CN106885909B - 一种用于早期诊断阿尔茨海默病的试剂盒 - Google Patents
一种用于早期诊断阿尔茨海默病的试剂盒 Download PDFInfo
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Abstract
本发明一种用于早期诊断阿尔茨海默病的试剂盒，含有表皮生长因子、生长调节的α蛋白/C‑X‑C基序趋化因子、巨噬细胞衍生的趋化因子/C‑C基序趋化因子22、单核细胞趋化蛋白1/C‑C基序趋化因子2、单核细胞趋化蛋白2/C‑C基序趋化因子8、单核细胞趋化蛋白4/C‑C基序趋化因子13、胸腺和活化调节的趋化因子/C‑C基序趋化因子17、干细胞因子/Kit配体、TNF相关性细胞凋亡诱导配体/肿瘤坏死因子配体超家族成员10、皮肤T细胞吸引趋化因子/C‑C基序趋化因子27和γ‑微管蛋白复合物成分2生物标记物。本发明这11种免疫或炎症相关的血浆蛋白组成的模型能够应用于AD的早期诊断。
Description
技术领域
本发明属于生物工程领域，涉及一种诊断试剂盒，具体来说是一种用于早期诊断阿尔茨海默病的试剂盒。
背景技术
阿尔茨海默病(AD)是一种隐匿起病不断进展的神经退行性疾病，其在65岁以上的人群中发病率最高。根据爱丁堡大学的发明，截至2010年中国约569万人口罹患AD，与1990年的193万人相比，在20年内几乎增加了两倍。随着我国人口老龄化的进展，预计在未来20年AD的增加比例将更加陡峭，导致巨大的家庭，社会和经济负担。然而，与快速增加的患者群体和巨大的社会和经济成本相反，目前尚无治愈AD的有效手段。AD的症状进展缓慢，并随着时间逐渐恶化。多项证据表明，AD患者大脑中Aβ和tau蛋白的异常积累早在痴呆症状出现前年即已经开始。因此，发现经济、方便的AD早期诊断方式对于提供更好的阻碍AD进展的机会是至关重要的。此外，鉴于到目前为止尚无针对AD的疾病缓解治疗方式，尚需要大量的临床试验以提供更有用的药物参考，而由于缺乏客观的早期诊断***，避免AD的纳入诊断偏倚仍然具有挑战性。因此，迫切需要找到可靠的客观方法用于AD的早期诊断。
在过去的几十年中，对脑结构MRI(如海马和内嗅皮层区域)，功能性MRI，淀粉样蛋白跟踪正电子发射断层扫描(PET)(如Pittsburgh compound B和18F-florbetapir)和脑脊液(CSF)的蛋白检测被认为是潜在的能够辅助早期AD诊断的方法。然而，这些先进技术或昂贵的或具有侵入性，将这些方法应用于初级卫生保健机构中常规筛查AD的风险似乎不切实际。相比之下，血液检查，由于其方便和经济，有潜力作为AD的一线筛查方式。近年来，基于蛋白质测定或基于质谱法的血液蛋白谱检测的AD生物标志物发明已经成为科学家的一个关注点。Ray等鉴定了血浆中AD的一组基于18种蛋白的AD生物标志物；O'Bryant等创建了一个基于血清30种生物标志物的算法用于早期筛查AD。考虑到这些潜在的生物标志物与多种生物过程，如造血、炎症、吞噬作用和能量稳态等相关，因此由这些功能各异的血清蛋白组成的生物标志物集合用于预警AD的机制目前尚不明确。若关注AD更有针对性的病理过程，如免疫和炎症通路，则可能更有效。
近年来的临床前和临床发明都表明免疫和炎症信号在AD的发生和发展中起重要作用。AD患者脑内固有免疫应答和炎症过程的显著激活是AD病理的一大标志。这些信号转导反应从AD发病非常早期的阶段开始，并参与疾病的整个过程。因此，本发明试图回答，外周免疫和炎症因素是否可以作为大脑慢性炎症的指标，是否能够通过一套可靠的血浆免疫炎症生物标志物辅助AD的早期诊断甚至预警AD的发生。
发明内容
针对现有技术中的上述技术问题，本发明提供了一种用于早期诊断阿尔茨海默病的试剂盒，所述的这种用于早期诊断阿尔茨海默病的试剂盒要解决现有技术中早期诊断阿尔茨海默病方法复杂，而且准确性不高的技术问题。
本发明提供了一种用于早期诊断阿尔茨海默病的试剂盒，含有表皮生长因子、生长调节的α蛋白/C-X-C基序趋化因子、巨噬细胞衍生的趋化因子/C-C基序趋化因子22、单核细胞趋化蛋白1/C-C基序趋化因子2、单核细胞趋化蛋白2/C-C基序趋化因子8、单核细胞趋化蛋白4/C-C基序趋化因子13、胸腺和活化调节的趋化因子/C-C基序趋化因子17、干细胞因子/Kit配体、TNF相关性细胞凋亡诱导配体/肿瘤坏死因子配体超家族成员10、皮肤T细胞吸引趋化因子/C-C基序趋化因子27和γ-微管蛋白复合物成分2生物标记物。
本发明还提供了表皮生长因子、生长调节的α蛋白/C-X-C基序趋化因子、巨噬细胞衍生的趋化因子/C-C基序趋化因子22、单核细胞趋化蛋白1/C-C基序趋化因子2、单核细胞趋化蛋白2/C-C基序趋化因子8、单核细胞趋化蛋白4/C-C基序趋化因子13、胸腺和活化调节的趋化因子/C-C基序趋化因子17、干细胞因子/Kit配体、TNF相关性细胞凋亡诱导配体/肿瘤坏死因子配体超家族成员10、皮肤T细胞吸引趋化因子/C-C基序趋化因子27和γ-微管蛋白复合物成分2作为生物标记物在制备早期诊断阿尔茨海默病的试剂盒中的应用。
迄今为止，阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)的确诊只能通过尸检实现。鉴于血液学检查能够提供实时信息指导临床治疗，发现能够辅助早期诊断甚至预警AD发生的血浆生物标志物一直是发明者追求的目标。许多发明表明AD患者脑中的慢性炎症在疾病的发病中起重要作用。因此，外周血免疫和炎症相关因子是否可以作为大脑慢性炎症的指标进而提示AD的进展值得探讨。
本发明分析了36名AD患者和36名年龄及性别匹配的健康对照(healthy control,HC)血浆中的70种免疫及炎症相关的信号蛋白水平。基于蛋白水平的差异，我们建立了能够将AD与健康对照区分开的模型。并在由另外10名AD，10名轻度认知障碍(mild cognitiveimpairment,MCI)患者和10名HC组成的队列中验证该模型预测AD的能力。
本发明发现由11种免疫或炎症相关的血浆蛋白组成的模型可用于区分AD患者与健康对照的血液样本，在验证队列中具有接近90％的特异性。我们进一步通过对MCI患者的两年随访发明评估了该模型的敏感性。经过2年随访，我们发现被算法预测为AD的2名MCI其认知障碍程度较基线显著加重。
本发明和已有技术相比，其技术进步是显著的。本发明发现11种血浆免疫炎症生物标志物的组合可以用于中国人群中AD的早期诊断。更进一步的是，在对验证队列中10名MCI的随访发明中发现该模型对AD有一定预警作用，用我们的模型鉴定为潜在AD的2名MCI在2年后认知功能较其它8名显著下降。这些发现表明，基于这11种血浆炎症信号蛋白的模型能够应用于AD的早期诊断。
附图说明
图1是用于证明早期诊断阿尔茨海默病的生物标志物的流程图。
图2是判别分析训练组(A,C)和测试组(B,D)结果的散点图和ROC曲线。
具体实施方式
实施例1
1.发明人群
本发明所纳入的轻度认知障碍(MCI)患者和AD患者从上海交通大学附属瑞金医院痴呆门诊由神经科专业医生招募。年龄和性别匹配的健康对照(HC)为通过流行病学调查社区的广告招募，或是MCI或AD患者参与者的亲属。共有150名55岁及以上的参与者参加了这项为期两年的观察性发明。每个参与者均接受了标准化评估，包括医学评估和神经心理学评估。在获得患者知情同意后，每位参与者均留取1管EDTA抗凝血剂管盛装的外周血样本。诊断为MCI组的患者满足在没有显著功能损失的情况下主观和客观认知困难的标准。AD的诊断基于美国神经和沟通障碍和中风阿尔茨海默病和相关疾病协会(NINCDSADRDA)标准[McKhann GM,Knopman DS,Chertkow H,Hyman BT,Jack CR,Jr.,Kawas CH,Klunk WE,Koroshetz WJ,Manly JJ,Mayeux R,et al:The diagnosis of dementia due toAlzheimer's disease:recommendations from the National Institute on Aging-Alzheimer's Association workgroups on diagnostic guidelines for Alzheimer'sdisease.Alzheimers Dement 2011；7:263-269.]中对轻度至中度痴呆的可能阿尔茨海默病的诊断(probable Alzheimer’s disease with mild to moderate dementia)(MMSE评分量表介于14-26分[Albert MS,DeKosky ST,Dickson D,Dubois B,Feldman HH,Fox NC,Gamst A,Holtzman DM,Jagust WJ,Petersen RC,et al:The diagnosis of mildcognitive impairment due to Alzheimer's disease:recommendations from theNational Institute on Aging-Alzheimer's Association workgroups on diagnosticguidelines for Alzheimer's disease.Alzheimers Dement 2011；7:270-279.])。HC组纳入的参与者年龄，性别和教育水平与AD组匹配。
由于本发明旨在分析免疫和炎症信号蛋白的水平，参与者具有高血糖症，高脂血症，高血压，冠心病，关节炎，头部创伤，急性或慢性感染事件或其他可能显著影响免疫和炎症***水平的疾病均被排除。排除标准：任何晚期，严重，进行性或不稳定的感染，代谢，免疫，内分泌，肝，血液，肺，心血管，胃肠道或泌尿***疾病可能干扰有效性和安全性评估；除了AD之外，具有其他神经疾病的病史：脑血管疾病，维生素B12缺乏或叶酸缺乏，脑积水，严重的脑外伤，CNS感染，自身免疫疾病或神经变性疾病。最后，在我们的发明中只有102名参与者符合标准：46名AD，10名MCI和46名HC。36名HC和36名AD被随机分入训练组，其他10个AD，10个HC和10个MCI进入验证集。本发明中的每个参与者都由相同的医生以相同的临床量表(MMSE，日常生活量表[ADL][Reisberg B,Finkel S,Overall J,Schmidt-Gollas N,Kanowski S,Lehfeld H,Hulla F,Sclan SG,Wilms HU,Heininger K,et al:TheAlzheimer's disease activities of daily living international scale(ADL-IS).Int Psychogeriatr 2001；13:163-181.]和ADAS-Cog[Rosen WG,Mohs RC,Davis KL:Anew rating scale for Alzheimer's disease.Am J Psychiatry 1984；141:1356-1364.])进行临床评估。
2.样品制备和蛋白监测
将外周血样品收集在EDTA抗凝管中，立即置于冰上，并以800g离心10分钟后将血浆等分并保存在-80℃。将来自所有参与者的血浆样品送至生物化学和细胞生物学发明所(SIBCB，SIBS，CAS，中国上海)，用两种商业化检测磁珠面板(MERCK Millipore)测量70种分析物：人细胞因子/趋化因子磁珠面板和高灵敏度人类细胞因子磁珠面板。这些商业化检测磁珠被开发用以测定先前报道在炎症和AD中改变的信号蛋白。人细胞因子/趋化因子磁珠面板测定蛋白包括38种免疫和炎症因子：EGF，嗜酸细胞活化趋化因子/CCL11，FGF-2，TGF-A，GCSF，Flt-3L，GM-CSF，Fractalkine/CX3CX1，IFN-IFN-γ，GRO/CXCL1，IL-10，MCP-3/CCL7，IL-12B，MDC/CCL22，IL-12A，IL-13，IL-15，sCD40L，IL-17，IL-1A，IL-9，IL-1B，IL-2，IL-3，IL-4，IL-5，IL-6，IL-7，IL-8，IP-10/CXCL10，MCP-1/CCL2，MIP-1A/CCL3，MIP-1B/CCL4，TNF-A，TNF-B，VEGF。高敏感性人细胞因子磁珠面板包含以下32种免疫和炎症因子：嗜酸细胞活化趋化因子-2/CCL24，MCP-2/CCL8，BCA-1/CXCL13，MCP-4/CCL13，I-309/CCL1，IL-，TARC/CCL17,6CKine/CCL21，嗜酸细胞活化趋化因子-3/CCL26，LIF，TPO，SCF/KITLG，TSLP，IL-33，IL-20，IL-21，IL-23，TRAIL/TNFSF10，CTACK/CCL27，SDF-1/CXCL12，ENA-78/CXCL5，MIP-1d/CCL15，IL-28A，GCP-2，I-TAC/CXCL11，MIP-3B/CCL19，MIP-3A/CCL20，淋巴细胞趋化因子，IL-11，IL--29，MIG/CXCL9和M-CSF。
70种炎症因子如下：
EGF：Epidermal growth factor：表皮生长因子；
FGF-2：Fibroblast growth factor 2：成纤维细胞生长因子2；
GCSF：Granulocyte-colony stimulating factor：粒细胞集落刺激因子；
GM-CSF：Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor：粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子；
GCP-2：Gamma-tubulin complex component 2：γ-微管蛋白复合物成分2；
Flt-3L：Fms-related tyrosine kinase 3ligand：Fms相关的酪氨酸激酶3配体；
IFN-A2：Interferon alpha-2：干扰素α-2；
IFN-γ：Interferon gamma：干扰素γ；
LIF：Leukemia inhibitory factor：白血病抑制因子；
M-CSF：Macrophage colony-stimulating factor：巨噬细胞集落刺激因子；
SCF/KITLG：Stem cell factor/Kit ligand：干细胞因子/Kit配体；
sCD40L：Soluble CD40ligand：可溶性CD40配体；
TGF-A：Protransforming growth factor alpha：重组生长因子α；
TNF-A：Tumor necrosis factor-alpha：肿瘤坏死因子-α；
TNF-B：Tumor necrosis factor-beta：肿瘤坏死因子-β；
TPO：Thyroid peroxidase：甲状腺过氧化物酶；
TRAIL/TNFSF10：TNF-related apoptosis-inducing ligand/Tumor necrosisfactor ligand superfamily member 10：TNF相关性细胞凋亡诱导配体/肿瘤坏死因子配体超家族成员10；
TSLP：Thymic stromal lymphopoietin：胸腺基质淋巴细胞生成素；
VEGF：Vascular endothelial growth factor：血管内皮生长因子；
IL-1A：Interleukin-1alpha：白细胞介素-1α；
IL-1B：Interleukin-1beta：白细胞介素-1β；
IL-1RA：Interleukin-1receptor antagonist protein：白介素-1受体拮抗剂蛋白；
IL-2：Interleukin-2：白细胞介素-2；
IL-3：Interleukin-3：白细胞介素-3；
IL-4：Interleukin-4：白细胞介素-4；
IL-5：Interleukin-5：白细胞介素-5；
IL-6：Interleukin-6：白细胞介素-6；
IL-7：Interleukin-7：白细胞介素-7；
IL-8：Interleukin-8：白细胞介素-8；
IL-9：Interleukin-9：白细胞介素-9；
IL-10：Interleukin-10：白细胞介素-10；
IL-11：Interleukin-11：白细胞介素-11；
IL-12A：Interleukin-12subunit alpha：白细胞介素-12亚基α；
IL-12B：Interleukin-12subunit beta：白细胞介素-12亚基β；
IL-13：Interleukin-13：白细胞介素-13；
IL-15：Interleukin-15：白细胞介素-15；
IL-16：Interleukin-16：白细胞介素-16；
IL-17：Interleukin-17：白细胞介素-17；
IL-20：Interleukin-20：白细胞介素-20；
IL-21：Interleukin-21：白细胞介素-21；
IL-23：Interleukin-23：白细胞介素-23；
IL-28A：Interleukin-28subunit alpha：白细胞介素-28亚基α；
IL-29：Interleukin-29：白细胞介素-29；
IL-33：Interleukin-33：白细胞介素-33；
I-309/CCL1：C-C motif chemokine 1：C-C基序趋化因子1；
MCP-1/CCL2：Monocyte chemotactic protein 1/C-C motif chemokine 2：单核细胞趋化蛋白1/C-C基序趋化因子2；
MIP-1A/CCL3：Macrophage inflammatory protein 1-alpha/C-C motifchemokine 3：巨噬细胞炎症蛋白1-α/C-C基序趋化因子3；
MIP-1B/CCL4：Macrophage inflammatory protein 1-beta/C-C motifchemokine 4：巨噬细胞炎症蛋白1-β/C-C基序趋化因子4；
MCP-3/CCL7：Monocyte chemotactic protein 3/C-C motif chemokine 7：单核细胞趋化蛋白3/C-C基序趋化因子7；
MCP-2/CCL8：Monocyte chemotactic protein 2/C-C motif chemokine 8：单核细胞趋化蛋白2/C-C基序趋化因子8；
Eotaxin/CCL11：C-C motif chemokine 11：C-C基序趋化因子11；
MCP-4/CCL13：Monocyte chemotactic protein 4/C-C motif chemokine 13：单核细胞趋化蛋白4/C-C基序趋化因子13；
MIP-1d/CCL15：Macrophage inflammatory protein 1-delta/C-C motifchemokine 15：巨噬细胞炎症蛋白1-delta/C-C基序趋化因子15；
TARC/CCL17：Thymus and activation-regulated chemokine/C-C motifchemokine 17：胸腺和活化调节的趋化因子/C-C基序趋化因子17；
MIP-3B/CCL19：Macrophage inflammatory protein 3-beta/C-C motifchemokine 19：巨噬细胞炎症蛋白3-β/C-C基序趋化因子19；
MIP-3A/CCL20：Macrophage inflammatory protein 3-alpha/C-C motifchemokine 20：巨噬细胞炎症蛋白3-α/C-C基序趋化因子20；
6CKine/CCL21：C-C motif chemokine 21：C-C基序趋化因子21；
MDC/CCL22：Macrophage-derived chemokine/C-C motif chemokine 22：巨噬细胞衍生的趋化因子/C-C基序趋化因子22；
Eotaxin-2/CCL24：Eosinophil chemotactic protein 2/C-C motif chemokine24：嗜酸性粒细胞趋化蛋白2/C-C基序趋化因子24；
Eotaxin-3/CCL26：Eosinophil chemotactic protein 3/C-C motif chemokine26：嗜酸性粒细胞趋化蛋白3/C-C基序趋化因子26；
CTACK/CCL27：Cutaneous T-cell-attracting chemokine/C-C motif chemokine27：皮肤T细胞吸引趋化因子/C-C基序趋化因子27；
GRO/CXCL1：Growth-regulated alpha protein/C-X-C motif chemokine：生长调节的α蛋白/C-X-C基序趋化因子；
ENA-78/CXCL5：Epithelial-derived neutrophil-activating protein78/C-X-Cmotif chemokine 5：上皮衍生嗜中性粒细胞活化蛋白78/C-X-C基序趋化因子5；
MIG/CXCL9：Monokine induced by interferon-gamma/C-X-C motif chemokine9：由干扰素-γ/C-X-C基序趋化因子诱导的单核因子9；
IP-10/CXCL10：10kDa interferon gamma-induced protein/C-X-C motifchemokine 10：10kDa干扰素γ诱导的蛋白/C-X-C基序趋化因子10；
I-TAC/CXCL11：Interferon-inducible T-cell alpha chemoattractant/C-X-Cmotif chemokine 11：干扰素诱导型T细胞α化学引诱物/C-X-C基序趋化因子11；
SDF-1/CXCL12：Stromal cell-derived factor 1/C-X-C motif chemokine12：基质细胞衍生因子1/C-X-C基序趋化因子12；
BCA-1/CXCL13：B cell-attracting chemokine 1/C-X-C motif chemokine13：B细胞吸引趋化因子1/C-X-C基序趋化因子13；
Fractalkine/CX3CL1：C-X3-C motif chemokine 1：C-X3-C基序趋化因子1；
根据制造商的说明书制备样品，每个样品具有三个复孔，每个分析物由7个参考标准点组成的单独标准曲线。每个板运行三个水平的质量控制(QC)措施(低，中和高稀释)。所有血浆样品共在四个96孔板上运行。
使用人总AβELISA试剂盒(ExCell Bio)分别测量血浆中Aβ的总浓度。该测定按照制造商推荐的程序进行。所有样品(血浆，标准品和QC)一式三份进行分析。
3.统计分析
本发明使用SPSS(版本18)进行统计分析。分析参加者的基本信息，对于连续变量(年龄，基线MMSE评分，ADL，ADAS-Cog，总Aβ负荷)使用独立T检验，分类变量(性别)使用卡方检验。连续测量数据表示为平均值±SD。使用独立T检验初步筛选AD和HC之间差异表达的信号蛋白。使用偏相关分析计算信号蛋白和疾病水平之间的部分相关性，以确定显著的生物标志物。进行因子分析以滤除不太重要的信号蛋白并留下累积贡献率超过90％的高影响因子。最后，11个信号蛋白被定义为本发明中的生物标志物。接下来，我们使用这些11信号蛋白通过判别分析建立模型，并把这个从训练组获得的模型应用于另外10名正常对照，10名MCI患者和10名AD患者(验证集)的判别中，以判定模型的诊断和预测AD的能力。
本发明的验证流程如图1所示，在入组时评估的150名参与者中，102名符合我们的发明标准而被纳入。其中，36个HC和36个AD被随机分入训练组。选择并测量先前报道在炎症和AD中改变的总Aβ和70个信号蛋白。所有参与者用MMSE，ADL和ADAS-Cog量表评估。对于基线人口统计学特征，用独立T检验分析连续数据(年龄，基线MMSE评分，ADL，ADAS-Cog，总Aβ负荷)并表示为平均值±SD。对于分类数据(性别)使用卡方检验。为了选择生物标志物建立AD的预测模型，首先使用独立T检验选择差异表达的信号蛋白，然后进行偏相关分析去除年龄和性别的影响以确定组间差异显著的信号蛋白。再通过因子分析筛选对AD诊断提供超过90％累积贡献率的强影响因子作为预测AD的生物标志物。通过判别分析用这些生物标志物建立预测模型，然后用于预测训练组中AD的发生率。测试组由另外10名HC，10名MCI患者和10名AD患者组成。
所有参与者根据伦理委员会指南自愿参加此发明并获得书面知情同意书。将总共102个血浆样品分成训练组(36HC，36AD)和测试组(10HC，10MCI，10AD)。首先用独立T检验分析相对信号蛋白浓度的变化，然后进行偏相关分析以选择显著的生物标志物。通过因子分析分析训练组，然后通过判别分析建立模型，用于在独立的测试组中对样本进行分类。
4.参与者的基本特征
所有参与者的基本信息统计数据被总结并显示在表1中。36个HC参与者的平均年龄是67.75±7.24年；男性性别比例为50％。MMSE的平均分为24.58±2.76；ADL和ADAS-Cog的平均得分分别为18.53±3.5和9.67±4.24；外周血浆中的平均总Aβ水平为167.92±83.63pg/ml。36例AD患者的平均年龄为71.83±7.28；其MMSE，ADL和ADAS-Cog得分分别为15.53±8.02,36.47±15.45和38.11±18.33；他们的平均总Aβ水平为127.27±108.46pg/ml。在基线时，HC和AD组之间的年龄，性别和Aβ水平没有显著差异。HC的MMSE评分显著高于AD患者，其中HC的ADL和ADAS-Cog评分显著低于AD患者。
表1本发明中受试者的基线人口统计特征。
注：数据表示为平均值±SD。缩写：MMSE＝简易智能精神状态检查，ADL＝日常生活活动，ADAS-Cog＝阿尔茨海默病评估量表-认知量表。
5.20种血浆信号蛋白水平在ADs和HCs之间具有显著差异
表2列出了20种在AD组和HC组之间显示显著水平差异的免疫和炎症相关的信号蛋白。我们同时检测了先前报道的在炎症或AD中改变的70种信号蛋白，具有0.2至16pg/ml的高灵敏度检测(参见方法)。最后，通过独立T检验分析AD和HC组之间血浆中的不同水平筛选出20种信号蛋白(EGF，GCSF，GRO/CXCL1，MDC/CCL22，MCP-1/CCL2，MCP-2/CCL8，BCA-1/CXCL13，MCP-4/CCL13，TARC/CCL17,6CKine/CCL21，SCF/KITLG，TRAIL/TNFSF10，CTACK/CCL27，SDF-1/CXCL12，ENA-78/CXCL5，MIP-1d/CCL15，GCP-2，I-TAC/CXCL11，MIP-3B/CCL19，MIG/CXCL9)。
表2在训练组中血浆中的差异表达的炎症相关因子
注：浓度单位为pg/mL。
6.11种信号蛋白被选为建立AD检测模型的生物标志物
为了进一步确定20个信号蛋白与AD的关系，我们因此分析了这些信号蛋白与我们队列中的AD临床诊断之间的相关性。偏相关分析排除年龄和性别的影响后显示，除了BCA-1/CXCL13和6CKine/CCL21，其他18个信号蛋白仍然与疾病显著相关(表3)。使用因子分析进一步降维，选择对AD提供超过90％累积贡献率的11种信号蛋白作为AD诊断的潜在生物标志物(表3)。这11种生物标志物是EGF，GRO/CXCL1，MDC/CCL22，MCP-1/CCL2，MCP-2/CCL8，MCP-4/CCL13，TARC/CCL17，SCF/KITLG，TRAIL/TNFSF10，CTACK/CCL27，GCP-2。因此，利用训练组，我们筛选出11种信号蛋白，并利用判别分析建模。
表3炎症相关蛋白和疾病水平之间的相关性。
注：以斜体表示的蛋白(BCA-1/CXCL13,6CKine/CCL21)显示与AD无显著相关性。a：通过因子分析鉴定出的预测AD的生物标志物。
7.验证AD检测模型
根据算法模型，每个受试者将获得两个得分，一个作为反映被诊断为AD的概率的风险得分，另一个作为反映健康概率的健康得分。如果AD风险评分/健康评分的比率大于1，则受试者将被诊断为AD，否则作为健康对照。首先，我们利用模型测试初始训练组的分类，对每个训练组的受试者用11个基于蛋白质的模型分析风险评分和健康评分，并计算二者比值。如图2(A)所示，模型预测结果与临床诊断的分类几乎相同，其预测61/72样本与临床诊断(准确度84.7％)一致，包括26/36AD患者(敏感性72.2％)和35/36健康对照(特异性97.2％)。阳性预测值(PV+)为96.3％，阴性预测值(PV-)为77.8％，AUC为0.92(图2(C))。
为了评估模型鉴别未知样品的能力，我们将模型应用于由10个健康对照，10个MCI和10个AD患者(测试组)组成的另外的新队列中的AD发生率。鉴别结果如图2(B)所示。AD风险评分和健康评分的比值显示从HC组到MCI患者再到AD患者有不断升高的趋势。在AD和健康对照的测试组中，该模型预测与临床诊断(精确度90％)一致的18/20个样品，包括10个AD患者中的9个(灵敏度90％)和10个健康对照中的9个(特异性90％)AUC为0.94(图2(D))。在MCI组的测试组中，2/10个患者具有大于1的比值被鉴别为潜在AD。因此，我们纵向跟踪10个MCI患者2年，观察模型的诊断的敏感性。在2年随访中，2名MCI患者失访-3号患者死于急性缺血性卒中，6号患者与我们的联系中断。在4号和7号患者中未测量ADAS-Cog量表。在被分类为潜在AD的2个MCI患者中，一个个体发展为AD，另一个个体显示认知功能显著下降，而其他6名被模型归类为健康对照组的MCI患者均无明显变化。MCI患者的MMSE，ADL和ADAS-Cog量表的分数显示了该疾病在2年期间的进展(表4)。这表明11种信号蛋白的组合不仅有助于AD的诊断，而且还能预测发展为AD的风险。
表4 10名MCI患者的MMSE，ADL和ADAS-Cog量表评分
注：a表示由预测算法判断为AD的MCI患者。4号和6号患者在随访期间丢失-4号患者死于急性缺血性卒中，6号患者失去了与我们的联系。在3号和7号患者中未测量ADAS-Cog量表。
值得注意的是，如表5所示，本发明表明，这11种蛋白质(除了MCP-4/CCL13和ENA-78/CXCL5)中大部分在中枢神经***(CNS)中表达，其中，据报道EGF和MCP-1/CCL2能够通过血脑屏障(BBB)。
表5已报道的11种生物标志物的功能注释。
注意：+表明具有相关作用；-表示未具有相关作用。缩写：CNS＝中枢神经***。BBB＝血脑屏障。
Claims (1)
1.表皮生长因子、生长调节的α蛋白/ C-X-C基序趋化因子、巨噬细胞衍生的趋化因子/C-C基序趋化因子22、单核细胞趋化蛋白1 / C-C基序趋化因子2、单核细胞趋化蛋白2 / C-C基序趋化因子8、单核细胞趋化蛋白4 / C-C基序趋化因子13、胸腺和活化调节的趋化因子/ C-C基序趋化因子17、干细胞因子/ Kit配体、TNF相关性细胞凋亡诱导配体/肿瘤坏死因子配体超家族成员10、皮肤T细胞吸引趋化因子/ C-C基序趋化因子27和γ-微管蛋白复合物成分2作为生物标记物在制备早期诊断阿尔茨海默病的试剂盒中的应用。
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