JP2007222166A - 高速微生物学的解析方法 - Google Patents

Abstract

【課題】
簡単かつ使用のために便利であると同時に、解析結果の信頼性を増加させる高速微生物学的解析方法を提供する。
【解決手段】
ＡＴＰの存在を表す試薬を選択するステップと、前記微生物のＡＴＰを前記試薬に対してアクセス可能にするように前記微生物に作用するステップと、ＡＴＰの存在を表すように構成された前記試薬を前記支持体上に被着させるステップと、前記試薬に対する前記支持体の応答を検知するステップとを含み、前記方法は、前記微生物に作用するステップの前に、前記支持体上に存在する不必要なＡＴＰを消費するように構成された試薬を選択するステップと、連続的に、前記支持体上のＡＴＰを消費するように構成された前記試薬を被着させるステップと、不必要なＡＴＰが消費され終わったとき、ＡＴＰを消費するように構成された前記試薬を除去するステップとを含む前処理ステップを含む。
【選択図】図７

Description

本発明は、高速微生物学的解析方法に関する。

現在、産業および医療活動を背景に、液体、気体または表面の微生物学的品質をチェックすることは、厳格な基準に従わなければならない。

このため、産業および健康および安全の専門家は、適切な時期および最小のコストで改善措置を適用することができるように、できる限り迅速に微生物学的な汚染を検知するためのツールにアクセスしなければならない。

実用上、微生物学的な監視は、マイクロポーラス膜上で収集された微生物が、裸眼で見ることができるようになるまでその上で培養されるゲル媒体上で実施される。

培養時間は、微生物によって様々であるが、一般に少なくとも２４時間であり、ゆっくりと成長する微生物（たとえばミコバクテリア）に対して、または微生物がそれらの環境条件によってストレスを受けたことにより、それよりも長いことがある。

検知を高速化するために一方法は、微生物の検知を、微生物の代謝活動を基礎とすることによって、最小培養時間を減少させることである（またはある微生物の場合、培養時間を完全になくすことさえもある）。

生きている微生物に含まれる、普遍的な代謝マーカー、通常アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）が、発光によってＡＴＰの存在を表すために生物発光試薬と接触させることによって測定され、それによって、コロニーがゲル媒体上に形成し、裸眼で見られるようになるのを待つ必要なく、微生物の存在が検知されることができる。

放出される光の量は、ＡＴＰの質量、およびしたがって微生物の数の関数である。

試液内に生存している微生物の数を計数するための方法は、特に、欧州特許第０ ５２９ ０８４号からすでに知られており、この方法は、
溶液内に含まれる生存している微生物を保持するためにマイクロポーラス膜を通って溶液を濾過するステップと、
微生物のＡＴＰを、後で噴霧される、発光によってＡＴＰの存在を表す試薬へアクセス可能にするように構成された薬剤を噴霧するステップと、
次にその試薬を膜上に噴霧するステップと、
試薬の被着に応答して放出される光の量から微生物の存在を検知するステップとを含む。
欧州特許第０ ５２９ ０８４号明細書 米国特許出願公開第２００４／００９４７３号明細書 欧州特許出願公開第０８０３５７７号明細書 欧州特許出願公開第０７８１８５１号明細書 米国特許第５ ７６６ ８６８号明細書

本発明は、簡単かつ使用のために便利であることを維持すると同時に、このような解析の結果の信頼性を増加させることを目的とする。

この目的のために、本発明は、ＡＴＰの存在を表すように構成された試薬を選択するステップと、
前記微生物のＡＴＰを前記試薬に対してアクセス可能にするように前記微生物に作用するステップと、
ＡＴＰの存在を表すように構成された前記試薬を支持体上に被着させるステップと、
前記試薬に対する前記支持体の応答を検知するステップとを含む
微生物を保持するように構成された前記支持体の高速微生物学的解析方法であって、
前記微生物に作用するステップの前に、
前記支持体上に存在する不必要なＡＴＰを消費するように構成された試薬を選択するステップと、連続的に、
前記支持体上のＡＴＰを消費するように構成された前記試薬を被着させるステップと、
不必要なＡＴＰが消費され終わったとき、ＡＴＰを消費するように構成された前記試薬を除去するステップと
を含む前処理ステップを含むことを特徴とする方法を提案する。

前処理ステップは、支持体上に存在する不必要なＡＴＰ、すなわち、微生物に由来せず、解析される予定の生成物内に含まれるかまたは外部の汚染の結果生じることがある（たとえば支持体の製造もしくは輸送中、または濾過ステップ中に生じる）ＡＴＰを除去する。

微生物のＡＴＰは、微生物の細胞壁によって前処理中試薬の作用から保護されるため、微生物のＡＴＰが消費されることなく、不必要なＡＴＰが試薬によって消費される。

微生物のＡＴＰが、発光によってＡＴＰを表すための試薬とその後で接触することができるように微生物が処理されるのは、この試薬を除去した後のみである。

前処理が不必要なＡＴＰを除去するため、微生物に由来するＡＴＰのみが、処理中に解析されることになり、「擬陽性」の検知（微生物の存在の誤検知）のリスクがかなり低減される。

製造および使用の簡略化および簡便化の理由で好ましい本発明の特徴によると、
ＡＴＰを消費するように構成された前記試薬を被着させる前記ステップが、前記試薬を前記支持体上に噴霧する少なくとも１つのステップを含む。

上記で示されたのと同じ理由で好ましい本発明の他の特徴によると、
前記微生物に作用する前記ステップが、前記微生物の細胞溶解のステップを含み、
ＡＴＰを消費するように構成された前記試薬を選択する前記ステップ、および前記試薬を被着させる前記ステップは、前記試薬を除去する前記ステップおよび細胞溶解の前記ステップが前記支持体を加熱する単一のステップによって達成されるように構成されている。

驚くことに、不必要なＡＴＰを消費する試薬が、微生物の細胞溶解が行われる前に加熱することによって全体的に除去されるため、支持体を加熱することによって試薬を除去すること、および微生物の細胞溶解を行うことが、まだ除去されていない試薬と微生物のＡＴＰの間に生じる顕著な相互作用なしで、単一のステップで可能である。このことは、不必要なＡＴＰを消費する試薬が、微生物の細胞溶解が行われる前に加熱することによって全体的に除去されるという事実によって説明される。微生物のＡＴＰは、試薬を除去した後にのみ解放される。

上記で示したのと同じ理由で好ましい本発明の他の特徴によると、
前記加熱するステップが、５０℃から１５０℃までの値にまで加熱温度を上昇させるステップを含み、
前記加熱するステップが、７０℃から１００℃までの値にまで加熱温度を上昇させるステップを含み、
前記支持体がマイクロ波によって加熱され、
前記微生物に作用する前記ステップが、前記微生物を透過可能にするステップを含み、
前記微生物を透過可能にする前記ステップが、前記微生物を透過可能にするように構成された試薬を前記支持体上に噴霧するステップを含み、
ＡＴＰの存在を表すように構成された前記試薬が、発光によってＡＴＰを表すように構成された試薬から選択され、
ＡＴＰを消費するように構成された前記試薬が、発光によってＡＴＰを表すように構成された試薬から選択され、
かつ／または、
ＡＴＰを消費するように構成された前記試薬を前記支持体上に被着させる前記ステップが、
前記試薬を噴霧するステップと、
前記試薬を不必要なＡＴＰと接触させた結果として放出される光の量を前記噴霧ステップ中に測定するステップと、
前記測定された光の量が所定の閾値を下回ると直ちに前記噴霧ステップを停止するステップとを含む。

ＡＴＰを消費する試薬が発光によってＡＴＰの存在を表す試薬である場合、不必要なＡＴＰとそれを消費する試薬を接触させることが、無視できない量の不必要なすなわち消費されていないＡＴＰが支持体上に残存するかどうかを示す光の放出を生じさせる。したがって、噴霧中に放出される光の量を測定することによって、不必要なＡＴＰのすべてを消費するために支持体上に噴霧されるべき試薬の適切な量を正確に計測することが可能である。

上記に示したのと同じ理由で好ましい本発明の他の特徴によると、
ＡＴＰの存在を示すように構成された前記試薬およびＡＴＰを消費するように構成された前記試薬が、ルシフェリン−ルシフェラーゼをベースにし、
ＡＴＰの存在を示すように構成された前記試薬およびＡＴＰを消費するように構成された前記試薬が、同一であり、
前記検知ステップが、
前記被着ステップが実行される時間ｔ_０の前の時間ｔ_１から、前記時間ｔ_０の後の時間ｔ_２の関数として、前記支持体によって放出される光の量を記録するステップと、
前記記録された光の量から、前記試薬の被着なしで前記時間ｔ_１から前記時間ｔ_２までに前記支持体によって放出されるであろう時間の関数としての光の量を外挿するステップと、
前記記録された光の量から、および前記外挿された光の量から、前記試薬がＡＴＰと接触した結果としてのみ前記時間ｔ_０から始まる時間の関数として、放出される光の量を表す一組の値を決定するステップとを含み、
前記一組の値を決定する前記ステップが、前記記録された光の量と前記外挿された光の量の間の差を決定するステップを含み、
前記一組の値を決定するステップの後、検知ステップが、
前記一組の値を時間の関数として積分するステップと、
微生物の存在を推論するためにその積分の結果を所定の値と比較するステップと
をさらに含み、
かつ／または、
前記一組の値を決定するステップの後、検知ステップが、
前記一組の値の最大値を選択するステップと、
微生物の存在を推論するためにその選択の結果を所定の値と比較するステップと
をさらに含み、かつ／または、
前記支持体がマイクロポーラス膜である。

本発明の特徴および利点は、好ましいがそれに限定されない例として、かつ添付の図面を参照にして与えられる以下の説明から明らかになるであろう。

フィルタユニット１５の高速解析装置１は、噴霧ステーション２、細胞溶解ステーション３および光測定ステーション４を備える。

噴霧ステーション２および測定ステーション４は互いに向かい合い、細胞溶解ステーション３は、ステーション２および４の近傍にある。

噴霧ステーション２は、パイプ２２によってフラスコ（図示せず）と接続された噴霧ノズル２１を備える。

噴霧ノズル２１は、円錐形のヘッド２５を有し、かつプレート２３を用いて装置の枠（図示せず）に固定されている。

パイプ２２がそれと接続されているフラスコは、水、ルシフェリン−ルシフェラーゼ複合体およびマグネシウムをベースとした、発光によってＡＴＰの存在を示すための試薬を含む。フラスコは、フラスコ内に含まれる試薬の初期容積、試薬の使用期限、またはフラスコ内の試薬の残りの量を使用して実施されることができるサイクル数などの試薬に関する情報を保持するＲＦＩＤチップを担持している。

細胞溶解ステーション３は、ほぼ平行六面体形状の包囲物３０および、包囲物３０の内部のアンテナ（見えていない）と同軸ケーブル（図示せず）によって接続されたマグネトロン３１（図１でその電子制御パネルを備えて示されている）を備える。

ノズル２１のプレート２３と同様に、マグネトロン３１およびその制御パネルは、装置の枠（図示せず）上に装着されている。

包囲物３０は、上側包囲物本体２８、下側包囲物本体２９およびＵ字型断面クランプ３２を備える。

各包囲物本体は、ほぼ平行六面体形状であり、かつ開いた面を有する。

包囲物本体２８（それぞれ２９）は、その開いた面の周囲に、横方向に包囲物本体の残りの部分へ接続された矩形輪郭フランジ４１（それぞれ４２）を有する。

Ｕ字型クランプ３２は、横方向の小さい分岐４５によって互いに接続された２つの大きな分岐４３を有する。

組み立てられた状態では、各フランジ４１、４２は、包囲物本体２８および２９の開いた面が互いに向かい合って配置されるように、クランプ３２の分岐と協働する。

包囲物３０の包囲物本体２８、２９およびクランプ３２は、マグネトロン３１が、包囲物３０によって画定された空洞内で定常波を生成するような寸法を有する。

組み立てられた状態では、分岐４３の間およびフランジ４１と４２の間の、分岐４５に対向する包囲物の側面上の空間は、窓３９によって噴霧ステーション２および測定ステーション４に向かう方向に開いている。

窓３９の近傍に、マグネトロン３１によって発生される電磁干渉から噴霧ステーション２および測定ステーション４を隔離するために、この窓を遮蔽するためのフラップ６８がある。

測定ステーション４は、テーブル５１および閉鎖部材５２を通過する光電子増倍管５０を備える（図６）。

光電子増倍管５０は、Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｔｕｂｅ ９２６６Ｂ光電子増倍管である。

閉鎖部材５２は、図６に詳細に示されており、不透明プレート５３、ロッド５６、クランク５５およびモータ５４を備える。

プレート５３は、可動であり、テーブル５１内に形成された空洞内に収容され、かつロッド５６によってクランク５５と接続されている。

装置１はまた、プレート１２およびリム９を有する台車５を備える（図２から４）。プレート１２は、２本のねじ７によってリム９に固定されている（図１）。

プレート１２内の円筒形のオリフィスが、プレートの各側面上に開いている。

このオリフィスは、プレート１２の各側面に対してくぼんでいる環状のフランジ１３によって側面を守られている。

光電子増倍管５０に面するプレート１２の側面上のくぼみが、ガラス窓１７を収容する。

フィルタユニット１５は、２つの対向する面１０および１１を有するマイクロポーラス膜１９の周囲の本体１８を備える。

台車５上のリム９は、ねじ８によりリムに固定されたベルト６４によって、かつ１組のプーリ６２、６３および６７によって、クランプ３２の分岐４５の近傍の包囲物３０の外側に位置されたモータ６５（図１および２）と接続されている。

プーリ上に巻きつけられるように構成されているばかりでなく、ベルト６４は、ベルトが推進力を伝達することを可能にする曲げ抵抗をベルトに与える曲線状の部画を有する。

ベルト６４は、クランプ３２の小さい分岐４５内に形成された窓３９および長円形の孔４６によって包囲物３０と交差する（図２から４）。

台車５は、受け位置（図１および２）、第１の処理位置（図３、５および６）および第２の処理位置（図４）の間で台車を移動させるためにベルトに固定されている。

装置１はまた、モータ６５の反対側の側面上に窓６０、および、窓が閉鎖されたときに窓６０が軽く密封するように構成されたキャップ６１を備える。

受け位置では、キャップ６１が開き、プレート１２が、窓６０を通って装置から突き出す。

第１の処理位置では、台車５がノズル２１と光電子増倍管５０の間にあり、その結果、この位置では、噴霧ステーション２は膜１９の面１０に面してそれと位置合わせされるが、測定ステーション４は窓１７を通る膜の面１１に面してそれと位置合わせされる。

ベルト６４は、受け位置および第１の処理位置で包囲物３０を完全に通過する。

第２の処理位置では、膜１９がこの包囲物の完全に内部にあり、かつリム９がフランジ４１と４２の間にあるように、台車５は、細胞溶解ステーション３の包囲物３０の内部にある。

様々な処理ステーションでのセンサ、特に試薬を含むフラスコの横のＲＦＩＤリーダ／ライタ、複数の台車位置センサおよび複数の温度センサ（たとえば光電子増倍管およびマグネトロン用）が、装置の動作状態を監視する。

噴霧ステーション２、細胞溶解ステーション３、測定ステーション４、モータ５４および６５および様々なセンサは、図１０のブロック図に示されるように、マイクロコンピュータ８２と接続されている。

マイクロコンピュータ８２は、解析サイクルを開始または停止するための命令を実行し、マンマシンインターフェイス８５を介してオペレータからの命令を受け、かつ光電子増倍管から来るデータをメモリ内に保管するように、特に構成されている。マイクロコンピュータ８２はまた、オペレータのために意図された情報（たとえば、現在のサイクルの進行状況、フラスコ内でまだ使用可能なサイクルの数、前の解析の結果ならびに様々な装置警報および維持管理記録）をスクリーン８３上に表示するように、かつ／またはラベルプリンタ８４を介して印刷するように構成されている。

装置１の動作が、次に説明される。

解析サイクルを実行する前に、オペレータは、フィルタユニット１５のマイクロポーラス膜１９上の、液体または気体内または表面上に存在するかもしれないいずれかの微生物を収集する。

フィルタユニットの本体１８と協働する適切なプレート１２を選択し、かつそれをリム９上に羅合した後、オペレータは次に、フィルタユニット１５を可動台車５（このときは、図１および２に示される受け位置にある）上に配置し、それをフランジ１３に対して中央に配置する。そのときユニット１５の本体１８の下端部は、このフランジの上にある。

マンマシンインターフェイスを使用して、オペレータは次に、膜解析サイクルの開始を命令する。

特に、オペレータは、３つの異なるサイクル、すなわち、前処理のないサイクル（このサイクルは、もちろんここに説明された本発明に関連せず、完全を期すためのみに言及される）、「手動の」前処理サイクルおよび自動前処理サイクルから選択する。

手動の前処理サイクルの様々なステップが、次に説明される。

最初に、制御モジュールが、可動台車５を並進方向に移動させるために、プーリ６２、６３および６７を旋回させるようにモータ６５を動かす。

このことは、台車を、噴霧モジュール２と測定モジュール４の間でその受け位置からその第１の処理位置（図３）へ移動させる。この移動中、台車５の全体が窓６０を通過し終えたとき、ばね負荷された装置のキャップ６１が閉じ、次のステップが、包囲された暗い環境内で実行される。

第１の処理位置では、ステーション２が、所定の容積の試薬を噴霧する。噴霧ノズル２１は、膜１９の全体にわたって一様にかつ規則的に試薬の微小飛沫を被着させるように設計されている。微小飛沫を噴霧することは、希釈のいかなる危険性も回避させるのに十分、被着される液体の容積を分割する。

したがって、試薬は、膜が保持している微生物ではなく、たとえば輸送または濾過中の外部の汚染に由来する膜上の不必要なＡＴＰと接触する。

試薬を不必要なＡＴＰと接触させることは、光を発生させる化学反応を生じさせ、不必要なＡＴＰを消費する。このようにして消費された不必要なＡＴＰは、解析サイクルの次のステップを妨害しないことになる。

試薬は、微生物のＡＴＰとは相互作用せず、微生物のＡＴＰはサイクルのこの段階では、微生物の細胞壁によって試薬からまだ保護されている。

試薬が噴霧され終わったとき、制御モジュールが、可動台車５を、細胞溶解ステーション３のマイクロ波空洞の内部の第２の処理位置を取るように、窓３９を通って包囲物３０内へ移動させるために、モータ６５を動かす。

台車５が包囲物３０内へ導入されたとき、ばね負荷されたフラップ６８が、包囲物３０を装置の残りの部分から隔離し、かつマイクロ波の放出によって生じる電磁干渉を最小化するために閉じる。

次に、マグネトロン３１が、入射波が、包囲物３０によって形成されるマイクロ波空洞内を伝播するように単一波場を放出する。定常波が、（包囲物３０の表面による入射波の反射の結果として）包囲物内で確立される。

窓３９および開口４６の近傍に位置されたフランジ４１および４２の部分もまた、これらの開口を通る磁場の漏出を最小化することを助ける。

マイクロ波場によって励起された、極性を持つ分子（特に、濾過後の膜内に含まれるかつ／または試薬の最初の噴霧の結果生じる水）が、膜１９を約９０℃の温度まで加熱する。

この温度で、まだ活性である試薬の割合（残留活性レベル）を時間の関数として示す図７の曲線７５によって示されるように、膜上の試薬は迅速に除去される。

この温度への曝露の６秒後、試薬の２０％が除去され、１５秒後、試薬の９０％が除去され、かつ１７秒後、すべての試薬が除去される。

微生物の細胞溶解反応速度は、この温度ではより遅い。図７の曲線７６および７７は、時間の関数としての、かつ２つのタイプの微生物（曲線７６の場合、サッカロマイセスセレヴィシエ、および曲線７７の場合、クリプトコッカス）に対しての細胞溶解を受ける微生物の割合を表している。試薬のすべてが除去されるときまでに少量の微生物しか細胞溶解を受けないことに留意されたい。

したがって、前に付着された試薬を除去し終わるときまで、大部分の微生物の細胞壁は細胞分解を受けない（したがって、微生物のＡＴＰはアクセス可能にされない）。したがって、微生物のＡＴＰの主な部分は試薬によって消費されない。

その上、温度の増加が、膜１９の部分的な乾燥に至り、加熱を試薬の除去において効果的にするため、試薬の除去が加速される。

マイクロ波加熱は、次のプロセスステップに影響を与える可能性がある残留熱を生成することなく、膜上に存在する水の量の関数であるエネルギーの必要な量のみの入力を呈する。

この加熱ステップの後、細胞分解を受けた微生物のＡＴＰは、解析されるためにアクセス可能になる。次に、モータ６５が、台車５を包囲物３０から外へ移動させて、第１の処理位置へ戻すように動かされ、その後、測定ステーションの閉鎖部材５２のモータ５４が、クランク５５を旋回させて、不透明プレート５３を光電子増倍管５０から離れた位置へ移動させるように動かされる（図３）。

次に、光電子増倍管が、光電子増倍管の「視野」内（ここでは膜１９およびそのすぐ周囲）に位置された材料から放出された、窓１７を通って光電子増倍管が受ける光の量を測定する。

閉鎖部材が解放されたときにマイクロコンピュータによって実行される操作が、図１１のフローチャートを参照して次に説明される。

操作９０では、時間ｔ_１（ここでは３０ｓ）から、時間ｔ_２（ここでは３００ｓ）まで、マイクロコンピュータが、光電子増倍管によって送信される測定データを記録する。

ｔ_１の後かつｔ_２の前の時間ｔ_０で（図８）、噴霧ステーション２が、光の量の記録を継続しながら、膜１９の全体にわたってフラスコ内に含まれる試薬の微小飛沫の第２の規則的は一様な被着を行う。

膜の厚さが薄いこと、およびこの目的のためにプレート１２内に形成されたオリフィスのため、光は、膜１９のおよびプレート１２の両側から放出される。

時間の関数として相対発光量（ＲＬＵ）で記録された光の量が、試薬が膜上に噴霧される時間に対応する時間ｔ_０まで規則的にかつ対数的に減少する光の量を示す、図８の曲線７８によって示されている。

この減少段階は、光電子増倍管の視野内に位置された材料による光子の自然の燐光放出による逆励起に対応する。

時間ｔ_０を超えると、試薬が、細胞分解ステップによってアクセス可能にされた微生物のＡＴＰと接触するため、光の放出の突然の遷移が生じる。

この突然の遷移の後、光の量は、再び対数的に減少する。

記録されたデータを使用して、マイクロコンピュータが、操作９１を行い、かつ、試薬が膜上に被着されていなかった場合に放出されたであろう光の量を、時間の関数として外挿する。

本例では、この操作は、ｔ_１（５０ｓ）からｔ_０（１００ｓ）までに記録されたデータに、かつｔ_３＝ｔ_０＋ｘ、からｔ_２（３００ｓ）までに記録されたデータから基づいており、ここでｘは、ｔ_３を過ぎると、試薬を追加することの影響が、無視できることが考慮されるように、ｔ_３がｔ_０から十分に離れているように選択される（ここではｔ_３＝２５０ｓ）。マイクロコンピュータが、記録されたデータから、曲線７８によって表される光の量として、ｔ_１からｔ_０までかつｔ_３からｔ_２まで全体的に変化する対数関数の係数を推論する。

本例では、この関数は、Ｑ（ｔ）＝−１６５１８．ｌｎ（ｔ）＋１２０３３４であり、図８の曲線７９によって表される。ここで、記録されたデータと、外挿された関数によるデータとの間の相関係数は、時間間隔［ｔ_１，ｔ_０］［ｔ_３，ｔ_２］で０．０９９９４である。

曲線７８および７９は、その下限が試薬が噴霧された時間ｔ_０（１００ｓ）である時間間隔の間で顕著に異なる（ここでは間隔［１００ｓ，１５０ｓ］）。

操作９２を用いて、マイクロコンピュータが次に、曲線７８および７９によってそれぞれ表される、記録されかつ外挿された光の量から、試薬と接触する微生物のＡＴＰのみから来る光の量を表す時間の関数としての一組の値を決定する。一組の値は、図９の曲線８０によって表される。

本例では、光の値の量が記録されたｔ_１からｔ_２の各時間に対して、マイクロコンピュータが、その値と、外挿関数Ｑ（ｔ）によって与えられた同じ時間の値との間の差を計算する。

この点同士の減算は、微生物のＡＴＰのみから来る光の量に対応する一組の値を得るために、不必要な発光背景雑音（「減少白色」）をデジタルでフィルタリングする。

背景雑音のフィルタリングは、保管条件（その影響は自然光の放出のために重要である）、膜上で被着または濾過される生成物の性質（その組成に応じてそれ自体光を放出する）、および実験解析条件（光の密封、熱の干渉、光電子増倍管の効率）の影響を除去する。

このようにしてフィルタリングされた光の量が次に、時間ｔ_１からｔ_２までで積分され（操作９３）、テスト（９４）が、この積分の結果を、ユーザーによって必要とされる微生物検知感受性に対応する閾値と比較する。

特に、この閾値の値は、微生物内に含まれるＡＴＰの質量が、微生物のタイプに応じて顕著に変化し得るため、検知される予定の微生物のタイプに応じて選択される。

この積分の結果が閾値を超える場合、この光を生じさせるＡＴＰが、膜上の微生物の存在によって生じると判断される。

逆に、この積分の結果が閾値を下回る場合、ＡＴＰは、微生物が膜上に存在する（または十分に多い量存在する）と考慮するのに十分な量存在しないと判断される。

マイクロコンピュータが次に、テスト９４の結果に応じて、操作９５または操作９６のいずれかを実行することによって装置のスクリーン上に適切な情報を表示する。

いったん解析が実行された後、制御モジュールが、台車５を第１の処理位置から受け位置へ移動させる。受け位置で、オペレータが、解析が完了したフィルタユニット１５を取り外し、解析される予定の次のユニットと交換することができる。

第１の処理位置での測定ステーション４および噴霧ステーション２の膜１９に対する配置は、光電子増倍管５０が、噴霧ステーションによって阻害されることなく、かつ噴霧ステーションを阻害することなく、膜１９にできる限り近くかつそれに対して横方向に配置されることを意味している。この配置は、最大の光を収集し、したがって光電子増倍管の検知感受性を最適化する。

さらに、薄い不透明プレートおよび遠隔開閉機構を有する閉鎖部材を使用して、光電子増倍管５０と膜１９の間の距離をさらに減少させ、このようにして検知感受性を増加させる。

装置の構成、前処理ステップ、および記録された光信号のデータ処理は、検知デバイスの感受性を極めて高くする。

上記の種類のデバイスは、１０フェムトグラムの周囲のみのＡＴＰの存在を検知することができる。

この感受性は、広範囲の微生物が検知されることができ、かつ膜上の単一の微生物の存在が培養なしで検知されることができることを意味している。

自動サイクルの場合に実行される前処理ステップが、次に説明される。

自動分析サイクルは、不必要なＡＴＰがすべて消費されていることを保証する。

消費されなかった不必要なＡＴＰの様々な量（曲線７８Ａの場合１７０ｆｇ、曲線７８Ｂの場合６６ｆｇ、曲線７８Ｃの場合５２ｆｇおよび曲線７８Ｄの場合１８ｆｇ）に対して時間ｔ_０で試薬を被着する前および後に記録された光の量を表す図１２では、消費されなかった不必要なＡＴＰが、大量に存在して、誤った解析（「擬陽性」の検知、膜は微生物を含まないが微生物の存在が検知される）を生じさせることがある。

したがって、不必要なＡＴＰのすべてを前処理ステップが消費したことを確認するサイクルをユーザーに提供することは、有用である。

微生物の細胞破壊を行う前に、台車５が第１の処理位置にあり、かつ試薬を噴霧するのと同時に、光電子増倍管５０が噴霧ステップ中に膜およびそのすぐ周囲によって放出された光の量を連続的に測定するように、閉鎖部材５２が解放される。マイクロコンピュータが、この測定値を、所定の閾値と比較し、光電子増倍管によって測定される光の量がその閾値を超えている限り、試薬の噴霧を継続する。

測定される光の量が閾値を下回ったとき、膜上にいまだに存在する不必要なＡＴＰの未消費の質量が無視できるようになったと判断されて、噴霧が停止される。台車が次に、解析サイクルを継続するために第２の処理位置へ移動する。

変形形態では、曲線８０によって表される光の量に対応する値のすべてを積分する代わりに、マイクロコンピュータが、その組から最大値を選択し、かつそれを所定の閾値と比較することができる。

さらなる変形形態は、膜が赤外線手段によって加熱されることである。

さらなる変形形態は、熱細胞分解のステップが、次に噴霧される発光によってＡＴＰを表すためにそれらが含むＡＴＰを試薬に対してアクセス可能にするために、微生物の化学的細胞分解を行うか、膜を微生物に対して透過可能にするかのいずれかで試薬を噴霧するステップによって代替されることである。

さらなる変形形態は、ＣＣＤカメラで光電子増倍管を代替することによって、または、何回か、一度に１つの基本領域で、膜を処理および／もしくは解析することによって、膜上の微生物を計数するために装置を使用することである。

本発明は、ここに説明され、示された実施形態に限定されず、そのいかなる変形実施形態も包含する。

フィルタユニットを受ける位置での装置の可動台車を示す高速微生物解析装置の透視図である。 台車の経路上の中央に配置された鉛直平面上でのこの装置の図１よりも大きい縮尺での断面透視図である。 図２と同様であるが、フィルタユニットの膜を処理するための第１の位置での可動台車を示す図である。 図２と同様であるが、フィルタユニットの膜を処理するための第２の位置での可動台車を示す図である。 図３よりも大きい縮尺での異なる角度での断面透視図である。 図３よりも大きい縮尺での異なる角度での断面透視図である。 濾過ユニットが含む膜が、９０℃の温度に加熱されたとき、膜上に前に被着された試薬の残留活性の比率、および膜上に存在する第１および第２のタイプの微生物の細胞分解の比率が、時間の関数としてどのように変化するかｗｐ、共通の時間目盛（横軸）および共通の割合目盛（縦軸）で示すタイミング図である。 発光によってＡＴＰの存在を表す試薬の被着前、被着中および被着後の、膜およびそのすぐ周囲によって放出される光と、試薬を被着させることなく放出されたであろう光の量とのの相対的な量を、共通の時間目盛（横軸）で示すタイミング図である。 図８と同様であるが、発光によってＡＴＰの存在を表すための試薬を膜上の微生物と接触させた結果としてのみ放出される光の量の隔離を示すタイミング図である。 装置のマイクロコンピュータを特に示す、装置のブロック図である。 装置の光電子増倍管によって供給されるデータに対してマイクロコンピュータによって行われる操作を示すフローチャートである。 発光によってＡＴＰの存在を表すための試薬の被着前、被着中および被着後での、異なる不必要なＡＴＰの初期量、膜およびそのすぐ周囲によって放出される光の量がどのように変化するかを、共通の時間目盛（横軸）で示すタイミング図である。

符号の説明

２ 噴霧器
３ マグネトロン
４ 光電子増倍管
１９ 支持体、マクロポーラス膜
８２ マイクロコンピュータ
８３ スクリーン
８４ ラベルプリンタ
８５ マンマシンインターフェイス
８６ ネットワーク
９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６ ステップ

Claims (19)

1. ＡＴＰの存在を表すように構成された試薬を選択するステップと、
   微生物のＡＴＰを前記試薬に対してアクセス可能にするように前記微生物に作用するステップと、
   ＡＴＰの存在を表すように構成された前記試薬を支持体（１９）上に被着させるステップと、
   前記試薬に対する前記支持体の応答を検知するステップとを含む
   微生物を保持するように構成された前記支持体（１９）の高速微生物学的解析方法であって、
   前記微生物に作用するステップの前に、
   前記支持体（１９）上に存在する不必要なＡＴＰを消費するように構成された試薬を選択するステップと、連続的に、
   前記支持体（１９）上のＡＴＰを消費するように構成された前記試薬を被着させるステップと、
   不必要なＡＴＰが消費され終わったとき、ＡＴＰを消費するように構成された前記試薬を除去するステップと
   を含む前処理ステップを含むことを特徴とする、方法。
2. ＡＴＰを消費するように構成された前記試薬を被着させる前記ステップが、前記試薬を前記支持体（１９）上に噴霧する少なくとも１つのステップを含むことを特徴とする、請求項１に記載の方法。
3. 前記微生物に作用する前記ステップが、前記微生物の細胞溶解のステップを含むことを特徴とする、請求項１または請求項２に記載の方法。
4. ＡＴＰを消費するように構成された前記試薬を選択する前記ステップ、および前記試薬を被着させる前記ステップは、前記試薬を除去する前記ステップおよび細胞溶解の前記ステップが前記支持体（１９）を加熱する単一のステップによって達成されるように構成されていることを特徴とする、請求項３に記載の方法。
5. 前記加熱するステップが、５０℃から１５０℃までの値にまで加熱温度を上昇させるステップを含むことを特徴とする、請求項４に記載の方法。
6. 前記加熱するステップが、７０℃から１００℃までの値にまで加熱温度を上昇させるステップを含むことを特徴とする、請求項５に記載の方法。
7. 前記支持体（１９）がマイクロ波によって加熱されることを特徴とする、請求項４から６のいずれか一項に記載の方法。
8. 前記微生物に作用する前記ステップが、前記微生物を透過可能にするステップを含むことを特徴とする、請求項１または請求項２のいずれかに記載の方法。
9. 前記微生物を透過可能にする前記ステップが、前記微生物を透過可能にするように構成された試薬を前記支持体（１９）上に噴霧するステップを含むことを特徴とする、請求項８に記載の方法。
10. ＡＴＰの存在を表すように構成された前記試薬が、発光によってＡＴＰを表すように構成された試薬から選択されることを特徴とする、請求項１から９のいずれか一項に記載の方法。
11. ＡＴＰを消費するように構成された前記試薬が、発光によってＡＴＰを表すように構成された試薬から選択されることを特徴とする、請求項１から１０のいずれか一項に記載の方法。
12. ＡＴＰを消費するように構成された前記試薬を前記支持体（１９）上に被着させる前記ステップが、
    前記試薬を噴霧するステップと、
    前記試薬を不必要なＡＴＰと接触させた結果として放出される光の量を前記噴霧ステップ中に測定するステップと、
    前記測定された光の量が所定の閾値を下回ると直ちに前記噴霧ステップを停止するステップとを含むことを特徴とする、請求項１１に記載の方法。
13. ＡＴＰの存在を示すように構成された前記試薬およびＡＴＰを消費するように構成された前記試薬が、ルシフェリン−ルシフェラーゼをベースにしていることを特徴とする、請求項１から１２のいずれか一項に記載の方法。
14. ＡＴＰの存在を示すように構成された前記試薬およびＡＴＰを消費するように構成された前記試薬が、同一であることを特徴とする、請求項１から１３のいずれか一項に記載の方法。
15. 前記検知ステップが、
    前記被着ステップが実行される時間ｔ_０の前の時間ｔ_１から、前記時間ｔ_０の後の時間ｔ_２の時間の関数として、前記支持体（１９）によって放出される光の量を記録するステップ（９０）と、
    前記記録された光の量から、前記試薬の被着なしで前記時間ｔ_１から前記時間ｔ_２までに前記支持体（１９）によって放出されるであろう時間の関数としての光の量を外挿するステップ（９１）と、
    前記記録された光の量から、および前記外挿された光の量から、前記試薬がＡＴＰと接触した結果としてのみ前記時間ｔ_０から始まる時間の関数として、放出される光の量を表す一組の値を決定するステップ（９２）とを含むことを特徴とする、請求項１０に記載の方法。
16. 前記一組の値を決定する前記ステップが、前記記録された光の量と前記外挿された光の量の間の差を決定するステップ（９２）を含むことを特徴とする、請求項１５に記載の方法。
17. 前記一組の値を決定するステップの後、検知ステップが、
    前記一組の値を時間の関数として積分するステップ（９３）と、
    微生物の存在を推論するためにその積分の結果を所定の値と比較するステップ（９４）と
    をさらに含むことを特徴とする、請求項１５または請求項１６のいずれかに記載の方法。
18. 前記一組の値を決定するステップの後、検知ステップが、
    前記一組の値の最大値を選択するステップと、
    微生物の存在を推論するためにその選択の結果を所定の値と比較するステップと
    をさらに含むことを特徴とする、請求項１５または請求項１６のいずれかに記載の方法。
19. 前記支持体がマイクロポーラス膜（１９）であることを特徴とする、請求項１から１７のいずれか一項に記載の方法。

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