JP2007228923A - New alcohol oxidase and method for producing glycolaldehyde by using the same - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、エチレングリコールに作用する新規なアルコール酸化酵素、および当該酵素を用いてグリコールアルデヒドを製造する方法に関する。 The present invention relates to a novel alcohol oxidase that acts on ethylene glycol, and a method for producing glycolaldehyde using the enzyme.
現在グリコールアルデヒドは化学的な方法で製造されているが、その製造方法は煩雑で、多量の副産物が生成されるため、グリコールアルデヒドの収率が低い欠点を有する。
これら化学的な製造方法の欠点を解決するために、メタノール酵母由来のアルコール酸化酵素や、アスペルギルス・ジャポニカス(Aspergillus japonicus)由来のグリセロール酸化酵素を用いて、エチレングリコールをグリコールアルデヒドへ変換する生化学的なグリコールアルデヒドの製造法が報告されている(特許文献1、非特許文献1、2)。
Currently, glycol aldehyde is produced by a chemical method, but the production method is complicated, and a large amount of by-products are produced, so that the yield of glycol aldehyde is low.
In order to solve the drawbacks of these chemical production methods, biochemistry of converting ethylene glycol to glycol aldehyde using alcohol oxidase derived from methanol yeast or glycerol oxidase derived from Aspergillus japonicus A method for producing glycol aldehyde has been reported (Patent Document 1, Non-Patent Documents 1 and 2).
従来のメタノール酵母由来のアルコール酸化酵素はエチレングリコールに対する親和性が低く、エチレングリコールを酸化するには多量の酵素が必要である。またアスペルギルス・ジャポニカス(Aspergillus japonicus)由来のグリセロール酸化酵素は、エチレングリコールが高濃度の場合に基質阻害を示す欠点がある。さらに両酵素はエチレングリコールの酸化によって生成されるグリコールアルデヒドにも作用して、グリコールアルデヒドをグリオキサールに変換するため、グリオキサールが副生成物として生成するなどの問題があった。
従って、本発明の目的は、エチレングリコールに作用しグリコールアルデヒドには実質的に作用しない新規な酸化酵素、当該酸化酵素を産生する微生物、当該酸化酵素を製造する方法、及び、当該酸化酵素又は上記微生物を用いて安価なエチレングリコールを原料にしてグリコールアルデヒドを効率的に製造する方法を提供することにある。 Accordingly, an object of the present invention is to provide a novel oxidase that acts on ethylene glycol and does not substantially act on glycolaldehyde, a microorganism that produces the oxidase, a method for producing the oxidase, and the oxidase or the above-mentioned An object of the present invention is to provide a method for efficiently producing glycolaldehyde using inexpensive ethylene glycol as a raw material using microorganisms.
本発明者は、上述の問題点を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、エチレングリコールに効率的に作用し、グリコールアルデヒドに対する作用が低い新規な酸化酵素をアスペルギルス属の微生物に見出した。そして、当該微生物から本酸化酵素を単離、精製し、本発明を完成した。 As a result of intensive studies to solve the above-mentioned problems, the present inventor has found a novel oxidase that efficiently acts on ethylene glycol and has a low effect on glycolaldehyde in an Aspergillus microorganism. And this oxidase was isolated and refine | purified from the said microorganism, and this invention was completed.
即ち、本発明は、以下の(1)及び(2)の性質を有する新規な酸化酵素を提供するものである。
(1)作用:
酸素存在下、エチレングリコールに作用し、グリコールアルデヒドと過酸化水素を生成する。
(2)基質特異性:
メタノール、エタノール、1−プロパノール、1−ブタノール、1−ペンタノール、2−メトキシエタノール、2−メチル−2−ブタノール、及び、エチレングリコールに対して活性を示し、1,2−プロパンジオール、1,3−プロパンジオール、及び、グリセロールには実質的に活性を示さない。
好ましくは、上記性質に加え、下記(3)の性質を有する酸化酵素である。
(3)基質特異性:グリコールアルデヒドには実質的に活性を示さない。(なお本願明細書において、「実質的に活性を示さない」とは、その化合物に対する活性が、エチレングリコールに対する活性の5%未満であることをいう。)
より好ましくは、上記性質に加え、下記(4)及び(5)の性質を有する酸化酵素である。
(4)作用最適pH:5.5−7.0。
(5)作用最適温度:50−55℃。
さらに好ましくは、上記性質に加え、下記(6)、(7)及び(8)の性質を有する酸化酵素である。
(6)分子量:ゲル濾過分析で2.7×105、SDS−ポリアクリルアミド電気泳動分析において6.8×104。
(7)pH安定性:pH6.5〜8.5で40℃、20分間加温する前処理を行った後、90%以上の活性が残存する。
(8)阻害剤:ヒドロキシアミン、フェニルヒドラジン、及び、ヒドラジンにより阻害される。
That is, the present invention provides a novel oxidase having the following properties (1) and (2).
(1) Action:
Acts on ethylene glycol in the presence of oxygen to produce glycolaldehyde and hydrogen peroxide.
(2) Substrate specificity:
Active against methanol, ethanol, 1-propanol, 1-butanol, 1-pentanol, 2-methoxyethanol, 2-methyl-2-butanol and ethylene glycol, 1,2-propanediol, 1, 3-propanediol and glycerol have substantially no activity.
An oxidase having the following property (3) in addition to the above property is preferable.
(3) Substrate specificity: substantially no activity for glycolaldehyde. (In the present specification, “substantially no activity” means that the activity for the compound is less than 5% of the activity for ethylene glycol.)
More preferably, it is an oxidase having the following properties (4) and (5) in addition to the above properties.
(4) Optimum pH of action: 5.5-7.0.
(5) Optimum temperature of action: 50-55 ° C.
More preferably, it is an oxidase having the following properties (6), (7) and (8) in addition to the above properties.
(6) Molecular weight: 2.7 × 10 5 in gel filtration analysis, 6.8 × 10 4 in SDS-polyacrylamide electrophoresis analysis.
(7) pH stability: 90% or more of the activity remains after pre-treatment of heating at 40 ° C. for 20 minutes at pH 6.5 to 8.5.
(8) Inhibitor: Inhibited by hydroxyamine, phenylhydrazine and hydrazine.
また、本発明は、上記酸化酵素を産生する微生物を提供する。さらに、本発明は、上記酸化酵素の製造法も提供する。
更に本発明は、上記酸化酵素又は上記微生物をエチレングリコールに作用させ、エチレングリコールに存在する2つの水酸基のうち、一方の水酸基を酸化して、グリコールアルデヒドに変換することを特徴とするグリコールアルデヒドの製造方法も提供する。
以下に本発明を詳述する。
The present invention also provides a microorganism that produces the oxidase. Furthermore, this invention also provides the manufacturing method of the said oxidase.
Furthermore, the present invention relates to a glycol aldehyde characterized in that the oxidase or the microorganism is allowed to act on ethylene glycol to oxidize one of two hydroxyl groups present in ethylene glycol and convert it to glycol aldehyde. A manufacturing method is also provided.
The present invention is described in detail below.
本発明は、従来報告されていないエチレングリコールをグリコールアルデヒドに酸化するが、反応生成物であるグリコールアルデヒドにはほとんど作用しない新規な酸化酵素を産生する微生物を自然界から見出し、当該酵素の諸性質を明らかにし、グリコールアルデヒドの製造に有効であることを明らかにすることにより完成された。このような微生物は、土壌サンプルをコレステロール、エチレングリコール、エタノールなどを炭素源とした培地に添加し、培養を行った後、生育してきた微生物について、エチレングリコールとグリコールアルデヒドに対する酸化活性を調べる事により得ることが出来る。 In the present invention, a microorganism that produces a novel oxidase that oxidizes ethylene glycol, which has not been reported so far, to glycol aldehyde, but hardly acts on glycol aldehyde, which is a reaction product, has been found in nature. It was clarified and completed by clarifying that it is effective for the production of glycolaldehyde. Such microorganisms can be obtained by adding a soil sample to a medium containing cholesterol, ethylene glycol, ethanol, etc. as a carbon source, culturing, and then examining the growing microorganisms for their oxidation activity against ethylene glycol and glycol aldehyde. Can be obtained.
本発明の酵素の起源となる微生物は特に限定されないが、カビなどが好適であり、好ましくはアスペルギルス属に属する微生物、なかでもアスペルギルス・オクラゼウス(Aspergillus ochraceus)が挙げられ、特に好ましくは岩手大学農学部校内の土壌から分離されたアスペルギルス・オクラゼウス(Aspergillus ochraceus)AIU 031株が挙げられる。当該AIU 031株は独立法人産業技術総合研究所特許微生物寄託センター(〒305−8566 日本国茨城県つくば市東1丁目1番地1 中央第6)にFERM P−20785として寄託されている。AIU 031株の菌学的諸性質を以下に示す。 Microorganisms that are the origin of the enzyme of the present invention are not particularly limited, but molds and the like are suitable, preferably microorganisms belonging to the genus Aspergillus, especially Aspergillus ochraceus, particularly preferably in the Faculty of Agriculture, Iwate University Aspergillus ochraceus AIU 031 strain isolated from the soil. The AIU 031 strain has been deposited as FERM P-20785 at the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology Patent Microorganism Depositary Center (1st, 1st East, 1-chome, Tsukuba, Ibaraki, Japan 305-8565). The mycological properties of AIU 031 strain are shown below.
・メトレ(長さ:16−22μm、直径:5.6−7.2μm)とフィアライド(長さ:7.2−10.4μm、直径=2.2−2.8μm)を形成。
・分生子頭が明橙黄色〜橙黄色。
・麦芽エキス寒天培地で25℃、7日間培養した時、コロニーの直径が40mm以上であり、菌糸体は白色。
・分生子柄は茶色、粗面、長さ1mm以下で、頂のうが12−42μm。
・分生子は球〜亜球状、直径2.8−3.6μm、粗面。
・37℃では生育しない。
-Metre (length: 16-22 μm, diameter: 5.6-7.2 μm) and phialide (length: 7.2-10.4 μm, diameter = 2.2.8-μm) are formed.
-The conidia head is bright orange yellow to orange yellow.
-When cultured on a malt extract agar medium at 25 ° C for 7 days, the diameter of the colony is 40 mm or more and the mycelium is white.
-The conidia pattern is brown, rough, 1 mm or less in length, and the top is 12-42 μm.
-Conidia are spherical to subspherical, 2.8-3.6 μm in diameter, rough.
・ Does not grow at 37 ℃.
本発明の酸化酵素は、該酵素を産生する微生物より、下記のようにして取得することができる。例えば、本活性を有する微生物を好適な条件で培養し、培養終了後に培養液からろ過や遠心分離などにより菌体を集め、超音波破砕、ガラスビーズを用いた破砕などの方法により、菌体を破砕し、粗酵素液を得る。さらにこの粗酵素液から塩析、各種クロマトグラフィーなどの方法により精製し、本発明の酵素を得ることができる。 The oxidase of the present invention can be obtained from the microorganism producing the enzyme as follows. For example, the microorganism having this activity is cultured under suitable conditions, and after culturing, the bacterial cells are collected from the culture solution by filtration or centrifugation, and the bacterial cells are collected by a method such as ultrasonic disruption or disruption using glass beads. Crush to obtain a crude enzyme solution. Further, the enzyme of the present invention can be obtained by purifying the crude enzyme solution by a method such as salting out or various chromatography.
本発明の酸化酵素、例えばアルペルギルス属に属するカビ、その代表的なものとしてアスペルギルス・オクラゼウス(Aspergillus ochraceus)AIU 031(FERM P−20785)が産生する酸化酵素は、その基質特異性よりアルコール酸化酵素、更に一級アルコール酸化酵素に分類されるが、メタノール酵母由来の一級アルコール酸化酵素(アルコールオキシダーゼ)よりも低濃度のエチレングリコールに対して速やかに反応し、グリコールアルデヒドを生成する。さらに、本発明の酸化酵素は、メタノール酵母由来のアルコールオキシダーゼと異なり、グリコールアルデヒドには実質的に活性を示さないため、生成したグリコールアルデヒドは蓄積し、グリコールアルデヒドの製造に有用である。 The oxidase of the present invention, for example, the mold belonging to the genus Alpergillus, representatively the oxidase produced by Aspergillus ochraceus AIU 031 (FERM P-20785) is an alcohol oxidase due to its substrate specificity, Furthermore, although classified into primary alcohol oxidase, it reacts more rapidly with ethylene glycol having a lower concentration than primary alcohol oxidase (alcohol oxidase) derived from methanol yeast to produce glycolaldehyde. Furthermore, unlike the alcohol oxidase derived from methanol yeast, the oxidase of the present invention does not substantially exhibit activity in glycol aldehyde, so that the produced glycol aldehyde accumulates and is useful for the production of glycol aldehyde.
また、従来、エチレングリコールに作用することが報告されているメタノール酵母由来のアルコールオキシダーゼ、その代表的なピキア・パストリス(Pichia pastoris)由来のアルコールオキシダーゼは、8つの分子量80,000の同一サブユニットからなる分子量675,000のタンパク質であり(Agric.Biol.Chem.,44,2279−2289(1980))、アスペルギルス・ジャポニカス(Aspergillus japonicus)が産生するグリセロールオキシダーゼは、分子量85kDaと65.8kDaの2つの異なったサブユニットからなる分子量400,000のタンパクである(J.Biol.Chem.,259,2748−2753(1984))。一方で、本発明の酵素は、SDS−ポリアクリルアミド電気泳動分析による分子量は約67,000であり、ゲルろ過分析による分子量は約270,000であることから、4つの分子量67,000の同一サブユニットからなる分子量270,000のタンパク質であり、基質特異性などと共に、分子量やタンパク質の構造においても、既知のアルコールオキシダーゼやアスペルギルス・ジャポニカスAspergillus japonicusが産生するグリセロール酸化酵素とは異なった、新規酸化酵素である。 In addition, alcohol oxidase derived from methanol yeast, which has been reported to act on ethylene glycol, and its typical alcohol oxidase derived from Pichia pastoris, consists of eight identical subunits having a molecular weight of 80,000. The glycerol oxidase produced by Aspergillus japonicus is a protein having a molecular weight of 675,000 (Agric. Biol. Chem., 44, 2279-2289 (1980)), and having a molecular weight of 85 kDa and 65.8 kDa. It is a protein with a molecular weight of 400,000 consisting of two different subunits (J. Biol. Chem., 259, 2748-2753 (1984)). On the other hand, the enzyme of the present invention has a molecular weight of about 67,000 by SDS-polyacrylamide electrophoresis analysis and a molecular weight of about 270,000 by gel filtration analysis. A protein with a molecular weight of 270,000 consisting of units, a novel oxidation that differs from glycerol oxidase produced by known alcohol oxidase and Aspergillus japonicus Aspergillus japonicus in terms of molecular weight and protein structure as well as substrate specificity. It is an enzyme.
本発明の酸化酵素の作用最適pHまたは作用最適温度は、反応条件のpHまたは温度を変えて活性を測定することにより決定される。 The optimum pH or temperature of action of the oxidase of the present invention is determined by measuring the activity by changing the pH or temperature of the reaction conditions.
本発明の酸化酵素の分子量は例えばTSK−G3000SW(7.8mm×30cm)(東ソー株式会社製)カラムを用いたゲル濾過分析により、標準タンパク質との相対溶出時間から算出することができ、サブユニット分子量はSDS−ポリアクリルアミド電気泳動により、標準タンパク質との相対移動度から算出することができる。 The molecular weight of the oxidase of the present invention can be calculated from the relative elution time with a standard protein by gel filtration analysis using, for example, a TSK-G3000SW (7.8 mm × 30 cm) (manufactured by Tosoh Corporation) column. The molecular weight can be calculated from the relative mobility with the standard protein by SDS-polyacrylamide electrophoresis.
本発明において、エチレングリコールをグリコールアルデヒドに変換する酸化酵素を産生する微生物を培養するための培地は、その微生物が増殖し得るものであれば特に限定されない。例えば、炭素源として、グルコース、シュークロースなどの糖類、エタノール、グリセリン、エチレングリコールなどのアルコール類、コレステロールなどのステロール類、オレイン酸、ステアリン酸などの脂肪酸ならびにそのエステル類、菜種油および大豆油などの油類;窒素源として、硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、ペプトン、カザミノ酸、酵母エキス、肉エキスおよびコーンスチープリカーなど;無機塩類として、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、炭酸カルシウム、リン酸水素カリウム、リン酸水素ナトリウムなど;その他に麦芽エキス、肉エキスなどを有する通常の液体培地が使用され得る。 In the present invention, the medium for culturing a microorganism that produces an oxidase that converts ethylene glycol into glycolaldehyde is not particularly limited as long as the microorganism can grow. For example, as a carbon source, sugars such as glucose and sucrose, alcohols such as ethanol, glycerin and ethylene glycol, sterols such as cholesterol, fatty acids such as oleic acid and stearic acid and esters thereof, rapeseed oil and soybean oil Oils: As a nitrogen source, ammonium sulfate, ammonium nitrate, peptone, casamino acid, yeast extract, meat extract, corn steep liquor, etc .; As inorganic salts, magnesium sulfate, sodium chloride, calcium carbonate, potassium hydrogen phosphate, sodium hydrogen phosphate, etc. Other conventional liquid media having malt extract, meat extract and the like may be used.
本発明によるグリコールアルデヒドの製造方法は、本発明の酸化酵素、又は、当該酸化酵素を産生する微生物をエチレングリコールに作用させ、グリコールアルデヒドへと変換蓄積せしめることを特徴とする。本発明で使用する酸化酵素としては、単一または部分的に精製された酵素であってもよい。本発明で使用する微生物としては、当該微生物の培養物またはその処理物を使用することも可能である。ここで、「微生物の培養物」とは、菌体を含む培養液あるいは培養菌体を意味し、「その処理物」とは、例えば粗酵素液、凍結乾燥菌体、アセトン乾燥菌体、あるいはそれらの破砕物、これらの混合物などを意味する。更に上記酸化酵素又は上記微生物は、公知の手段(例えば、架橋法、物理的吸着法、包括法など)で固定化されて使用できる。本発明の微生物としては、上記酸化酵素の産生能を有している限り、野生株または変異株、あるいは本発明の酸化酵素をコードするDNAをベクターに組込み、これを宿主内に導入してなる形質転換体(組替え体)であってもよい。また、本発明で使用する酸化酵素の産生能を有する形質転換体は、酸化酵素をコードするDNAを宿主のゲノムに安定的に組み込むことによっても製造できる。 The method for producing glycol aldehyde according to the present invention is characterized in that the oxidase of the present invention or a microorganism producing the oxidase is allowed to act on ethylene glycol to be converted and accumulated into glycol aldehyde. The oxidase used in the present invention may be a single or partially purified enzyme. As the microorganism used in the present invention, a culture of the microorganism or a processed product thereof can be used. Here, “microorganism culture” means a culture solution or culture containing bacterial cells, and “the processed product” means, for example, a crude enzyme solution, freeze-dried cells, acetone-dried cells, or These crushed materials and their mixtures are meant. Furthermore, the oxidase or the microorganism can be used after being immobilized by a known means (for example, a crosslinking method, a physical adsorption method, a comprehensive method, etc.). As long as the microorganism of the present invention has the ability to produce the above oxidase, a wild strain or a mutant strain, or a DNA encoding the oxidase of the present invention is incorporated into a vector and introduced into a host. It may be a transformant (recombinant). The transformant having the ability to produce the oxidase used in the present invention can also be produced by stably integrating DNA encoding the oxidase into the host genome.
本発明の酸化酵素をエチレングリコールに反応させる際の条件は、温度は5℃〜80℃、好ましくは5〜50℃の範囲、pHは4〜12、好ましくはpH5〜9の範囲、エチレングリコールの濃度は、0.1M以上、好ましくは1M以上である。反応は、酸素条件下で行うことが好ましい。また酸素の反応液への溶解を促進するため、反応は振とう、攪拌条件下で行なわれることが好ましい。さらに大気圧以上の加圧下で反応を行うことにより、反応液への酸素の溶解度が向上し、反応がより進む場合もある。
The conditions for the reaction of the oxidase of the present invention with ethylene glycol are as follows: temperature is 5 ° C. to 80 ° C., preferably 5 to 50 ° C., pH 4 to 12, preferably
尚、本発明の酸化酵素による酸化反応により、過酸化水素が生成するが、この過酸化水素は酵素を失活させる場合がある。しかし、反応系にカタラーゼを添加することにより、生成した過酸化水素を分解、除去することが可能である。使用するカタラーゼは、過酸化酵素を速やかに分解、除去するという観点から、使用する酸化酵素の活性の10倍以上、好ましくは100倍以上、さらに好ましくは1000倍以上の活性量を使用する事が望ましい。また、上述した形質転換体に酸化酵素と共にカタラーゼを組換え発現させることにより、効率良く過酸化水素を分解することが可能である。一方、形質転換体の宿主として、もともとカタラーゼを産生する能力を有する微生物を使用することが好ましい。 Incidentally, hydrogen peroxide is produced by the oxidation reaction by the oxidase of the present invention, but this hydrogen peroxide may deactivate the enzyme. However, by adding catalase to the reaction system, the generated hydrogen peroxide can be decomposed and removed. From the viewpoint of rapidly decomposing and removing peroxidase, the catalase used may be used in an amount of activity that is 10 times or more, preferably 100 times or more, more preferably 1000 times or more the activity of the oxidase used. desirable. In addition, hydrogen peroxide can be efficiently decomposed by allowing the above-mentioned transformant to recombinantly express catalase together with an oxidase. On the other hand, it is preferable to use a microorganism originally having an ability to produce catalase as a host of a transformant.
本発明の新規な酸化酵素は、エチレングリコールをグリコールアルデヒドに酸化するが、反応生成物であるグリコールアルデヒドにはほとんど作用しない特異性の高い酸化酵素であり、本発明の酸化酵素を使用すれば、安価なエチレングリコールからグリコールアルデヒドを効率的に製造することができる。 The novel oxidase of the present invention is a highly specific oxidase that oxidizes ethylene glycol to glycol aldehyde, but hardly acts on the reaction product, glycol aldehyde. If the oxidase of the present invention is used, Glycolaldehyde can be efficiently produced from inexpensive ethylene glycol.
以下、実施例により本発明を更に詳しく説明するが、本発明はこれら実施例になんら限定されるものではない。
(実施例1)エチレングリコールに作用してグリコールアルデヒドにほとんど作用しない酸化酵素を産生する能力を持つ微生物の分離
スクリーニングのために、表1に示す培地を120℃で15分間加圧殺菌した。この培地5mlを分注した試験管に少量の土壌を添加し、30℃で2〜7日間振盪培養した。微生物の生育が確認された培養液について、その培養液0.1mlを上記と同一組成の培地に植菌し、同様に30℃で2〜7日間振盪培養した。この操作をもう一度繰り返した後、培養液を上記液体培地と同一組成に2%寒天を加えて調製した寒天平板培地にプレートアウトし、30℃で培養した。そして寒天平板培地に生育した微生物を平板培地と同一組成の斜面培地に植菌し、30℃で培養して保存した。次に、斜面培地に分離した微生物を再度表1に示す培地150mlを入れた坂口フラスコを用いて30℃で振盪培養した。
そして培養液から遠心分離で集菌し、集めた菌体を0.1Mリン酸緩衝液(pH7.0)に懸濁してガラスビーズを用いて菌体を破砕した。次に、菌体破砕残渣を遠心分離で除去し、得られた上清液をエチレングリコールまたはグリコールアルデヒドを0.1Mになるように添加した表2に示す酵素活性測定用発色液に添加し、反応を行った。この反応で、エチレングリコール存在下で反応液が紫色に着色し(過酸化水素が生成した)、グリコールアルデヒド存在下では、反応液の色がほとんど変化しない(過酸化水素が生成しない)微生物を選抜した。
このような方法で得られた菌株は、上記の菌学的性質を示す微生物であり、Aspergillus ochraceus AIU 031と命名した。
EXAMPLES Hereinafter, although an Example demonstrates this invention in more detail, this invention is not limited to these Examples at all.
(Example 1) Separation of microorganisms capable of producing an oxidase which acts on ethylene glycol and hardly acts on glycolaldehyde. For screening, the medium shown in Table 1 is pressurized at 120C for 15 minutes. Sterilized. A small amount of soil was added to a test tube into which 5 ml of this medium had been dispensed, and cultured with shaking at 30 ° C. for 2 to 7 days. About the culture solution with which the growth of microorganisms was confirmed, the culture solution 0.1ml was inoculated to the culture medium of the same composition as the above, and was similarly shake-cultured at 30 degreeC for 2 to 7 days. After repeating this operation once more, the culture solution was plated out on an agar plate medium prepared by adding 2% agar to the same composition as the liquid medium, and cultured at 30 ° C. The microorganisms grown on the agar plate medium were inoculated into a slant medium having the same composition as the plate medium, cultured at 30 ° C. and stored. Next, the microorganisms separated into the slant medium were cultured again at 30 ° C. using a Sakaguchi flask containing 150 ml of the medium shown in Table 1.
Then, the cells were collected from the culture by centrifugation, and the collected cells were suspended in 0.1 M phosphate buffer (pH 7.0), and the cells were crushed using glass beads. Next, the bacterial cell disruption residue was removed by centrifugation, and the resulting supernatant was added to the coloring solution for enzyme activity measurement shown in Table 2 to which ethylene glycol or glycol aldehyde was added to a concentration of 0.1 M, Reaction was performed. In this reaction, the reaction solution turns purple in the presence of ethylene glycol (hydrogen peroxide was generated), and in the presence of glycolaldehyde, the reaction solution color hardly changed (hydrogen peroxide was not generated). did.
The strain obtained by such a method is a microorganism exhibiting the above mycological properties, and was named Aspergillus ochraceus AIU 031.
(実施例2)エチレングリコールに作用してグリコールアルデヒドに作用しない酸化酵素の製造
実施例1で分離した微生物を、表1に示す液体培地150mlを入れた500ml容フラスコに植菌し、30℃で振盪培養して、培養時間と酵素生産量との関係を調べた。その結果、エチレングリコールに作用する酸化酵素の生産量は培養2〜3日目が最も高い値を示した。
(Example 2) Production of oxidase that acts on ethylene glycol but does not act on glycolaldehyde The microorganism separated in Example 1 was inoculated into a 500 ml flask containing 150 ml of the liquid medium shown in Table 1. The culture was performed at 30 ° C. with shaking, and the relationship between the culture time and the amount of enzyme produced was examined. As a result, the production amount of oxidase acting on ethylene glycol showed the highest value on the 2nd to 3rd day of culture.
(実施例3)エチレングリコールに作用してグリコールアルデヒドに作用しない酸化酵素の精製
実施例2の結果を基に、表1に示す液体培地150mlを分注した500ml容フラスコに実施例1で分離した微生物を植菌し、30℃で2日間振盪培養した。続いて、このようにして培養した900mLの培養液から菌体を集めて、以下の方法で酵素を精製した。尚、酵素の精製にはpH7.0のリン酸緩衝液を用いた。
1)粗酵素液の調製
900mL培養液から集菌した菌体(湿重量:5.5g)を10mMリン酸緩衝液に懸濁し、10℃以下の温度で0.5mmガラスビーズを用いて6分間(2分x3回)細胞破砕した。この細胞破砕液を遠心分離して菌体残渣を除去して上清画分を得た。菌体残渣は、再度上記と同じようにガラスビーズを用いて破砕し、遠心分離して上清画分を得た。両上清画分を混合して粗酵素液とし、酵素の精製に用いた。
2)脱塩濃縮
上記の方法で調製した粗酵素液120mlを限外濾過膜で電導度2ms/cmまで脱塩した後、25mlまで濃縮し、遠心分離で不溶物を除去した。
3)CIM DEAE−8カラムクロマトグラフィー
2ms/cmまで脱塩濃縮した粗酵素液を20mMリン酸緩衝液で平衡化したCIM DEAE−8カラム(15×45mm)に吸着させた。本カラムを20mMリン酸緩衝液80mlで洗浄した後、酵素を20mMリン酸緩衝液(50ml)と0.3M NaClを含む20mMリン酸緩衝液(50ml)を用いて直線濃度勾配法で溶出した。
4)CIM C4−8カラムクロマトグラフィー
CIM DEAE−8カラムからの溶出液に35%飽和濃度まで固形の硫安を添加し、遠心分離で不溶物を除去した。この35%飽和の硫安を含む酵素液を、1.5M硫安を含む20mMリン酸緩衝液で平衡化したCIM C4−8カラム(15×45mm)に吸着させた。本カラムを1.5M硫安を含む20mMリン酸緩衝液50mlで洗浄した後、酵素を1.5M硫安を含む20mMリン酸緩衝液(50ml)と0.5M硫安を含む20mMリン酸緩衝液(50ml)を用いて直線濃度勾配法で溶出した。
5)CIM Isobutylカラムクロマトグラフィー
CIM C4−8カラムからの溶出液に0.5M量の固形硫安を添加した後、1.5M硫安を含む20mMリン酸緩衝液で平衡化したCIM Isobutylカラム(16×6mm)に吸着させた。本カラムを1.5M硫安を含む20mMリン酸緩衝液10mlで洗浄した後、酵素を1.5M硫安を含む20mMリン酸緩衝液(10ml)と20mMリン酸緩衝液(10ml)を用いて直線濃度勾配法で溶出した。
以上の方法で得られた上記5)の酵素標品をNativeおよびSDS−ポリアクリルアミド電気泳動法で分析した結果、電気泳動的に単一であった。尚、本精製法による酵素の精製収率は、表3の通りであった。
(Example 3) Purification of oxidase that acts on ethylene glycol but does not act on glycol aldehyde Based on the result of Example 2, the example was applied to a 500 ml flask in which 150 ml of the liquid medium shown in Table 1 was dispensed. The microorganism separated in 1 was inoculated and cultured with shaking at 30 ° C. for 2 days. Subsequently, the bacterial cells were collected from 900 mL of the culture medium thus cultured, and the enzyme was purified by the following method. In addition, a pH 7.0 phosphate buffer was used for the purification of the enzyme.
1) Preparation of crude enzyme solution Cells collected from a 900 mL culture solution (wet weight: 5.5 g) are suspended in 10 mM phosphate buffer, and 0.5 mm glass beads are used at a temperature of 10 ° C. or less for 6 minutes. Cells were disrupted (2 minutes x 3 times). The cell lysate was centrifuged to remove cell residue and obtain a supernatant fraction. The cell residue was crushed again using glass beads in the same manner as described above, and centrifuged to obtain a supernatant fraction. Both supernatant fractions were mixed to obtain a crude enzyme solution, which was used for enzyme purification.
2) Desalination and Concentration 120 ml of the crude enzyme solution prepared by the above method was desalted to an electric conductivity of 2 ms / cm using an ultrafiltration membrane, concentrated to 25 ml, and insoluble matters were removed by centrifugation.
3) CIM DEAE-8 column chromatography The crude enzyme solution desalted and concentrated to 2 ms / cm was adsorbed on a CIM DEAE-8 column (15 × 45 mm) equilibrated with 20 mM phosphate buffer. The column was washed with 80 ml of 20 mM phosphate buffer, and then the enzyme was eluted by a linear concentration gradient method using 20 mM phosphate buffer (50 ml) and 20 mM phosphate buffer (50 ml) containing 0.3 M NaCl.
4) CIM C4-8 column chromatography Solid ammonium sulfate was added to the eluate from the CIM DEAE-8 column to a 35% saturation concentration, and insoluble matters were removed by centrifugation. The enzyme solution containing 35% saturated ammonium sulfate was adsorbed on a CIM C4-8 column (15 × 45 mm) equilibrated with 20 mM phosphate buffer containing 1.5 M ammonium sulfate. The column was washed with 50 ml of 20 mM phosphate buffer containing 1.5 M ammonium sulfate, and then the enzyme was 20 mM phosphate buffer (50 ml) containing 1.5 M ammonium sulfate and 20 mM phosphate buffer (50 ml containing 0.5 M ammonium sulfate). ) Using a linear concentration gradient method.
5) CIM Isobutyl column chromatography After adding 0.5M solid ammonium sulfate to the eluate from CIM C4-8 column, CIM Isobutyl column (16 × 6 mm). The column was washed with 10 ml of 20 mM phosphate buffer containing 1.5 M ammonium sulfate, and then the enzyme was linearly concentrated using 20 mM phosphate buffer (10 ml) and 20 mM phosphate buffer (10 ml) containing 1.5 M ammonium sulfate. Elute by gradient method.
The enzyme preparation of the above 5) obtained by the above method was analyzed by Native and SDS-polyacrylamide electrophoresis. As a result, it was electrophoretically single. The purification yield of the enzyme by this purification method was as shown in Table 3.
(実施例4)エチレングリコールに作用してグリコールアルデヒドに作用しない酸化酵素の性質
実施例3の方法で精製した酵素標品は、NativeおよびSDS−ポリアクリルアミド電気泳動法を用いて分析した結果、いずれの分析でも蛋白的に単一であった。よって、本精製酵素標品を用いて諸性質を検討した。
1.作用
エチレングリコールを1.05%(w/v)濃度になるように添加した表2に示す酵素活性測定用発色液0.95mlに精製酵素液0.05mlを添加し、30℃で反応を行った。その結果、時間の経過と共に555nmの吸光度が増大し、エチレングリコールと本酵素の反応によって、過酸化水素が生成されることが明らかになった。
また、反応生成物をIsobe and Nishiseの方法[Biosci.Biotech.Biochem.,58,170−173,(1994)]に従ってN−methyl−2−benzothiazolinone hydrazone(MBTH)と反応させ、その吸収スペクトルおよびC18の逆相カラムからの溶出時間を分析した。まず、反応生成物を0.2Mグリシン−HCl緩衝液(pH4.0)0.75mlに溶解し、それに1.0%(w/v)MBTH液を0.3ml添加した(反応1)。さらに、前記反応液の一部(0.2ml)に0.2%FeCl3液を0.75ml添加した(反応2)。その後、反応1および反応2で得られた反応液について吸収スペクトルを測定した。その結果、グリコールアルデヒドの反応1および反応2により得られる反応液の吸収スペクトルと同様に、上記反応生成物の反応1の反応液では、極大吸収を持つスペクトルは得られず、反応2の反応液では620nm付近に極大吸収を持つ吸収スペクトルが得られた。そして上記反応2の反応液をC18の逆相カラムで分析した場合も、グリコールアルデヒドの反応2により得られる生成物と同じ溶出位置にピークが得られた。よって、本酵素は、下記の式に従ってエチレングリコールをグリコールアルデヒドに酸化することが明らかになった。
HOH2CCH2OH+O2→OHCCH2OH+H2O2 (Example 4) Properties of oxidase that acts on ethylene glycol but does not act on glycolaldehyde The enzyme preparation purified by the method of Example 3 was analyzed using Native and SDS-polyacrylamide electrophoresis. As a result, the protein was single in any analysis. Therefore, various properties were examined using this purified enzyme preparation.
1. 0.05 ml of purified enzyme solution was added to 0.95 ml of the coloring solution for enzyme activity measurement shown in Table 2 to which ethylene glycol was added to a concentration of 1.05% (w / v), and the reaction was carried out at 30 ° C. It was. As a result, it was revealed that the absorbance at 555 nm increased with the passage of time, and hydrogen peroxide was produced by the reaction between ethylene glycol and this enzyme.
In addition, the reaction product was subjected to the method of Isobe and Nishise [Biosci. Biotech. Biochem. , 58, 170-173, (1994)], and reacted with N-methyl-2-benzothiazolinone hydrazone (MBTH), and analyzed its absorption spectrum and elution time from C18 reverse phase column. First, the reaction product was dissolved in 0.75 ml of 0.2 M glycine-HCl buffer (pH 4.0), and 0.3 ml of 1.0% (w / v) MBTH solution was added thereto (reaction 1). Further, 0.75 ml of 0.2% FeCl 3 solution was added to a part (0.2 ml) of the reaction solution (reaction 2). Thereafter, the absorption spectra of the reaction solutions obtained in Reaction 1 and Reaction 2 were measured. As a result, similar to the absorption spectrum of the reaction liquid obtained by the reaction 1 and reaction 2 of glycolaldehyde, the reaction liquid of the reaction product 1 does not obtain a spectrum having maximum absorption, and the reaction liquid of reaction 2 Then, an absorption spectrum having a maximum absorption around 620 nm was obtained. When the reaction solution of reaction 2 was analyzed with a C18 reverse phase column, a peak was obtained at the same elution position as the product obtained by reaction 2 of glycolaldehyde. Therefore, it became clear that this enzyme oxidizes ethylene glycol to glycol aldehyde according to the following formula.
HOH 2 CCH 2 OH + O 2 → OHCCH 2 OH + H 2 O 2
次に、エチレングリコールまたはグリコールアルデヒドを21mMになるように添加した表2に示す酵素活性測定用発色液0.95mlに精製酵素液0.05mlを添加し、30℃で反応を行い、555nmの吸光度の増加を経時的に測定した。その結果、エチレングリコールを基質とした場合、時間の経過と共に555nmの吸収は直線的に増加するが、グリコールアルデヒドを基質とした場合、555nmの吸収の増加ははほとんど認められなかった。よって、本酵素は、エチレングリコールをグリコールアルデヒドに酸化するが、反応生成物であるグリコールアルデヒドにはほとんど作用しないことが明らかになった。 Next, 0.05 ml of the purified enzyme solution was added to 0.95 ml of the coloring solution for enzyme activity measurement shown in Table 2 to which ethylene glycol or glycol aldehyde was added to 21 mM, and the reaction was carried out at 30 ° C., and the absorbance at 555 nm. The increase in was measured over time. As a result, when ethylene glycol was used as a substrate, the absorption at 555 nm increased linearly with the passage of time, but when glycol aldehyde was used as a substrate, an increase in absorption at 555 nm was hardly observed. Therefore, it was clarified that this enzyme oxidizes ethylene glycol to glycol aldehyde, but hardly acts on glycol aldehyde which is a reaction product.
2.基質特異性
表4に示すアルコール類を1.05%(w/v)濃度になるように添加した表2に示す酵素活性測定用発色液0.95mlに精製酵素液0.05mlを添加し、30℃で反応を行い、555nmの吸光度の増加を分光光度計にて連続して測定し、時間あたりの555nmの増加量を算出し、各アルコール類に対する活性を調べた。
その結果、表4に示すように、本酵素は、メタノール、エタノール、1−プロパノール、1−ブタノール、1−ペンタノール、2−メトキシエタノール、2−メチル−2−ブタノール、及び、エチレングリコールに対して活性を示し、1,2−プロパンジオール、1,3−プロパンジオール、及び、グリセロールには実質的に活性を示さなかった。なお、表4中の各数値は、メタノールに対する活性を100とした場合の相対値である。
2. Substrate Specificity 0.05 ml of purified enzyme solution was added to 0.95 ml of the coloring solution for enzyme activity measurement shown in Table 2 to which alcohols shown in Table 4 were added to a concentration of 1.05% (w / v), The reaction was carried out at 30 ° C., and the increase in absorbance at 555 nm was continuously measured with a spectrophotometer, the increase in 555 nm per hour was calculated, and the activity against each alcohol was examined.
As a result, as shown in Table 4, this enzyme is against methanol, ethanol, 1-propanol, 1-butanol, 1-pentanol, 2-methoxyethanol, 2-methyl-2-butanol and ethylene glycol. 1 and 2-propanediol, 1,3-propanediol, and glycerol showed substantially no activity. In addition, each numerical value in Table 4 is a relative value when the activity with respect to methanol is set to 100.
3.エチレングリコールに対するKm値
エチレングリコールを225mMから1.8Mの濃度になるように添加した表2に示す酵素活性測定用発色液0.95mlに精製酵素液0.05mlを添加し、30℃で反応を行い、555nmの吸光度の増加を分光光度計にて連続して測定し、時間あたりの555nmの増加量を算出し、各濃度のエチレングリコールに対する活性を測定した。更に、得られた活性値と基質濃度より作成したLineweaver−Burk plotにより、Km値、Vmax値を算出した。
その結果、エチレングリコールに対するKm値は約1.25Mで、Vmax値は3.64μmol/min/mg・proteinと算出された。Candida属酵母由来のアルコールオキシダーゼのエチレングリコールに対するKm値は、2.96Mであり、Pichia属酵母由来のアルコールオキシダーゼのエチレングリコールに対するKm値は、4M以上であると報告されており、本酵素のエチレングリコールに対する親和性は従来の酵母由来のアルコールオキシダーゼよりも高いことが明らかになった。
また、エタノールを1mMから200mMの濃度になるように添加した表2に示す酵素活性測定用発色液を用いて、上記と同様に活性を測定した。その結果、本酵素のエタノールに対するKm値は、約12mMで、Vmax値は3.59μmol/min/mg・proteinと算出された。よって、本酵素を高濃度のエチレングリコールに作用させると、エタノールとほぼ同等の速度でエチレングリコールを酸化することが明らかになった。
3. Km value with respect to ethylene glycol Ethylene glycol was added to a concentration of 225 mM to 1.8 M, 0.05 ml of purified enzyme solution was added to 0.95 ml of coloring solution for enzyme activity measurement shown in Table 2, and the reaction was carried out at 30 ° C. The increase in absorbance at 555 nm was continuously measured with a spectrophotometer, the increase in 555 nm per hour was calculated, and the activity against ethylene glycol at each concentration was measured. Further, Km value and Vmax value were calculated by Lineweaver-Burk plot prepared from the obtained activity value and substrate concentration.
As a result, the Km value for ethylene glycol was about 1.25 M, and the Vmax value was calculated to be 3.64 μmol / min / mg · protein. The Km value for ethylene glycol of Candida yeast-derived alcohol oxidase is 2.96M, and the Km value for ethylene glycol of alcohol oxidase derived from Pichia yeast is reported to be 4M or higher. It was revealed that the affinity for glycol was higher than that of conventional alcohol oxidase derived from yeast.
Further, the activity was measured in the same manner as described above using a coloring solution for enzyme activity measurement shown in Table 2 to which ethanol was added to a concentration of 1 mM to 200 mM. As a result, the Km value of this enzyme with respect to ethanol was about 12 mM, and the Vmax value was calculated to be 3.59 μmol / min / mg · protein. Therefore, it was clarified that when this enzyme was allowed to act on ethylene glycol at a high concentration, ethylene glycol was oxidized at a rate almost the same as that of ethanol.
4.分子量
精製酵素を高速液体クロマトグラフィーによるTSK−G3000SW(7.8mm×30cm)(東ソー株式会社製)カラムを用いたゲル濾過、および1%の2−メルカプトエタノール存在下、10%SDS−ポリアクリルアミド電気泳動に供し、標準タンパクとの相対移動度より、その分子量を推定した。その結果、分子量は、ゲル濾過法で約272,000、SDS−ポリアクリルアミド電気泳動法で約68,000であった。
[ゲル濾過法による分子量測定条件]
カラム:TSK−G3000SW(7.8mm×30cm)(東ソー株式会社製)
溶離液:0.1Mリン酸緩衝液+0.3M塩化ナトリウム(pH7.0)
流 速:1.0ml/min
温 度:室温
検 出:220nm
4). Gel filtration using TSK-G3000SW (7.8 mm × 30 cm) (manufactured by Tosoh Corp.) column with molecular weight purified enzyme by high performance liquid chromatography, and 10% SDS-polyacrylamide electrolysis in the presence of 1% 2-mercaptoethanol It was subjected to electrophoresis and its molecular weight was estimated from the relative mobility with the standard protein. As a result, the molecular weight was about 272,000 by gel filtration and about 68,000 by SDS-polyacrylamide electrophoresis.
[Molecular weight measurement conditions by gel filtration]
Column: TSK-G3000SW (7.8 mm × 30 cm) (manufactured by Tosoh Corporation)
Eluent: 0.1 M phosphate buffer + 0.3 M sodium chloride (pH 7.0)
Flow velocity: 1.0ml / min
Temperature: Room temperature detection: 220nm
5.各種化合物の影響
エタノールを1.05%(w/v)濃度、更に表5に示す化合物を1.05mM濃度になるように添加した表2に示す酵素活性測定用発色液0.95mlに精製酵素液0.05mlを添加し、30℃で反応を行い、555nmの吸光度の増加を分光光度計にて連続して測定し、時間あたりの555nmの増加量を算出し、活性を調べた。
その結果、表5に示すように、本酵素は、ヒドラジン、フェニルヒドラジン、シアン化カリウムで強く阻害され、ヒドロキシアミンでも阻害された。そしてキレート化合物で若干活性化されることが明らかになった。
5). Effect of various compounds Purified enzymes were added to 0.95 ml of the coloring solution for enzyme activity measurement shown in Table 2, to which ethanol was added at a concentration of 1.05% (w / v) and the compounds shown in Table 5 to a concentration of 1.05 mM. 0.05 ml of the solution was added, the reaction was carried out at 30 ° C., and the increase in absorbance at 555 nm was continuously measured with a spectrophotometer, the increase in 555 nm per hour was calculated, and the activity was examined.
As a result, as shown in Table 5, this enzyme was strongly inhibited by hydrazine, phenylhydrazine and potassium cyanide, and also inhibited by hydroxyamine. And it became clear that it was activated a little with a chelate compound.
6.最適pH
エタノールを1.05%(w/v)濃度になるように添加し、緩衝液の種類を変更してpH5.5からpH8.5で調製した表2に示す酵素活性測定用発色液0.95mlに精製酵素液0.05mlを添加し、30℃で反応を行い、555nmの吸光度の増加を分光光度計にて連続して測定し、時間あたりの555nmの増加量を算出し、活性を調べた。
その結果、図1に示すように、本酵素は酸性領域から弱アルカリ性領域の広い範囲で活性を示し、反応の最適pHは5.5−7.0であった。
6). PH optimum
Ethanol was added to a concentration of 1.05% (w / v), and the type of buffer solution was changed to 0.95 ml of the coloring solution for enzyme activity measurement shown in Table 2 prepared from pH 5.5 to pH 8.5. 0.05 ml of purified enzyme solution was added to the sample, reacted at 30 ° C., and the increase in absorbance at 555 nm was continuously measured with a spectrophotometer, the increase in 555 nm per hour was calculated, and the activity was examined. .
As a result, as shown in FIG. 1, this enzyme showed activity in a wide range from an acidic region to a weakly alkaline region, and the optimum pH of the reaction was 5.5 to 7.0.
7.最適温度
エタノールを1.05%(w/v)濃度になるように添加した表2に示す酵素活性測定用発色液0.95mlに精製酵素液0.05mlを添加し、25℃から60℃の範囲で反応を行い、555nmの吸光度の増加を分光光度計にて連続して測定し、時間あたりの555nmの増加量を算出し、活性を調べた。
その結果、図2に示すように、本酵素は測定したいずれの温度でも活性を示し、反応の最適温度は50−55℃付近であった。
7). 0.05 ml of the purified enzyme solution was added to 0.95 ml of the coloring solution for enzyme activity measurement shown in Table 2 to which ethanol was added at the optimum temperature of 1.05% (w / v), and the temperature was adjusted to 25 to 60 ° C. The reaction was performed in the range, and the increase in absorbance at 555 nm was continuously measured with a spectrophotometer, the increase in 555 nm per hour was calculated, and the activity was examined.
As a result, as shown in FIG. 2, this enzyme showed activity at any measured temperature, and the optimum temperature for the reaction was around 50-55 ° C.
8.pH安定性
pH5.5からpH8.5で酵素液を40℃、20分間加温する前処理を行った。
その後、エタノールを1.05%(w/v)濃度になるように添加した表2に示す酵素活性測定用発色液0.95mlに上記前処理後の酵素液0.05mlを添加し、30℃で反応を行い、555nmの吸光度の増加を分光光度計にて連続して測定し、時間あたりの555nmの増加量を算出し、残存する酵素活性を調べた。各処理後の残存活性(前処理前の活性に対する各処理後の相対活性:前処理前の活性を100とした)を図3に示す。
上記の酵素活性測定法を用いて、残存酵素活性を測定した。その結果、図3に示すように、酵素活性は、酸性領域からアルカリ性領域の広い範囲で残存しており、特にpH6.5からpH8.5の範囲では、90%以上の活性が残存した。よって、本酵素は、微酸性領域からアルカリ性の領域領域の広い範囲で安定であることが明らかになった。
8). pH stability Pretreatment was carried out in which the enzyme solution was heated at 40 ° C. for 20 minutes at pH 5.5 to pH 8.5.
Thereafter, 0.05 ml of the enzyme solution after the above pretreatment was added to 0.95 ml of the coloring solution for enzyme activity measurement shown in Table 2 to which ethanol was added to a concentration of 1.05% (w / v), and 30 ° C. The increase in absorbance at 555 nm was continuously measured with a spectrophotometer, the increase in 555 nm per hour was calculated, and the remaining enzyme activity was examined. FIG. 3 shows the residual activity after each treatment (relative activity after each treatment relative to the activity before pretreatment: the activity before pretreatment is taken as 100).
Residual enzyme activity was measured using the enzyme activity measurement method described above. As a result, as shown in FIG. 3, the enzyme activity remained in a wide range from the acidic region to the alkaline region, and in particular, in the range from pH 6.5 to pH 8.5, 90% or more of the activity remained. Therefore, it was revealed that this enzyme is stable in a wide range from a slightly acidic region to an alkaline region.
9.熱安定性
pH7.0で酵素液を0℃〜60℃,20間加温する前処理を行った後、上記pH安定性と同様な方法で、残存酵素活性を測定した。その結果、図4に示すように、40℃では90%以上の酵素活性が残存しており、50℃でも約60%以上の酵素活性が残存していた。
9. After pretreatment of heating the enzyme solution at 0 to 60 ° C. for 20 hours at a heat stability of pH 7.0, the residual enzyme activity was measured by the same method as the above pH stability. As a result, as shown in FIG. 4, 90% or more of the enzyme activity remained at 40 ° C., and about 60% or more of the enzyme activity remained even at 50 ° C.
(実施例5)粗酵素液を用いたグリコールアルデヒドの合成
実施例2記載の方法で得たAIU 031株培養液150mlから集菌した菌体を20mMリン酸緩衝液5mlに懸濁し、10℃以下の温度で0.5mmガラスビーズを用いて10分間(2分×5回)細胞破砕した。この細胞破砕液を遠心分離して菌体残渣を除去し、上清分画を粗酵素液として得た。得られた粗酵素液0.8mlに10Mエチレングリコール水溶液0.1ml、5,000U/mlカタラーゼ(Bovive Liver由来;ナカライ社製)溶液0.1mlを添加し、試験管中で28℃、10時間、振盪し、反応を行った。その後、得られた反応液をIsobe and Nishiseの方法[Biosci.Biotech.Biochem.,58,170−173,(1994)]で高速液体クロマトグラフィーにより分析した。その結果、反応液中に45mMのグリコールアルデヒドが生成していた。
(Example 5) Synthesis of glycol aldehyde using crude enzyme solution The cells collected from 150 ml of AIU 031 strain culture obtained by the method described in Example 2 were suspended in 5 ml of 20 mM phosphate buffer. The cells were disrupted with 0.5 mm glass beads at a temperature of 10 ° C. or lower for 10 minutes (2 minutes × 5 times). The cell lysate was centrifuged to remove cell residue, and a supernatant fraction was obtained as a crude enzyme solution. To 0.8 ml of the obtained crude enzyme solution, 0.1 ml of a 10M ethylene glycol aqueous solution and 0.1 ml of a 5,000 U / ml catalase (derived from Bovive Liver; manufactured by Nakarai) solution were added, and the mixture was 28 ° C. for 10 hours in a test tube. The reaction was carried out by shaking. Thereafter, the obtained reaction solution was subjected to the method of Isobe and Nishise [Biosci. Biotech. Biochem. 58, 170-173, (1994)] by high performance liquid chromatography. As a result, 45 mM glycolaldehyde was produced in the reaction solution.
(実施例6)精製酵素を用いたグリコールアルデヒドの合成
実施例3で得た精製酵素0.1U、エチレングリコール0.1M、カタラーゼ(Bovive Liver由来;ナカライ社製)500Uを含む100mMリン酸緩衝液(pH7.0)1mlを試験管に加え、30℃、5時間、振盪し、反応を行った。その後、得られた反応液を高速液体クロマトグラフィーにより分析した。その結果、反応液中に27mMのグリコールアルデヒドが生成していた。
(Example 6) Synthesis of glycol aldehyde using purified
Claims (11)
(1)作用:
酸素存在下、エチレングリコールに作用し、グリコールアルデヒドと過酸化水素を生成する。
(2)基質特異性:
メタノール、エタノール、1−プロパノール、1−ブタノール、1−ペンタノール、2−メトキシエタノール、2−メチル−2−ブタノール、及び、エチレングリコールに対して活性を示し、1,2−プロパンジオール、1,3−プロパンジオール、及び、グリセロールには実質的に活性を示さない。 An oxidase having the following properties (1) and (2).
(1) Action:
Acts on ethylene glycol in the presence of oxygen to produce glycolaldehyde and hydrogen peroxide.
(2) Substrate specificity:
Active against methanol, ethanol, 1-propanol, 1-butanol, 1-pentanol, 2-methoxyethanol, 2-methyl-2-butanol and ethylene glycol, 1,2-propanediol, 1, 3-propanediol and glycerol have substantially no activity.
(3)基質特異性:グリコールアルデヒドには実質的に活性を示さない。 Furthermore, the oxidase of Claim 1 which has the property of following (3).
(3) Substrate specificity: substantially no activity for glycolaldehyde.
(4)作用最適pH:5.5−7.0。
(5)作用最適温度:50−55℃。 Furthermore, the oxidase in any one of Claims 1-2 which has the property of following (4) and (5).
(4) Optimum pH of action: 5.5-7.0.
(5) Optimum temperature of action: 50-55 ° C.
(6)分子量:ゲル濾過分析で2.7×105、SDS−ポリアクリルアミド電気泳動分析において6.8×104。
(7)pH安定性:pH6.5〜8.5で40℃、20分間加温する前処理を行った後、90%以上の活性が残存する。
(8)阻害剤:ヒドロキシアミン、フェニルヒドラジン、及び、ヒドラジンにより阻害される。 Furthermore, the oxidase in any one of Claims 1-3 which has the property of following (6), (7) and (8).
(6) Molecular weight: 2.7 × 10 5 in gel filtration analysis, 6.8 × 10 4 in SDS-polyacrylamide electrophoresis analysis.
(7) pH stability: 90% or more of the activity remains after pretreatment of heating at 40 ° C. for 20 minutes at pH 6.5 to 8.5.
(8) Inhibitor: Inhibited by hydroxyamine, phenylhydrazine and hydrazine.
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2006
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