望ましい作用を損なわない任意の材料または望ましい作用を補足する材料と混合することができる。これらには、他のヌクレオチド化合物を含む他の薬物を含めることができる。非経口投与、皮下投与、皮内投与または局所外用の場合、製剤は、滅菌希釈剤、緩衝剤、張性調節剤および抗菌剤を含み得る。活性化合物は、徐放性を持つインプラントまたはマイクロカプセルなど、分解または身体からの速やかな排除を防ぐ担体を使って、調製することができる。静脈内投与の場合、好ましい担体は生理食塩水またはリン酸緩衝食塩水である。好ましくは、オリゴマー化合物は、処置される患者に深刻な副作用を引き起こさずに患者に治療有効量を送達するのに十分な量で、単位製剤に、例えば医薬的に許容できる担体または希釈剤などに含まれる。
本発明の医薬組成物は、局所的処置が望ましいか全身的処置が望ましいかに応じて、また処置すべき領域に応じて、いくつかの方法で投与することができる。投与は（a）経口投与、（b）肺投与、例えば散剤またはエアゾル剤の吸入または吹送などによる投与（噴霧器による投与を含む）、気管内投与、鼻腔内投与、（c）局所外用、表皮投与、経皮投与、点眼および粘膜への投与（膣送達および直腸送達を含む）、または（d）非経口投与（静脈内、動脈内、皮下、腹腔内または筋肉内への注射または注入を含む）、または頭蓋内投与、例えば髄腔内または脳室内投与であることができる。ある実施形態では、活性オリゴをIV投与、IP投与、経口投与、局所投与するか、ボーラス注射として投与するか、または標的器官に直接投与する。局所外用のための医薬組成物および医薬製剤には、経皮貼付剤、軟膏、ローション剤、クリーム剤、ゲル剤、点滴剤、噴霧剤、坐剤、液剤および散剤が含まれ得る。通常の医薬担体、水性基剤、粉末基剤または油性基剤、増粘剤などが必要であるか、または望ましい場合がある。コーティングされたコンドーム、グローブなども、役立ち得る。好ましい局所外用製剤には、本発明のオリゴヌクレオチドが局所外用送達剤（脂質、リポソーム、脂肪酸、脂肪酸エステル、ステロイド、キレート剤および界面活性剤など）と混合されているものが含まれる。経口投与用の組成物および製剤には、例えば散剤または顆粒剤、マイクロ粒子、ナノ粒子、水または非水性媒質中の懸濁剤または溶液剤、カプセル剤、ゲルカプセル剤、分包、錠剤またはミニ錠剤などがあるが、これらに限るわけではない。非経口投与、髄腔内投与または脳室内投与用の組成物および製剤としては、緩衝剤、希釈剤および他の適切な添加剤（例えば浸透促進剤、担体化合物および他の医薬的に許容できる担体または賦形剤などであるが、これらに限らない）をも含有してよい滅菌水溶液剤を挙げることができる。
本発明の医薬組成物には、例えば溶液、エマルジョン、およびリポソーム含有製剤などが含まれるが、これらに限るわけではない。これらの組成物は、例えば既製の液体、自己乳化性固体および自己乳化性半固体などを含む様々な成分から製造することができる。腫瘍組織への薬物の送達は、例えばカチオンリポソーム、シクロデキストリン、ポルフィリン誘導体、分岐鎖デンドリマー、ポリエチレンイミンポリマー、ナノ粒子およびミクロスフェアなどの担体送達によって増進することができる（Dass CR. J Pharm Pharmacol 2002；54(1):3-27）。単位投薬剤形で便利に提供することができる本発明の医薬製剤は、製薬産業で周知の従来技術に従って製造することができる。そのような技術には、活性成分を医薬担体または医薬賦形剤と混合するステップを含む。一般に製剤は、活性成分を液体担体または微細固形担体またはその両方と均一かつ十分に混合した後、必要であれば製品を成型することによって製造される。本発明の組成物は、例えば錠剤、カプセル剤、ゲルカプセル剤、液状シロップ剤、ソフトゲル剤および坐剤など、考え得る数多くの剤形のどれにでも製剤化することができる。本発明の組成物は、水性媒質、非水性媒質または混合媒質中の懸濁剤として製剤化することもできる。水性懸濁剤は懸濁剤の粘度を増加させる物質、例えばカルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトールおよび/またはデキストランをさらに含有してよい。懸濁液は安定剤も含有してよい。本発明のオリゴマー化合物は、例えばアスピリン、イブプロフェン、サルファ剤、抗糖尿病薬、抗菌剤、または抗生物質などの活性原薬とコンジュゲートすることもできる。
LNA含有オリゴマー化合物は上に示したいくつかの治療用途に役立つ。一般に本発明の治療方法は、哺乳動物（特にヒト）に治療有効量のLNA修飾オリゴヌクレオチドを投与することを含む。ある実施形態では、本発明は、（a）1以上のアンチセンス化合物と（b）非アンチセンス機序によって機能する1以上の他の化学療法剤とを含有する医薬組成物を提供する。本発明の化合物と共に使用する場合、そのような化学療法剤は、個別に（例えばミトラマイシンとオリゴヌクレオチド）、逐次的に（例えばミトラマイシンとオリゴヌクレオチドとを一定期間使用した後、別の薬剤とオリゴヌクレオチドとを使用）、または1以上の前記他の化学療法剤と組み合わせて、または放射線治療と組み合わせて、使用することができる。当業者に知られている化学療法剤は全て、本発明の化合物との併用処置剤として、本明細書中に組み込まれる。例えば非ステロイド抗炎症薬およびコルチコステロイドなどの抗炎症薬、抗ウイルス薬、および免疫調整薬も、本発明の組成物に組み合わせることができる。2以上の併用化合物を一緒にまたは逐次的に使用することができる。
したがって本発明のさらにもう一つの態様は、癌を処置するための医薬の製造を目的とする、本明細書中に定義する化合物または本明細書中に定義するコンジュゲートの使用であって、前記医薬が、副腎皮質ステロイド（プレドニゾン、デキサメタゾンまたはデカドロンなど）、アルトレタミン（ヘキサレン、ヘキサメチルメラミン（HMM））、アミフォスチン（エチオール）、アミノグルテチミド（シタドレン）、アムサクリン（M-AMSA）、アナストロゾール（アリミデクス）、アンドロゲン（テストステロンなど）、アスパラギナーゼ（エルスパー）、カルメットゲラン桿菌、ビカルタミド（カソデックス）、ブレオマイシン（ブレノキサン）、ブスルファン（ミレラン）、カルボプラチン（パラプラチン）、カルムスチン（BCNU、BiCNU）、クロラムブシル（リューケラン）、クロロデオキシアデノシン（2-CDA、クラドリビン、ロイスタチン）、シスプラチン（プラチノール）、シトシンアラビノシド（シタラビン）、ダカルバジン（DTIC）、ダクチノマイシン（アクチノマイシンD、コスメゲン）、ダウノルビシン（セルビジン）、ドセタキセル（タキソテール）、ドキソルビシン（アドリアマイシン）、エピルビシン、エストラムスチン（emcyt）、エストロゲン（ジエチルスチルベストロール（DES）など）、エトポシド（VP-16、ベプシド、エトポフォス）、フルダラビン（フルダラ）、フルタミド（ユーレキシン）、5-FUDR（フロクスウリジン）、5-フルオロウラシル（5-FU）、ゲムシタビン（ゲムザール）、ゴセレリン（ゾダレックス）、ハーセプチン（トラスツズマブ）、ヒドロキシ尿素（ハイドレア）、イダルビシン（イダマイシン）、イホスファミド、IL-2（プロロイキン、アルデスロイキン）、インターフェロン・アルファ（イントロンA、ロフェロンA）、イリノテカン（カンプトサール）、ロイプロリド（ルプロン）、レバミソール（エルガミソール）、ロムスチン（CCNU）、メクロルエタミン（マスターゲン、ナイトロジェンマスタード）、メルファラン（アルケラン）、メルカプトプリン（プリネトール、6-MP）、メトトレキセート（メキセート）、マイトマイシンC（ムタムチン）、ミトキサントロン（ノバントロン）、オクトレオチド（サンドスタチン）、ペントスタチン（2-デオキシコホルマイシン、ニペント）、プリカマイシン（ミトラマイシン、ミトラシン）、プロカルバジン（マチュラン）、ストレプトゾシン、タモキシフェン（ノルバデックス）、タキソール（パクリタキセル）、テニポシド（ビュウモン、VM-26）、チオテパ、トポテカン（ハイカムチン）、トレチノイン（ベサノイド、全トランス型レチノイン酸）、ビンブラスチン（バルバン）、ビンクリスチン（オンコビン）およびビノレルビン（ナベルビン）からなる群より選択される化学療法剤をさらに含む使用に向けられる。好適には、さらなる化学療法剤は、タキソール、パクリタキセルまたはドセタキセルなどのタキサン類から選択される。
同様に、本発明はさらに、癌を処置するための医薬の製造を目的とする、本明細書中に定義する化合物、または本明細書中に定義するコンジュゲートの使用であって、前記処置が、副腎皮質ステロイド（プレドニゾン、デキサメタゾンまたはデカドロンなど）、アルトレタミン（ヘキサレン、ヘキサメチルメラミン（HMM））、アミフォスチン（エチオール）、アミノグルテチミド（シタドレン）、アムサクリン（M-AMSA）、アナストロゾール（アリミデクス）、アンドロゲン（テストステロンなど）、アスパラギナーゼ（エルスパー）、カルメットゲラン桿菌、ビカルタミド（カソデックス）、ブレオマイシン（ブレノキサン）、ブスルファン（ミレラン）、カルボプラチン（パラプラチン）、カルムスチン（BCNU、BiCNU）、クロラムブシル（リューケラン）、クロロデオキシアデノシン（2-CDA、クラドリビン、ロイスタチン）、シスプラチン（プラチノール）、シトシンアラビノシド（シタラビン）、ダカルバジン（DTIC）、ダクチノマイシン（アクチノマイシンD、コスメゲン）、ダウノルビシン（セルビジン）、ドセタキセル（タキソテール）、ドキソルビシン（アドリアマイシン）、エピルビシン、エストラムスチン（emcyt）、エストロゲン（ジエチルスチルベストロール（DES）など）、エトポシド（VP-16、ベプシド、エトポフォス）、フルダラビン（フルダラ）、フルタミド（ユーレキシン）、5-FUDR（フロクスウリジン）、5-フルオロウラシル（5-FU）、ゲムシタビン（ゲムザール）、ゴセレリン（ゾダレックス）、ハーセプチン（トラスツズマブ）、ヒドロキシ尿素（ハイドレア）、イダルビシン（イダマイシン）、イホスファミド、IL-2（プロロイキン、アルデスロイキン）、インターフェロン・アルファ（イントロンA、ロフェロンA）、イリノテカン（カンプトサール）、ロイプロリド（ルプロン）、レバミソール（エルガミソール）、ロムスチン（CCNU）、メクロルエタミン（マスターゲン、ナイトロジェンマスタード）、メルファラン（アルケラン）、メルカプトプリン（プリネトール、6-MP）、メトトレキセート（メキセート）、マイトマイシンC（ムタムチン）、ミトキサントロン（ノバントロン）、オクトレオチド（サンドスタチン）、ペントスタチン（2-デオキシコホルマイシン、ニペント）、プリカマイシン（ミトラマイシン、ミトラシン）、プロカルバジン（マチュラン）、ストレプトゾシン、タモキシフェン（ノルバデックス）、タキソール（パクリタキセル）、テニポシド（ビュウモン、VM-26）、チオテパ、トポテカン（ハイカムチン）、トレチノイン（ベサノイド、全トランス型レチノイン酸）、ビンブラスチン（バルバン）、ビンクリスチン（オンコビン）およびビノレルビン（ナベルビン）からなる群より選択されるさらなる化学療法剤の投与をさらに含む使用に向けられる。好適には、前記処置は、タキソール、パクリタキセルまたはドセタキセルなどのタキサン類から選択されるさらなる化学療法剤の投与をさらに含む。
言い換えると、本発明はさらに、癌の処置方法であって、本明細書中に定義する化合物または本明細書中に定義するコンジュゲートまたは本明細書中に定義する医薬組成物を、その必要がある患者に投与することを含むと共に、さらなる化学療法剤の投与をさらに含む方法に向けられる。前記さらなる投与は、さらなる化学療法剤が本発明の化合物にコンジュゲートされるか、上記医薬組成物中に存在するか、または別個の製剤として投与されるような形をとり得る。
もう一つの実施形態として、本発明の組成物は、第1核酸にターゲティングされる1以上のアンチセンス化合物、特にオリゴヌクレオチドと、第2核酸標的にターゲティングされる1以上の追加アンチセンス化合物とを含有し得る。2以上の併用化合物は一緒にまたは逐次的に使用することができる。
好ましい実施形態として、本発明は、（a）1以上のアンチセンス化合物と、（b）微小管を安定化するか、微小管の運動を鈍らせ、よって姉妹染色分体の動原体における張力形成を妨げる1以上の他の化学療法剤とを含有する医薬組成物を提供する。そのような化学療法剤には、タキサン類、特にタキソール、パクリタキセルおよびドセタキセルが含まれる。本発明の化合物と共に使用する場合は、オリゴヌクレオチド処置から開始して、その期間中に、腫瘍細胞内および腫瘍脈管構造の増殖内皮細胞内のサバイビンタンパク質レベルを低下させることにより、その後の化学療法剤による同時処置に対する標的細胞の感受性を高めてから、引き続いて上記のような化学療法剤を使用すべきである。
もう一つの好ましい実施形態として、本発明は、（a）1以上のアンチセンス化合物を含有する医薬組成物と、（b）放射線治療とを提供する。本発明の化合物と共に使用する場合は、オリゴヌクレオチド処置から開始して、その期間中に、腫瘍細胞内および腫瘍脈管構造の増殖内皮細胞内のサバイビンタンパク質レベルを低下させることにより、その後の追加放射線治療に対する標的細胞の感受性を高めてから、引き続いて放射線治療を使用すべきである。
投薬は処置すべき疾患状態の重症度および応答性に依存し、処置過程は数日から数ヶ月または治癒が達成されるか疾患状態の減退が達成されるまで継続する。最適な投薬スケジュールは、患者の身体における薬物蓄積量の測定値から計算することができる。最適な投与量は個々のオリゴヌクレオチドの相対効力に依存して変動し得る。
一般にこれは、インビトロモデルおよびインビボ動物モデルで有効であることがわかったEC50に基づいて見積ることができる。一般的には、投与量は体重1kgあたり0.01μg〜1gであり、毎日、毎週、毎月または毎年1回以上投与するか、2〜10年ごとに1回投与するか、または数時間〜数ヶ月間にわたる持続注入によって投与することができる。投与の反復率は、体液または組織における薬物の滞留時間および濃度の測定値に基づいて見積ることができる。処置が成功した後は、疾患状態が再発しないように患者に維持治療を施すことが望ましい場合がある。
本発明のLNA含有オリゴマー化合物は、研究試薬、診断薬、治療薬および予防薬として使用することもできる。研究では、細胞および実験動物におけるサバイビン遺伝子の合成を特異的に阻害し、そうすることによって標的の機能解析または治療的介入の標的としてのその有用性の評価を容易にするために、アンチセンスオリゴヌクレオチドを使用することができる。診断薬の場合は、ノーザンブロット法、インサイチューハイブリダイゼーションまたは同様の技術によって細胞および組織におけるサバイビン発現を検出し定量するために、アンチセンスオリゴヌクレオチドを使用することができる。治療薬の場合は、サバイビンの発現を調整することによって処置することができる疾患または障害を持つと疑われる動物またはヒトを、本発明アンチセンス化合物の投与によって処置する。さらに、サバイビンの発現に関係する疾患または状態を持つか、そのような疾患または状態に陥りやすいと疑われる動物、特にマウスおよびラットならびにヒトを、1以上の本発明アンチセンス化合物または本発明アンチセンス組成物の治療有効量または予防有効量の投与によって処置する方法も提供する。
本発明のさらなる一態様は、アポトーシスを防止または制限する方法であって、本明細書中に定義する化合物、本明細書中に定義するコンジュゲートまたは本明細書中に定義する医薬組成物の投与を含む方法に向けられる。アポトーシスの防止はインビトロでもインビボでもよい。この防止は、細胞アッセイで行うか、組織試料内または生きた哺乳動物内で行うことができる。
本発明の関連する一態様は、細胞増殖を防止する方法であって、本明細書中に定義する化合物、本明細書中に定義するコンジュゲートまたは本明細書中に定義する医薬組成物の投与を含む方法に向けられる。増殖の防止はインビトロでもインビボでもよい。この防止は、細胞アッセイで行うか、組織試料内または生きた哺乳動物内で行うことができる。
以下に実施例を挙げて本発明をさらに例示する。ただしこれらは本発明を限定するものではない。
（実施例１）
モノマー合成
LNAモノマー構成単位およびその誘導体を以下の公表された方法およびそこに引用されている文献に従って製造した。
WO 03/095467 A1
D. S. Pedersen，C. Rosenbohm，T. Koch（2002）「Preparation of LNA Phosphoramidites（LNAホスホロアミダイトの製造）」Synthesis 6，802-808.
M. D. Soerensen，L. Kvarnoe，T. Bryld，A. E. Hakansson，B. Verbeure，G. Gaubert，P. Herdewijn，J. Wengel（2002）「α-L-ribo-configured Locked Nucleic Acid (α-l-LNA): Synthesis and Properties（α-L-ribo型ロックト核酸（α-l-LNA）：合成および性質）」J. Am. Chem. Soc.，124，2164-2176.
S. K. Singh，R. Kumar，J. Wengel（1998）「Synthesis of Novel Bicyclo[2.2.1] Ribonucleosides: 2'-Amino- and 2'-Thio-LNA Monomeric Nucleosides（新規ビシクロ[2.2.1]リボヌクレオシドの合成：2'-アミノ-および2'-チオ-LNAモノマー型ヌクレオシド）」J. Org. Chem. 1998，63，6078-6079.
C. Rosenbohm，S. M. Christensen，M. D. Srensen，D. S. Pedersen，L. E. Larsen，J. Wengel，T. Koch（2003）「Synthesis of 2'-amino-LNA: a new strategy（2'-アミノ-LNAの合成：新しい戦略）」Org. Biomol. Chem. 1，655-663.
を参照されたい。
2'-チオ-LNAリボチミジンホスホロアミダイトの合成：試薬および条件：i）Pd/C、H2、アセトン、MeOH；ii）BzCl、ピリジン、DMF；iii）0.25M H2SO4（水溶液）、DMF、80℃（4から79％；3段階）、iv）Tf2O、DMAP、CH2Cl2、0℃；v）Na2S、DMF（7から72％；2段階）；vi）NaOBz、DMF、100℃（81％）；vii）NH3、MeOH（76％）；viii）DMT-Cl、ピリジン（88％）；ix）P(OCH2CH2CN)(N(iPr)2)2、4,5-ジシアノイミダゾール、CH2Cl2（99％）。DMT＝4,4'-ジメトキシトリチル、PN2＝2-シアノエトキシ(ジイソプロピルアミノ)ホスフィノイル。
1-(3-O-ベンゾイル-5-O-メタンスルホニル-4-C-メタンスルホニルオキシメチル-β-D-トレオ-ペントフラノシル)チミン（7、図4）
無水ヌクレオシド4（C. Rosenbohm，S. M. Christensen，M. D. Soerensen，D. S. Pedersen，L. E. Larsen，J. Wengel，T. Koch（2003）「Synthesis of 2'-amino-LNA: a new strategy（2'-アミノ-LNAの合成：新しい戦略）」Org. Biomol. Chem. 1，655-663）（30.0g，58.1mmol）を、メタノール（1000cm3）とアセトン（1000cm3）の混合液中で、透明な溶液が得られるまで70℃に加熱し、その溶液を室温にした。反応フラスコをアルゴンでフラッシュし、Pd/C（10重量％Pd/炭素、6.2g、5.8mmol）を加えた。その混合物を水素ガス雰囲気（風船）下で激しく撹拌した。23時間後に、そのスラリーをセライトのパッド越しに濾過した。触媒をセライトから除去し、DMF（1000cm3）中で1時間還流した。その熱DMFスラリーをセライトのパット越しに濾過し、有機層を合わせ、減圧下でエバポレートすることにより、ヌクレオチド5を黄色粉末として得た。残留溶媒を高真空ポンプで一晩除去した。
粗製ヌクレオシド5（23g）をDMF（300cm3）中で70℃に加熱することにより透明な黄色溶液を得て、これを室温まで冷ました。塩化ベンゾイル（81.7g、581mmol、67.4cm3）を加え、次にピリジン（70cm3）を加えた。18時間後に、メタノール（200cm3）で反応をクエンチし、過剰のメタノールを減圧下で除去した。ヌクレオシド6の暗褐色溶液に、H2SO4水溶液（0.25M、400cm3）を加えた。その溶液を油浴で80℃に加熱した（約50℃で沈殿が起こる。溶液は80℃で再び透明になる）。80℃で22時間後、溶液を室温まで冷ました。反応混合物を酢酸エチル（1000cm3）と共に分液漏斗に移した。有機層を飽和NaHCO3水溶液（1000cm3×2）で洗浄した。合わせた水層を酢酸エチル（1000＋500cm3）で抽出した。有機層を合わせ、飽和NaHCO3水溶液（1000cm3）で洗浄し、乾燥（Na2SO4）し、濾過し、減圧下でエバポレートすることにより、黄色液体を得た。残留溶媒を高真空ポンプで一晩除去することにより、黄色シロップを得た。生成物を乾燥カラム減圧クロマトグラフィー（Dry Column Vacuum Chromatography）（内径10cm；分画サイズ100cm3；50〜100％EtOAｃ/n-ヘプタン（v/v）−増加幅10％；2〜24％MeOH/EtOAｃ（v/v）−増加幅2％）で精製した。生成物含有画分を合わせ、減圧下でエバポレートすることにより、ヌクレオシド7（25.1g、79％）を白色泡状物として得た。
Rf＝0.54（5％MeOH/EtOAc，v/v）；
ESI-MS m/z 実測値549.0（[MH]+，計算値549.1）；
1H NMR（DMSO-d6）δ11.39（br s，1H，NH），8.10-8.08（m，2H，Ph），7.74-7.70（m，1H，Ph），7.60-7.56（m，2H，Ph），7.51（d，J＝1.1Hz，1H，H6），6.35（d，J＝4.9Hz，1H，H1'），6.32（d，J＝5.3Hz，1H，2'-OH），5.61（d，J＝4.0Hz，1H，H3'），4.69（d，J＝10.8Hz，1H），4.59（m，1H，H2'），4.55（d，J＝10.8Hz，1H），4.52（d，J＝10.8Hz，1H），4.46（d，J＝10.6Hz，1H)（H5'およびH1''），3.28（s，3H，Ms），3.23（s，3H，Ms），1.81（s，3H，CH3）；
13C NMR（DMSO-d6）δ164.5，163.6（C4，PhC(O)），150.3（C2），137.7（C6），133.8，129.6，128.7，128.6（Ph），108.1（C5），84.8（C1'），81.1（C4'），78.0（C3'），73.2（C2'），68.0，67.1（C5'，C1''），36.7，36.6（Ms×2），11.9（CH3）；
元素分析計算値（C20H24N2O12S2・0.33H2Oとして、％）：C，44.34；H，4.65；N，4.85．実測値：C，44.32；H，4.58；N，4.77。
（1R,3R,4R,7R)-7-ベンゾイルオキシ-1-メタンスルホニルオキシメチル-3-(チミン-1-イル)-2-オキサ-5-チアビシクロ[2.2.1]ヘプタン（9）
1-(3-O-ベンゾイル-5-O-メタンスルホニル-4-C-メタンスルホニルオキシメチル-β-D-トレオ-ペントフラノシル)チミン（7）（10.00g、18.23 mmol）をジクロロメタン（500cm3）に溶解し、0℃に冷却した。ピリジン（15cm3）およびDMAP（8.91g、72.9mmol）を加えた後、トリフルオロメタンスルホン酸無水物（10.30g、36.5mmol、6.0cm3）を滴下した。1時間後に、飽和NaHCO3水溶液（500cm3）で反応をクエンチし、分液漏斗に移した。有機層を1.0M HCl水溶液（500cm3）、飽和NaHCO3水溶液（500cm3）および食塩水（500cm3）で洗浄した。有機層をトルエン（100cm3）と共に減圧下でエバポレートすることにより、1-(3-O-ベンゾイル-5-O-メタンスルホニル-4-C-メタンスルホニルオキシメチル-2-O-トリフルオロメタンスルホニル-β-D-トレオ-ペントフラノシル)チミン（8）を黄色粉末として得た。粗製ヌクレオシド（8）をDMF（250cm3）に溶解し、Na2S（1.57g、20.1mmol）を加えたところ、暗緑色スラリーを得た。3時間後に反応を半飽和NaHCl3水溶液（500cm3）でクエンチし、ジクロロメタン（500＋250cm3×2）で抽出した。合わせた有機層を食塩水（500cm3）で洗浄し、乾燥（Na2SO4）し、濾過し、減圧下で濃縮することにより、黄色液体を得た。残留溶媒を高真空ポンプで一晩除去することにより黄色ゴム質を得て、これを乾燥カラム減圧クロマトグラフィー（内径6cm：分画サイズ50cm3；50〜100％EtOAc/n-ヘプタン（v/v）-増加幅(increment)10％；2〜20％MeOH/EtOAc−増加幅2％）で精製することにより、ヌクレオシド9（6.15g、72％）を黄色泡状物として得た。
Rf＝0.27（20％n-ヘプタン/EtOAc，v/v）；
ESI-MS m/z 実測値469.0（[MH]+，計算値469.1）；
1H NMR（CDCl3）δ8.70（br s，1H，NH），8.01-7.99（m，2H，Ph），7.67（d，J＝1.1Hz，1H，H6），7.65-7.61（m，1H，Ph），7.50-7.46（m，2H，Ph），5.98（s，1H，H1'），5.34（d，J＝2.4Hz，1H，H3'），4.66（d，J＝11.7Hz，1H，H5'a），4.53（d，J＝11.5Hz，1H，H5'b），4.12（m（残留EtOAcとオーバーラップ），1H，H2'），3.15-3.13（m，4H，H1''aおよびMs），3.06（d，J＝10.6Hz，1H，H1''b），1.98（d，J＝1.1Hz，3H，CH3）；
13C NMR（CDCl3）δ165.2，163.5（C4，PhC(O)），149.9（C2），134.1，133.9，129.8，128.7，128.3（C6，Ph），110.7（C5），91.1（C1'），86.8（C4'），72.6（C3'），65.8（C5'），50.5（C2'），37.9（Ms），35.1（C1''），12.5（CH3）；
元素分析計算値（C19H20N2O8S2・0.33EtOAcとして、％）：C，49.21；H，4.72；N，5.47．実測値：C，49.25；H，4.64；N，5.48。
(1R,3R,4R,7R)-7-ベンゾイルオキシ-1-ベンゾイルオキシメチル-3-(チミン-1-イル)-2-オキサ-5-チアビシクロ[2.2.1]ヘプタン（10）
ヌクレオシド9（1.92g、4.1mmol）をDMF（110cm3）に溶解した。安息香酸ナトリウム（1.2g、8.2mmol）を加え、その混合物を24時間100℃に加熱した。反応混合物を半飽和食塩水（200cm3）と共に分液漏斗に移し、酢酸エチル（100cm3×3）で抽出した。合わせた有機層を乾燥（Na2SO4）し、濾過し、減圧下でエバポレートすることにより、褐色の液体を得た。生成物を高真空ポンプにかけて、残留溶媒を除去した。得られた褐色ゴム質を乾燥カラム減圧クロマトグラフィー（内径4cm；分画サイズ50cm3；0〜100％EtOAc/n-ヘプタン（v/v）−増加幅10％；2〜10％MeOH/EtOAc（v/v）−増加幅2％）で精製することにより、ヌクレオシド10（1.64g、81％）をわずかに黄色い泡状物として得た。
Rf＝0.57（20％n-ヘプタン/EtOAc，v/v）；
ESI-MS m/z 実測値 495.1（[MH]+，計算値495.1）；
1H NMR（CDCl3）δ9.02（br s，1H，NH），8.07-7.99（m，4H，Ph），7.62-7.58（m，2H，Ph），7.47-7.42（m，5H，PhおよびH6），5.95（s，1H，H1'），5.46（d，J＝2.2Hz，1H，H3'），4.93（d，J＝12.8Hz，1H，H5'a），4.60（d，J＝12.8Hz，1H，H5'b），4.17（d，J＝2.2Hz，1H，H2'），3.27（d，J＝10.6Hz，1H，H1''a），3.16（d，J＝10.6Hz，1H，H1''b），1.55（d，J＝1.1Hz，3H，CH3）；
13C NMR（CDCl3）δ165.8，165.1，163.7（C4，PhC(O)×2），150.0（C2），133.9，133.7，133.6，129.8，129.6，129.0，128.8，128.6，128.5（C6，2×Ph），110.3（C5），91.3（C1'），87.5（C4'），72.9（C3'），61.3（C5'），50.6（C2'），35.6（C1''），12.3（CH3）；
元素分析計算値（C25H22N2O7Sとして、％）：C，60.72；H，4.48；N，5.66．実測値：C，60.34；H，4.49；N，5.35。
(1R,3R,4R,7R)-7-ヒドロキシ-1-ヒドロキシメチル-3-(チミン-1-イル)-2-オキサ-5-チアビシクロ[2.2.1]ヘプタン（11）
アンモニアを飽和させたメタノール（50cm3）にヌクレオシド10（1.50g、3.0mmol）を溶解した。反応フラスコを密封し、周囲温度で20時間撹拌した。反応混合物を減圧下で濃縮することにより黄色ゴム質を得て、これを乾燥カラム減圧クロマトグラフィー（内径4cm；分画サイズ50cm3；0〜16％MeOH/EtOAc（v/v）−増加幅1％）で精製することにより、ヌクレオシド11（0.65g、76％）を透明な針状物として得た。
Rf＝0.31（10％ MeOH/EtOAc，v/v）；
ESI-MS m/z 実測値287.1（[MH]+，計算値287.1）；
1H NMR（DMSO-d6）δ11.32（br s，1H，NH），7.96（d，J＝1.1Hz，1H，H6），5.95（s，1H，H6），5.70（d，J＝4.2Hz，1H，3'-OH），5.62（s，1H，H1'），4.49（t，J＝5.3Hz，1H，5'-OH），4.20（dd，J＝4.1および2.1Hz，1H，H3'），3.77-3.67（m，2H，H5'），3.42（d，J＝2.0Hz，1H，H2'），2.83（d，J＝10.1Hz，1H，H1''a），2.64（d，J＝10.1Hz，1H，H1''b），1.75（d，J＝1.1Hz，3H，CH3）；
13C NMR（DMSO-d6）δ 163.8（C4），150.0（C2），135.3（C6），107.5（C5），90.2，89.6（C1'およびC4'），69.4（C3'），58.0（C5'），52.1（C2'），34.6（C1''），12.4（CH3）；
元素分析計算値（C11H14N2O5Sとして、％）：C，46.15；H，4.93；N，9.78．実測値C，46.35；H，4.91；N，9.54。
(1R,3R,4R,7R)-1-(4,4'-ジメトキシトリチルオキシメチル)-7-ヒドロキシ-5-メチル-3-(チミン-1-イル)-2-オキサ-5-チアビシクロ[2.2.1]ヘプタン（12）
ヌクレオシド11（0.60g、2.1mmol）をピリジン（10cm3）に溶解した。塩化4,4'-ジメトキシトリチル（0.88g、2.6mmol）を加え、反応を周囲温度で3時間撹拌した。反応混合物を水（100cm3）と共に分液漏斗に移し、酢酸エチル（100＋50cm3×2）で抽出した。合わせた有機層を飽和NaHCO3（100cm3）、食塩水（100cm3）で洗浄し、減圧下で蒸発乾固することにより、粘性黄色液体を得た。生成物をトルエン（50cm3）に再溶解し、減圧下で濃縮することにより、黄色泡状物を得た。その泡状物を高真空ポンプで一晩乾燥し、乾燥カラム減圧クロマトグラフィー（内径4cm；分画サイズ50cm3；10〜100％EtOAc/n-ヘプタン（v/v）−増加幅10％）で精製することにより、ヌクレオシド12（1.08g、88％）を白色泡状物として得た。
Rf＝0.24（20％n-ヘプタン/EtOAc，v/v）；
ESI-MS m/z 実測値587.1（[M-H]+，計算値587.2）；
1H NMR（CDCl3）δ8.96（br s，1H，NH），7.74（d，J＝1.1Hz，1H，H6），7.46-7.44（m，2H，Ph），7.35-7.22（m，9H，Ph），7.19-7.15（m，2H，Ph），6.86-6.80（m，2H，Ph），5.82（s，1H，H1'），4.55（dd，J＝9.3および2.1Hz，1H，H3'），3.79（s，6H，OCH3），3.71（d，J＝2.0Hz，1H，H2'），3.50（s，2H，H5'），2.81（d，J＝10.8Hz，1H，H1''a），2.77（d，J＝10.8Hz，1H，H1''b），2.69（d，J＝9.2Hz，1H，3'-OH），1.42（s，3H，CH3）；
13C NMR（CDCl3）δ158.7（C4），150.1（C2），144.1，135.2，135.1，130.1，129.1，128.1，128.0，127.1，127.0，113.3（C6，2×Ph），110.0（C5），90.2（C(Ph)3），89.6（C1'），87.0（C4'），71.7（C3'），60.9（C5'），55.2（C2'），34.7（C1''），12.2（CH3）；
元素分析計算値（C32H32N2O7S・0.5H2Oとして、％）：C，64.31；H，5.57；N，4.69．実測値：C，64.22；H，5.67；N，4.47。
(1R,3R,4R,7R)-7-(2-シアノエトキシ(ジイソプロピルアミノ)ホスフィノキシ)-1-(4,4'-ジメトキシトリチルオキシメチル)-3-(チミン-1-イル)-2-オキサ-5-チアビシクロ[2.2.1]ヘプタン（13）
公表された方法（D. S. Pedersen，C. Rosenbohm，T. Koch（2002）「Preparation of LNA Phosphoramidites（LNAホスホロアミダイトの製造）」Synthesis，6，802-808）に従って、ヌクレオシド12（0.78g，1.33mmol）をジクロロメタン（5cm3）に溶解し、4,5-ジシアノイミダゾールの1.0Mアセトニトリル溶液（0.93cm3、0.93mmol）を加え、次に、2-シアノエチル-N,N,N',N'-テトライソプロピルホスホロジアミダイト（0.44cm3、1.33mmol）を滴下した。2時間後に反応液をジクロロメタン（40cm3）と共に分液漏斗に移し、飽和NaHCO3水溶液（25cm3×2）および食塩水（25cm3）で洗浄した。有機層を乾燥（Na2SO4）し、濾過し、減圧下でエバポレートすることにより、ヌクレオシド13（1.04g、99％）を白色泡状物として得た。Rf＝0.29および0.37−2つのジアステレオ異性体（20％n-ヘプタン/EtOAc，v/v）；ESI-MS m/z 実測値789.3（[MH]+，計算値789.3）；31P NMR（DMSO-d6）δ150.39，150.26。
（実施例２）
オリゴヌクレオチド合成
Expedite 8900/MOSS合成装置（Multiple Oligonucleotide Synthesis System）でホスホロアミダイト法を使用して、1μmolまたは15μmol量のオリゴヌクレオチドを合成した。合成（DMT-オン）が終了したら、アンモニア水を使って室温で1時間かけてオリゴヌクレオチドを固体支持体から切り離し、さらに65℃で3時間脱保護した。オリゴヌクレオチドを逆相HPLC（RP-HPLC）で精製した。DMT基の除去後に、オリゴヌクレオチドをIE-HPLCまたはRP-HPLCによって特徴づけた。オリゴヌクレオチドの正体はESI-MSによって確認した。詳細は下記参照。
LNAスクシニルヘミエステルの製造
5'-O-Dmt-3'-ヒドロキシ-LNAモノマー（500mg）、無水コハク酸（1.2当量）およびDMAP（1.2当量）をDCM（35mL）に溶解した。反応液を室温で一晩撹拌した。NaH2PO4 0.1M pH5.5（2回）および食塩水（1回）で抽出した後、さらに無水Na2SO4で有機層を乾燥し、濾過し、エバポレートした。ヘミエステル誘導体を95％の収率で得て、これをさらに精製することなく使用した。
LNA-支持体の製造
上で製造したヘミエステル誘導体（90μmol）を最少量のDMFに溶解し、DIEAおよびpyBOP（90μmol）を加え、1分間混合した。このプレ活性化混合物を手動合成装置でLCAA-CPG（500Å、80〜120メッシュサイズ、300mg）と混合し、撹拌した。室温で1.5時間後に、支持体を濾去し、DMF、DCMおよびMeOHで洗浄した。乾燥後に負荷量は57μmol/gと決定された（F. Eckstein編「Oligonucleotides and Analogues A Practical Approach」（Oxford:IRL Press，1991）の13〜14頁、Tom Brown，Dorcas J. S. Brown著「Modern machine-aided methods of oligodeoxyribonucleotide synthesis（最新のオリゴデオキシリボヌクレオチド機械合成法）」参照）。
オリゴヌクレオチドの伸長
ホスホロアミダイト（A(bz)、G(ibu)、5-メチル-C(bz)またはT-β-シアノエチル-ホスホロアミダイト）のカップリングは、5'-O-DMT保護アミダイトの0.1Mアセトニトリル溶液と、活性化剤としてアセトニトリル中のDCI（4.5-ジシアノイミダゾール）（0.25M）とを使って行う。チオール化は、塩化キサンタン（xanthan chloride）（アセトニトリル：ピリジン10％中0.01M）を使って行う。残りの試薬はオリゴヌクレオチド合成に典型的に使用されるものである。RP-HPLCによる精製：
カラム：XTerra，RP18，5μm，7.8×50mmカラム
溶離液：
溶離液A：0.1M NH40Ac，pH:10
溶離液B：アセトニトリル
流速：5ml/分
勾配：
Figure 2007523601
IE-HPLCによる分析
カラム：Dionex，DNAPac PA-100，2×250mmカラム
溶離液：
溶離液A：20mMトリス-HCl，pH7.6；1mM EDTA；10mM NaClO4
溶離液B：20mMトリス-HCl，pH7.6；1mM EDTA；1M NaClO4
流速：0.25ml/分
勾配：
Figure 2007523601
略号
DMT：ジメトキシトリチル
DCI：4,5-ジシアノイミダゾール
DMAP：4-ジメチルアミノピリジン
DCM：ジクロロメタン
DMF：ジメチルホルムアミド
THF：テトラヒドロフラン
DIEA：N,N-ジイソプロピルエチルアミン
PyBOP：ベンゾトリアゾール-1-イル-オキシ-トリス-ピロリジノ-ホスホニウム-ヘキサフルオロホスフェート
Bz：ベンゾイル
Ibu：イソブチリル。
（実施例３）
オリゴマー化合物のデザインの試験
我々の関心は、サバイビンを標的とするオリゴヌクレオチドの最適なデザインを選択することの重要性を明らかにするために、様々なデザインを持つオリゴヌクレオチドのアンチセンス活性を評価することにあった。そのために我々は、アンチセンスオリゴヌクレオチドによるダウンレギュレーション後にホタル（Photinus pyralis）ルシフェラーゼの活性を測定することによって数多くの異なるオリゴヌクレオチドデザインのスクリーニングが可能になるようなインビトロアッセイを設定した。図1には本文で述べるデザインの大半が図解されている。最初のスクリーニングでは、β-D-オキシ-LNA含有デザインであって、いずれもmRNAの同じモチーフを標的にしているものを評価した。異なるギャップサイズと、異なるホスホロチオエートヌクレオシド間連結部負荷と、異なるLNA負荷とを持つギャップマーからなるデザインを試験した。異なるβ-D-オキシ-LNA負荷と、異なるホスホロチオエートヌクレオシド間連結部負荷と、異なるDNA負荷とを持つヘッドマーおよびテイルマーを製造した。様々な組成を持つミックスマー（これは交互に現われる数単位のβ-D-オキシ-LNA、α-L-LNAおよびDNAを持つことを意味する）もインビトロアッセイで解析した。さらに、LNA誘導体も様々なデザインに含めて、それらのアンチセンス活性を評価した。良いデザインの重要性は、ルシフェラーゼ活性で得ることができるデータに反映される。ルシフェラーゼ発現レベルは％として測定され、β-D-オキシ-LNAおよびLNA誘導体を含有する様々なデザインのアンチセンス活性の指標になる。一部のデザインが強力なアンチセンスオリゴヌクレオチドであるのに対して、他のデザインではダウンレギュレーションレベルが中ぐらい〜低いことは、容易に分かる。したがって、良いアンチセンス活性と最適なオリゴヌクレオチドデザインとの密接な相関関係は極めて明白である。我々は、様々なデザインで良好なダウンレギュレーションレベルを認めた。7〜10nt DNAのギャップを持ち、主鎖全体がチオール化されているか、ギャップ内に限ってチオール化されていて隣接部分にはPOを持つギャップマーは、良い結果を示した。これらのデザインはβ-D-オキシ-LNAまたはLNA誘導体を含有する。6ntおよび8ntβ-D-オキシ-LNAのヘッドマーも、ホスホロチオエートヌクレオシド間連結部が主鎖全体にわたるか、DNAセグメント部分だけにある場合は、良好なダウンレギュレーションレベルを示した。ルシフェラーゼアッセイでは様々なミックスマーが良好なアンチセンス活性を与えた。交互に現われる各α-L-オキシ-LNA、β-D-オキシ-LNAまたはDNA組成の単位数がミックスマーを定義する。図1参照。3'末端にデオキシヌクレオチド残基を持つミックスマー3-9-3-1は、かなりのダウンレギュレーションレベルを示した。ミックスマー4-1-1-5-1-1-3では、ギャップを中断する2つのα-L-オキシ-LNA残基を置き、隣接部分はβ-D-オキシ-LNAとした。さらにまた、2つのα-L-オキシ-LNA残基でギャップを中断し、両隣接部分をα-L-オキシ-LNAで置換した。どちらのデザインもかなりのダウンレギュレーションレベルを示した。α-L-オキシ-LNAの存在は、デオキシリボヌクレオチド残基中のスパイキングにより、ノース（North）型固定隣接部分（オキシ-LNA）とα-L-オキシ-LNAの間の柔軟な移行をもたらすのかもしれない。α-L-オキシ-LNA残基がDNAストレッチを中断しているデザイン4-3-1-3-5を調べることも興味深い。我々は、ギャップ中のα-L-オキシ-LNAに加えて、隣接部分の縁部にある2つのオキシ-LNAも2つのα-L-オキシ-LNA残基で置換した。ギャップ中のDNAストレッチを中断するβ-D-オキシ-LNA残基が一つだけ存在すると（デザイン4-3-1-3-5）、劇的なダウンレギュレーションの喪失が起こる。α-L-オキシ-LNAを代わりに使用するだけで、このデザインは50nMのオリゴヌクレオチド濃度で、著しいダウンレギュレーションを示す。接合部分にα-L-オキシ-LNAを置き、ギャップの中央に1つのα-L-オキシ-LNAを置いた場合も、ダウンレギュレーションを示した。α-L-オキシ-LNAは、高レベルのアンチセンス活性を示すことができる様々なミックスマーの構築を可能にする強力なツールであることがわかる。他のミックスマー、例えば4-1-5-1-5および3-3-3-3-3-1なども製造することができる。一部のデザインが強力なアンチセンスオリゴヌクレオチドであるのに対して、他のデザインではダウンレギュレーションレベルが中ぐらい〜低いことは、容易に分かる。したがって、ここでも、良いアンチセンス活性と最適なオリゴヌクレオチドデザインとの密接な相関関係は極めて明白である。他の好ましいデザインは、DNA残基がギャップの両側にある3つのβ-D-オキシ-LNAモノマーと共に隣接部分に位置している（1-3-8-3-1）である。さらにもう一つの好ましいデザインは、D-オキシ-LNA隣接部分と9ギャップとを持つと共に3'末端にDNAを持つ（4-9-3-1）である。
アッセイ
「tet-off」ルシフェラーゼ系が安定にトランスフェクトされたX1/5Hela細胞株（ECACC整理番号95051229）を使用した。テトラサイクリンの不在下ではルシフェラーゼ遺伝子が構成的に発現する。ルシフェラーゼ基質ルシフェリンを添加すると、発現を照度計で光として測定することができる。X1/5Hela細胞株は、1×非必須アミノ酸（Sigma M7145）、1×グルタマックス（Glutamax）I（Invitrogen 35050-038）、10％FBS仔ウシ血清、25μg/mlゲンタマイシン（Sigma G1397）、500μg/ml G418（Invitrogen 10131-027）および300μg/mlハイグロマイシンB（Invitrogen 10687-010）を補足した必須培地イーグル（Sigma M2279）で生育させた。トランスフェクションの前日に、X1/5Hela細胞を1ウェルあたり8000細胞の密度で白色96穴プレート（Nunc 136101）に播種した。トランスフェクションの前に、細胞をOptiMEM（Invitrogen）で1回洗浄し、次に2μg/mlのリポフェクトアミン2000（Invitrogen）を含むOptiMEM 40μlを加えた。細胞を7分間インキュベートしてからオリゴヌクレオチドを添加した。10μlのオリゴヌクレオチド溶液を加え、細胞を37℃および5％CO2で4時間インキュベートした。この4時間のインキュベーション後に、細胞をOptiMEMで1回洗浄し、成長培地を加えた（100μl）。翌日、ルシフェラーゼ発現を測定した。ルシフェラーゼ発現は、PromegaのSteady-Gloルシフェラーゼアッセイシステムを使って測定した。100μlのSteady-Glo試薬を各ウェルに加え、プレートを700rpmで30秒間浸透した。細胞の全溶解を完了させるために8分間インキュベートしてから、ThermoLabsystemsのLuminoskan Ascent装置でプレートを読み取った。ルシフェラーゼ発現は、1秒あたりの相対発光強度（Relative Light Units per seconds：RLU/s）として測定される。Ascentソフトウェア（v2.6）でデータを処理し、SigmaPlot2001でグラフを描いた。
（実施例４）
インビトロモデル：細胞培養
標的核酸発現に対するアンチセンス化合物の影響は、標的核酸が測定可能なレベルで存在するのであれば、様々な細胞タイプのいずれでも試験することができる。標的は内因性に発現するものであってもよいし、前記核酸をコードする核酸の一過性トランスフェクションもしくは安定トランスフェクションによって発現させることもできる。標的核酸の発現レベルは、常法により、例えばノーザンブロット解析、リアルタイムPCR、リボヌクレアーゼ保護アッセイなどを使って決定することができる。例示のために以下の細胞タイプを挙げるが、選択した細胞タイプ中で標的が発現するのであれば、他の細胞タイプも型どおりに使用することができる。
後述する適当な培地で細胞を培養し、湿度95〜98％、5％CO2で37℃に保った。細胞は通常どおり週に2〜3回継代した。
15PC3：ヒト前立腺癌細胞株15PC3はオランダAMC Neurozintuigen LaboratoryのF.Baas博士の厚意により提供され、DMEM（Sigma）＋10％ウシ胎仔血清（FBS）＋グルタマックスI＋ゲンタマイシンで培養した。
A549：ヒト非小細胞肺癌細胞株A549はATCC（マナッサス）から購入し、DMEM（Sigma）＋10％FBS＋グルタマックスI＋ゲンタマイシンで培養した。
MCF7：ヒト乳癌細胞株MCF7はATCCから購入し、イーグルMEM（Sigma）＋10％FBS＋グルタマックスI＋ゲンタマイシンで培養した。
SW480：ヒト結腸癌細胞株SW480はATCCから購入し、L-15リーボビッツ（Sigma）＋10％FBS＋グルタマックスI＋ゲンタマイシンで培養した。
SW620：ヒト結腸癌細胞株SW620はATCCから購入し、L-15リーボビッツ（Sigma）＋10％FBS＋グルタマックスI＋ゲンタマイシンで培養した。
HT29：ヒト前立腺癌細胞株HT29はATCCから購入し、マッコイの5aMM（Sigma）＋10％FBS＋グルタマックスI＋ゲンタマイシンで培養した。
NCI H23：このヒト非小細胞肺癌細胞株はATCCから購入し、GlutamaxIを含むRPMI1640（Gibco）＋10％FBS＋HEPES＋ゲンタマイシンで培養した。
HCT-116：ヒト結腸癌細胞株HCT-116はATCCから購入し、マッコイの5aMM＋10％FBS＋グルタマックスI＋ゲンタマイシンで培養した。
MDA-MB-231：ヒト乳癌細胞株MDA-MB-231はATCCから購入し、L-15リーボビッツ＋10％FBS＋グルタマックスI＋ゲンタマイシンで培養した。
MDA-MB-435s：ヒト乳癌細胞株MDA-MB-435sはATCCから購入し、L-15リーボビッツ＋10％FBS＋グルタマックスI＋ゲンタマイシンで培養した。
DMS273：ヒト小細胞肺癌細胞株DMS273はATCCから購入し、＋10％FBS＋グルタマックス＋ゲンタマイシンで培養した。
PC3：ヒト前立腺癌細胞株PC3はATCCから購入し、グルタミンを含むF12クーン（Coon's）培地（Gibco）＋10％FBS＋ゲンタマイシンで培養した。
U373：ヒト膠芽腫星状細胞腫癌細胞株U373をECACCから購入し、EMEM＋10％FBS＋グルタマックス＋NEAA＋ピルビン酸ナトリウム＋ゲンタマイシンで培養した。
HeLa Sur-GFP：Wheately,S.P.ら，Curr. Biol. 11 446-490，2001。
HUVEC-C ヒト臍静脈内皮細胞はATCCから購入し、製造者の指示に従って増殖させた。
HMVEC-d（DMVEC−皮膚ヒト微小血管内皮細胞）はCloneticsから購入し、製造者の指示どおりに培養した。
HMVEC ヒト微小血管内皮細胞をCloneticsから購入し、製造者が述べるとおりに培養した。
ヒト胎児肺線維芽細胞はATCCから購入し、製造者の指示どおりに培養した。
HMEC-1 ヒト***上皮細胞はCloneticsから購入し、製造者の推奨どおりに維持した。
（実施例５）
インビトロモデル：アンチセンスオリゴヌクレオチドによる処理
陽イオンリポソーム製剤リポフェクトアミン（LipofectAMINE）2000（Gibco）を使って細胞をオリゴヌクレオチドで処理した。細胞を12穴細胞培養プレート（NUNC）に播種し、80〜90％コンフルエントに達した時に処理を行った。使用したオリゴ濃度は最終濃度125nM〜0.2nNの範囲だった。オリゴ-脂質複合体の形成は、500μlの総体積中、無血清OptiMEM（Gibco）と10μg/mlのリポフェクトアミン2000の最終脂質濃度とを使って、基本的にDeanら（Journal of Biological Chemistry 1994，269，16416-16424）に記載されているように行った。細胞を37℃で4時間インキュベートし、オリゴ含有培養培地の除去によって処理を停止した。細胞を洗浄し、血清含有培地を加えた。オリゴ処理の後、細胞を18時間回復させてから、RNA解析またはタンパク質解析のために収集した。
（実施例６）
インビトロモデル：RNAの抽出およびcDNA合成
全RNA単離
全RNAは、RNeasyミニキット（Qiagenカタログ番号74104）またはトリゾール（Trizol）試薬（Life technologiesカタログ番号15596）を使って単離した。細胞株からのRNA単離には、RNeasyが好ましい方法であり、組織試料からのRNA単離には、トリゾールが好ましい方法である。
Qiagen RNA OPFロボット−BIO Robot 3000を使用し、製造者によって提供されたプロトコールに従って、細胞株から全RNAを単離した。組織試料はUltra Turrax T8ホモジナイザー（IKA Analysen technik）を使ってホモジナイズし、製造者によって提供されたトリゾール試薬プロトコールを使って、全RNAを単離した。
第1鎖合成
第1鎖合成はOmniScript逆転写酵素キット（カタログ番号205113、Qiagen）を使用し、製造者の指示に従って行った。各試料につき0.5μgの全RNAをそれぞれ12μlになるようにRNaseフリーH2Oを使って調節し、ポリ(dT)12-18（2.5μg/ml）（Life Technologies，GibcoBRL，デンマーク・ロスキレ）2μl、dNTPミックス（5mMの各dNTP）2μl、10×バッファーRT 2μl、RNAguard(商標)Rnaseインヒビター（33.3U/ml）（カタログ番号27-0816-01、Amersham Pharmacia Biotech、デンマーク・ホシュロム）1μlおよびOmniScript逆転写酵素（4U/μl）1μlと混合した後、37℃で60分間インキュベートし、酵素の熱不活化を93℃で5分間行った。
（実施例７）
インビトロモデル：リアルタイムPCRによるサバイビン発現のオリゴヌクレオチド阻害の解析
サバイビン発現のアンチセンス調整は、当技術分野で知られる様々な方法でアッセイすることができる。例えばサバイビンmRNAレベルは、ノーザンブロット解析、競合ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）またはリアルタイムPCRなどによって定量することができる。現時点ではリアルタイム定量PCRが好ましい。RNA解析は全細胞RNAまたはmRNAで行うことができる。
ノーザンブロット解析などのRNA単離方法およびRNA解析方法は当技術分野では常法であり、例えば「Current Protocols in Molecular Biology」（John Wiley and Sons）などに教示されている。
リアルタイム定量（PCR）は、BioRADから市販されているiQマルチカラーリアルタイムPCR検出システムを使って便利に行うことができる。
サバイビンmRNAレベルのリアルタイム定量PCR解析
iQマルチカラーリアルタイムPCR検出システム（BioRAD）を使用し、製造者の指示に従って、リアルタイム定量PCRにより、mRNAレベルを定量した。リアルタイム定量PCRは当技術分野では周知の技術であり、例えばHeidら「Real time quantitative PCR（リアルタイム定量PCR）」Genome Research（1996），6:986-994などに教示されている。
Invitorogenカタログ番号11730からプラチナ定量PCRスーパーミックスUDG2×PCRマスターミックスを得た。プライマーおよびTaqMan(登録商標)プローブはMWG-Biotech AG（ドイツ・エーバースベルク）から入手した。
ヒトサバイビンに対するプローブおよびプライマーは、公表された配列情報（配列番号1として本明細書に組み込まれるGenBankアクセッション番号NM001168）を使って、ヒトサバイビン配列にハイブリダイズするように設計した。
ヒトサバイビン用のPCRプライマーは、アッセイ1では、
フォワードプライマー：5'caggtccccgctttctttg 3'（アッセイにおける最終濃度；0.6μM）、
リバースプライマー：5'ggaggagggcgaatcaaa 3'（アッセイにおける最終濃度；0.6μM）とし、PCRプローブは5'FAM-ccatcatcttacgccagacttcagcc-TAMRA 3'（アッセイにおける最終濃度；0.1μM）とした。
アッセイ2では、
フォワードプライマー：5'aaggaccaccgcatctctaca 3'（アッセイにおける最終濃度；0.9μM）、
リバースプライマー：5'ccaagtctggctcgttctcagt 3'（アッセイにおける最終濃度；0.6μM）とし、PCRプローブは5'FAM-cgaggctggcttcatccactgcc-TAMRA 3'（アッセイにおける最終濃度；0.1μM）とした。
試料調製物のばらつきを規格化するために、グルタルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ（GAPDH）mRNA量を、内部対照として使用した。
試料のヒトGAPDH mRNA含量は、ヒトGAPDH Prism Pre-Developed TaqManアッセイ試薬（Applied Biosystemsカタログ番号4310884E）を使用し、製造者の指示に従って定量した。
マウスGAPDH mRNAを定量するために以下のプライマーおよびプローブを設計した：センスプライマー5'aaggctgtgggcaaggtcatc 3'（最終濃度0.3μM）、アンチセンスプライマー5'gtcagatccacgacggacacatt（最終濃度0.6μM）、TaqManプローブ5'FAM-gaagctcactggcatggcatggccttccgtgttc-TAMRA 3'（最終濃度0.2μM）。
リアルタイムPCR
実施例6で述べたように行われる第1鎖合成から得たcDNAを2〜20倍希釈し、リアルタイム定量PCRによって解析した。プライマーおよびプローブを2×プラチナ定量PCRスーパーミックスUDG（カタログ番号11730、Invitrogen）と混合し、3.3μlのcDNAに加えて、最終体積が25μlになるようにした。各試料を三重に分析した。興味あるRNAを発現させる細胞株から精製された材料で調製しておいたcDNAの2倍希釈液をアッセイすることにより、アッセイ用の標準曲線を作成した。テンプレートなしの対照にはcDNAの代わりに滅菌H2Oを使用した。PCRプログラム：50℃で2分、95℃で10分の後、95℃で15秒、60℃で1分を40サイクル。iCycler iQリアルタイム検出システムソフトウェアを使って、計算された閾値サイクルから標的mRNA配列の相対量を決定した。
図7および表1、2、3、4および5を参照されたい。
（実施例８）
インビトロ解析：サバイビンmRNAレベルのノーザンブロット解析
ノーザンブロット解析は、当技術分野で周知の手法により、基本的に「Current Protocols in Molecular Biology」（John Wiley & Sons）に記載されているとおりに行った。ハイブリダイゼーションプローブは、逆転写PCRによって得たcDNA 1μlから373bp断片をPCR増幅することによって得た。この反応は、プライマー5'agcacaaagccattctaagtcattg 3'（フォワード）および5'tccatcatcttacgccagacttc 3'（リバース）（それぞれ最終濃度0.5μM）、200nMの各dNTP、1.5mM MgCl2およびプラチナTaq DNAポリメラーゼ（Invitrogenカタログ番号10966-018）を使って行った。DNAは、Perkin Elmer 9700サーマルサイクラーで、以下のプログラムを使用して、40サイクル増幅した：94℃で2分の後、94℃で30秒および72℃で30秒（1サイクルごとに0.5℃下げる）を40サイクルし、次に72℃で7分。
増幅されたPCR産物は、S-400 MicroSpinカラム（Amersham Pharmacia Biotechカタログ番号27-5140-01）を使って、製造者の指示に従って精製し、分光光度測定法によって定量した。
Redivue(商標)[α-32P]dATP 3000Ci/mmol（Amersham Pharmacia Biotechカタログ番号AA0005）およびPrime-It RmTラベリングキット（Stratageneカタログ番号300392）を使用し、製造者の指示に従って、ハイブリダイゼーションプローブを標識し、その放射標識プローブをS-300 MicroSpinカラム（Amersham Pharmacia Biotechカタログ番号27-5130-01）で精製した。使用前にプローブを96℃で変性し、直ちに氷上に置いた。
実施例6に記載したとおりに精製した全RNA 2μgの試料を変性し、2.2Mホルムアルデヒド/MOPSアガロースゲルでサイズ分離した。TurboBlotter（Schleicher & Schuell）を使用し、下向き毛管移動によって、RNAを正荷電ナイロン膜に移し、Stratageneクロスリンカーを使ったUV架橋によってRNAを膜に固定化した。膜をExpressHybハイブリダイゼーション液（Clontechカタログ番号8015-1）中、60℃でプレハイブリダイズした後、ハイブリダイゼーションのためにプローブを加えた。ハイブリダイゼーションは60℃で行い、ブロットを室温の低ストリンジェンシー洗浄バッファー（2×SSC、0.1％SDS）で洗浄し、さらに50℃の高ストリンジェンシー洗浄バッファー（0.1×SSC、0.1％SDS）で洗浄した。
そのブロットをコダック製ストレージフォスファスクリーン（storage phosphor screen）に曝露し、BioRAD FXモレキュラーイメージャーでスキャンした。Quantity Oneソフトウェア（BioRAD）によってサバイビンmRNAレベルを定量した。
RNA試料負荷量の同等性は、ブロットを85℃の0.5％SDS/H2O中でストリップし、基本的に上述のようにしてプライマー5'aacggatttggtcgtatt 3'（フォワード）および5'taagcagttggtggtgca 3'（リバース）を使って得た標識GAPDH（グルタルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ）プローブで再プローブすることによって評価した。図2および図3参照。強度はホスホイメージャーBiorad FXスキャナーでモニターした（下記参照）。試験したオリゴマー化合物を実施例10に示す。
サバイビンノーザンブロット法によって評価したmRNAのダウンレギュレーション率（データはGAPDHに対して規格化されている）
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（実施例９）
インビトロ解析：サバイビンタンパク質レベルのウェスタンブロット解析
サバイビンのタンパク質レベルは、例えば免疫沈降、ウェスタンブロット解析（免疫ブロット法）、ELISA、RIA（ラジオイムノアッセイ）または蛍光細胞分析分離法（FACS）など、当技術分野で周知の様々な方法で定量することができる。サバイビンに対する抗体を同定し、例えばUpstate Biotechnologies（米国レークプラシッド）、Novus Biologicals（コロラド州リトルトン）、Santa Cruz Biotechnology（カリフォルニア州サンタクルーズ）などの様々な供給源から入手するか、通常の抗体作製方法によって製造することができる。
ウェスタンブロット法：
サバイビンタンパク質レベルに対するサバイビンオリゴのインビトロ作用を、ウェスタンブロット法で決定した。細胞を実施例5で述べたようにトランスフェクトした。トランスフェクションの約24時間後に細胞を収集し、プロテアーゼインヒビターカクテル錠（Roche）を添加した2.5％SDS、5mM DTTおよび6M尿素で溶解した。総タンパク質濃度はブラッドフォード試薬を使って測定した。150μgの総タンパク質量を、12％ビス-トリスゲルに負荷し、MOPSバッファーで泳動し、PVDF膜に製造者（Invitorogen）の推奨に従ってブロットした。ブロッキングバッファー（Invitrogen）中で終夜インキュベートした後、膜をウサギ抗サバイビン抗体（R&DのAF886またはAbcamのNovus500-201）と共に2時間インキュベートし、次に二次抗体中で1時間インキュベートした。発色免疫検出キット（Invitorogen）を使ってサバイビンを可視化した。あるいは、HRPコンジュゲートウサギ免疫グロブリン（DAKO）と共にインキュベートした後、ECL+ Plus試薬（Amersham）と共にインキュベートし、VersaDocケミルミネセンス検出システムを使って可視化した（図13参照。試験したオリゴマー化合物を実施例10に示す）。
（実施例１０）
インビトロ解析：オリゴマー化合物によるヒトサバイビン発現のアンチセンス阻害
本発明に従い、公表された配列（配列番号1として本明細書に組み込まれるGenBankアクセッション番号NM_001168）を使って、ヒトサバイビンRNAの様々な領域を標的とするように、一連のオリゴヌクレオチドを設計した。16ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドを表1および表2に示す。「標的部位」は、そのオリゴヌクレオチドが結合する特定標的配列上の第1ヌクレオチド番号を示す。好ましい化合物はLNA含有化合物である。表3に、4つの化合物の低いIC50を示す。
表1：本発明のオリゴマー化合物
オリゴマー化合物を、15PC3細胞中でサバイビンmRNAをノックダウンするその能力について評価した。データをモックトランスフェクト細胞と比較したダウンレギュレーション百分率として表す。転写物定常状態をリアルタイムPCRによってモニターし、GAPDH転写物定常状態に対して規格化した。LNA Cはいずれも5'-メチル-シトシンであることに留意されたい。
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表2：本発明のオリゴマー化合物
オリゴマー化合物を、15PC3細胞中でサバイビンmRNAをノックダウンするその能力について評価した。データをモックトランスフェクト細胞と比較したダウンレギュレーション百分率として表す。転写物定常状態をリアルタイムPCRによってモニターし、GAPDH転写物定常状態に対して規格化した。LNA Cはいずれも5'-メチル-シトシンであることに留意されたい。
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 ＊は、下線部が上の化合物に対するミスマッチを示している化合物を表す。化合物145Fおよび146Fは、大文字斜体で示すMOE化学基を含有し、これは化合物ISIS23722である。
表3：起源が異なる2つの細胞株におけるLNA（β-D-オキシ-LNA）含有オリゴマーのIC50（nM）
オリゴマー化合物を、15PC3細胞およびMCF7細胞中でサバイビンmRNAをノックダウンするその能力について評価した。転写物定常状態をリアルタイムPCRによってモニターし、GAPDH転写物定常状態に対して規格化した。
Figure 2007523601
表1および表2に示すように、配列番号2、3、4、5、6、8、9、10、11、12、13、14、15、118、119、120、121、122、123、125、126、128、129、130および131は、これらの実験では、25nMで少なくとも30％のサバイビン発現阻害を示し、したがって好ましい。
特に興味深い化合物は、2A、2B、4A、4B、6A、6B、15A、15B、15E、119A、119B、121A、121B、128A、128B、130A、130B、131Aおよび131Bである。
（実施例１１）
LNAアンチセンスオリゴマー化合物の使用による、ホスホロチオエートおよびMOEと比較した、インビトロでのサバイビン発現阻害の改善
ホスホロチオエートおよびMOE（Calbiochem）含有アンチセンスオリゴヌクレオチドと、LNA含有アンチセンスオリゴヌクレオチドとを使って、15PC3細胞におけるmRNA阻害の比較を行った。LNA型のISIS23722を、18マー4MOE/PS+10PS+4MOE/PSであるMOE含有化合物と比較し、また、等配列ホスホロチオエートと比較した。15PC3のトランスフェクションは、オリゴヌクレオチドまたは培地（モック）を使って行った（実施例5参照）。サバイビンmRNAをリアルタイムPCRでモニターし、GAPDHに対して規格化した。サバイビンmRNAをモック発現との比較で表した（表4参照）。
表4：mRNAのダウンレギュレーション百分率
Figure 2007523601
もう一つの実験では、後期アポトーシス細胞も解析できるように、各培養ウェルの上清も解析に含めた。上記18マーLNA、PSおよびMOE化合物を本発明のLNA16マーと比較した。15PC3細胞に所定の濃度の表示オリゴをトランスフェクトした（実施例5参照）。24時間で全RNAを抽出した。培地上清中の細胞を解析に含めた。サバイビンmRNAをリアルタイムPCRでモニターし、GAPDHに対して規格化した。サバイビンmRNAをモック発現との比較で表した（表5参照）。
表5：mRNAのダウンレギュレーション（モック発現に対する百分率）
Figure 2007523601
（実施例１２）
LNAアンチセンスオリゴマー化合物によるアポトーシス誘導
トランスフェクションの前日に、細胞を、DMEM中、白色96穴プレート（Nunc136101）の1ウェルにつき12000細胞の密度で播種した。翌日、予め温めておいたOptiMEMで細胞を1回洗浄した後、5μg/mlのリポフェクトアミン2000（Invitrogen）を含有するOptiMEM 72μlを添加した。細胞を7分間インキュベートした後、OptiMEMで希釈したオリゴヌクレオチド18μlを加えた。最終オリゴヌクレオチド濃度は5nM〜25nMにわたった。処理の4時間後に、細胞をOptiMEMで洗浄し、血清含有DMEM 100μlを加えた。オリゴ処理に続いて、細胞を表示の期間回復させてから、CO2培養器から取り出し、15分間室温に平衡化した。高感度カスパーゼ3/7-Glo(商標)試薬（Promega）を92穴プレート中の細胞に直接加え、プレートを20分間インキュベートし、さらに1分間の遅延時間の後、Thermo LabsystemsのLuminoskan Ascent装置で、ルミネセンス（ルシフェラーゼ活性）を記録した。ルシフェラーゼ活性は、1秒あたりの相対光強度（RLU/s）として測定される。データをAscentソフトウェア2.4.2で処理し、エクセル（excel）でグラフを描いた（図8参照）。
（実施例１３）
LNAアンチセンスオリゴマー化合物の使用による、ホスホロチオエートおよびMOEと比較した、インビトロでのアポトーシス誘導の改善
BD(商標)サイトメトリックビーズアレイ（CBA）（カタログ557816）を使ったアポトーシスの測定。上述のようにリポフェクトアミン2000を使って細胞をトランスフェクトした（実施例5参照）。トランスフェクションの24時間後に、上清から細胞を遠沈し、付着細胞をトリプシン処理し、遠沈した。細胞ペレットをPBSに再懸濁/洗浄し、プロテアーゼインヒビターを含有する溶解バッファー1mlにつき細胞濃度が2×106細胞になるように、細胞数を数えた。以下の変更を加えた他は製造者が記述しているとおりの手順を踏んだ。細胞を溶解する際に、細胞を40分間溶解し、10分間隔でボルテックスした。1×105細胞をカスパーゼ3、Bcl-2およびPARPビーズと共にインキュベートし、手短に混和し、室温で1時間インキュベートした。オリゴ処置細胞におけるカスパーゼ3活性、Bcl2発現およびPARPの誘導を、BD(商標)CBAソフトウェアを使って解析した。データをエクセルに転送し、グラフを描いた。データは全てモック（これを1に設定）と比較した値である。図9は、LNA含有化合物（145Aおよび145C）が、等配列MOE化合物ISIS27322（ここでは145F）および等配列ホスホロチオエート化合物（145D）と比較して、アポトーシスの誘導を改善することを示している。LNA化合物のミスマッチ対照（146C）およびMOE化合物のミスマッチ対照（146F）ならびにLNA化合物15Aも、この試験に含めた。さらに、化合物15Aのカスパーゼ3活性化を、LNAオリゴマー化合物処理細胞の免疫組織化学的解析によって検出した（図10）。
（実施例１４）
増殖する癌細胞におけるアンチセンスオリゴヌクレオチドによるサバイビンの阻害
トランスフェクションの前日に、細胞を、DMEM中、白色96穴プレート（Nunc136101）の1ウェルにつき12000細胞の密度で播種した。翌日、予め温めておいたOptiMEMで細胞を1回洗浄した後、5μg/mlのリポフェクトアミン2000（Invitrogen）を含有するOptiMEM 72μlを添加した。細胞を7分間インキュベートした後、OptiMEMで希釈したオリゴヌクレオチド18μlを加えた。最終オリゴヌクレオチド濃度は5nM〜100nMにわたった。処理の4時間後に、細胞をOptiMEMで洗浄し、血清含有DMEM 100μlを加えた。オリゴ処理に続いて、細胞を表示の期間回復させてから、20μlのテトラゾリウム化合物［3-(4,5-ジメチル-2-イル)-5-(3-カルボキシメトキシフェニル)-2-(4-スルホフェニル)-2H-テトラゾリウム分子内塩；MTS］および電子カップリング試薬（エト硫酸フェナジン；PES）を加えることにより、生細胞を測定した（CellTiter 96(登録商標)AQueous One Solution細胞増殖アッセイ，Promega）。生細胞はPowerwave（BiotekInstruments）を使って490nmで測定した。成長速度（ΔOD/時間）をオリゴ濃度に対してプロットした（図11参照）。
（実施例１５）
サバイビンを標的とするオリゴマー化合物による処理後の細胞の倍数性（細胞周期）およびDNA分解（アポトーシス）の測定
アポトーシスカスケードの後期段階は多数の小さなDNA断片をもたらすが、これは細胞のヨウ化プロピジウム染色によって解析することができる。さらにヨウ化プロジウム染色は、処理細胞における倍数性を評価するために使用することもできる。サバイビンに対するオリゴマー化合物で処理した細胞の倍数性/アポトーシスを評価するために、細胞をPBA中で洗浄し、4℃の70％EtOH中で1時間固定した。50μg/ml RNAse（Sigma）により室温で20分間処理した後、細胞をPBSで洗浄し、40μg/mlヨウ化プロピジウム（SigmaまたはBD）と共に30分間インキュベートした。試料は全て、蛍光細胞分析分離装置（FACSCalibur，Becton Dickinson）とCell Questソフトウェアを使って解析した。DNAヒストグラムでは、低二倍体またはサブG1ピーク（sub-G1 peak）がアポトーシス細胞を表す。
（実施例１６）
サバイビンを標的とするオリゴマー化合物による処理後の細胞のミトコンドリア膜電位変化の測定
ミトコンドリア膜電位の変化を測定するために、MitoSensor(商標)試薬法（Becton Dickinson、カタログ番号K2017-1）を使用した。MitoSensor(商標)試薬は健常細胞によって取り込まれ、その細胞中で赤色蛍光を放射する凝集体を形成する。アポトーシスが起こるとミトコンドリア膜電位が変化して、この試薬はミトコンドリア内で凝集することができなくなるので、そのモノマー型で細胞質中に留まり、緑色の蛍光を放射する。サバイビンに対するオリゴマー化合物で処理した細胞を洗浄し、製造者が記述しているとおりに、インキュベーションバッファーに希釈したMitoSensor試薬中でインキュベートした。オリゴ処理後の膜電位の変化は、蛍光細胞分析分離装置（FACSCalibur、Becton Dickinson）により、Cell Questソフトウェアを使って検出した。
（実施例１７）
アンチセンスオリゴ処理後の内皮細胞の毛管形成の阻害
内皮単層細胞（例えばHUVEC）を、サバイビンに対するアンチセンスオリゴと共にインキュベートした。以下の2つの方法のどちらかによって、管形成を解析した。第1の方法はBD BioCoat血管新生管形成システムである。上述（実施例5）のように細胞にオリゴをトランスフェクトした。トランスフェクト細胞を、マトリゲル重合BD Biocoat血管新生プレート上に、2×104細胞/96ウェブの密度で播種した。プレートを、PMA（5〜50nM）、VEGF（20〜200ng/ml）、スラミンまたは賦形剤と共に、またはそれを伴わずに、表記の時間/日数にわたってインキュベートした。プレートをカルセイン-AMで製造者が述べているとおりに染色し、撮像した。MetaMorphを使って総管長を測定した。あるいは、10×DMEM 0.1体積中のラット尾I型コラーゲン（3mg/ml、Becton Dickinson）に細胞を播種し、滅菌1MNaOHで中和し、氷上またはマトリゲル中に保った。細胞をコラーゲン懸濁液に1×106細胞/mlコラーゲンの最終濃度で加えた。細胞-コラーゲン混合物を6穴または35穴プレートに加え、37℃の湿潤培養器に入れた。ゲル化したら、培養培地3mlと追加の10％FBSを加え、細胞に、PMA（16nM）、VEGF（50ng/ml）の存在下または不在下で、表示した期間にわたって、毛管様導管を形成させた。ゲルのクライオスタット切片化と位相差顕微鏡による切片の検査後に、管形成を定量した。
（実施例１８）
サバイビンを標的とするオリゴマー化合物による処理後のインビトロ細胞毒性の測定
細胞を播種し（0.3〜1.2×104）、上述のように（MTSアッセイ実施例12の例）、アンチセンスオリゴで処理した。表示した時間で、培地へのLDHの放出を測定するために、アンチセンス処理細胞から得た20〜50μlの培地を96穴プレートに移した。等体積のLDH基質を製造者の説明どおりに加えた。放出されたLDHを、テトラゾリウム塩（INT）を赤いホルマザン生成物に変換させる30分間共役酵素アッセイを使って測定した。生成した色の量は溶解された細胞の数に比例する。可視波長吸光度データ（490nmで測定）を標準的96穴プレートリーダー（Powerwave、Bio-Tek Instruments）を使って収集した。陽性対照細胞は、0.9％トリトンX-100で約45分間処理した（＝100％溶解）。細胞毒性をモックおよびトリトン-X100処理細胞に対してプロットした（100％溶解＝100％細胞毒性）。
（実施例１９）
インビボモデル：アンチセンスオリゴヌクレオチドを使った全身処置による、インビボで成長するヒト腫瘍細胞の腫瘍成長阻害
6週齢の雌NMRI無胸腺ヌードマウスをM&B（デンマーク）から購入し、実験に入る前に少なくとも1週間は馴化させた。ヒト癌細胞（典型的には106細胞をマトリゲル（BD Bioscience）300μlに懸濁したもの）を、7〜8週齢NMRI無胸腺雌ヌードマウスの脇腹に皮下注射した。腫瘍成長が確立されたら（通例、腫瘍細胞注射の７〜12日後）、皮下に植え込んだALZET浸透圧ポンプを使って、様々なアンチセンスオリゴヌクレオチドを、5mg/kg/日で最長28日まで投与した。背側への埋植に先立って、ポンプを開始させるために滅菌PBS中、室温で、ポンプを一晩インキュベートした。対照動物には同じ期間にわたって食塩水のみを投与した。各実験群は少なくとも5匹のマウスを含んだ。抗腫瘍活性は腫瘍体積の抑制によって見積った。直角に交わる2つの直径を測定することにより、腫瘍成長を定期的に追跡した。腫瘍体積は式（π×L×D2/6）に従って計算した（式中、Lは最大直径を表し、DはLと直角を成す腫瘍直径を表す）。処置の終了時に動物を屠殺し、腫瘍重量を測定した。各群の平均腫瘍体積および平均腫瘍重量をマン-ホイットニーの検定を使って比較した。解析は全てウインドウズ用SPSSバージョン11.0で行った。最適には、そのアンチセンスオリゴヌクレオチドがタンパク質レベルに対する抑制作用を持つかどうかを測定するために、ウェスタンブロット解析も行うことができる。したがって、処置期間の終了時に動物を麻酔し、腫瘍を切除し、直ちに液体窒素中で凍結した。モーター駆動ホモジナイザーを使って、腫瘍を、溶解バッファー（すなわち20mMトリス-Cl［pH7.5］；2％トリトンX-100；1/100体積のプロテアーゼインヒビターカクテルセットIII（Calbiochem）；1/100体積のプロテアーゼインヒビターカクテルセットII（Calbiochem））中、4℃でホモジナイズした。腫瘍組織100mgにつき500μlの溶解バッファーを適用した。各マウス群から得た腫瘍溶解液をプールし、組織片を除去するために、13,000g、4℃で5分間遠心分離した。腫瘍抽出物のタンパク質濃度は、BCAタンパク質アッセイ試薬キット（Pierce、ロックフォード）を使って決定した。タンパク質抽出物（50〜100μg）を4〜20％にわたる勾配SDS-PAGEゲルで分画し、PVDF膜に移し、アミノブラック染色によって可視化した。サバイビンの発現は、抗ヒトサバイビン抗体を加え、次にセイヨウワサビペルオキシダーゼ結合抗ヤギIgG（DAKO）を加えることによって検出した。免疫反応性は、ECL Plus（Amersham biotech）によって検出し、Versadoc 5000 liteシステム（Bio-Rad）によって定量した。
（実施例２０）
インビボモデル：LNAアンチセンスオリゴによる腹腔内処置後の、ヌードマウスに移植されたヒト腫瘍断片の腫瘍成長阻害
LNAアンチセンスオリゴヌクレオチドの腫瘍成長阻害活性を、異種移植を受けた無胸腺ヌードマウスNMRI nu/nu（Oncotest（ドイツ・フライブルク）の繁殖コロニーから入手したもの）で調べた。乳腫瘍（MDA MB231）、前立腺腫瘍（PC3）または肺腫瘍（LXFE397、Oncotest）由来のヒト腫瘍断片を、ヌードマウスで連続継代中の異種移植片から得た。ドナーマウスから腫瘍を取り出した後、それらを断片（直径1〜2mm）に切断し、皮下移植までRPMI1640培養培地に入れておいた。受容マウスをイソフルランの吸入によって麻酔した。背中の皮膚に小さな切開を施した。腫瘍断片（マウス1匹につき断片2個）を鉗子で移植した。MDA MB231腫瘍およびLXFE397腫瘍は雌マウスに移植し、PC3腫瘍は雄マウスに移植した。平均腫瘍直径が4〜6mmに達したら動物を無作為化し、3週間にわたり週末を除いて毎日1回、20mg/kgのオリゴヌクレオチドで腹腔内処置した。全ての実験に賦形剤対照群（食塩水）および陽性対照群（タキソール、20mg/kg/日）を含めた。全ての群は6匹のマウスからなった。腫瘍体積は、無作為化の日（0日目）とその後の毎週2回、カリパスで二次元測定することによって決定した。腫瘍体積は式：（a×b2）×0.5に従って計算した（式中、aは最大直径を表し、bはそれと直角に交わる腫瘍直径を表す）。無作為化後、腫瘍体積が倍加するまで28日間、マウスを毎日観察した。腫瘍直径が1.6cmを超えた時にマウスを屠殺した。腫瘍阻害の統計的有意性を評価するために、マン-ホイットニー-ウィルコクソンによるU検定を行った。慣例により、p値＜0.05は腫瘍阻害の有意性を示す。
（実施例２１）
マウスにおけるオリゴヌクレオチドの体内分布
6週齢の雌NMRI無胸腺ヌードマウスをM&B（デンマーク）から購入し、実験に入る前に少なくとも1週間は馴化させた。ヒト癌細胞（典型的には106細胞をマトリゲル（BD Bioscience）300μlに懸濁したもの）を、7〜8週齢NMRI無胸腺雌ヌードマウスの脇腹に皮下注射した。腫瘍成長が明確になったら、皮下に植え込んだALZET浸透圧ポンプを使って、トリチウム標識オリゴヌクレオチドを、5mg/kg/日の用量で14日間投与した。オリゴヌクレオチドはGraham MJら（J Pharmacol Exp Ther 1998;286(1):447-458）が述べているようにトリチウム標識した。全ての主要器官（肝臓、腎臓、脾臓、心臓、胃、肺、小腸、大腸、リンパ節、皮膚、筋、脂肪、骨、骨髄）および皮下移植ヒト腫瘍組織について組織抽出物のシンチレーション計数を行うことによって、オリゴヌクレオチドを定量した。
（実施例２２）
ヒト腫瘍異種移植片におけるLNAオリゴマー化合物の取り込み
実施例13のヒト15PC3異種移植腫瘍を10体積の0.5％Igepal CA-630、25mMトリス（pH8.0）、25mM EDTA、100mM NaCl、1mg/mlプロテイナーゼK1中でホモジナイズし、摂氏37度で一晩インキュベートした後、フェノール-クロロホルム抽出を行った。合わせた水相中のアンチセンスオリゴヌクレオチド2650の濃度を、配列特異的ELISAアッセイを使って決定した。アンチセンスオリゴヌクレオチドに相補的な配列を持つ2つのプローブ（1つはビオチンで標識したもの、1つはジゴキシゲニン（DIG）で標識したもの）をアンチセンスオリゴにハイブリダイズさせる。その複合体を固定化ストレプトアビジンで捕捉し、セイヨウワサビペルオキシダーゼ結合ヤギ抗ジゴキシゲニンと標準的ELISA法とを使って定量した。簡単に述べると、PBS中の1％ブロッキング試薬（Rocheカタログ番号1 096 176）中で、10nM DNA捕捉プローブ（5'-aactgtgc-ビオチン-3'）および10nM LNA検出プローブ（5'-DIG-GATGTTTCgatgtttc-3'）を試料または標品と混合した。その混合物を摂氏70度に加熱し、摂氏20度まで徐冷することにより、プローブをオリゴにアニールさせた。この混合物をストレプトアビジン被覆ウェルに移した。捕捉されたDIGプローブの量は、HRP結合ヤギ抗DIG抗体断片（Roche）と標準的ELISA法とを使って定量される。少なくとも1.3μg/g-腫瘍組織のオリゴマー化合物15Aが検出された（回収率について調整していないデータ）。
本発明をその好ましい実施形態のいくつかに従って具体的に説明した。したがって、上記の例は本発明を例示する役割を果たすだけであって、本発明を限定しようとするものではない。
本発明の様々なデザイン、すなわちギャップマー、ヘッドマー、テイルマー、および組成の異なるミックスマーの図解を示す図面である。ミックスマーの場合、数字は、交互に現われるDNA、β-D-オキシ-LNAまたはα-L-LNAの連続したストレッチを示す。図中、線はDNAであり、灰色の影はα-L-LNA残基に相当し、矩形はβ-D-オキシ-LNAである。 LNAアンチセンスオリゴマー化合物によるサバイビンmRNAのダウンレギュレーションを示す図面である。0.2、1、5、25nMの化合物2A、6A、9A、15Aでそれぞれ処理した15PC3から得た全RNAのノーザンブロット。どの化合物も低濃度で有効な阻害剤だった。 LNAアンチセンスオリゴマー化合物によるサバイビンmRNAのダウンレギュレーションを示す図面である。0.2、1、5、25nMの化合物2Aおよび15Aでそれぞれ処理したSW480（上図）およびA549（下図）から得た全RNAのノーザンブロット。細胞にオリゴヌクレオチドをトランスフェクトし、24時間培養した。 チオ-LNAの一般合成スキームを示す図面である。 配列番号1 GenBankアクセッション番号NM_001168ヒトサバイビンmRNA配列を示す図面である。 アポトーシス経路におけるサバイビンの概略を示す図面である。 LNAアンチセンスオリゴヌクレオチドによるサバイビンmRNAのダウンレギュレーションを示す図面である。細胞にオリゴヌクレオチドをトランスフェクトし、24時間培養した。全RNAを抽出し、15PC3およびMCF-7におけるサバイビンmRNAの発現をリアルタイムPCRによって検出した。サバイビン発現をGAPDH転写物定常状態に規格化して記載する。 LNA含有アンチセンスオリゴヌクレオチドによるアポトーシスの誘導を示す図面である。96穴プレートで、15PC3細胞に、表示した濃度のオリゴをトランスフェクトした。トランスフェクションの24時間後に、カスパーゼ3/7-Glo試薬を記載するように加え、Thermo Labsystems製のLuminoskan Ascent装置でルミネセンス（ルシフェラーゼ活性）の誘導を記録した。ルシフェラーゼ活性は、1秒あたりの相対発光強度（RLU/s）として測定する。 LNA含有化合物（145Aおよび145C）が、等配列MOE化合物ISIS27322（ここでは145F）および等配列ホスホロチオエート化合物（145D）との比較で、アポトーシスの誘導を改善することを示す図面である。LNA化合物（146C）およびMOE化合物（146F）のミスマッチ対照ならびにLNA化合物15Bもこの試験に含めた。15PC3では、LNAアンチセンスオリゴマー化合物を使ったサバイビンmRNAの標的ダウンレギュレーションが、アポトーシスの増加をもたらす。アポトーシスの活性化は、サイトメトリックビーズアレイによって測定する。モック処理細胞に対する誘導倍率を記載する。 サバイビンを標的とするLNAアンチセンスオリゴヌクレオチド15Aで処理した15PC3細胞における活性カスパーゼ3を免疫組織化学を使って検出した、ことを示す図面である。 増殖する癌細胞におけるLNAアンチセンスによるサバイビンの阻害を示す図面である。例えば、化合物6Aはとりわけ強力である。 化合物15Aをトランスフェクトした15PC3細胞におけるサバイビンのダウンレギュレーションをウェスタンブロット法によって解析した（100nMの場合）、ことを示す図面である。

Claims (152)

  1. 合計8〜50個のヌクレオチドおよび/またはヌクレオチド類似体からなる化合物であって、前記化合物は少なくとも8ヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体の部分配列を含み、前記部分配列が、配列番号2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143および144からなる群より選択される配列内に位置する化合物。
  2. 前記配列が、配列番号2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132および133からなる群より選択される配列内に位置する、請求項1に記載の化合物。
  3. 8〜40個のヌクレオチドを含む、請求項1または2に記載の化合物。
  4. 8〜20個のヌクレオチドを含む、請求項3に記載の化合物。
  5. 12〜20個のヌクレオチドを含む、請求項4に記載の化合物。
  6. 12、13、14、15、16、17、18、19または20個のヌクレオチドを含む、請求項5に記載の化合物。
  7. 14、15、16、17または18個のヌクレオチドを含む、請求項6に記載の化合物。
  8. 15〜17個のヌクレオチドを含む、請求項5に記載の化合物。
  9. 15、16または17個のヌクレオチドを含む、請求項8に記載の化合物。
  10. 15個のヌクレオチドを含む、請求項8に記載の化合物。
  11. 16個のヌクレオチドを含む、請求項9に記載の化合物。
  12. 17個のヌクレオチドを含む、請求項9に記載の化合物。
  13. 少なくとも10ヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体の部分配列を含む、上記請求項のいずれか一項に記載の化合物。
  14. 少なくとも12ヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体の部分配列を含む、上記請求項のいずれか一項に記載の化合物。
  15. 少なくとも14ヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体の部分配列を含む、上記請求項のいずれか一項に記載の化合物。
  16. 10、11、12、13、14、15または16ヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体の部分配列を含む、請求項1〜13のいずれか一項に記載の化合物。
  17. 前記ヌクレオチドがホスフェート基、ホスホロチオエート基およびボラノホスフェート基からなる群より選択される連結基を含み、ヌクレオシド間連結部が-O-P(O)2-O-、-O-P(O,S)-O-、-O-P(S)2-O-、-S-P(O)2-O-、-S-P(O,S)-O-、-S-P(S)2-O-、-O-P(O)2-S-、-O-P(O,S)-S-、-S-P(O)2-S-、-O-PO(RH)-O-、O-PO(OCH3)-O-、-O-PO(NRH)-O-、-O-PO(OCH2CH2S-R)-O-、-O-PO(BH3)-O-、-O-PO(NHRH)-O-、-O-P(O)2-NRH-、-NRH-P(O)2-O-、-NRH-CO-O-、-NRH-CO-NRH-、-O-CO-O-、-O-CO-NRH-、-NRH-CO-CH2-、-O-CH2-CO-NRH-、-O-CH2-CH2-NRH-、-CO-NRH-CH2-、-CH2-NRH-CO-、-O-CH2-CH2-S-、-S-CH2-CH2-O-、-S-CH2-CH2-S-、-CH2-SO2-CH2-、-CH2-CO-NRH-、-O-CH2-CH2-NRH-CO-、CH2-NCH3-O-CH2-（式中、RHは水素およびC1-4-アルキルから選択される）でありうる、請求項1〜16のいずれか一項に記載の化合物。
  18. 前記ヌクレオチドが、ホスフェート基、ホスホロチオエート基およびボラノホスフェート基からなる群より選択される連結基を含む、請求項1〜17のいずれか一項に記載の化合物。
  19. 前記連結部がホスフェート基である、請求項18に記載の化合物。
  20. 前記連結部がホスホロチオエート基である、請求項17に記載の化合物。
  21. 全てのヌクレオチドがホスホロチオエート基を含む、請求項20に記載の化合物。
  22. 少なくとも1つのヌクレオチドが対応するヌクレオチド類似体で置き換えられている、上記請求項のいずれか一項に記載の化合物。
  23. 1〜50個のヌクレオチド類似体を含む、請求項22に記載の化合物。
  24. 2〜45個のヌクレオチド類似体を含む、請求項23に記載の化合物。
  25. 3〜40個のヌクレオチド類似体を含む、請求項24に記載の化合物。
  26. 4〜35個のヌクレオチド類似体を含む、請求項25に記載の化合物。
  27. 5〜30個のヌクレオチド類似体を含む、請求項26に記載の化合物。
  28. 6〜25個のヌクレオチド類似体を含む、請求項27に記載の化合物。
  29. 6〜20個のヌクレオチド類似体を含む、請求項28に記載の化合物。
  30. 6〜12個のヌクレオチド類似体を含む、請求項29に記載の化合物。
  31. 8〜12個のヌクレオチド類似体を含む、請求項30に記載の化合物。
  32. 6、7、8、9、10、11または12個のヌクレオチド類似体を含む、請求項30に記載の化合物。
  33. 6〜10個のヌクレオチド類似体を含む、請求項31に記載の化合物。
  34. 6、7、8、9または10個のヌクレオチド類似体を含む、請求項33に記載の化合物。
  35. 7、8または9個のヌクレオチド類似体を含む、請求項34に記載の化合物。
  36. 8個のヌクレオチド類似体を含む、請求項35に記載の化合物。
  37. 全てのヌクレオチドが対応するヌクレオチド類似体で置き換えられている、請求項22〜36のいずれか一項に記載の化合物。
  38. 3'末端に位置するヌクレオシドを含む、請求項22〜36のいずれか一項に記載の化合物。
  39. 前記ヌクレオチド類似体の少なくとも1つが式：
    Figure 2007523601
     ［式中、ZおよびZ*は独立して、存在しないか、ヌクレオシド間連結部、末端基または保護基の中から選択され、
    XおよびYは、O、S、NR、CH2、CH（二重結合の一部である場合）、CH2-O、CH2-S、CH2-NR、CH2-CH2、CH2-CH（二重結合の一部である場合）およびCH=CH（式中、Rは水素またはC1-4-アルキルである）からなる群より独立して選択される］
    のロックト核酸（LNA）である、請求項22〜39のいずれか一項に記載の化合物。
  40. XはOであり、YはO、SおよびNR（式中、Rは水素またはC1-4-アルキルである）からなる群より選択される、請求項40に記載の化合物。
  41. XはOであり、YはO、SおよびNHからなる群より選択される、請求項41に記載の化合物。
  42. XはOであり、YはOである、請求項42に記載の化合物。
  43. 前記LNAがベータ-D型またはアルファ-L型である、請求項40〜46のいずれか一項に記載の化合物。
  44. 前記ヌクレオチド類似体が、-O-P(O)2-O-、-O-P(O,S)-O-、-O-P(S)2-O-、-S-P(O)2-O-、-S-P(O,S)-O-、-S-P(S)2-O-、-O-P(O)2-S-、-O-P(O,S)-S-、-S-P(O)2-S-、-O-PO(RH)-O-、O-PO(OCH3)-O-、-O-PO(NRH)-O-、-O-PO(OCH2CH2S-R)-O-、-O-PO(BH3)-O-、-O-PO(NHRH)-O-、-O-P(O)2-NRH-、-NRH-P(O)2-O-、-NRH-CO-O-、-NRH-CO-NRH-、-O-CO-O-、-O-CO-NRH-、-NRH-CO-CH2-、-O-CH2-CO-NRH-、-O-CH2-CH2-NRH-、-CO-NRH-CH2-、-CH2-NRH-CO-、-O-CH2-CH2-S-、-S-CH2-CH2-O-、-S-CH2-CH2-S-、-CH2-SO2-CH2-、-CH2-CO-NRH-、-O-CH2-CH2-NRH-CO-、CH2-NCH3-O-CH2-（式中、RHは水素およびC1-4-アルキルから選択される）からなる群より選択される連結基を含む、請求項40〜44のいずれか一項に記載の化合物。
  45. 前記ヌクレオチドおよび/またはヌクレオチド類似体がホスフェート基によって互いに連結されている、請求項45に記載の化合物。
  46. 前記ヌクレオチドおよび/またはヌクレオチド類似体がホスホロチオエート基によって互いに連結されている、請求項45に記載の化合物。
  47. 前記ヌクレオチドおよび/またはヌクレオチド類似体がホスフェート基によって互いに連結されており、XはOであり、YはOであり、前記LNAがβ-D型である、請求項47に記載の化合物。
  48. 前記部分配列が、2〜6LNA（請求項40〜44のいずれか一項に定義するもの）のストレッチと、それに続く4〜12ヌクレオチドのストレッチと、それに続く2〜6LNA（請求項40〜44のいずれか一項に定義するもの）のストレッチとを含む、請求項45〜48のいずれか一項に記載の化合物。
  49. 前記部分配列が、4LNA（請求項40〜44のいずれか一項に定義するもの）のストレッチと、それに続く8ヌクレオチドのストレッチと、それに続く4LNA（請求項40〜44のいずれか一項に定義するもの）のストレッチとを含む、請求項49に記載の化合物。
  50. 前記部分配列が、2〜6LNA（請求項40〜44のいずれか一項に定義するもの）のストレッチと、それに続く4〜12ヌクレオチドのストレッチと、それに続く2〜5LNA（請求項40〜44のいずれか一項に定義するもの）のストレッチと、それに続く1ヌクレオチドとを含む、請求項48に記載の化合物。
  51. 前記部分配列が、4LNA（請求項40〜44のいずれか一項に定義するもの）のストレッチと、それに続く8ヌクレオチドのストレッチと、それに続く3LNA（請求項40〜44のいずれか一項に定義するもの）のストレッチと、それに続く1ヌクレオチドとを含む、請求項51に記載の化合物。
  52. 前記1ヌクレオチドが3'末端に位置する、請求項51または52のいずれかに記載の化合物。
  53. 前記ヌクレオシドおよび/またはLNAが、ホスフェート基、ホスホロチオエート基およびボラノホスフェート基からなる群より選択される連結基によって互いに連結されている、請求項49〜53のいずれか一項に記載の化合物。
  54. 前記ヌクレオシドおよび/または前記LNAがホスフェート基によって互いに連結されている、請求項54に記載の化合物。
  55. 前記ヌクレオシドおよび/または前記LNAがホスホロチオエート基によって互いに連結されている、請求項54に記載の化合物。
  56. 部分配列が配列番号2aである、請求項56に記載の化合物。
  57. 部分配列が配列番号3aである、請求項56に記載の化合物。
  58. 部分配列が配列番号4aである、請求項56に記載の化合物。
  59. 部分配列が配列番号5aである、請求項56に記載の化合物。
  60. 部分配列が配列番号6aである、請求項56に記載の化合物。
  61. 部分配列が配列番号7aである、請求項56に記載の化合物。
  62. 部分配列が配列番号8aである、請求項56に記載の化合物。
  63. 部分配列が配列番号9aである、請求項56に記載の化合物。
  64. 部分配列が配列番号10aである、請求項56に記載の化合物。
  65. 部分配列が配列番号11aである、請求項56に記載の化合物。
  66. 部分配列が配列番号12aである、請求項56に記載の化合物。
  67. 部分配列が配列番号13aである、請求項56に記載の化合物。
  68. 部分配列が配列番号14aである、請求項56に記載の化合物。
  69. 部分配列が配列番号15aである、請求項56に記載の化合物。
  70. 部分配列が配列番号117aである、請求項56に記載の化合物。
  71. 部分配列が配列番号118aである、請求項56に記載の化合物。
  72. 部分配列が配列番号119aである、請求項56に記載の化合物。
  73. 部分配列が配列番号120aである、請求項56に記載の化合物。
  74. 部分配列が配列番号121aである、請求項56に記載の化合物。
  75. 部分配列が配列番号122aである、請求項56に記載の化合物。
  76. 部分配列が配列番号123aである、請求項56に記載の化合物。
  77. 部分配列が配列番号124aである、請求項56に記載の化合物。
  78. 部分配列が配列番号125aである、請求項56に記載の化合物。
  79. 部分配列が配列番号126aである、請求項56に記載の化合物。
  80. 部分配列が配列番号127aである、請求項56に記載の化合物。
  81. 部分配列が配列番号128aである、請求項56に記載の化合物。
  82. 部分配列が配列番号129aである、請求項56に記載の化合物。
  83. 部分配列が配列番号130aである、請求項56に記載の化合物。
  84. 部分配列が配列番号131aである、請求項56に記載の化合物。
  85. 部分配列が配列番号132aである、請求項56に記載の化合物。
  86. 部分配列が配列番号133aである、請求項56に記載の化合物。
  87. 3'末端LNAが対応する天然ヌクレオシドで置き換えられている、請求項57〜72のいずれか一項に記載の化合物。
  88. 配列番号2aを含む化合物。
  89. 配列番号3aを含む化合物。
  90. 配列番号4aを含む化合物。
  91. 配列番号5aを含む化合物。
  92. 配列番号6aを含む化合物。
  93. 配列番号7aを含む化合物。
  94. 配列番号8aを含む化合物。
  95. 配列番号9aを含む化合物。
  96. 配列番号10aを含む化合物。
  97. 配列番号11aを含む化合物。
  98. 配列番号12aを含む化合物。
  99. 配列番号13aを含む化合物。
  100. 配列番号14aを含む化合物。
  101. 配列番号15aを含む化合物。
  102. 配列番号117aを含む化合物。
  103. 配列番号118aを含む化合物。
  104. 配列番号119aを含む化合物。
  105. 配列番号120aを含む化合物。
  106. 配列番号121aを含む化合物。
  107. 配列番号122aを含む化合物。
  108. 配列番号123aを含む化合物。
  109. 配列番号124aを含む化合物。
  110. 配列番号125aを含む化合物。
  111. 配列番号126aを含む化合物。
  112. 配列番号127aを含む化合物。
  113. 配列番号128aを含む化合物。
  114. 配列番号129aを含む化合物。
  115. 配列番号130aを含む化合物。
  116. 配列番号131aを含む化合物。
  117. 配列番号132aを含む化合物。
  118. 配列番号133aを含む化合物。
  119. 3'末端LNAが対応するヌクレオチドで置き換えられている、請求項74〜104のいずれか一項に記載の化合物。
  120. 請求項1〜73のいずれか一項に記載の化合物と、前記化合物に共有結合された少なくとも1つの非ヌクレオチドまたは非ポリヌクレオチド部分とを含むコンジュゲート。
  121. 請求項1〜105のいずれか一項に記載の化合物または請求項106に記載のコンジュゲートと、医薬的に許容できる希釈剤、担体または佐剤とを含む医薬組成物。
  122. 少なくとも１つの化学療法剤を更に含み、ここで、該アンチセンスオリゴおよび化学療法剤の１個以上の同じ医薬組成物を併用処置とする、請求項107に記載の医薬組成物。
  123. 前記化学療法剤が、副腎皮質ステロイド（プレドニゾン、デキサメタゾンまたはデカドロンなど）、アルトレタミン（ヘキサレン、ヘキサメチルメラミン（HMM））、アミフォスチン（エチオール）、アミノグルテチミド（シタドレン）、アムサクリン（M-AMSA）、アナストロゾール（アリミデクス）、アンドロゲン（テストステロンなど）、アスパラギナーゼ（エルスパー）、カルメットゲラン桿菌、ビカルタミド（カソデックス）、ブレオマイシン（ブレノキサン）、ブスルファン（ミレラン）、カルボプラチン（パラプラチン）、カルムスチン（BCNU、BiCNU）、クロラムブシル（リューケラン）、クロロデオキシアデノシン（2-CDA、クラドリビン、ロイスタチン）、シスプラチン（プラチノール）、シトシンアラビノシド（シタラビン）、ダカルバジン（DTIC）、ダクチノマイシン（アクチノマイシンD、コスメゲン）、ダウノルビシン（セルビジン）、ドセタキセル（タキソテール）、ドキソルビシン（アドリアマイシン）、エピルビシン、エストラムスチン（emcyt）、エストロゲン（ジエチルスチルベストロール（DES）など）、エトポシド（VP-16、ベプシド、エトポフォス）、フルダラビン（フルダラ）、フルタミド（ユーレキシン））、5-FUDR（フロクスウリジン）、5-フルオロウラシル（5-FU）、ゲムシタビン（ゲムザール）、ゴセレリン（ゾダレックス）、ハーセプチン（トラスツズマブ）、ヒドロキシ尿素（ハイドレア）、イダルビシン（イダマイシン）、イホスファミド、IL-2（プロロイキン、アルデスロイキン）、インターフェロン・アルファ（イントロンA、ロフェロンA）、イリノテカン（カンプトサール）、ロイプロリド（ルプロン）、レバミソール（エルガミソール）、ロムスチン（CCNU）、メクロルエタミン（マスターゲン、ナイトロジェンマスタード）、メルファラン（アルケラン）、メルカプトプリン（プリネトール、6-MP）、メトトレキセート（メキセート）、マイトマイシンC（ムタムチン）、ミトキサントロン（ノバントロン）、オクトレオチド（サンドスタチン）、ペントスタチン（2-デオキシコホルマイシン、ニペント）、プリカマイシン（ミトラマイシン、ミトラシン）、プロカルバジン（マチュラン）、ストレプトゾシン、タモキシフェン（ノルバデックス）、タキソール（パクリタキセル）、テニポシド（ビュウモン、VM-26）、チオテパ、トポテカン（ハイカムチン）、トレチノイン（ベサノイド、全トランス型レチノイン酸）、ビンブラスチン（バルバン）、ビンクリスチン（オンコビン）およびビノレルビン（ナベルビン）からなる群より選択される、請求項108の医薬組成物。
  124. 医薬として使用するための、請求項1〜105のいずれか一項に定義した化合物または請求項106に定義したコンジュゲート。
  125. 癌を処置するための医薬の製造を目的とする、請求項1〜105のいずれか一項に定義した化合物または請求項106に定義したコンジュゲートの使用。
  126. 前記癌が固形腫瘍の形態をしている、請求項111に記載の使用。
  127. 前記癌が癌腫である、請求項111または112に記載の使用。
  128. 前記癌腫が、悪性黒色腫、基底細胞癌、卵巣癌、乳癌、非小細胞肺癌、腎細胞癌、膀胱癌、再発性表在性膀胱癌、胃癌、前立腺癌、膵癌、肺癌、子宮頸癌、子宮頚部形成異常、咽頭乳頭腫症、結腸癌、結腸直腸癌および類癌腫からなる群より選択される、請求項113に記載の使用。
  129. 前記癌腫が、悪性黒色腫、非小細胞肺癌、乳癌、結腸癌および腎細胞癌からなる群より選択される、請求項114に記載の使用。
  130. 前記悪性黒色腫が、表在拡大型黒色腫、結節型黒色腫、悪性黒子型黒色腫、先端黒色腫、メラニン欠乏症黒色腫および線維硬化性黒色腫からなる群より選択される、請求項115に記載の使用。
  131. 前記癌が肉腫である、請求項111または112のいずれかに記載の使用。
  132. 前記肉腫が、骨肉腫、ユーイング肉腫、軟骨肉腫、悪性線維性組織球腫、線維肉腫およびカポジ肉腫からなる群より選択される、請求項117に記載の使用。
  133. 前記癌が神経膠腫である、請求項111または112のいずれかに記載の使用。
  134. 癌を処置する方法であって、請求項1〜105のいずれか一項に定義した化合物、請求項106に定義したコンジュゲート、または請求項107〜109のいずれか一項に定義した医薬組成物を、その必要がある患者に投与することを含む方法。
  135. 前記癌が固形腫瘍の形態をしている、請求項120に記載の方法。
  136. 前記癌が癌腫である、請求項120に記載の方法。
  137. 前記癌腫が、悪性黒色腫、基底細胞癌、卵巣癌、乳癌、非小細胞肺癌、腎細胞癌、膀胱癌、再発性表在性膀胱癌、胃癌、前立腺癌、膵癌、肺癌、子宮頸癌、子宮頚部形成異常、咽頭乳頭腫症、結腸癌、結腸直腸癌癌腫および類癌腫からなる群より選択される、請求項122に記載の方法。
  138. 前記癌腫が、悪性黒色腫、非小細胞肺癌、乳癌、結腸癌および腎細胞癌からなる群より選択される、請求項123に記載の方法。
  139. 前記悪性黒色腫が、表在拡大型黒色腫、結節型黒色腫、悪性黒子型黒色腫、先端黒色腫、メラニン欠乏症黒色腫および線維硬化性黒色腫からなる群より選択される、請求項124に記載の方法。
  140. 前記癌が肉腫である、請求項120に記載の方法。
  141. 前記肉腫が、骨肉腫、ユーイング肉腫、軟骨肉腫、悪性線維性組織球腫、線維肉腫およびカポジ肉腫からなる群より選択される、請求項126に記載の方法。
  142. 前記癌が神経膠腫である、請求項120または121に記載の方法。
  143. アテローム性動脈硬化症、乾癬、糖尿病性網膜症、慢性関節リウマチ、喘息、疣贅およびアレルギー性皮膚炎を処置するための医薬の製造を目的とする、請求項1〜105のいずれか一項に定義した化合物または請求項106に定義したコンジュゲートの使用。
  144. 癌を処置するための医薬の製造を目的とする、請求項1〜105のいずれか一項に定義した化合物または請求項106に定義したコンジュゲートの使用であって、前記医薬が、副腎皮質ステロイド（プレドニゾン、デキサメタゾンまたはデカドロンなど）、アルトレタミン（ヘキサレン、ヘキサメチルメラミン（HMM））、アミフォスチン（エチオール）、アミノグルテチミド（シタドレン）、アムサクリン（M-AMSA）、アナストロゾール（アリミデクス）、アンドロゲン（テストステロンなど）、アスパラギナーゼ（エルスパー）、カルメットゲラン桿菌、ビカルタミド（カソデックス）、ブレオマイシン（ブレノキサン）、ブスルファン（ミレラン）、カルボプラチン（パラプラチン）、カルムスチン（BCNU、BiCNU）、クロラムブシル（リューケラン）、クロロデオキシアデノシン（2-CDA、クラドリビン、ロイスタチン）、シスプラチン（プラチノール）、シトシンアラビノシド（シタラビン）、ダカルバジン（DTIC）、ダクチノマイシン（アクチノマイシンD、コスメゲン）、ダウノルビシン（セルビジン）、ドセタキセル（タキソテール）、ドキソルビシン（アドリアマイシン）、エピルビシン、エストラムスチン（emcyt）、エストロゲン（ジエチルスチルベストロール（DES）など）、エトポシド（VP-16、ベプシド、エトポフォス）、フルダラビン（フルダラ）、フルタミド（ユーレキシン）、5-FUDR（フロクスウリジン）、5-フルオロウラシル（5-FU）、ゲムシタビン（ゲムザール）、ゴセレリン（ゾダレックス）、ハーセプチン（トラスツズマブ）、ヒドロキシ尿素（ハイドレア）、イダルビシン（イダマイシン）、イホスファミド、IL-2（プロロイキン、アルデスロイキン）、インターフェロン・アルファ（イントロンA、ロフェロンA）、イリノテカン（カンプトサール）、ロイプロリド（ルプロン）、レバミソール（エルガミソール）、ロムスチン（CCNU）、メクロルエタミン（マスターゲン、ナイトロジェンマスタード）、メルファラン（アルケラン）、メルカプトプリン（プリネトール、6-MP）、メトトレキセート（メキセート）、マイトマイシンC（ムタムチン）、ミトキサントロン（ノバントロン）、オクトレオチド（サンドスタチン）、ペントスタチン（2-デオキシコホルマイシン、ニペント）、プリカマイシン（ミトラマイシン、ミトラシン）、プロカルバジン（マチュラン）、ストレプトゾシン、タモキシフェン（ノルバデックス）、タキソール（パクリタキセル）、テニポシド（ビュウモン、VM-26）、チオテパ、トポテカン（ハイカムチン）、トレチノイン（ベサノイド、全トランス型レチノイン酸）、ビンブラスチン（バルバン）、ビンクリスチン（オンコビン）およびビノレルビン（ナベルビン）からなる群より選択される化学療法剤をさらに含む使用。
  145. 化学療法剤が、タキソール、パクリタキセルまたはドセタキセルなどのタキサン類から選択される、請求項130に記載の使用。
  146. 癌を処置するための医薬の製造を目的とする、請求項1〜105のいずれか一項に定義した化合物または請求項106に定義したコンジュゲートの使用であって、前記処置が、副腎皮質ステロイド（プレドニゾン、デキサメタゾンまたはデカドロンなど）、アルトレタミン（ヘキサレン、ヘキサメチルメラミン（HMM））、アミフォスチン（エチオール）、アミノグルテチミド（シタドレン）、アムサクリン（M-AMSA）、アナストロゾール（アリミデクス）、アンドロゲン（テストステロンなど）、アスパラギナーゼ（エルスパー）、カルメットゲラン桿菌、ビカルタミド（カソデックス）、ブレオマイシン（ブレノキサン）、ブスルファン（ミレラン）、カルボプラチン（パラプラチン）、カルムスチン（BCNU、BiCNU）、クロラムブシル（リューケラン）、クロロデオキシアデノシン（2-CDA、クラドリビン、ロイスタチン）、シスプラチン（プラチノール）、シトシンアラビノシド（シタラビン）、ダカルバジン（DTIC）、ダクチノマイシン（アクチノマイシンD、コスメゲン）、ダウノルビシン（セルビジン）、ドセタキセル（タキソテール）、ドキソルビシン（アドリアマイシン）、エピルビシン、エストラムスチン（emcyt）、エストロゲン（ジエチルスチルベストロール（DES）など）、エトポシド（VP-16、ベプシド、エトポフォス）、フルダラビン（フルダラ）、フルタミド（ユーレキシン）、5-FUDR（フロクスウリジン）、5-フルオロウラシル（5-FU）、ゲムシタビン（ゲムザール）、ゴセレリン（ゾダレックス）、ハーセプチン（トラスツズマブ）、ヒドロキシ尿素（ハイドレア）、イダルビシン（イダマイシン）、イホスファミド、IL-2（プロロイキン、アルデスロイキン）、インターフェロン・アルファ（イントロンA、ロフェロンA）、イリノテカン（カンプトサール）、ロイプロリド（ルプロン）、レバミソール（エルガミソール）、ロムスチン（CCNU）、メクロルエタミン（マスターゲン、ナイトロジェンマスタード）、メルファラン（アルケラン）、メルカプトプリン（プリネトール、6-MP）、メトトレキセート（メキセート）、マイトマイシンC（ムタムチン）、ミトキサントロン（ノバントロン）、オクトレオチド（サンドスタチン）、ペントスタチン（2-デオキシコホルマイシン、ニペント）、プリカマイシン（ミトラマイシン、ミトラシン）、プロカルバジン（マチュラン）、ストレプトゾシン、タモキシフェン（ノルバデックス）、タキソール（パクリタキセル）、テニポシド（ビュウモン、VM-26）、チオテパ、トポテカン（ハイカムチン）、トレチノイン（ベサノイド、全トランス型レチノイン酸）、ビンブラスチン（バルバン）、ビンクリスチン（オンコビン）およびビノレルビン（ナベルビン）からなる群より選択されるさらなる化学療法剤の投与をさらに含む使用。
  147. 前記処置が、タキソール、パクリタキセルまたはドセタキセルなどのタキサン類から選択されるさらなる化学療法剤の投与をさらに含む、請求項132に記載の使用。
  148. 癌を処置する方法であって、請求項1〜105のいずれか一項に定義した化合物、請求項106に定義したコンジュゲート、または請求項107〜109のいずれか一項に定義した医薬組成物を、その必要がある患者に投与することを含み、さらに、副腎皮質ステロイド（プレドニゾン、デキサメタゾンまたはデカドロンなど）、アルトレタミン（ヘキサレン、ヘキサメチルメラミン（HMM））、アミフォスチン（エチオール）、アミノグルテチミド（シタドレン）、アムサクリン（M-AMSA）、アナストロゾール（アリミデクス）、アンドロゲン（テストステロンなど）、アスパラギナーゼ（エルスパー）、カルメットゲラン桿菌、ビカルタミド（カソデックス）、ブレオマイシン（ブレノキサン）、ブスルファン（ミレラン）、カルボプラチン（パラプラチン）、カルムスチン（BCNU、BiCNU）、クロラムブシル（リューケラン）、クロロデオキシアデノシン（2-CDA、クラドリビン、ロイスタチン）、シスプラチン（プラチノール）、シトシンアラビノシド（シタラビン）、ダカルバジン（DTIC）、ダクチノマイシン（アクチノマイシンD、コスメゲン）、ダウノルビシン（セルビジン）、ドセタキセル（タキソテール）、ドキソルビシン（アドリアマイシン）、エピルビシン、エストラムスチン（emcyt）、エストロゲン（ジエチルスチルベストロール（DES）など）、エトポシド（VP-16、ベプシド、エトポフォス）、フルダラビン（フルダラ）、フルタミド（ユーレキシン）、5-FUDR（フロクスウリジン）、5-フルオロウラシル（5-FU）、ゲムシタビン（ゲムザール）、ゴセレリン（ゾダレックス）、ハーセプチン（トラスツズマブ）、ヒドロキシ尿素（ハイドレア）、イダルビシン（イダマイシン）、イホスファミド、IL-2（プロロイキン、アルデスロイキン）、インターフェロン・アルファ（イントロンA、ロフェロンA）、イリノテカン（カンプトサール）、ロイプロリド（ルプロン）、レバミソール（エルガミソール）、ロムスチン（CCNU）、メクロルエタミン（マスターゲン、ナイトロジェンマスタード）、メルファラン（アルケラン）、メルカプトプリン（プリネトール、6-MP）、メトトレキセート（メキセート）、マイトマイシンC（ムタムチン）、ミトキサントロン（ノバントロン）、オクトレオチド（サンドスタチン）、ペントスタチン（2-デオキシコホルマイシン、ニペント）、プリカマイシン（ミトラマイシン、ミトラシン）、プロカルバジン（マチュラン）、ストレプトゾシン、タモキシフェン（ノルバデックス）、タキソール（パクリタキセル）、テニポシド（ビュウモン、VM-26）、チオテパ、トポテカン（ハイカムチン）、トレチノイン（ベサノイド、全トランス型レチノイン酸）、ビンブラスチン（バルバン）、ビンクリスチン（オンコビン）およびビノレルビン（ナベルビン）からなる群より選択されるさらなる化学療法剤を投与することを含む方法。
  149. 癌を処置する方法であって、請求項1〜105のいずれか一項に定義した化合物、請求項106に定義したコンジュゲート、または請求項107〜109のいずれか一項に定義した医薬組成物を、その必要がある患者に投与することを含み、さらに、タキサン類、特にタキソール、パクリタキセルまたはドセタキセルからなる群より選択されるさらなる化学療法剤を投与することを含む方法。
  150. 異常な血管新生によって起こる疾患を患っている哺乳動物またはそのような疾患に罹りやすい哺乳動物を処置する方法であって、サバイビンを標的とするオリゴヌクレオチドであって1以上のLNA単位を含むオリゴヌクレオチドの治療有効量を、その哺乳動物に投与することを含む方法。
  151. アポトーシスを防止または制限する方法であって、請求項1〜105のいずれか一項に定義した化合物、請求項106に定義したコンジュゲート、または請求項107〜109のいずれか一項に定義した医薬組成物を投与することを含む方法。
  152. 細胞増殖を防止する方法であって、請求項1〜105のいずれか一項に定義した化合物、請求項106に定義したコンジュゲート、または請求項107〜109のいずれか一項に定義した医薬組成物を投与することを含む方法。

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