JP5017947B2 - Identification method of multiple nucleotide polymorphisms - Google Patents
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本発明は、塩基判定用オリゴヌクレオチドプライマー、および核酸の伸長反応が起こりうる形態のオリゴヌクレオチドプローブを用いた塩基多型の同定方法に関するものである。本発明は、遺伝病の診断、塩基多型解析等に際して特に有用である。 The present invention relates to a nucleotide polymorphism identification method using an oligonucleotide primer for base determination and an oligonucleotide probe in a form in which a nucleic acid extension reaction can occur. The present invention is particularly useful for diagnosis of genetic diseases, nucleotide polymorphism analysis, and the like.
本発明において、塩基多型とは野生型とは異なる塩基配列を有することをいう。遺伝子の塩基多型は薬物代謝において副作用および治療失敗の発生において個体間変動の原因として重要な役割を果たし、体質として知られる基礎代謝等の個人差の原因としても知られている。その上、これらは多数の疾患の遺伝マーカーとしての働きもする。それゆえ、これら突然変異の解明は臨床的に重要であり、ルーチンの表現型分類が臨床研究における精神医学患者および自発志願者にとって特に推奨される（非特許文献１、非特許文献２）。また、原因となる変異型遺伝子の同定に続くそれぞれの遺伝子型の検出用の核酸配列分析法が所望される。 In the present invention, the nucleotide polymorphism means having a nucleotide sequence different from the wild type. The nucleotide polymorphism of a gene plays an important role as a cause of inter-individual variation in the occurrence of side effects and treatment failures in drug metabolism, and is also known as a cause of individual differences such as basic metabolism known as constitution. In addition, they also serve as genetic markers for a number of diseases. Therefore, elucidation of these mutations is clinically important, and routine phenotyping is particularly recommended for psychiatric patients and volunteers in clinical studies (Non-Patent Document 1, Non-Patent Document 2). In addition, a nucleic acid sequence analysis method for detecting each genotype following identification of the causative mutant gene is desired.
従来の核酸配列分析技術としては、例えば核酸配列決定法（シークエンシング法）がある。核酸配列決定法は核酸配列中に含まれる塩基多型を検出、同定することができるが、鋳型核酸の調製、ＤＮＡポリメラーゼ反応、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、核酸配列の解析等を行うため多大な労力と時間が必要である。また近年の自動シークエンサーを用いることで省力化は行うことができるが、高価な装置が必要であるという問題がある。 As a conventional nucleic acid sequence analysis technique, for example, there is a nucleic acid sequencing method (sequencing method). Nucleic acid sequencing can detect and identify nucleotide polymorphisms contained in nucleic acid sequences, but requires a great deal of effort to prepare template nucleic acids, DNA polymerase reaction, polyacrylamide gel electrophoresis, analysis of nucleic acid sequences, etc. And time is needed. Further, labor can be saved by using a recent automatic sequencer, but there is a problem that an expensive apparatus is required.
一方、遺伝子の点突然変異により引き起こされる遺伝病が種々知られており、それらの中には、遺伝子のどの部位がどのように点突然変異することにより遺伝病が引き起こされるかわかっているものも少なくない。 On the other hand, there are various known genetic diseases caused by point mutations in genes, and some of them know which part of the gene and how point mutations cause genetic diseases. Not a few.
このような予想される点突然変異を検出する方法として、従来より、ＰＣＲ（polymerase chain reaction）法（例えば、特許文献１及び２参照）などの遺伝子増幅法を利用した遺伝子の点突然変異の検出方法が知られている。増幅された遺伝子断片に対し、特定の核酸配列を切断する制限酵素により処理し、生じるフラグメントの大きさで判断する方法（ＰＣＲ−ＲＦＬＰ）法が用いられている。同じくＰＣＲ法を用いた検出方法としては、使用するプライマーの特異性を利用したAlelle specific amplification法が用いられる。この方法では、遺伝子増幅法に用いる一対のオリゴヌクレオチドのうちの一方のオリゴヌクレオチドとして、野生型遺伝子の増幅領域の端部領域に完全に相補的な野生型用オリゴヌクレオチドと、変異型遺伝子の増幅領域の端部領域に完全に相補的な変異型用オリゴヌクレオ チドとを用いる。変異型のオリゴヌクレオチドは、その３’末端が予想される点突然変異を起こしたヌクレオチドに相補的なヌクレオチドになっている。このような野生型及び変異型用オリゴヌクレオチドをそれぞれ別個に用いて試料遺伝子を遺伝子増幅法に供する。 As a method for detecting such a predicted point mutation, detection of a point mutation of a gene using a gene amplification method such as a PCR (polymerase chain reaction) method (see, for example, Patent Documents 1 and 2) has been conventionally performed. The method is known. The amplified gene fragment is treated with a restriction enzyme that cleaves a specific nucleic acid sequence, and a method of judging based on the size of the resulting fragment (PCR-RFLP) is used. Similarly, as a detection method using the PCR method, the Alelle specific amplification method using the specificity of the primer to be used is used. In this method, as one of the pair of oligonucleotides used in the gene amplification method, a wild-type oligonucleotide that is completely complementary to the end region of the wild-type gene amplification region and the mutant-type gene amplification Use a mutant oligonucleotide that is completely complementary to the end region of the region. Mutant oligonucleotides have nucleotides complementary to the predicted point mutation at the 3 'end. Such wild-type and mutant-type oligonucleotides are separately used to subject the sample gene to the gene amplification method.
試料遺伝子が野生型であれば、野生型用オリゴヌクレオチドを用いた場合には核酸の増幅が起きるが、変異型用オリゴヌクレオチドを用いた場合には、オリゴヌクレオチドの３’末端が試料遺伝子の対応ヌクレオチドと相補的ではない（ミスマッチ）ので伸長反応が起きず、核酸の増幅は起きない。一方、試料遺伝子が変異型であれば、逆に、野生型用オリゴヌクレオチドを用いた場合には増幅が起きず、変異型用オリゴヌクレオチドを用いた場合に増幅が起きる。従って、各オリゴヌクレオチドを用いた場合に増幅が起きるか否かを調べることにより、試料遺伝子が野生型か変異型かを判別することができ、それによって試料遺伝子中の点突然変異を同定することができる。この時増幅が起きたか否かを調べる方法として、増幅産物をアガロースゲル電気泳動した後、エチジウムブロマイド等の核酸特異的結合蛍光試薬を用いて染色の後、ＵＶ照射して増幅核酸の有無を検出できる。 If the sample gene is wild-type, nucleic acid amplification occurs when a wild-type oligonucleotide is used, but if a mutant-type oligonucleotide is used, the 3 ′ end of the oligonucleotide corresponds to the sample gene. Since it is not complementary to the nucleotide (mismatch), no extension reaction occurs, and no nucleic acid amplification occurs. On the other hand, if the sample gene is a mutant type, conversely, amplification does not occur when the wild-type oligonucleotide is used, and amplification occurs when the mutant-type oligonucleotide is used. Therefore, by examining whether amplification occurs when using each oligonucleotide, it is possible to determine whether the sample gene is a wild type or a mutant type, thereby identifying a point mutation in the sample gene. Can do. As a method to check whether amplification has occurred at this time, the amplified product is subjected to agarose gel electrophoresis, stained with a nucleic acid-specific binding fluorescent reagent such as ethidium bromide, and then irradiated with UV to detect the presence of amplified nucleic acid. it can.
上記のような方法により増幅核酸を検出し、容易に多型の同定が行えるように思われるが、実際には、非特異的な核酸増幅が起こり試料遺伝子が野生型か変異型かを明確に判別できない場合もある。また上記の塩基多型同定方法では１箇所の塩基多型を同定するために通常１回または２回の核酸増幅を行う必要があり、特に遺伝病の原因となる点突然変異が遺伝子の複数の部位で起こっている場合には上記一連の操作を複数回行わなければならいため、遺伝子の塩基多型を同定するためにより大きな労力が必要となる。 Although it seems that the amplified nucleic acid can be detected by the above-mentioned method and polymorphism can be easily identified, in practice, non-specific nucleic acid amplification occurs and it is clear whether the sample gene is wild type or mutant type. Sometimes it cannot be determined. In addition, in the above-mentioned nucleotide polymorphism identification method, it is usually necessary to perform nucleic acid amplification once or twice in order to identify one nucleotide polymorphism. In particular, a point mutation causing a genetic disease is caused by a plurality of gene mutations. When this occurs at a site, the above-described series of operations must be performed a plurality of times, so that greater effort is required to identify the nucleotide polymorphism of the gene.
試料中に存在する特定の核酸分子を検出するための他の代表的な技術としては、ハイブリダイゼーション法がある（例えば、非特許文献３参照）。核酸のハイブリダイゼーション分析は、多種類の核酸の中から非常に少数の標的核酸（ＤＮＡやＲＮＡ）をプローブで検出する技術であるが、ハイブリダイゼーション法では、高感度なレポーター（酵素、蛍光色素、ラジオアイソトープ等）を用いても、低コピー数（１〜１０００個）の標的核酸分子を検出するのは困難である。さらに、ハイブリダイゼーション法には、非特異反応という大きな問題点が存在するため、特定の核酸分子を正確に検出する為には担体のブロッキング、非特異シグナルの除去等の操作が不可欠であり、多大な労力が必要となる。 As another typical technique for detecting a specific nucleic acid molecule present in a sample, there is a hybridization method (see, for example, Non-Patent Document 3). Nucleic acid hybridization analysis is a technique for detecting a very small number of target nucleic acids (DNA and RNA) from various types of nucleic acids using probes. In hybridization methods, highly sensitive reporters (enzymes, fluorescent dyes, Even if a radioisotope or the like is used, it is difficult to detect a target nucleic acid molecule having a low copy number (1-1000). Furthermore, since the hybridization method has a big problem of non-specific reaction, operations such as carrier blocking and removal of non-specific signal are indispensable for accurately detecting a specific nucleic acid molecule. Effort is required.
また、過去において非特異反応の問題を解決するための方法として、標的核酸より調製した標識ＤＮＡに、同様に調製した非標識ＤＮＡを添加して非特異反応を抑制するコンペティティブハイブリダイゼーション法（例えば、特許文献３、非特許文献４参照）が開発された。しかしコンペティティブハイブリダイゼーション法は操作が煩雑であり、また検出感度の面でも十分とはいえないため、特に遺伝病の診断、塩基多型解析等には適用できない。
本発明の目的は、上記のような問題点を解決して、明確にかつ再現性よく核酸配列中の多型を検出することができる方法及びそのための試薬を提供することである。 An object of the present invention is to provide a method and a reagent therefor that can solve the above-mentioned problems and detect a polymorphism in a nucleic acid sequence clearly and reproducibly.
本発明者らは、上記事情に鑑み、鋭意研究の結果、本発明を完成させるに至った。 In view of the above circumstances, the present inventors have completed the present invention as a result of intensive studies.
すなわち、本発明は以下のような構成からなる。
１．試料溶液中に含まれる標的核酸配列上の塩基部位を判定する方法において、少なくとも以下の（１）〜（４）の工程を含むことを特徴とする塩基判定方法。
（１）第一のリガンドが結合したオリゴヌクレオチドプライマー（Ａ）と該プライマー（Ａ）の伸長産物の一部と相補的なオリゴヌクレオチドプライマー(Ｂ)とを用いて、標的核酸配列から核酸増幅反応を行う第一工程であり、該プライマー（Ａ、Ｂ）が下記の(ａ)または(ｂ)のいずれかの組み合わせから選択される：（ａ）判定したい塩基部位（Ｘ）の上流領域と相同的な該プライマー（Ａ）と、判定したい塩基部位（Ｘ）の下流領域と相補的な該プライマー(Ｂ)との組合せ；（ｂ）判定したい塩基部位（Ｘ）の上流領域と相同的な該プライマー（Ｂ）と、判定したい塩基部位（Ｘ）の下流領域と相補的な該プライマー(Ａ)との組合せ
（２）第一工程で得られうるプライマー（Ａ）の伸長産物と、第二のリガンドが結合しておりかつ該伸長産物の塩基部位（Ｘ）と特異的に結合する少なくとも１種類の検出用オリゴヌクレオチドプローブ（Ｃ）とをハイブリダイズさせた複合体（Ｐｃ）、および、該第一工程で得られうるプライマー（Ａ）の伸長産物と、第三のリガンドが結合しておりかつ該伸長産物の塩基部位（Ｘ）と特異的に結合する少なくとも１種類の検出用オリゴヌクレオチドプローブ（Ｄ）とをハイブリダイズさせた複合体（Ｐｄ）、を形成せしめる第二工程
（３）第二工程で得られうる該複合体（Ｐｃ）中に、第一のリガンドと第二のリガンドが共存しているかどうかを検出する第三工程
（４）第二工程で得られうる該複合体（Ｐｄ）中に、第一のリガンドと第三のリガンドが共存しているかどうかを検出する第四工程
２．第一工程において、オリゴヌクレオチドプローブ（Ｃ）および／または（Ｄ）が存在していることを特徴とする１の塩基判定方法。
３．第二工程において、複合体（Ｐｃ）を形成せしめる際にプライマー（Ａ）の伸長産物を鋳型としてオリゴヌクレオチドプローブ（Ｃ）の伸長反応を行い、複合体（Ｐｄ）を形成せしめる際にプライマー（Ａ）の伸長産物を鋳型としてオリゴヌクレオチドプローブ（Ｄ）の伸長反応を行うことを特徴とする１または２の塩基判定方法。
４．第三工程と第四工程を同時に行うことを特徴とする１〜３のいずれかの塩基判定方法。
５．第一のリガンドが抗原、抗体、蛍光物質、発光団および酵素からなる群より選ばれた少なくとも１種以上であることを特徴とする１〜４のいずれかの塩基判定方法。
６．第二のリガンドが抗原、抗体、蛍光物質、発光団および酵素からなる群より選ばれた少なくとも１種以上であることを特徴とする１〜４のいずれかの塩基判定方法。
７．第三のリガンドが抗原、抗体、蛍光物質、発光団および酵素からなる群より選ばれた少なくとも１種以上であることを特徴とする１〜４のいずれかの塩基判定方法。
８．第三工程が、以下の（ｉ）または（ｉｉ）のいずれかの工程を含むことを特徴とする１〜７のいずれかの塩基判定方法。
（ｉ）複合体（Ｐｃ）を第一のリガンドの捕捉剤が結合した固相上に捕捉した後、第二のリガンドを検出する工程
（ｉｉ）第二のリガンドに結合できかつ標識されてなる少なくとも１種類の生理活性物質を、複合体（Ｐｃ）を介して、第一のリガンドの捕捉剤が結合した固相上に捕捉した後、該複合体（Ｐｃ）を介して固相上に捕捉された該生理活性物質の標識を検出する工程
９．第四工程が、以下の（ｉ）または（ｉｉ）のいずれかの工程を含むことを特徴とする１〜８のいずれかの塩基判定方法。
（ｉ）複合体（Ｐｄ）を第一のリガンドの捕捉剤が結合した固相上に捕捉した後、第三のリガンドを検出する工程
（ｉｉ）第三のリガンドに結合できかつ標識されてなる少なくとも１種類の生理活性物質を、複合体（Ｐｄ）を介して、第一のリガンドの捕捉剤が結合した固相上に捕捉した後、該複合体（Ｐｄ）を介して固相上に捕捉された該生理活性物質の標識を検出する工程
１０．第一のリガンドの捕捉剤が抗体、オリゴヌクレオチド、レセプター、核酸特異的結合物質及びアビジンからなる群より選ばれた少なくとも１種以上であることを特徴とする８又は９の塩基判定方法。
１１．生理活性物質が抗体、オリゴヌクレオチド、レセプター、核酸特異的結合物質およびアビジンからなる群より選ばれた少なくとも１種以上であることを特徴とする８又は９の塩基判定方法。
１２．生理活性物質に結合される標識が、蛍光化学物質、発光団、酵素、蛍光蛋白質、発光蛋白質、磁性体および導電性物質からなる群より選ばれた少なくとも１種以上であることを特徴とする８又は９の塩基判定方法。
１３．オリゴヌクレオチドプローブ（Ｃ）および／または（Ｄ）の３’末端の塩基が判定したい塩基部位（Ｘ）の予想される塩基と同じ、または相補的な塩基であることを特徴とする１〜１２のいずれかの塩基判定方法。
１４．オリゴヌクレオチドプローブ（Ｃ）および／または（Ｄ）の３’末端より２番目の塩基が判定したい塩基部位（Ｘ）の予想される塩基と同じ、または相補的な塩基であることを特徴とする１〜１２のいずれかの塩基判定方法。
１５．オリゴヌクレオチドプローブ（Ｃ）および／または（Ｄ）の３’末端より３から５番目の少なくとも１つの塩基が鋳型となる核酸配列と相補的または相同的でない塩基に置換されていることを特徴とする１３または１４の塩基判定方法。
１６．オリゴヌクレオチドプローブ（Ｃ）および／または（Ｄ）の３’末端から２番目以降の少なくとも一つのヌクレオチドがリガンドにより標識されていることを特徴とする１〜１５のいずれかの塩基判定方法。
１７．オリゴヌクレオチドプローブ（Ｃ）および／または（Ｄ）の５’末端がリガンドにより標識されていることを特徴とする１〜１６のいずれかの塩基判定方法。
１８．少なくとも以下の（１）〜（３）を含むことを特徴とする塩基判定用キット。
（１）第一のリガンドが結合したオリゴヌクレオチドプライマー（Ａ）と、該プライマー（Ａ）の伸長産物の一部と相補的なオリゴヌクレオチドプライマー(Ｂ)であり、該プライマー（Ａ、Ｂ）が下記の(ａ)または(ｂ)のいずれかの組み合わせから選択される：（ａ）判定したい塩基部位（Ｘ）の上流領域と相同的な該プライマー（Ａ）と、判定したい塩基部位（Ｘ）の下流領域と相補的な該プライマー(Ｂ)との組合せ；（ｂ）判定したい塩基部位（Ｘ）の上流領域と相同的な該プライマー（Ｂ）と、判定したい塩基部位（Ｘ）の下流領域と相補的な該プライマー(Ａ)との組合せ
（２）該プライマー（Ａ）の伸長産物と、第二のリガンドが結合しておりかつ該伸長産物の塩基部位（Ｘ）と特異的に結合する少なくとも１種類の検出用オリゴヌクレオチドプローブ（Ｃ）
（３）該プライマー（Ａ）の伸長産物と、第三のリガンドが結合しておりかつ該伸長産物の塩基部位（Ｘ）と特異的に結合する少なくとも１種類の検出用オリゴヌクレオチドプローブ（Ｄ）
１９．さらに以下の（４）及び（５）を含むことを特徴とする１３の塩基判定用キット。
（４）第二のリガンドに結合できかつ標識されてなる少なくとも１種類の生理活性物質および／または第三のリガンドに結合できかつ標識されてなる少なくとも１種類の生理活性物質
（５）第一のリガンドの捕捉剤が結合した固相。
２０．第一のリガンドが抗原、抗体、蛍光物質、発光団および酵素からなる群より選ばれた少なくとも１種以上であることを特徴とする１８又は１９の塩基判定用キット。
２１．第二のリガンドが抗原、抗体、蛍光物質、発光団および酵素からなる群より選ばれた少なくとも１種以上であることを特徴とする１８又は１９の塩基判定用キット。
２２．第三のリガンドが抗原、抗体、蛍光物質、発光団および酵素からなる群より選ばれた少なくとも１種以上であることを特徴とする１８又は１９の塩基判定用キット。
２３．第一のリガンドの捕捉剤が抗体、オリゴヌクレオチド、レセプター、核酸特異的結合物質及びアビジンからなる群より選ばれた少なくとも１種以上であることを特徴とする１８又は１９の塩基判定用キット。
２４．生理活性物質が抗体、オリゴヌクレオチド、レセプター、核酸特異的結合物質およびアビジンからなる群より選ばれた少なくとも１種以上であることを特徴とする１８又は１９の塩基判定用キット。
２５．生理活性物質に結合される標識が、蛍光化学物質、発光団、酵素、蛍光蛋白質、発光蛋白質、磁性体および導電性物質からなる群より選ばれた少なくとも１種以上であることを特徴とする１８又は１９の塩基判定用キット。
That is, the present invention has the following configuration.
1. A method for determining a base site on a target nucleic acid sequence contained in a sample solution, comprising at least the following steps (1) to (4):
(1) Nucleic acid amplification reaction from a target nucleic acid sequence using an oligonucleotide primer (A) to which a first ligand is bound and an oligonucleotide primer (B) complementary to a part of the extension product of the primer (A) The primer (A, B) is selected from any of the following combinations (a) or (b): (a) homologous to the upstream region of the base site (X) to be determined A combination of the primer (A) and the primer (B) complementary to the downstream region of the base site (X) to be determined; (b) the homologous to the upstream region of the base site (X) to be determined A combination of the primer (B) and the primer (A) complementary to the downstream region of the base site (X) to be determined (2) an extension product of the primer (A) obtainable in the first step; Ligand bound and the extension product A complex (Pc) hybridized with at least one type of oligonucleotide probe for detection (C) that specifically binds to the base site (X) of the DNA, and a primer (A) obtainable in the first step And a hybrid obtained by hybridizing the extension product of at least one detection oligonucleotide probe (D) to which the third ligand is bound and specifically binds to the base site (X) of the extension product Second step of forming (Pd) (3) Third step of detecting whether the first ligand and the second ligand coexist in the complex (Pc) obtainable in the second step (4) Fourth step of detecting whether or not the first ligand and the third ligand coexist in the complex (Pd) obtained in the second step. The base determination method according to 1, wherein the oligonucleotide probe (C) and / or (D) is present in the first step.
3. In the second step, when the complex (Pc) is formed, an extension reaction of the oligonucleotide probe (C) is performed using the extension product of the primer (A) as a template, and when the complex (Pd) is formed, the primer (A 1) The base determination method according to 1 or 2, wherein the extension reaction of the oligonucleotide probe (D) is carried out using the extension product as a template.
4). The base determination method according to any one of 1 to 3, wherein the third step and the fourth step are performed simultaneously.
5. The base determination method according to any one of 1 to 4, wherein the first ligand is at least one selected from the group consisting of an antigen, an antibody, a fluorescent substance, a luminophore, and an enzyme.
6). The base determination method according to any one of 1 to 4, wherein the second ligand is at least one selected from the group consisting of an antigen, an antibody, a fluorescent substance, a luminophore, and an enzyme.
7). The base determination method according to any one of 1 to 4, wherein the third ligand is at least one selected from the group consisting of an antigen, an antibody, a fluorescent substance, a luminophore, and an enzyme.
8). The base determination method according to any one of 1 to 7, wherein the third step includes any of the following steps (i) and (ii):
(I) The step of detecting the second ligand after capturing the complex (Pc) on the solid phase to which the capture agent for the first ligand is bound (ii) The label can be bound to and labeled with the second ligand At least one type of physiologically active substance is captured on the solid phase to which the capture agent of the first ligand is bound via the complex (Pc), and then captured on the solid phase via the complex (Pc). 8. detecting a label of the physiologically active substance thus produced; The fourth step includes any one of the following steps (i) or (ii): The base determination method according to any one of 1 to 8, wherein
(I) a step of detecting the third ligand after capturing the complex (Pd) on the solid phase to which the capture agent for the first ligand is bound; and (ii) binding to and labeling the third ligand. At least one type of physiologically active substance is captured on the solid phase to which the capture agent of the first ligand is bound via the complex (Pd), and then captured on the solid phase via the complex (Pd). 10. detecting a label of the bioactive substance thus formed; 8. The base determination method according to 8 or 9, wherein the capture agent for the first ligand is at least one selected from the group consisting of an antibody, an oligonucleotide, a receptor, a nucleic acid-specific binding substance, and avidin.
11. 8. The base determination method according to 8 or 9, wherein the physiologically active substance is at least one selected from the group consisting of an antibody, an oligonucleotide, a receptor, a nucleic acid-specific binding substance, and avidin.
12 The label bonded to the physiologically active substance is at least one selected from the group consisting of a fluorescent chemical substance, a luminophore, an enzyme, a fluorescent protein, a photoprotein, a magnetic substance, and a conductive substance. Or the base determination method of 9.
13. 1 to 12 characterized in that the base at the 3 'end of the oligonucleotide probe (C) and / or (D) is the same or complementary base as the expected base of the base site (X) to be determined Either base determination method.
14 1 characterized in that the second base from the 3 ′ end of the oligonucleotide probe (C) and / or (D) is the same or complementary base as the expected base of the base site (X) to be determined. The base determination method in any one of -12.
15. The oligonucleotide probe (C) and / or (D) is characterized in that at least one base 3 to 5 from the 3 ′ end is substituted with a base that is not complementary or homologous to the nucleic acid sequence used as a template. 13 or 14 base determination method.
16. The base determination method according to any one of 1 to 15, wherein at least one nucleotide from the 3 ′ end of the oligonucleotide probe (C) and / or (D) is labeled with a ligand.
17. The base determination method according to any one of 1 to 16, wherein the 5 ′ end of the oligonucleotide probe (C) and / or (D) is labeled with a ligand.
18. A base determination kit comprising at least the following (1) to (3):
(1) An oligonucleotide primer (A) to which a first ligand is bound, an oligonucleotide primer (B) complementary to a part of the extension product of the primer (A), and the primers (A, B) It is selected from any of the following combinations (a) or (b): (a) the primer (A) homologous to the upstream region of the base site (X) to be determined, and the base site (X) to be determined A combination of the primer (B) complementary to the downstream region of the primer; (b) the primer (B) homologous to the upstream region of the base site (X) to be determined and the downstream region of the base site (X) to be determined (2) The extension product of the primer (A) is bound to the second ligand and specifically binds to the base site (X) of the extension product. At least one detection oligonucleotide Otide probe (C)
(3) At least one type of oligonucleotide probe for detection (D) in which the extension product of the primer (A) is bound to a third ligand and specifically binds to the base site (X) of the extension product
19. Furthermore, the kit for 13 base determination characterized by including the following (4) and (5).
(4) at least one physiologically active substance capable of binding to and labeled with the second ligand and / or at least one physiologically active substance capable of binding to and labeled with the third ligand (5) first A solid phase to which a ligand capture agent is bound.
20. The kit for determining a base according to 18 or 19, wherein the first ligand is at least one selected from the group consisting of an antigen, an antibody, a fluorescent substance, a luminophore, and an enzyme.
21. The kit for determining a base according to 18 or 19, wherein the second ligand is at least one selected from the group consisting of an antigen, an antibody, a fluorescent substance, a luminophore, and an enzyme.
22. A kit for determining a base according to 18 or 19, wherein the third ligand is at least one selected from the group consisting of an antigen, an antibody, a fluorescent substance, a luminophore, and an enzyme.
23. 18. The kit for determining a base according to 18 or 19, wherein the capture agent for the first ligand is at least one selected from the group consisting of an antibody, an oligonucleotide, a receptor, a nucleic acid-specific binding substance, and avidin.
24. The kit for determining a base according to 18 or 19, wherein the physiologically active substance is at least one selected from the group consisting of an antibody, an oligonucleotide, a receptor, a nucleic acid-specific binding substance and avidin.
25. The label bonded to the physiologically active substance is at least one selected from the group consisting of a fluorescent chemical substance, a luminophore, an enzyme, a fluorescent protein, a photoprotein, a magnetic substance and a conductive substance. Or 19 base determination kits.
本発明により、試料核酸中の複数の塩基多型を明確にまた簡便に、再現性よく検出できる方法が提供される。 The present invention provides a method capable of clearly and simply detecting a plurality of nucleotide polymorphisms in a sample nucleic acid with good reproducibility.
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明において「試料溶液」とは、標的核酸配列すなわち解析の対象となる塩基多型部位を含む染色体又はその断片に相補的な配列を有する核酸を含む溶液を指し、例えば、バクテリア、動物または植物組織、個体細胞由来の溶解物などのあらゆる材料から調製することができる。該試料溶液の調製法は特に限定されないが、例えば、患者の血液、組織から、既知の方法により調製してもよい。代表的なものとして、フェノール／クロロホルム抽出法（Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ ａｃｔａ 第７２巻、第６１９〜６２９頁、１９６３年）、アルカリＳＤＳ法（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ 第７巻、第１５１３〜１５２３頁、１９７９年）等の液相で行う方法がある。また、核酸の単離に核酸結合用担体を用いる系としては、ガラス粒子とヨウ化ナトリウム溶液を使用する方法（Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． ＵＳＡ 第７６−２巻、第６１５〜６１９頁、１９７９年）、ハイドロキシアパタイトを用いる方法（特開昭６３−２６３０９３号公報）等がある。その他の方法としてはシリカ粒子とカオトロピックイオンを用いた方法（Ｊ． Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ 第２８−３巻、第４９５〜５０３頁、１９９０年、特開平２−２８９５９６号公報）が挙げられる。
Hereinafter, the present invention will be described in detail.
In the present invention, the “sample solution” refers to a solution containing a nucleic acid having a sequence complementary to a target nucleic acid sequence, that is, a chromosome containing a nucleotide polymorphism site to be analyzed or a fragment thereof, for example, bacteria, animals or plants. It can be prepared from any material such as tissue, lysates from individual cells. The method for preparing the sample solution is not particularly limited. For example, it may be prepared from a patient's blood or tissue by a known method. Typical examples include phenol / chloroform extraction method (Biochimica et Biophysica acta 72, 619-629, 1963), alkaline SDS method (Nucleic Acid Research 7, 1513-1523, 1979). There is a method of performing in the liquid phase. Further, as a system using a nucleic acid binding carrier for nucleic acid isolation, a method using glass particles and a sodium iodide solution (Proc. Natl. Acad. USA, Vol. 76-2, 615-619, 1979). ) And a method using hydroxyapatite (Japanese Patent Laid-Open No. 63-263093). Examples of other methods include a method using silica particles and chaotropic ions (J. Clinical Microbiology Vol. 28-3, 495-503, 1990, JP-A-2-289596).
本発明において「標的核酸配列」とは、標的核酸すなわち解析の対象となる塩基多型部位を含む核酸の配列を指す。該標的核酸の例としては、Ａｌｕ配列、リボゾーム遺伝子、蛋白質をコードする遺伝子のエキソンやイントロン、プロモーターなどが例示できる。より具体的には、遺伝病を含む各種疾患、薬物代謝、生活習慣病（高血圧、糖尿病等）に関連する遺伝子が挙げられる。例えば、薬物代謝に関連する遺伝子としてＣＹＰ２Ｃ１９ （Cytochrome P450 2C19）遺伝子が挙げられる。 In the present invention, the “target nucleic acid sequence” refers to a target nucleic acid, that is, a nucleic acid sequence containing a nucleotide polymorphism site to be analyzed. Examples of the target nucleic acid include an Alu sequence, a ribosomal gene, an exon, intron, and promoter of a gene encoding a protein. More specifically, genes related to various diseases including genetic diseases, drug metabolism, lifestyle-related diseases (hypertension, diabetes, etc.) can be mentioned. For example, the CYP2C19 (Cytochrome P450 2C19) gene can be mentioned as a gene related to drug metabolism.
本発明において「塩基多型」とは、核酸が野生型とは異なる塩基配列を有することをいう。野生型の塩基配列を有する野生型核酸のうち少なくとも１つ、好ましくは１つのヌクレオチドが点突然変異して他のヌクレオチドに置換されているものや、該野生型核酸の一部に挿入、欠失配列等を含む核酸、すなわち変異型核酸について、どの部位のヌクレオチドが変異しているかが解明されてきている。また、このような塩基多型により体質等が異なっていることも解明されてきており、本発明の方法は試料中の核酸がこのような予想される変異を有しているか否かを検査する方法であり、「塩基部位（Ｘ）」とは、該塩基多型のうち検査の対象として判定しようとする塩基部位を示す。 In the present invention, the “base polymorphism” means that the nucleic acid has a base sequence different from that of the wild type. At least one of wild-type nucleic acids having a wild-type base sequence, preferably one nucleotide is point-mutated and replaced with another nucleotide, or inserted or deleted in a part of the wild-type nucleic acid It has been elucidated which part of the nucleotide is mutated in a nucleic acid containing a sequence, that is, a mutant nucleic acid. In addition, it has been elucidated that the constitution is different depending on such base polymorphism, and the method of the present invention examines whether or not the nucleic acid in the sample has such an expected mutation. This is a method, and “base part (X)” indicates a base part to be determined as a test target in the base polymorphism.
本発明において、第一のリガンドが結合したオリゴヌクレオチドプライマー（Ａ）と、該プライマー（Ａ）の伸長産物の一部と相補的なオリゴヌクレオチドプライマー(Ｂ)とは、下記の(ａ)または(ｂ)のいずれかの組み合わせから選択される。
（ａ）判定したい塩基部位（Ｘ）の上流領域と相同的な該プライマー（Ａ）と、判定したい塩基部位（Ｘ）の下流領域と相補的な該プライマー(Ｂ)との組合せ。
（ｂ）判定したい塩基部位（Ｘ）の上流領域と相同的な該プライマー（Ｂ）と、判定したい塩基部位（Ｘ）の下流領域と相補的な該プライマー(Ａ)との組合せ。
（ａ）の設定方法を図１に、（ｂ）の設定方法を図２に示す。
以下、（ａ）の組み合わせを例として説明するがこれに限定されるものではない。
In the present invention, the oligonucleotide primer (A) to which the first ligand is bound and the oligonucleotide primer (B) complementary to a part of the extension product of the primer (A) are the following (a) or ( It is selected from any combination of b).
(A) A combination of the primer (A) homologous to the upstream region of the base site (X) to be determined and the primer (B) complementary to the downstream region of the base site (X) to be determined.
(B) A combination of the primer (B) homologous to the upstream region of the base site (X) to be determined and the primer (A) complementary to the downstream region of the base site (X) to be determined.
The setting method of (a) is shown in FIG. 1, and the setting method of (b) is shown in FIG.
Hereinafter, the combination of (a) will be described as an example, but the present invention is not limited to this.
本発明において、第一のリガンドが結合しておりかつ判定したい塩基部位（Ｘ）上流領域に相同的なオリゴヌクレオチドプライマー（Ａ）と、判定したい塩基部位（Ｘ）の下流領域に相補的なオリゴヌクレオチドプライマー（Ｂ）とは、対象となる核酸配列を含む染色体又はその断片に相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドであって、既知の増幅方法であるＰＣＲ、ＮＡＳＢＡ、ＬＣＲ、ＳＤＡ、ＲＣＡ、ＴＭＡ、ＬＡＭＰ、ＩＣＡＮおよびＵＣＡＮ法に使用でき、増幅された核酸断片が判定したい塩基部位（Ｘ）を含みうるものであれば特に限定されるものではなく、必要に応じて修飾されていても良い。プライマー鎖長は、９〜３５塩基であればよく、好ましくは、１１〜３０塩基である。該プライマーは検出したい核酸配列に応じて、複数混在していても良い。例えば、判定したい塩基部位（Ｘ）が複数箇所存在する場合、所望により、プライマー（Ａ）および／またはプライマー（Ｂ）を複数、混在させてもよい。複数のプライマーを使用し、一つの反応系で増幅反応を行うことができる。複数のプライマー（Ａ）を混合して用いる場合、第一のリガンドの種類を変えても良い。 In the present invention, an oligonucleotide primer (A) to which the first ligand is bound and which is homologous to the upstream region of the base site (X) to be judged, and an oligo complementary to the downstream region of the base site (X) to be judged The nucleotide primer (B) is an oligonucleotide having a sequence complementary to a chromosome containing a target nucleic acid sequence or a fragment thereof, and is a known amplification method such as PCR, NASBA, LCR, SDA, RCA, TMA, It is not particularly limited as long as it can be used in the LAMP, ICAN and UCAN methods, and the amplified nucleic acid fragment can contain the base site (X) to be determined, and may be modified as necessary. The primer chain length may be 9 to 35 bases, and preferably 11 to 30 bases. A plurality of the primers may be mixed depending on the nucleic acid sequence to be detected. For example, when there are a plurality of base sites (X) to be determined, a plurality of primers (A) and / or primers (B) may be mixed as desired. An amplification reaction can be performed in one reaction system using a plurality of primers. When a plurality of primers (A) are mixed and used, the type of the first ligand may be changed.
本発明において、第一のリガンドが結合しておりかつ判定したい塩基部位（Ｘ）上流領域に相同的なオリゴヌクレオチドプライマー（Ａ）、第二のリガンドが結合しておりかつ該伸長産物の塩基部位（Ｘ）と特異的に結合する少なくとも１種類の検出用オリゴヌクレオチドプローブ（Ｃ）、第三のリガンドが結合しておりかつ該伸長産物の塩基部位（Ｘ）と特異的に結合する少なくとも１種類の検出用オリゴヌクレオチドプローブ（Ｄ）の伸長方法は、基本的には、従来の方法を用いて行うことができる。通常、一本鎖に変性させた特定の塩基多型部位を含む染色体又はその断片に、４種類のデオキシヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）及びＤＮＡポリメラーゼを共に、作用させることで、標的核酸を鋳型としてオリゴヌクレオチドが伸長する。 In the present invention, the oligonucleotide primer (A) homologous to the upstream region of the base site (X) to which the first ligand is bound and to be determined, the base site of the extension product to which the second ligand is bound At least one kind of oligonucleotide probe for detection (C) that specifically binds to (X), at least one kind that specifically binds to the base site (X) of the extension product to which the third ligand is bound The method of extending the oligonucleotide probe (D) for detection can basically be performed using a conventional method. Usually, a target nucleic acid is used as a template by allowing four types of deoxynucleoside triphosphates (dNTP) and DNA polymerase to act on a chromosome or fragment thereof containing a specific nucleotide polymorphism site denatured into a single strand. The oligonucleotide is extended.
該伸長反応は、Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Third Edition （Sambrookら、第８章、第８．１〜８．１２６頁、２００１年）に記載の方法に従って行うことができる。また、標的核酸が検出するのに十分な量が含まれていない場合、予め前記判定したい塩基部位（Ｘ）を含む核酸断片を以下に示す増幅反応によって、増幅しておくことも可能である。 The extension reaction can be performed according to the method described in Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Third Edition (Sambrook et al., Chapter 8, 8.1-8.126, 2001). If the target nucleic acid does not contain a sufficient amount for detection, a nucleic acid fragment containing the base site (X) to be determined can be amplified in advance by the amplification reaction shown below.
本発明において、特定の塩基多型部位を含む染色体又は断片の増幅方法も、基本的には、従来の方法を用いて行うことができ、通常、一本鎖に変性させた特定の塩基多型部位を含む染色体又はその断片に、４種類のデオキシヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）及びＤＮＡポリメラーゼ及びオリゴヌクレオチドプライマー（Ａ）および（Ｂ）を作用させることで、標的核酸を鋳型として用いたオリゴヌクレオチドプライマー間の配列が増幅される。 In the present invention, a method for amplifying a chromosome or fragment containing a specific nucleotide polymorphism site can also be basically performed using a conventional method, and usually a specific nucleotide polymorphism denatured into a single strand. Oligonucleotide primer using target nucleic acid as template by allowing 4 types of deoxynucleoside triphosphate (dNTP), DNA polymerase and oligonucleotide primers (A) and (B) to act on the chromosome containing the site or fragment thereof The sequence between is amplified.
核酸増幅方法としては、ＰＣＲ、ＮＡＳＢＡ（Nucleic acid sequence-basedamplification method；Nature 第３５０巻、第９１頁（１９９１年））、ＬＣＲ（国際公開８９／１２６９６号公報、特開平２−２９３４号公報）、ＳＤＡ（Strand Displacement Amplification：Nucleic acid research 第２０巻、第１６９１頁（１９９２年））、ＲＣＡ（国際公開９０／１０６９号公報）、ＴＭＡ（Transcription mediated amplification method；J.Clin.Microbiol. 第３１巻、第３２７０頁（１９９３年））、ＬＡＭＰ（loop-mediated isothermal amplification method：J Clin Microbiol. 第４２巻：第１，９５６頁（２００４年））、ＩＣＡＮ（isothermal and chimeric primer-initiated amplification of nucleic acids：Kekkaku. 第７８巻、第５３３頁（２００３年））などが挙げられる。 Examples of nucleic acid amplification methods include PCR, NASBA (Nucleic acid sequence-based amplification method; Nature 350, 91 (1991)), LCR (International Publication No. 89/12696, JP-A-2-2934), SDA (Strand Displacement Amplification: Nucleic acid research Vol. 20, 1691 (1992)), RCA (International Publication No. 90/1069), TMA (Transcription mediated amplification method; J. Clin. Microbiol. Vol. 31, 3270 (1993)), LAMP (loop-mediated isothermal amplification method: J Clin Microbiol. 42: 1,956 (2004)), ICAN (isothermal and chimeric primer-initiated amplification of nucleic acids: Kekkaku. 78, 533 (2003)).
なかでもＰＣＲ法は、試料核酸、４種類のデオキシヌクレオシド三リン酸、一対のオリゴヌクレオチド及び耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの存在下で、変性、アニーリング、伸長の３工程からなるサイクルを繰り返すことにより、上記一対のオリゴヌクレオチドプライマーで挟まれる試料核酸の領域を指数関数的に増幅させる方法である。すなわち、変性工程で試料の核酸を変性し、続くアニーリング工程において各オリゴヌクレオチドプライマーと、それぞれに相補的な一本鎖試料核酸上の領域とをハイブリダイズさせ、続く伸長工程で、各オリゴヌクレオチドプライマーを起点としてＤＮＡポリメラーゼの働きにより鋳型となる各一本鎖試料核酸に相補的なＤＮＡ鎖を伸長させ、二本鎖ＤＮＡとする。この１サイクルにより、１本の二本鎖ＤＮＡが２本の二本鎖ＤＮＡに増幅される。従って、このサイクルをｎ回繰り返せば、理論上、上記一対のオリゴヌクレオチドプライマーで挟まれた試料ＤＮＡの領域は２のｎ乗倍に増幅される。増幅されたＤＮＡ領域は大量に存在するので、電気泳動等の方法により容易に検出できる。よって、遺伝子増幅法を用いれば、従来では検出不可能であった、極めて微量（１分子でも可）の試料核酸をも検出することが可能であり、最近非常に広く用いられている技術である。 In particular, the PCR method repeats a cycle consisting of three steps of denaturation, annealing, and extension in the presence of a sample nucleic acid, four types of deoxynucleoside triphosphates, a pair of oligonucleotides, and a heat-resistant DNA polymerase, and thereby the above paired pair. In this method, the region of the sample nucleic acid sandwiched between the oligonucleotide primers is exponentially amplified. That is, the nucleic acid of the sample is denatured in the denaturation step, each oligonucleotide primer is hybridized with a region on the single-stranded sample nucleic acid complementary to each in the subsequent annealing step, and each oligonucleotide primer is then synthesized in the subsequent extension step. The DNA strand complementary to each single-stranded sample nucleic acid serving as a template is extended by the action of DNA polymerase from the starting point to form double-stranded DNA. By this one cycle, one double-stranded DNA is amplified into two double-stranded DNAs. Therefore, if this cycle is repeated n times, the region of the sample DNA sandwiched between the pair of oligonucleotide primers is theoretically amplified to 2 n times. Since the amplified DNA region exists in a large amount, it can be easily detected by a method such as electrophoresis. Therefore, if a gene amplification method is used, it is possible to detect even a very small amount of sample nucleic acid that could not be detected in the past (one molecule is acceptable), which is a very widely used technique recently. .
本発明に用いられる「第二のリガンドが結合しておりかつ該伸長産物の塩基部位（Ｘ）と特異的に結合する少なくとも１種類の検出用オリゴヌクレオチドプローブ（Ｃ）」および「第三のリガンドが結合しておりかつ該伸長産物の塩基部位（Ｘ）と特異的に結合する少なくとも１種類の検出用オリゴヌクレオチドプローブ（Ｄ）」は、好適には該プライマー（Ａ）の伸長産物のうち該塩基部位（Ｘ）を含む部分に相補的なオリゴヌクレオチドにリガンドが結合されたもの、より好適には、オリゴヌクレオチドプライマー（Ａ）および（Ｂ）を用いて増幅した核酸断片のうちの該プライマー（Ａ）の伸長産物のうち該塩基部位（Ｘ）を含む部分に相補的なオリゴヌクレオチドにリガンドが結合されたものを用いることができ、上記プローブ（Ｃ）および（Ｄ）の伸長反応を阻害しない位置にリガンドを結合させることが好ましい。該リガンドを結合させる位置としては、該オリゴヌクレオチドプローブ（Ｃ）および（Ｄ）の３’末端から２番目以降の少なくとも一つのヌクレオチドにリガンドを結合させることが好ましく、該オリゴヌクレオチドプローブ（Ｃ）および（Ｄ）の５’末端にリガンドを結合させることがより好ましい。 “At least one type of detection oligonucleotide probe (C) to which the second ligand is bound and specifically binds to the base site (X) of the extension product” and “third ligand” used in the present invention And at least one type of detection oligonucleotide probe (D) that specifically binds to the base site (X) of the extension product is preferably selected from the extension products of the primer (A). A primer having a ligand bound to an oligonucleotide complementary to a portion containing the base site (X), more preferably, the primer (of the nucleic acid fragment amplified using the oligonucleotide primers (A) and (B)) ( Among the extension products of A), a product in which a ligand is bound to an oligonucleotide complementary to the portion containing the base site (X) can be used, and the probe (C And it is attached to the ligand at a position that does not inhibit the extension reaction of (D) is preferred. As the position for binding the ligand, it is preferable to bind the ligand to at least one nucleotide after the 3 ′ end of the oligonucleotide probes (C) and (D), and the oligonucleotide probe (C) and More preferably, a ligand is bound to the 5 ′ end of (D).
また、該オリゴヌクレオチドプローブ（Ｃ）および（Ｄ）は、３’末端より1番目または２番目の塩基が、判定したい塩基部位（Ｘ）の位置に相当するように設計するのがよい。好ましくは、２番目の塩基が、該塩基部位（Ｘ）の位置に相当するように設計するのがよい。また、本発明の効果を損なわないように、３’末端より３番目や３番目以降の塩基を該塩基部位（Ｘ）の位置に相当するように設計してもよい。さらに、３’末端より３から５番目の少なくとも1つの塩基が、鋳型となる核酸配列と相補的でない塩基に置換させることによって、該塩基部位（Ｘ）が存在した場合、より選択的に該オリゴヌクレオチドプローブ（Ｃ）および（Ｄ）の伸長反応が起こりうるようにしてもよい。該オリゴヌクレオチドプローブの鎖長は、５〜２５塩基であればよく、好ましくは、１０〜２０塩基である。 The oligonucleotide probes (C) and (D) are preferably designed so that the first or second base from the 3 'end corresponds to the position of the base site (X) to be determined. Preferably, the second base is designed so as to correspond to the position of the base site (X). In order not to impair the effects of the present invention, the third and third bases from the 3 'end may be designed to correspond to the position of the base site (X). Furthermore, when the base site (X) is present by substituting at least one base 3 to 5 from the 3 ′ end with a base that is not complementary to the template nucleic acid sequence, the oligo is more selectively selected. The extension reaction of the nucleotide probes (C) and (D) may occur. The chain length of the oligonucleotide probe may be 5 to 25 bases, and preferably 10 to 20 bases.
また、該オリゴヌクレオチドプローブ（Ｃ）および（Ｄ）は、オリゴヌクレオチドプライマー（Ａ）および（Ｂ）を用いた増幅反応を阻害しないように設計するのがよい。その一例として、該オリゴヌクレオチドプローブ（Ｃ）および（Ｄ）のＴｍ値を該プライマー（Ａ，Ｂ）のＴｍ値より低くなるように設計すればよい。 The oligonucleotide probes (C) and (D) are preferably designed so as not to inhibit the amplification reaction using the oligonucleotide primers (A) and (B). As an example, the oligonucleotide probes (C) and (D) may be designed to have a Tm value lower than that of the primers (A, B).
オリゴヌクレオチドプライマーのＴｍ値は、ハイブリッドを形成した２本鎖ＤＮＡ分子の５０％が乖離する温度のことであり、その計算方法としては、既知の方法であれば特に限定されないが、Ｎｅａｒｅｓｔ ｎｅｉｇｈｂｏｒ ｍｅｔｈｏｄ、Ｗａｌｌａｃｅ法、ＧＣ％法のいずれかにより求められたもので、本発明の特性を満たしていることが必要である。なお、特に好ましいＴｍ値はＮｅａｒｅｓｔ ｎｅｉｇｈｂｏｒ ｍｅｔｈｏｄで計算されたものである。該オリゴヌクレオチドプローブ（Ｃ，Ｄ）および該プライマー（Ａ，Ｂ）におけるＴｍ値の差は１℃以上であれば特に限定されるものではないが、好ましくは５℃以上である。なお、Ｔｍ値の差は５０℃以下であればよく、好ましくは４０℃以下がよい。プローブ鎖長は、５〜３０塩基であればよく、好ましくは、８〜２５塩基である。 The Tm value of the oligonucleotide primer is a temperature at which 50% of the double-stranded DNA molecules forming the hybrid are separated from each other, and the calculation method is not particularly limited as long as it is a known method, but the Neighbor Neighbor method, It is obtained by either the Wallace method or the GC% method and needs to satisfy the characteristics of the present invention. Note that a particularly preferable Tm value is calculated by the Nearest neighbor method. The difference in Tm value between the oligonucleotide probe (C, D) and the primer (A, B) is not particularly limited as long as it is 1 ° C or higher, but is preferably 5 ° C or higher. In addition, the difference of Tm value should just be 50 degrees C or less, Preferably 40 degrees C or less is good. The probe chain length may be 5 to 30 bases, and preferably 8 to 25 bases.
本発明においては、第一のリガンドが結合した少なくとも１種類のオリゴヌクレオチドプライマー（Ａ）と、第二のリガンドが結合しておりかつ該伸長産物の塩基部位（Ｘ）と特異的に結合する少なくとも１種類の検出用オリゴヌクレオチドプローブ（Ｃ）、および第三のリガンドが結合しておりかつ該伸長産物の塩基部位（Ｘ）と特異的に結合する少なくとも１種類の検出用オリゴヌクレオチドプローブ（Ｄ）は、別々、又は同時に作用させることが可能である。 In the present invention, at least one oligonucleotide primer (A) to which the first ligand is bound, and at least the second ligand is bound and specifically binds to the base site (X) of the extension product. One type of detection oligonucleotide probe (C), and at least one type of detection oligonucleotide probe (D) to which a third ligand is bound and specifically binds to the base site (X) of the extension product Can act separately or simultaneously.
別々に作用させる場合には、一例として、上記オリゴヌクレオチドプライマー（Ａ）および（Ｂ）を用いて増幅反応を行った後に該オリゴヌクレオチドプローブ（Ｃ）および（Ｄ）を加え、９８℃、３分の熱変性を行ってから徐々に室温付近まで温度を下げることができる。 When acting separately, as an example, after performing an amplification reaction using the oligonucleotide primers (A) and (B), the oligonucleotide probes (C) and (D) are added, and 98 ° C. for 3 minutes. The temperature can be gradually lowered to near room temperature after the thermal denaturation of is carried out.
同時に作用させる場合には、一例として、上記オリゴヌクレオチドプライマー（Ａ）、（Ｂ）および該オリゴヌクレオチドプローブ（Ｃ）、（Ｄ）を混合した状態で増幅反応を行い、増幅反応に引き続いて９８℃、３分の熱変性を行ってから徐々に室温付近まで温度を下げることができる。 When acting simultaneously, as an example, an amplification reaction is performed in a state where the oligonucleotide primers (A) and (B) and the oligonucleotide probes (C) and (D) are mixed. After performing heat denaturation for 3 minutes, the temperature can be gradually lowered to near room temperature.
核酸増幅法から複合体（Ｐｃ）および／または（Ｐｄ）を形成せしめるまでは、ホモジニアスな系で実施しても良い。例えば、試料核酸、４種類のデオキシヌクレオシド三リン酸、プライマー（Ａ）、プライマー（Ｂ）、検出用オリゴヌクレオチドプローブ（Ｃ）、検出用オリゴヌクレオチドプローブ（Ｄ）及び耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの存在下で、変性、アニーリング、伸長の３工程からなるサイクルを繰り返し、核酸増幅反応を行う。その後、９８℃、３分の熱変性を行ってから徐々に室温付近まで温度を下げ、検出用オリゴヌクレオチドプローブ（Ｃ）および／または（Ｄ）とプライマー（Ａ）の伸長産物をハイブリダイズせしめる。その後、反応系に存在する耐熱性ＤＮＡポリメラーゼにより、プライマー（Ａ）の伸長産物を鋳型として検出用オリゴヌクレオチドプローブ（Ｃ）および／または（Ｄ）の伸長反応を行い、オリゴヌクレオチドプローブ（Ｃ）および／または（Ｄ）の伸長産物とプライマー（Ａ）の伸長産物の複合体（Ｐｃ）および／または（Ｐｄ）を形成せしめる。その後、複合体（Ｐｃ）および／または（Ｐｄ）の検出を行えばよい。 Until the complex (Pc) and / or (Pd) is formed from the nucleic acid amplification method, a homogeneous system may be used. For example, in the presence of sample nucleic acid, 4 types of deoxynucleoside triphosphates, primer (A), primer (B), detection oligonucleotide probe (C), detection oligonucleotide probe (D) and thermostable DNA polymerase A nucleic acid amplification reaction is performed by repeating a cycle consisting of three steps of denaturation, annealing, and extension. Then, after heat denaturation at 98 ° C. for 3 minutes, the temperature is gradually lowered to near room temperature, and the extension product of the detection oligonucleotide probe (C) and / or (D) and the primer (A) is hybridized. Thereafter, an extension reaction of the oligonucleotide probe for detection (C) and / or (D) is carried out using the extension product of the primer (A) as a template by a heat-resistant DNA polymerase present in the reaction system, and the oligonucleotide probe (C) and A complex (Pc) and / or (Pd) of the extension product of (D) and the extension product of primer (A) is formed. Thereafter, the complex (Pc) and / or (Pd) may be detected.
使用される第一のリガンド、第二のリガンド、第三のリガンドは核酸配列の検出を妨げるものでないのであれば、特に限定されるものではないが、好適には抗原、抗体、蛍光物質、発光団、および酵素、アビジン、ビオチン、ジゴケシゲニン、ジニトロフェニルからなる群から選ぶことができる。好ましくは、抗原、蛍光物質、ビオチン、ジゴキシゲニン、ジニトロフェニルなどが良く、特に好ましくは抗原、蛍光物質、ビオチン、ジゴキシゲニン、ジニトロフェニルが良い。本発明を実施するにあたって、第一のリガンド、第二のリガンド、第三のリガンドは異なっていることが好ましい。例えば、第一リガンドにビオチン、第二のリガンドにＦＩＴＣ、第三のリガンドにジゴキシゲニンを用いてもよい。 The first ligand, the second ligand, and the third ligand to be used are not particularly limited as long as they do not interfere with the detection of the nucleic acid sequence, but are preferably antigens, antibodies, fluorescent substances, luminescence The group can be selected from the group consisting of enzymes, avidin, biotin, digokesigenin, dinitrophenyl. Preferably, antigens, fluorescent substances, biotin, digoxigenin, dinitrophenyl and the like are preferable, and antigens, fluorescent substances, biotin, digoxigenin and dinitrophenyl are particularly preferable. In practicing the present invention, the first ligand, the second ligand, and the third ligand are preferably different. For example, biotin may be used as the first ligand, FITC as the second ligand, and digoxigenin as the third ligand.
本発明の重要な開示の一つは、第一工程で得られうるプライマー（Ａ）の伸長産物に、オリゴヌクレオチドプローブ（Ｃ，Ｄ）をハイブリダイズさせる場合に、プライマー（Ａ）の伸長産物を鋳型とする伸長反応を行ってオリゴヌクレオチドプローブ（Ｃ，Ｄ）の伸長産物とプライマー（Ａ）の伸長産物の複合体（Ｐｃ，Ｐｄ）を形成せしめることによって、従来公知の伸長反応を行わないハイブリダイゼーション法と比較して複合体（Ｐｃ，Ｐｄ）の生成量が大幅に向上し、塩基多型を明確にまた簡便に同定できるような顕著な効果を見出したことにある。 One of the important disclosures of the present invention is that when the oligonucleotide probe (C, D) is hybridized to the extension product of the primer (A) that can be obtained in the first step, the extension product of the primer (A) By performing an extension reaction using a template to form a complex (Pc, Pd) of the extension product of the oligonucleotide probe (C, D) and the extension product of the primer (A), a conventionally known extension reaction is not performed. Compared to the hybridization method, the amount of complex (Pc, Pd) produced is greatly improved, and a remarkable effect has been found that allows the base polymorphism to be clearly and easily identified.
この原理は、オリゴヌクレオチドプローブ（Ｃ，Ｄ）と「プライマー（Ａ）の伸長産物」の複合体を（ｐ’ｃ，ｐ’ｄ）とすると、オリゴヌクレオチドプローブ（Ｃ，Ｄ）の伸長産物と「プライマー（Ａ）の伸長産物」の複合体（Ｐｃ，Ｐｄ）の方が、複合体（ｐ’ｃ，ｐ’ｄ）より、はるかに安定であることに由来する。一般に、「第一工程で得られうるプライマー（Ａ）の伸長産物」を含む二本鎖核酸の方がオリゴヌクレオチドプローブ（Ｃ，Ｄ）よりはるかに長いため、該二本鎖核酸の変性により形成された一本鎖核酸同士がハイブリダイズして元の二本鎖核酸を形成する反応の方が、該一本鎖核酸の一方すなわち「プライマー（Ａ）の伸長産物」に該オリゴヌクレオチドプローブ（Ｃ，Ｄ）がハイブリダイズして複合体（ｐ’ｃ，ｐ’ｄ）を形成する反応よりはるかに優勢である。該オリゴヌクレオチドプローブ（Ｃ，Ｄ）を「プライマー（Ａ）の伸長産物」にハイブリダイズさせ、該伸長産物を鋳型として伸長させることによって形成された該オリゴヌクレオチドプローブ（Ｃ，Ｄ）の伸長産物の方が、該オリゴヌクレオチドプローブ（Ｃ，Ｄ）よりはるかに長いため、複合体（Ｐｃ，Ｐｄ）の方が複合体（ｐ’ｃ，ｐ’ｄ）よりはるかに大量に存在しうる。また、伸長反応とは、換言すれば一本鎖核酸を鋳型とした相補鎖の合成によって合成二本鎖核酸を形成せしめる反応であり、該合成反応は、二本鎖核酸の変性により形成された一本鎖核酸同士がハイブリダイズして元の二本鎖核酸を形成する反応よりはるかに優勢であることからも、プライマー（Ａ）の伸長産物を鋳型とするオリゴヌクレオチドプローブ（Ｃ，Ｄ）の伸長反応によって複合体（Ｐｃ，Ｐｄ）の生成量が大幅に向上し、該複合体（Ｐｃ，Ｐｄ）は複合体（ｐ’ｃ，ｐ’ｄ）よりはるかに大量に存在しうる。 This principle is that when the complex of the oligonucleotide probe (C, D) and “primer (A) extension product” is (p′c, p′d), the extension product of the oligonucleotide probe (C, D) This is because the complex (Pc, Pd) of the “primer (A) extension product” is much more stable than the complex (p′c, p′d). In general, a double-stranded nucleic acid containing a “primer (A) extension product obtainable in the first step” is much longer than an oligonucleotide probe (C, D), so it is formed by denaturation of the double-stranded nucleic acid. In the reaction in which the single-stranded nucleic acids thus hybridized to form the original double-stranded nucleic acid, one of the single-stranded nucleic acids, that is, the “extension product of primer (A)” is linked to the oligonucleotide probe (C , D) is much more prevalent than the reaction of hybridizing to form a complex (p′c, p′d). An extension product of the oligonucleotide probe (C, D) formed by hybridizing the oligonucleotide probe (C, D) to the “extension product of the primer (A)” and using the extension product as a template. The complex (Pc, Pd) can be present in a much larger amount than the complex (p′c, p′d) because it is much longer than the oligonucleotide probe (C, D). In other words, the extension reaction is a reaction in which a synthetic double-stranded nucleic acid is formed by synthesizing a complementary strand using a single-stranded nucleic acid as a template, and the synthetic reaction is formed by denaturation of the double-stranded nucleic acid. Since this is far superior to the reaction in which single-stranded nucleic acids hybridize to form the original double-stranded nucleic acid, the oligonucleotide probe (C, D) using the extension product of the primer (A) as a template The production amount of the complex (Pc, Pd) is greatly improved by the extension reaction, and the complex (Pc, Pd) can be present in a much larger amount than the complex (p′c, p′d).
従って標的核酸配列上の塩基部位（Ｘ）の有無は、複合体の検出シグナルとなって反映される。塩基部位（Ｘ）が存在すれば、オリゴヌクレオチドプローブ（Ｃ，Ｄ）の伸長産物がえられ、複合体（Ｐｃ，Ｐｄ）の生成量が増えるため高いシグナルが得られる。逆に、塩基部位（Ｘ）が存在しなければ、オリゴヌクレオチドプローブ（Ｃ，Ｄ）の伸長産物が得られないため、複合体（Ｐｃ，Ｐｄ）が生成されず、シグナルが得られないか、若しくはごく少数の複合体（ｐ’ｃ，ｐ’ｄ）に起因する極度に低いシグナルとなる。ごく少数の複合体（ｐ’ｃ，ｐ’ｄ）に起因する極度に低いシグナルが観察される場合には、カットオフ値を設定してもよい。カットオフ値は対象とする塩基部位（Ｘ）毎に設定してもよい。カットオフ値の設定は、当業者であれば、容易に設定できる。 Therefore, the presence or absence of the base site (X) on the target nucleic acid sequence is reflected as a detection signal of the complex. If the base site (X) is present, an extension product of the oligonucleotide probe (C, D) is obtained, and the amount of complex (Pc, Pd) produced increases, so that a high signal is obtained. Conversely, if the base site (X) does not exist, an extension product of the oligonucleotide probe (C, D) cannot be obtained, so that no complex (Pc, Pd) is produced and no signal is obtained. Alternatively, the signal is extremely low due to very few complexes (p′c, p′d). If extremely low signals due to very few complexes (p'c, p'd) are observed, a cut-off value may be set. The cut-off value may be set for each target base site (X). A person skilled in the art can easily set the cutoff value.
本発明では、形成された複合体（Ｐｃ）中に第一のリガンドと第二のリガンドが共存しているかどうか、および、形成された複合体（Ｐｄ）中に第一のリガンドと第三のリガンドが共存しているかどうか、を確認できればよい。例えば、複合体（Ｐｃ）および（Ｐｄ）を第一のリガンドの捕捉剤が結合した固相上に捕捉した後、第二のリガンドと第三のリガンドを検出しても良い。このとき、該リガンドを直接検出しても良いし、該リガンドに結合できかつ標識されてなる少なくとも１種類の生理活性物質を、該複合体を介して固相上に捕捉し、該生理活性物質の標識を検出しても良い。また、第二のリガンドと第三のリガンドは同時に検出しても良いし、別々に検出しても良い。 In the present invention, whether the first ligand and the second ligand coexist in the formed complex (Pc), and the first ligand and the third ligand in the formed complex (Pd). What is necessary is just to be able to confirm whether the ligand coexists. For example, the second ligand and the third ligand may be detected after capturing the complexes (Pc) and (Pd) on a solid phase to which a capture agent for the first ligand is bound. At this time, the ligand may be directly detected, or at least one physiologically active substance that can be bound to the ligand and is labeled is captured on a solid phase via the complex, and the physiologically active substance is captured. May be detected. Further, the second ligand and the third ligand may be detected simultaneously or separately.
上記の一例として、図３に示すように、複合体（Ｐｃ）および（Ｐｄ）を第一のリガンドの捕捉剤が結合した固相上に捕捉し、第二のリガンドに結合できかつ標識されてなる少なくとも１種類の生理活性物質を、複合体（Ｐｃ）を介して第一のリガンドの捕捉剤が結合した固相上に捕捉した後、該複合体（Ｐｃ）を介して固相上に捕捉された該生理活性物質の標識を検出し、第三のリガンドに結合できかつ標識されてなる少なくとも１種類の生理活性物質を、複合体（Ｐｄ）を介して第一のリガンドの捕捉剤が結合した固相上に捕捉した後、該複合体（Ｐｄ）を介して固相上に捕捉された該生理活性物質の標識を検出することができる。また別の一例としては、図４に示すように、複合体（Ｐｃ）および（Ｐｄ）を第一のリガンドの捕捉剤が結合した固相上に捕捉し、第二のリガンドを直接検出した後、第三のリガンドに結合できかつ標識されてなる少なくとも１種類の生理活性物質を、複合体（Ｐｄ）を介して第一のリガンドの捕捉剤が結合した固相上に捕捉した後、該複合体（Ｐｄ）を介して固相上に捕捉された該生理活性物質の標識を検出することができる。 As an example of the above, as shown in FIG. 3, the complexes (Pc) and (Pd) are captured on the solid phase to which the capture agent of the first ligand is bound, and can be bound to the second ligand and labeled. The at least one physiologically active substance is captured on the solid phase to which the first ligand capture agent is bound via the complex (Pc), and then captured on the solid phase via the complex (Pc). The label of the bioactive substance thus detected is detected, and the capture agent for the first ligand binds to at least one bioactive substance that can be bound to the third ligand and is labeled via the complex (Pd). After capturing on the solid phase, the label of the physiologically active substance captured on the solid phase via the complex (Pd) can be detected. As another example, as shown in FIG. 4, after the complexes (Pc) and (Pd) are captured on the solid phase to which the capture agent of the first ligand is bound, the second ligand is directly detected. After capturing at least one type of physiologically active substance capable of binding to and labeled with the third ligand on the solid phase to which the capture agent of the first ligand is bound via the complex (Pd), The label of the physiologically active substance captured on the solid phase via the body (Pd) can be detected.
固相としては金属板、木片、プラスチック板、ガラス板、ゴム板、発泡スチロール、フィルム、膜、通液性フィルター、ゲル、アッセイプレートなどを使用してもよい。好ましくは、アッセイプレートがよい。 As the solid phase, a metal plate, a piece of wood, a plastic plate, a glass plate, a rubber plate, a polystyrene foam, a film, a membrane, a liquid-permeable filter, a gel, an assay plate, or the like may be used. An assay plate is preferable.
用いられる生理活性物質は第二または第三のリガンドに親和性を有するものであれば、特に限定されるものではないが、好適には抗体、オリゴヌクレオチド、レセプター、核酸特異的結合物質、アビジン、ビオチン、ジゴケシゲニンよりなる群より選ぶことができる。好ましくは抗体、アビジンがよく、特に好ましくは抗体がよい。例えば、該リガンドがＦＩＴＣの場合、生理活性物質は抗ＦＩＴＣ抗体であればよく、該リガンドがジゴキシゲニンの場合、生理活性物質は抗ジゴキシゲニン抗体であればよい。 The physiologically active substance to be used is not particularly limited as long as it has an affinity for the second or third ligand, but is preferably an antibody, oligonucleotide, receptor, nucleic acid-specific binding substance, avidin, It can be selected from the group consisting of biotin and digokesigenin. An antibody and avidin are preferable, and an antibody is particularly preferable. For example, when the ligand is FITC, the physiologically active substance may be an anti-FITC antibody, and when the ligand is digoxigenin, the physiologically active substance may be an anti-digoxigenin antibody.
第一のリガンド、第二のリガンド、第三のリガンド、第一のリガンドの捕捉剤及び第二または第三のリガンドに結合する生理活性物質を選択する場合、第二のリガンドと第二のリガンドに結合する生理活性物質は結合でき、第二のリガンドと第三のリガンドに結合する生理活性物質および第一のリガンドの捕捉剤は結合できないように選択するのがよい。また、第三のリガンドと第三のリガンドに結合する生理活性物質は結合でき、第三のリガンドと第二のリガンドに結合する生理活性物質および第一のリガンドの捕捉剤は結合できないように選択するのがよい。さらに、第一のリガンドと第一のリガンドの捕捉剤は結合でき、第一のリガンドと第二のリガンドに結合する生理活性物質および第三のリガンドに結合する生理活性物質は結合できないように選択するのがよい。 When selecting a first ligand, a second ligand, a third ligand, a capture agent for the first ligand, and a bioactive substance that binds to the second or third ligand, the second ligand and the second ligand The bioactive substance that binds to the second ligand and the third ligand may be selected so that the second ligand and the third ligand can not bind, and the first ligand capture agent cannot bind. Also, select the third ligand and the physiologically active substance that binds to the third ligand so that the third ligand and the second ligand can bind to the physiologically active substance and the first ligand capture agent. It is good to do. Furthermore, the first ligand and the first ligand capture agent can be bound, and the bioactive substance that binds to the first and second ligands and the bioactive substance that binds to the third ligand cannot be bound. It is good to do.
生理活性物質に結合される標識としては、蛍光化学物質、発光団、酵素、蛍光蛋白質、発光蛋白質、磁性体、導電性物質よりなる群より選ぶことができる。好ましくは蛍光化学物質、蛍光蛋白質、発光団、酵素、導電性物質がよく、さらに好ましくは蛍光化学物質、蛍光蛋白質、酵素がよく、特に好ましくは酵素がよい。この標識は、第一のリガンド、第二のリガンド、第三のリガンド、第一のリガンドの捕捉剤、第二のリガンドに結合する生理活性物質および第三のリガンドに結合する生理活性物質のいずれとも結合しない物質が好ましい。 The label bonded to the physiologically active substance can be selected from the group consisting of a fluorescent chemical substance, a luminophore, an enzyme, a fluorescent protein, a photoprotein, a magnetic substance, and a conductive substance. Preferred are fluorescent chemical substances, fluorescent proteins, luminophores, enzymes and conductive substances, more preferred are fluorescent chemical substances, fluorescent proteins and enzymes, and particularly preferred are enzymes. This label can be any of a first ligand, a second ligand, a third ligand, a capture agent for the first ligand, a physiologically active substance that binds to the second ligand, and a physiologically active substance that binds to the third ligand. Substances that do not bind to each other are preferred.
標識の検出は既知の方法であれば特に限定されるものではないが、標識が蛍光化学物質または蛍光蛋白質の場合、特定波長の光を照射し蛍光化学物質または蛍光蛋白質を励起させ、基底状態に変換される際に生じる特定波長の蛍光量を測定することが可能である。これらに用いられる蛍光化学物質としては、ＦＩＴＣ、ＦＡＭ、ＴＡＭＲＡ、ＴｅｘａｓＲｅｄ、ＶＩＣ、Ｃｙ３、Ｃｙ５、ＨＥＸ等が挙げられ、蛍光蛋白質としては、ＧＦＰ、ＹＦＰ、ＲＦＰ等を挙げることができる。標識が酵素である場合、酵素の基質を添加することによって生成される反応生成物を検出することによって測定が可能である。これらに用いられる酵素と基質の組み合わせとしては、アルカリフォスファターゼとパラニトロフェニルリン酸、ＣＤＰ−ｓｔａｒ、ＡＭＰＰＤ、ＤＤＡＯｐｈｏｓｐａｔｅ、ＢＣＩＰ−ＮＢＴ等の組み合わせ、パーオキシダーゼとＴＭＢ、Ｌｕｍｉ−Ｌｉｇｈｔ（ロッシュ・ダイアグノスティックス）、ＳＡＴ−１（同仁化学）等の組み合わせ、ジアホラーゼとＮＴＢ等の組み合わせ、各種オキシダーゼと基質、各種デヒドロゲナーゼと基質の組み合わせ等、反応性生物が検出されるものであれば、これらに限定されることはなく用いることが可能である。標識が磁性体の場合、磁気を検出することによって測定が可能である。標識が導電性物質、電流値を検出することによって測定が可能である。 The detection of the label is not particularly limited as long as it is a known method. However, when the label is a fluorescent chemical substance or a fluorescent protein, light of a specific wavelength is irradiated to excite the fluorescent chemical substance or the fluorescent protein to bring it to the ground state. It is possible to measure the amount of fluorescence of a specific wavelength generated when converted. Examples of the fluorescent chemical substance used in these include FITC, FAM, TAMRA, Texas Red, VIC, Cy3, Cy5, HEX, and the like, and examples of the fluorescent protein include GFP, YFP, and RFP. When the label is an enzyme, it can be measured by detecting the reaction product produced by adding the enzyme substrate. Examples of combinations of enzymes and substrates used in these include alkaline phosphatase and paranitrophenyl phosphate, CDP-star, AMPPD, DDAOphosphate, BCIP-NBT, etc., peroxidase and TMB, Lumi-Light (Roche Diagnostics) ), Combinations of SAT-1 (Dojindo), combinations of diaphorase and NTB, various oxidases and substrates, combinations of various dehydrogenases and substrates, etc. It can be used without any problems. When the label is a magnetic substance, measurement can be performed by detecting magnetism. The label can be measured by detecting a conductive substance and a current value.
特に、ヒトを始め、高等生物は、１種類の遺伝子について、父親由来の遺伝子と母親由来の遺伝子をそれぞれ１つずつ有しているが、これら方法によれば、試料遺伝子が野生型のホモか、変異型のホモか、あるいは、両方のヘテロかを区別することもできる。すなわち、ヘテロの場合には、野生型遺伝子と変異型遺伝子が共に存在するから野生型と変異型の両方で検出される。 In particular, humans and other higher organisms have one gene each derived from a father and one from a mother, but according to these methods, whether a sample gene is a wild-type homolog or not. It is also possible to distinguish between mutant homozygous or both heterozygous. That is, in the case of heterogeneity, both wild type and mutant types are detected because both wild type genes and mutant genes exist.
キット
本発明において、少なくとも以下の（１）〜（３）を含むことを特徴とする塩基判定用キットである。
（１）第一のリガンドが結合したオリゴヌクレオチドプライマー（Ａ）と、該プライマー（Ａ）の伸長産物の一部と相補的なオリゴヌクレオチドプライマー(Ｂ)であり、該プライマー（Ａ、Ｂ）が下記の(ａ)または(ｂ)のいずれかの組み合わせから選択される：（ａ）判定したい塩基部位（Ｘ）の上流領域と相同的な該プライマー（Ａ）と、判定したい塩基部位（Ｘ）の下流領域と相補的な該プライマー(Ｂ)との組合せ；（ｂ）判定したい塩基部位（Ｘ）の上流領域と相同的な該プライマー（Ｂ）と、判定したい塩基部位（Ｘ）の下流領域と相補的な該プライマー(Ａ)との組合せ
（２）該プライマー（Ａ）の伸長産物と、第二のリガンドが結合しておりかつ該伸長産物の塩基部位（Ｘ）と特異的に結合する少なくとも１種類の検出用オリゴヌクレオチドプローブ（Ｃ）、
（３）該プライマー（Ａ）の伸長産物と、第三のリガンドが結合しておりかつ該伸長産物の塩基部位（Ｘ）と特異的に結合する少なくとも１種類の検出用オリゴヌクレオチドプローブ（Ｄ）。
Kit In the present invention, a kit for determining a base, comprising at least the following (1) to (3).
(1) An oligonucleotide primer (A) to which a first ligand is bound, an oligonucleotide primer (B) complementary to a part of the extension product of the primer (A), and the primers (A, B) It is selected from any of the following combinations (a) or (b): (a) the primer (A) homologous to the upstream region of the base site (X) to be determined, and the base site (X) to be determined A combination of the primer (B) complementary to the downstream region of the primer; (b) the primer (B) homologous to the upstream region of the base site (X) to be determined and the downstream region of the base site (X) to be determined (2) The extension product of the primer (A) is bound to the second ligand and specifically binds to the base site (X) of the extension product. At least one detection oligonucleotide Otide probe (C),
(3) At least one type of oligonucleotide probe for detection (D) in which the extension product of the primer (A) is bound to a third ligand and specifically binds to the base site (X) of the extension product .
さらに以下の（４）及び（５）を含むことを特徴とする塩基判定用キットである。
（４）第二のリガンドに結合できかつ標識されてなる少なくとも１種類の生理活性物質および／または第三のリガンドに結合できかつ標識されてなる少なくとも１種類の生理活性物質
（５）第一のリガンドの捕捉剤が結合した固相。
Furthermore, it is a kit for base determination characterized by including the following (4) and (5).
(4) at least one physiologically active substance capable of binding to and labeled with the second ligand and / or at least one physiologically active substance capable of binding to and labeled with the third ligand (5) first A solid phase to which a ligand capture agent is bound.
以下、実施例に基づき本発明をより具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。 Hereinafter, based on an Example, this invention is demonstrated more concretely. However, the present invention is not limited to the following examples.
実施例１
Cytochrome P450 2C19（ＣＹＰ２Ｃ１９）遺伝子の塩基多型 （６３６Ｇ→Ａ）の検出
（１）ＣＹＰ２Ｃ１９遺伝子の６３６番目の多型を検出するオリゴヌクレオチドの合成
パーキンエルマー社製ＤＮＡシンセサイザー３９２型を用いて、ホスホアミダイト法にて、配列番号１〜４に示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチド（以下、オリゴ１〜４と示す）を合成した。合成はマニュアルに従い、各種オリゴヌクレオチドの脱保護はアンモニア水で５５℃、一夜実施した。オリゴヌクレオチドの精製はパーキンエルマー社ＯＰＣカラムにて実施した。もしくはＤＮＡ合成受託会社（（株）日本バイオサービス、シグマアルドリッチジャパン（株）、オペロンバイオテクノロジー（株）等）に依頼した。
オリゴ１がオリゴヌクレオチドプライマー(Ａ)、オリゴ２がオリゴヌクレオチドプライマー(Ｂ)である。オリゴ３は野生型検出用オリゴヌクレオチドプローブ（Ｃ）であり、オリゴ４は変異型検出用オリゴヌクレオチドプローブ（Ｄ）である。オリゴ１は５’末端をビオチンにより標識され、オリゴ３は５’末端をＦＩＴＣにより標識され、オリゴ４は５’末端をジゴキシゲニンにより標識されている。オリゴ３および４の５’末端を標識することで、オリゴ３および４からの伸長反応を可能にしている。
Example 1
Detection of nucleotide polymorphism (636G → A) of Cytochrome P450 2C19 (CYP2C19) gene (1) Synthesis of oligonucleotide to detect 636th polymorphism of CYP2C19 gene By the method, oligonucleotides having the base sequences shown in SEQ ID NOs: 1 to 4 (hereinafter referred to as oligos 1 to 4) were synthesized. The synthesis was carried out according to the manual, and the deprotection of various oligonucleotides was carried out with ammonia water at 55 ° C. overnight. Oligonucleotide purification was carried out on a Perkin Elmer OPC column. Alternatively, DNA commissioned companies (Nippon Bioservice, Sigma-Aldrich Japan, Operon Biotechnology, etc.) were requested.
Oligo 1 is an oligonucleotide primer (A), and oligo 2 is an oligonucleotide primer (B). Oligo 3 is a wild-type detection oligonucleotide probe (C), and oligo 4 is a mutation-type detection oligonucleotide probe (D). Oligo 1 is labeled with biotin at the 5 ′ end, oligo 3 is labeled with FITC at the 5 ′ end, and oligo 4 is labeled with digoxigenin at the 5 ′ end. Labeling the 5 ′ ends of oligos 3 and 4 allows extension reactions from oligos 3 and 4.
（２）ＰＣＲ法によるＣＹＰ２Ｃ１９遺伝子多型の解析
ＰＣＲ法による増幅反応ヒト白血球からフェノール・クロロフォルム法により抽出したＤＮＡ溶液をサンプルとして使用して、下記試薬を添加して、下記条件によりヒトＣＹＰ２Ｃ１９遺伝子の塩基多型 （６３６Ｇ→Ａ）を解析した。
(2) Analysis of CYP2C19 gene polymorphism by PCR method Amplification reaction by PCR method Using a DNA solution extracted from human leukocytes by phenol-chloroform method as a sample, the following reagents were added, and the human CYP2C19 gene was The nucleotide polymorphism (636G → A) was analyzed.
試薬
以下の試薬を含む２５μｌ溶液を調製した。
ＫＯＤ ｐｌｕｓ ＤＮＡポリメラーゼ反応液
オリゴ１（５’末端をビオチンにより標識） ５ｐｍｏｌ、
オリゴ２ ５ｐｍｏｌ、
オリゴ３（５’末端をＦＩＴＣにより標識） ５ｐｍｏｌ、
オリゴ４（５’末端をジゴキシゲニンにより標識） ５ｐｍｏｌ、
×１０緩衝液 ２．５μｌ、
２ｍＭ ｄＮＴＰ ２．５μｌ、
２５ｍＭ ＭｇＣｌ２ １．０μｌ、
ＫＯＤ ｐｌｕｓ ＤＮＡポリメラーゼ ０．４Ｕ、
抽出ＤＮＡ溶液 ２０ｎｇ
Reagents A 25 μl solution containing the following reagents was prepared.
KOD plus DNA polymerase reaction solution Oligo 1 (5 ′ end labeled with biotin) 5 pmol,
5 pmol of oligo 2,
Oligo 3 (5 ′ end labeled with FITC) 5 pmol,
Oligo 4 (5 ′ end labeled with digoxigenin) 5 pmol,
X10 buffer 2.5 μl,
2.5 μl of 2 mM dNTP,
25 mM MgCl 2 1.0 μl,
KOD plus DNA polymerase 0.4U,
Extracted DNA solution 20ng
増幅条件
９４℃・２分
９４℃・１５秒、
６０℃・３０秒、
６８℃・３０秒（３５サイクル）
９８℃・３分、
６５℃・１分、
５５℃・１分、
４５℃・１分、
３５℃・１分、
２５℃・１５分。
Amplification conditions 94 ° C, 2 minutes, 94 ° C, 15 seconds,
60 ° C for 30 seconds,
68 ℃, 30 seconds (35 cycles)
98 ℃, 3 minutes,
65 ° C for 1 minute,
55 ° C for 1 minute,
45 ° C for 1 minute,
35 ° C for 1 minute,
25 ° C for 15 minutes.
（３）アッセイプレートを用いた検出
増幅反応液１５μｌをＰＯＤ標識抗ジゴキシゲニン抗体（ＤＡＫＯ Ｃｙｔｏｍａｔｉｏｎ製）の溶液３０μｌに加えて、室温にて５分間反応させた。これによって、増幅されたＣＹＰ２Ｃ１９遺伝子断片に結合したジゴキシゲニン標識オリゴヌクレオチドであるオリゴ４にＰＯＤ標識抗ジゴキシゲニン抗体が結合する。この反応液をアビジンの結合したアッセイプレート（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ製）に添加するとプレートのウェル内に増幅されたＣＹＰ２Ｃ１９遺伝子断片が捕捉される。洗浄液によるプレートの洗浄後、ウェルに洗浄液を添加して励起光を当て、オリゴ３の標識体であるＦＩＴＣによる蛍光を確認した。次に、洗浄液を廃棄し、ＰＯＤ基質液を添加後、オリゴ４の標識体であるジゴキシゲニンに結合したＰＯＤ標識抗ジゴキシゲニン抗体による溶液の発色を目視によって確認した。表１に、試料Ｎｏ．１〜７で示すサンプルおよび試料なしの場合について、ＦＩＴＣによる蛍光およびＰＯＤ標識抗ジゴキシゲニン抗体による溶液の発色について、明らかに確認できたものを「＋」、明らかに確認できなかったものを「−」として示す。
(3) Detection using an assay plate 15 μl of an amplification reaction solution was added to 30 μl of a POD-labeled anti-digoxigenin antibody (manufactured by DAKO Cytomation) and reacted at room temperature for 5 minutes. As a result, the POD-labeled anti-digoxigenin antibody binds to oligo 4, which is a digoxigenin-labeled oligonucleotide bound to the amplified CYP2C19 gene fragment. When this reaction solution is added to an avidin-conjugated assay plate (BD Biosciences), the amplified CYP2C19 gene fragment is captured in the well of the plate. After washing the plate with the washing solution, the washing solution was added to the wells and irradiated with excitation light, and the fluorescence by FITC, the oligo 3 label, was confirmed. Next, the washing solution was discarded, and after adding the POD substrate solution, the color development of the solution by the POD-labeled anti-digoxigenin antibody bound to digoxigenin, which was the oligo 4 label, was visually confirmed. In Table 1, Sample No. Regarding the samples shown in 1 to 7 and the case without the sample, “+” indicates that the fluorescence was confirmed by FITC and color development of the solution by the POD-labeled anti-digoxigenin antibody was “+”; As shown.
上記のように、容易にかつ迅速に遺伝子型を明確に判定することができた。 As described above, the genotype could be clearly determined easily and quickly.
本発明により、試料核酸中の複数の塩基多型を明確にまた簡便に検出が可能となり、これまでの方法のように煩雑な操作を必要とせず、迅速で容易に再現性の良い結果が得られることからも、産業界に大きく寄与することが期待される。 According to the present invention, it is possible to clearly and easily detect a plurality of nucleotide polymorphisms in a sample nucleic acid, and it is possible to quickly and easily obtain a reproducible result without requiring a complicated operation as in the conventional method. Therefore, it is expected to contribute greatly to the industrial world.
Claims (25)
（１）第一のリガンドが結合したオリゴヌクレオチドプライマー（Ａ）と該プライマー（Ａ）の伸長産物の一部と相補的なオリゴヌクレオチドプライマー（Ｂ）とを用いて、標的核酸配列から核酸増幅反応を行う第一工程であり、該プライマー（Ａ、Ｂ）が下記の（ａ）または（ｂ）のいずれかの組み合わせから選択される：（ａ）判定したい塩基多型（Ｘ）の上流領域と相同的な該プライマー（Ａ）と、判定したい塩基多型（Ｘ）の下流領域と相補的な該プライマー（Ｂ）との組合せ；（ｂ）判定したい塩基多型（Ｘ）の上流領域と相同的な該プライマー（Ｂ）と、判定したい塩基多型（Ｘ）の下流領域と相補的な該プライマー（Ａ）との組合せ
（２）第一工程で得られうるプライマー（Ａ）の伸長産物と、第二のリガンドが結合しておりかつ該伸長産物の塩基多型（Ｘ）と特異的に結合する少なくとも１種類の検出用オリゴヌクレオチドプローブ（Ｃ）とをハイブリダイズさせた複合体（Ｐｃ）、および、該第一工程で得られうるプライマー（Ａ）の伸長産物と、第三のリガンドが結合しておりかつ該伸長産物の塩基多型（Ｘ）と特異的に結合する少なくとも１種類の検出用オリゴヌクレオチドプローブ（Ｄ）とをハイブリダイズさせた複合体（Ｐｄ）、を形成せしめる第二工程
（３）第二工程で得られうる該複合体（Ｐｃ）中に、第一のリガンドと第二のリガンドが共存しているかどうかを検出する第三工程
（４）第二工程で得られうる該複合体（Ｐｄ）中に、第一のリガンドと第三のリガンドが共存しているかどうかを検出する第四工程 A method for determining a base polymorphism on a target nucleic acid sequence contained in a sample solution, comprising at least the following steps (1) to (4):
(1) A nucleic acid amplification reaction from a target nucleic acid sequence using an oligonucleotide primer (A) to which a first ligand is bound and an oligonucleotide primer (B) complementary to a part of the extension product of the primer (A) The primer (A, B) is selected from the following combinations (a) or (b): (a) an upstream region of the nucleotide polymorphism (X) to be determined; and homologous the primer (a), the combination of the complementary said primer and the downstream region of the determined desired nucleotide polymorphism (X) (B); homologous to the upstream region of (b) determined desired nucleotide polymorphism (X) A combination of the primer (B) and the primer (A) complementary to the downstream region of the nucleotide polymorphism (X) to be determined (2) an extension product of the primer (A) obtainable in the first step; The second ligand is bound One該伸length product of nucleotide polymorphism (X) to specifically bind to at least one of the detection oligonucleotide probe (C) and was allowed to hybridize complex (Pc), and obtained in said first step An extension product of the primer (A), and at least one detection oligonucleotide probe (D) to which a third ligand is bound and specifically binds to the nucleotide polymorphism (X) of the extension product. Whether or not the first ligand and the second ligand coexist in the complex (Pc) that can be obtained in the second step (3) and the second step to form the hybridized complex (Pd). The fourth step of detecting whether or not the first ligand and the third ligand coexist in the complex (Pd) obtainable in the second step.
（ｉ）複合体（Ｐｃ）を第一のリガンドの捕捉剤が結合した固相上に捕捉した後、第二のリガンドを検出する工程、
（ｉｉ）第二のリガンドに結合できかつ標識されてなる少なくとも１種類の生理活性物質を、複合体（Ｐｃ）を介して、第一のリガンドの捕捉剤が結合した固相上に捕捉した後、
該複合体（Ｐｃ）を介して固相上に捕捉された該生理活性物質の標識を検出する工程。 The base polymorphism determination method according to any one of claims 1 to 7, wherein the third step includes one of the following steps (i) and (ii).
(I) a step of detecting a second ligand after capturing the complex (Pc) on a solid phase to which a capture agent for the first ligand is bound;
(Ii) After capturing at least one physiologically active substance capable of binding to and labeled with the second ligand on the solid phase to which the capture agent of the first ligand is bound via the complex (Pc) ,
Detecting the label of the physiologically active substance captured on the solid phase via the complex (Pc).
（ｉ）複合体（Ｐｄ）を第一のリガンドの捕捉剤が結合した固相上に捕捉した後、第三のリガンドを検出する工程、
（ｉｉ）第三のリガンドに結合できかつ標識されてなる少なくとも１種類の生理活性物質を、複合体（Ｐｄ）を介して、第一のリガンドの捕捉剤が結合した固相上に捕捉した後、該複合体（Ｐｄ）を介して固相上に捕捉された該生理活性物質の標識を検出する工程。 The base polymorphism determination method according to any one of claims 1 to 8, wherein the fourth step includes the following step (i) or (ii):
(I) a step of detecting a third ligand after capturing the complex (Pd) on a solid phase to which a capture agent for the first ligand is bound;
(Ii) After capturing at least one physiologically active substance capable of binding to and labeled with the third ligand on the solid phase to which the capture agent of the first ligand is bound via the complex (Pd) Detecting the label of the physiologically active substance captured on the solid phase via the complex (Pd).
（１）第一のリガンドが結合したオリゴヌクレオチドプライマー（Ａ）と、該プライマー（Ａ）の伸長産物の一部と相補的なオリゴヌクレオチドプライマー（Ｂ）であり、該プライマー（Ａ、Ｂ）が下記の（ａ）または（ｂ）のいずれかの組み合わせから選択される：（ａ）判定したい塩基多型（Ｘ）の上流領域と相同的な該プライマー（Ａ）と、判定したい塩基多型（Ｘ）の下流領域と相補的な該プライマー（Ｂ）との組合せ；（ｂ）判定したい塩基多型（Ｘ）の上流領域と相同的な該プライマー（Ｂ）と、判定したい塩基多型（Ｘ）の下流領域と相補的な該プライマー（Ａ）との組合せ
（２）該プライマー（Ａ）の伸長産物と、第二のリガンドが結合しておりかつ該伸長産物
の塩基多型（Ｘ）と特異的に結合する少なくとも１種類の検出用オリゴヌクレオチドプローブ（Ｃ）
（３）該プライマー（Ａ）の伸長産物と、第三のリガンドが結合しておりかつ該伸長産物の塩基多型（Ｘ）と特異的に結合する少なくとも１種類の検出用オリゴヌクレオチドプローブ（Ｄ） A nucleotide polymorphism determination kit comprising at least the following (1) to (3):
(1) An oligonucleotide primer (A) to which a first ligand is bound, an oligonucleotide primer (B) complementary to a part of the extension product of the primer (A), and the primers (A, B) are It is selected from any of the following combinations (a) or (b): (a) the primer (A) homologous to the upstream region of the nucleotide polymorphism (X) to be determined, and the nucleotide polymorphism to be determined ( A combination of the primer (B) complementary to the downstream region of X); (b) the primer (B) homologous to the upstream region of the nucleotide polymorphism (X) to be determined and the nucleotide polymorphism (X And (2) a combination of the primer (A) and the extension product of the primer (A), and a base polymorphism (X) of the extension product to which a second ligand is bound. At least one type of detection that specifically binds Oligonucleotide probes (C)
(3) At least one type of oligonucleotide probe for detection (D) in which the extension product of the primer (A) is bound to a third ligand and specifically binds to the nucleotide polymorphism (X) of the extension product )
（４）第二のリガンドに結合できかつ標識されてなる少なくとも１種類の生理活性物質および／または第三のリガンドに結合できかつ標識されてなる少なくとも１種類の生理活性物質
（５）第一のリガンドの捕捉剤が結合した固相 19. The nucleotide polymorphism determination kit according to claim 18 , further comprising the following (4) and (5).
(4) at least one physiologically active substance capable of binding to and labeled with the second ligand and / or at least one physiologically active substance capable of binding to and labeled with the third ligand (5) first Solid phase with ligand capture agent bound
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