JP2007319121A - Method for detecting and typing human papilloma virus - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、試料中のヒトパピローマウイルスの検出及びタイピングを実施するためのオリゴヌクレオチドおよびそのキットに関する。 The present invention relates to oligonucleotides and kits for detecting and typing human papillomavirus in a sample.
ヒトパピローマウイルス(HPV)は子宮頸癌またはその前癌病変から高率(90%以上)に検出される。HPVはこれまで80以上の遺伝子型が報告されているが、その中で産婦人科領域で感染が確認される型は30種程度であり、さらに癌化のリスクによりグループ化される。したがって、頸部スワブ等の臨床検体からHPVを検出しタイピングすることによりリスクを予測することは非常に重要である。 Human papillomavirus (HPV) is detected at a high rate (> 90%) from cervical cancer or its precancerous lesions. Up to now, more than 80 genotypes have been reported for HPV. Among them, about 30 types are confirmed to be infected in the field of obstetrics and gynecology, and they are further grouped according to the risk of canceration. Therefore, it is very important to predict risk by detecting and typing HPV from clinical specimens such as cervical swabs.
従来のHPV検出及びタイピング法としてはハイブリッド・キャプチャー法、PCR-RFLP法、ラインプローブ法、DNAアレイ法などが知られているが、感度が低かったり、操作が煩雑であるといった問題点があった。 Conventional HPV detection and typing methods such as the hybrid capture method, PCR-RFLP method, line probe method, and DNA array method are known, but there are problems such as low sensitivity and complicated operation. .
本発明の目的は、上記のような課題を解決して、明確かつ再現性よく試料中のHPVを検出し、必要に応じてタイピングするためのオリゴヌクレオチドまたは試薬キットを提供することである。 An object of the present invention is to solve the above-described problems and provide an oligonucleotide or a reagent kit for detecting HPV in a sample clearly and reproducibly and typing it as necessary.
本発明者らは、上記事情に鑑み、鋭意研究の結果、特定のプライマーセットにより試料中のHPV配列を効率よく増幅させることでHPVの検出を行い、それぞれの増幅産物中のわずかな配列的特徴を認識可能なタイピング用プローブセットを開発することで本発明を完成させるに至った。
すなわち、本発明は以下のような構成からなる。
In light of the above circumstances, the present inventors have conducted extensive research to detect HPV by efficiently amplifying an HPV sequence in a sample using a specific primer set, and to detect slight sequence characteristics in each amplification product. The present invention has been completed by developing a typing probe set capable of recognizing.
That is, the present invention has the following configuration.
項１. フォワードプライマーとして配列番号１で示される塩基配列の連続する１８〜２４塩基及び配列番号２から７の中から選択される一つ以上の塩基配列の連続する１８〜２４塩基を有するオリゴヌクレオチド、リバースプライマーとして配列番号８で示される塩基配列の連続する１６から２１塩基及び配列番号９から１５の中から選択される一つ以上の塩基配列の連続する１６から２１塩基を有するオリゴヌクレオチドを組み合わせて使用することを特徴とするヒトパピローマウイルス核酸増幅用プライマーセット。
項２. フォワードプライマーとして配列番号１で示される塩基配列の連続する１８〜２４塩基及び配列番号２から７の塩基配列の連続する１８〜２４塩基を有するオリゴヌクレオチド、リバースプライマーとして配列番号８で示される塩基配列の連続する１６から２１塩基及び配列番号９から１５の塩基配列の連続する１６から２１塩基を有するオリゴヌクレオチドを組み合わせて使用することを特徴とするヒトパピローマウイルス核酸増幅用プライマーセット。
項３. フォワードプライマーとして配列番号１及び配列番号２から７の一つ以上、リバースプライマーとして配列番号８及び配列番号９から１５の一つ以上を組み合わせて使用することを特徴とするヒトパピローマウイルス核酸増幅用プライマーセット。
項４. フォワードプライマーとして配列番号１から７のオリゴヌクレオチド、リバースプライマーとして配列番号８から１５のオリゴヌクレオチドを使用することを特徴とするヒトパピローマウイルス核酸増幅用プライマーセット。
項５. 項１〜４に記載のプライマーセットに由来する増幅反応が進行したか否かによって存在の有無を決定する試料中のヒトパピローマウイルスの検出方法。
項６. 配列番号４３で示される塩基配列の連続する１８〜２５塩基及び配列番号４４で示される塩基配列の連続する１９〜２７塩基を有するオリゴヌクレオチドプライマーを含む項１〜４のプライマーセット。
項７. 配列番号４３で示される塩基配列及び配列番号４４で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドプライマーを含む項１〜４のプライマーセット。
項８. 項１〜４に記載のプライマーセットに由来する増幅反応が進行したか否かによって試料中のヒトパピローマウイルスの存在の有無を決定するにあたり、存在が否定された場合に配列番号４３で示される塩基配列及び配列番号４４で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドプライマーに由来する増幅産物を検出することで反応液中の増幅反応の進行を保証する試料中のヒトパピローマウイルスの検出方法。
項９. 核酸を増幅させる方法が、ＰＣＲ、ＮＡＳＢＡ、ＬＣＲ、ＳＤＡ、ＲＣＲおよびＴＭＡからなる群から選ばれたいずれかの方法である項１〜８に記載の方法。
項１０. 項１〜４記載のオリゴヌクレオチドプライマーセットと、各増幅産物特異配列に実質的に相補的あるいは相同的配列を有するオリゴヌクレオチドプローブを用いて解析する工程を含む、試料中のヒトパピローマウイルスをタイピングする方法。
項１１. オリゴヌクレオチドプローブが配列番号１６から４１で示される塩基配列の連続する１４から全長の長さを有するオリゴヌクレオチドから一つ以上選択される項１０記載の試料中のヒトパピローマウイルスをタイピングする方法。
項１２. オリゴヌクレオチドプローブが配列番号１６から４１で示される塩基配列の連続する１４から全長の長さを有するオリゴヌクレオチドセットである項１０記載の試料中のヒトパピローマウイルスをタイピングする方法。
項１３. オリゴヌクレオチドプローブが配列番号１６から４１で示される塩基配列のオリゴヌクレオチドから一つ以上選択される項１０記載の試料中のヒトパピローマウイルスをタイピングする方法。
項１４. オリゴヌクレオチドプローブが配列番号１６から４１で示される塩基配列のオリゴヌクレオチドセットである項１０記載の試料中のヒトパピローマウイルスをタイピングする方法。
項１５. 配列番号４３および４４で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドプライマーセットおよび配列番号４２で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドプローブを含む項１０〜１４記載の試料中のヒトパピローマウイルスをタイピングする方法。
項１６. オリゴヌクレオチドプライマーおよび／またはオリゴヌクレオチドプローブが標識されているか、水不溶性単体に固定されていることを特徴とする項１０〜１５記載の試料中のヒトパピローマウイルスをタイピングする方法。
項１７. 標識が、蛍光化学物質、発光団、酵素、蛍光蛋白質、発光蛋白質、磁性体、導電性物質、ビオチン、ハプテン、抗原、抗体よりなる群から選ばれたいずれかである項１６記載の試料中のヒトパピローマウイルスをタイピングする方法。
項１８. 項１〜４に記載のプライマーセットに由来する増幅反応が進行したか否かによって存在の有無を決定する試料中のヒトパピローマウイルスを検出するためのキット。
項１９. 項１〜４に記載のプライマーセットに由来する増幅反応が進行したか否かによって試料中のヒトパピローマウイルスの存在の有無を決定するにあたり、存在が否定された場合に配列番号４３で示される塩基配列及び配列番号４４で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドプライマーに由来する増幅産物を検出することで反応液中の増幅反応の進行を保証する試料中のヒトパピローマウイルスを検出するためキット。
項２０. 項１〜４記載のオリゴヌクレオチドプライマーセットと、各増幅産物特異配列に実質的に相補的あるいは相同的配列を有するオリゴヌクレオチドプローブを用いて解析する工程を含む、試料中のヒトパピローマウイルスをタイピングするためのキット。
項２１. オリゴヌクレオチドプローブが配列番号１６から４１で示される塩基配列の連続する１４から全長の長さを有するオリゴヌクレオチドから一つ以上選択される項２０記載の試料中のヒトパピローマウイルスをタイピングするためのキット。
項２２. オリゴヌクレオチドプローブが配列番号１６から４１で示される塩基配列の連続する１４から全長の長さを有するオリゴヌクレオチドセットである項２０記載の試料中のヒトパピローマウイルスをタイピングするためのキット。
項２３. オリゴヌクレオチドプローブが配列番号１６から４１で示される塩基配列のオリゴヌクレオチドから一つ以上選択される項２０記載の試料中のヒトパピローマウイルスをタイピングするためのキット。
項２４. オリゴヌクレオチドプローブが配列番号１６から４１で示される塩基配列のオリゴヌクレオチドセットである項２０記載の試料中のヒトパピローマウイルスをタイピングするためのキット。
項２５. 配列番号４３および４４で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドプライマーセットおよび配列番号４２で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドプローブを含む項２０〜２４記載の試料中のヒトパピローマウイルスをタイピングする方法。
項２６. オリゴヌクレオチドプライマーおよび／またはオリゴヌクレオチドプローブが標識されているか、水不溶性単体に固定されていることを特徴とする項２０〜２５記載の試料中のヒトパピローマウイルスをタイピングするためのキット。
項２７. 標識が、蛍光化学物質、発光団、酵素、蛍光蛋白質、発光蛋白質、磁性体、導電性物質、ビオチン、ハプテン、抗原、抗体よりなる群から選ばれたいずれかである項２６記載の試料中のヒトパピローマウイルスをタイピングするためのキット。
Item 1. An oligonucleotide having 18 to 24 bases of the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 and 18 to 24 bases of one or more base sequences selected from SEQ ID NOs: 2 to 7 as a forward primer A combination of oligonucleotides having 16 to 21 consecutive bases of one or more base sequences selected from SEQ ID NOs: 9 to 15 and 16 to 21 consecutive bases of SEQ ID NO: 8 as reverse primers A primer set for amplifying human papillomavirus nucleic acid.
Item 2. An oligonucleotide having 18 to 24 bases of the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 as a forward primer and 18 to 24 bases of a base sequence of SEQ ID NOs: 2 to 7, and represented by SEQ ID NO: 8 as a reverse primer A primer set for amplifying a human papillomavirus nucleic acid, comprising a combination of oligonucleotides having a continuous base sequence of 16 to 21 bases and a base sequence of SEQ ID NOs: 9 to 15 of 16 to 21 bases.
Item 3. Human papillomavirus nucleic acid amplification characterized by using one or more of SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2 to 7 as a forward primer and one or more of SEQ ID NO: 8 and SEQ ID NO: 9 to 15 as a reverse primer in combination. Primer set.
Item 4. A human papillomavirus nucleic acid amplification primer set comprising the oligonucleotides of SEQ ID NOs: 1 to 7 as forward primers and the oligonucleotides of SEQ ID NOs: 8 to 15 as reverse primers.
Item 5. A method for detecting human papillomavirus in a sample, the presence or absence of which is determined by whether or not the amplification reaction derived from the primer set according to Items 1 to 4 has progressed.
Item 6. The primer set according to Items 1 to 4, comprising an oligonucleotide primer having 18 to 25 contiguous base sequences of SEQ ID NO: 43 and 19 to 27 contiguous base sequences of SEQ ID NO: 44.
Item 7. The primer set according to Items 1 to 4, comprising an oligonucleotide primer having the base sequence represented by SEQ ID NO: 43 and the base sequence represented by SEQ ID NO: 44.
Item 8. When determining the presence or absence of human papillomavirus in the sample based on whether or not the amplification reaction derived from the primer set according to Items 1 to 4 has progressed, And a method for detecting human papilloma virus in a sample that guarantees the progress of an amplification reaction in a reaction solution by detecting an amplification product derived from an oligonucleotide primer having a base sequence represented by SEQ ID NO: 44.
Item 9. The method according to Item 1 to 8, wherein the method for amplifying a nucleic acid is any method selected from the group consisting of PCR, NASBA, LCR, SDA, RCR and TMA.
Item 10. A human papilloma virus in a sample, comprising the step of analyzing using the oligonucleotide primer set according to Item 1-4 and an oligonucleotide probe having a sequence substantially complementary or homologous to each amplification product-specific sequence. How to type.
Item 11. A method for typing human papillomavirus in a sample according to Item 10, wherein the oligonucleotide probe is selected from one or more oligonucleotides having a full length from 14 consecutive base sequences represented by SEQ ID NOs: 16 to 41 .
Item 12. The method of typing human papillomavirus in a sample according to Item 10, wherein the oligonucleotide probe is an oligonucleotide set having a length from 14 to the full length of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NOs: 16 to 41.
Item 13. A method for typing human papillomavirus in a sample according to Item 10, wherein the oligonucleotide probe is one or more selected from oligonucleotides having the nucleotide sequences represented by SEQ ID NOs: 16 to 41.
Item 14. A method for typing human papillomavirus in a sample according to Item 10, wherein the oligonucleotide probe is an oligonucleotide set having the nucleotide sequences represented by SEQ ID NOs: 16 to 41.
Item 15. A method for typing human papillomavirus in a sample according to Item 10-14, comprising an oligonucleotide primer set having the nucleotide sequence represented by SEQ ID NOs: 43 and 44 and an oligonucleotide probe having the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 42 .
Item 16. The method for typing human papillomavirus in a sample according to Item 10-15, wherein the oligonucleotide primer and / or oligonucleotide probe is labeled or fixed to a water-insoluble simple substance.
Item 17. The item 16, wherein the label is selected from the group consisting of a fluorescent chemical substance, a luminophore, an enzyme, a fluorescent protein, a photoprotein, a magnetic substance, a conductive substance, biotin, a hapten, an antigen, and an antibody. A method for typing human papillomavirus in a sample.
Item 18. A kit for detecting human papillomavirus in a sample, the presence or absence of which is determined based on whether or not the amplification reaction derived from the primer set according to Items 1 to 4 has progressed.
Item 19. In determining the presence or absence of human papillomavirus in a sample based on whether or not the amplification reaction derived from the primer set according to Items 1 to 4 has progressed, A kit for detecting human papillomavirus in a sample that assures the progress of an amplification reaction in a reaction solution by detecting an amplification product derived from an oligonucleotide primer having the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 44 and the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 44.
Item 20. A human papillomavirus in a sample, comprising the step of analyzing using the oligonucleotide primer set according to Item 1-4 and an oligonucleotide probe having a sequence substantially complementary or homologous to each amplification product-specific sequence. Kit for typing.
Item 21. To type human papillomavirus in a sample according to item 20, wherein the oligonucleotide probe is selected from one or more oligonucleotides having a full length from 14 consecutive base sequences represented by SEQ ID NOs: 16 to 41 Kit.
Item 22. A kit for typing human papillomavirus in a sample according to Item 20, wherein the oligonucleotide probe is an oligonucleotide set having a length from 14 to the full length of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NOs: 16 to 41.
Item 23. A kit for typing human papillomavirus in a sample according to Item 20, wherein the oligonucleotide probe is selected from one or more oligonucleotides having the nucleotide sequences represented by SEQ ID NOs: 16 to 41.
Item 24. A kit for typing human papillomavirus in a sample according to Item 20, wherein the oligonucleotide probe is an oligonucleotide set having the nucleotide sequences represented by SEQ ID NOs: 16 to 41.
Item 25. A method for typing human papillomavirus in a sample according to Items 20 to 24, comprising an oligonucleotide primer set having the nucleotide sequence represented by SEQ ID NOs: 43 and 44 and an oligonucleotide probe having the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 42 .
Item 26. The kit for typing human papillomavirus in a sample according to any one of Items 20 to 25, wherein the oligonucleotide primer and / or the oligonucleotide probe is labeled or fixed to a water-insoluble simple substance.
Item 27. The item 26, wherein the label is any one selected from the group consisting of a fluorescent chemical substance, a luminophore, an enzyme, a fluorescent protein, a photoprotein, a magnetic substance, a conductive substance, biotin, a hapten, an antigen, and an antibody. A kit for typing human papillomavirus in a sample.
本発明により、明確かつ再現性よく試料中のHPVを検出し、必要に応じてタイピングすることができるオリゴヌクレオチドおよびキットが提供される。 The present invention provides oligonucleotides and kits that can detect HPV in a sample clearly and reproducibly and can be typed as needed.
以下、本発明を詳細に説明する。試料中のHPVを増幅させるためのフォワードプライマーとしては上述のように配列表の配列番号１で示される塩基配列の連続する１８ないし２４塩基及び配列番号２から７の中から選択される一つ以上の塩基配列の連続する１８ないし２４塩基を有するオリゴヌクレオチドからなり、好ましくは配列番号１から７で示される塩基配列の連続する２４塩基である。 Hereinafter, the present invention will be described in detail. As a forward primer for amplifying HPV in a sample, as described above, one or more selected from 18 to 24 bases of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing and SEQ ID NOs: 2 to 7 The base sequence is an oligonucleotide having 18 to 24 bases, preferably 24 bases having the base sequence represented by SEQ ID NOs: 1 to 7.
同じく、リバースプライマーとしては配列番号８で示される塩基配列の連続する１６ないし２１塩基及び配列番号９から１５の中から選択される一つ以上の塩基配列の連続する１６ないし２１塩基を有するオリゴヌクレオチドからなり、好ましくは配列番号８から１５で示される塩基配列の連続する２１塩基である。 Similarly, the reverse primer is an oligonucleotide having 16 to 21 consecutive bases of the base sequence represented by SEQ ID NO: 8 and 16 to 21 consecutive bases of one or more base sequences selected from SEQ ID NOs: 9 to 15 Preferably, there are 21 consecutive bases of the base sequence represented by SEQ ID NOs: 8 to 15.
フォワードプライマー、リバースプライマーともにそれぞれ配列番号１、配列番号８で示される塩基配列以外に一つ以上選択されるプライマーは目的に応じて選択されても良いし全てが選択されても良い。 In addition to the base sequences shown in SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 8, both the forward primer and the reverse primer may be selected according to the purpose or all may be selected.
各プライマーセットに由来する増幅反応が進行したか否かによって試料中のヒトパピローマウイルス存在の有無を決定するにあたっては公知の様々な検出方法が利用されうる。例えばアガロースゲル電気泳動法、ポリアクリルアミド電気泳動法、フラグメント解析法、蛍光物質による検出方法などが挙げられるがこれらに限定されるものではない。 Various known detection methods can be used to determine the presence or absence of human papillomavirus in a sample depending on whether or not the amplification reaction derived from each primer set has progressed. Examples include, but are not limited to, agarose gel electrophoresis, polyacrylamide electrophoresis, fragment analysis, and detection using a fluorescent substance.
配列番号４３で示される塩基配列の連続する１８ないし２５塩基を有するオリゴヌクレオチド及び配列番号４４で示される塩基配列の連続する１９〜２７塩基を有するオリゴヌクレオチドを配列番号１〜１５のプライマーセットと共に使用するとで、試料中のヒトβアクチン遺伝子を増幅することが可能となり、HPV由来の増幅産物が得られなかった際に、少なくとも核酸抽出、増幅までの工程が正常に進行していることが可能となる。より好ましい形態は、それぞれ連続した２５塩基と２７塩基であり、配列番号１〜１５のプライマーセットと同じ増幅条件でHPV由来の増幅反応に影響を与えることなく特異的に増幅反応を進行させることができる。 An oligonucleotide having 18 to 25 consecutive bases of the base sequence shown in SEQ ID NO: 43 and an oligonucleotide having 19 to 27 consecutive bases of the base sequence shown in SEQ ID NO: 44 are used together with the primer set of SEQ ID NOs: 1 to 15 Then, it becomes possible to amplify the human β-actin gene in the sample, and when the HPV-derived amplification product is not obtained, at least the steps up to nucleic acid extraction and amplification can proceed normally. Become. More preferred forms are 25 bases and 27 bases, respectively, and the amplification reaction is allowed to proceed specifically without affecting the HPV-derived amplification reaction under the same amplification conditions as the primer sets of SEQ ID NOS: 1-15. it can.
増幅反応に先立つ試料からのHPV DNAの抽出方法に関しては、HPV DNAが抽出可能な方法であれば特に限定されない。例えば、フェノール・クロロホルム法や市販の核酸抽出キット(東洋紡製、QIAGEN製 等)などがあげられる。 The method for extracting HPV DNA from the sample prior to the amplification reaction is not particularly limited as long as HPV DNA can be extracted. Examples include the phenol / chloroform method and commercially available nucleic acid extraction kits (Toyobo, QIAGEN, etc.).
核酸増幅方法としては、ＰＣＲ、ＮＡＳＢＡ（Nucleic acid sequence-based amplification method；Ｎａｔｕｒｅ 第３５０巻、第９１頁(1991)）、ＬＣＲ（国際公開８９／１２６９６号公報、特開平２−２９３４号公報）、ＳＤＡ（Strand Displacement Amplification：Nucleic acid research 第２０巻、第１６９１頁(1992)）、ＲＣＲ（国際公開９０／１０６９号公報）、ＴＭＡ（Transcription mediated amplification method；J.Clin.Microbiol. 第３１巻、第３２７０頁(1993)）などが挙げられる。 Examples of nucleic acid amplification methods include PCR, NASBA (Nucleic acid sequence-based amplification method; Nature, Vol. 350, page 91 (1991)), LCR (International Publication No. 89/12696, JP-A-2-2934), SDA (Strand Displacement Amplification: Nucleic acid research Vol. 20, 1691 (1992)), RCR (International Publication No. 90/1069), TMA (Transcription mediated amplification method; J. Clin. Microbiol. Vol. 31, Vol. 31) 3270 (1993)).
なかでもＰＣＲ法は、試料核酸、４種類のデオキシヌクレオシド三リン酸、一対のオリゴヌクレオチド及び耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの存在下で、変性、アニーリング、伸長の３工程からなるサイクルを繰り返すことにより、上記一対のオリゴヌクレオチドで挟まれる試料核酸の領域を指数関数的に増幅させる方法である。すなわち、変性工程で試料の核酸を変性し、続くアニーリング工程において各オリゴヌクレオチドと、それぞれに相補的な一本鎖試料核酸上の領域とをハイブリダイズさせ、続く伸長工程で、各オリゴヌクレオチドを起点としてＤＮＡポリメラーゼの働きにより鋳型となる各一本鎖試料核酸に相補的なＤＮＡ鎖を伸長させ、二本鎖ＤＮＡとする。この１サイクルにより、１本の二本鎖ＤＮＡが２本の二本鎖ＤＮＡに増幅される。従って、このサイクルをｎ回繰り返せば、理論上上記一対のオリゴヌクレオチドで挟まれた試料ＤＮＡの領域は２ｎ倍に増幅される。増幅されたＤＮＡ領域は大量に存在するので、電気泳動等の方法により容易に検出できる。よって、遺伝子増幅法を用いれば、従来では検出不可能であった、極めて微量（１分子でも可）の試料核酸をも検出することが可能であり、最近非常に広く用いられている技術である。 In particular, the PCR method repeats a cycle consisting of three steps of denaturation, annealing, and extension in the presence of a sample nucleic acid, four types of deoxynucleoside triphosphates, a pair of oligonucleotides, and a heat-resistant DNA polymerase, and thereby the above paired pair. In this method, the region of the sample nucleic acid sandwiched between the oligonucleotides is exponentially amplified. That is, the sample nucleic acid is denatured in the denaturation step, each oligonucleotide is hybridized with a region on the complementary single-stranded sample nucleic acid in the subsequent annealing step, and each oligonucleotide is the starting point in the subsequent extension step. As described above, a DNA strand complementary to each single-stranded sample nucleic acid serving as a template is extended by the action of DNA polymerase to form double-stranded DNA. By this one cycle, one double-stranded DNA is amplified into two double-stranded DNAs. Therefore, if this cycle is repeated n times, the region of the sample DNA sandwiched between the pair of oligonucleotides is theoretically amplified 2n times. Since the amplified DNA region exists in a large amount, it can be easily detected by a method such as electrophoresis. Therefore, if a gene amplification method is used, it is possible to detect even a very small amount of sample nucleic acid that could not be detected in the past (one molecule is acceptable), which is a very widely used technique recently. .
本発明は、配列番号５，９，１０，１１，１２及び１３で示される塩基配列を有するグループ１のオリゴヌクレオチドと、配列番号２，３，４，７及び１５で示される塩基配列を有するグループ２のオリゴヌクレオチドと、配列番号１，６，８及び１４で示される塩基配列を有するグループ３のオリゴヌクレオチドを、グループ１：グループ２：グループ３＝１：２：３の比率で混合し、核酸増幅方法を行い、増幅反応が進行したか否かによって存在の有無を決定する試料中のヒトパピローマウイルスの検出方法でもある。 The present invention relates to an oligonucleotide of group 1 having the base sequence represented by SEQ ID NOs: 5, 9, 10, 11, 12 and 13 and a group having the base sequence represented by SEQ ID NOs: 2, 3, 4, 7 and 15. 2 oligonucleotides and Group 3 oligonucleotides having the base sequences shown in SEQ ID NOs: 1, 6, 8 and 14 are mixed at a ratio of Group 1: Group 2: Group 3 = 1: 2: 3 It is also a method for detecting human papillomavirus in a sample in which the presence or absence is determined by performing an amplification method and determining whether or not the amplification reaction has proceeded.
配列番号１〜１５に示されるオリゴヌクレオチドプライマーセットを用いた各増幅産物特異配列に実質的に相補的あるいは相同的配列を有するオリゴヌクレオチドプローブを用いることで、試料中のヒトパピローマウイルスをタイピングすることができる。 It is possible to type human papillomavirus in a sample by using an oligonucleotide probe having a sequence substantially complementary or homologous to each amplification product specific sequence using the oligonucleotide primer set shown in SEQ ID NOs: 1 to 15 it can.
オリゴヌクレオチドプローブは配列番号１６から４１で示される塩基配列の連続する１４ないしそれぞれの配列の全長までの長さを有するオリゴヌクレオチドから一つ以上選択することができる。より好ましくはそれぞれの配列の全長の長さを有するオリゴヌクレオチドプローブである。 One or more oligonucleotide probes can be selected from oligonucleotides having a length from the consecutive 14 base sequences shown in SEQ ID NOs: 16 to 41 to the full length of each sequence. More preferred are oligonucleotide probes having the full length of each sequence.
増幅反応時に、配列番号４３および４４で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドプライマーセットを同時に使用しておけば配列番号４２で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドプローブを用いることでヒトゲノム由来増幅産物の有無を確認することもできる。 If an oligonucleotide primer set having the nucleotide sequence shown in SEQ ID NOs: 43 and 44 is used at the same time during the amplification reaction, the presence or absence of the amplification product derived from the human genome can be obtained by using the oligonucleotide probe having the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 42 Can also be confirmed.
本発明においては、オリゴヌクレオチドプライマーおよび／またはオリゴヌクレオチドプローブを標識されているか、水不溶性単体に固定して使用することも可能である。 In the present invention, it is also possible to use oligonucleotide primers and / or oligonucleotide probes that are labeled or fixed to a water-insoluble simple substance.
標識するにあたっては、蛍光化学物質、発光団、酵素、蛍光蛋白質、発光蛋白質、磁性体、導電性物質、ビオチン、ハプテン、抗原、抗体などが使用できる。
蛍光化学物質としては、ＦＩＴＣ，６−ＦＡＭ，ＨＥＸ，ＴＥＴ，ＴＡＭＲＡ，テキサスレッド、Ｃｙ３、Ｃｙ５などが挙げられる。発光団としては、ルテニウムなどが挙げられる。酵素としては、アルカリフォスファターゼ、ペルオキシダーゼなどが挙げられる。
In labeling, fluorescent chemical substances, luminophores, enzymes, fluorescent proteins, luminescent proteins, magnetic substances, conductive substances, biotin, haptens, antigens, antibodies, and the like can be used.
Examples of fluorescent chemical substances include FITC, 6-FAM, HEX, TET, TAMRA, Texas Red, Cy3, and Cy5. Examples of the luminophore include ruthenium. Examples of the enzyme include alkaline phosphatase and peroxidase.
本発明において、キットとしては、ヒトパピローマウイルス用プライマーセット（フォワードプライマー及びリバースプライマー）、ＤＮＡポリメラーゼ、４種類のデオキシヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）を含むものである。 In the present invention, the kit includes a primer set for human papillomavirus (forward primer and reverse primer), DNA polymerase, and four types of deoxynucleoside triphosphates (dNTPs).
該各オリゴヌクレオチドは、予め上述したような蛍光化学物質、発光団、酵素、蛍光蛋白質、発光蛋白質、磁性体、導電性物質、ビオチン、ハプテン、抗原、抗体などによって標識されていてもよい。 Each oligonucleotide may be previously labeled with a fluorescent chemical substance, a luminophore, an enzyme, a fluorescent protein, a luminescent protein, a magnetic substance, a conductive substance, biotin, a hapten, an antigen, an antibody, or the like as described above.
また、キットとしては、ヒトパピローマウイルス用プライマーセット（フォワードプライマー及びリバースプライマー）、ＤＮＡポリメラーゼ、４種類のデオキシヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）及びヒトパピローマウイルス特異検出用オリゴヌクレオチドプローブを含む。 The kit includes a human papillomavirus primer set (forward primer and reverse primer), DNA polymerase, four types of deoxynucleoside triphosphates (dNTPs), and human papillomavirus-specific detection oligonucleotide probes.
各プライマー及び／またはオリゴヌクレオチドプローブは、予め上述したような蛍光化学物質、発光団、酵素、蛍光蛋白質、発光蛋白質、磁性体、導電性物質、ビオチン、ハプテン、抗原、抗体などによって標識されていてもよい。 Each primer and / or oligonucleotide probe is previously labeled with a fluorescent chemical substance, luminophore, enzyme, fluorescent protein, luminescent protein, magnetic substance, conductive substance, biotin, hapten, antigen, antibody or the like as described above. Also good.
検出方法は標識の種類に応じて選択されれば良く、特に限定されるものではない。例えば、プライマー、プローブが異なる蛍光化学物質で標識されている場合は、蛍光検出器、フローサイトメーター等を利用することができる。また、FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer）を利用した検出をしても良い。一方がビオチン、他方が蛍光化学物質や発光団等の場合は、ビオチン標識を利用してハイブリッドの捕捉を行い、捕捉されたハイブリッドの標識を測定する方法などが考えられる。またビオチンと抗原等の両方が捕捉可能な物質の場合は、例えばアビジンを固定した通液フィルターでハイブリッドを捕捉し、次に酵素標識抗体を反応ご当該酵素の発色もしくは発光基質を添加することで検出することも可能である。 The detection method may be selected according to the type of label and is not particularly limited. For example, when the primer and probe are labeled with different fluorescent chemical substances, a fluorescence detector, a flow cytometer, or the like can be used. Moreover, you may detect using FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer). When one is biotin and the other is a fluorescent chemical or a luminophore, a method of capturing the hybrid using a biotin label and measuring the label of the captured hybrid can be considered. In the case of a substance that can capture both biotin and antigen, for example, capture the hybrid with a flow-through filter fixed with avidin, and then react with the enzyme-labeled antibody to add the coloring or luminescent substrate of the enzyme. It is also possible to detect.
このように、本発明の方法では、試料中のHPVをバランス良く効率的に増幅可能なプライマーセット、およびそれぞれの増幅産物中のわずかな配列的特徴を認識可能なオリゴヌクレオチドプローブセット、およびそれらを用いた検出法、タイピング法、それらのキットを提供されるので、明確かつ再現性よく試料中のHPVを検出し、必要に応じてタイピングすることができる。 Thus, in the method of the present invention, a primer set capable of efficiently amplifying HPV in a sample in a balanced manner, an oligonucleotide probe set capable of recognizing slight sequence characteristics in each amplification product, and Since the detection method used, typing method, and kits thereof are provided, it is possible to detect HPV in a sample clearly and reproducibly and perform typing as necessary.
以下、実施例に基づき本発明をより具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。 Hereinafter, based on an Example, this invention is demonstrated more concretely. However, the present invention is not limited to the following examples.
（実施例１ HPV DNAの検出）
（１）各種オリゴヌクレオチドの合成
配列番号1〜44に示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチド（以下、オリゴ1〜44と示す）及びその標識物の合成は、DNA合成受託会社(プロリゴジャパン、(株)日本バイオサービス、等)に依頼した。尚、オリゴ1〜7は、実施例2以降の検討で使用することを考慮して5'末端をFITCで標識した。
(Example 1 Detection of HPV DNA)
(1) Synthesis of various oligonucleotides The oligonucleotides having the nucleotide sequences shown in SEQ ID NOs: 1-44 (hereinafter referred to as oligos 1-44) and their labeled products were synthesized by a DNA synthesis contractor (Proligo Japan, Inc. ) Japan Bio Service, etc.) Oligos 1 to 7 were labeled with FITC at the 5 ′ end in consideration of use in the examination in Example 2 and later.
（２）陽性コントロールプラスミドの作成
26種のHPV(6、11、16、18、30、31、33、34、35、39、42、44、45、51、52、53、54、55、56、58、59、61、66、68、70、82)のL1遺伝子領域を含む陽性コントロールプラスミドを作成した。
(2) Preparation of positive control plasmid
26 HPVs (6, 11, 16, 18, 30, 31, 33, 34, 35, 39, 42, 44, 45, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 58, 59, 61, 66 , 68, 70, 82) positive control plasmids containing the L1 gene region were prepared.
（３）PCR法によるHPV DNAの増幅および検出
(3)-1 PCR法による増幅反応
上述の各陽性コントロールプラスミド、104コピーを使用し、下記試薬を添加して、下記条件によりHPV DNAの増幅反応を実施した。比較実験として公知プライマーペア(オリゴ1とオリゴ8)のみを使用した増幅反応を実施した。
(3) Amplification and detection of HPV DNA by PCR
(3) -1 Amplification Reaction by PCR Method Using the above-mentioned positive control plasmids, 104 copies, the following reagents were added, and HPV DNA amplification reaction was carried out under the following conditions. As a comparative experiment, an amplification reaction using only a known primer pair (oligo 1 and oligo 8) was performed.
試薬
以下の試薬を含む25μｌ溶液を調製した。
PCR反応液
プライマー(オリゴ1〜15)混合溶液＊ 2.0 μl
×10緩衝液 2.5 μl
2 mM dNTP 2.5 μl
25 mM MgCl2 1.5 μl
Blend Taq-plus DNAポリメラーゼ 1.0 Ｕ
プラスミドDNA溶液 104copies
Reagents A 25 μl solution containing the following reagents was prepared.
PCR reaction solution Primer (oligo 1-15) mixed solution * 2.0 μl
× 10 buffer 2.5 μl
2 mM dNTP 2.5 μl
25 mM MgCl 2 1.5 μl
Blend Taq-plus DNA polymerase 1.0 U
Plasmid DNA solution 10 4 copies
＊: プライマー(オリゴ1〜15)混合溶液 2.0 μl中の各オリゴの量
15 pmol; オリゴ1、オリゴ6、オリゴ8、オリゴ14
10 pmol; オリゴ2、オリゴ3、オリゴ4、オリゴ7、オリゴ15
5 pmol; オリゴ5、オリゴ9、オリゴ10、オリゴ11、オリゴ12、オリゴ13
*: Amount of each oligo in 2.0 μl of primer (oligo 1-15) mixed solution
15 pmol; oligo 1, oligo 6, oligo 8, oligo 14
10 pmol; oligo 2, oligo 3, oligo 4, oligo 7, oligo 15
5 pmol; oligo 5, oligo 9, oligo 10, oligo 11, oligo 12, oligo 13
増幅条件 (GeneAmp 9700サーマルサイクラーを使用)
94℃・5分
94℃・30秒、50℃・30秒、72℃、30秒（45サイクル）
72℃・2分。
Amplification conditions (using GeneAmp 9700 thermal cycler )
94 ℃, 5 minutes
94 ° C for 30 seconds, 50 ° C for 30 seconds, 72 ° C for 30 seconds (45 cycles)
72 ℃ for 2 minutes.
(3)-2 ポリアクリルアミド電気泳動法による検出
それぞれの増幅反応液2μｌを5％ポリアクリルアミドゲルにアプライしＡＴＴＯ社電気泳動装置で１５０Ｖ-３０分間電気泳動を行った。結果は表１に示す。
(3) -2 Detection by Polyacrylamide Electrophoresis 2 μl of each amplification reaction solution was applied to a 5% polyacrylamide gel and electrophoresed on an ATTO electrophoresis apparatus for 150 V-30 minutes. The results are shown in Table 1.
本発明のプライマーセットを用いることで、26種全てのHPV DNAを検出することが可能であった。 By using the primer set of the present invention, it was possible to detect all 26 types of HPV DNA.
（実施例２ HPV のタイピング）
（１）各種増幅産物の調製
26種の増幅産物は実施例１で得られた増幅産物を使用した。
(Example 2 HPV typing)
(1) Preparation of various amplification products
The amplification products obtained in Example 1 were used as 26 kinds of amplification products.
（２）各種増幅産物のタイピング
(2)-1 オリゴヌクレオチドプローブによるハイブリダイゼーション
26種のオリゴヌクレオチドプローブ(オリゴ16〜41)は合成の際、3'末端をビオチン標識した。標識プローブは1×Blend Taq緩衝液で0.125 pmol /μｌに調製した。各種増幅産物20μｌは140μｌの1×Blend Taq緩衝液で8倍に希釈した。
ハイブリダイゼーションは希釈済標識プローブ液4μｌと希釈済増幅産物液4μｌをPCR用チューブ内で混合し、GeneAmp 9700サーマルサイクラーを用いて98℃で3分、25℃で3分以上保温することにより実施した。
(2) Typing of various amplification products
(2) -1 Hybridization with oligonucleotide probe
26 kinds of oligonucleotide probes (oligos 16 to 41) were labeled with biotin at the 3 ′ end during synthesis. The labeled probe was adjusted to 0.125 pmol / μl with 1 × Blend Taq buffer. 20 μl of various amplification products were diluted 8-fold with 140 μl of 1 × Blend Taq buffer.
Hybridization was performed by mixing 4 μl of diluted labeled probe solution and 4 μl of diluted amplification product solution in a PCR tube and incubating at 98 ° C. for 3 minutes and at 25 ° C. for 3 minutes or more using a GeneAmp 9700 thermal cycler. .
(2)-2 通液性フィルターを用いた検出
ハイブリダイゼーション済溶液全量をPOD標識アビジン(Dako Cytomation製)の溶液30μｌに加えて、室温にて5分間反応させた。これによって、ビオチン標識プローブとPOD標識アビジンが結合する。この反応液を抗FITC抗体の結合した通液性フィルターに添加するとフィルター上にビオチン標識プローブを介してPOD標識アビジンが結合したFITC標識HPV由来増幅産物が捕捉される。次に、上部より洗浄液およびPOD基質液を順次添加後、フィルター表面の発色を目視によって確認した。なお、抗体の結合したガラス繊維不織布フィルターは特開２００４−１５６９８５号公報の実施例１に準じて行った。結果は表２に示す。
(2) -2 Detection using liquid-permeable filter The entire amount of the hybridized solution was added to 30 μl of a solution of POD-labeled avidin (manufactured by Dako Cytomation) and reacted at room temperature for 5 minutes. As a result, the biotin-labeled probe and the POD-labeled avidin are bound. When this reaction solution is added to a liquid-permeable filter to which an anti-FITC antibody is bound, a FITC-labeled HPV-derived amplification product to which POD-labeled avidin is bound is captured on the filter via a biotin-labeled probe. Next, the washing solution and the POD substrate solution were sequentially added from the top, and the color development on the filter surface was visually confirmed. In addition, the glass fiber nonwoven fabric filter which the antibody couple | bonded was performed according to Example 1 of Unexamined-Japanese-Patent No. 2004-156985. The results are shown in Table 2.
各標識プローブは各々の型由来増幅産物とのみを特異的に検出することができ、明確なタイピングが可能であった。 Each labeled probe was able to specifically detect only the amplification product derived from each type, and a clear typing was possible.
（実施例３ HPV DNAのグルーピング検出） (Example 3 Grouping detection of HPV DNA)
（１）各種増幅産物の調製
26種の増幅産物は実施例１で得られた増幅産物を使用した。
(1) Preparation of various amplification products
The amplification products obtained in Example 1 were used as 26 kinds of amplification products.
（２）各種増幅産物のグルーピング検出
(2)-1 オリゴヌクレオチドプローブミックスによるハイブリダイゼーション
26種のオリゴヌクレオチドプローブ(オリゴ16〜41)は合成の際、3'末端をビオチン標識した。標識プローブを用いてプローブミックスA(16、 18、 33、 52、 58)、プローブミックスB(31、 35、 39、 45、 51、 56、 59、 68)、プローブミックスC(6、11)を1×Blend Taq緩衝液で各プローブ濃度がそれぞれ0.125 pmol /μｌになるように調製した。各種増幅産物20μｌは140μｌの1×Blend Taq緩衝液で8倍に希釈した。
(2) Grouping detection of various amplification products
(2) -1 Hybridization using oligonucleotide probe mix
26 kinds of oligonucleotide probes (oligos 16 to 41) were labeled with biotin at the 3 ′ end during synthesis. Using labeled probe, probe mix A (16, 18, 33, 52, 58), probe mix B (31, 35, 39, 45, 51, 56, 59, 68), probe mix C (6, 11) Each probe concentration was adjusted to 0.125 pmol / μl with 1 × Blend Taq buffer. 20 μl of various amplification products were diluted 8-fold with 140 μl of 1 × Blend Taq buffer.
ハイブリダイゼーションは希釈済標識プローブ液4μｌと希釈済増幅産物液4μｌをPCR用チューブ内で混合し、GeneAmp 9700サーマルサイクラーを用いて98℃で3分、25℃で3分以上保温することにより実施した。 Hybridization was performed by mixing 4 μl of diluted labeled probe solution and 4 μl of diluted amplification product solution in a PCR tube and incubating at 98 ° C. for 3 minutes and at 25 ° C. for 3 minutes or more using a GeneAmp 9700 thermal cycler. .
(2)-2 通液性フィルターを用いた検出
ハイブリダイゼーション済溶液全量をPOD標識アビジン(Dako Cytomation製)の溶液30μｌに加えて、室温にて5分間反応させた。これによって、ビオチン標識プローブとPOD標識アビジンが結合する。この反応液を抗FITC抗体の結合した通液性フィルターに添加するとフィルター上にビオチン標識プローブを介してPOD標識アビジンが結合したFITC標識HPV由来増幅産物が捕捉される。次に、上部より洗浄液およびPOD基質液を順次添加後、フィルター表面の発色を目視によって確認した。なお、抗体の結合したガラス繊維不織布フィルターは特開２００４−１５６９８５号公報の実施例１に準じて行った。結果は表３に示す。
(2) -2 Detection using liquid-permeable filter The entire amount of the hybridized solution was added to 30 μl of a solution of POD-labeled avidin (manufactured by Dako Cytomation) and reacted at room temperature for 5 minutes. As a result, the biotin-labeled probe and the POD-labeled avidin are bound. When this reaction solution is added to a liquid-permeable filter to which an anti-FITC antibody is bound, a FITC-labeled HPV-derived amplification product to which POD-labeled avidin is bound is captured on the filter via a biotin-labeled probe. Next, the washing solution and the POD substrate solution were sequentially added from the top, and the color development on the filter surface was visually confirmed. In addition, the glass fiber nonwoven fabric filter which the antibody couple | bonded was performed according to Example 1 of Unexamined-Japanese-Patent No. 2004-156985. The results are shown in Table 3.
各プライマーミックスは、各々目的とした型のみを特異的に検出することができ、グルーピング検出が可能であった。 Each primer mix was able to specifically detect only the target type, and grouping detection was possible.
本発明により、明確かつ再現性よく試料中のHPVを検出し、必要に応じてタイピングやグルーピング検出することが可能となり、操作も非常に容易であることから、さまざまな場でニーズに応じたHPV検出試薬としての使用が期待される。 According to the present invention, it is possible to detect HPV in a sample clearly and reproducibly, and to detect typing and grouping as required, and the operation is very easy. Use as a detection reagent is expected.
Claims (27)
27. The sample according to claim 26, wherein the label is any one selected from the group consisting of a fluorescent chemical substance, a luminophore, an enzyme, a fluorescent protein, a photoprotein, a magnetic substance, a conductive substance, biotin, a hapten, an antigen, and an antibody. Kit for typing human papillomavirus.
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