JP2003121448A - Detection method of abnormal prion protein - Google Patents

Abstract

PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a highly-sensitive and quantitative detection method and a detection means of a protein in a sample. SOLUTION: This detection method of an object protein in the sample is characterized by reacting the object protein to be detected with a univalent antibody to the object protein.

Description

【発明の詳細な説明】Detailed Description of the Invention

【０００１】[0001]

【発明の属する技術分野】本発明は、タンパク質の検出
方法及びその検出手段に関する。特に本発明は、異常プ
リオンタンパク質の検出方法及びその検出手段に関す
る。TECHNICAL FIELD The present invention relates to a method for detecting a protein and a means for detecting the protein. In particular, the present invention relates to a method for detecting abnormal prion protein and a detecting means therefor.

【０００２】[0002]

【従来の技術】牛海綿状脳症（狂牛病）やクロイツフェ
ルト・ヤコブ症（CJD）などの致死性の神経疾患（プリ
オン病）は、異常プリオンタンパク質（以下、異常プリ
オンという。）に起因すると考えられている。プリオン
とは、病気を伝播させるタンパク様感染性粒子であり、
正常プリオンタンパク質（PrP^C；以下、正常プリオンと
いう。）と異常プリオン（PrP^SC）が存在する。正常プ
リオンは通常、健康な個体の細胞質内に存在するが、こ
れが何らかの原因で異常プリオンとなり、この異常プリ
オンが脳に沈着することによりプリオン病が生じると考
えられている。プリオン病には、ヒトのクールー、CJ
D、ゲルストマン＝ストロイスラー＝シャインカー症候
群（GSS）、ならびにヒツジのスクレイピー、それがミ
ンク、ウシ及びネコに伝播した伝播性ミンク脳症、牛海
綿状脳症、猫海綿状脳症などが含まれる。感染性異常プ
リオンは、臓器移植等の外科手術、輸血や血液製剤の投
与、又は汚染食物の経口摂取などにより感染する。プリ
オン病に感染した宿主では、脳組織を中心に異常プリオ
ンがアミロイドとして沈着し、最終的に死に至る。プリ
オン病の有効な予防法及び治療法は現状では存在せず、
唯一の対策としては、医薬品や食品等への感染性プリオ
ンの混入を防止することである。BACKGROUND OF THE INVENTION Fatal neurological diseases (prion diseases) such as bovine spongiform encephalopathy (mad cow disease) and Creutzfeldt-Jakob disease (CJD) are attributed to abnormal prion proteins (hereinafter referred to as abnormal prions). It is considered. Prions are proteinaceous infectious particles that spread disease,
There are normal prion protein (PrP ^C ; hereinafter referred to as normal prion) and abnormal prion (PrP ^SC ). Normal prions are usually present in the cytoplasm of healthy individuals, but for some reason, they become abnormal prions, and it is thought that the deposition of these abnormal prions in the brain causes prion disease. For prion disease, human kuru, CJ
D, Gerstmann-Stroisler-Scheinker syndrome (GSS), and sheep scrapie, transmitted mink encephalopathy transmitted to mink, cattle and cats, bovine spongiform encephalopathy, cat spongiform encephalopathy and the like. The infectious abnormal prion is infected by surgery such as organ transplantation, blood transfusion, administration of blood products, or oral intake of contaminated food. In a host infected with prion disease, abnormal prions are deposited as amyloid mainly in brain tissue and eventually die. Currently, there is no effective prevention and treatment for prion disease,
The only countermeasure is to prevent the infectious prion from being mixed into medicines and foods.

【０００３】異常プリオンの検出には、現在、ウエスタ
ンブロッティング法やELISA法、イムノPCR法、キャピラ
リー電気泳動法等が用いられているが、検出感度はng〜
pgオーダーであるため十分とは言えず、迅速性や再現性
にも問題がある。このような抗原抗体反応を利用する方
法においては、従来の抗体では極微量のプリオンを定量
的に検出することはできない。従って、感染動物の早期
診断や医薬品・食品等の安全性確保の観点から、サンプ
ル中の異常プリオンを高感度かつ定量的に検出する方法
が望まれていた。Western blotting method, ELISA method, immuno PCR method, capillary electrophoresis method and the like are currently used for detecting abnormal prions, but the detection sensitivity is ng-
Since it is in the pg order, it cannot be said to be sufficient, and there are problems in speed and reproducibility. In a method utilizing such an antigen-antibody reaction, a conventional antibody cannot quantitatively detect a very small amount of prion. Therefore, from the viewpoint of early diagnosis of infected animals and ensuring of safety of medicines, foods, etc., a method for highly sensitive and quantitative detection of abnormal prions in a sample has been desired.

【０００４】[0004]

【発明が解決しようとする課題】本発明は、サンプル中
のタンパク質、特に異常プリオンタンパク質を高感度か
つ定量的に検出する方法及び検出手段を提供することを
目的とする。SUMMARY OF THE INVENTION It is an object of the present invention to provide a method and a detection means for detecting a protein in a sample, particularly an abnormal prion protein, with high sensitivity and quantitatively.

【０００５】[0005]

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記課題
を解決するため、従来のプリオン検出方法に用いられて
いた抗体の欠点を明らかにし、その欠点を改善するため
鋭意研究を重ねた結果、プリオンに対する一価抗体との
反応を利用することによってサンプル中の異常プリオン
を高感度かつ定量的に検出できることを見出し、本発明
を完成した。[Means for Solving the Problems] In order to solve the above problems, the present inventors clarified the drawbacks of antibodies used in conventional prion detection methods, and conducted extensive studies to improve the drawbacks. As a result, they have found that abnormal prion in a sample can be detected with high sensitivity and quantitatively by utilizing the reaction with a monovalent antibody against prion, and completed the present invention.

【０００６】また本発明者らは、上記の一価抗体との反
応を利用する検出方法の原理を種々のタンパク質検出方
法に応用することによって、タンパク質を高感度かつ定
量的に検出できることを見出した。すなわち、本発明
は、検出の目的タンパク質と、該目的タンパク質に対す
る一価抗体とを反応させることを特徴とする、サンプル
中の該目的タンパク質の検出方法である。ここで、目的
タンパク質としては、ホルモン、サイトカイン、ウイル
ス抗原等が挙げられる。また、一価抗体はFabフラグメ
ント、Fab'フラグメント又はFvフラグメントでありう
る。The present inventors have also found that a protein can be detected with high sensitivity and quantitatively by applying the principle of the detection method utilizing the reaction with a monovalent antibody to various protein detection methods. . That is, the present invention is a method for detecting a target protein in a sample, which comprises reacting the target protein for detection with a monovalent antibody against the target protein. Here, examples of the target protein include hormones, cytokines, virus antigens, and the like. Also, the monovalent antibody can be a Fab fragment, Fab 'fragment or Fv fragment.

【０００７】さらに上記方法において、目的タンパク質
はプリオンタンパク質でありうる。また、目的タンパク
質が異常プリオンタンパク質である場合には、一価抗体
と反応させる前にサンプルをプロテイナーゼKで処理す
る必要がある。Further, in the above method, the protein of interest may be a prion protein. Further, when the target protein is an abnormal prion protein, it is necessary to treat the sample with proteinase K before reacting with the monovalent antibody.

【０００８】また上記プリオンタンパク質は、哺乳動物
に由来するものでありうる。例えば、ヒツジ、ウシ、ヒ
ト、ヤギ、マウス、ハムスター等に由来するものが挙げ
られる。サンプルとしては、体液、医薬品又は食品など
を対象とすることができる。検出は、抗原抗体反応を検
出しうる任意の方法により行いうるが、フローサイトメ
トリーで行うことが好ましい。The prion protein may be of mammalian origin. Examples thereof include those derived from sheep, cows, humans, goats, mice, hamsters and the like. The sample may be a body fluid, a drug, a food, or the like. The detection can be performed by any method capable of detecting an antigen-antibody reaction, but is preferably performed by flow cytometry.

【０００９】また本発明は、プリオンタンパク質に対す
る一価抗体である。ここで、プリオンタンパク質及び一
価抗体は上記と同様である。さらに本発明は、上記一価
抗体を含むことを特徴とする試薬キットである。該試薬
キットはさらにプロテイナーゼK及び／又はプリオンペ
プチド固相化ビーズを含んでもよい。The present invention is also a monovalent antibody against prion protein. Here, the prion protein and the monovalent antibody are the same as above. Furthermore, the present invention is a reagent kit comprising the above monovalent antibody. The reagent kit may further contain proteinase K and / or prion peptide-immobilized beads.

【００１０】[0010]

【発明の実施の形態】以下、本発明を詳細に説明する。BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION The present invention will be described in detail below.

【００１１】本発明者らは、従来のプリオン検出方法の
欠点が、抗原結合部位が２カ所存在する抗体を用いるこ
とであり、そのため、プリオン検出の際にプリオン２分
子又は１分子のみと反応した２種類の抗体が混在して生
成され、これにより極微量のプリオンを正確に検出する
ことができないと考え、この欠点を改善するため研究を
重ねた結果、本発明は完成された。The present inventors have found that a drawback of the conventional prion detection method is that an antibody having two antigen-binding sites is used. Therefore, the prion detection reaction with only two or one prion molecule has occurred. The present invention has been completed as a result of repeated studies to improve this defect, because it is thought that two kinds of antibodies are produced in a mixed manner, and thus it is impossible to accurately detect a very small amount of prion.

【００１２】従って、本発明のプリオン検出方法は、異
常プリオンと、プリオンに対する一価抗体とを反応させ
ることを特徴とするものである。一価抗体であるFabフ
ラグメント、Fab'フラグメント及びFvフラグメント等は
抗原結合部位が１カ所であるため、このような抗プリオ
ン一価抗体との反応を利用すると、従来の方法よりも数
十倍〜数万倍の感度で定量的にプリオンを検出すること
ができる。また、本発明の方法は、プリオンに限らず、
その他あらゆるタンパク質の検出・定量に応用すること
ができる。以下、本発明の概要を説明する。Therefore, the prion detection method of the present invention is characterized by reacting an abnormal prion with a monovalent antibody against the prion. Since Fab fragments, Fab 'fragments, Fv fragments, and the like, which are monovalent antibodies, have only one antigen-binding site, using such a reaction with an anti-prion monovalent antibody results in several tens of times more than conventional methods. It is possible to detect prion quantitatively with a sensitivity of tens of thousands of times. Further, the method of the present invention is not limited to prions,
It can be applied to the detection and quantification of all other proteins. The outline of the present invention will be described below.

【００１３】１．一価抗体の作製 本発明の検出方法では、まず一価抗体を調製する。「一
価抗体」とは、１分子当たり１個の抗原結合部位しかも
たない抗体であり、例えば、Fabフラグメント、Fab'フ
ラグメント、Fvフラグメント等がある。1. Preparation of Monovalent Antibody In the detection method of the present invention, a monovalent antibody is first prepared. The “monovalent antibody” is an antibody having only one antigen-binding site per molecule, and examples thereof include Fab fragment, Fab ′ fragment and Fv fragment.

【００１４】(i) 抗原の調製 本発明の一価抗体を作製するために、まず抗原を調製す
る。本発明では、検出及び定量が望まれるタンパク質
（以下、目的タンパク質という。）を抗原として使用し
うる。目的タンパク質としては、限定するものではない
が、ホルモン、サイトカイン、ウイルス抗原等を例示す
ることができる。具体的には、インシュリン、成長ホル
モン、インターロイキン、インターフェロン、HIV env
タンパク質等が挙げられる。特に、高感度の検出が望ま
れている異常プリオンが好ましい。(I) Preparation of Antigen To prepare the monovalent antibody of the present invention, the antigen is first prepared. In the present invention, a protein whose detection and quantification are desired (hereinafter referred to as target protein) can be used as an antigen. Examples of the target protein include, but are not limited to, hormones, cytokines, virus antigens and the like. Specifically, insulin, growth hormone, interleukins, interferons, HIV env
Protein etc. are mentioned. In particular, abnormal prions for which highly sensitive detection is desired are preferable.

【００１５】上述した目的タンパク質は、当技術分野で
公知の手法を用いて供与源から単離・精製して調製する
ことができるし、あるいは、当該タンパク質のアミノ酸
配列が公知であれば、遺伝子工学的手法により微生物で
産生させて精製して調製してもよい。The above-mentioned target protein can be prepared by isolation and purification from a source using a method known in the art, or if the amino acid sequence of the protein is known, it can be genetically engineered. It may be produced by a microorganism by a specific method and then purified and prepared.

【００１６】本発明により検出することが好ましいプリ
オンは、正常プリオンと異常プリオンとの間でアミノ酸
配列に違いはないため、哺乳動物に常在する正常プリオ
ンのアミノ酸配列を利用して抗原を調製することができ
る。正常プリオンをコードするプリオン遺伝子は、ヒ
ト、ヒツジ、ヤギ、ウシ、マウス、ハムスターなど多く
の動物種で同定されており、そのアミノ酸配列は90％以
上の相同性を示し、高度に保存されていることが知られ
ている。Since the prion which is preferably detected according to the present invention has no difference in amino acid sequence between normal prion and abnormal prion, an antigen is prepared using the amino acid sequence of normal prion resident in mammals. be able to. The prion gene encoding a normal prion has been identified in many animal species such as human, sheep, goat, cow, mouse and hamster, and its amino acid sequence shows 90% or more homology and is highly conserved. It is known.

【００１７】本発明で使用しうるプリオンのアミノ酸配
列は、DDBJ/EMBL/GenBank nucleotide sequence databa
sesより、例えばヒツジプリオンのアミノ酸配列（Acces
sionnumber U67922）が入手可能であるが、プリオンの
アミノ酸配列であれば特に限定されない。なお、本発明
においては、精製されたタンパク質全体のみならず、そ
の部分断片も使用することができる。「部分断片」とい
う用語は、目的タンパク質のアミノ酸配列を含む限り、
特に長さに関係なく使用する。The amino acid sequence of prion that can be used in the present invention is DDBJ / EMBL / GenBank nucleotide sequence databa
ses, for example, the amino acid sequence of sheep prion (Acces
sionnumber U67922) is available, but is not particularly limited as long as it is the amino acid sequence of prion. In the present invention, not only the whole purified protein but also a partial fragment thereof can be used. The term "partial fragment" includes, as long as it includes the amino acid sequence of the target protein,
Use regardless of length.

【００１８】部分断片は、ペプチド断片として通常のペ
プチド合成等により調製することができる。ペプチドの
化学合成は常法手段を採用することができる。例えば、
アジド法、酸クロライド法、酸無水物法、混合酸無水物
法、DCC 法、活性エステル法、カルボイミダゾール法、
酸化還元法等が挙げられる。また、その合成は、固相合
成法及び液相合成法のいずれでもよい。なお、本発明に
おいては、市販の自動ペプチド合成装置（例えば島津製
作所社の自動ペプチド合成装置PSSM-8）を使用して合成
することもできる。The partial fragment can be prepared as a peptide fragment by ordinary peptide synthesis or the like. For chemical synthesis of peptides, conventional methods can be adopted. For example,
Azide method, acid chloride method, acid anhydride method, mixed acid anhydride method, DCC method, active ester method, carboimidazole method,
A redox method and the like can be mentioned. In addition, the synthesis may be either a solid phase synthesis method or a liquid phase synthesis method. In the present invention, a commercially available automatic peptide synthesizer (for example, an automatic peptide synthesizer PSSM-8 manufactured by Shimadzu Corporation) can also be used for the synthesis.

【００１９】本発明で使用するのに適したペプチド断片
は、配列番号１に示すアミノ酸配列又はその部分断片を
有するものが挙げられるが、これに限定されるものでは
ない。ペプチド部位は、例えば、タンパク質の表層にあ
ること、αへリックス構造をとらないこと、リピート配
列等の単純な配列を含まないこと、などを考慮して決定
しうる。また、免疫に用いるペプチド配列は、哺乳動物
間で非常に類似している可能性があるため、KLH、BSA等
の当技術分野で公知のキャリアタンパク質と該ペプチド
配列とを結合することにより免疫原性を高めて免疫を行
うことが好ましい。Peptide fragments suitable for use in the present invention include, but are not limited to, those having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 or a partial fragment thereof. The peptide portion can be determined in consideration of, for example, that it is on the surface layer of the protein, that it does not have an α-helix structure, and that it does not contain a simple sequence such as a repeat sequence. In addition, since the peptide sequence used for immunization may be very similar between mammals, the immunogen can be obtained by combining the peptide sequence with a carrier protein known in the art such as KLH and BSA. It is preferable to immunize with increased sex.

【００２０】(ii) 抗体の作製 本発明において「抗体」とは、抗原である目的タンパク
質又はその部分断片に結合し得る抗体分子を意味し、ポ
リクローナル抗体であってもモノクローナル抗体であっ
てもよい。本発明において、抗体（ポリクローナル抗体
及びモノクローナル抗体）は例えば以下の手法により製
造することができる。(Ii) Preparation of antibody In the present invention, "antibody" means an antibody molecule capable of binding to a target protein as an antigen or a partial fragment thereof, and may be a polyclonal antibody or a monoclonal antibody. . In the present invention, the antibody (polyclonal antibody and monoclonal antibody) can be produced, for example, by the following method.

【００２１】(iia) モノクローナル抗体 前記のようにして作製したタンパク質又はその断片を抗
原として、哺乳動物、例えばラット、マウス、ウサギな
どに投与する。必要に応じてフロイント完全アジュバン
ト(FCA)、フロイント不完全アジュバント(FIA)等のアジ
ュバントを用いることもできる。免疫は、主として静脈
内、皮下、腹腔内に注入することにより行われる。ま
た、免疫の間隔は特に限定されず、数日から数週間間隔
で、１〜10回の免疫を行う。そして、最終の免疫日から
１〜60日後に抗体産生細胞を採集する。抗体産生細胞と
しては、脾臓細胞、リンパ節細胞、末梢血細胞等が挙げ
られる。(Iia) Monoclonal antibody The protein or fragment thereof produced as described above is administered as an antigen to mammals such as rats, mice and rabbits. If necessary, an adjuvant such as Freund's complete adjuvant (FCA) or Freund's incomplete adjuvant (FIA) can be used. Immunization is mainly performed by injecting intravenously, subcutaneously, or intraperitoneally. The interval of immunization is not particularly limited, and immunization is performed 1 to 10 times at intervals of several days to several weeks. Then, antibody-producing cells are collected 1 to 60 days after the final immunization day. Examples of antibody-producing cells include spleen cells, lymph node cells, peripheral blood cells and the like.

【００２２】ハイブリドーマを得るため、抗体産生細胞
とミエローマ細胞との細胞融合を行う。抗体産生細胞と
融合させるミエローマ細胞として、一般に入手可能な株
化細胞を使用することができる。使用する細胞株として
は、薬剤選択性を有し、未融合の状態ではHAT選択培地
(ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジンを含む)で
生存できず、抗体産生細胞と融合した状態でのみ生存で
きる性質を有するものが好ましい。ミエローマ細胞とし
ては、例えば P3X63-Ag.8.U1(P3U1)、NS-Iなどのマウス
ミエローマ細胞株が挙げられる。To obtain a hybridoma, cell fusion between antibody-producing cells and myeloma cells is performed. As the myeloma cells to be fused with the antibody-producing cells, commonly available cell lines can be used. The cell line to be used has drug selectivity and HAT selection medium in the unfused state
Those having a property of not being able to survive (including hypoxanthine, aminopterin and thymidine) and being able to survive only in a state of being fused with antibody-producing cells are preferable. Examples of myeloma cells include mouse myeloma cell lines such as P3X63-Ag.8.U1 (P3U1) and NS-I.

【００２３】次に、上記ミエローマ細胞と抗体産生細胞
とを細胞融合させる。細胞融合は、血清を含まないDME
M、RPMI-1640培地などの動物細胞培養用培地中で、抗体
産生細胞とミエローマ細胞とを混合し（抗体産生細胞と
ミエローマ細胞との細胞比5:1が好ましい）、細胞融合
促進剤（例えばポリエチレングリコール等）の存在のも
とで融合反応を行う。また、エレクトロポレーションを
利用した市販の細胞融合装置を用いて細胞融合させるこ
ともできる。Next, the myeloma cells and the antibody-producing cells are fused. Cell fusion is serum-free DME
M, a mixture of antibody-producing cells and myeloma cells in a medium for animal cell culture such as RPMI-1640 medium (cell ratio of antibody-producing cells and myeloma cells is preferably 5: 1), cell fusion promoter (eg The fusion reaction is performed in the presence of (polyethylene glycol, etc.). Alternatively, cell fusion can be performed using a commercially available cell fusion device utilizing electroporation.

【００２４】細胞融合処理後の細胞から目的とするハイ
ブリドーマを選別する。例えば、細胞懸濁液をウシ胎児
血清含有RPMI-1640培地などで適当に希釈後、マイクロ
タイタープレート上にまく。各ウエルに選択培地を加
え、以後適当に選択培地を交換して培養を行う。その結
果、選択培地で培養開始後、14日前後から生育してくる
細胞をハイブリドーマとして得ることができる。The target hybridoma is selected from the cells after the cell fusion treatment. For example, the cell suspension is appropriately diluted with RPMI-1640 medium containing fetal bovine serum and then plated on a microtiter plate. A selective medium is added to each well, and then the selective medium is appropriately exchanged for culturing. As a result, cells that start to grow about 14 days after the start of culture in the selective medium can be obtained as hybridomas.

【００２５】次に、増殖してきたハイブリドーマの培養
上清中に、目的タンパク質に反応する抗体が存在するか
否かをスクリーニングする。ハイブリドーマのスクリー
ニングは、通常の方法に従えばよく、例えば酵素免疫測
定法、放射性免疫測定法等を採用することができる。
融合細胞のクローニングは、限界希釈法等により行い、
目的のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを
樹立する。Next, it is screened whether or not the antibody that reacts with the target protein is present in the culture supernatant of the grown hybridoma. The screening of hybridomas may be carried out according to a usual method, and for example, an enzyme immunoassay method, a radioimmunoassay method or the like can be adopted.
Cloning of the fused cells is performed by the limiting dilution method,
A hybridoma that produces the desired monoclonal antibody is established.

【００２６】樹立したハイブリドーマからモノクローナ
ル抗体を採取する方法として、通常の細胞培養法又は腹
水形成法等を採用することができる。上記抗体の採取方
法において抗体の精製が必要とされる場合は、硫安塩析
法、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過、アフィ
ニティークロマトグラフィーなどの公知の方法を適宜選
択して、又はこれらを組み合わせることにより精製する
ことができる。As a method for collecting a monoclonal antibody from the established hybridoma, an ordinary cell culture method, ascites formation method or the like can be adopted. When purification of the antibody is required in the above antibody collection method, known methods such as ammonium sulfate salting-out method, ion exchange chromatography, gel filtration, affinity chromatography are appropriately selected, or a combination thereof is used. It can be purified.

【００２７】(iib) ポリクローナル抗体の作製 ポリクローナル抗体を作製する場合は、前記と同様に動
物を免疫し、最終の免疫日から６〜60日後に、酵素免疫
測定法(ELISA(enzume-linked immunosorbent assy)又は
EIA(enzyme immunoassay))、放射性免疫測定法(RIA；r
adioimmuno assay)等で抗体価を測定し、最大の抗体価
を示した日に採血し、抗血清を得る。その後は、抗血清
中のポリクローナル抗体の反応性をELISA法などで測定
する。(Iib) Preparation of Polyclonal Antibody When preparing a polyclonal antibody, an animal is immunized in the same manner as described above, and 6 to 60 days after the final immunization day, an enzyme immunoassay (ELISA (enzume-linked immunosorbent assy) is performed. ) Or
EIA (enzyme immunoassay)), radioimmunoassay (RIA; r
The antibody titer is measured by adioimmuno assay) or the like, and blood is collected on the day when the maximum antibody titer is shown, to obtain antiserum. After that, the reactivity of the polyclonal antibody in the antiserum is measured by the ELISA method or the like.

【００２８】(iii) 一価抗体の作製 本発明の一価抗体は、上述のようにして得られた抗体を
プロテアーゼで処理することにより得ることができる。
本発明において使用しうる一価抗体としては、Fabフラ
グメント、Fab'フラグメント及びFvフラグメントが挙げ
られる。(Iii) Preparation of monovalent antibody The monovalent antibody of the present invention can be obtained by treating the antibody obtained as described above with a protease.
Monovalent antibodies that can be used in the present invention include Fab fragments, Fab 'fragments and Fv fragments.

【００２９】Fabフラグメントは、上記抗体をパパイン
で処理することにより得ることができる。またFab'フラ
グメントは、上記抗体をペプシン消化して生じるF(ab')
₂フラグメントを2-メルカプトエタノールなどの試薬を
用いて還元し、続いてモノヨード酢酸を用いてアルキル
化することにより得ることができる。あるいは、これら
の一価抗体をコードする遺伝子を構築し、これを発現ベ
クターに導入した後、適当な宿主細胞で発現させること
により一価抗体を得てもよい。同様に、Fvフラグメント
は、抗体可変領域であるV_HとV_Lのみをコードする遺伝子
をリンカーペプチドをコードする塩基配列で連結した融
合遺伝子を作製し、これを発現ベクターに導入した後、
適当な宿主細胞で発現させることにより得ることができ
る。The Fab fragment can be obtained by treating the above antibody with papain. In addition, Fab 'fragment is F (ab') generated by digesting the above antibody with pepsin.
_{The 2} fragment can be obtained by reduction with a reagent such as 2-mercaptoethanol, followed by alkylation with monoiodoacetic acid. Alternatively, a monovalent antibody may be obtained by constructing a gene encoding these monovalent antibodies, introducing the gene into an expression vector, and then expressing the gene in an appropriate host cell. Similarly, the Fv fragment is a fusion gene in which a gene encoding only the antibody variable region V _H and V _L is linked with a nucleotide sequence encoding a linker peptide, and after introducing this into an expression vector,
It can be obtained by expressing in a suitable host cell.

【００３０】２．タンパク質の検出 本発明では、上記のようにして作製された一価抗体と目
的タンパク質とを反応させ、得られる反応産物から該目
的タンパク質を定量的に検出する。本発明で対象とする
サンプルとしては、検出が望まれる目的タンパク質を含
有する可能性があるものなら特に限定されない。異常プ
リオンの検出では、異常プリオンが混入している可能性
のある体液、医薬品、食品などが検出の対象となる。例
えば、プリオン病感染が疑われるか又はプリオン病への
非感染を証明しようとする家畜の組織、及び血液、血
清、血漿、乳汁等の体液；肉骨粉等の家畜飼料に用いら
れる材料；家畜等で産生された物質を使用した医薬品及
び食品などを例示することができる。2. Detection of Protein In the present invention, the monovalent antibody prepared as described above is reacted with the target protein, and the target protein is quantitatively detected from the resulting reaction product. The sample targeted by the present invention is not particularly limited as long as it may contain the target protein whose detection is desired. In the detection of abnormal prions, body fluids, pharmaceuticals, foods, etc. that may contain abnormal prions are the targets of detection. For example, tissues of livestock suspected of being infected with prion disease or trying to prove non-infection with prion disease, and body fluids such as blood, serum, plasma, milk; materials used for livestock feed such as meat and bone meal; livestock, etc. Pharmaceuticals and foods using the substance produced in 1. can be exemplified.

【００３１】異常プリオンの検出では、上述したよう
に、正常プリオンと異常プリオンとの間のアミノ酸配列
に違いがないため、上記一価抗体は正常及び異常プリオ
ンの両者を認識することに注意する。本発明の検出方法
では、異常プリオンの検出を目的とするため、プロテイ
ナーゼKに対する耐性を有する異常プリオンの性質を利
用する。従って、プロテイナーゼKを用いてサンプルを
処理する。その結果、正常プリオンは分解され、異常プ
リオンが存在する場合には、異常プリオンのみがサンプ
ル中に存在することになる。プロテイナーゼKによる処
理は、例えば、プロテイナーゼKを終濃度が25μg/mlと
なるようにサンプルに添加し、37℃にて60分間インキュ
ベートする。It should be noted that in the detection of abnormal prions, the above-mentioned monovalent antibody recognizes both normal and abnormal prions because there is no difference in the amino acid sequence between normal prion and abnormal prion as described above. Since the detection method of the present invention is intended to detect abnormal prions, the property of abnormal prions having resistance to proteinase K is used. Therefore, the sample is treated with proteinase K. As a result, normal prions are degraded and, if abnormal prions are present, only abnormal prions are present in the sample. For the treatment with proteinase K, for example, proteinase K is added to the sample so that the final concentration is 25 μg / ml, and the mixture is incubated at 37 ° C. for 60 minutes.

【００３２】本発明の検出方法は、一価抗体とサンプル
中の目的タンパク質との抗原抗体反応を利用するもので
あり、抗原抗体反応を検出することができる免疫学的手
法を用いてサンプル中の目的タンパク質を検出すること
ができる。抗原抗体反応を検出することができる手法と
しては、限定するものではないが、フローサイトメトリ
ーを利用する方法、免疫電気泳動法、免疫蛍光法、ラジ
オイムノアッセイ、エンザイムイムノアッセイなどが挙
げられる。本発明では、フローサイトメトリーを利用す
る方法が好ましい。The detection method of the present invention utilizes an antigen-antibody reaction between a monovalent antibody and a target protein in a sample, and an immunological method capable of detecting the antigen-antibody reaction is used to detect the antigen-antibody reaction in the sample. The target protein can be detected. Techniques that can detect the antigen-antibody reaction include, but are not limited to, methods utilizing flow cytometry, immunoelectrophoresis, immunofluorescence, radioimmunoassay, enzyme immunoassay, and the like. In the present invention, a method utilizing flow cytometry is preferable.

【００３３】フローサイトメトリーは、粒子懸濁液を高
速で細管中に流し、浮遊している粒子を１個ずつ分別
し、各粒子にレーザー光を照射して、レーザー光の粒子
による散乱や、レーザー光によって励起される粒子の蛍
光発光などを検出・測定する分析方法である。In the flow cytometry, a particle suspension is flown at high speed through a thin tube to separate suspended particles one by one, and each particle is irradiated with a laser beam to scatter the laser beam by the particle or This is an analysis method for detecting and measuring fluorescence emission of particles excited by laser light.

【００３４】本発明のフローサイトメトリーを利用する
検出方法は次のようにして行う： (1) サンプルと一価抗体とを反応させる。これによりサ
ンプル中に含まれる目的タンパク質（抗原）の量と相関
して一価抗体が消費される。 (2) ペプチド固相化ビーズを加える。これにより未反応
の一価抗体とビーズとが結合する。 (3) ビーズを洗浄する。未反応の一価抗体と結合したビ
ーズ及び未結合ビーズが残る。 (4) 蛍光標識２次抗体を加える。この蛍光標識２次抗体
は未反応の一価抗体と反応し、未反応一価抗体と結合し
たビーズが蛍光標識される。 (5) 蛍光標識されたビーズをフローサイトメトリーによ
り検出する。 (6) 添加した一価抗体量と検出された蛍光量から、間接
的にサンプル中の目的タンパク質量を推定する。The detection method using flow cytometry of the present invention is carried out as follows: (1) A sample is reacted with a monovalent antibody. As a result, the monovalent antibody is consumed in correlation with the amount of the target protein (antigen) contained in the sample. (2) Add peptide-immobilized beads. As a result, the unreacted monovalent antibody binds to the beads. (3) Wash the beads. Beads that have bound unreacted monovalent antibody and unbound beads remain. (4) Add a fluorescently labeled secondary antibody. The fluorescently labeled secondary antibody reacts with the unreacted monovalent antibody, and the beads bound to the unreacted monovalent antibody are fluorescently labeled. (5) Fluorescently labeled beads are detected by flow cytometry. (6) The amount of the target protein in the sample is indirectly estimated from the amount of added monovalent antibody and the detected amount of fluorescence.

【００３５】上記の工程(1)においては、サンプルと一
価抗体とを反応させるが、サンプル中に存在しうる目的
タンパク質に対し、過剰の一価抗体を添加する必要があ
る。サンプルと一価抗体の量は、当業者であれば容易に
決定することができるが、抗体量が多すぎると感度が低
くなり、少なすぎると検出が困難になるため、陽性反応
を明確に識別しうる（平均蛍光強度100程度）必要最少
量の抗体量を予め調べておく必要がある。In the above step (1), the sample is reacted with the monovalent antibody, but it is necessary to add an excess of the monovalent antibody to the target protein which may be present in the sample. The amount of the sample and the monovalent antibody can be easily determined by those skilled in the art, but if the amount of the antibody is too large, the sensitivity becomes low, and if it is too small, the detection becomes difficult. It is necessary to investigate beforehand the minimum amount of antibody that can be used (mean fluorescence intensity of about 100).

【００３６】工程(2)に記載されている「ペプチド固相
化ビーズ」とは、未反応の一価抗体と反応させるために
添加するものであって、固相化するペプチドは検出目的
のタンパク質の断片でありうる。例えばプリオンに対す
る一価抗体と反応させる場合には、プリオンペプチドを
固相化する。ビーズとしては、フローサイトメトリーに
適した当技術分野で公知のあらゆる粒子を用いることが
でき、例えば、ラテックスビーズ、ポリスチレンビーズ
等が挙げられるが、特にラテックスビーズが好ましい。
ペプチドをビーズに固相化する方法は、当技術分野で公
知である。ペプチド固相化ビーズの添加量は、約５×10
⁴個／サンプル、すなわち、フローサイトメトリーにお
いて10⁴個のビーズを測定するのに十分な量である。The "peptide-immobilized beads" described in the step (2) are added in order to react with unreacted monovalent antibody, and the immobilized peptide is a protein to be detected. Can be a fragment of For example, when reacting with a monovalent antibody against prion, the prion peptide is immobilized. As the beads, all particles known in the art suitable for flow cytometry can be used, and examples thereof include latex beads, polystyrene beads and the like, and latex beads are particularly preferable.
Methods for immobilizing peptides on beads are known in the art. The amount of peptide-immobilized beads added is approximately 5 x 10
⁴ / sample, i.e., an amount sufficient to measure the 10 ⁴ beads in flow cytometry.

【００３７】工程(3)においては、当業者に公知の手法
によりビーズを洗浄する。例えば、プリオン検出におい
てラテックスビーズを用いる場合には、2000g、室温に
て30秒間遠心分離して洗浄する。In step (3), the beads are washed by a method known to those skilled in the art. For example, when latex beads are used for prion detection, centrifugation is performed at 2000 g and room temperature for 30 seconds for washing.

【００３８】工程(4)において加える蛍光標識２次抗体
は、工程(3)の洗浄後に残っている、未反応一価抗体が
結合したビーズと未結合ビーズのうち、未反応一価抗体
と反応する。すなわち、未反応一価抗体が結合したビー
ズを蛍光標識する。蛍光標識２次抗体は、未反応一価抗
体と反応するものであり、未反応一価抗体がウサギにお
いて生成されたものであれば、２次抗体は抗ウサギ抗体
である。使用しうる蛍光標識としては、限定するもので
はないが、フルオレセインイソチオシアネート（FIT
C）、フィコエリスリン（PE）、フィコエリスリン−シ
アニン5（PE-Cy5）等が挙げられる。また、２次抗体を
直接標識するだけではなく、間接的に２次抗体を標識し
てもよい。例えば、ビオチン標識２次抗体に対し、蛍光
標識したストレプトアビジンを結合させることにより２
次抗体を間接的に蛍光標識することもできる。The fluorescence-labeled secondary antibody added in step (4) reacts with the unreacted monovalent antibody among the unreacted monovalent antibody-bound beads and unbound beads remaining after the washing in step (3). To do. That is, the beads to which the unreacted monovalent antibody is bound are fluorescently labeled. The fluorescently labeled secondary antibody reacts with the unreacted monovalent antibody, and if the unreacted monovalent antibody is produced in rabbit, the secondary antibody is an anti-rabbit antibody. Fluorescent labels that can be used include, but are not limited to, fluorescein isothiocyanate (FIT
C), phycoerythrin (PE), phycoerythrin-cyanine 5 (PE-Cy5) and the like. In addition to directly labeling the secondary antibody, the secondary antibody may be indirectly labeled. For example, by binding a fluorescently labeled streptavidin to a biotin-labeled secondary antibody, 2
The secondary antibody can also be indirectly fluorescently labeled.

【００３９】工程(5)において、フローサイトメーター
により、上述のように蛍光標識したビーズを検出する。
検出は、例えば、EPICS Elite XLフローサイトメーター
により、FS=300V, 2.0 Gain、SS=260V, 2.0 Gain、FL2=
930V, 1.0 GainのDetector感度設定で行うことができ
る。In step (5), the beads labeled with fluorescence as described above are detected by a flow cytometer.
Detection is, for example, EPICS Elite XL flow cytometer, FS = 300V, 2.0 Gain, SS = 260V, 2.0 Gain, FL2 =
This can be done with the Detector sensitivity setting of 930V, 1.0 Gain.

【００４０】最後に、工程(6)において、工程(5)で測定
された蛍光量からサンプル中の目的タンパク質量を算出
する。予め既知濃度のタンパク質を含有するサンプルを
用いて検量線を作成しておくことが望ましい。Finally, in step (6), the amount of the target protein in the sample is calculated from the fluorescence amount measured in step (5). It is desirable to prepare a calibration curve using a sample containing a known concentration of protein in advance.

【００４１】以上のようにして、サンプル中のタンパク
質量を定量的に求めることができる。本発明によると、
極微量のタンパク質であっても検出することができる。
図１に、IgG抗体又は一価抗体とタンパク質抗原分子と
の結合反応を模式化して示す。IgG抗体は抗原結合部位
を２カ所有するため、極微量の抗原分子存在下では、抗
原２分子と結合した抗体、抗原１分子とのみ反応した抗
体、又はこれら両抗体が混在して存在し得るため、抗原
量と結合抗体量は必ずしも比例しない。この２価抗体の
特性が微量タンパク質検出の障害になっていると考えら
れる。一方、本発明の一価抗体は抗体１分子につき１個
の結合部位しかないため、抗原分子量と結合抗体量は比
例する。従って、本発明の検出方法では、サンプル中の
極微量のタンパク質を高感度かつ定量的に検出すること
ができる。As described above, the amount of protein in the sample can be quantitatively determined. According to the invention,
Even a trace amount of protein can be detected.
FIG. 1 schematically shows the binding reaction between an IgG antibody or monovalent antibody and a protein antigen molecule. Since an IgG antibody has two antigen-binding sites, in the presence of a very small amount of antigen molecules, an antibody that binds to two molecules of antigen, an antibody that reacts only with one molecule of antigen, or both of these antibodies may coexist. The amount of antigen and the amount of bound antibody are not necessarily proportional. It is considered that the property of this bivalent antibody is an obstacle to detection of a trace amount of protein. On the other hand, since the monovalent antibody of the present invention has only one binding site per antibody molecule, the amount of the antigen molecule is proportional to the amount of the bound antibody. Therefore, the detection method of the present invention can detect an extremely small amount of protein in a sample with high sensitivity and quantitatively.

【００４２】さらに、本発明の異常プリオン検出方法
は、試薬キットを用いて非常に容易に実施することがで
きる。ここで、試薬キットは、少なくともプリオンに対
する一価抗体を含んでいる。また、該試薬キットは、さ
らにプロテイナーゼK、プリオンペプチド固相化ビー
ズ、蛍光標識２次抗体等を含んでもよい。Furthermore, the abnormal prion detection method of the present invention can be carried out very easily using a reagent kit. Here, the reagent kit contains at least a monovalent antibody against prion. Further, the reagent kit may further contain proteinase K, prion peptide-immobilized beads, fluorescently labeled secondary antibody, and the like.

【００４３】[0043]

【実施例】以下、実施例により本発明をさらに具体的に
説明する。但し、本発明は下記実施例にその技術的範囲
が限定されるものではない。 ＜実施例１＞ 抗プリオンFabフラグメントの作製 （１）抗プリオンペプチド抗体の作製 ヒツジプリオンタンパク質のアミノ酸配列（DDBJ/EMBL/
GenBank nucleotide sequence databases；Accession n
umber U67922として公開されている）を元にペプチドを
設計した。すなわち、スクレイピープリオン（PrP^sc）
のコアフラグメントP27-30のN末端配列にCysを付加した
２０アミノ酸からなるペプチド（NH₂-CGQGGSHSQWNKPSKP
KTNM-COOH；配列番号１）を合成した。さらにこのペプ
チドにキーホールリンペットヘモシアニン(KLH)を付加
したものを抗原としてウサギに免疫した。数回のブース
ト免疫後、抗血清を回収し、プロテインAカラムを用い
てIgG抗体を精製した。 （２）Fabフラグメントの作製 精製IgG抗体をパパイン結合カラムに通すことにより、I
gG分子をFc部とFab部に切断した。次にプロテインAビー
ズと混合することによって未消化IgG分子とFc部を除去
した。抗体のFab化はSDS電気泳動で確認した。EXAMPLES The present invention will be described in more detail below with reference to examples. However, the technical scope of the present invention is not limited to the following examples. <Example 1> Preparation of anti-prion Fab fragment (1) Preparation of anti-prion peptide antibody Amino acid sequence of sheep prion protein (DDBJ / EMBL /
GenBank nucleotide sequence databases ； Accession n
(published as umber U67922) was used to design the peptide. That is, scrapie prion (PrP ^sc )
Peptide consisting of 20 amino acids (NH ₂ -CGQGGSHSQWNKPSKP) with Cys added to the N-terminal sequence of the core fragment P27-30 of
KTNM-COOH; SEQ ID NO: 1) was synthesized. Rabbits were immunized with the peptide obtained by adding keyhole limpet hemocyanin (KLH) as an antigen. After several boost immunizations, antisera were collected and IgG antibodies were purified using a protein A column. (2) Preparation of Fab fragment By passing the purified IgG antibody through a papain-binding column, I
The gG molecule was cut into the Fc part and the Fab part. The undigested IgG molecules and Fc part were then removed by mixing with protein A beads. Fab formation of the antibody was confirmed by SDS electrophoresis.

【００４４】＜実施例２＞ プリオンペプチド固相化担
体ビーズの作製 カルボキシル化ラテックスマイクロビーズ（直径10μ
m、ポリサイエンス社製）に上記プリオンペプチドを固
相化した。すなわち、ビーズのカルボキシル基を活性化
させた後、ペプチドと一晩混合した。遠心して上清を除
去した後、エタノールアミンを加えてビーズの未反応基
をブロックした。遠心洗浄後、BSA溶液を加え、ビーズ
の非特異的タンパク結合部位をブロックした。Example 2 Preparation of prion peptide-immobilized carrier beads Carboxylated latex micro beads (diameter: 10 μm)
m, manufactured by Poly Science Co., Ltd.) was immobilized with the above prion peptide. That is, the carboxyl groups of the beads were activated and then mixed with the peptides overnight. After centrifugation to remove the supernatant, ethanolamine was added to block the unreacted groups of the beads. After centrifugation and washing, a BSA solution was added to block nonspecific protein binding sites on the beads.

【００４５】＜実施例３＞ フローサイトメトリーによ
る検出 既知濃度のプリオンペプチドを含む試料（102.4fg〜40n
g/10μl）と、抗プリオンペプチドFabフラグメント（1
μg/10μl）又は対照としてIgG抗体とを混合し、４℃で
２０分間反応させた。10⁵個/5μlのビーズを添加して混
合した後、さらに４℃で２０分間反応させた。ビーズを
遠心洗浄後、ビオチン標識抗ウサギIgG抗体（２次抗
体）を反応させた。遠心洗浄後、フィコエリスリン標識
ストレプトアビジンで染色した。蛍光反応はEPICS Elit
e XLフローサイトメーター（ベックマン・コールター社
製）を用いて検出し、ビーズ一個あたりの平均蛍光強度
（MFI）を算出した。Example 3 Detection by Flow Cytometry Sample (102.4fg-40n) containing a known concentration of prion peptide
g / 10 μl) and the anti-prion peptide Fab fragment (1
μg / 10 μl) or IgG antibody as a control was mixed and reacted at 4 ° C. for 20 minutes. After adding 10 ⁵ beads / 5 μl of the beads and mixing, beads were further reacted at 4 ° C. for 20 minutes. After the beads were washed by centrifugation, they were reacted with a biotin-labeled anti-rabbit IgG antibody (secondary antibody). After centrifugation and washing, it was stained with phycoerythrin-labeled streptavidin. Fluorescence reaction is EPICS Elit
Using an eXL flow cytometer (manufactured by Beckman Coulter, Inc.), the mean fluorescence intensity (MFI) per bead was calculated.

【００４６】図２AにIgG抗体を用いてプリオンペプチド
を検出した結果を示す。IgG抗体を添加しない陰性対照
（NCで示す）ではビーズのバックグラウンド蛍光のみの
ためMFI値は低い（＜10）。一方、ペプチドを添加せず
にIgG抗体を反応させた陽性対照ではMFI値は約110を示
した。ペプチドを添加したサンプルではおよそ12.8pgか
ら40ngの範囲でほぼ直線的にMFIが減少し、この範囲内
でプリオンペプチドの検出に定量性があることがわか
る。しかしながら12.8pg以下の濃度ではMFI値はほぼプ
ラトーになり、またバラつきも大きく定量性はない。FIG. 2A shows the result of detection of prion peptide using IgG antibody. The negative control (indicated by NC) without the addition of IgG antibody has a low MFI value (<10) due to the background fluorescence of the beads only. On the other hand, the MFI value was about 110 in the positive control in which the IgG antibody was reacted without adding the peptide. In the sample to which the peptide was added, the MFI decreased almost linearly in the range of approximately 12.8 pg to 40 ng, and it can be seen that detection of prion peptide is quantitative within this range. However, at a concentration of 12.8 pg or less, the MFI value almost plateaus, and there are large variations and there is no quantification.

【００４７】図２BにFabフラグメントを用いて同様に解
析した結果を示す。ペプチド量が102.4fgから40ngまで
ほぼ直線的にMFI値が減少し、この広い濃度範囲でプリ
オン抗原を定量的に検出できることが判明した。従来法
のプリオンの検出限界は、ウェスタンブロッティング法
で約3ng、キャピラリー電気泳動法で約64pg、ELISAで約
60pg及びイムノPCR法で約6pgであり、これらの方法と比
較すると本検出方法は数十倍から数万倍の検出感度を有
することがわかる。FIG. 2B shows the result of the same analysis using the Fab fragment. It was revealed that the MFI value decreased almost linearly from 102.4 fg to 40 ng of peptide, and that prion antigen could be detected quantitatively in this wide concentration range. The detection limit of prion of the conventional method is about 3 ng by Western blotting, about 64 pg by capillary electrophoresis, and about ELISA.
It is 60 pg and about 6 pg by the immuno PCR method, and it can be seen that the present detection method has a detection sensitivity of several tens to several tens of thousands times as compared with these methods.

【００４８】＜実施例４＞ 感染脳乳剤からの異常プリ
オンの検出 正常マウス脳及びヒツジスクレイピー接種マウス脳を用
いて１％ホモジェネートを作製し、リンタングステン酸
法でプリオンタンパクを粗精製しプロテアーゼ（Protei
nase K）処理した。サンプルを1/50000〜1/50倍に希釈
し、Fabフラグメントと反応させる本検出方法によりプ
ロテアーゼ耐性の異常プリオンの検出を行った。図３に
示すように、正常脳由来のサンプルでは各希釈段階でほ
ぼ一定のMFI値（A）及び陽性率（B）を示した。それに
対して、スクレイピー感染脳由来サンプルでは、希釈率
が下がるにつれてMFI値及び陽性率が減少し、1/5000〜1
/50倍希釈サンプルでは、正常マウス脳と比較して低いM
FI値及び陽性率を示した。これは、本検出方法のFabフ
ラグメントが異常プリオンと反応していることを示す。
従って、本検出方法により、スクレイピー感染脳乳剤か
ら異常プリオンを検出可能であると考えられる。Example 4 Detection of Abnormal Prion from Infected Brain Emulsion 1% homogenate was prepared using normal mouse brain and sheep scrapie-inoculated mouse brain, and the prion protein was roughly purified by the phosphotungstic acid method to produce a protease (Protei).
nase K) treated. The sample was diluted 1/50000 to 1/50 and diluted with the Fab fragment to detect abnormal protease-resistant prions by this detection method. As shown in FIG. 3, the samples derived from normal brain showed almost constant MFI value (A) and positive rate (B) at each dilution step. On the other hand, in the scrapie-infected brain-derived sample, the MFI value and the positive rate decreased as the dilution rate decreased, reaching 1/5000 to 1
Lower 50/50 diluted sample compared to normal mouse brain
The FI value and the positive rate were shown. This indicates that the Fab fragment of this detection method is reacting with the abnormal prion.
Therefore, it is considered that this detection method can detect abnormal prions from scrapie-infected brain emulsion.

【００４９】[0049]

【発明の効果】本発明により、サンプル中のタンパク質
を高感度かつ定量的に検出する方法が提供される。本発
明の検出方法は、高感度な検出が望まれている異常プリ
オンタンパク質の検出において特に有用であり、異常プ
リオンタンパク質混入サンプルを検出することによって
プリオン病の感染を回避することができる。INDUSTRIAL APPLICABILITY The present invention provides a method for detecting a protein in a sample with high sensitivity and quantitatively. The detection method of the present invention is particularly useful in the detection of abnormal prion protein for which highly sensitive detection is desired, and infection of prion disease can be avoided by detecting a sample contaminated with abnormal prion protein.

【００５０】[0050]

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> National Institute of Animal Health <120> A method for detecting abnormal prion proteins <130> P01-0635 <140> <141> <160> 1 <170> PatentIn Ver. 2.0 <210> 1 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: synthetic peptide <400> 1 Cys Gly Gln Gly Gly Ser His Ser Gln Trp Asn Lys Pro Ser Lys Pro 1 5 10 15 Lys Thr Asn Met 20[Sequence list]                                SEQUENCE LISTING <110> National Institute of Animal Health <120> A method for detecting abnormal prion proteins <130> P01-0635 <140> <141> <160> 1 <170> PatentIn Ver. 2.0 <210> 1 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: synthetic peptide <400> 1 Cys Gly Gln Gly Gly Ser His Ser Gln Trp Asn Lys Pro Ser Lys Pro   1 5 10 15 Lys Thr Asn Met              20

【００５１】[0051]

【配列表フリーテキスト】配列番号１：合成ペプチド[Sequence list free text] SEQ ID NO: 1: Synthetic peptide

【図面の簡単な説明】[Brief description of drawings]

【図１】IgG抗体又は一価抗体とプリオン抗原分子との
結合反応の模式図である。FIG. 1 is a schematic diagram of a binding reaction between an IgG antibody or a monovalent antibody and a prion antigen molecule.

【図２】抗プリオンペプチドIgG抗体（A）及び抗プリオ
ンペプチドFabフラグメント（B）を用いて既知濃度のプ
リオンペプチドを検出した結果である。FIG. 2 shows the results of detection of known concentrations of prion peptide using anti-prion peptide IgG antibody (A) and anti-prion peptide Fab fragment (B).

【図３】抗プリオンペプチドIgG抗体及び抗プリオンペ
プチドFabフラグメントを用いて、正常マウス脳及びヒ
ツジスクレイピー接種マウス脳中の異常プリオンを検出
した結果である。FIG. 3 shows the results of detecting abnormal prions in normal mouse brain and sheep scrapie-inoculated mouse brain using anti-prion peptide IgG antibody and anti-prion peptide Fab fragment.

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 村山 裕一 茨城県つくば市松代３−６−13 ニューマ リッジ中山205 Ｆターム(参考） 4H045 AA11 AA30 CA40 DA75 EA50 FA72    ─────────────────────────────────────────────────── ─── Continued front page    (72) Inventor Yuichi Murayama             Puma, 3-6-13 Matsushiro, Tsukuba, Ibaraki             Ridge Nakayama 205 F-term (reference) 4H045 AA11 AA30 CA40 DA75 EA50                       FA72

Claims (14)

【特許請求の範囲】[Claims] 【請求項１】 検出の目的タンパク質と、該目的タンパ
ク質に対する一価抗体とを反応させることを特徴とす
る、サンプル中の該目的タンパク質の検出方法。1. A method for detecting a target protein in a sample, which comprises reacting the target protein for detection with a monovalent antibody against the target protein. 【請求項２】 目的タンパク質が、ホルモン、サイトカ
イン及びウイルス抗原からなる群より選択されるもので
ある、請求項１記載の方法。2. The method according to claim 1, wherein the target protein is selected from the group consisting of hormones, cytokines and viral antigens. 【請求項３】 一価抗体がFabフラグメント、Fab'フラ
グメント又はFvフラグメントである、請求項１又は２記
載の方法。3. The method according to claim 1 or 2, wherein the monovalent antibody is a Fab fragment, Fab 'fragment or Fv fragment. 【請求項４】 目的タンパク質がプリオンタンパク質で
ある請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。4. The method according to claim 1, wherein the target protein is a prion protein. 【請求項５】 一価抗体と反応させる前にサンプルをプ
ロテイナーゼKで処理する請求項１〜４のいずれか１項
に記載の方法。5. The method according to claim 1, wherein the sample is treated with proteinase K before reacting with the monovalent antibody. 【請求項６】 目的タンパク質が異常プリオンタンパク
質である請求項５記載の方法。6. The method according to claim 5, wherein the target protein is an abnormal prion protein. 【請求項７】 プリオンタンパク質が哺乳動物に由来す
るものである、請求項４〜６のいずれか１項に記載の方
法。7. The method according to claim 4, wherein the prion protein is derived from a mammal. 【請求項８】 サンプルが、体液、医薬品又は食品であ
る、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。8. The method according to claim 1, wherein the sample is a body fluid, a drug, or a food. 【請求項９】 フローサイトメトリーにより検出を行
う、請求項１〜８のいずれか１項に記載の検出方法。9. The detection method according to claim 1, wherein the detection is performed by flow cytometry. 【請求項１０】 プリオンタンパク質に対する一価抗
体。10. A monovalent antibody against a prion protein. 【請求項１１】 プリオンタンパク質が哺乳動物に由来
するものである、請求項１０記載の一価抗体。11. The monovalent antibody according to claim 10, wherein the prion protein is derived from a mammal. 【請求項１２】 Fabフラグメント、Fab'フラグメント
又はFvフラグメントである、請求項１０又は１１記載の
一価抗体。12. The monovalent antibody according to claim 10 or 11, which is a Fab fragment, Fab ′ fragment or Fv fragment. 【請求項１３】 請求項１０〜１２のいずれか１項に記
載の一価抗体を含むことを特徴とする試薬キット。13. A reagent kit comprising the monovalent antibody according to any one of claims 10 to 12. 【請求項１４】 プロテイナーゼK及び／又はプリオン
ペプチド固相化ビーズをさらに含む請求項１３記載の試
薬キット。14. The reagent kit according to claim 13, further comprising proteinase K and / or prion peptide-immobilized beads.