JP2007248256A - Concentration method of abnormal prion protein and removal method of same - Google Patents

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Abstract

<P>PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a method for rapidly and simply concentrating abnormal prion protein with high efficiency, and a method for rapidly and simply removing abnormal prion protein from a biosample. <P>SOLUTION: A liquid specimen containing body fluids and/or bio-tissue destructed substances is adjusted to pH 5.5-10.5 and an oxide, which is selected from an oxide of an element selected from silicon, aluminum, zirconium, titanium, molybdenum and tungsten, a composite oxide composed of at least two kinds of the above-mentioned elements, a composite oxide composed of at least one kind of the element and at least one kind of a metal element other than the element and a combination of at least two kinds of them, is added to and mixed with the specimen to concentrate the specimen or the precipitate obtained by precipitating the oxide. <P>COPYRIGHT: (C)2007,JPO&INPIT

Description

本発明は、異常型プリオン蛋白質の濃縮方法および除去方法、特に脳脊髄液、尿、血液などを用いて行う迅速、簡便かつ高効率に濃縮する異常型プリオン蛋白質濃縮方法、およびこの濃縮物を分離して行う異常型プリオン蛋白質除去方法に関するものである。   The present invention relates to a method for concentrating and removing abnormal prion protein, particularly a method for concentrating abnormal prion protein rapidly, simply and efficiently using cerebrospinal fluid, urine, blood, etc., and separating the concentrate. The present invention relates to a method for removing abnormal prion protein.

体内にある正常型プリオン蛋白質（ＰｒＰＣ）が、何らかの原因によりプリオン、即ち異常型プリオン蛋白質（ＰｒＰＳｃ）となることがある。異常型プリオン蛋白質は、正常型プリオン蛋白質の立体構造変異体であり、正常細胞にある正常型プリオン蛋白質が異常型に変化することにより生理的な代謝経路から外れて、神経系への蓄積と神経細胞死を起し、牛の狂牛病（牛海綿状脳症：ＢＳＥ；Ｂｏｖｉｎｅ Ｓｐｏｎｇｉｆｏｒｍ Ｅｎｃｅｐｈａｌｏｐａｔｈｙ）、羊のスクレイピー、人のクロイツフェルト・ヤコブ病（ＣＪＤ）など所謂プリオン病の病原体となると考えられている。特に、狂牛病は我々の生活に密接した牛に発症し、さらにヒトへの感染が懸念されることから世界的な関心事となった。牛は食肉以外に、牛乳、ゼラチン、コラーゲン等などが様々な用途に用いられており、これらを原材料として作られた製品の安全性を確実に確認するために発症早期あるいは発症前診断の開発が急がれている。   The normal prion protein (PrPC) in the body may become a prion, that is, an abnormal prion protein (PrPSc) for some reason. Abnormal prion protein is a three-dimensional structural variant of normal prion protein. When normal prion protein in normal cells changes to abnormal type, it deviates from the physiological metabolic pathway, accumulates in the nervous system and It causes cell death and is considered to be a pathogen of so-called prion diseases such as bovine mad cow disease (BoSE Spongiform Encephalopathy), sheep scrapie, and Creutzfeldt-Jakob disease (CJD) in humans. . In particular, mad cow disease has become a worldwide concern because it affects cattle that are closely related to our lives and concerns about human infection. In addition to meat, cows use milk, gelatin, collagen, etc. for a variety of purposes. Development of early diagnosis or pre-onset diagnosis is necessary to ensure the safety of products made from these ingredients. I'm in a hurry.

現在牛のプリオン病診断には死後の中枢神経組織を可溶化し、これをウエスタンブロット（ＷＢ：Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ）法やＥＬＩＳＡ法、免疫組織染色法などにより測定されている。しかし、異常型プリオン蛋白質の含有量は極めて低い上に、検体が希釈されるので、微量の異常型プリオン蛋白質を検出せねばならず、操作の煩雑さに加え、測定精度の上でも限界がある。   At present, for diagnosis of cattle prion disease, post-mortem central nervous tissue is solubilized and measured by Western blot (WB) method, ELISA method, immunohistochemical staining method and the like. However, since the abnormal prion protein content is extremely low and the specimen is diluted, a trace amount of abnormal prion protein must be detected, and there is a limit in measurement accuracy in addition to the complexity of operation. .

そこで、異常型プリオン蛋白質を検出するとき、異常型プリオン蛋白質の濃縮が必要とされることが多い。異常型プリオン蛋白質を濃縮する技術として、超遠心分離法、アルコール沈殿法、リンタングステン酸沈殿法〔非特許文献１、２参照〕や限外ろ過法が代表的であり、その他一般に蛋白質の濃縮に用いられる技術が応用されることがある。最近では、異常型プリオン蛋白質を含む試料に蛋白凝集作用物質を作用させて凝集沈殿物中に異常型プリオン蛋白質を濃縮させる方法〔特許文献１参照〕、異常型プリオン蛋白質を含む試料をβ−プリーツシート結合性分子を結合した固体担体と一緒にインキュベートして、選択的に異常型プリオン蛋白質をβ−プリーツシート結合性分子に結合させて濃縮する方法〔特許文献２参照〕などの提案がある。   Therefore, when detecting an abnormal prion protein, it is often necessary to concentrate the abnormal prion protein. Typical techniques for concentrating abnormal prion protein include ultracentrifugation, alcohol precipitation, phosphotungstic acid precipitation (see Non-Patent Documents 1 and 2), and ultrafiltration. The technology used may be applied. Recently, a method of causing a protein aggregation agent to act on a sample containing an abnormal prion protein to concentrate the abnormal prion protein in an aggregated precipitate (see Patent Document 1), and a sample containing an abnormal prion protein as β-pleats. There is a proposal of a method of incubating with a solid carrier to which a sheet-binding molecule is bound, selectively binding an abnormal prion protein to the β-pleat sheet-binding molecule, and concentrating (see Patent Document 2).

サーファー（Ｓａｆａｒ Ｊ）ら，ネイチャーメディスン（Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）、４巻．１０号、１１５７−１１６５頁、１９９８年１０月発行Surfer J et al., Nature Medicine, 4 volumes. No.10, pp. 1157-1165, published October 1998 ワズワース（Ｗａｄｓｗｏｒｔｈ ＪＤＦ）ら，ランセット（Ｌａｎｃｅｔ）、３５８巻．９２７７号、１７１−１８０頁、２００１年７月２１日発行Wadsworth JDF et al., Lancet, 358. 9277, pp. 171-180, issued July 21, 2001 特開２００５−３００４３１号公報JP-A-2005-300431 特表２００５−５３１７７５号公報JP 2005-53775 A

従来の方法における超遠心分離法は、プリオン病罹患個体の脳組織などより異常型プリオン蛋白質を濃縮する際に汎用されているが、超遠心機が必要であり１回に濃縮できる容量には限度があり、異常型プリオン蛋白質を沈殿物として濃縮するまでには半時間以上の時間を要してしまう。アルコール沈殿法は現行のＢＳＥ診断キット中で使われており超遠心分離法よりは簡単、且つ迅速に行うことができるが、超遠心分離法ほど高度に濃縮はできない。リンタングステン酸法は従来法の中ではもっとも高度に異常型プリオン蛋白質を濃縮できるが、手間や時間を要する。限外ろ過フィルターなどを用いた限外ろ過法では、用いるフィルターの網目の大きさや材質や試料の容量によって所要時間や濃縮効率が左右され、通常実験室で行われている１ｍＬ以下の少量試料からの濃縮でも２０分以上を要する。その他の蛋白質濃縮に使われる一般的技術の応用は、手間、迅速性、濃縮効率の点ではこれらの代表的な従来法に劣る欠点がある。
かかる問題点に鑑み本発明の目的は、異常型プリオン蛋白質を迅速、簡便かつ高効率に濃縮する方法を提供し、また迅速、簡便に生体試料から異常型プリオン蛋白質を除去する方法を提供することにある。 The ultracentrifugation method in the conventional method is widely used to concentrate abnormal prion protein from brain tissues of individuals suffering from prion diseases, but requires an ultracentrifuge and limits the capacity that can be concentrated at one time. Therefore, it takes more than half an hour to concentrate the abnormal prion protein as a precipitate. The alcohol precipitation method is used in current BSE diagnostic kits and can be performed more easily and faster than the ultracentrifugation method, but cannot be concentrated as highly as the ultracentrifugation method. The phosphotungstic acid method can concentrate abnormal prion protein to the highest degree among conventional methods, but it requires labor and time. In the ultrafiltration method using an ultrafiltration filter, the required time and concentration efficiency depend on the size, material, and sample volume of the filter network used. It takes 20 minutes or more to concentrate. The application of other general techniques used for protein concentration has disadvantages inferior to these typical conventional methods in terms of labor, speed, and concentration efficiency.
In view of such problems, an object of the present invention is to provide a method for concentrating abnormal prion protein quickly, simply and efficiently, and to provide a method for rapidly and simply removing abnormal prion protein from a biological sample. It is in.

上記課題を解決すべく本発明は異常型プリオン蛋白質の濃縮方法であり、体液及び／又は生体組織破壊物を含む液体状の検体をｐＨ５．５〜１０．５に調整し、ケイ素、アルミニウム、ジルコニウム、チタン、モリブデン、タングステンから選ばれる元素の酸化物、前記元素の二種以上よりなる複合酸化物、前記元素から選らばれる一種以上の元素と前記元素以外の一種以上の金属元素とよりなる複合酸化物、およびこれらの二種以上の組合わせ、から選ばれる酸化物を加え混合した後、前記酸化物が沈殿されて得られた沈殿物上に濃縮させることを特徴とする。このような異常型プリオン蛋白質の濃縮方法において、検体に、異常型プリオン蛋白質を含まない尿を、尿の混合割合が２０〜９０％（容量）となるように加えることが好ましく、また、検体は、脳脊髄液、尿、血液から選ばれることが良く、さらに、検体は、前記ｐＨ範囲に調整される前に蛋白質分解されることが好適である。
そして、酸化物は、検体１ｍＬに対し０．５ｎｇ〜１０００ｍｇ加えることが好ましく、また、沈殿物は、酸化物が加え混合された後、遠心処理により分離されることが好ましい。 In order to solve the above-mentioned problems, the present invention is a method for concentrating abnormal prion protein, wherein a liquid specimen containing body fluid and / or biological tissue destruction is adjusted to pH 5.5 to 10.5, and silicon, aluminum, zirconium An oxide of an element selected from titanium, molybdenum and tungsten, a composite oxide composed of two or more of the above elements, a composite oxide composed of one or more elements selected from the above elements and one or more metal elements other than the above elements And an oxide selected from the combination of two or more thereof, and after mixing, the oxide is precipitated and then concentrated on the precipitate. In such an abnormal prion protein concentration method, it is preferable to add urine containing no abnormal prion protein to the specimen so that the mixing ratio of urine is 20 to 90% (volume). Cerebrospinal fluid, urine, and blood are preferably selected, and the specimen is preferably proteolyzed before being adjusted to the pH range.
The oxide is preferably added in an amount of 0.5 ng to 1000 mg per 1 mL of the sample, and the precipitate is preferably separated by centrifugation after the oxide is added and mixed.

また、本発明による異常型プリオン蛋白質の除去方法は、体液及び／又は生体組織破壊物を含む液体状の検体を、以上のような異常型プリオン蛋白質の濃縮方法により得られた沈殿物が分離除去されることを特徴とする。この異常型プリオン蛋白質の除去方法においては、酸化物はカラムに充填され、カラムの上から検体を含む溶液を流すことができる。   In addition, the method for removing abnormal prion protein according to the present invention is a method in which a liquid specimen containing a body fluid and / or biological tissue destruction product is separated and removed from the precipitate obtained by the abnormal prion protein concentration method as described above. It is characterized by being. In this abnormal prion protein removal method, the oxide is filled in the column, and a solution containing the specimen can be flowed from the top of the column.

脳脊髄液、尿、血液などの体液、及び／又は生体組織破壊物から異常型プリオン蛋白質が濃縮でき、精度の高い分析が可能となってプリオン病診断に応用でき、同時に体液や生体組織破壊物を含む液体状の検体から異常型プリオン蛋白質を除去するのに役立つ。   Abnormal prion protein can be concentrated from body fluids such as cerebrospinal fluid, urine, blood, and / or biological tissue destruction, and can be applied to the diagnosis of prion disease with high precision analysis. Simultaneously, body fluid and biological tissue destruction It is useful for removing abnormal prion protein from a liquid specimen containing

本発明は、異常型プリオン蛋白質の感染を確認するための異常型プリオン蛋白質の濃縮方法であって、体液及び／又は生体組織破壊物を含む検体にごく少量の酸化物を加えて混合し、次いで酸化物を沈殿させて酸化物上に異常型プリオン蛋白質を濃縮させる方法である。   The present invention is a method for concentrating abnormal prion protein for confirming infection with abnormal prion protein, wherein a very small amount of oxide is added to a sample containing body fluid and / or biological tissue destruction, This is a method for precipitating an oxide and concentrating the abnormal prion protein on the oxide.

ここで、検体は、脳脊髄液、尿、血液、血清、血漿、水性体液、涙液、唾液、リンパ液、乳汁、あるいは生体組織の破壊物など任意に選ばれるが、採取のし易さ、測定感度の観点から脳脊髄液、尿、血液が好ましい。これらを二種以上混合した検体であってもよい。本発明においては、検体が液体である必要があり、従って、体液はそのまま、あるいは水、緩衝液などで希釈して、生体組織は適切な緩衝液（例えば、５０ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ７．５）中で機械的に粉砕しホモジナイズして用いる。体液や生体組織破壊物としては、如何なる生物由来のものであっても適用できるが、プリオン病に罹患する可能性のある哺乳動物、例えば、ウシ、ヤギ、ヒツジ、シカ、オオジカ、ミンク、ブタ、サル、マウス、ラット、ハムスター、ネコ、ヒトなどの哺乳動物由来のものがより有効である。また、例えば、このような哺乳動物由来の体液や生体組織などで副次的に汚染され異常型プリオン蛋白質を含有する可能性のある食品や飼料などの検体についても適用可能である。このような食品や飼料を検体とする場合には、それぞれ各種夾雑物を除去することが好ましく、例えば、従来技術として上述した限外ろ過法、アルコール沈殿法、リンタングステン酸法、超遠心法などの他、塩析、透析等を含め、一般に蛋白質の濃縮に用いられる技術と組み合わせて実施することも可能である。   Here, the specimen is arbitrarily selected from cerebrospinal fluid, urine, blood, serum, plasma, aqueous body fluid, tear fluid, saliva, lymph fluid, milk, or biological tissue destruction, but it is easy to collect and measure From the viewpoint of sensitivity, cerebrospinal fluid, urine, and blood are preferable. A specimen in which two or more of these are mixed may be used. In the present invention, the specimen needs to be a liquid. Therefore, the body fluid is left as it is or diluted with water, a buffer solution or the like, and the living tissue is subjected to an appropriate buffer solution (for example, 50 mM phosphate buffer solution, pH 7.5). ) Mechanically crushed and homogenized. As the body fluid or biological tissue destruction product, any organism can be applied, but mammals that may suffer from prion disease, such as cattle, goats, sheep, deer, elk, mink, pigs, Those derived from mammals such as monkeys, mice, rats, hamsters, cats and humans are more effective. Further, for example, it can be applied to specimens such as foods and feeds that are secondarily contaminated with body fluids or biological tissues derived from mammals and may contain abnormal prion protein. When such food or feed is used as a specimen, it is preferable to remove various contaminants. For example, the ultrafiltration method, the alcohol precipitation method, the phosphotungstic acid method, the ultracentrifugation method, etc. described above as conventional techniques In addition, it can be carried out in combination with techniques generally used for protein concentration, including salting out and dialysis.

また、検体が尿以外の場合、その検体に尿を加えると酸化物に対しての結合性がよくなり、本発明の異常型プリオン蛋白質の濃縮効果が向上する。このとき加えられる尿は、異常型プリオン蛋白質を含まない尿でなくてはならないのはいうまでもない。なお、尿としては、如何なる哺乳動物由来の尿であっても使用できるが、尿添加の効果は尿素やアンモニア以外の尿成分によるものであり、尿素やアンモニアの濃度が高いと異常型プリオン蛋白質の濃縮効果が充分得られない場合があり、健常人の尿がより好適に使用できる。また、このとき加えられる尿の量は、尿の混合割合（容量）として２０％〜９０％が好ましく、４０％〜８０％とすることがより好ましく、４０％〜６０％がさらに好適である。この範囲より少なくともそれなりの効果は出るが、加えたことの効果発現が大きくない。またこの範囲より多いと、効果は充分発現するが検体が尿で希釈された状態となり、操作が煩雑となる。   In addition, when the sample is other than urine, when urine is added to the sample, the binding property to the oxide is improved, and the concentration effect of the abnormal prion protein of the present invention is improved. Needless to say, the urine added at this time must be urine containing no abnormal prion protein. Urine from any mammal can be used as urine, but the effect of urine addition is due to urine components other than urea and ammonia. If the concentration of urea or ammonia is high, abnormal prion protein In some cases, a sufficient concentration effect cannot be obtained, and urine from healthy people can be used more suitably. The amount of urine added at this time is preferably 20% to 90%, more preferably 40% to 80%, and even more preferably 40% to 60% as the urine mixing ratio (volume). Although at least some effect is obtained from this range, the added effect is not significant. On the other hand, if the amount is larger than this range, the effect is sufficiently exhibited, but the specimen is diluted with urine, and the operation becomes complicated.

検体は、体液及び／又は生体組織破壊物を蛋白質分解したものであることができる。蛋白質分解は、プロテアーゼ、たとえばプロテイナーゼＫで処理する。プロテイナーゼＫ（ＰＫ）としては、ウエスタンブロット法やＥＬＩＳＡ法等による各種蛋白の検出又は測定用の試料を調製するための蛋白質分解処理に通常用いられるようなプロテイナーゼＫであれば、如何なるプロテイナーゼＫであっても用いることができ、例えば、トリチラキウム アルブム（Ｔｒｉｔｉｒａｃｈｉｕｍ ａｌｂｕｍ）のような真菌由来のプロテイナーゼＫ（ＥｎｄｏｐｅｐｔｉｄａｓｅＫ：ＥＣ ３．４．２１．６４）の他、細菌、真菌、酵母、動物細胞などを宿主細胞とし上記のような真菌由来のプロテイナーゼＫと同等以上の正常型プリオン蛋白質分解活性を有する蛋白質を発現するように遺伝子組換された組換原核細胞又は組換真核細胞の産生物から得られるリコンビナントプロテイナーゼＫなども使用できる。プロテアーゼ消化は、それぞれのプロテアーゼの標準条件で実施されるが、代表的には、例えば上記真菌由来のプロテイナーゼＫの場合、ｐＨ４〜１２．５で、プロテアーゼ１０μｇ／ｍＬ〜５００μｇ／ｍＬ、好ましくは１０μｇ／ｍＬ〜１００μｇ／ｍＬが加えられ、３７℃で３０分〜１時間程度で実施される。プロテアーゼによる蛋白質分解では、正常型プリオン蛋白質は分解するが、異常型プリオン蛋白質は、アミノ基末端側の一部が分解して分子量が小さくなる程度である。   The specimen can be a proteolytic product of a bodily fluid and / or biological tissue destruction product. Proteolysis is treated with a protease, such as proteinase K. As proteinase K (PK), any proteinase K can be used as long as it is a proteinase K usually used in proteolytic treatment for preparing samples for detection or measurement of various proteins by Western blotting, ELISA, or the like. For example, in addition to proteinase K (Endopeptidase K: EC 3.4.21.64) derived from fungi such as Tritillachium album, bacterial cells, fungi, yeasts, animal cells and the like are used as host cells. And a recombinant prokaryotic cell or recombinant eukaryotic cell product that has been genetically modified to express a protein having a normal prion proteolytic activity equal to or higher than that of the above-mentioned fungal-derived proteinase K. Proteinase K can also be usedProtease digestion is performed under standard conditions for each protease, but typically, for example, in the case of proteinase K derived from the above fungi, the pH is 4 to 12.5 and the protease is 10 μg / mL to 500 μg / mL, preferably 10 μg. / ML-100 μg / mL is added, and it is carried out at 37 ° C. for about 30 minutes to 1 hour. In proteolysis with protease, normal prion protein is degraded, but abnormal prion protein has a molecular weight that is reduced by partial degradation at the amino group terminal side.

次いで、検体に酸化物が加えられる。このときの検体のｐＨは５．５〜１０．５であり、６〜１０が好ましく、６〜９がより好ましく、６〜８に調整することが最適である。蛋白質分解が行なわれる場合には、蛋白質分解とｐＨ調整は、どちらが先でもよいが、酸化物が加えられるときには、ｐＨが５．５〜１０．５となっていることが必要である。ｐＨが上記範囲の外では、異常型プリオン蛋白質と酸化物との結合が弱くなり、異常型プリオン蛋白質の酸化物上に濃縮する効率が低下する場合があり、また、使用する酸化物の種類にもよるが、検体に加えた酸化物が混合工程中に一部溶解し酸化物沈殿が充分に得られない事態も発生し得る。蛋白質分解を行うことで異常型プリオン蛋白質及び異常型プリオン蛋白質の部分分解フラグメントが酸化物上に濃縮（結合固着）され易くなり、この後に行われるプリオン病感染を確認する精度が高くなる。ｐＨ調整方法は特に限定するものではないが、必要により通常の酸、アルカリで所定領域近くにした後、例えば、生理食塩液、リン酸塩系（リン酸バッファー生理食塩液：ＰＢＳ）、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン塩系（Ｔｒｉｓバッファー）、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチルグリシン塩系（Ｔｒｉｃｉｎｅバッファー）、Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ′−エタンスルホン酸塩系（ＨＥＰＥＳバッファー）、３−（モルホリノ）プロパンスルホン酸塩系（ＭＯＰＳバッファー）、Ｎ−シクロヘキシル−３−アミノプロパンスルホン酸系（ＣＡＰＳバッファー）、グリシン−塩酸系、酢酸塩系等のバッファー液で調整することができる。異常型プリオン蛋白質又は異常型プリオン蛋白質の部分分解フラグメントと酸化物との結合は、強酸や強アルカリ、高塩濃度の溶液では影響を受けることより、静電的な結合が関与しているものと考えられ、上記のようなバッファー液により塩化ナトリウム１５０ｍＭに相当するイオン強度以下の一般的に用いられるイオン強度とし、上記ｐＨ範囲に調整することがより好ましい。   The oxide is then added to the specimen. The pH of the specimen at this time is 5.5 to 10.5, preferably 6 to 10, more preferably 6 to 9, and optimally adjusted to 6 to 8. When proteolysis is performed, either the proteolysis or the pH adjustment may be performed first, but when an oxide is added, the pH needs to be 5.5 to 10.5. If the pH is outside the above range, the bond between the abnormal prion protein and the oxide becomes weak, and the efficiency of concentration on the oxide of the abnormal prion protein may decrease. However, the oxide added to the specimen may partially dissolve during the mixing process, and the oxide precipitate may not be sufficiently obtained. Proteolysis makes it easy for the abnormal prion protein and the partial degradation fragment of the abnormal prion protein to be concentrated (bonded) on the oxide, and the accuracy of confirming the subsequent prion disease infection is increased. The pH adjustment method is not particularly limited, but after making it close to a predetermined region with a normal acid or alkali as necessary, for example, physiological saline, phosphate (phosphate buffered saline: PBS), tris ( Hydroxymethyl) aminomethane salt system (Tris buffer), N-tris (hydroxymethyl) methylglycine salt system (Tricine buffer), N-2-hydroxyethylpiperazine-N'-ethanesulfonate system (HEPES buffer), 3 It can be adjusted with a buffer solution such as-(morpholino) propane sulfonate (MOPS buffer), N-cyclohexyl-3-aminopropane sulfonic acid (CAPS buffer), glycine-hydrochloric acid, acetate. The bond between the abnormal prion protein or the partially decomposed fragment of the abnormal prion protein and the oxide is affected by a strong acid, strong alkali, or high salt solution, so that electrostatic binding is involved. It is conceivable that the ionic strength generally used is equal to or lower than the ionic strength corresponding to 150 mM sodium chloride with the above buffer solution, and it is more preferable to adjust the pH range.

酸化物は、ケイ素、アルミニウム、ジルコニウム、チタン、モリブデン、タングステンから選ばれる元素の酸化物、これらの元素から選ばれる二種以上の元素よりなる複合酸化物、前記元素の一種以上と前記元素以外の一種以上の金属元素とよりなる複合酸化物、およびこれらの二種以上の組合わせである。ここで、酸化物としては、例えば、各種結晶系のシリカとも呼ばれる二酸化ケイ素（非晶質石英ガラス、シリカゲルなども含む）、アルミナ、酸化数４以上の酸化ジルコニウム、酸化チタン、酸化モリブデン、酸化タングステンなどを挙げることができる。二種以上の元素よりなる複合酸化物は、シリカアルミナ、ゼオライト、クレイ（粘土鉱物）などである。また、例えば、ゼオライト（ゼオライト型化合物又はゼオライト類縁物質とも呼ばれる広義ゼオライトも含まれる）、クレイ、フロリジール、珪藻土、セライトなど上記以外の元素が含まれている酸化物（不純物含有酸化物、酸化物塩や複合酸化物）であってもよい。ここで、上記元素以外の元素を含む複合酸化物としてのゼオライトやクレイには、様々な組成を有する天然又は合成のものが知られており、例えば、ｐＨ５．５〜１０．５に調整した水性溶媒やバッファー液に添加混合した場合に多量（例えば添加重量の半量以上）が溶解することがなく、好ましくは、ｐＨ６〜９に調整した水性溶媒やバッファー液に添加混合した場合に殆ど（例えば添加重量の１０％以上、好ましくは５％以上）溶解することがなく、本発明の目的達成に支障を及ぼすことのない複合酸化物であればいずれのゼオライトやクレイであっても使用できる。なお、このような複合酸化物としては、前記元素の一種以上の元素はケイ素、アルミニウムから選ばれることが好ましく、前記元素以外の金属元素としては、第１族元素、第２族元素から選ばれる金属元素（アルカリ金属、アルカリ土類金属）が好ましい。また、このような複合酸化物では、水溶性が高く上述のような問題を生じる場合もあることから、その組成式において前記元素以外の金属元素の占める比率（結晶水を除く元素数比％）は２５％以下が好ましく、１５％以下であることがより好ましい。以上のような酸化物の形態は微細な粉体であれば良く、酸化物の比重に応じて操作に適した粒径を選定することができ、特に限定されないが、通常粒径は０．１μｍ〜１５００μｍであり、０．５μｍ〜１０００μｍが好ましく、１μｍ〜５００μｍがより好ましい。粒子形状についても、略球状、方形状、破砕された不定形状など如何なる形状であっても良く、また、粉体粒子の一部又は全部を多孔性のものとすることもできる。また、酸化物が不純物を含有する場合、不純物として如何なる無機物又は有機物、或いはこの両方を含んでもよいが、不純物含有重量については、３０％以下が好ましく、１５％以下がより好ましく、１０％以下がさらに好ましい。３０％を超えると異常型プリオン蛋白質の濃縮効率が低下する場合がある。   The oxide is an oxide of an element selected from silicon, aluminum, zirconium, titanium, molybdenum, tungsten, a composite oxide composed of two or more elements selected from these elements, one or more of the elements and other than the elements A composite oxide composed of one or more metal elements and a combination of two or more of these. Here, as the oxide, for example, silicon dioxide (including amorphous quartz glass and silica gel) also called various crystalline silica, alumina, zirconium oxide having an oxidation number of 4 or more, titanium oxide, molybdenum oxide, tungsten oxide. And so on. The composite oxide composed of two or more elements is silica alumina, zeolite, clay (clay mineral), and the like. In addition, for example, oxides (impurities containing impurities, oxide salts) containing elements other than the above, such as zeolite (including zeolite in a broad sense called zeolite-type compound or zeolite-related substance), clay, florisil, diatomaceous earth, celite, etc. Or a complex oxide). Here, natural or synthetic materials having various compositions are known as zeolites and clays as complex oxides containing elements other than the above elements. For example, aqueous solutions adjusted to pH 5.5 to 10.5 are known. When added and mixed with a solvent or buffer solution, a large amount (for example, more than half of the added weight) does not dissolve, and preferably when added to and mixed with an aqueous solvent or buffer solution adjusted to pH 6-9 (for example, added) Any zeolite or clay can be used as long as it is a composite oxide that does not dissolve and does not hinder the achievement of the object of the present invention. As such a composite oxide, one or more elements of the above elements are preferably selected from silicon and aluminum, and the metal elements other than the above elements are selected from Group 1 elements and Group 2 elements. Metal elements (alkali metals, alkaline earth metals) are preferred. In addition, since such a complex oxide has high water solubility and may cause the above-mentioned problems, the proportion of metal elements other than the above elements in the composition formula (ratio of the number of elements excluding crystal water) Is preferably 25% or less, and more preferably 15% or less. The form of the oxide as described above may be a fine powder, and a particle size suitable for operation can be selected according to the specific gravity of the oxide. Although not particularly limited, the normal particle size is 0.1 μm. ˜1500 μm, preferably 0.5 μm to 1000 μm, and more preferably 1 μm to 500 μm. The particle shape may be any shape such as a substantially spherical shape, a square shape, a crushed indeterminate shape, or a part or all of the powder particles may be porous. Further, when the oxide contains impurities, it may contain any inorganic or organic matter or both as impurities, but the impurity-containing weight is preferably 30% or less, more preferably 15% or less, and more preferably 10% or less. Further preferred. If it exceeds 30%, the concentration efficiency of abnormal prion protein may decrease.

酸化物の使用量は、当該酸化物の比重や粒径に応じて適宜決定することができ、特に限定されないが、検体１ｍＬに対し通常０．５ｎｇ〜１０００ｍｇ、好ましくは０．５ｎｇ〜１０ｍｇ、より好ましくは０．５ｎｇ〜１００μｇ、さらに好ましくは０．５ｎｇ〜１０μｇ、最も好ましくは５０ｎｇ〜５μｇである。０．５ｎｇより少ないと本発明の目的は達せられるが沈殿物量が少なくなり誤差を招き易くなることがある。また、１０００ｍｇより多いことは取り扱いする上での困難を伴うことがある。
検体に酸化物が加え混合されたとき、検体中の異常型プリオン蛋白質は通常速やかに結合されるが、結合を充分完結させるために、室温で２分間以上、好ましくは５分間程度攪拌を続ける。攪拌時間はこれ以上長くなっても特別障害とはならない。次いで酸化物を分離するが、この分離は、遠心処理すると酸化物を円滑に沈殿するので好ましい。 The amount of oxide used can be appropriately determined according to the specific gravity and particle size of the oxide and is not particularly limited, but is usually 0.5 ng to 1000 mg, preferably 0.5 ng to 10 mg, based on 1 mL of the sample. Preferably, it is 0.5 ng to 100 μg, more preferably 0.5 ng to 10 μg, and most preferably 50 ng to 5 μg. If the amount is less than 0.5 ng, the object of the present invention can be achieved, but the amount of precipitate is reduced, and an error may be easily caused. Moreover, if it exceeds 1000 mg, it may be difficult to handle.
When an oxide is added to the sample and mixed, the abnormal prion protein in the sample is usually rapidly bound, but stirring is continued at room temperature for 2 minutes or more, preferably about 5 minutes in order to sufficiently complete the binding. The stirring time does not become a special obstacle even if it is longer than this. The oxide is then separated, and this separation is preferred because the oxide precipitates smoothly upon centrifugation.

本発明の方法により異常型プリオン蛋白質は酸化物に結合されて酸化物とともに沈殿物となる。体液や生体組織中には正常型プリオン蛋白質と異常型プリオン蛋白質が含まれているが、本発明者の検討によると両者の酸化物上への結合に大きな差があり、異常型プリオン蛋白質が選択的に結合することを見出した。従って、検体中の異常型プリオン蛋白質のほとんどが酸化物沈殿物上に固着されるので、この酸化物沈殿物から異常型プリオン蛋白質を溶出させることで、検体中の異常型プリオン蛋白質を確認、定量することが可能となる。ここで溶出液は、異常型プリオン蛋白質を溶解することが可能であれば如何なる溶液であっても良く、特に限定されないが、高い回収率で溶出可能な溶出液としては、例えば、１５０ｍＭ塩化ナトリウムに相当するイオン強度以上のイオン強度を有する塩溶液やバッファー液、ｐＨ５．５未満又はｐＨ１０．５を超えるｐＨを有する水性の溶液（鉱酸や有機酸溶液、アルカリ溶液、バッファー液等：イオン強度不問）、尿素液（濃度８Ｍ以上が好適）などを挙げることができる。   By the method of the present invention, the abnormal prion protein is bound to the oxide and becomes a precipitate together with the oxide. Body fluid and biological tissue contain normal prion protein and abnormal prion protein, but according to the study of the present inventor, there is a large difference in the binding of both to the oxide, and abnormal prion protein is selected. Found to be combined. Therefore, most of the abnormal prion protein in the sample is fixed on the oxide precipitate. By eluting the abnormal prion protein from the oxide precipitate, the abnormal prion protein in the sample is confirmed and quantified. It becomes possible to do. Here, the eluate may be any solution as long as it can dissolve the abnormal prion protein, and is not particularly limited. As an eluate that can be eluted at a high recovery rate, for example, 150 mM sodium chloride is used. Salt solution or buffer solution having an ionic strength equal to or higher than the corresponding ionic strength, aqueous solution having a pH of less than 5.5 or more than pH 10.5 (mineral acid, organic acid solution, alkaline solution, buffer solution, etc. ), Urea solution (preferably having a concentration of 8M or more), and the like.

本発明の方法は、濃縮効率では従来の超遠心分離法、アルコール沈殿法、限外ろ過法よりはるかに優れており、リンタングステン酸法と同等またはそれ以上である。一方、迅速簡便性においては、本発明の方法はこれらのいずれの従来法よりも格段に優れている。したがって、従来法に比べて、簡単であり、高度濃縮効率を保ちつつ、より迅速に多量のサンプルを同時に処理できるという利点がある。   The method of the present invention is far superior to the conventional ultracentrifugation method, alcohol precipitation method, and ultrafiltration method in concentration efficiency, and is equivalent to or higher than the phosphotungstic acid method. On the other hand, in terms of rapid simplicity, the method of the present invention is significantly superior to any of these conventional methods. Therefore, compared with the conventional method, there is an advantage that a large amount of samples can be simultaneously processed more rapidly while maintaining high concentration efficiency.

また、この酸化物沈殿物を分離した後の検体は、異常型プリオン蛋白質濃度が低くなるので、体液、あるいは生体組織破壊物を含む溶液に、充分多い量の酸化物と接触させることで、異常型プリオン蛋白質を実質含まない体液、あるいは溶液を得ることができる。従って、異常型プリオン蛋白質が除去された体液、あるいは生体組織破壊物を含む溶液を得るには、以上のバッチ法以外に、カラムに酸化物を充填し、上から目的の体液及び／又は生体組織破壊物を含む溶液を流すことでも目的を達することができる。   In addition, since the abnormal prion protein concentration in the specimen after separation of the oxide precipitate becomes low, contact with a sufficient amount of oxide in a body fluid or a solution containing a biological tissue destructive substance causes abnormalities. A body fluid or solution substantially free of type prion protein can be obtained. Therefore, in order to obtain a body fluid from which abnormal prion protein has been removed or a solution containing a biological tissue destruction product, in addition to the above batch method, the column is filled with an oxide, and the target body fluid and / or biological tissue is treated from above. The purpose can also be achieved by flowing a solution containing destructive substances.

本発明方法（以降、特に断りのない限り「酸化物法」と記す）とリンタングステン酸法（従来方法）との比較を行った。
〔評価に用いた検体〕
（細胞）
・スクレイピープリオンであるＲＭＬ株がマウス神経芽細胞腫細胞（Ｎｅｕｒｏ ２ａ）に持続感染したＳｃＮ２ａ細胞（Ｓｃ）。
・スクレイピープリオンであるＲＭＬ株がマウス神経芽細胞腫細胞（Ｎｅｕｒｏ ２ａ ＃５８）に持続感染したＣｈ２細胞（Ｃｈ２）。
・ヒトプリオン病プリオンであるＦｕｋｕｏｋａ−１株がマウス神経芽細胞腫細胞（Ｎｅｕｒｏ ２ａ ＃５８）に持続感染したＦ３細胞（Ｆ３）。
・スクレイピープリオンである２２Ｌ株がマウス神経芽細胞腫細胞（Ｎｅｕｒｏ ２ａ）に持続感染したＮ１６７細胞（Ｎ１６７）。 The method of the present invention (hereinafter referred to as “oxide method” unless otherwise specified) was compared with the phosphotungstic acid method (conventional method).
[Samples used for evaluation]
(cell)
ScN2a cells (Sc) in which the RML strain, which is a scrapie prion, was persistently infected with mouse neuroblastoma cells (Neuro 2a).
-Ch2 cells (Ch2) in which the RML strain, which is a scrapie prion, was persistently infected with mouse neuroblastoma cells (Neuro 2a # 58).
F3 cells (F3) in which Fukuoka-1 strain, a human prion disease prion, was persistently infected with mouse neuroblastoma cells (Neuro 2a # 58).
-N167 cells (N167) in which the 22L strain, which is a scrapie prion, was persistently infected with mouse neuroblastoma cells (Neuro 2a).

（細胞の処理方法）
上記細胞のそれぞれを、細胞培養フラスコ（底面積２５ｃｍ２）にて培養し、細胞密度がコンフルエントとなった時点で培養上清を除き、リン酸バッファー生理食塩水〔ＰＢＳ、ｐＨ＝６．５〕で細胞を洗浄した。洗浄液を十分に除き、リシス液〔ｌｙｓｉｓ液：０．５％デオキシコール酸ナトリウム、０．５％ＮＰ−４０（商品名、和光純薬工業（株）、オクチルフェニルエーテル）、残部ＰＢＳ〕１ｍＬを用いて細胞を溶解した。軽く遠心分離して高分子核酸を除いた後、細胞溶解液にトリチラキウム アルブム（Ｔｒｉｔｉｒａｃｈｉｕｍ ａｌｂｕｍ）由来のプロテイナーゼＫ（ＰＫ：ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｋ）を終濃度１０μｇ／ｍＬとなるように加え３７℃で３０分反応（蛋白質分解）させた後、フェニルメタンスルホニルフロライド（ｐｈｅｎｙｌｍｅｔｈａｎ ｓｕｌｆｏｎｙｌｆｌｕｏｒｉｄｅ：ＰＭＳＦ）を終濃度１ｍＭとなるように加えて反応をとめた。 (Cell processing method)
Each of the above cells was cultured in a cell culture flask (bottom area 25 cm 2 ). When the cell density became confluent, the culture supernatant was removed, and phosphate buffered saline (PBS, pH = 6.5). The cells were washed with. 1 ml of lysis solution [lysis solution: 0.5% sodium deoxycholate, 0.5% NP-40 (trade name, Wako Pure Chemical Industries, Ltd., octylphenyl ether), remaining PBS] Used to lyse the cells. After lightly centrifuging to remove the polymer nucleic acid, proteinase K (PK: proteinase K) derived from Tritillachium album is added to the cell lysate so as to have a final concentration of 10 μg / mL and reacted at 37 ° C. for 30 minutes. (Proteolysis), phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) was added to a final concentration of 1 mM to stop the reaction.

〔評価方法〕
蛋白分解処理した細胞溶解液を０．５ｍＬずつ２つに分け、一方は酸化物法で、他方はリンタングステン酸法でそれぞれ異常型プリオン蛋白質を濃縮した。
（酸化物法）
蛋白質分解処理した細胞溶解液０．５ｍＬに、核酸分離用シリカとして市販されているＦＯＧ（Ｑｂｉｏｇｅｎｅ社製）を滅菌水（オートクレーブ滅菌蒸留水）で１０００倍希釈したシリカ懸濁液５μＬ〔固形分（シリカ）約１．５μｇ含有〕を加え、２〜３分間室温で混合した後、軽く遠心〔５，０００×ｇ、１分間〕してシリカを沈殿させ、上清を除いた。
この沈殿全量に対しＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）用バッファー〔１％ ＳＤＳ（ソディウムドデシルサルフェート）、０．０５％ ブロモフェノールブルー、４％ グリセロール、１％ ２−メルカプトエタノール、２５ｍＭ トリス塩酸 ｐＨ６．８〕２０μＬを加えて懸濁し、９５℃、５分間の熱変性後にイシカワ、ドウ−ウラ（Ｉｓｈｉｋａｗａ， Ｄｏｈ−ｕｒａ）らの方法〔イシカワ Ｋ．，ドウ−ウラ Ｋ．ら， ジャーナル オブ ジェネラル ヴァイロロジー（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ）２００４年、 ８５巻、 １７８５−１７９０頁〕に準じ、１５％ トリス・グリシンＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで電気泳動し、ウエスタンブロット法でプリオン蛋白質を検出した。ウエスタンブロット法においては、電気泳動した蛋白質をナイロンメンブラン（ミリポア社製、ＰＶＤＦメンブレイン）にブロッティングし、プリオン蛋白質に対するマウスモノクローナル抗体（ＳＰＩ−ＢＩＯ 社製、ＳＡＦ８３ （５，０００倍希釈））、及びアルカリフォスファターゼ・コンジュゲートヤギ抗マウス免疫グロブリン抗体（プロメガ社製（２０，０００倍希釈）、化学発光検出試薬（アマーシャム社製、ＣＤＰ−Ｓｔａｒ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｒｅａｇｅｎｔ）を使用してプリオン蛋白質の検出を行った。 〔Evaluation methods〕
The proteolytic cell lysate was divided into two 0.5 mL portions, and the abnormal prion protein was concentrated by one using the oxide method and the other using the phosphotungstic acid method.
(Oxide method)
5 μL of silica suspension obtained by diluting FOG (manufactured by Qbiogene) commercially available as silica for nucleic acid separation 1000-fold with sterilized water (autoclaved sterilized distilled water) into 0.5 mL of the proteolytic cell lysate [solid content ( Silica) containing about 1.5 μg] was added and mixed at room temperature for 2-3 minutes, and then lightly centrifuged (5,000 × g, 1 minute) to precipitate silica, and the supernatant was removed.
SDS polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) buffer [1% SDS (sodium dodecyl sulfate), 0.05% bromophenol blue, 4% glycerol, 1% 2-mercaptoethanol, 25 mM Tris-HCl for the total amount of this precipitate pH 6.8] Suspended by adding 20 μL, and after heat denaturation at 95 ° C. for 5 minutes, the method of Ishikawa, Doh-ura et al. [Ishikawa K. et al. , Dow-ura K. Et al., Journal of General Virology 2004, Vol. 85, pp. 1785-1790], and prion protein was detected by Western blotting using a 15% Tris-Glycine SDS-PAGE gel. In Western blotting, the electrophoresed protein is blotted onto a nylon membrane (Millipore, PVDF membrane), mouse monoclonal antibody against prion protein (SPI-BIO, SAF83 (5,000-fold dilution)), and Prion protein was detected using alkaline phosphatase-conjugated goat anti-mouse immunoglobulin antibody (Promega (20,000-fold dilution)) and chemiluminescence detection reagent (Amersham, CDP-Star detection reagent).

（リンタングステン酸法）
ワズワースらが報告している方法〔非特許文献２〕に基づき異常型プリオン蛋白質を沈殿させた。すなわち、プロテイナーゼＫで蛋白質分解を行った後にＰＭＳＦを加え反応を止めたプリオン感染細胞溶解液５００μＬにＡ溶液（ＰＢＳ中に４％サルコシルを含有）５００μＬを加えて撹拌し、３７℃で３０分間反応させた。その後、Ｂ溶液（４％リンタングステン酸水溶液ｐＨ７．４、１７０ｍＭ ＭｇＣｌ２を含有）８１．３μＬを加えて撹拌し、３７℃で３０分間反応させた。次に、室温で１８，０００×ｇ、３０分間遠心を行い、異常型プリオン蛋白質を沈殿させた。この沈殿について、上記と同様にしてバッファーを加えて懸濁し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで泳動し、ウエスタンブロット法でプリオン蛋白質を検出した。 (Phosphotungstic acid method)
Abnormal prion protein was precipitated based on the method reported by Wadsworth et al. In other words, 500 μL of prion-infected cell lysate, which was proteolyzed with proteinase K and then stopped by adding PMSF, was added with 500 μL of solution A (containing 4% sarkosyl in PBS), and stirred at 37 ° C. for 30 minutes. I let you. Thereafter, 81.3 μL of solution B (4% phosphotungstic acid aqueous solution pH 7.4, containing 170 mM MgCl 2 ) was added and stirred, and reacted at 37 ° C. for 30 minutes. Next, centrifugation was performed at 18,000 × g for 30 minutes at room temperature to precipitate abnormal prion protein. The precipitate was suspended by adding a buffer in the same manner as described above, electrophoresed by SDS-PAGE, and the prion protein was detected by Western blotting.

〔結果〕
結果を図１に示す。図中、Ｓｃ、Ｆ３、Ｎ１６７、Ｃｈ２はそれぞれの細胞であり、ＦＯＧは本発明の酸化物法によるもの、ＰＴＡはリンタングステン酸法によるものである。
なお、ウエスタンブロット法により得られたプリオン蛋白質に由来する全てのシグナルをスキャナー（エプソン（株）製、ＧＴ−８４００Ｕ）でコンピューターに取り込んだ後に、Ｉｍａｇｅ Ｊ解析ソフト（ｈｔｔｐ：／／ｒｓｂ．ｉｎｆｏ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｉｊ／）を用いてレーン毎に検出されたプリオン蛋白質に由来する全てのバンドのシグナル強度を定量し、リンタングステン酸法に対する酸化物法によるプリオン蛋白質の濃縮効果（濃縮効率）を回収率（％）として算出しレーン毎に示した。この結果から、本発明の酸化物法は、従来法で最も異常型プリオン蛋白質濃縮効率が優れているとされるリンタングステン酸法と比較して、充分満足できる程度（８３〜１０７％）に異常型プリオン蛋白質を濃縮できることがわかる。 〔result〕
The results are shown in FIG. In the figure, Sc, F3, N167, and Ch2 are the respective cells, FOG is based on the oxide method of the present invention, and PTA is based on the phosphotungstic acid method.
All signals derived from the prion protein obtained by Western blotting were taken into a computer with a scanner (manufactured by Epson Corporation, GT-8400U), and then image J analysis software (http://rsb.info.com). nih.gov/ij/) is used to quantify the signal intensity of all the bands derived from the prion protein detected for each lane, and the concentration effect (concentration efficiency) of the prion protein by the oxide method relative to the phosphotungstic acid method Calculated as the recovery rate (%) and shown for each lane. From this result, the oxide method of the present invention is abnormal to a satisfactory degree (83 to 107%) as compared with the phosphotungstic acid method, which is considered to have the highest abnormal prion protein concentration efficiency in the conventional method. It can be seen that the type prion protein can be concentrated.

他の酸化物、シリカ塩や複合酸化物についての比較を行った。
〔評価に用いた検体、および評価方法〕
プリオン持続感染細胞Ｆ３を、２個の細胞培養フラスコ（底面積２５ｃｍ２）にそれぞれで培養し、細胞密度がコンフルエントとなった時点で培養上清を除き、ＰＢＳ（ｐＨ ６．５）で細胞を洗浄した。洗浄液を十分に除き、それぞれのフラスコの細胞を溶解液１ｍＬに溶解し、遠心分離して高分子核酸を除いた後、２個のフラスコからの細胞溶解液を一つにまとめ混合し、実施例１の場合と同じようにプロテイナーゼＫで蛋白質分解処理を行いＰＭＳＦで酵素処理を止め検体（Ａ）とした。スクレイピープリオン持続感染細胞ＳｃＮ２ａを用い、上記プリオン持続感染細胞Ｆ３の場合と同様に培養、洗浄、細胞溶解、蛋白質分解処理等を行い検体（Ｂ）とした。これら蛋白質分解処理済の細胞溶解液をそれぞれ０．１ｍＬずつキャップ付マイクロチューブに分けた。酸化チタン（ＩＶ）（和光純薬工業（株）製）、酸化ジルコニウム（ＩＶ）（和光純薬工業（株）製）、酸化タングステン（ＩＶ）（和光純薬工業（株）製）、酸化モリブデン（ＩＶ）（和光純薬工業（株）製）、二酸化ケイ素 （和光純薬工業（株）製）、酸化アルミニウム（アルミナ粉末、１〜５μｍ、和光純薬工業（株）製）、フロリジール（ケイ酸マグネシウム：７５〜１５０μｍ、和光純薬工業（株）製）、合成ゼオライト（Ｆ−９：Ｎａ２Ｏ・Ａｌ２Ｏ３・２．５ＳｉＯ２、粉末、７５μｍ、和光純薬工業（株）製）、ＦＯＧのそれぞれを０．３ｍｇ／ｍＬとなるように加えた懸濁液（粉末に滅菌蒸留水を加えてスラリー状にしたもの）を、各マイクロチューブ中の細胞溶解液にそれぞれ５μＬを加えて２〜３分間室温で混合した後、軽く遠心〔５，０００×ｇ、１分間〕して沈殿物を得た。それぞれの沈殿物について、実施例１と同様にしてＳＤＳ−ＰＡＧＥで泳動し、ウエスタンブロット法でプリオン蛋白質を検出した。 Comparison was made for other oxides, silica salts, and composite oxides.
[Samples and methods used for evaluation]
The prion persistently infected cells F3 are cultured in two cell culture flasks (bottom area 25 cm 2 ), and when the cell density becomes confluent, the culture supernatant is removed, and the cells are washed with PBS (pH 6.5). Washed. The washing solution was sufficiently removed, the cells in each flask were dissolved in 1 mL of the lysis solution, centrifuged to remove the high molecular nucleic acid, and then the cell lysis solution from the two flasks were combined and mixed together. Proteolytic treatment with proteinase K was performed in the same manner as in 1, and the enzyme treatment was stopped with PMSF to obtain a specimen (A). Using the scrapy prion persistently infected cell ScN2a, culture, washing, cell lysis, proteolytic treatment and the like were performed as in the case of the prion persistently infected cell F3 to obtain a specimen (B). Each of these proteolytic cell lysates was divided into 0.1 mL cap microtubes. Titanium oxide (IV) (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), Zirconium oxide (IV) (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), Tungsten oxide (IV) (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), Molybdenum oxide (IV) (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), silicon dioxide (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), aluminum oxide (alumina powder, 1-5 μm, manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), Florisil (Kei magnesium acid: 75-150, produced by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), synthetic zeolite (F-9: Na 2 O · Al 2 O 3 · 2.5SiO 2, powder, 75 [mu] m, manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd. ), 5 μL each of the FOG suspension added to a concentration of 0.3 mg / mL (powdered with sterile distilled water added to the powder) is added to the cell lysate in each microtube. And mix for 2-3 minutes at room temperature And then lightly centrifuged (5,000 × g, 1 minute) to obtain a precipitate. Each precipitate was electrophoresed by SDS-PAGE in the same manner as in Example 1, and the prion protein was detected by Western blotting.

〔結果〕
結果を図２Ａ、Ｂに示す。なお、実施例１の場合と同様にプリオン蛋白質に由来するバンドのシグナル強度の測定結果から算出した回収率（％）をレーン毎に示した。酸化物である酸化チタン（Ａ１）、酸化ジルコニウム（Ａ２）、酸化タングステン（Ａ３、Ｂ３）、酸化モリブデン（Ａ４、Ｂ２）、二酸化ケイ素（Ａ５）、酸化アルミニウム（Ｂ１）、シリカ塩であるフロリジール（Ｂ４）、複合酸化物である合成ゼオライト（Ｂ５）を用いた異常型プリオン蛋白質の濃縮効果（濃縮効率）は、ＦＯＧ（Ａ６、Ｂ６）を用いた場合とほぼ同程度であった。 〔result〕
The results are shown in FIGS. In addition, the recovery rate (%) calculated from the measurement result of the signal intensity of the band derived from the prion protein as in Example 1 is shown for each lane. Titanium oxide (A1), zirconium oxide (A2), tungsten oxide (A3, B3), molybdenum oxide (A4, B2), silicon dioxide (A5), aluminum oxide (B1), which is an oxide, Florisil (silica salt) B4) The concentration effect (concentration efficiency) of the abnormal prion protein using synthetic zeolite (B5), which is a complex oxide, was almost the same as that when FOG (A6, B6) was used.

酸化物法が異常型プリオン蛋白質を選択的に濃縮できることを確認する試験を行った。
〔評価に用いた検体、および評価方法〕
（１）プリオンが感染していないＮｅｕｒｏ ２ａ細胞（Ｎ２ａ細胞）を用いた点と細胞溶解液を蛋白質分解処理せずにＰＭＳＦを加えた点以外は実施例１と同様にして調製したＮ２ａ細胞溶解液を検体とした。この検体中のプリオン蛋白質をシリカ（ＦＯＧ）上に濃縮し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで泳動、ウエスタンブロット法でプリオン蛋白質を検出した（図３のレーン１）。熱変性条件、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ泳動条件、ＷＢ検出条件等については実施例１の場合と同様とした（以下（２）〜（４）についても同様の条件にて行った）。
（２）上記Ｎ２ａ細胞溶解液１７μＬ（０．５ｍＬの３０分の１）を検体として用い、酸化物による濃縮操作を施すことなく直接５倍濃度のＳＤＳ−ＰＡＧＥ用バッファー４．２μＬを加えたものを対照検体試料とした（図３のレーン２）。
（３）上記Ｎ２ａ細胞溶解液１００μＬ（０．５ｍＬの５分の１）を検体として用い、この検体に１００％冷メタノール４００μＬを加え５分ほど混合した後、４℃で高速遠心（条件：１８，０００×ｇ、１０分間）で沈殿させた蛋白質沈殿物にＳＤＳ−ＰＡＧＥ用バッファー２０μＬを加えたものをアルコール沈殿法による比較例検体試料とした（図３のレーン３）。
（４）実施例１に述べたプリオン感染Ｎｅｕｒｏ ２ａ細胞を蛋白質分解処理したＳｃＮ２ａ細胞溶解液０．５ｍＬから実施例１の場合と同様にして得た沈殿シリカにＳＤＳ−ＰＡＧＥ用バッファー２０μＬを加えたものを酸化物法による検体試料とした（図３のレーン４）。 A test was conducted to confirm that the oxide method can selectively concentrate abnormal prion protein.
[Samples and methods used for evaluation]
(1) N2a cell lysis prepared in the same manner as in Example 1, except that Neuro 2a cells (N2a cells) not infected with prions were used and that PMSF was added to the cell lysate without proteolytic treatment. The liquid was used as a specimen. The prion protein in this sample was concentrated on silica (FOG), electrophoresed by SDS-PAGE, and the prion protein was detected by Western blotting (lane 1 in FIG. 3). Thermal denaturation conditions, SDS-PAGE electrophoresis conditions, WB detection conditions, and the like were the same as in Example 1 (hereinafter, the same conditions were applied to (2) to (4)).
(2) 17 μL of the above N2a cell lysate (1/30 of 0.5 mL) was used as a sample, and 4.2 μL of a 5-fold concentration SDS-PAGE buffer was directly added without performing the concentration operation with oxides. Was used as a control sample (lane 2 in FIG. 3).
(3) Using 100 μL of the N2a cell lysate (1/5 of 0.5 mL) as a sample, adding 400 μL of 100% cold methanol to this sample and mixing for about 5 minutes, followed by high-speed centrifugation at 4 ° C. (conditions: 18 , 1,000 × g, 10 minutes), and 20 μL of SDS-PAGE buffer added to the protein precipitate was used as a comparative sample sample by the alcohol precipitation method (lane 3 in FIG. 3).
(4) 20 μL of SDS-PAGE buffer was added to precipitated silica obtained in the same manner as in Example 1 from 0.5 mL of ScN2a cell lysate obtained by proteolytic treatment of prion-infected Neuro 2a cells described in Example 1. This was used as a specimen sample by the oxide method (lane 4 in FIG. 3).

〔結果〕
結果を図３に示す。なお、実施例１の場合と同様にプリオン蛋白質に由来するバンドのシグナル強度の測定結果から算出した回収率（％）をレーン毎に示した。図中レーン１は異常型プリオン蛋白質が感染していない細胞を用いた場合における酸化物法による正常型プリオン蛋白質の濃縮（１）結果であり、レーン２における対照試料（３０分の１相当量）以下の濃縮効率を示し、レーン３の（５分の１相当量を用いた）アルコール沈殿法による比較例検体試料と比較しても、酸化物法では正常型プリオン蛋白質をほとんど濃縮していないことがわかる。一方、酸化物法は異常型プリオン蛋白質を高効率で濃縮することから（レーン４）、異常型プリオン蛋白質を極めて選択的に濃縮可能であることが確認された。 〔result〕
The results are shown in FIG. In addition, the recovery rate (%) calculated from the measurement result of the signal intensity of the band derived from the prion protein as in Example 1 is shown for each lane. Lane 1 in the figure is the result of concentration of normal prion protein by the oxide method (1) when cells not infected with abnormal prion protein are used, and control sample in lane 2 (equivalent to 1/30) It shows the following concentration efficiency, and even if compared with the comparative sample sample by the alcohol precipitation method (using 1/5 equivalent amount) in Lane 3, the normal prion protein is hardly concentrated by the oxide method I understand. On the other hand, since the oxide method concentrates abnormal prion protein with high efficiency (lane 4), it was confirmed that the abnormal prion protein can be highly selectively concentrated.

蛋白質分解処理の効果を検討した。
〔評価に用いた検体、および評価方法〕
プリオン持続感染細胞ＳｃＮ２ａを、５個の細胞培養フラスコ（底面積２５ｃｍ２）にそれぞれで培養し、細胞密度がコンフルエントとなった時点で培養上清を除き、ＰＢＳ（ｐＨ ６．５）で細胞を洗浄した。洗浄液を十分に除き、それぞれのフラスコの細胞を溶解液１ｍＬに溶解し、遠心分離して高分子核酸を除いた後、５個のフラスコからの細胞溶解液を一つにまとめ混合し、これから０．５ｍＬずつ１０本のキャップ付マイクロチューブに分け検体とした。このうち５本については実施例１の場合と同じようにプロテイナーゼＫで蛋白質分解処理を行いＰＭＳＦで酵素処理を止め、他の５本は蛋白質分解処理を施さずにＰＭＳＦのみを添加して評価した。評価は、各マイクロチューブ中の細胞溶解液にＦＯＧ原液、ＦＯＧ原液の１０４倍希釈品、１０３倍希釈品、１０２倍希釈品、１０倍希釈品の５μＬを加えて酸化物法の沈殿物を得た。それぞれの沈殿物について、実施例１と同様にしてＳＤＳ−ＰＡＧＥで泳動し、ウエスタンブロット法でプリオン蛋白質を検出した。 The effect of proteolytic treatment was investigated.
[Samples and methods used for evaluation]
The prion persistently infected cells ScN2a were cultured in 5 cell culture flasks (bottom area 25 cm 2 ), and when the cell density became confluent, the culture supernatant was removed, and the cells were washed with PBS (pH 6.5). Washed. Thoroughly remove the washing solution, dissolve the cells in each flask in 1 mL of the lysis solution, centrifuge to remove the high molecular nucleic acid, mix the cell lysis solution from the 5 flasks together, and then add 0 Samples were divided into 10 capped microtubes each containing 5 mL. Of these, 5 samples were proteolytically treated with proteinase K as in Example 1 and the enzyme treatment was stopped with PMSF, and the other 5 were evaluated by adding only PMSF without proteolytic treatment. . Evaluation, FOG stock cell lysate in each microtube, 10 4 fold dilution products FOG stock, 10 3 fold dilutions article 10 doubling dilutions products, the 10-fold diluted mixture oxide process by adding 5μL of precipitation I got a thing. Each precipitate was electrophoresed by SDS-PAGE in the same manner as in Example 1, and the prion protein was detected by Western blotting.

〔結果〕
結果を図４に示す。なお、実施例１の場合と同様にプリオン蛋白質に由来するバンドのシグナル強度の測定結果から算出した回収率（％）をレーン毎に示した。図中「ＰＫ＋」はプロテイナーゼＫ（ＰＫ）で蛋白質分解処理を行ったもの、「ＰＫ−」は蛋白質分解処理を行っていないものである。それぞれのレーン１はＦＯＧ原液の１０４倍希釈品を用いた場合、レーン２はＦＯＧ原液の１０３倍希釈品を用いた場合、レーン３はＦＯＧ原液の１０２倍希釈品を用いた場合、レーン４はＦＯＧ原液の１０倍希釈品を用いた場合、レーン５はＦＯＧ原液を用いた場合である。
この結果から、酸化物法では、蛋白質分解処理を行うと極めて少量のシリカ添加で濃縮が出来たが、蛋白質分解処理を行わない場合には蛋白質分解処理を加えた場合より多く添加する必要があることがわかる。 〔result〕
The results are shown in FIG. In addition, the recovery rate (%) calculated from the measurement result of the signal intensity of the band derived from the prion protein as in Example 1 is shown for each lane. In the figure, “PK +” indicates that the protein is decomposed with proteinase K (PK), and “PK−” indicates that the protein is not decomposed. Each lane 1 in the case of using 10 4 times diluted mixture of FOG stock, if lane 2 with 10 3-fold dilutions products FOG stock, if lane 3 using 10 two-fold dilutions products FOG stock, Lane 4 shows the case where a 10-fold diluted product of the FOG stock solution is used, and Lane 5 shows the case where the FOG stock solution is used.
From this result, in the oxide method, it was possible to concentrate with the addition of a very small amount of silica when proteolytic treatment was performed, but it was necessary to add more when proteolytic treatment was added when proteolytic treatment was not performed. I understand that.

実際の体液検体として入手が容易であるヒトの尿を用いて、蛋白質分解処理した異常型プリオン蛋白質を添加して、酸化物法による添加回収試験を行った。
〔評価に用いた検体試料〕
・実施例１における蛋白質分解処理したＦ３細胞溶解液５０μＬに、健常成人の尿４５０μＬを加え検体試料とした。
・実施例１における蛋白質分解処理したＦ３細胞溶解液５０μＬに、ＰＢＳ４５０μＬを加え検体試料とした。 Using human urine, which is easily available as an actual body fluid sample, an abnormal prion protein subjected to proteolytic treatment was added, and an addition recovery test by the oxide method was performed.
[Specimen sample used for evaluation]
A sample sample was prepared by adding 450 μL of healthy adult urine to 50 μL of the F3 cell lysate treated with proteolysis in Example 1.
-A sample sample was prepared by adding 450 μL of PBS to 50 μL of the F3 cell lysate treated with proteolysis in Example 1.

〔評価方法〕
各検体試料に、ＦＯＧ原液を滅菌水で１０００倍希釈したもの５μＬを加え、３分間室温で混合した後、軽く遠心分離してシリカを沈殿させ、上清を除いた。このシリカ沈殿にＳＤＳ−ＰＡＧＥ用バッファーを加えて懸濁し、熱変性後にＳＤＳ−ＰＡＧＥで泳動し、ウエスタンブロット法でプリオン蛋白質を検出した。 〔Evaluation methods〕
To each specimen sample, 5 μL of a FOG stock solution diluted 1000-fold with sterilized water was added, mixed for 3 minutes at room temperature, and then lightly centrifuged to precipitate silica, and the supernatant was removed. SDS-PAGE buffer was added to this silica precipitate to suspend it, and after heat denaturation, it was electrophoresed by SDS-PAGE, and prion protein was detected by Western blotting.

〔結果〕
結果を図５に示す。なお、実施例１の場合と同様にプリオン蛋白質に由来するバンドのシグナル強度の測定結果から算出した回収率（％）をレーン毎に示した。図５において、レーン１はヒトの尿を用いた場合、レーン２はＰＢＳ溶液を用いた場合である。
この結果から、異常型プリオン蛋白質は尿を加えた場合、尿を加えない（ＰＢＳ使用）場合に比べて１．４倍濃縮されていることがわかる。 〔result〕
The results are shown in FIG. In addition, the recovery rate (%) calculated from the measurement result of the signal intensity of the band derived from the prion protein as in Example 1 is shown for each lane. In FIG. 5, lane 1 is when human urine is used, and lane 2 is when PBS solution is used.
From this result, it can be seen that the abnormal prion protein is concentrated 1.4 times more when urine is added than when urine is not added (using PBS).

〔実施例６−１〕：実施例５において、尿に添加した異常型プリオン蛋白質が酸化物法にて極めて効率的に濃縮できることが明らかとなり、尿中に酸化物法の効果を高める成分が含まれることが考えられる。そこで、酸化物法による蛋白質分解処理を行わない異常型プリオン蛋白質の濃縮への尿の効果を検討した。   [Example 6-1]: In Example 5, it became clear that the abnormal prion protein added to urine can be concentrated very efficiently by the oxide method, and the urine contains a component that enhances the effect of the oxide method It is possible that Therefore, the effect of urine on the concentration of abnormal prion protein without proteolytic treatment by the oxide method was examined.

〔評価に用いた検体試料〕
・実施例１における蛋白質分解処理をしたＦ３細胞溶解液１００μＬに尿４００μＬを加え検体試料とした。
・実施例１における蛋白質分解処理をしたＦ３細胞溶解液１００μＬにリシス液４００μＬを加え検体試料とした。
・蛋白質分解しなかった以外は実施例１と同様に調製したＦ３細胞溶解液１００μＬに尿４００μＬを加え検体試料とした。
・蛋白質分解しなかった以外は実施例１と同様に調製したＦ３細胞溶解液１００μＬにリシス液４００μＬを加え検体試料（比較例）とした。
・未感染のＮｅｕｒｏ ２ａ細胞を用い蛋白質分解しなかった以外は実施例１と同様にして調製した溶解液１００μＬに尿４００μＬを加え検体試料（比較例）とした。
・未感染のＮｅｕｒｏ ２ａ細胞を用い蛋白質分解しなかった以外は実施例１と同様にして調製した溶解液１００μＬにリシス液４００μＬを加え検体試料（比較例）とした。 [Specimen sample used for evaluation]
-A sample sample was prepared by adding 400 μL of urine to 100 μL of the F3 cell lysate subjected to the proteolytic treatment in Example 1.
A sample sample was prepared by adding 400 μL of the lysis solution to 100 μL of the F3 cell lysate subjected to the proteolytic treatment in Example 1.
-A sample sample was prepared by adding 400 µL of urine to 100 µL of the F3 cell lysate prepared in the same manner as in Example 1 except that the protein was not degraded.
A sample sample (comparative example) was prepared by adding 400 μL of the lysis solution to 100 μL of the F3 cell lysate prepared in the same manner as in Example 1 except that the protein was not degraded.
A sample sample (comparative example) was prepared by adding 400 μL of urine to 100 μL of a lysate prepared in the same manner as in Example 1 except that uninfected Neuro 2a cells were not used for proteolysis.
A sample sample (comparative example) was prepared by adding 400 μL of the lysis solution to 100 μL of the lysate prepared in the same manner as in Example 1 except that uninfected Neuro 2a cells were not used for proteolysis.

〔評価方法〕
各検体試料にＦＯＧ原液を滅菌水で１０００倍希釈したもの５μＬを加え、実施例１と同様にしてＳＤＳ−ＰＡＧＥで泳動し、ウエスタンブロット法でプリオン蛋白質を検出した。 〔Evaluation methods〕
5 μL of a FOG stock solution diluted 1000-fold with sterilized water was added to each specimen sample, followed by SDS-PAGE in the same manner as in Example 1, and prion protein was detected by Western blotting.

〔結果〕
結果を図６に示す。なお、実施例１の場合と同様にプリオン蛋白質に由来するバンドのシグナル強度の測定結果から算出した回収率（％）をレーン毎に示した。図中、レーン１は蛋白質分解処理をしたＦ３細胞溶解液に尿を加えた検体試料、レーン２は比較例であり、蛋白質分解処理をしたＦ３細胞溶解液にリシス液を加えた検体試料、レーン３は未処理のＦ３細胞溶解液に尿を加えた検体試料、レーン４は比較例であり、未処理のＦ３細胞溶解液にリシス液を加えた検体試料、レーン５は未感染のＮｅｕｒｏ ２ａ細胞溶解液に尿を加えた検体試料、レーン６は比較例であり、未感染のＮｅｕｒｏ ２ａ細胞溶解液１００μＬにリシス液を加えた検体試料である。
この結果から、検体中に尿を添加することにより、プリオン蛋白質の効率的な濃縮が蛋白分解処理をしていない異常型プリオン蛋白質だけではなく、正常型プリオン蛋白質でもみられることが明らかとなった。 〔result〕
The results are shown in FIG. In addition, the recovery rate (%) calculated from the measurement result of the signal intensity of the band derived from the prion protein as in Example 1 is shown for each lane. In the figure, lane 1 is a sample sample obtained by adding urine to F3 cell lysate subjected to proteolysis, lane 2 is a comparative example, and a sample sample obtained by adding lysis solution to F3 cell lysate subjected to protein degradation, lane 3 is a sample sample obtained by adding urine to an untreated F3 cell lysate, lane 4 is a comparative example, a sample sample obtained by adding a lysis solution to an untreated F3 cell lysate, and lane 5 is an uninfected Neuro 2a cell. A sample sample obtained by adding urine to a lysate, lane 6, is a comparative example, and is a sample sample obtained by adding a lysis solution to 100 μL of an uninfected Neuro 2a cell lysate.
From this result, it was clarified that by adding urine to the specimen, efficient concentration of prion protein was observed not only in abnormal prion protein without proteolytic treatment but also in normal prion protein .

〔実施例６−２〕：尿添加の特異性についての検討；尿の添加による効果が細胞溶解液であるリシス液の組成化合物（界面活性剤やＮａＣｌ）の濃度を変えたことによる影響であるかどうかを、リンタングステン酸法の場合も含め検討した。
〔評価に用いた検体試料〕
・実施例１における蛋白質分解処理をしたＦ３細胞溶解液１００μＬに、ＰＢＳ４００μＬを加え検体試料とした。
・実施例１における蛋白質分解処理をしたＦ３細胞溶解液１００μＬに、蒸留水４００μＬを加え検体試料とした。
・実施例１における蛋白質分解処理をしたＦ３細胞溶解液１００μＬに、リシス液４００μＬを加え検体試料とした。
・実施例１における蛋白質分解処理をしたＦ３細胞溶解液１００μＬに、尿４００μＬを加え検体試料とした。 [Example 6-2]: Examination of the specificity of urine addition; the effect of urine addition is the effect of changing the concentration of the composition compound (surfactant or NaCl) in the lysis solution, which is a cell lysate Whether or not the phosphotungstic acid method was examined.
[Specimen sample used for evaluation]
-A sample sample was prepared by adding 400 μL of PBS to 100 μL of the F3 cell lysate subjected to proteolytic treatment in Example 1.
-A sample sample was prepared by adding 400 μL of distilled water to 100 μL of the F3 cell lysate subjected to the proteolytic treatment in Example 1.
A sample sample was prepared by adding 400 μL of the lysis solution to 100 μL of the F3 cell lysate subjected to the proteolytic treatment in Example 1.
-A sample sample was prepared by adding 400 μL of urine to 100 μL of the F3 cell lysate subjected to the proteolytic treatment in Example 1.

〔評価方法〕
各検体試料にＦＯＧ原液を滅菌水で１０００倍希釈したもの５μＬを加え、実施例１と同様にしてＳＤＳ−ＰＡＧＥで泳動し、ウエスタンブロット法でプリオン蛋白質を検出した。
なお、同一プール検体より分注し同様な処理をしたものを、リンタングステン酸法で並行して解析した。 〔Evaluation methods〕
5 μL of a FOG stock solution diluted 1000-fold with sterilized water was added to each specimen sample, followed by SDS-PAGE in the same manner as in Example 1, and prion protein was detected by Western blotting.
In addition, what was dispensed from the same pool specimen and processed similarly was analyzed in parallel by the phosphotungstic acid method.

〔結果〕
結果を図７に示す。なお、実施例１の場合と同様にプリオン蛋白質に由来するバンドのシグナル強度の測定結果から算出した回収率（％）をレーン毎に示した。図中レーン１は、蛋白質分解処理をしたＦ３細胞溶解液に、ＰＢＳを加えた検体試料、レーン２は蒸留水を加えた検体試料、レーン３はリシス液を加えた検体試料、レーン４は尿を加えた検体試料である。この結果から、尿添加の効果は溶解液組成化合物の濃度変化によるものではないことが判明した。さらに、尿添加を行った場合には、酸化物法による異常型プリオン蛋白質濃縮効率はリンタングステン酸法を上回っていた。 〔result〕
The results are shown in FIG. In addition, the recovery rate (%) calculated from the measurement result of the signal intensity of the band derived from the prion protein as in Example 1 is shown for each lane. In the figure, lane 1 is a sample sample obtained by adding PBS to F3 cell lysate subjected to proteolysis treatment, lane 2 is a sample sample obtained by adding distilled water, lane 3 is a sample sample obtained by adding a lysis solution, and lane 4 is urine sample. It is a specimen sample to which is added. From this result, it was found that the effect of urine addition was not due to a change in the concentration of the solution composition compound. Furthermore, when urine was added, the abnormal prion protein concentration efficiency by the oxide method exceeded the phosphotungstic acid method.

〔実施例６−３〕：尿の添加量の効果を検討した。
〔評価に用いた検体試料〕
・実施例１における蛋白質分解処理したＦ３細胞溶解液１００μＬに、尿単独、尿とリシス液の１：３、１：１、３：１（容量比）混合液、リシス液単独のそれぞれ４００μＬを加え検体試料とした。
・蛋白質分解処理しない以外は実施例１と同様に調製したＦ３細胞溶解液１００μＬに、尿単独、尿とリシス液の混合液〔１：３、１：１、３：１（容量比）〕、リシス液単独のそれぞれ４００μＬを加え検体試料とした。 [Example 6-3]: The effect of the amount of urine added was examined.
[Specimen sample used for evaluation]
-To 100 μL of the F3 cell lysate treated with proteolysis in Example 1, 400 μL each of urine alone, 1: 3, 1: 1, 3: 1 (volume ratio) mixed solution of urine and lysis solution, and lysis solution alone was added. A specimen sample was used.
-To 100 μL of F3 cell lysate prepared in the same manner as in Example 1 except that no proteolytic treatment was performed, urine alone, a mixture of urine and lysis solution [1: 3, 1: 1, 3: 1 (volume ratio)], 400 μL of each lysis solution alone was added to prepare a specimen sample.

〔評価方法〕
各検体試料５００μＬにＦＯＧ原液を滅菌水で１０００倍希釈したもの５μＬを加え、実施例１と同様にしてＳＤＳ−ＰＡＧＥで泳動し、ウエスタンブロット法でプリオン蛋白質を検出した。なお、蛋白質分解処理を加えた検体試料群（Ａ）では免疫反応シグナルを検出する時間（化学発光シグナルをＸ線フィルムに露出する時間）を１分間とし、蛋白質分解処理を行わない検体試料群（Ｂ）については１０分間の検出時間とした。 〔Evaluation methods〕
5 μL of a FOG stock solution diluted 1000-fold with sterilized water was added to 500 μL of each specimen sample, followed by SDS-PAGE in the same manner as in Example 1, and prion protein was detected by Western blotting. In the sample sample group (A) subjected to the proteolytic treatment, the time for detecting the immune reaction signal (time for exposing the chemiluminescence signal to the X-ray film) is 1 minute, and the sample sample group (proteolytic treatment is not performed) For B), the detection time was 10 minutes.

〔結果〕
結果を図８に示す。なお、実施例１の場合と同様にプリオン蛋白質に由来するバンドのシグナル強度の測定結果から算出した回収率（％）をレーン毎に示した。図中、Ａは蛋白質分解処理した異常型プリオン蛋白質含有検体試料、Ｂは蛋白質分解処理していない異常型プリオン蛋白質及び正常型プリオン蛋白質含有検体試料であり、レーン１はＦ３細胞溶解液にリシス液単独を加えた検体試料、レーン２は尿とリシス液１：３（容量比）の混合液、レーン３は尿とリシス液１：１（容量比）の混合液、レーン４は尿とリシス液３：１（容量比）の混合液、レーン５は尿単独を加えた検体試料である。
蛋白質分解処理をした異常型プリオン蛋白質では、検体試料中の尿が４０容量％（レーン３）以上では尿の添加効果が顕著となり、それ以上の尿添加では効果がほぼ飽和しているようにみえる。一方、図８Ｂに示すように蛋白質分解処理をしていないプリオン蛋白質（異常型以外にも正常型を含む）では無添加に比べ、尿を２０容量％含むと効率が上がっていたが、２０〜６０容量％で効率は変わらず、８０容量％添加で大きく効率は上がった。 〔result〕
The results are shown in FIG. In addition, the recovery rate (%) calculated from the measurement result of the signal intensity of the band derived from the prion protein as in Example 1 is shown for each lane. In the figure, A is an abnormal prion protein-containing specimen sample that has undergone proteolysis, B is an abnormal prion protein that has not been proteolytically processed, and a normal prion protein-containing specimen sample, and lane 1 is a lysis solution in the F3 cell lysate. Sample sample added alone, lane 2 is a mixture of urine and lysis solution 1: 3 (volume ratio), lane 3 is a mixture of urine and lysis solution 1: 1 (volume ratio), lane 4 is urine and lysis solution A 3: 1 (volume ratio) mixture, lane 5 is a specimen sample to which urine alone is added.
In the abnormal prion protein that has been subjected to proteolytic treatment, the urine addition effect becomes remarkable when the urine in the sample sample is 40% by volume (lane 3) or more, and the effect seems to be almost saturated when the urine is added more than that. . On the other hand, as shown in FIG. 8B, in the prion protein not subjected to proteolytic treatment (including normal type as well as abnormal type), the efficiency was increased when 20% by volume of urine was contained, compared with no addition. The efficiency did not change at 60% by volume, and the efficiency increased greatly with the addition of 80% by volume.

〔実施例６−４〕：尿の添加効果が酸化物法に特異的であるのか、あるいは他の方法、特にリンタングステン酸法にも認められるかどうかを検討した。   [Example 6-4]: It was examined whether the urine addition effect was specific to the oxide method or whether it was also observed in other methods, particularly the phosphotungstic acid method.

〔評価に用いた検体試料、および評価方法〕
前記（実施例６−３）と同一プールから分注した検体を用いて、前記（実施例６−２）の方法による酸化物法、およびリンタングステン酸法で解析した。 [Specimen sample used for evaluation and evaluation method]
Using the sample dispensed from the same pool as in the above (Example 6-3), analysis was performed by the oxide method and the phosphotungstic acid method according to the method of (Example 6-2).

〔結果〕
結果を図９に示す。なお、実施例１の場合と同様にプリオン蛋白質に由来するバンドのシグナル強度の測定結果から算出した回収率（％）をレーン毎に示した。図中、ＦＯＧは酸化物法、ＰＴＡはリンタングステン酸法によるものであり、レーン１はＦ３細胞溶解液にリシス液単独を加えた検体試料、レーン２は尿とリシス液１：３（容量比）の混合液、レーン３は尿とリシス液１：１（容量比）の混合液、レーン４は尿とリシス液３：１（容量比）の混合液、レーン５は尿単独を加えた検体試料である。 〔result〕
The results are shown in FIG. In addition, the recovery rate (%) calculated from the measurement result of the signal intensity of the band derived from the prion protein as in Example 1 is shown for each lane. In the figure, FOG is based on the oxide method, PTA is based on the phosphotungstic acid method, lane 1 is a specimen sample obtained by adding lysis solution alone to F3 cell lysate, lane 2 is urine and lysis solution 1: 3 (volume ratio) Lane 3 is a mixed solution of urine and lysis solution 1: 1 (volume ratio), lane 4 is a mixed solution of urine and lysis solution 3: 1 (volume ratio), and lane 5 is a sample to which urine alone is added. It is a sample.

リンタングステン酸法では、酸化物法における尿容量に依存する濃縮効率の向上は観察されなかった。また、図７でも観察されたように、検体試料容量中の４０％以上の尿添加では酸化物法の方がリンタングステン酸法よりも異常型プリオン蛋白質の濃縮効率は優れていた。   In the phosphotungstic acid method, no improvement in the concentration efficiency depending on the urine volume in the oxide method was observed. In addition, as observed in FIG. 7, when the urine was added in an amount of 40% or more of the sample volume, the oxide method was superior to the phosphotungstic acid method in concentrating the abnormal prion protein.

〔実施例６−５〕：尿添加の影響が尿中に含まれる尿素やアンモニアの影響であるかどうかを検討した。
〔評価に用いた検体試料、および評価方法〕
実施例１における蛋白質分解処理したＦ３細胞溶解液１００μＬに尿素を含まないリシス液、あるいは尿素１、２、３、４、５％（重量）含むリシス液４００μＬを加えた検体試料を用いて、前記（実施例６−３）の方法による酸化物法で解析した。また、実施例１における蛋白質分解処理したＦ３細胞溶解液１００μＬにアンモニアを含まないリシス液、あるいはアンモニア０．２５、０．５、１、１．５、２％（重量）含むリシス液４００μＬを加えた検体試料を用いて、前記（実施例６−３）の方法による酸化物法で解析した。
〔結果〕
酸化物法による異常型プリオン蛋白質の濃縮において、尿素添加やアンモニア添加では濃縮効率の改善は見られなかった。 [Example 6-5]: It was examined whether or not the effect of urine addition was the effect of urea or ammonia contained in urine.
[Specimen sample used for evaluation and evaluation method]
Using the sample sample obtained by adding a lysis solution containing no urea or 400 μL of a lysis solution containing urea 1, 2, 3, 4, 5% (weight) to 100 μL of the F3 cell lysate treated with proteolysis in Example 1 Analysis was performed by an oxide method according to the method of Example 6-3. Moreover, 400 μL of a lysis solution containing no ammonia or lysis solution containing 0.25, 0.5, 1, 1.5, 2% (weight) of ammonia was added to 100 μL of the F3 cell lysate treated with proteolysis in Example 1. The sample was analyzed by the oxide method according to the method of Example 6-3.
〔result〕
In the enrichment of abnormal prion protein by the oxide method, the addition of urea or ammonia did not improve the concentration efficiency.

検体試料溶液中の塩濃度が酸化物法による異常型プリオン蛋白質濃縮に及ぼす影響を調べた。
〔評価に用いた検体試料、および評価方法〕
実施例１における蛋白質分解処理したＳｃＮ２ａ細胞溶解液０．５ｍＬにＰＢＳを加えて容量を１ｍＬとした検体試料、および蛋白質分解処理したＳｃＮ２ａ細胞溶解液０．５ｍＬに、核酸抽出用キット（Ｑｂｉｏｇｅｎｅ社製）に添付されている高塩濃度溶液であるＨｉｇｈ Ｓａｌｔ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｓｏｌｕｔｉｏｎの１２５、２５０、３７５、５００μＬをそれぞれ加え、さらにＰＢＳを加えて容量を１ｍＬとした検体試料のそれぞれについて、ＦＯＧ原液を１０００倍希釈したもの５μＬを加えて異常型プリオン蛋白質を沈殿させ、実施例１と同様にしてＳＤＳ−ＰＡＧＥで泳動し、ウエスタンブロット法でプリオン蛋白質を検出した。 The effect of salt concentration in the sample solution on the enrichment of abnormal prion protein by the oxide method was investigated.
[Specimen sample used for evaluation and evaluation method]
Nucleic acid extraction kit (manufactured by Qbiogene) was added to 0.5 mL of the sample solution in which PBS was added to 0.5 mL of the proteolytically processed ScN2a cell lysate in Example 1 and the volume was adjusted to 1 mL. Add 125, 250, 375 and 500 μL of High Salt Binding Solution, which is a high salt concentration solution attached to), and further dilute the FOG stock solution by a factor of 1000 for each sample sample with PBS added to a volume of 1 mL. 5 μL of the product was added to precipitate abnormal prion protein, which was subjected to SDS-PAGE in the same manner as in Example 1 to detect prion protein by Western blotting.

〔結果〕
結果を図１０に示す。なお、実施例１の場合と同様にプリオン蛋白質に由来するバンドのシグナル強度の測定結果から算出した回収率（％）をレーン毎に示した。酸化物法による異常型プリオン蛋白質の濃縮は検体試料中の塩濃度がＰＢＳ中の塩化ナトリウムに由来する１５０ｍＭより高くなるにしたがって濃縮効率が低下した。 〔result〕
The results are shown in FIG. In addition, the recovery rate (%) calculated from the measurement result of the signal intensity of the band derived from the prion protein as in Example 1 is shown for each lane. Concentration of abnormal prion protein by the oxide method decreased as the salt concentration in the specimen sample was higher than 150 mM derived from sodium chloride in PBS.

酸化物法において検体に添加する酸化物量について調べた。
〔評価に用いた検体試料、および評価方法〕
実施例１における蛋白質分解処理したＦ３細胞溶解液０．５ｍＬあるいは０．２５ｍＬに、ＦＯＧ原液を滅菌水で５（ｎ−１）×１０００倍希釈（ｎ＝１〜６）したものをそれぞれ５μＬあるいは２．５μＬを加え、３分間室温で混合した後、軽遠心してシリカを沈殿させ、上清を除いた。このシリカ沈殿にＳＤＳ−ＰＡＧＥ用バッファーを加えて懸濁し、熱変性後にＳＤＳ−ＰＡＧＥで泳動し、ウエスタンブロット法でプリオン蛋白質を検出した。 The amount of oxide added to the specimen in the oxide method was examined.
[Specimen sample used for evaluation and evaluation method]
5 μL each of the FOG cell lysate 0.5 mL or 0.25 mL proteolytically treated in Example 1 diluted 5 (n−1) × 1000 times (n = 1-6) with sterilized water After adding 2.5 μL and mixing at room temperature for 3 minutes, light centrifugation was performed to precipitate silica, and the supernatant was removed. SDS-PAGE buffer was added to this silica precipitate to suspend it, and after heat denaturation, it was electrophoresed by SDS-PAGE, and prion protein was detected by Western blotting.

〔結果〕
結果を図１１に示す。なお、実施例１の場合と同様にプリオン蛋白質に由来するバンドのシグナル強度の測定結果から算出した回収率（％）をレーン毎に示した。図中のレーンの数字は、５（ｎ−１）×１０００倍希釈（ｎ＝１〜６）のｎと一致している。この結果から、検体１００μＬあたりＦＯＧ原液を５４×１０００倍希釈したシリカ溶液１μＬ量までほぼ同程度に異常型プリオン蛋白質を濃縮できた。５４×１０００倍希釈したシリカ溶液１μＬに含まれるシリカ量はおよそ０．５ｎｇである。 〔result〕
The results are shown in FIG. In addition, the recovery rate (%) calculated from the measurement result of the signal intensity of the band derived from the prion protein as in Example 1 is shown for each lane. The numbers in the lanes in the figure coincide with n of 5 (n-1) x 1000-fold dilution (n = 1 to 6). This result could be concentrated an abnormal prion protein at approximately the same extent silica solution 1μL amount of dilution of the sample 100μL per FOG stock 5 4 × 1000 times. The amount of silica contained in 1 μL of the 5 4 × 1000 diluted silica solution is approximately 0.5 ng.

酸化物による異常型プリオン蛋白質の濃縮において、酸化物との反応時の温度条件について検討を行った。
〔評価に用いた酸化物〕
ＦＯＧとプラスミドＤＮＡ回収用シリカであるＱＩＡＥＸ（Ｑｉａｇｅｎ社製）をそれぞれ用い、細胞溶解液とシリカとの混合反応を４℃、２０℃、３７℃で５分間行い、比較した。 In the enrichment of abnormal prion protein with oxides, the temperature conditions during the reaction with oxides were investigated.
[Oxides used for evaluation]
Using FOG and QIAEX (manufactured by Qiagen), which is a silica for plasmid DNA recovery, a cell lysate and silica were mixed at 4 ° C., 20 ° C., and 37 ° C. for 5 minutes for comparison.

ＦＯＧ原液とほぼ等量になるようにＱＩＡＥＸシリカを滅菌水で調整した（図１２の１００のレーン）。これを１０１倍、１０２倍，１０３倍に希釈したものも調整した（図１２のそれぞれ１０−１、１０−２，１０−３のレーン）。ＦＯＧは原液を滅菌水で１０３倍希釈したものを調製した。実施例１の蛋白質分解処理したＳｃＮ２ａ細胞溶解液０．５ｍＬに、調製した各シリカ液５μＬを加え、４℃、２０℃、３７℃で５分間混合した後、軽遠心〔５，０００×ｇ、１分間〕してシリカを沈殿させ、上清を除いた。このシリカ沈殿にＳＤＳ−ＰＡＧＥ用バッファーを加えて懸濁し、９５℃、５分間の熱変性後にＳＤＳ−ＰＡＧＥで泳動し、ウエスタンブロット法でプリオン蛋白質を検出した。また、実施例１の場合と同様にプリオン蛋白質に由来するバンドのシグナル強度の測定結果から算出した回収率（％）をレーン毎に示した。結果を図１２で示すように、ＦＯＧもＱＩＡＥＸも細胞溶解液との混合反応時の温度については、４℃より（データ非表示）２０℃の方が、２０℃より３７℃の方が異常型プリオン蛋白質の濃縮効率は良かった。 The QIAEX silica to be substantially equal amount as FOG stock was adjusted with sterile water (10 of FIG. 12 0 lanes). Those diluted to 10 1 times, 10 2 times, and 10 3 times were also prepared (lanes 10 −1 , 10 −2 , and 10 −3 in FIG. 12), respectively. FOG was prepared which was diluted 10 3 fold stock with sterile water. After adding 5 μL of each prepared silica solution to 0.5 mL of the proteolytically processed ScN2a cell lysate of Example 1, mixing at 4 ° C., 20 ° C., and 37 ° C. for 5 minutes, followed by light centrifugation [5,000 × g, 1 minute] to precipitate the silica and remove the supernatant. SDS-PAGE buffer was added to this silica precipitate for suspension, and after heat denaturation at 95 ° C. for 5 minutes, electrophoresis was performed by SDS-PAGE, and prion protein was detected by Western blotting. Moreover, the recovery rate (%) calculated from the measurement result of the signal intensity of the band derived from the prion protein in the same manner as in Example 1 is shown for each lane. As shown in FIG. 12, the temperature at the time of the mixed reaction of FOG and QIAEX with the cell lysate is abnormal at 4 ° C. (data not shown) at 20 ° C. and at 20 ° C. at 37 ° C. Prion protein concentration efficiency was good.

（１）実施例７で検体試料溶液中の塩濃度が酸化物による異常型プリオン蛋白質の濃縮効果を低下させることを明らかにした。そこで異常型プリオン蛋白質が濃縮された酸化物沈殿物の洗浄液の塩濃度について調べた。
〔評価に用いた検体、およびその処理〕
・実施例１における蛋白質分解処理したＳｃＮ２ａ細胞溶解液を検体とした。
・プリオンが感染していないＮｅｕｒｏ ２ａ細胞を用い、蛋白質分解処理しないこと以外は実施例１と同様にして調製したＮ２ａ細胞溶解液を検体とした。 (1) In Example 7, it was clarified that the salt concentration in the sample solution decreased the concentration effect of the abnormal prion protein by the oxide. Therefore, the salt concentration of the washing solution of the oxide precipitate enriched with the abnormal prion protein was investigated.
[Samples used for evaluation and their treatment]
-Proteolytically treated ScN2a cell lysate in Example 1 was used as a specimen.
A N2a cell lysate prepared in the same manner as in Example 1 except that Neuro 2a cells not infected with prions were used and proteolytic treatment was not used was used as a specimen.

〔評価方法〕
検体としての各細胞溶解液０．５ｍＬにＦＯＧ原液を滅菌水で１０００倍希釈したもの５μＬを加えて混合し、軽遠心〔５，０００×ｇ、１分間〕して分離した沈殿に、０〜１．５ＭのＮａＣｌ溶液０．５ｍＬを加え懸濁させ軽遠心〔５，０００×ｇ、１分間〕して上清を除く処理を３回繰り返した。このような洗浄処理を施さない無処置沈殿、及び各洗浄処理を施し最終的に得られた沈殿について、ＳＤＳ−ＰＡＧＥバッファーを加えて、９５℃、５分間の熱変性後にＳＤＳ−ＰＡＧＥで泳動し、ウエスタンブロット法でプリオン蛋白質を検出した。 〔Evaluation methods〕
Add 5 μL of the FOG stock solution diluted 1000-fold with sterilized water to 0.5 mL of each cell lysate as a sample, mix, mix with the precipitate separated by light centrifugation [5,000 × g, 1 minute] The process of adding 0.5 mL of a 1.5 M NaCl solution, suspending it, and lightly centrifuging (5,000 × g, 1 minute) and removing the supernatant was repeated three times. SDS-PAGE buffer was added to the untreated precipitates that were not subjected to such washing treatment, and the precipitates that were finally obtained after each washing treatment, and were subjected to SDS-PAGE after heat denaturation at 95 ° C. for 5 minutes. The prion protein was detected by Western blotting.

〔結果〕
結果を図１３に示す。なお、実施例１の場合と同様にプリオン蛋白質に由来するバンドのシグナル強度の測定結果から算出した回収率（％）をレーン毎に示した。図中、正常型プリオン蛋白質は、蛋白質分解処理していないＮ２ａ細胞溶解液より回収されたものであり、異常型プリオン蛋白質は蛋白分解処理したＳｃＮ２ａ細胞溶解液より回収されたものである。０．１５Ｍを超える塩濃度での洗浄では、異常型プリオン蛋白質は酸化物から遊離することがわかった。また抗プリオン蛋白質抗体ＳＡＦ８３で認識された正常型プリオン蛋白質を含むシグナルからは０．０７５Ｍ以外の塩濃度での洗浄では酸化物から遊離したことを示す。 〔result〕
The results are shown in FIG. In addition, the recovery rate (%) calculated from the measurement result of the signal intensity of the band derived from the prion protein as in Example 1 is shown for each lane. In the figure, the normal prion protein is recovered from the N2a cell lysate not subjected to proteolytic treatment, and the abnormal prion protein is recovered from the proteolytically processed ScN2a cell lysate. It was found that the abnormal prion protein was released from the oxide by washing with a salt concentration exceeding 0.15M. Further, the signal containing the normal prion protein recognized by the anti-prion protein antibody SAF83 indicates that it was released from the oxide by washing at a salt concentration other than 0.075M.

（２）次に洗浄液のｐＨについて検討した。
〔評価に用いた検体試料、およびその処理〕
実施例１における蛋白質分解処理したＳｃＮ２ａ細胞溶解液０．５ｍＬにＦＯＧを混合して得た沈殿物に、ｐＨ２（０．０５Ｍ グリシンバッファー）、ｐＨ３（０．０５Ｍ グリシンバッファー）、ｐＨ４（０．０５Ｍ クエン酸バッファー）、ｐＨ５（０．０５Ｍ クエン酸バッファー）、ｐＨ６（０．０５Ｍ ２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）バッファー）、ｐＨ７（０．０５Ｍ 燐酸バッファー）、ｐＨ８（０．０５Ｍ トリスバッファー）、ｐＨ９（０．０５Ｍ トリスバッファー）、ｐＨ１０（０．０５Ｍ Ｎ−シクロヘキシル−３−アミノプロパンスルホン酸（ＣＡＰＳ）バッファー）、ｐＨ１１（０．０５Ｍ ＣＡＰＳバッファー）、ｐＨ１２（０．０５Ｍ ＣＡＰＳバッファー）の各種バッファー溶液０．５ｍＬを加え懸濁したのち軽遠心〔５，０００×ｇ、１分間〕して上清を除く処理を３回繰り返した。このような洗浄処理を施さない無処置沈殿、及び各洗浄処理を施し最終的に得られた沈殿にＳＤＳ−ＰＡＧＥバッファーを加えて、９５℃、５分間の熱変性後にＳＤＳ−ＰＡＧＥで泳動し、ウエスタンブロット法でプリオン蛋白質を検出した。 (2) Next, the pH of the cleaning solution was examined.
[Specimen sample used for evaluation and its treatment]
The precipitate obtained by mixing FOG with 0.5 mL of the proteolytically treated ScN2a cell lysate in Example 1 was added to pH 2 (0.05 M glycine buffer), pH 3 (0.05 M glycine buffer), pH 4 (0.05 M). Citrate buffer), pH 5 (0.05 M citrate buffer), pH 6 (0.05 M 2- (N-morpholino) ethanesulfonic acid (MES) buffer), pH 7 (0.05 M phosphate buffer), pH 8 (0.05 M Tris buffer), pH 9 (0.05 M Tris buffer), pH 10 (0.05 M N-cyclohexyl-3-aminopropanesulfonic acid (CAPS) buffer), pH 11 (0.05 M CAPS buffer), pH 12 (0.05 M CAPS buffer) ) 0.5 mL of various buffer solutions Treatment was repeated with the exception of the supernatant three times lightly centrifuged were suspended [5,000 × g, 1 minute]. SDS-PAGE buffer is added to the untreated precipitate without such washing treatment and the precipitate finally obtained after each washing treatment, and after electrophoresis at 95 ° C. for 5 minutes, it is electrophoresed by SDS-PAGE. The prion protein was detected by Western blotting.

〔結果〕
結果を図１４のＡおよびＢに示す。なお図１４Ｂには、実施例１の場合と同様にプリオン蛋白質に由来するバンドのシグナル強度の測定結果から算出した回収率（％）をレーン毎に示した。この結果から、調べたｐＨバッファー溶液の中ではｐＨ６〜１０以外の溶液での洗浄では異常型プリオン蛋白質は酸化物から遊離することがわかった。 〔result〕
The results are shown in FIGS. In FIG. 14B, the recovery rate (%) calculated from the measurement result of the signal intensity of the band derived from the prion protein as in Example 1 is shown for each lane. From this result, it was found that the abnormal prion protein is released from the oxide in the examined pH buffer solution by washing with a solution other than pH 6-10.

酸化物法における検体試料容量の影響について検討した。
実施例１と同様にしてＳＤＳ−ＰＡＧＥで泳動し、ウエスタンブロット法でプリオン蛋白質を検出した。
実施例１における蛋白質分解処理したＦ３細胞溶解液０．１ｍＬに、ＰＢＳと尿を混合して全体の容量を０．３〜１．２ｍＬまで０．１ｍＬずつ増加させた検体試料を調整した。なお、加える尿量は全体の容量あたり４０％になるようにした。また、蛋白質分解処理したＦ３細胞溶解液０．１ｍＬに尿を加えずＰＢＳのみを０．４ｍＬ加えたものを参考として調整した。これらの検体試料にＦＯＧ原液を滅菌水で１０００倍希釈したものを５μＬ混合して沈殿させたシリカ沈殿物に、実施例１と同様にしてＳＤＳ−ＰＡＧＥ用バッファーを加えて、９５℃、５分間の熱変性後にＳＤＳ−ＰＡＧＥで泳動し、ウエスタンブロット法でプリオン蛋白質を検出した。 The effect of sample volume on the oxide method was investigated.
In the same manner as in Example 1, electrophoresis was carried out by SDS-PAGE, and prion protein was detected by Western blotting.
A sample sample in which PBS and urine were mixed with 0.1 mL of the F3 cell lysate treated with proteolysis in Example 1 to increase the total volume by 0.1 mL from 0.3 to 1.2 mL was prepared. The amount of urine added was 40% of the total volume. Further, 0.1 mL of F3 cell lysate treated with proteolysis was adjusted with reference to 0.4 mL of PBS alone without adding urine. An SDS-PAGE buffer was added to a silica precipitate obtained by mixing 5 μL of the FOG stock solution diluted 1000-fold with sterilized water with these specimen samples, and then precipitated at 95 ° C. for 5 minutes. After heat denaturation, the sample was electrophoresed by SDS-PAGE, and the prion protein was detected by Western blotting.

〔結果〕
結果を図１５に示す。なお、実施例１の場合と同様にプリオン蛋白質に由来するバンドのシグナル強度の測定結果から算出した回収率（％）をレーン毎に示した。図中、レーン１〜１０はそれぞれ容量が０．３〜１．２ｍＬの検体試料から異常型プリオン蛋白質を濃縮したものである。レーン１１は参考のため尿を加えていない検体試料より異常型プリオン蛋白質を濃縮したものである。例えば、レーン１とレーン１０を比較すると明らかなように、検体試料容量が４倍に増加し異常型プリオン蛋白質濃度が４分の１に低下しても、酸化物法により濃縮される異常型プリオン蛋白質量に変化は見られなかった。
この結果は、酸化物法では検体試料の容量に関係なく、検体中の異常型プリオン蛋白質を高効率に濃縮できることを示している。 〔result〕
The results are shown in FIG. In addition, the recovery rate (%) calculated from the measurement result of the signal intensity of the band derived from the prion protein as in Example 1 is shown for each lane. In the figure, lanes 1 to 10 are obtained by concentrating abnormal prion protein from a specimen sample having a volume of 0.3 to 1.2 mL, respectively. Lane 11 is obtained by concentrating abnormal prion protein from a sample sample to which urine is not added for reference. For example, as apparent from comparing lane 1 and lane 10, even if the specimen sample volume is increased by a factor of 4 and the abnormal prion protein concentration is reduced by a factor of four, the abnormal prion is concentrated by the oxide method. There was no change in protein mass.
This result shows that the abnormal prion protein in the sample can be concentrated with high efficiency regardless of the volume of the sample by the oxide method.

酸化物法によった沈殿物からの異常型プリオン蛋白質の溶出について検討した。
実施例１と同様にしてＳＤＳ−ＰＡＧＥで泳動し、ウエスタンブロット法でプリオン蛋白質を検出した。 The elution of abnormal prion protein from precipitates by the oxide method was investigated.
In the same manner as in Example 1, electrophoresis was carried out by SDS-PAGE, and prion protein was detected by Western blotting.

実施例１における蛋白質分解処理したＳｃＮ２ａ細胞溶解液０．５ｍＬにＦＯＧを混合して沈殿したシリカ沈殿物に、８Ｍ尿素液（２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．５）２０μＬを加え９５℃で５分、あるいは６Ｍグアニジンチオシアン酸溶液（２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．５）２０μＬを加え３７℃で１５分反応させた。それぞれを軽遠心〔５，０００×ｇ、１分間〕して上清２０μＬを回収した。これを蒸留水で２倍に希釈した後に５倍濃度のＳＤＳ−ＰＡＧＥ用バッファー１０μＬを加えて撹拌したもの（５０μＬ）の２０μＬを、９５℃、５分間の熱変性の代わりに室温で一晩おいて解析用試料とした。一方、沈殿物にＳＤＳ−ＰＡＧＥ用バッファー５０μＬを加えて懸濁し、９５℃、５分間の熱変性させたものの２０μＬを対照用試料とした。これらの試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥで泳動し、ウエスタンブロット法でプリオン蛋白質を検出した。   20 μL of 8 M urea solution (25 mM Tris-HCl pH 7.5) is added to the silica precipitate precipitated by mixing FOG with 0.5 mL of the proteolytically treated ScN2a cell lysate in Example 1, or at 95 ° C. for 5 minutes, or 20 μL of 6M guanidine thiocyanic acid solution (25 mM Tris-HCl pH 7.5) was added and reacted at 37 ° C. for 15 minutes. Each was lightly centrifuged (5,000 × g, 1 minute), and 20 μL of the supernatant was recovered. Dilute this solution 2 times with distilled water, add 10 μL of 5 × SDS-PAGE buffer and stir (50 μL) 20 μL overnight at room temperature instead of heat denaturation at 95 ° C. for 5 minutes. And used as a sample for analysis. On the other hand, 50 μL of SDS-PAGE buffer was added to the precipitate and suspended, and 20 μL of the sample which had been heat denatured at 95 ° C. for 5 minutes was used as a control sample. These samples were run by SDS-PAGE, and the prion protein was detected by Western blotting.

〔結果〕
結果を図１６に示す。なお、実施例１の場合と同様にプリオン蛋白質に由来するバンドのシグナル強度の測定結果から算出した回収率（％）をレーン毎に示した。図中、「ｕｒｅａ」は沈殿物から８Ｍ尿素液処理で溶出した異常型プリオン蛋白質、「Ｇｄｎ」は沈殿物から６Ｍグアニジンチオシアン酸溶液処理で溶出した異常型プリオン蛋白質、「Ｃｏｎｔ」は尿素液やグアニジンチオシアン酸溶液で未処理の沈殿物に含まれている異常型プリオン蛋白質である。
この結果から、８Ｍ尿素液での処理では、酸化物の沈殿物より異常型プリオン蛋白質を「Ｃｏｎｔ」の場合に対して１００％以上遊離回収することが出来た。したがって、酸化物法で濃縮した異常型プリオン蛋白質は尿素処理により簡単に溶液状態で遊離回収でき、様々な検査法に利用することが出来る。 〔result〕
The results are shown in FIG. In addition, the recovery rate (%) calculated from the measurement result of the signal intensity of the band derived from the prion protein as in Example 1 is shown for each lane. In the figure, “urea” is an abnormal prion protein eluted from the precipitate by treatment with 8M urea solution, “Gdn” is an abnormal prion protein eluted from the precipitate by treatment with 6M guanidine thiocyanate solution, “Cont” is urea solution or It is an abnormal prion protein contained in an untreated precipitate with a guanidine thiocyanate solution.
From this result, in the treatment with 8M urea solution, 100% or more of the abnormal prion protein could be recovered from the precipitate of the oxide as compared with the case of “Cont”. Therefore, the abnormal prion protein concentrated by the oxide method can be easily released and recovered in a solution state by urea treatment, and can be used for various inspection methods.

本発明の酸化物法による異常型プリオン蛋白質の濃縮効果について、従来のリンタングステン酸法と比較して試験を行った結果の一例として、ウエスタンブロットの泳動像を示す図面代用写真である。It is a drawing substitute photograph which shows the migration image of a Western blot as an example of the result of having tested compared with the conventional phosphotungstic acid method about the concentration effect of the abnormal prion protein by the oxide method of this invention. 同酸化物法による異常型プリオン蛋白質の濃縮効果について、酸化物の種類による比較試験を行った結果の一例として、ウエスタンブロットの泳動像を示す図面代用写真であり、Ａは蛋白分解処理を加えたプリオン持続感染細胞Ｆ３の細胞溶解液を検体として用いた場合、Ｂは蛋白分解処理を加えたプリオン持続感染細胞ＳｃＮ２ａの細胞溶解液を検体として用いた場合の結果を示す。As an example of the result of a comparative test according to the type of oxide, the effect of concentrating abnormal prion protein by the oxide method is a drawing-substituting photograph showing a migration image of Western blot, and A is proteolytically treated When the cell lysate of the prion persistently infected cell F3 is used as a specimen, B shows the result when the cell lysate of the prion persistently infected cell ScN2a subjected to proteolytic treatment is used as the specimen. 同酸化物法による異常型プリオン蛋白質の選択的濃縮効果について、正常型プリオン蛋白質の場合との比較試験を行った結果の一例として、ウエスタンブロットの泳動像を示す図面代用写真である。FIG. 5 is a drawing-substituting photograph showing a Western blot electrophoretic image as an example of the result of a comparison test with the normal prion protein regarding the selective enrichment effect of abnormal prion protein by the oxide method. 同酸化物法による異常型プリオン蛋白質の濃縮効果について、検体の蛋白質分解処理の有無による比較試験を行った結果の一例として、ウエスタンブロットの泳動像を示す図面代用写真である。It is a drawing substitute photograph which shows the migration image of a Western blot as an example of the result of having done the comparative test by the presence or absence of the proteolysis process of the test substance about the concentration effect of the abnormal prion protein by the oxide method. 同酸化物法による異常型プリオン蛋白質の濃縮効果について、尿検体に対して異常型プリオン蛋白質の添加回収試験を行った結果の一例として、ウエスタンブロットの泳動像を示す図面代用写真である。FIG. 6 is a drawing-substituting photograph showing a Western blot migration image as an example of the result of adding and recovering an abnormal prion protein to a urine sample with respect to the concentration effect of the abnormal prion protein by the oxide method. 同酸化物法による異常型プリオン蛋白質の濃縮効果について、検体に対して尿の添加の有無と蛋白質分解処理の有無の影響を確認する試験を行った結果の一例として、ウエスタンブロットの泳動像を示す図面代用写真である。As an example of the results of a test to confirm the effects of the presence or absence of urine addition and the presence or absence of proteolytic treatment on the sample, the Western blot electrophoresis image is shown for the concentration effect of abnormal prion protein by the oxide method It is a drawing substitute photograph. 同酸化物法による異常型プリオン蛋白質の濃縮効果について、検体に対する尿の添加の特異的影響をリンタングステン酸法と比較して試験を行った結果の一例として、ウエスタンブロットの泳動像を示す図面代用写真である。As an example of the results of testing the specific effect of urine addition on specimens compared to the phosphotungstic acid method for the concentration effect of abnormal prion protein by the oxide method, a Western blot electrophoretic image is substituted for a drawing It is a photograph. 同酸化物法による異常型プリオン蛋白質の濃縮効果について、検体に対する尿の添加量と蛋白質分解処理の有無の影響を確認する試験を行った結果の一例として、ウエスタンブロットの泳動像を示す図面代用写真である。As an example of the results of a test to confirm the effect of the amount of urine added to the sample and the presence or absence of proteolytic treatment, the photo of the drawing substituted for Western blotting is shown as an example of the concentration effect of abnormal prion protein by the oxide method. It is. 同酸化物法による異常型プリオン蛋白質の濃縮効果について、検体に対する尿の添加量の影響をリンタングステン酸法と比較して試験を行った結果の一例として、ウエスタンブロットの泳動像を示す図面代用写真である。As an example of the results of testing the concentration effect of abnormal prion protein by the same oxide method compared to the phosphotungstic acid method on the effect of the amount of urine added to the specimen, a photograph substituted for a Western blot image It is. 同酸化物法による異常型プリオン蛋白質の濃縮効果について、検体試料中の塩濃度の影響を確認する試験を行った結果の一例として、ウエスタンブロットの泳動像を示す図面代用写真である。It is a drawing substitute photograph which shows the migration image of a Western blot as an example of the result of having conducted the test which confirms the influence of the salt concentration in a test substance about the concentration effect of the abnormal prion protein by the oxide method. 同酸化物法による異常型プリオン蛋白質の濃縮効果について、検体に対する酸化物添加量の影響を確認する試験を行った結果の一例として、ウエスタンブロットの泳動像を示す図面代用写真である。It is a drawing substitute photograph which shows the migration image of a Western blot as an example of the result of having conducted the test which confirms the influence of the oxide addition amount with respect to the test substance about the concentration effect of the abnormal prion protein by the oxide method. 同酸化物法による異常型プリオン蛋白質の濃縮効果について、酸化物添加反応時の温度の影響を確認する試験を行った結果の一例として、ウエスタンブロットの泳動像を示す図面代用写真である。It is a drawing substitute photograph which shows the migration image of a Western blot as an example of the result of having done the test which confirms the influence of the temperature at the time of an oxide addition reaction about the concentration effect of the abnormal prion protein by the oxide method. 同酸化物法により酸化物上に濃縮されたプリオン蛋白質と酸化物との結合について、洗浄液の塩濃度の影響を確認する試験を行った結果の一例として、ウエスタンブロットの泳動像を示す図面代用写真である。As a result of a test to confirm the influence of the salt concentration of the washing solution on the binding between prion protein and oxide concentrated on the oxide by the same oxide method, a photograph substituted for a drawing showing a migration image of Western blot It is. 同酸化物法により酸化物上に濃縮されたプリオン蛋白質と酸化物との結合について、洗浄液のｐＨの影響を確認する試験を行った結果の一例として、ウエスタンブロットの泳動像を示す図面代用写真であり、ＡはｐＨ２〜５、８、１１、１２とした場合、ＢはｐＨ６〜１０とした場合を示す。As an example of the result of a test to confirm the effect of pH of the washing solution on the binding between the prion protein concentrated on the oxide by the oxide method and the oxide, a photograph substituted for a drawing showing a Western blot electrophoretic image is shown. Yes, when A is pH 2-5, 8, 11, 12 and B is when pH 6-10. 同酸化物法による異常型プリオン蛋白質の濃縮効果について、検体試料容量の影響を確認する試験を行った結果の一例として、ウエスタンブロットの泳動像を示す図面代用写真である。It is a drawing substitute photograph which shows the migration image of a Western blot as an example of the result of having conducted the test which confirms the influence of a sample sample volume about the concentration effect of the abnormal type prion protein by the oxide method. 同酸化物法により酸化物上に濃縮された異常型プリオン蛋白質の酸化物からの遊離溶出試験を行った結果の一例として、ウエスタンブロットの泳動像を示す図面代用写真である。It is a drawing substitute photograph which shows the migration image of a Western blot as an example of the result of having carried out the free elution test from the oxide of the abnormal prion protein concentrated on the oxide by the oxide method.

Claims (8)

体液及び／又は生体組織破壊物を含む液体状の検体をｐＨ５．５〜１０．５に調整し、ケイ素、アルミニウム、ジルコニウム、チタン、モリブデン、タングステンから選ばれる元素の酸化物、前記元素の二種以上よりなる複合酸化物、前記元素の一種以上と前記元素以外の一種以上の金属元素とよりなる複合酸化物、およびこれらの二種以上の組合わせ、から選ばれる酸化物を加え混合した後、前記酸化物が沈殿されて得られた沈殿物上に濃縮させることを特徴とする異常型プリオン蛋白質の濃縮方法。   A liquid specimen containing body fluid and / or biological tissue destructive material is adjusted to pH 5.5 to 10.5, and an oxide of an element selected from silicon, aluminum, zirconium, titanium, molybdenum and tungsten, and two kinds of the above elements After adding an oxide selected from a composite oxide comprising the above, a composite oxide comprising one or more of the above elements and one or more metal elements other than the above elements, and a combination of two or more thereof, and mixing, A method for concentrating abnormal prion protein, comprising concentrating on a precipitate obtained by precipitating the oxide. 前記検体に、異常型プリオン蛋白質を含まない尿を、尿の混合割合が２０〜９０％（容量）となるように加えることを特徴とする請求項１記載の異常型プリオン蛋白質の濃縮方法。   2. The method for concentrating abnormal prion protein according to claim 1, wherein urine containing no abnormal prion protein is added to the specimen so that the mixing ratio of urine is 20 to 90% (volume). 前記検体は、脳脊髄液、尿、血液から選ばれることを特徴とする請求項１又は２に記載の異常型プリオン蛋白質の濃縮方法。   The method for concentrating abnormal prion protein according to claim 1 or 2, wherein the specimen is selected from cerebrospinal fluid, urine, and blood. 前記検体は、前記ｐＨ範囲に調整される前に蛋白質分解されることを特徴とする請求項１乃至３のいずれかに記載の異常型プリオン蛋白質の濃縮方法。   4. The method for concentrating abnormal prion protein according to claim 1, wherein the specimen is proteolyzed before being adjusted to the pH range. 前記酸化物は、前記検体１ｍＬに対し０．５ｎｇ〜１０００ｍｇであることを特徴とする請求項１乃至４のいずれかに記載の異常型プリオン蛋白質の濃縮方法。   The method for concentrating abnormal prion protein according to any one of claims 1 to 4, wherein the oxide is 0.5 ng to 1000 mg per 1 mL of the specimen. 前記沈殿物は、前記酸化物が加え混合された後、遠心処理により分離されることを特徴とする請求項１乃至５のいずれかに記載の異常型プリオン蛋白質の濃縮方法。   The method for concentrating abnormal prion protein according to any one of claims 1 to 5, wherein the precipitate is separated by centrifugation after the oxide is added and mixed. 体液及び／又は生体組織破壊物を含む液体状の検体を、請求項１乃至６のいずれか１項に記載の異常型プリオン蛋白質の濃縮方法により得られた前記沈殿物が分離除去されることを特徴とする異常型プリオン蛋白質の除去方法。   A liquid specimen containing a bodily fluid and / or biological tissue destruction product is separated and removed from the precipitate obtained by the abnormal prion protein concentration method according to any one of claims 1 to 6. A method for removing abnormal prion protein. 前記酸化物はカラムに充填され、前記カラムの上から前記検体を含む溶液を流すことを特徴とする請求項７に記載の異常型プリオン蛋白質の除去方法。   The method for removing an abnormal prion protein according to claim 7, wherein the oxide is packed in a column, and a solution containing the specimen is allowed to flow over the column.
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Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2002538468A (en) * 1999-03-05 2002-11-12 ザ・レジェンツ・オブ・ザ・ユニバーシティー・オブ・カリフォルニア Blood serum samples prepared for prion and PrPSc isolation
JP2003121448A (en) * 2001-10-15 2003-04-23 National Agricultural Research Organization Detection method of abnormal prion protein
JP2005061833A (en) * 2003-08-08 2005-03-10 Canon Chemicals Inc Apparatus for inspecting abnormal prion protein
WO2005026197A1 (en) * 2003-09-10 2005-03-24 Bayer Healthcare, Llc Prion clearance using particulate metal oxides
JP2005300431A (en) * 2004-04-14 2005-10-27 Ns Tekku:Kk Separation/concentration/sample preparation method for prion protein
JP2006507484A (en) * 2002-09-27 2006-03-02 カプリオン ファーマシューティカルズ インコーポレーティッド PrPSc-interacting molecules and their uses

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2002538468A (en) * 1999-03-05 2002-11-12 ザ・レジェンツ・オブ・ザ・ユニバーシティー・オブ・カリフォルニア Blood serum samples prepared for prion and PrPSc isolation
JP2003121448A (en) * 2001-10-15 2003-04-23 National Agricultural Research Organization Detection method of abnormal prion protein
JP2006507484A (en) * 2002-09-27 2006-03-02 カプリオン ファーマシューティカルズ インコーポレーティッド PrPSc-interacting molecules and their uses
JP2005061833A (en) * 2003-08-08 2005-03-10 Canon Chemicals Inc Apparatus for inspecting abnormal prion protein
WO2005026197A1 (en) * 2003-09-10 2005-03-24 Bayer Healthcare, Llc Prion clearance using particulate metal oxides
JP2005300431A (en) * 2004-04-14 2005-10-27 Ns Tekku:Kk Separation/concentration/sample preparation method for prion protein

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