JP2007509331A - アルツハイマー病の診断のための迅速な試験 - Google Patents

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Abstract

本発明はアルツハイマー病またはその早期段階もしくは前述の疾患の傾向の診断のための方法に関する。前述の方法は、有糸***で発現される表面マーカー、特にCD69、ならびに末梢で到達可能な細胞、例えば皮膚細胞またはリンパ球の、有糸***刺激の（a）前および（b）後における定量的決定に基づいている。特異的な刺激指数a:bはアルツハイマー病またはその早期段階もしくは前述の疾患の傾向の指標である。本発明はまた、本発明の診断方法を行うために適したキットに関する。

Description

発明の詳細な説明
本発明は、アルツハイマー病またはこの疾患の早期段階もしくは傾向の診断方法に関し、該方法は、末梢で到達可能な細胞、例えば皮膚またはリンパ球の、有糸***で発現される表面マーカー、好ましくはCD69の、有糸***刺激の (a) 前および (b) 後の定量に基づき、特殊な刺激指数 a:bはアルツハイマー病またはこの疾患の早期段階もしくは傾向の兆しである。本発明はまた、本発明による診断方法を行うのに適したキットに関する。
アルツハイマー病は、臨床の手段および利用可能な臨床以外の方法ならびにそのような装置および技術に基づく方法では、確実性が最高の診断はできない。常に解剖による検証が必要である。他の痴呆の原因に関する診断の区別は、特に疾患の早期段階においてしばしば難しい。しかしながら、この疾患の非常に早期の段階において、二つの理由により確かな診断が重要である。一つは、潜在的に治療可能な形態の痴呆の診断の区別を可能にし、それらに効果的な治療を施し得、もう一つはこれらの早期段階においてのみ成功し得る、アルツハイマー病における神経変性の過程への、任意の形態の治療介入の前提条件である。かかる診断の確実性は、アルツハイマー病の生物マーカー（biomarker）によってのみ、すなわちこの疾患に対して感受性と特異性が高く、容易に決定できる生物学的変化によってのみ、保証され得る。
アルツハイマー病の生物マーカーは診断的価値があり、特にリスクの有る群、ならびに症状発症前の段階および臨床早期の患者を安全に見分けるために特に役立つであろう。生物マーカーはまた、継続管理ならびに予後および治療の介入に対する反応の制御に役立つ。モデル生物マーカーはある理論上および実際の要求に準ずるべきである。これらは特に高い特異性および感受性、症状発症前の段階で識別する能力、ならびに高い正と負の予測価を含む。生物マーカーは、可能なら、非侵襲性の方法で決定され、患者に負荷や驚愕を与えるべきでない。この分析は安価で、容易に、および可能なら家庭医の業務において行えるよう適しているべきである。不幸にも、現在公知の前述した要求に準ずるアルツハイマー病の生物マーカーは無い。特に公知の生物マーカーは低い感受性および特異性のために、診断の手段としては適さない。より高い感受性および特異性を有する他の診断的検査には複雑な技術的前提条件が必要であり、そのため多くの患者を有する部分的な使用には適さない。
本発明は実質的に、アルツハイマー病の診断のための簡単な方法を提供する技術的な課題に基づき、アルツハイマー病の診断、症状発症前の疾患の段階の検出、および十分な感受性および特異性でのアルツハイマー病と他の痴呆との診断的区別を可能にしている。
この技術的な課題は、特許請求の範囲で特徴付けられた態様を提供することによって解決された。
皮膚細胞もしくは血液リンパ球等の、末梢で接触可能な患者の細胞を用いて、免疫磁気細胞分画法後のような有糸***刺激ありまたはなしでの、有糸***指数（活性化指数）の測定に基づいた診断方法を発展させることは可能であった。これらの細胞の活性化は、好ましくは抗原-抗体反応によって定量的に検出され得る活性化マーカーが表面に提示されることと同時に起こり、好ましくは抗体で覆われた磁性粒子が用いられることにより、磁気細胞分画ならびに、その後の有糸***刺激の前および後に表面マーカーを発現する細胞数の定量が可能となる。この特徴は正常な所見と比べ、疾患特異的な偏位を示す。本発明の方法は、アルツハイマー病の診断および症状発現前の疾患の段階の検出、およびアルツハイマー病と他の痴呆の診断方法の区別を可能にする。
本発明は、患者試料による、アルツハイマー病またはこの疾患の早期段階もしくは傾向の診断方法に関し、該方法は以下の工程：
(a)試料中の末梢で到達可能な細胞を有糸***刺激する工程；
(b)有糸***刺激後に発現された一つ以上の表面マーカーによって、工程(a)の前および後の細胞集団中で、有糸***刺激を受けた細胞を定量化し、表面マーカーに対する抗体を用いて表面マーカーを有する細胞を、表面マーカーを有さない細胞から分離する工程；および、
(c)工程(a)の前および後での一つまたは複数の表面マーカーを有する細胞数の間の関係としての、刺激指数を測定する工程、
を含み、刺激をされていない対照試料の少なくとも10倍、最大として100倍に達する刺激指数がアルツハイマー病またはこの疾患の早期段階もしくは傾向の兆しである。
当業者は、有糸***によって刺激され得る細胞を十分に含む、本発明の方法に適しており患者試料を得るために役立つ、適切な手段を知っている。例えば、適切な試料は、皮膚組織試料、好ましくは静脈血由来の、血液試料、脳脊髄液由来の細胞および尿由来の細胞である。
本発明に準じた診断方法の好ましい態様おいて、例えば血液試料が用いられる場合、本方法の他の工程より前に安定化のために、例えばクエン酸ナトリウムまたはヘパリンといった抗血液凝固化合物を加える。
用語「アルツハイマー病の診断」はまた、本明細書中で使用される場合において、継続管理および予後、治療の介入の効率の制御および他の痴呆との診断的区別も含む。
用語「末梢で到達可能な細胞」は、本明細書中で使用される場合、手術なしで、もしくは（最小限の）侵襲性の方法で人体から除去され得る細胞をいい、それらは、例えば、皮膚細胞、および末梢血のリンパ球を含み、本発明の方法のためには後者が好ましい。
表面マーカーの発現を得るための有糸***刺激は、フィトヘムアグルチニン(PHA)、プロテインA、PWMまたは他の、栄養に関わるもしくは有糸***の効果のある化合物等の、公知の刺激物質によって影響され得る。該刺激は、個々の化合物を加えること、もしくは混合して加えることにより影響を受け得る。
当業者は、かかる刺激のための適切な実験条件を、例えば、使用する***誘発因子の濃度、刺激の持続時間、およびその他の培養条件に関して知っている。刺激は十分にガス交換が行えるような、適切な容器内で行うべきである。それぞれの刺激剤の濃度は、生理的濃度、PHAは1μg/ml〜20μg/ml、PWMは1μg/ml〜50μg/ml、およびプロテインAは10μg/ml〜200μg/mlの範囲内とする。刺激時間は、検査される分子の発現速度による。しかしながら、確実な検査には、2〜24時間の刺激時間が必要である。CD69の場合、４時間の刺激時間が最適である。刺激は生理学的条件下で行うべきであり、ガス処理インキュベーター（gassing incubator）内で、例として、37℃および5％ CO2で行われ得る。
当業者はまた、有糸***刺激で明らかになる適切な表面マーカー、例えばCD69、CD25、CD45RO、CD63、およびHLA-Drを知っており、表面マーカーCD69が好ましい。本発明のために、表面マーカーの組み合わせの決定、もしくは、例えば、CD69のような特定の表面マーカーによって分けられた細胞の、さらなる細分化に関する、例えば細分化（例えば、CD4+および／またはCD8+および／またはCD19+および／またはCD56+）によるさらなる特定化を行うこともまた、可能である。
刺激指数（活性化指数）は、刺激の前および後で、一つまたは複数の表面マーカーを有する細胞数の関係から得られる。刺激をされていない対照試料の少なくとも10倍、最大として100倍に達する刺激指数がアルツハイマー病またはこの疾患の早期段階もしくは傾向の兆しである。刺激をされていない対照試料の10倍未満の刺激指数は、アルツハイマー病または、この疾患の早期段階もしくは傾向の兆しではない。表面マーカーを有する細胞は、例えば、ウェスタンブロット、ELISA、RIA、FACS、LSC等の従来の方法により決定され得る。
表面マーカーを有する細胞を決定するために、該細胞は、特徴的な細胞特性によって好ましくは、表面マーカーを有さない、もしくは他の表面マーカーを有する細胞から分離される。
本発明の診断方法において、所望の（一つまたは複数の）表面マーカーに対する抗体により、表面マーカーを有する細胞は、表面マーカーを有さない細胞から分離される。この目的に適した抗体は、モノクローナル、ポリクローナルもしくは合成の抗体、またはそれらの断片であり得る。この結び付きにおいて、用語「断片」は、完全な抗体と同様のエピトープの特異性を有する、モノクローナル抗体の全ての部位（例えば、Fab、Fvまたは一本鎖Fv断片）を意味する。かかる断片の産物は当業者には公知であり、表面マーカーに対する多くの抗体はまた、市販されている。
本発明に準ずる診断方法の最も好ましい態様において、表面マーカーに特異的な、一つまたは複数の抗体は、現在の方法に準じた免疫磁気分画法を介して細胞を対応する表面マーカーにより分離することを可能にする、磁性粒子、例えば常磁性ビーズ（例えば、DYNAL A.S., P.O.Box 158 Skoyen,N-0212 Oslo、Norwayから入手可能）と結合する。
例えば、細胞溶解後に分光光度計による核酸もしくはタンパク質含量の決定によって、または、特異的な色素、例えば、エチジウムブロマイド、ヨウ化プロピジウム、アクリジンオレンジ、DAPI、等の特異的な色素を用いた染色後に光度の定量によって、といった現在の方法を用いて、核酸含量および／またはタンパク質含量に基づいて、所望の表面マーカーによって分離された細胞の量を決定することにより、刺激指数は特定され得る。細胞数は検量線によって、試料のタンパク質および／または核酸含量により算出され得る。
本発明はまた、本発明の診断方法を行うのに適したキットに関し、および、少なくとも以下の構成要素：
(a)有糸***刺激のための化合物；
(b)有糸***刺激後に発現する表面マーカーに対する少なくとも一つの抗体、好ましくは磁性粒子に結合した抗体；
を含む。
本発明のキットはまた、好ましくは
(a)少なくとも一つの反応容器；
(b)抗血液凝固化合物および／または細胞溶解バッファー；
(c)細胞固定バッファー；
(d)DNAおよび／またはタンパク質濃度の定量に必要な物質、ならびに検量線の作製のための既製の溶液；
(e)磁性粒子に結合した細胞を分離するための磁石（磁性粒子に結合した抗体を使用する場合には含まれている）；ならびに
(f)結合した磁性粒子を取り除くための試薬（磁性粒子に結合した抗体を使用する場合には含まれている）;
を含んでいる。
本発明のキットの好ましい態様において、抗体は抗CD69抗体である。さらに、該キットはさらに、または抗CD69抗体の代わりに、抗CD4および／または抗CD8抗体を含み得る。
最終的に、本発明のキットは、適切な場合には、一つ以上のさらなる検出剤、例えば蛍光色素と結合した一次抗体、二次抗体、タンパク質および／または核酸の検出剤、例えば、挿入色素等、の組み合わせで、提供され得る。
実施例
アルツハイマー病を患う患者におけるCD69による有糸***刺激指数の決定
生存している患者（生物マーカー）で行われ得る、アルツハイマー病の今日まで公知の特徴の決定は、不十分な感受性および特異性のみを示すか、または費用もしくは非常に複雑な検査の組み合わせのために、症例数の多い検査には適さない。臨床の手段によると、診断の正確性は、80％〜90％のみであり、診断の区別に関しては、特に疾患の早期段階で困難である。疾患の症状発症前の段階の検出は現在、適切な生物マーカーが存在しないために、可能ではない。
アルツハイマー病の場合、神経変性の変化は、栄養に関わるおよび有糸***のシグナルの細胞内の仲介の過程が破壊されることに基づいている。これらの細胞内シグナル伝達の機能不全は、神経系に限られていない。患者の皮膚細胞および末梢血のリンパ球にも同様に見つかり得る。かかる疾患の特異性のために、この変化は診断的価値があり、生物マーカーとして適している。
以下の実施例において、栄養に関わるおよび有糸***のシグナルの細胞内の仲介の、アルツハイマー病の典型的な機能不全があるかどうかという疑問は、有糸***刺激の前および後の、CD69提示リンパ球の免疫磁性細胞分画法によって決定される。
SRASTEDT社の採血装置を用いた静脈穿刺によって血液を回収する。採血の際に、血液は、採血装置に入ったクエン酸ナトリウムまたはヘパリンナトリウム等の抗血液凝固剤により安定化する。血液は、この形態で、室温で24〜48時間保存され得る。刺激実験は、Greiner bio-one社の24ウェル懸濁培養プレート等のよく通気され得る反応容器内で行った。このため、***誘発因子フィトヘムアグルチニン（PHA）、プロテインAおよびアメリカヤマゴボウ***誘発因子（PWM）は個々もしくは種々の組み合わせで、400μlの安定な全血ごとに使用した。それぞれの***誘発因子の終濃度は生理学的な範囲内とし、本実施例において、PHAについては12μg/ml、プロテインAについては50μg/mlおよびPWMについては4μg/mlとした。生理学的条件下で、ガス処理インキュベーター内で4時間、37℃および5％CO2濃度で刺激を行った。刺激した全血を100μl毎に、種々の抗体で覆われた磁性粒子と共にインキュベートした。本実施例において、DYNAL社の抗CD4および抗CD8で覆われた磁性粒子を使用した。対応するリンパ球の副集団を確実に完全に単離させるために、対応する磁性粒子を特定の試料に過剰に（10μlの磁性粒子懸濁液）加えた。30分、4℃のインキュベーションに続いて、対応するリンパ球の副集団を磁力により分離し、次の洗浄の工程の後、1％ウシ胎児血清（FCS）と混合された100μlの所定の培地、本実施例においてはRPM1640に移した。結合した磁性粒子は本実施例においては、10μlずつのDYNAL社、DETACHaBEADを使用して除去した。45分、室温のインキュベーションに続いて、除去された磁性粒子を分離し、細胞懸濁液を、複数回の洗浄の工程の後、所定の培地、本実施例においてはRPM1640に移した。特異的な溶解バッファーを加えることにより、細胞を破砕し、DNAをエチジウムブロマイド、ヨウ化プロピジウム、アクリジンオレンジまたはDAPI等の特異的なDNA色素により標識し、次に、光度測定により定量化した。試料中のタンパク質含量はBradfordに準じたタンパク質測定法により比較した。細胞数は検量線によって試料中のDNAおよび／またはタンパク質含量から算出した。この手順は細胞数についての直接の結論を可能にする。有糸***刺激の前および後においてCD69を提示している細胞数による指数（刺激指数）の計算は、これらの細胞が有糸***によって刺激できることの変化に関する情報をもたらした。
刺激をされていない対照試料の少なくとも10倍、最大として100倍に達する刺激指数がアルツハイマー病または、この疾患の早期段階もしくは傾向の兆しである。刺激をされていない対照試料の10倍未満の刺激指数は、アルツハイマー病または、この疾患の早期段階もしくは傾向の兆しではない。
別の実験において、試料のタンパク質含量を決定し、CD69提示細胞の定量のためのDNA染色物質の添加なしでDNA含量を決定した。この場合、DNAまたはタンパク質によるある波長（例えば、260nmまたは280nm）の光の吸収を測定した。

Claims (13)

  1. （a）患者試料中の、末梢で到達可能な細胞の有糸***刺激；
    （b）有糸***刺激後に発現する一つ以上の表面マーカーによる、工程（a）の前および後の、細胞集団中の有糸***刺激を受けた、表面マーカーに対する抗体により表面マーカーを有さない細胞から分離された、表面マーカーを有する細胞の定量化；
    （c）工程（a）の前および後に表面マーカーを有する細胞数の関係としての刺激指数の決定、
    の工程を含み、刺激をされていない対照試料の少なくとも10倍、最大として100倍に達する刺激指数が、アルツハイマー病またはこの疾患の早期段階もしくは傾向の兆しである、患者の試料によるアルツハイマー病またはこの疾患の早期段階もしくは傾向の診断方法。
  2. 試料が血液試料であり、細胞がリンパ球である、請求項１記載の方法。
  3. 表面マーカーがCD69である、請求項１または２記載の方法。
  4. CD69+細胞がさらにCD4+および／またはCD8+副集団に関して特定化される、請求項３記載の方法。
  5. 血液が工程（a）の前に一つ以上の抗血液凝固化合物により安定化される、請求項１〜４いずれか記載の方法。
  6. 細胞がPHA、プロテインAまたはPWMにより刺激される、請求項１〜５いずれか記載の方法。
  7. 工程（b）の抗体が磁性粒子に結合しており、分離が免疫磁性分画法により行われる、請求項１記載の方法。
  8. 刺激指数が工程（a）の前および後に表面マーカーを有する細胞のタンパク質含量および／または核酸含量の決定により決定される、請求項１〜７いずれか記載の方法。
  9. 以下の構成要素：
    （a）有糸***刺激のための化合物；および
    （b）有糸***刺激後に発現する表面マーカーに対する少なくとも一つの抗体、
    を含む、アルツハイマー病またはこの疾患の早期もしくは傾向の診断のためのキット。
  10. （c）抗血液凝固化合物；および／または
    （d）細胞溶解バッファー、
    も含む、請求項９記載のキット。
  11. 抗体が磁性粒子に結合した抗体である、請求項９または１０記載のキット。
  12. 抗体が抗CD69抗体である、請求項９〜１１いずれか記載のキット。
  13. 抗CD4および／または抗CD8抗体も含む、請求項９〜１２いずれか記載のキット。
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