JP2007501614A - Tssk4:ヒト精巣特異的セリン/トレオニンキナーゼ - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、国立衛生研究所により付与されたグラント番号HD38082およびU54 29099のもと、アメリカ合衆国政府の支援により成された。米国合衆国政府は本発明の権利の一部を所有する。
本出願は、2003年8月7日出願の米国仮出願番号第60/493,401号および2004年1月8日出願の米国出願番号第10/754,829号についての35USC§119(e)に基づく優先権を主張し、それらの開示内容は出展明示により本発明の一部とされる。
***形成、すなわち機能的な***細胞が精巣内で生成される過程には、分化中の生殖細胞とそれらの支持体であるセルトリ細胞との間の特異的相互作用、並びにアンドロゲンを産生するライディッヒ細胞によるホルモン調節が関与する。***形成の一般的機構は、全ての哺乳動物において本質的に同じであり、3つの異なる段階:1)最初の段階は、精原細胞が有糸***し、***細胞のプールを形成する増殖段階または精原段階;2)一倍体の精細胞が生じる減数期段階;および3)それぞれ球形の精細胞が***に分化する***変態段階、に分けることができる。初めの2つの段階を調節する分子機構は比較的よく特徴付けられているが、***変態の分子的な基礎は、ほとんど知られていない。
本発明は、***特異的キナーゼ(tssk)ファミリーの遺伝子の、それらにコードされたタンパク質、およびこれらタンパク質に対する抗体に関する。より詳細には、本発明は、ヒトキナーゼ4(tssk4)、およびそのキナーゼのtssk4キナーゼ活性のアゴニストまたはアンタゴニストを同定するための使用に関する。tssk4活性のアンタゴニストは避妊物質として有用であると予想される。本発明はまた、tssk4に特異的な抗体を含み、かかる抗体を治療および診断の手段として用いることを含む。
図1は、ヒトtssk1(配列番号:4)、ヒトtssk2(配列番号:5)、ヒトtssk3(配列番号:6)およびヒトtssk4(配列番号:20)のアミノ酸配列間の比較である。図1において見られるように、4つのタンパク質間のアミノ酸配列の差異はカルボキシ末端付近にある。
図2は、種々のヒト組織から調製されたcDNAとtssk1特異的プライマーを用いて行われたリアルタイムPCRから得られたデータを表したグラフである。
図3は、種々のヒト組織から調製されたcDNAとtssk2特異的プライマーを用いて行われたリアルタイムPCRから得られたデータを表したグラフである。
図4は、種々のヒト組織から調製されたcDNAとtssk3特異的プライマーを用いて行われたリアルタイムPCRから得られたデータを表したグラフである。
図5は、種々のヒト組織から調製されたcDNAとtssk4特異的プライマーとを用いて行われたリアルタイムPCRから得られたデータを表したグラフである。
図6は、tssk4プローブを用いたマウス精巣組織のインシトゥ(in situ)ハイブリダイゼーションである。
図7は、種々の組織から単離され、32P−dCTPを用いたランダムプライミングにより標識化された1.4キロベースのマウスTSSK4cDNAプローブを用いて探索されたマウスのポリ−A mRNAのノーザンブロットである。
定義
本発明の明細書および請求の範囲にて、次の用語を以下に示す定義により使用する。
1.1つまたはそれ以上のペプチジル−C(O)NR−連結(結合)が、非ペプチジル連結、例えば−CH2−カルバメート連結(−CH2OC(O)NR−)、ホスホナート連結、−CH2−スルホンアミド(−CH2−S(O)2NR−)連結、尿素(−NHC(O)NH−)連結、−CH2−第二級アミン連結によって、あるいはアルキル化ペプチジル連結(−C(O)NR−)(ここで、Rは、C1−C4アルキルである)で置換されているペプチド;
2.N末端が、−NRR1基に、−NRC(O)R基に、−NRC(O)OR基に、−NRS(O)2R基に、−NHC(O)NHR基、(ここで、RおよびR1は水素であるか、またはRおよびR1の両方が水素でない場合にはC1−C4アルキルである)に誘導されているペプチド;
3.C末端が、R2がC1−C4アルコキシからなる群から選択される−C(O)R2、並びにR3およびR4が水素およびC1−C4アルキルからなる群から独立して選択される−NR3R4に誘導されているペプチド。
I. 小さい脂肪族、非極性もしくは僅かに極性のある残基:
Ala、Ser、Thr、Pro、Gly;
II. 極性、負電荷の残基およびそのアミド:
Asp、Asn、Glu、Gln;
III. 極性、正電荷の残基:
His、Arg、Lys;
IV. 大きい脂肪族、非極性残基:
Met、Leu、Ile、Val、Cys
V. 大きい芳香族残基:
Phe、Tyr、Trp
本発明は、精巣に豊富に存在し、これらに限らないがヒトおよびマウスの雄生殖細胞おいて主として発現するキナーゼのファミリー(tsskキナーゼファミリー)に関する。より詳細には、本発明は、tssk4並びに診断薬や避妊薬として使用できる化合物を調製および単離するための、このタンパク質の使用に関する。
新規マウス精巣特異的セリン/スレオニンキナーゼの単離
プロテインキナーゼ中に存在する保存領域に対応する変性オリゴヌクレオチドを用いた逆転写−ポリメラーゼ連鎖反応(RT−PCR)により、精巣特異的セリン/スレオニンキナーゼの新規メンバーを単離した。このPCR断片は、ノーザンブロット分析により雄生殖細胞における1020bp転写物を認識した。プローブとしてこの断片を用いて、全長cDNAをマウス混合生殖細胞cDNAライブラリーからクローニングした。このcDNAは、268アミノ酸のタンパク質をコードする804塩基の読み取り枠を有する。組織発現分析により、このプロテインキナーゼは、マウス精巣生殖細胞中で発生時に発現し、脳、卵巣、腎臓、肝臓または初期胚細胞には存在しないことが示された。
精原細胞群の単離
パキテン期染色体、球形精細胞および濃縮精細胞(condensing spermatids)の精製された集団を、コラゲナーゼおよびトリプシン−DNaseIでの連続分離(Bellveら、1977; Romrellら、1976)により、成体マウス(CD-1; Charles Rivers)の被膜剥離精巣から調製した。細胞を、強化クレブスリンゲル重炭酸培地(enriched Krebs Ringer Bicarbonate Medium)(EKRB)(Bellveら、1977; Romrellら、1976)中の2−4%BSA勾配における単位重量の沈降速度により、個別の集団に分離した。パキテン期染色体および球形精細胞群は、各々少なくとも純度85%であったが、濃縮精細胞群は約40〜50%の純度であった(主に無核残留物(anucleated residual bodies)およびいくつかの球形精細胞が混入している)。
体細胞組織、特定年齢のマウスの精巣、および成体マウスの単離精原細胞からの全RNAを、5M グアニジウムイソチオシアネート、25mM クエン酸ナトリウム、pH7.2、0.5%サルコシル(Sarkosyl)、および0.1M 2−メルカプトエタノール中で細胞をホモジナイズすることにより単離した(Chirgwinら、1979)。溶菌液を、5.7M CsCl、0.1M EDTAのクッションにて114,000×gで一晩20℃で遠心分離した。ペレットを再懸濁し、フェノール:クロロホルムで抽出し、そのRNAをエタノールで沈殿させた。そのRNAの完全性は、1%アガロースゲルにおけるリボゾームRNAのエチジウムブロミド染色により証明された。等量のRNAを、ホルムアルデヒドを含む1.2%アガロースゲル中で電気泳動させた(Sambrookら、1989)。RNAをニトロセルロース紙に移し、80℃で2時間ベイク(bake)し、50%ホルムアミド、5×Denhartdt’s、0.1%SDS、100μg/ml トルラRNA、5×SSPE中で最低42℃で1時間、プレハイブリダイズした。適当なDNAプローブをPCRで作成し、ランダムプライム法により32p−dCTPで放射標識し、50%ホルムアミド、5×Denhartdt’s、0.1%SDS、100μg/ml トルラRNA、10%硫酸デキストランを含む5×SSPE中のブロット(1×106 cpm/ml)でインキュベートし、42℃で一晩ハイブリダイズした。ブロットを2×SSPE、0.1%SDSで洗浄し、次いで0.1×SSPE、0.1%SDSで洗浄した(いずれも室温で2×10分間)。洗浄後、フィルターを風乾させ、増強スクリーンを伴うフィルムに−70℃で露光させた。ヒト組織のノーザンブロットはClontechから取得し、ハイブリダイゼーションを上記のとおり行った。
逆転写ポリメラーゼ連鎖反応(RT−PCR)は、Gibco−BRLのスパースクリプト(Superscript)IIを用いて使用説明書に従って行い、次いでプロメガ(Promega)のTaqポリメラーゼを使用した。PCR条件は次の通りであった:95℃、2分間を1サイクルし;95℃で1分間、55℃で1分間および72℃で1分間を35サイクルし;72℃、7分間を1サイクルして、このサイクルを終了し、次いで4℃に冷やした。次いで、DNA産物を2%アガロースゲルで分析した。チロシンキナーゼの標的保存領域に対して、以下の変性プライマーを用いた:逆転写工程については、3つの無作為なヌクレオチドに続いてサブクローニング用の5’EcoRI共通部位を付加したチロシンキナーゼのサブファミリーに共通するコード小領域IXに対応する変性アンチセンス20−マー(CGTGGATCCA(A/T)AGGACCA(C/G)AC(A/G)TC;配列番号:11);(2)PCR工程については、同じプライマーをチロシンキナーゼのサブファミリーと共通する小領域VIbに対応する変性センス20−マーと一緒に使用し、さらにEcoRIの共通部位を4つの無作為なヌクレオチドの後ろに導入した(ATTCGGATCCAC(A/C)G(A/C/T/G)GA(C/T)(C/T)T(配列番号:12)。PCR反応が完了し、その産物を分析した後に、そのcDNAを使用説明書に従ってTOPO TAクローニングベクター(In Vitrogen)にサブクローニングしたが、EcoRIサブクローニング用共通部位は使用しなかった。35個の陽性コロニーからキアゲン(Qiagen)キットを用いてミニプレップ調製し、次いでT7プライマーを用いて配列決定した。
tssk3bをクローニングするため、RT−PCRにより得られた特有配列を用いて、この新規キナーゼに対する特定プライマーを設計した。プライマーA2(アンチセンス:CATCACCTTTCTTGCTATCATGGG;配列番号:13)およびS2(センス:TGTGAGAACGCCTTGTTGCAG;配列番号:14)を用いて、169塩基のPCR断片を得た。続いて、ランダムプライム法により、このPCR断片を32p−dCTPで放射標識し、プローブとして用いて、前記したようにオリゴ−dTプライム化混合生殖細胞cDNAライブラリーをスクリーニングした。
ヒトESTデータベースを検索するため予測されるマウスtssk3bアミノ酸配列を用いて、BLAST検索において登録AI553938を得た。このEST配列を用いてアンチセンスプライマーA3(GACATCACCTTTTTTGCTATCGT;配列番号:15)を設計した。鋳型としてヒト精巣マラソンレディーcDNA(Clontech, Inc)を用いて、このプライマーおよびアダプタープライマー(CCATCCTAATACGACTCACTATAGGGC;配列番号:16)を5’RACEに使用した。まず、PCR反応混合液を94℃で10分間加熱し、次いでその混合液を次の条件下で40サイクルのPCRを行った:94℃で30秒、55℃で30秒、72℃で2分間。これらのサイクルに続いて、混合液を72℃で10分間インキュベートした。AmpTaq Gold(Perkin Elmer)を、従来のPCR用Taqポリメラーゼの代わりに用いた。増幅cDNA断片をTOPO TAクローニングキット(Invitrogen)を用いてクローニングし、配列決定した。5’RACE後に得られたcDNA配列の5’端を用いてセンスプライマーS3(GCAGGTGAGAATGTTCTAACGCTG;配列番号:17)を設計し;アンチセンスプライマーA4(TCTCCCCCTACTTTATTGGAGAGC;配列番号:18)は、AI553938の3’末端に基く。次いで、これら2つのプライマーを用いて、前記条件を用いて同じライブラリーから全長ヒトtssk3b相同体を増幅した。増幅された1.058kb断片を切り出してクローニングし、バージニア大学の配列決定設備を用いて配列決定した。cDNAライブラリー増幅tssk3bヒト相同体のC末端1400bp断片をヒト組織のノーザンブロットに使用した。
すべての配列決定は、AmpliTaq、FSダイ・ターミネーターサイクルシーケンシングキット・ケミストリーおよび適当なプライマーで、373A DNAシーケンサー(PE Applied Biosystems, Foster City, CA)を用いて行った。不明瞭な部分は、逆鎖を配列決定することにより解決した。DNAおよびタンパク質配列分析は、Mac Vector MT(Kodak Scientific Imaging Systems、ニューヘブン、コネチカット州)およびSequencher TM(Gene Codes Corp.、アナーバー、ミシガン州)ソフトウェアプログラムを用い行った。
蛍光性インシトゥハイブリダイゼーション(FISH)および免疫蛍光の検出を、前記のように行った(Bellら、1995、Cytogenet. Cell Genet、70: 263-267)。1kbのマウスcDNAクローンおよび相当する1kbのヒト相同体を、1μg DNA、各20μMのdATP、dCTPおよびdGTP(Perkin Elmer)、1μM dTTP(Perkin Elmer)、25mM トリス−HCl、pH7.5、5mM MgCl2(Sigma)、10mM B−メルカプトエタノール(Sigma)、10μM ビオチン−16−dUTP(Boehringher Mannheim)、2ユニットのDNAポリメラーゼI/DNaseI(GIBCO, BRL)およびH2Oを含み総容量が50μlの反応液中のニックトランスレーションによりビオチン化した。プローブを変性させ、ヒト末梢リンパ球およびマウス胚線維芽細胞のそれぞれに由来する***中期スプレッド(metaphase spreads)にハイブリダイズさせた。ハイブリダイズプローブを、フルオレセイン標識アビジンを用いて検出し、抗アビジン抗体(Oncor)およびフルオレセイン標識アビジンの第二層を加えることよりシグナルを増幅した。染色体調製物をDAPIで対比染色し、マッキントッシュコンピューターワークステーションにより操作される冷却CCDカメラ(Photometrics、トゥーソン、アリゾナ州)を装着したZeiss Axiophot落射蛍光顕微鏡で観察した。DAPI染色およびFITCシグナルのデジタルイメージを取り込み、擬色化し、Oncor version 1.6ソフトウェアを用いてマージした。
マウス雄生殖細胞からのプロテインキナーゼのクローニング
哺乳類***受精能獲得は、いくつかのタンパク質のタンパク質チロシンリン酸化の増加に随伴している。成熟***はタンパク質を合成できず、これらの細胞中にRNAが存在するかが議論されているため、RT−PCRによりプロテインキナーゼを同定し、最終的にはその機能を推測するために、まず、RNAをマウス混合生殖細胞群から単離した。チロシンキナーゼのサブファミリー中の保存領域を標的とする変性プライマーを用い、TAクローニングに続いて、「方法」に記載したようにして得られた27個の配列をGene Bankの配列と比較し、分析した。殆どの配列が、チロシンキナーゼサブファミリーの既知メンバーと一致したが、得られた配列のいくつかは、ser/thrプロテインキナーゼのサブファミリーのメンバーと一致した。
マウスtssk3bの発現様式を、tssk3bの全長転写産物に相当するtssk3b特異的プローブを用いて異なるマウス組織由来の全RNAのノーザンブロット分析により調査した。このプローブは、前記「方法」に記載のようにして調製された、もっぱら混合マウス生殖細胞群中に存在するおよそ1kbの単一の転写産物を認識した。高露光しても、もっぱら生殖細胞中で1.35kb転写産物を識別することができ、この転写物は、マウス生殖細胞ライブラリーをスクリーニングした場合には観察されなかったことから、tssk3bのスプライシング変化を示すかもしれない。精巣中のtssk3bの発現様式をさらに分析するために、成体精巣の精製された生殖細胞から得られたRNAを用いたノーザンブロットを行った。tssk3b mRNAは、球形および濃縮精細胞中で減数***後に発現されることが見出されたが、減数***パキテン期染色体では発現されなかった。マウス精巣は胚発生の11−12日で分化し、始原生殖細胞が大部分を占める。最初の***形成波は、生後数日で始まり、精原細胞は思春期前に初期精細胞に分化する。成熟***への分化は、テストステロンに依存的であり、思春期後に生ずる。
マウスtssk3配列を用いて、生殖細胞腫瘍由来のヒトESTをデータベースのBLAST検索により同定し、3’および5’RACEと組み合わせて使用して「方法」に記載のように適宜ライゲーションされたヒト精巣cDNAライブラリー(Clontech)から全長ヒト相同体(配列番号:3)をクローニングした。
tssk3bの染色***置もまた、全長ヒトcDNAプローブを用いた蛍光性インシトゥハイブリダイゼーション(FISH)によりマッピングした。評価した20個の中期スプレッドすべてにおいて第1染色体上で蛍光シグナルが検出された。観察された合計109個のシグナルのうち、49個(45%)が1pにあった。すべての染色体特異的シグナルは1p34.1−34.3に局在していた。これらシグナルの分布は次の通りであった:第1染色分体(6細胞)、第2染色分体(14細胞)および第3染色分体(5細胞)。マウスtssk3b cDNA相同体は、第4染色体のシンテニック領域、バンドEにマッピングされた。
tsskキナーゼファミリーのヒト相同体の全長cDNAおよびtssk基質からの部分的なcDNA配列のクローニング
ジーンバンクを検索するために、予想されるマウスtssk1および2アミノ酸配列を用いて、マウスtssk1およびtssk2の両方のゲノム配列が得られた。これらの遺伝子は第5および第22染色体にそれぞれマッピングされており、イントロンはない。コード領域の3’末端および5’末端に相当する配列を用いて、それぞれセンスおよびアンチセンスプライマーを設計した。両方のヒトキナーゼ相同体の全長配列を最終的に得るため、鋳型としてヒト精巣マラソンレディーcDNA(Clontech, Inc.)を用いて、アンチセンスプライマーを5’RACEに使用し、センスプライマーを3’RACEに使用した。増幅されたcDNA断片をTOPO TAクローニングキット(Invitrogen)を用いてクローニングし、配列決定した。全長ヒトtsskキナーゼcDNAを増幅するため、5’RACE後に得られたcDNA配列の5’端を用いて5’センスプライマーを設計した。3’RACE後に得られたcDNA配列の3’端を用いて、アンチセンスプライマーを設計した。次いで、これらの2対のプライマーを用いて、同じライブラリーからヒトtssk1および2を増幅した。増幅配列1.3kb(tssk1)および1.2kb(tssk2)をサブクローニングし、配列決定した。tsskキナーゼファミリーの3つのメンバーの翻訳されたヒト相同体をそれぞれ配列番号:4〜6として提供する。
免疫学的局在決定およびイムノブロッティング実験
tssk1、2および3キナーゼおよびそれらの基質が精巣および/または成熟***中に存在するかどうか決定するため、組換えタンパク質に対する特異的抗体を作製する。別に、各cDNAの予想されるアミノ酸配列から設計される特異ペプチドに対する抗ペプチド抗体を作製する。作製された各抗体の特異性を、組換えtssk1、2および3に対して試験する。各タンパク質の特定のアミノ酸配列に対して設計された抗ペプチド抗体が特異的であると予想される。
免疫学的局在決定およびイムノブロッティング実験を行うため、ヒト***を健常なドナーから採取し、以前に記載されたようにPercoll(Pharmacia Biotech, Upsala, Sweden)密度勾配遠心分離を用い精製する(Naaby-Hansenら、Biol Reprd 1997; 56:771-787)。次いで、***を最終濃度2×107細胞/mlとなるよう再懸濁する。
***および異なる組織からの別の細胞型を遠心分離でペレット化し、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)1mlで洗浄し、メルカプトエタノールを含まないサンプル緩衝液(Laemmli, 1970)に再懸濁し、5分間煮沸する。遠心分離した後、上清を回収し、2−メルカプトエタノールを最終濃度5%となるように加え、5分間煮沸し、次いで、10%SDS−PAGEにかける。タンパク質濃度は、PierceのABCキットにより決定する。Immobilon Pへのタンパク質の電気泳動転移および免疫検出を、以前に記載されたように行う(Kalabら、Mol Reprod Dev. 1994 May;38(1):91-3)。ゲルを、銀またはクマジーブルーで染色するか、immobilon PVDF(Millipore)へ転移させ、抗組換え抗体で探索する。
tssk1、2および3の細胞内の局在を決定するため、可溶性の酵素に対する特異抗体をヒト精巣組織およびヒト***の免疫蛍光実験ならびに免疫電子顕微鏡検査に使用する。さらに、抗体がマウス抗原を認識する場合には、その局在を、マウス生殖細胞および***の免疫蛍光により調査する。
組換えtsskタンパク質の発現
多くのキナーゼが大腸菌内で活性分子として発現されている(Bodenbachら、1994; Letwinら、1992)。大腸菌には比較的単純で容易にスケールアップできるという利点がある。Tssk1、2、3の読み取り枠を増幅し、pET28bベクター(Novagen)中のHisタグと融合させる。そのプラスミドをBL21 DE3または他の適当な宿主株に形質転換する。組換えタンパク質産生は培養培地に最終濃度1mMとなるようIPTGを加えることにより誘導される。組換えタンパク質は、天然の条件下でNi−NTAカラムを用いて大腸菌溶解物から精製される。結晶形成の促進のため、高純度のタンパク質が最適である。上記のタンパク質調製物を精製するため、PrepCell(Bio−RAD)を使用する予備的な電気泳動を用いる。キナーゼアッセイを結晶化させる前に行う。
酵母ツー・ハイブリッドシステムにおけるtsksとのtssk2相互作用
tssk2とtsksとのタンパク質−タンパク質相互作用を実証するため、ツー・ハイブリッドシステムを用いた。この実験では、ベイト遺伝子(tssk2)を、最初にGAL4 DNA結合ドメイン(DNA−BD)に対する融合体としてレポーター株中に形質転換した。GAL4活性化ドメイン(AD)に対する融合体としてtsksを発現する第2のプラスミドもまたAH109レポーター株中に導入した。ウェスタンブロットを行い、酵母中での融合タンパク質の発現の確認を行った。tssk2とtsksとの相互作用により、ヒスチジン(HIS)遺伝子の転写が促進され、His不含培地で酵母が増殖し得ることが観察された。同様に、GAL4 DNA結合ドメインに融合されたp53を発現する第1の構築物およびGAL4活性化ドメイン(AD)に融合されたSV40ラージT抗原を発現する第2の構築物を酵母細胞に同時トランスフェクトすることにより、p53とSV40ラージT抗原とが相互作用し、His遺伝子活性化が促進されることが示された。この相互作用を陽性対照として使用した。対照的に、tssk2およびp53とDNA−BDとの融合タンパク質は、GAL−ADプラスミドを同時トランスフェクトしても増殖は促進されなかった。GAL−AD単独、またはGAL−ADとTSKSとの融合タンパク質またはGAL−ADとSV40ラージT抗原との融合タンパク質のいずれも、His遺伝子の転写を活性化する能力を有さなかった。この実験により、tssk2および基質tsksが相互作用し得ることが示され、これによりこれらのタンパク質のヒト相同体が、マウス対応物と同様の挙動を示すことが示唆される。
tssk1、2、3およびtssk基質の結晶構造の単離
2つの方針をtssk特異的阻害剤の合理的設計に利用する。第一に、ハイスループット・スクリーニングを両立するインビトロ・キナーゼアッセイを開発する。第二に、tsskキナーゼ単独の結晶構造またはその基質との複合体の結晶構造を得る。
tssk特異的キナーゼアッセイの開発
tsskファミリー用の特異的キナーゼアッセイの設計は、別の観点から利点がある。第一に、キナーゼアッセイにより、ATP、二価陽イオンおよび基質に対するKmなどのこれら酵素の動力学的な特徴づけが可能となる。第二に、活性酵素だけが結晶学的研究に適当であるため、キナーゼアッセイにより、組換えタンパク質の折りたたみを確認し得る。第三に、tssk特異的阻害剤のハイスループットスクリーニングに適当なキナーゼアッセイに対する基礎となる研究室規模でのインビトロキナーゼアッセイを開発するのに望ましい。
それぞれのヒトtsskキナーゼのORFをpCMV−HAエピトープタグ付き哺乳類発現ベクター(Clontech cat#K6003-1)中にサブクローニングする。同様に、tssk基質のORFをpCMV−Myc哺乳類発現ベクター(Clontech、上記と同じ)にサブクローニングする。それぞれ3つのHA−キナーゼを、ヒトtsskの各3種それぞれについてのCOS細胞系でcMyc−tssk基質と共に共発現させる。共発現は、それぞれの抗タグ抗体を用いた免疫蛍光を行うことによって確認される。HAおよびHycに対する抗体はClontechから入手できる。抗c−Mycはマウスモノクローナルであり、抗HAはウサギポリクローナルであるため、キナーゼと基質の両方が同じ細胞中で共発現されているかどうか分析することができる。
それぞれ精製した酵素を、種々の濃度のATP(10μM、100μMおよび1mM)、Mg2+またはMn2+(100μM、1mMおよび10mM)、1μCiの[γ32P]ATP、および種々の濃度の精製tssk基質(1、10および100ng/アッセイ)と混合する。リン酸化は、SDS−PAGE分離およびオートラジオグラフィーにより評価する。このタンパク質が正確に折りたたまれている場合には、その基質のリン酸化は、この方法で容易に検出されると期待される。
tssk抗体の作製
精製tssk2およびtsksを使用し、ラットポリクローナル抗体を作製した。組換えヒトtssk1、2および3ならびにヒトtssk基質に対する抗血清を用いて、タンパク質レベルの組織分布および細胞内局在を決定する。ラット抗tssk抗体および抗tsks抗体は、組換えタンパク質を認識し、***および精巣中で予想されるMWのタンパク質をも認識したことから、tsskファミリーの少なくとも1つのメンバーおよびその基質(tsks)が***中に存在することが示唆される。次いで、これらの抗体を用いて、受精能を獲得したヒト***中のこれらタンパク質の細胞内局在を研究した。Tssk2は、ヒト***の赤道部分に局在することが観察された。tsksもまた赤道部分に局在した。それにも拘わらず、抗tsks抗体は、前頭および尾に存在するタンパク質をも認識する。これら分子の免疫学的局在決定により、tssk2およびtsksがヒト***群の少なくとも1区画で***の類似領域中に存在することが示唆される。対照実験は、各抗体のラット免疫前血清を用いて行った。ウェスタンブロットおよび免疫蛍光の両方は陰性であった。tssk2に対する抗体はtssk2に対して作製されたが、配列に高い相同性があるためこの抗体がtsskファミリーの他のメンバーを認識したことは否定しきれない。しかしながら、3つのtsskイソ酵素間の識別は、tssk1と2の間で相違し、tssk3中には存在しないC末端ドメインに対する抗体を作製することにより可能となり得る。
リアルタイムRT−PCR分析
最初のストランドcDNAを、製造業者から提供された反応バッファーを用いた100μl反応液中の1μMオリゴd(T)プライマー(Ambion、オースティン、テキサス州)およびOmniscript逆転写酵素 (Qiagen、アラメダ、カルフォルニア州)を用いてヒト精巣由来の全RNA5μg(Ambion、オースティン、テキサス州)から調製した。リアルタイムRT−PCRをBio−Rad(Hercules、カルフォルニア州) i−サイクラーIQシステムを用いて実施した。プライマー対は、2μlの精巣cDNA、10μlのIQ SYBR Green supermix(BioRad)および各プライマーの10μMストック溶液0.6μl(最終濃度0.3μM)を含む20μlのPCR反応液中にて確認された。サイクルの条件は、95℃で3分間、続いて95℃で10秒間および60℃で30秒間を45サイクルであった。増幅の後、そのPCR産物を95℃で1分間変性させ、72℃で10秒間アニーリングさせる融解曲線分析を行った。次いで、SYBRグリーンの蛍光の消失をモニターしながら温度を0.1℃刻みで上昇させた。各プライマー対は、予想されたPCR産物の推測Tm値と一致した温度で鋭い融解ピークを有する単一の産物を増幅した。アガロースゲル電気泳動により増幅産物は期待されたサイズであることが確認された。逆転写酵素をcDNA合成反応から除いた場合には、産物は得られなかった。
Tssk4のインシトゥ局在およびノーザンブロット分析
インシトゥ分析
インシトゥハイブリダイゼーションにて用いるプローブをハツカネズミ(Mus musculus)セリン/トレオニンプロテインキナーゼSSTK(Sstk−保留)、mRNA NM 032004(配列番号:35)から調製した。増幅された領域は(配列番号:36)の320〜714の範囲の394塩基対のコード配列領域である。フォワードプライマーは、配列tcg agt tca tcg aag tgt gc (配列番号:37)であり、リバースプライマーは、配列ggt gac cat gac gta gag ca (配列番号:38)であった。
鋳型は、マウス精巣cDNAファーストストランドキット(Invitrogen)を含み、成分はPCR反応に用いた成分およびそれらの濃度は以下の通りである:
PCRプログラム:
1 94°C 1分
2 92°C 30秒
3 66°C 30秒
4 72°C 2分
5 2に戻る、33×
6 72°C 10分
7 4°C
6時間のBouin固定およびパラフィン包埋されたマウス精巣を4μmの薄片に切断した。Pro Taqs Clear Intermedium(Quartett GmbH、ベルリン、ドイツ)にて脱パラフィンし、エタノール勾配溶液の系列に通じて再水和させた後に、組織を室温にて0.2N HCl中で20分間インキュベートし、次いで2×SSC中70℃で15分間インキュベートした。このスライドを室温にて5分間PBS中で洗浄した。その後、プロテイナーゼK(2μg/ml最終濃度)で37℃にて10分間部分消化した。0.2%(w/v)グリシン中で4℃にて10分間インキュベートし、4℃で5分間4%パラホルムアルデヒド(PBS中)を用いて後固定した後、この薄片をPBSにて室温で2回洗浄した。
Claims (15)
- tsskキナーゼ活性のアンタゴニストを同定する方法であって、標識化されたリン酸供給源、tssk基質およびtssk4キナーゼを含むインビトロ・キナーゼアッセイ組成物を提供し、該組成物を候補阻害化合物と接触させて試験アッセイ組成物を形成させ、その試験アッセイ組成物をキナーゼ活性が発揮される条件のもとでキナーゼ阻害物質の非存在下でインキュベートし;そして、tsskキナーゼ活性を低下させる化合物を同定する方法。
- 標識化されたリン酸供給源が[32P]ATPであるところの、請求項1記載の方法。
- tssk基質が配列番号:8記載のアミノ酸配列を含むところの、請求項2記載の方法。
- キナーゼアッセイ組成物が、tssk1、tssk2およびtssk3から成る群から選択されるtsskキナーゼをさらに含むところの、請求項1記載の方法。
- 標識化されたリン酸供給源、tssk基質およびtssk4キナーゼを含むインビトロ・キナーゼアッセイ組成物をキナーゼ活性が発揮される条件の下でインキュベートする第2の反応を実施する工程、および生成された標識化tssk基質の量と試験アッセイ組成物により生成された標識化tssk基質の量とを比較する工程をさらに含む、請求項1記載の方法。
- 候補化合物を、候補化合物、標識化されたリン酸供給源、キナーゼ基質および非tsskキナーゼを含む対照組成物と接触させる第2の反応を実施する工程、および候補合物が非tsskキナーゼ活性を低下させるかどうかを決定する工程をさらに含む、請求項1記載の方法。
- 雄の哺乳動物種の受精能力を低下させる方法であって、tssk4キナーゼ活性の阻害剤を含む組成物を投与する工程を含む方法。
- 配列番号:19記載の核酸配列と操作可能に連結された非天然プロモーターを含む、組換えヒトtssk遺伝子構築物。
- 請求項8記載の構築物を含むトランスジェニック細胞。
- 配列番号:20記載のポリペプチドと結合する抗体。
- 抗体が配列番号:4〜6記載のペプチド配列と結合しないところの、請求項10記載の抗体。
- 抗体がモノクローナル抗体であるところの、請求項10記載の抗体。
- 潜在的なヒト治療物質をスクリーニングする方法であって、配列番号:20および配列番号:20の生物活性のある断片から成る群から選択されるtsskポリペプチドを生理学的条件下で候補化合物と接触させ;
結合しなかった物質および非特異的に結合した物質を取り除くためにtsskポリペプチドを洗浄し;そして
tsskポリペプチドと引き続き結合している化合物を単離することを含む方法。 - tsskポリペプチドが固層表面に固定化され、候補物が標識化されているところの、請求項13記載の方法。
- 候補化合物が他のキナーゼポリペプチドと比較して、tsskポリペプチドと選択的に結合するかどうかを決定する工程をさらに含む、請求項13記載の方法。
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