JP2007500505A - 細胞の培養及び増殖方法 - Google Patents
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Abstract
Description
国際特許第WO01/19972号には、細胞培養物をポリマー前駆体と結合し、その後ポリマーの架橋によって固定化する、固定化プロセスが記載されている。
上記で定義した問題は、独立請求項の特徴によって解決される。好ましい実施形態は、従属項(subclaims)に記載されている特徴との組合せから導かれる。
−培地の移動による(例えばピストン、圧、ポンプ等によって)基質/カートリッジを通過する培地の流れ、
−培地内での基質/カートリッジの移動、
−対応するラインを通しての培地と基質/カートリッジの移動(例えば静水圧によって)
によって実現できる。
a)i)基本的に互いの上層に配置された少なくとも2つの多孔性材料層であって、その層の間にフロースルー可能な空間が存在する前記材料層、又は
ii)その形状を維持しながら、それ自体が巻き上げられた又は互いの上層にある材料層の少なくとも2つの断面の間にフロースルー可能な空間が存在するように配置された、少なくとも1つの多孔性材料層、
を含む、層状構造を有する炭素ベースの支持体/基質を提供すること及び
b)前記支持体に、生存している及び/又は増殖することができる生物材料を負荷すること、
c)前記負荷した支持体を液体培地と接触させること
を含む、細胞を培養するための方法に関する。
i)基本的に互いの上層に配置された少なくとも2つの多孔性材料層であって、その層の間にフロースルー可能な空間が存在する前記材料層、又は
ii)その形状を維持しながら、それ自体が巻き上げられた又は互いの上層にある材料層の少なくとも2つの断面の間にフロースルー可能な空間が存在するように配置された、少なくとも1つの多孔性材料層、
を含み、生存している(生存可能な)及び/又は増殖することができる(繁殖可能な)固定化された生物材料を含む、層状構造を有する多孔性炭素ベースの支持体/基質を包含する。
支持体/基質
本発明の炭素ベースの支持体/基質は、細胞培養物又は細胞のための支持体/基質材料として使用するとき、優れた生体適合性を有する。それらは、毒性放出がなく、寸法安定性を有し、設計に関して、例えば孔径、内部構造及び外部形状に関して極めて融通性が効く。
さらに、材料層はまた、交互に異なる深さの溝エンボス化又はプリーツ化及び/又は波形が材料層上に提供され、溝構造、波形構造又はプリーツ構造の交差端の点における隣接材料層の間の接触点の数が、使用可能な溝の縁の総数に比べて全体として適切に少なくなるように、異なる高さの個々の溝縁の上昇を導くように距離をおいて配置しうる。これらの点で材料層を連結することにより、支持体/基質の適切な強度が確保され、良好な流動抵抗が確保される。
本発明に従った方法により、支持体/基質に生存可能及び/又は増殖可能な生物材料を負荷する。生物材料は、好ましくは単細胞又は多細胞微生物、真菌、胞子、ウイルス、植物細胞、細胞培養又は組織又は動物又はヒト細胞、細胞培養物又は組織、又はそれらの混合物を含む。負荷は、好ましくは生物材料の広汎な固定化を導く。
本発明の方法は、好ましくは、生物材料の負荷前又は負荷後に適切なハウジング、容器又は反応器又は反応器システムに導入される1つ(又はそれ以上)の基質によって実施される。当該基質を、好ましくは、ハウジング、容器又は反応器及び/又は反応器システムを少なくとも部分的に満たすことによってハウジング、容器又は反応器又は反応器システム中で液体培地と接触させる。
本発明によれば、基質は、従来のバイオリアクターシステム、例えば連続的な調節技術を伴わない受動的システム、例えば組織プレート、組織ボトル、ローラーボトル並びにガスの注入及びパラメータ(酸性度、温度)の自動調節を伴う能動的システム、すなわち最も広い意味で測定及び制御テクノロジーを備えた反応器システム、における培養に使用しうる。
(実施例)
表面積対容積比1700m2/m3、自由流動横断面0.6m2/m3;開放構造及び20mmのフローチャネル長の故に、実験条件下で材料を通過する水の流れにおいて測定可能な圧低下は検出できなかった。
細胞培養システムのための支持体/基質材料としての意図する適用のために、天然繊維を含み、100g/m2の重量及び110μmの乾燥層厚さを有するポリマー複合体を、長さ300mm、幅150mm及び高さ50mmの寸法を有する支持体に成形し、その形態で接着させた。これは、平らな材料の波形とこれらの単層波形構造の積層により、3mmの平均チャネル径を有するフローチャネルを生成し、次にそれらを各々90°に分枝して、放射状に閉じたフローチャネルを生成した。これらの成形体を、多孔度を調節するために末端に向けて空気を添加しながら、窒素雰囲気中800℃で48時間炭化した。61重量%の重量損失が起こった。生じた材料は、水中で7.4のpH及び弱酸の緩衝範囲を有していた。
表面積対容積比1700m2/m3、自由流動横断面0.6m2/m3;開放構造及び20mmのフローチャネル長の故に、実験条件下で支持体/基質を通過する水の流れにおいて測定可能な圧低下は検出できなかった。
支持体/基質を伴う試料は、細胞の自発的な定量的固定化を示し(それまでの混濁上清が約4時間後に透明になった)、その後懸濁液の混濁は検出できなかった。7日間のインキュベーション時間内に、細胞密度は7倍の1.8×107細胞/mLに上昇していた。MAB産生は、最初の50μg/mLから、タンパク質分解の徴候を伴わずに350μL/mLの平均培養寿命に上昇した。25日後に、12の試料のうち12がまだ生存可能であり、その後実験を終了した。これは、本発明の基質が、より高い細胞密度にもかかわらず、接触阻害の中断を導くことを示す。凍結保存と解凍後であっても、新鮮培養培地の添加後自発的にMAB産生が再開した。
表面積対容積比2500m2/m3、自由流動横断面0.3m2/m3;開放構造及び20mmのフローチャネル長の故に、実験条件下で支持体/基質を通過する水の流れにおいて測定可能な圧低下は検出できなかった。
Claims (27)
- 以下の工程、
a)i)基本的に互いの上層に配置された少なくとも2つの多孔性材料層であって、その層の間にフロースルー可能な空間が存在する前記材料層、又は
ii)その形状を維持しながら、それ自体が巻き上げられた、又は互いの上層にある材料層の少なくとも2つの断面の間にフロースルー可能な空間が存在するように配置された、少なくとも1つの多孔性材料層、
を含む、層状構造を有する炭素ベースの支持体を提供すること及び
b)前記支持体に、生存している及び/又は増殖することができる生物材料を負荷すること、
c)前記負荷した支持体を液体培地と接触させること
を含む、細胞を培養するための方法。 - 前記支持体が多数の材料層を含むこと、及び各々が互いの上層に配置された2つの材料層の間に少なくとも1つの空間が存在することを特徴とする、請求項1に記載の方法。
- 各々2つの材料層の間の又は1つの巻き上げられた材料層の各々2つの断面の間の空間が、基本的に互いに平行して走る多数のチャネルを有することを特徴とする、請求項1又は2に記載の方法。
- 各々基本的に互いに平行して配置されたチャネルが、約1nm〜約1m、特に約1nm〜約10cm、好ましくは10nm〜10mm、および特に好ましくは50nm〜1mmの範囲内の平均チャネル直径を有することを特徴とする、請求項3に記載の方法。
- 前記支持体が、互いに対して交互に角度的に分枝された(angularly offset)チャネル層を示すように、各々第一と第二材料層の間のチャネルが、前記第二材料層と第三材料層の間の隣接層内のチャネルに対して、0°以上90°まで、好ましくは30〜90°、および特に好ましくは45〜90°の角度で、角度分枝して配置されていることを特徴とする、請求項3又は4のいずれか一項に記載の方法。
- 基本的に平行に走るチャネルが、層内で線状、波状、曲がりくねっている又はジグザグであることを特徴とする、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
- 前記多孔性材料層及び/又はチャネル壁が、約1nm〜10cm、好ましくは10nm〜10mm、および特に好ましくは50nm〜1mmの範囲内の平均孔径を有することを特徴とする、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
- 多孔性支持体として、繊維、紙、織物又は高分子材料に基づく、場合により構造化された、巻き上げられた、エンボス加工した、前処理した及び/又は折りたたんだシート材料の炭化によって生産されるモジュラー構造を使用することを特徴とする、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
- 前記生物材料が、単細胞又は多細胞微生物、真菌、酵母、胞子、植物細胞、細胞培養又は組織又は動物及び/又はヒト細胞、細胞培養物又は組織、又はそれらの混合物から選択されることを特徴とする、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
- 前記支持体の負荷が、支持体内及び/又は支持体上への実質的に広汎な前記生物材料の固定化を導くことを特徴とする、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
- 前記培地が、液体又は気体、溶媒、水、気体又は液体又は固体反応抽出物及び/又は生成物、酵素、細胞及び組織のための液体培養培地、それらの混合物等から選択されることを特徴とする、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
- 前記支持体が、化学又は生物反応のための反応器、例えばフラスコ、ボトル、特に細胞培養ボトル、ローラーボトル、スピナー(spinner)ボトル、培養チューブ、細胞培養チャンバー、細胞培養ディッシュ、培養プレート、ピペットキャップ、スナップカバーガラス、クライオチューブ、攪拌式反応器、固定床反応器、管型反応器等、から選択されるハウジング内あるいは適切な容器内又は容器上に配置されることを特徴とする、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
- 前記支持体を、前記容器を少なくとも部分的に満たすことによって前記液体培地と接触させることを特徴とする、請求項12に記載の方法。
- 前記支持体を容器内の培地中で動かすことを特徴とする、請求項13に記載の方法。
- 前記容器が、フィード機構によって培地で満たされた供給容器に連結されていること、及び場合により、培地が連続的に又は断続的に容器内へと及び容器内を通って通過するための除去機構も備えられていることを特徴とする、請求項12又は13に記載の方法。
- 液体培地が、場合により容器内に液浸されている、支持体を通って連続的に又は断続的に流れることを特徴とする、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
- 支持体を通る液体培地の流れが、支持体を培地中で動かすことによって達成されることを特徴とする、請求項16に記載の方法。
- 支持体を通る液体培地の流れが、支持体内で培地を移動させることによって達成される、請求項16に記載の方法。
- 連続的に又は断続的に、栄養素が前記培地と共に供給される及び/又は代謝産物が前記培地と共に除去されることを特徴とする、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
- 生存している及び/又は増殖することができる固定化された生物材料を含む、前記請求項のいずれか一項に記載の多孔性炭素ベースの支持体。
- 前記生物材料が、単細胞又は多細胞微生物、酵母、真菌、胞子、植物細胞、細胞培養物又は組織又は動物及び/又はヒト細胞、細胞培養物又は組織、又はそれらの混合物から選択されることを特徴とする、請求項20に記載の支持体。
- 活性炭、焼結活性炭、無定形、結晶性又は部分結晶性炭素、黒鉛、熱分解性炭素質材料、炭素繊維又は炭化物、カルボニトリド、金属又は非金属のオキシカーバイド及び/又はオキシカルボニトリド並びにそれらの混合物を含む、請求項20又は21に記載の支持体。
- 負荷した支持体の総重量に基づき、10-5重量%〜99重量%、好ましくは10-2重量%〜80重量%、最も好ましくは1重量%〜50重量%の細胞を含むことを特徴とする、請求項20から22のいずれか一項に記載の支持体。
- 請求項20から23に記載の1又はそれ以上の支持体を含む、細胞を培養するための反応器。
- 化学又は生物反応のための反応器、例えばフラスコ、ボトル、特に細胞培養フラスコ、ローラーボトル、スピナーボトル、培養チューブ、細胞培養チャンバー、細胞培養ディッシュ、培養プレート、ピペットキャップ、スナップカバーガラス、クライオチューブ、攪拌式反応器、固定床反応器及び管型反応器から選択される、請求項24に記載の反応器。
- 請求項20から23のいずれか一項に記載の支持体を含むローラーボトル。
- ハウジング内に請求項20から26のいずれか一項に記載の支持体を含むカートリッジ。
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