JP2007212446A - Selectively bonding substance immobilizing carrier - Google Patents
Selectively bonding substance immobilizing carrier Download PDFInfo
- Publication number
- JP2007212446A JP2007212446A JP2007002503A JP2007002503A JP2007212446A JP 2007212446 A JP2007212446 A JP 2007212446A JP 2007002503 A JP2007002503 A JP 2007002503A JP 2007002503 A JP2007002503 A JP 2007002503A JP 2007212446 A JP2007212446 A JP 2007212446A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- selective binding
- binding substance
- carrier
- immobilized
- substance
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Images
Abstract
Description
本発明は、選択結合性物質固定化担体に関し、詳しくは、検体と選択的に結合する物質（本明細書において「選択結合性物質」という。）が固定化され、検体と選択結合性物質の反応による分析を行う際に用いうる選択結合性物質固定化担体、当該選択結合性物質固定化担体を含む分析用チップ、及び前記選択結合性物質固定化担体並びに前記分析用チップを用いた被検物質の分析方法、及び選択結合性物質固定化担体に関する。 The present invention relates to a selective binding substance-immobilized carrier. Specifically, a substance that selectively binds to a specimen (referred to as “selective binding substance” in this specification) is immobilized, and the specimen and the selective binding substance are immobilized. Selective binding substance-immobilized carrier that can be used for analysis by reaction, analytical chip including the selective binding substance-immobilized carrier, and test using the selective binding substance-immobilized carrier and the analytical chip The present invention relates to a substance analysis method and a selective binding substance-immobilized carrier.
各種生物の遺伝情報解析の研究が始められている。ヒト遺伝子をはじめとして、多数の遺伝子とその塩基配列、また遺伝子配列にコードされる蛋白質およびこれら蛋白質から二次的に作られる糖鎖に関する情報が急速に明らかにされつつある。配列の明らかにされた遺伝子、蛋白質、糖鎖などの高分子体の機能は、各種の方法で調べることができる。主なものとして、核酸は、ノーザンブロッティング、あるいはサザンブロッティングのように、各種の核酸／核酸間の相補性を利用した方法により、各種遺伝子とその生体機能発現との関係を調べることができる。一方、蛋白質は、ウエスタンブロッティングに代表される蛋白質／蛋白質間の反応を利用し蛋白質の機能および発現について調べることができる。 Research on genetic information analysis of various organisms has begun. Information on human genes and many other genes and their base sequences, proteins encoded by the gene sequences, and sugar chains that are secondarily produced from these proteins are rapidly being clarified. The functions of macromolecules such as genes, proteins, and sugar chains whose sequences have been clarified can be examined by various methods. Mainly, nucleic acids can be examined for the relationship between various genes and their biological function expression by a method utilizing complementarity between various nucleic acids / nucleic acids, such as Northern blotting or Southern blotting. On the other hand, the protein can be examined for the function and expression of the protein using a protein / protein reaction typified by Western blotting.
近年、多数の遺伝子発現を一度に解析する手法として、ＤＮＡマイクロアレイ法（ＤＮＡチップ法）と呼ばれる新しい分析法が開発され、注目を集めている。これらの方法は、いずれも、核酸／核酸間ハイブリダイゼーション反応に基づく核酸検出・定量法である点で原理的には従来の方法と同じである。これらの方法は、蛋白質／蛋白質間あるいは糖鎖／糖鎖間や糖鎖／蛋白質間の特異的な反応に基づく蛋白質や糖鎖検出・定量に応用が可能である。これらの技術は、マイクロアレイ又はＤＮＡチップと呼ばれるガラスの平面基板片上に、多数のＤＮＡ断片や蛋白質、糖鎖が高密度に整列固定化されたものが用いられている点に大きな特徴がある。ＤＮＡチップの具体的使用法としては、例えば、研究対象細胞の発現遺伝子等を蛍光色素等で標識したサンプルを平面基板片上でハイブリダイゼーションさせ、互いに相補的な核酸（ＤＮＡあるいはＲＮＡ）同士を結合させ、その箇所を高解像度検出装置（スキャナー）で高速に読み取る方法や、電気化学反応にもとづく電流値等の応答を検出する方法が挙げられる。このようして、サンプル中のそれぞれの遺伝子量を迅速に推定できる。また、ＤＮＡチップの応用分野は、発現遺伝子の量を推定する遺伝子発現解析のみならず、遺伝子の一塩基置換（ＳＮＰ）を検出する手段としても大きく期待されている。 In recent years, a new analysis method called a DNA microarray method (DNA chip method) has been developed and attracts attention as a method for analyzing many gene expressions at once. These methods are in principle the same as conventional methods in that they are nucleic acid detection / quantification methods based on a nucleic acid / nucleic acid hybridization reaction. These methods can be applied to the detection and quantification of proteins and sugar chains based on specific reactions between proteins / proteins or between sugar chains / sugar chains or between sugar chains / proteins. These technologies have a great feature in that a large number of DNA fragments, proteins, and sugar chains are aligned and fixed on a flat glass substrate called a microarray or DNA chip at a high density. As a specific method of using a DNA chip, for example, a sample in which a gene expressed in a cell to be studied is labeled with a fluorescent dye is hybridized on a flat substrate piece, and complementary nucleic acids (DNA or RNA) are bound to each other. There are a method of reading the part at high speed with a high resolution detection device (scanner) and a method of detecting a response such as a current value based on an electrochemical reaction. In this way, the amount of each gene in the sample can be quickly estimated. The application field of DNA chips is highly expected not only as a gene expression analysis for estimating the amount of expressed gene but also as a means for detecting single base substitution (SNP) of a gene.
ＤＮＡチップによる検出の際は、調製したＤＮＡを含む溶液（ＤＮＡ溶液）を、ＤＮＡチップ上の選択結合性物質と反応させることが必要であるが、このような反応をビーズを用いて促進させる方法も開発されている（例えば、特許文献１、特許文献２など）。しかしながら、いずれの方法もビーズが沈殿や偏りを起こしやすく、また、ビーズがＤＮＡを破損する危険がある、などといった問題点があり、反応を十分に促進させるものではなかった。
When detecting with a DNA chip, it is necessary to react a solution containing the prepared DNA (DNA solution) with a selective binding substance on the DNA chip. A method of promoting such a reaction using beads. Have also been developed (for example,
本発明は、前記課題を解決するもので、被検物質を含む溶液を、選択結合性物質固定化担体を密接してスポットした場合にも、被験物質を選択結合性物質に効率よく接触させることができ、被検物質と固定化された選択結合性物質との選択的な反応を簡便に且つ安定して行うことができる選択結合性物質固定化担体を提供することにある。 The present invention solves the above-mentioned problem, and even when a solution containing a test substance is spotted in close contact with a selective binding substance-immobilized carrier, the test substance is efficiently brought into contact with the selective binding substance. An object of the present invention is to provide a selective binding substance-immobilized carrier capable of easily and stably performing a selective reaction between a test substance and an immobilized selective binding substance.
上記課題を解決するため、本発明者らは鋭意検討を重ねた。その過程で、特開２００４−２６４２８９号公報に記載されている、選択結合性物質が凹凸部の複数の凸部に固定化される基板において、凹部に微粒子を移動可能に格納させ、これを揺動、回転等させることにより、被検物質を含む溶液を撹拌させ、固定化された選択結合性物質との選択的な反応を促進できることに着目した。 In order to solve the above problems, the present inventors have made extensive studies. In the process, in the substrate described in JP-A-2004-264289 on which the selective binding substance is fixed to the plurality of convex portions of the concave and convex portions, the fine particles are movably stored in the concave portions, and this is shaken. We focused on the fact that the solution containing the test substance can be stirred by moving, rotating, etc., and the selective reaction with the immobilized selective binding substance can be promoted.
しかし、上記特開２００４−２６４２８９号公報の基板において、凸部を等間隔に形成すると、凸部を密接して多数形成させる場合には、凹部のスペースを十分に取ることができず、非常に小さな微粒子しか用いることができず、撹拌を十分に行うことができなかった。 However, in the substrate of Japanese Patent Application Laid-Open No. 2004-264289, when the convex portions are formed at equal intervals, when a large number of the convex portions are formed in close contact with each other, a sufficient space for the concave portions cannot be taken. Only small fine particles could be used, and stirring could not be performed sufficiently.
そこで、本発明者らは、凸部の間隔を調整することにより、凸部を多数形成した場合にも凹部のスペースを確保することができ、凹部に比較的大きいサイズの微粒子やマイクロロッド（微細な棒状）を格納することも可能となり、撹拌効率を高めることができることを見出し、本発明に到達した。 Accordingly, the present inventors can secure the space of the concave portion even when a large number of convex portions are formed by adjusting the interval between the convex portions, and relatively small size particles or microrods (fine particles) are formed in the concave portion. It was also possible to store a large rod shape), and found that the stirring efficiency could be increased, and the present invention was reached.
本発明によれば、下記のものが提供される：
〔１〕 担体上に凹部及び凸部からなる凹凸部を有し、前記凹凸部を構成する複数の凸部の上面に選択結合性物質が固定化される担体であって、
前記凹凸部は、凸部がマトリクス状に形成された複数のサブブロック領域からなることを特徴とする選択結合性物質固定化担体。
〔２〕 前記凹凸部において、隣接するサブブロック領域間の凹部の幅が、サブブロック領域内の凹部の幅よりも広いことを特徴とする前記〔１〕に記載の選択結合性物質固定化担体。
〔３〕 サブブロック領域間の凹部の幅が、２００μｍ以上であることを特徴とする前記〔１〕または〔２〕に記載の選択結合性物質固定化担体。
〔４〕 前記凹凸部において、複数の凹部の深さを有することを特徴とする前記〔１〕〜〔３〕のいずれか一項に記載の選択結合性物質固定化担体。
〔５〕 前記凹凸部において、隣接するサブブロック領域間の凹部の深さが、サブブロック領域内の凹部の深さよりもよりも深いことを特徴とする前記〔１〕〜〔４〕のいずれか一項に記載の選択結合性物質固定化担体。
〔６〕 サブブロック領域間の凹部の深さが、凸部上面から凹部底面までの深さで１００μｍ以上であることを特徴とする前記〔１〕〜〔５〕のいずれか一項に記載の選択結合性物質固定化担体。
〔７〕 前記凹凸部において、凹部に微粒子またはマイクロロッドが移動可能に格納されていることを特徴とする前記〔１〕〜〔６〕のいずれか一項に記載の選択結合性物質固定化担体。
〔８〕 前記選択結合性物質固定化担体の凹凸部を有する表面に、平坦部が設けられてなることを特徴とする前記〔１〕〜〔７〕のいずれか一項に記載の選択結合性物質固定化担体。
〔９〕 前記選択結合性物質が、ＤＮＡ、ＲＮＡ、蛋白質、ペプチド、糖、糖鎖または脂質であることを特徴とする前記〔１〕〜〔８〕のいずれか一項に記載の選択結合性物質固定化担体。
〔１０〕 前記〔１〕〜〔９〕のいずれか一項に記載の選択結合性物質固定化担体の表面を覆い、前記選択結合性物質固定化担体と接着されたカバー部材を更に備え、前記選択結合性物質固定化担体と前記カバー部材との間に空隙を有し、前記カバー部材は前記空隙に連通する１つ以上の貫通孔を有することを特徴とする分析用チップ。
〔１１〕 前記〔１〕〜〔９〕のいずれか一項に記載の選択結合性物質固定化担体に、被検物質を接触させて選択的に結合させ、前記選択結合性物質固定化担体上に前記選択結合性物質を介して結合した前記被検物質量を測定することを特徴とする被検物質の分析方法。
〔１２〕 前記選択結合性物質固定化担体に被検物質を接触させるにあたり、前記選択結合性物質固定化担体と被検物質が含まれる溶液とを撹拌することを特徴とする前記〔１１〕に記載の分析方法。
〔１３〕 前記〔１０〕に記載の分析用チップに、前記貫通孔から被検物質をアプライし、前記カバー部材に封止部材を貼付して前記貫通孔を封止し、前記被検物質を前記分析用チップを構成する担体に選択的に結合させ、更に前記選択結合性物質固定化担体上に前記選択結合性物質を介して結合した前記被検物質量を測定することを特徴とする被検物質の分析方法。
〔１４〕 前記貫通孔から被検物質をアプライするにあたり、被検物質が含まれる溶液を貫通孔から注入するとともに、前記検体を前記分析用チップを構成する担体に選択的に結合させるにあたり、前記注入された溶液を撹拌することを特徴とする前記〔１３〕に記載の分析方法。
〔１５〕 前記〔１〕〜〔９〕のいずれか一項に記載の選択結合性物質固定化担体と、前記選択結合性物質固定化担体の表面を覆い前記選択結合性物質固定化担体と接着されたカバー部材と、前記カバー部材に貼付し前記貫通孔を封止する封止部材とを含むことを特徴とする分析用キット。
〔１６〕 前記〔１０〕に記載の分析用チップと、前記カバー部材に貼付し前記貫通孔を封止する封止部材とを含むことを特徴とする分析用キット。
According to the present invention, the following is provided:
[1] A carrier having a concavo-convex portion consisting of a concave portion and a convex portion on a carrier, and a selective binding substance immobilized on the upper surfaces of the plurality of convex portions constituting the concavo-convex portion,
The selective binding substance-immobilized carrier according to
[2] The selective binding substance-immobilized carrier according to [1], wherein in the concavo-convex portion, the width of the concave portion between adjacent sub-block regions is wider than the width of the concave portion in the sub-block region. .
[3] The selective binding substance-immobilized carrier according to [1] or [2] above, wherein the width of the recess between the sub-block regions is 200 μm or more.
[4] The selective binding substance-immobilized carrier according to any one of [1] to [3], wherein the uneven portion has a depth of a plurality of recessed portions.
[5] Any one of the above [1] to [4], wherein in the concavo-convex portion, the depth of the concave portion between adjacent sub-block regions is deeper than the depth of the concave portion in the sub-block region. The selective binding substance-immobilized support according to one item.
[6] Described in any one of [1] to [5], wherein the depth of the concave portion between the sub-block regions is 100 μm or more in depth from the upper surface of the convex portion to the bottom surface of the concave portion. Selective binding substance-immobilized carrier.
[7] The selective binding substance-immobilized carrier according to any one of [1] to [6], wherein in the concave and convex portion, fine particles or microrods are movably stored in the concave portion. .
[8] The selective binding property according to any one of [1] to [7], wherein a flat portion is provided on a surface of the selective binding substance-immobilized carrier having an uneven portion. Substance immobilization carrier.
[9] The selective binding substance according to any one of [1] to [8], wherein the selective binding substance is DNA, RNA, protein, peptide, sugar, sugar chain or lipid. Substance immobilization carrier.
[10] The method further comprises a cover member that covers the surface of the selective binding substance-immobilized carrier according to any one of [1] to [9], and is bonded to the selective binding substance-immobilized carrier. An analysis chip comprising a gap between the selective binding substance-immobilized carrier and the cover member, wherein the cover member has one or more through holes communicating with the gap.
[11] The selective binding substance-immobilized support according to any one of [1] to [9] is contacted and selectively bound to the test substance, and the selective binding substance-immobilized support A method for analyzing a test substance, comprising measuring the amount of the test substance bound to the selective binding substance via the selective binding substance.
[12] In the above [11], the selective binding substance-immobilized support and the solution containing the test substance are stirred when the test substance is brought into contact with the selective binding substance-immobilized support. Analysis method described.
[13] A test substance is applied to the analysis chip according to [10] from the through hole, a sealing member is attached to the cover member to seal the through hole, and the test substance is Selectively binding to a carrier constituting the analysis chip, and further measuring the amount of the test substance bound to the selective binding substance-immobilized support through the selective binding substance. Analytical method of the test substance.
[14] In applying the test substance from the through-hole, the solution containing the test substance is injected from the through-hole, and the sample is selectively bound to the carrier constituting the analysis chip. The analysis method according to [13], wherein the injected solution is stirred.
[15] The selective binding substance-immobilized support according to any one of [1] to [9], and the selective binding substance-immobilized support that covers the surface of the selective binding substance-immobilized support and adheres An analysis kit, comprising: a cover member formed on the cover member; and a sealing member attached to the cover member to seal the through hole.
[16] An analysis kit comprising the analysis chip according to [10], and a sealing member that is attached to the cover member and seals the through hole.
本発明によれば、核酸等のハイブリダイゼーションに代表される、被検物質と固定化された選択結合性物質との選択的な反応において、選択結合性物質を密接してスポットした場合にも、被験物質を選択結合性物質固定化担体上の選択結合性物質と効率よく接触させることができ、被検物質と固定化された選択結合性物質との選択的な反応を簡便に且つ安定して行うことができる。 According to the present invention, in a selective reaction between a test substance and an immobilized selective binding substance typified by hybridization of nucleic acid or the like, even when the selective binding substance is spotted closely, The test substance can be efficiently brought into contact with the selective binding substance on the selective binding substance-immobilized carrier, and the selective reaction between the test substance and the immobilized selective binding substance can be carried out easily and stably. It can be carried out.
本発明の選択結合性物質固定化担体は、担体上に凹部及び凸部からなる凹凸部を有し、前記凹凸部を構成する複数の凸部の上面に選択結合性物質が固定化される担体であって、前記凹凸部は、凸部がマトリクス状に形成された複数のサブブロック領域からなることを特徴とする。 The selective binding substance-immobilized carrier of the present invention has a concavo-convex part composed of a concave part and a convex part on the carrier, and the selective binding substance is immobilized on the upper surfaces of a plurality of convex parts constituting the concavo-convex part. And the said uneven | corrugated | grooved part consists of a some subblock area | region where the convex part was formed in matrix form.
本発明の選択結合性物質固定化担体は、その表面に、凹部及び凸部からなる凹凸部を有することが必要である。このような構造をとることにより、検出の際、非特異的に吸着した被検物質を検出することがないので、ノイズが小さく、結果的によりＳ／Ｎが良好な結果を得ることができる。ノイズが小さくなる具体的な理由は、以下の通りである。すなわち、凸部上端面に選択結合性物質を固定化した担体をスキャナーと呼ばれる装置を用いてスキャンすると、凹凸部の凸部上端面にレーザー光の焦点が合っていることから、凹部では、レーザー光がぼやけ、凹部に非特異的に吸着した検体の望まざる蛍光（ノイズ）を検出しがたいという効果があるためである。 The selective binding substance-immobilized carrier of the present invention needs to have a concavo-convex portion including a concave portion and a convex portion on the surface thereof. By adopting such a structure, a non-specifically adsorbed test substance is not detected at the time of detection, so that a noise is small and a result with a better S / N can be obtained as a result. The specific reason why the noise is reduced is as follows. That is, when a carrier having a selective binding substance immobilized on the upper surface of the convex portion is scanned using an apparatus called a scanner, the laser beam is focused on the upper surface of the convex portion of the concave and convex portions. This is because the light is blurred and it is difficult to detect undesired fluorescence (noise) of the specimen adsorbed nonspecifically in the concave portion.
上記凹凸部において、凸部は、マトリクス状に、すなわち、行方向及び列方向に配置される。このように凸部がマトリクス状に配置されることにより、凸部の間隙を構成する凹部がＸＹ方向に通路状に形成される。このような構成により、凹部に微粒子やマイクロロッドを格納した場合に、微粒子やマイクロロッドを移動可能な状態でかつ選択的結合性物質に接触させずに保持することができる。例えば、図１や図４に示す具体例で説明すると、凸部の列に挟まれた部分、或いは凹凸部と後述の平坦部との境界部分に凹部の列が形成され、凹部の列に格納された微粒子やマイクロロッドが前後左右方向に移動可能となる。なお、凸部の形状は、担体表面に凹凸部が形成される程度であれば良いが、特に円柱、角柱等の柱状であることが好ましく、特に円柱状であることが好ましい。 In the concavo-convex portion, the convex portions are arranged in a matrix, that is, in the row direction and the column direction. By thus arranging the convex portions in a matrix shape, the concave portions constituting the gaps of the convex portions are formed in a passage shape in the XY direction. With such a configuration, when fine particles or microrods are stored in the recesses, the fine particles or microrods can be held in a movable state without contacting the selective binding substance. For example, in the specific example shown in FIG. 1 or FIG. 4, a row of concave portions is formed in a portion sandwiched between rows of convex portions, or a boundary portion between an uneven portion and a flat portion described later, and stored in the row of concave portions. The fine particles and microrods thus made can move in the front-rear and left-right directions. Note that the shape of the convex portion is not limited as long as the concave and convex portion is formed on the surface of the carrier, but is preferably a columnar shape such as a cylinder or a prism, and particularly preferably a cylindrical shape.
本発明において、このような凹凸部は、上述のようにマトリクス状に形成された凸部が、複数のサブブロック領域からなることが必要である。すなわち、凹凸部においては、マトリックス状に形成されてなる凸部がエリア別に分割され、それぞれがサブブロック領域を構成している。
例えば、図１の例では、複数の凸部１１と、凸部間の凹部１０からなる凹凸部１２が複数のサブブロック領域Ｓ１、Ｓ２、Ｓ３・・・ ・・・Ｓ３２に分割されており、各サブブロック領域内において凸部１１はマトリックス状にＸＹ方向に形成されている。サブブロック領域のサイズは、凹凸部に設ける凸部の数、微粒子、マイクロロッドのサイズ等に応じて定めることができる。サブブロックの領域のサイズとしては、そのピッチが３８４マイクロタイタープレートのウェルの間隔に相当する４．５ｍｍを好ましく用いることができるが、これに制限されるものではない。
In the present invention, such a concavo-convex part requires that the convex part formed in a matrix as described above comprises a plurality of sub-block regions. That is, in the concavo-convex portion, the convex portions formed in a matrix are divided by area, and each constitutes a sub-block region.
For example, in the example of FIG. 1, the concavo-
凹凸部における凹部の幅は、担体上に設ける凸部の数、および、凸部の大きさによってほぼ決まるが、通常１０〜８００μｍ、好ましくは、５０〜２００μｍとすることができる。また、凸部を円柱状とする場合には、隣接する凸部の中心軸間の距離で５０〜１０００μｍ、好ましくは、１００〜５００μｍの範囲で適宜定めることができる。特に、サブブロック領域内外で凹部の幅を変更することが好ましく、中でも、隣接するサブブロック領域間の凹部の幅が、サブブロック領域内の凹部の幅よりも広くなるようにすると、微粒子の大きさやマイクロロッドの直径が制限されず、効率の良い撹拌が可能となるので好ましい。例えば、微粒子やマイクロロッドを移動させて溶液を撹拌する場合については、撹拌効率は、微粒子・マイクロロッドの直径が１００μｍ以上の場合が好ましい。よって、サブブロック領域間の凹部の幅は、１００μｍの微粒子・マイクロロッドが詰まらない程度の幅を持つことが好ましく、具体的にはその幅を、２００μｍ以上、好ましくは２００〜８００μｍ、特に２５０μｍ〜６００μｍとすることが好ましい。一方、サブブロック領域内の凹部の幅は、基板上に設ける凸部の数によって決まるが、５０〜４００μｍ、好ましくは５０〜１８０μｍとすることができる。 The width of the concave portion in the concavo-convex portion is substantially determined by the number of convex portions provided on the carrier and the size of the convex portion, but is usually 10 to 800 μm, preferably 50 to 200 μm. Moreover, when making a convex part into a column shape, it can determine suitably in the range of 50-1000 micrometers by the distance between the central axes of an adjacent convex part, Preferably, it is 100-500 micrometers. In particular, it is preferable to change the width of the recesses inside and outside the sub-block region. In particular, if the width of the recesses between adjacent sub-block regions is larger than the width of the recesses in the sub-block region, the size of the fine particles The diameter of the sheath is not limited, and efficient stirring is possible, which is preferable. For example, in the case of stirring the solution by moving fine particles or microrods, the stirring efficiency is preferably when the diameter of the microparticles / microrods is 100 μm or more. Therefore, the width of the recesses between the sub-block regions is preferably such that the 100 μm fine particles / microrods are not clogged. Specifically, the width is 200 μm or more, preferably 200 to 800 μm, particularly 250 μm to The thickness is preferably 600 μm. On the other hand, the width of the concave portion in the sub-block region is determined by the number of convex portions provided on the substrate, but can be 50 to 400 μm, preferably 50 to 180 μm.
一方、凹凸部における凹部の深さ、すなわち、凸部の上面から凹部の底面までの距離（高さの差）は、微粒子、マイクロロッドが円滑に移動可能な状態となるサイズを適宜設定することができるが、通常は、１０μｍ以上、５００μｍ以下が好ましく、５０μｍ以上、３００μｍ以下が特に好ましい。凸部の高さが１０μｍより低いと、スポット以外の部分の非特異的に吸着した検体試料を検出してしまうことがあり、結果的にＳ／Ｎが悪くなることがあるため好ましくない。また、凸部の高さが５００μｍより高いと、凸部が折れて破損しやすいなどの問題が生じる場合があり好ましくない。 On the other hand, the depth of the concave portion in the concavo-convex portion, that is, the distance (height difference) from the top surface of the convex portion to the bottom surface of the concave portion is appropriately set to a size that allows the fine particles and microrods to move smoothly. However, it is usually preferably 10 μm or more and 500 μm or less, particularly preferably 50 μm or more and 300 μm or less. If the height of the convex portion is lower than 10 μm, a non-specifically adsorbed specimen sample other than the spot may be detected, and as a result, the S / N may be deteriorated. On the other hand, when the height of the convex portion is higher than 500 μm, problems such as the convex portion being easily broken and broken may occur, which is not preferable.
本発明においては、凹部の幅を特に、サブブロック領域内外で変更することが好ましい。特に、凹凸部内で複数の深さの凹部を設けること、すなわち、凹部の深さを一定とせずに、凹部ごとに異なる深さとすることもでき、この場合、隣接するサブブロック領域間の凹部の深さを、サブブロック領域内の凹部の深さよりも深くすることにより、微粒子の大きさ、マイクロロッドの直径が制限されず、効率の良い撹拌が可能となるので好ましい。またこの場合は、凸部上面に選択結合性物質を固定化した効果を失わない範囲で、サブブロック領域内の凹部の深さを浅くすることが可能となるので、必要な被検物資が含まれる溶液（以下、検体溶液という。）の量を減らすことが可能となることからも好ましい。検体溶液の量を減らすことが可能となると、後述する検体自体の量を減らすこと、または、検体溶液中の検体の濃度を濃くすることが可能となる。特に、検体溶液中の検体濃度を濃くすれば、担体に固定化された選択性結合物質と検体との反応効率を上げることができ、結果的にシグナル強度が強くなる。具体的には例えば、サブブロック領域間の凹部の深さを、凸部上面から凹部底面までの深さで１００μｍ以上、好ましくは１００〜５００μｍ、特に１００〜３００μｍとすることができ、一方、サブブロック領域内の凹部の深さを２０〜２００μｍ、好ましくは３０〜１５０μｍ、特に３０〜１００μｍとすることができる。 In the present invention, it is particularly preferable to change the width of the recesses inside and outside the sub-block region. In particular, it is possible to provide recesses having a plurality of depths within the concavo-convex portion, that is, the depth of the recesses can be different for each recess without making the depth of the recesses constant. By making the depth deeper than the depth of the recess in the sub-block region, the size of the fine particles and the diameter of the microrod are not limited, and efficient stirring is possible, which is preferable. In this case, since the depth of the concave portion in the sub-block region can be reduced within a range that does not lose the effect of fixing the selective binding substance on the upper surface of the convex portion, the necessary test material is included. This is also preferable because the amount of the solution (hereinafter referred to as a specimen solution) can be reduced. When the amount of the sample solution can be reduced, the amount of the sample itself described later can be reduced, or the concentration of the sample in the sample solution can be increased. In particular, if the concentration of the sample in the sample solution is increased, the reaction efficiency between the selective binding substance immobilized on the carrier and the sample can be increased, resulting in a stronger signal intensity. Specifically, for example, the depth of the recesses between the sub-block regions can be set to 100 μm or more, preferably 100 to 500 μm, particularly 100 to 300 μm as the depth from the top surface of the projection to the bottom surface of the recess. The depth of the recess in the block region can be 20 to 200 μm, preferably 30 to 150 μm, particularly 30 to 100 μm.
凹凸部の凸部の上面の高さに関しては、それぞれの凸部の上端面の高さが略同一であるであることが好ましい。ここで、高さが略同一とは、多少高さの違う凸部の上端面に選択結合性物質を固定化し、これと蛍光標識した検体とを反応させ、そして、スキャナーでスキャンした際、その信号レベルの強度差が問題とならない高さをいう。具体的に高さが略同一とは、高さの差が５０μｍ以下であることをいう。高さの差は３０μｍ以下であることがより好ましく、高さが同一であればなお好ましい。なお、本願でいう同一の高さとは、生産等で発生するばらつきによる誤差も含むものとする。最も高い凸部上端面の高さと、最も低い凸部上端面の高さの差が５０μｍより大きいと、高さのずれた凸部上端面でのレーザー光がぼやけてしまい、この凸部上端面に固定化された選択結合性物質と反応した検体からのシグナル強度が弱くなる場合があるため好ましくない。
また、凸部分の上端面は、実質的に平坦であることが好ましい。ここで凸部上端面が実質的に平坦とは、２０μｍ以上の凹凸がないことを意味する。
Regarding the height of the upper surface of the convex portion of the concavo-convex portion, it is preferable that the height of the upper end surface of each convex portion is substantially the same. Here, when the height is substantially the same, a selective binding substance is immobilized on the upper end surface of a convex part having a slightly different height, and this is reacted with a fluorescently labeled specimen. The height at which the difference in signal level strength does not matter. Specifically, “the heights are substantially the same” means that the height difference is 50 μm or less. The difference in height is more preferably 30 μm or less, and even more preferably the same height. In addition, the same height as used in this application shall also include the error by the dispersion | variation which generate | occur | produces by production etc. If the difference between the height of the highest convex upper end surface and the lowest convex upper end surface is larger than 50 μm, the laser beam on the convex upper end surface with a shifted height will be blurred. This is not preferable because the signal intensity from the sample reacted with the selective binding substance immobilized on the sample may become weak.
Moreover, it is preferable that the upper end surface of a convex part is substantially flat. Here, the fact that the upper end surface of the convex portion is substantially flat means that there is no unevenness of 20 μm or more.
本発明においては、上述した凹凸部のうち凸部の上面（上端面）に選択結合性物質（プローブ）が固定化される。選択結合性物質の固定化は、予めなされるものであっても良く、また、選択結合性物質を固定化しないで担体のみを用意しておき、検体の分析の際に所望の検体に応じた選択結合性物質を適宜選択し固定することもできる。
凸部の上面に固定化できる選択結合性物質（例えば核酸）は、データとして必要なものを適宜選択することができるが、単なるダミーの選択結合性物質であっても良い。また、すべての凸部表面に選択結合性物質を結合する必要は無く、何も固定化していない凸部を有していても良い。
In the present invention, the selective binding substance (probe) is immobilized on the upper surface (upper end surface) of the convex portion among the concave and convex portions described above. The selective binding substance may be immobilized in advance, or only the carrier is prepared without immobilizing the selective binding substance, and the sample is analyzed according to the desired specimen. A selective binding substance can be appropriately selected and fixed.
The selective binding substance (for example, nucleic acid) that can be immobilized on the upper surface of the convex portion can be appropriately selected as necessary as data, but may be a simple selective binding substance. Further, it is not necessary to bind the selective binding substance to all the convex surface, and it may have a convex part where nothing is fixed.
本発明の担体の凸部の上面の面積は、略同一であることが好ましい。凸部の上面の面積が略同一であることにより、多種の選択結合性物質が固定化される部分の面積を同一にできるので、後の解析に有利である。ここで、凸部の上部の面積が略同一とは、凸部の中で最も大きい上端面積を、最も小さい上端面積で割った値が１．２以下であることを言う。 The area of the upper surface of the convex portion of the carrier of the present invention is preferably substantially the same. Since the area of the upper surface of the convex portion is substantially the same, the area of the portion where the various selective binding substances are immobilized can be made the same, which is advantageous for later analysis. Here, the area of the upper part of the convex part is substantially the same means that the value obtained by dividing the largest upper end area in the convex part by the smallest upper end area is 1.2 or less.
選択結合性物質が固定化された凸部の上面の面積は、特に限定されるものではないが、選択結合性物質の量を少なくすることができる点とハンドリングの容易さの点から、１ｍｍ2以下、１０μｍ2以上が好ましい。また、凸部の数は、凸部の形状やサイズ、凹凸部の面積、凹部の幅、サブブロック領域、微粒子やマイクロロッドのサイズ等により適宜定めることができる。凸部の数の好ましい範囲は、本発明の効果を発揮できる点から鑑みると、１０００個から５００００個である。より好ましい範囲は、３０００個から５００００個であり、特に好ましくは、５０００個から５００００個である。凸部の密度としては、５個／ｍｍ2から５０個／ｍｍ2の間が好ましい範囲である。 The area of the upper surface of the convex portion on which the selective binding substance is immobilized is not particularly limited, but it is 1 mm 2 from the viewpoint that the amount of the selective binding substance can be reduced and handling is easy. Hereinafter, 10 μm 2 or more is preferable. Further, the number of convex portions can be appropriately determined depending on the shape and size of the convex portions, the area of the concave and convex portions, the width of the concave portions, the sub-block region, the size of the fine particles and the microrods, and the like. The preferable range of the number of convex portions is 1000 to 50000 in view of the effect of the present invention. A more preferred range is 3000 to 50000, and particularly preferred is 5000 to 50000. The density of the protrusions is preferably in the range of 5 / mm 2 to 50 / mm 2 .
本発明の担体において、さらに好ましくは、その担体における凹凸部を有する面に、さらに平坦部が設けられていることが好ましい。このような構造とすることにより、凹凸部に検体溶液をアプライすることが容易となる。
凹凸部の凸部の上端面の高さと平坦部の高さは、略同一であることが好ましい。すなわち、平坦部の高さと凸部上端面の高さの差は、５０μｍ以下であることが好ましい。凸部上端面の高さと平坦部の高さの差が５０μｍを超えると、検出できる蛍光強度が弱くなる場合があるため好ましくない。平坦部の高さと凸部上端面の高さの差は、より好ましくは３０μｍ以下であり、さらに好ましくは、１０μｍ以下である。最も好ましくは、平坦部の高さと凸部の高さは同一である。
In the carrier of the present invention, it is more preferable that a flat portion is further provided on the surface of the carrier having the uneven portion. With such a structure, it is easy to apply the sample solution to the uneven portion.
It is preferable that the height of the upper end surface of the convex part of the uneven part and the height of the flat part are substantially the same. That is, the difference between the height of the flat part and the height of the upper end surface of the convex part is preferably 50 μm or less. If the difference between the height of the upper end surface of the convex portion and the height of the flat portion exceeds 50 μm, the detectable fluorescence intensity may become weak, which is not preferable. The difference between the height of the flat portion and the height of the upper end surface of the convex portion is more preferably 30 μm or less, and even more preferably 10 μm or less. Most preferably, the height of the flat part and the height of the convex part are the same.
本発明の選択結合性物質固定化担体の具体例を図１、図２及び図３を基に説明する。図１は、本発明の選択結合性物質固定化担体の表面上方からみた模式図であり、図２及び図３は、いずれも図１に示す選択結合性物質固定化担体をＣ１面で切断した断面図である。
図１に示す例において、選択結合性物質固定化担体１の表面には、複数の凸部１１を含む凹凸部１２により構成されており、その周りに平坦部１３が設けられている。凸部１１の上面には、選択結合性物質（例えば核酸）が固定化される。
Specific examples of the selective binding substance-immobilized carrier of the present invention will be described with reference to FIGS. FIG. 1 is a schematic view of the selective binding substance-immobilized carrier of the present invention as viewed from above the surface. FIGS. 2 and 3 both show the selective binding substance-immobilized carrier shown in FIG. It is sectional drawing.
In the example shown in FIG. 1, the surface of the selective binding substance-immobilized
図２の例では、サブブロック領域Ｓｋと隣接するサブブロック領域Ｓｋ＋１間の凹部１０Ａの幅ＷＡが、サブブロック領域内の凹部１０Ｂの幅ＷＢよりも広くなっている。また、平坦部１３とサブブロック領域Ｓｋとの間に凹部１０Ｃが設けられ、その凹部１０Ｃの幅ＷＣは凹部１０Ａの幅ＷＡよりも広くなっている。よって、サブブロック領域内の凹部のみにビーズを入れる場合に比較し、サブブロック領域と隣接するサブブロック領域の間の凹部により大きなビーズを入れることが可能となる。よって、これを移動させることにより効率的に溶液の撹拌が可能となる。
また、図３の例では、図２と同様サブブロック領域Ｓｋと隣接するサブブロック領域Ｓｋ＋１間の凹部１０Ａの幅ＷＡが、サブブロック領域内の凹部１０Ｂの幅ＷＢよりも広くなっており、また平坦部１３とサブブロック領域Ｓｋとの間に凹部１０Ｃが設けられ、その凹部１０Ｃの幅ＷＣは凹部１０Ａの幅ＷＡよりも広くなっている。そして、サブブロック領域Ｓｋと隣接するサブブロック領域Ｓｋ＋１間の凹部１０Ａの深さおよび平坦部１３とサブブロック領域Ｓｋと間の凹部１０Ｃの深さＤＡが、サブブロック領域内の凹部１０Ｂの深さＤＢよりも深くなっている。この場合は、図２の場合と比較し、さらに大きなビーズをサブブロック領域と隣接するサブブロック領域との間の凹部に入れることが可能となるのでより好ましい。
In the example of FIG. 2, the width WA of the
In the example of FIG. 3, the width WA of the
また、図１、図２及び図３の例では、平坦部１３を使って、容易にスキャナーの励起光等の測定用の光線の焦点を凸部１１の上端面に合わせることが可能となる。より具体的に説明すると、担体の表面に測定用のレーザー等の照射光を照射するにあたり焦点を合わせる際には、図４に示すように、バネ４０で付勢して治具４１に選択結合性物質固定化担体１を突き当て、この治具の突き当て面４２の高さにレーザー光４４が合焦するようレンズ４３等により予め焦点を調整しておくことが多い。本発明の選択結合性物質固定化担体の平坦部を治具の面４２に突き当てることにより、容易に担体の凸部上端面にスキャナーのレーザー光の焦点を合わせることが可能となる。なお、図４の例においては、選択結合性物質固定化担体１は、選択結合性物質が固定化された面が下側になるよう固定されている。
In the example of FIGS. 1, 2, and 3, it is possible to easily focus the light beam for measurement such as the excitation light of the scanner on the upper end surface of the
本発明の担体、上記凹凸部の凹部に移動可能に格納された微粒子またはマイクロロッドを更に含むことが好ましい。当該微粒子を含むことにより、被検物質が含まれる溶液をアプライした後に分析チップを揺動、回転等させることで、空隙内で微粒子またはマイクロロッドを運動させ、検体溶液と本発明の選択結合性物質固定化担体との十分な撹拌を達成し、より精密な分析を行うことができる。 It is preferable that the carrier of the present invention further includes fine particles or microrods movably stored in the concave portions of the concave and convex portions. By including the microparticles, after applying the solution containing the test substance, the microchip or microrod is moved in the gap by swinging, rotating, etc. the analysis chip, and the selective binding between the sample solution and the present invention is achieved. Sufficient agitation with the substance-immobilized carrier can be achieved and more precise analysis can be performed.
前記微粒子やマイクロロッドの形状は、特に限定されず、微粒子の場合、球状の形状以外に、多角形でも良く、マイクロロッドの場合、円筒形、角柱形など任意の形状とすることができる。また、微粒子のサイズも特に限定されないが、例えば球状の微粒子の場合、０．１〜３００μｍの範囲とすることができ、更に、マイクロロッドの場合、長さ５０〜５０００μｍ、底面直径１０〜３００μｍの範囲とすることができる。前記微粒子やマイクロロッドの材質も、特に限定されないが、ガラス、セラミック（例えばイットリウム部分安定化ジルコニア）、金属（例えば金、白金、ステンレス）、プラスチック（例えばナイロンやポリスチレン）等を用いることができる。上述の微粒子等は、本発明の選択結合性物質固定化担体に予め格納した態様とすることができるが、被検物質が含まれる溶液に微粒子を混入させて該溶液のアプライと同時に微粒子を格納してもよく、または被検物質が含まれる溶液のアプライの前又は後に、微粒子を別途格納してもよい。マイクロロッドの材料としては、特に限定されるものではないが、加工の容易さの点から、金属（例えば、ステンレス、白金、金）が好ましく用いられる。微粒子やマイクロロッドは、撹拌効率などの面から、１種類を選択して用いることもできる他、２種類以上を組み合わせて用いることができる。 The shape of the fine particles and the microrod is not particularly limited. In the case of fine particles, in addition to the spherical shape, the shape may be a polygonal shape. In the case of the microrod, the shape may be any shape such as a cylindrical shape or a prism shape. Further, the size of the fine particles is not particularly limited. For example, in the case of spherical fine particles, it can be in the range of 0.1 to 300 μm, and in the case of a microrod, the length is 50 to 5000 μm and the bottom diameter is 10 to 300 μm. It can be a range. The material of the fine particles and the microrod is not particularly limited, and glass, ceramic (for example, yttrium partially stabilized zirconia), metal (for example, gold, platinum, stainless steel), plastic (for example, nylon or polystyrene), or the like can be used. The above-mentioned fine particles can be stored in advance in the selective binding substance-immobilized carrier of the present invention. However, the fine particles are mixed with the solution containing the test substance, and the fine particles are stored simultaneously with the application of the solution. Alternatively, the microparticles may be stored separately before or after the application of the solution containing the test substance. The material of the microrod is not particularly limited, but a metal (for example, stainless steel, platinum, gold) is preferably used from the viewpoint of ease of processing. One kind of fine particles and microrods can be selected and used in view of stirring efficiency, and two or more kinds can be used in combination.
本発明の担体の材質は、特に限定されないが、ガラス、セラミック、シリコンなどの無機材料、ポリエチレンテレフタレート、酢酸セルロース、ポリカーボネート、ポリスチレン、ポリメチルメタクリレート、シリコーンゴム等のポリマーなどを挙げることができる。この中でも、ポリメチルメタクリレート、ポリスチレン、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）エラストマー、ガラス及びシリコンを特に好ましく用いることができる。 The material of the carrier of the present invention is not particularly limited, and examples thereof include inorganic materials such as glass, ceramic and silicon, and polymers such as polyethylene terephthalate, cellulose acetate, polycarbonate, polystyrene, polymethyl methacrylate and silicone rubber. Among these, polymethyl methacrylate, polystyrene, polydimethylsiloxane (PDMS) elastomer, glass and silicon can be particularly preferably used.
本発明の選択結合性物質固定化担体は、少なくとも一部が黒色であることが好ましい。このようにすることにより、担体からの自家蛍光を低減することができる。担体の黒色にする部分としては、凹凸部が設けられた担体の本体でも良いし、凸部の側面、凹部に設けられた疎水的な材料や絶縁層でも良いし、これらの全部でも良い。 The selective binding substance-immobilized carrier of the present invention is preferably at least partially black. By doing so, autofluorescence from the carrier can be reduced. The blackened portion of the carrier may be the main body of the carrier provided with the concavo-convex portion, or may be a hydrophobic material or insulating layer provided on the side surface of the convex portion or the concave portion, or all of them.
ここで、担体が黒色であるとは、可視光（波長４００ｎｍ〜８００ｎｍ）において、担体の黒色部分の分光反射率が特定のスペクトルパターン（特定のピークなど）を持たず、一様に低い値であり、かつ、担体の黒色部分の分光透過率も、特定のスペクトルパターンを持たず、一様に低い値であることを意味する。
この分光反射率、分光透過率の値としては、可視光（波長４００ｎｍ〜８００ｎｍ）の範囲の分光反射率が７％以下であり、同波長範囲での分光透過率が２％以下であることが好ましい。尚、ここで言う分光反射率は、ＪＩＳ Ｚ ８７２２の条件Ｃに適合した、照明・受光光学系で、担体からの正反射光を取り込んだ場合の分光反射率を言う。
Here, the black carrier means that in visible light (wavelength 400 nm to 800 nm), the spectral reflectance of the black portion of the carrier does not have a specific spectral pattern (such as a specific peak) and is uniformly low. In addition, the spectral transmittance of the black portion of the carrier also does not have a specific spectral pattern and means a uniformly low value.
As values of the spectral reflectance and the spectral transmittance, the spectral reflectance in the range of visible light (wavelength 400 nm to 800 nm) is 7% or less, and the spectral transmittance in the same wavelength range is 2% or less. preferable. Note that the spectral reflectance here refers to the spectral reflectance when regular reflected light from a carrier is captured in an illumination / light-receiving optical system conforming to the condition C of JIS Z 8722.
黒色にする手段としては、本発明の選択結合性物質固定化担体に黒色物質を含有させることにより達成しうる。この黒色物質は、光を反射したり透過し難いものであれば、特に制限はないが、好ましいものを挙げると、カーボンブラック、グラファイト、チタンブラック、アニリンブラック、Ｒｕ、Ｍｎ、Ｎｉ、Ｃｒ、Ｆｅ、Ｃｏ、およびＣｕの酸化物、Ｓｉ、Ｔｉ、Ｔａ、ＺｒおよびＣｒの炭化物などの黒色物質が使用できる。 The means for blackening can be achieved by incorporating a black substance into the selective binding substance-immobilized carrier of the present invention. The black material is not particularly limited as long as it is difficult to reflect or transmit light, but preferred examples include carbon black, graphite, titanium black, aniline black, Ru, Mn, Ni, Cr, Fe. , Co and Cu oxides, black materials such as Si, Ti, Ta, Zr and Cr carbides can be used.
これらの黒色物質は単独で含有させる他、２種類以上を混合して含有させることもできる。例えば、ポリエチレンテレフタレート、シリコーン樹脂などのポリマーの場合は、この中の黒色物質の中でも、カーボンブラック、グラファイト、チタンブラック、アニリンブラックを好ましく含有させることができ、特にカーボンブラックを好ましく用いることができる。ガラス、セラミックの無機材料の場合は、Ｒｕ、Ｍｎ、Ｎｉ、Ｃｒ、Ｆｅ、Ｃｏ、およびＣｕの酸化物、Ｓｉ、Ｔｉ、Ｔａ、ＺｒおよびＣｒの炭化物を好ましく含有させることができる。 These black materials can be contained alone or in combination of two or more. For example, in the case of a polymer such as polyethylene terephthalate and silicone resin, among the black materials, carbon black, graphite, titanium black and aniline black can be preferably contained, and carbon black can be particularly preferably used. In the case of an inorganic material such as glass or ceramic, oxides of Ru, Mn, Ni, Cr, Fe, Co, and Cu, and carbides of Si, Ti, Ta, Zr, and Cr can be preferably contained.
本発明の選択結合性物質固定化担体の形状については、担体表面に、上述したような凹部および凸部からなる凹凸部を有するものであれば、特に限定されるものではない。
また、本発明の選択結合性物質固定化担体は、各種製法にて製造することができる。例えば、材質がポリマー等の場合、射出成形法、ホットエンボス法、鋳型内で重合させる方法等により成型することができる。また、材質がガラスやセラミック等の無機物の場合、サンドブラスト法、シリコンの場合は公知の半導体プロセスなどで成型することができる。
成型した担体は、選択結合性物質をその表面に固定化するのに先立ち、必要に応じて各種の表面処理を施すことができる。かかる表面処理としては、具体的には例えば特開２００４−２６４２８９号公報に記載されるものなどを挙げることができる。
The shape of the selective binding substance-immobilized carrier of the present invention is not particularly limited as long as it has a concave and convex portion composed of the concave portion and the convex portion as described above on the surface of the carrier.
The selective binding substance-immobilized carrier of the present invention can be produced by various production methods. For example, when the material is a polymer or the like, it can be molded by an injection molding method, a hot embossing method, a method of polymerizing in a mold, or the like. Further, when the material is an inorganic material such as glass or ceramic, it can be molded by a sandblast method, and when silicon is used, it can be molded by a known semiconductor process.
The molded carrier can be subjected to various surface treatments as necessary before immobilizing the selective binding substance on the surface. Specific examples of such surface treatment include those described in JP-A No. 2004-264289.
本発明の選択結合性物質固定化担体は、検体の分析用チップとして用いることができる。
本発明において、分析用チップとは、被検物質が含まれる溶液（検体溶液）を当該チップにアプライし、検体の存在の有無や、検体の量や、検体の性状等を測定するために用いるチップをいう。具体的には、担体表面に固定化された選択結合性物質と検体との反応により、検体の量や、検体の有無を測定するバイオチップが挙げられる。より具体的には、核酸を担体表面に固定化したＤＮＡチップ、抗体に代表されるタンパク質を担体表面に固定化したタンパク質チップ、糖鎖を担体表面に固定化した糖鎖チップ、及び細胞を担体表面に固定化した細胞チップ等が挙げられる。
The selective binding substance-immobilized carrier of the present invention can be used as a sample analysis chip.
In the present invention, the analysis chip is used to apply a solution (specimen solution) containing a test substance to the chip and measure the presence / absence of the sample, the amount of the sample, the properties of the sample, and the like. A tip. Specifically, a biochip that measures the amount of the specimen and the presence or absence of the specimen by a reaction between the selective binding substance immobilized on the surface of the carrier and the specimen can be mentioned. More specifically, a DNA chip having a nucleic acid immobilized on the carrier surface, a protein chip having a protein typified by an antibody immobilized on the carrier surface, a sugar chain chip having a sugar chain immobilized on the carrier surface, and a cell carrier Examples thereof include a cell chip immobilized on the surface.
本発明において、選択結合性物質とは、検体と直接的又は間接的に、選択的に結合し得る各種の物質を意味する。担体の表面に結合しうる選択結合性物質の代表的な例としては、核酸、蛋白質、ペプチド、糖類、脂質を挙げることができる。
核酸としては、ＤＮＡやＲＮＡでも良く、またＰＮＡでも良い。特定の塩基配列を有する一本鎖核酸は、該塩基配列又はその一部と相補的な塩基配列を有する一本鎖核酸と選択的にハイブリダイズして結合するので、本発明でいう「選択結合性物質」に該当する。
核酸は、生細胞等天然物由来のものであっても良いし、核酸合成装置により合成されたものであっても良い。生細胞からのＤＮＡ又はＲＮＡの調製は、公知の方法、例えばＤＮＡの抽出については、Ｂｌｉｎらの方法（Blin et al., Nucleic Acids Res. 3: 2303 (1976)）等により、また、ＲＮＡの抽出については、Ｆａｖａｌｏｒｏらの方法（Favaloro et al., Methods Enzymol.65: 718 (1980)）等により行うことができる。固定化する核酸としては、更に、鎖状若しくは環状のプラスミドＤＮＡや染色体ＤＮＡ、これらを制限酵素により若しくは化学的に切断したＤＮＡ断片、試験管内で酵素等により合成されたＤＮＡ、又は化学合成したオリゴヌクレオチド等を用いることもできる。
In the present invention, the selective binding substance means various substances that can selectively bind to a specimen directly or indirectly. Representative examples of the selective binding substance that can bind to the surface of the carrier include nucleic acids, proteins, peptides, saccharides, and lipids.
The nucleic acid may be DNA or RNA, or PNA. A single-stranded nucleic acid having a specific base sequence selectively hybridizes and binds to a single-stranded nucleic acid having a base sequence complementary to the base sequence or a part thereof. Falls under the category of
The nucleic acid may be derived from natural products such as living cells, or may be synthesized by a nucleic acid synthesizer. Preparation of DNA or RNA from living cells can be carried out by a known method, for example, the method of Blin et al. (Blin et al., Nucleic Acids Res. 3: 2303 (1976)) or the like for DNA extraction. Extraction can be performed by the method of Favaloro et al. (Favaloro et al., Methods Enzymol. 65: 718 (1980)) and the like. Examples of the nucleic acid to be immobilized include linear or circular plasmid DNA and chromosomal DNA, DNA fragments obtained by digesting these with restriction enzymes or chemically, DNA synthesized with enzymes in a test tube, or chemically synthesized oligos. Nucleotides and the like can also be used.
また、蛋白質としては、抗体及びＦａｂフラグメントやＦ（ａｂ´）2フラグメントのような、抗体の抗原結合性断片、並びに種々の抗原を挙げることができる。抗体やその抗原結合性断片は、対応する抗原と選択的に結合し、抗原は対応する抗体と選択的に結合するので、「選択結合性物質」に該当する。
糖類としては、各種単糖のほか、オリゴ糖や多糖などの糖鎖を挙げることができる。
脂質としては、単純脂質の他、複合脂質であっても良い。
更に、上記核酸、蛋白質、糖類、脂質以外の抗原性を有する物質を固定化することもできる。また、選択結合性物質として、担体の表面に細胞を固定化してもよい。
これらの選択結合性物質のうち特に好ましいものとして、ＤＮＡ、ＲＮＡ、蛋白質、ペプチド、糖、糖鎖または脂質を挙げることができる。
Examples of the protein include an antibody, an antigen-binding fragment of an antibody such as a Fab fragment or F (ab ′) 2 fragment, and various antigens. Since an antibody or an antigen-binding fragment thereof selectively binds with a corresponding antigen, and the antigen selectively binds with a corresponding antibody, it corresponds to a “selective binding substance”.
Examples of the saccharide include various monosaccharides and sugar chains such as oligosaccharides and polysaccharides.
The lipid may be a simple lipid or a complex lipid.
Furthermore, antigenic substances other than the nucleic acids, proteins, saccharides and lipids can also be immobilized. Moreover, you may fix a cell on the surface of a support | carrier as a selective binding substance.
Among these selective binding substances, DNA, RNA, protein, peptide, sugar, sugar chain or lipid can be mentioned as particularly preferred.
本発明の選択結合性物質固定化担体を分析用チップとして用いる場合には、該選択結合性物質固定化担体の表面を覆い前記選択結合性物質固定化担体と接着されたカバー部材を更に備えるものであっても良い。カバー部材を備えることにより、検体溶液を簡便に密閉保持することができ、その結果、検体と、担体の領域（図１、図２及び図３中の１２）に固定化された選択結合性物質との反応を、安定して行うことができる。また、特に選択結合性物質固定化担体とカバー部材とが接着され一体となっていることにより、微粒子やマイクロロッドを予め封入しておくことができ、検体溶液をアプライする作業を容易に行うことが可能である。そして、検体溶液をアプライした後の貫通孔を塞ぐ作業においてもテープやシール剤が検体溶液と接触することがないので、バックグラウンドノイズが上昇しないという利点もある。 When the selective binding substance-immobilized carrier of the present invention is used as an analysis chip, it further comprises a cover member that covers the surface of the selective binding substance-immobilized carrier and is adhered to the selective binding substance-immobilized carrier. It may be. By providing the cover member, the sample solution can be easily hermetically sealed, and as a result, the selective binding substance immobilized on the sample and the carrier region (12 in FIGS. 1, 2 and 3). The reaction with can be carried out stably. In particular, since the selective binding substance-immobilized carrier and the cover member are bonded and integrated, it is possible to enclose fine particles and microrods in advance, and to easily apply the sample solution. Is possible. Further, even in the operation of closing the through hole after applying the sample solution, there is an advantage that the background noise does not increase because the tape and the sealant do not come into contact with the sample solution.
図５は、前記選択結合性物質固定化担体に加え、更にカバー部材、接着層、貫通孔及び液面駐止用チャンバーを有する本発明の分析用チップの概略的な態様の例を示す斜視図であり、図６は図５の分析用チップを矢印Ａ１に沿った面で切断した断面図である。図５及び図６に示す例においては、選択結合性物質固定化担体１が、接着層３０を介してカバー部材３で覆われ、選択結合性物質が固定化された領域１２を含む空隙３１を形成している。空隙３１は、複数の貫通孔３２を介して外部と連通する他は、外部と連通しない閉じた空間である。
FIG. 5 is a perspective view showing an example of a schematic aspect of the analysis chip of the present invention further including a cover member, an adhesive layer, a through hole, and a liquid level holding chamber in addition to the selective binding substance-immobilized carrier. FIG. 6 is a cross-sectional view of the analysis chip of FIG. 5 cut along a plane along arrow A1. In the example shown in FIGS. 5 and 6, the selective binding substance-immobilized
前記カバー部材は、前記選択結合性物質固定化担体の表面の少なくとも一面の一部を覆い、担体と、カバー部材との間に空隙を有するよう接着されることができる。そして、担体は、好ましくはその表面であって前記空隙内に位置する領域上に固定化された選択結合性物質を有する。即ち、好ましくは、前記選択結合性物質が固定化された領域が、当該空隙内に存在するように、前記カバー部材は前記選択結合性物質固定化担体に接着される。前記カバー部材は、前記空隙が形成される限りにおいて、どのような態様で接着されてもよいが、好ましくは、両面テープ、樹脂組成物等の接着層を介して接着される。 The cover member may cover at least a part of the surface of the selective binding substance-immobilized carrier, and may be bonded so as to have a gap between the carrier and the cover member. The carrier preferably has a selective binding substance immobilized on a region of the carrier located on the surface of the carrier. That is, preferably, the cover member is bonded to the selective binding substance-immobilized carrier so that the region where the selective binding substance is immobilized exists in the gap. The cover member may be bonded in any manner as long as the gap is formed, but is preferably bonded through an adhesive layer such as a double-sided tape or a resin composition.
前記カバー部材は、前記空隙に連通する１つ以上の貫通孔を有するものとすることができ、複数の貫通孔を有することが好ましい。より具体的には、貫通孔は、一つの空隙に対して複数あることが好ましく、中でも３個から６個とすることにより、検体溶液の充填が容易となるので特に好ましい。なお、後述するように、空隙が、互いに連通しない複数の空間に分かれている場合は、各空間あたりに複数個、より好ましくは３〜６個の貫通孔を有することが好ましい。カバー部材が複数の貫通孔を有する場合、それらの孔径は、同一でも異なっていてもよいが、複数の貫通孔のうちの一つをアプライ口とし、他の貫通孔を空気の抜け口として機能させる場合、検体溶液のアプライの容易さ及び検体溶液の密閉保持性の点から、アプライ口のみをアプライに必要な広い孔径としその他の貫通孔をより狭い孔径とすることが、好ましい。具体的には、アプライ口の貫通孔サイズは直径０．０１から２．０ｍｍの範囲内とし、その他の貫通孔の直径を０．０１〜１．０ｍｍとすることが好ましい。 The cover member may have one or more through holes communicating with the gap, and preferably has a plurality of through holes. More specifically, it is preferable that there are a plurality of through-holes with respect to one gap, and among these, it is particularly preferable that the number of through-holes is 3 to 6 because the sample solution can be easily filled. As will be described later, when the gap is divided into a plurality of spaces that do not communicate with each other, it is preferable that each space has a plurality, more preferably 3 to 6, through holes. When the cover member has a plurality of through holes, the diameters thereof may be the same or different, but one of the plurality of through holes functions as an apply port and the other through hole functions as an air outlet. In this case, from the viewpoint of easy application of the sample solution and hermetic retention of the sample solution, it is preferable that only the apply port has a wide hole diameter necessary for the application and other through holes have a narrower hole diameter. Specifically, the through-hole size of the apply port is preferably in the range of 0.01 to 2.0 mm in diameter, and the diameters of the other through-holes are preferably 0.01 to 1.0 mm.
貫通孔３２は、その少なくとも１つが、その径を変化させて、上端に径の広い部分、いわゆる液面駐止用チャンバー３３を備えるものとしても良い。液面駐止用チャンバーを備えることにより、貫通孔３２からアプライされ空隙３１に充填された検体溶液の液面の上昇を抑え、貫通孔を封止部材３４で封止する際の封止を容易かつ確実に行うことが可能となるとともに、検体溶液の中に多数の気泡が入ったり、検体溶液の流出を防ぐことができるので好ましい。液面駐止用チャンバーの形状は特に限定されるものではなく、円柱形、角柱形、円錐形、角錐形、半球形、又はこれに近似した形状とすることができる。これらのうち、製造の容易さ及び検体溶液の上昇を抑制する効果の高さ等の観点から、円柱形が特に好ましい。
At least one of the through-
貫通孔の孔径サイズについては特に限定されるわけではないが、図７に示す縦断面形状の円筒形の貫通孔３２及び液面駐止用チャンバー３３との組み合わせの場合を例に挙げると、貫通孔３２の孔径サイズ（直径）は、０．０１から２．０ｍｍが好ましく、０．３から１．０ｍｍがより好ましい。孔径を０．０１ｍｍ以上とすることにより、検体溶液のアプライを容易に行うことができる。一方、貫通孔３２の直径を１．５ｍｍ以下とすることにより、アプライ後封止前の検体溶液の蒸発などをより効果的に抑制することができる。液面駐止用チャンバー３３の孔径サイズ（直径）については、１．０ｍｍ以上が好ましい。１．０ｍｍ以上とすることにより、貫通孔３２とのサイズの差を十分に得ることができ、十分な液面駐止効果が得られ好ましい。液面駐止用チャンバー３３の直径の上限は、特に限定されないが、１０ｍｍ以下とすることができる。また、液面駐止用チャンバー３３の深さは、特に限定されないが、０．１〜５ｍｍの範囲内とすることができる。
The hole diameter size of the through hole is not particularly limited. For example, in the case of a combination with the cylindrical through
このようなカバー部材は、前述の選択結合性物質固定化担体に、脱離可能に接着されていることが好ましい。本発明の分析用チップをＤＮＡチップとして用いる場合、通常、ＤＮＡチップを専用スキャナーで読み取ることが必要であるが、カバー部材が接着された状態では、専用スキャナーにセットすることが難しく、セットされたとしてもスキャン操作を実施するとカバー部材とスキャナーの光学系部品が接触し、故障の原因となることがある。また、カバー部材を介しての読み取りが可能であっても、読み取り値が不正確となりうる。そのため、読み取りの工程においてカバー部材を取り外せるよう、カバー部材が脱離可能であることが好ましい。 Such a cover member is preferably detachably bonded to the above-described selective binding substance-immobilized carrier. When the analysis chip of the present invention is used as a DNA chip, it is usually necessary to read the DNA chip with a dedicated scanner. However, in the state where the cover member is adhered, it is difficult to set in the dedicated scanner. However, when the scanning operation is performed, the cover member and the optical parts of the scanner may come into contact with each other, which may cause a failure. Further, even if reading through the cover member is possible, the reading value may be inaccurate. Therefore, it is preferable that the cover member is removable so that the cover member can be removed in the reading step.
カバー部材を選択結合性物質固定化担体に脱離可能に接着する態様は、特に限定されないが、カバー部材と担体が損傷されることなく脱離することが可能である態様が好ましい。例えば、両面テープ、樹脂組成物等の接着層を介して接着することができる。 A mode in which the cover member is detachably attached to the selective binding substance-immobilized carrier is not particularly limited, but a mode in which the cover member and the carrier can be detached without being damaged is preferable. For example, it can adhere | attach through adhesive layers, such as a double-sided tape and a resin composition.
接着層として両面テープを用いる場合、両面で接着力の異なる両面テープを用いることが好ましく、具体的には、該両面テープの接着力の弱い面を担体側に接着し、接着力の強い面をカバー部材側に接着することが好ましい。このような態様とすることにより、カバー部材を剥離する際に、両面テープがカバー部材に接着した状態で同時に担体より脱離し易く、それにより、担体上への接着層の残存による読み取りの工程における不都合を回避することができる。このような両面テープとしては、日東電工株式会社製の製品番号Ｎｏ．５３５Ａ、住友スリーエム株式会社製の製品番号９４１５ＰＣ及び４５９１ＨＬ、並びに株式会社寺岡製作所製の製品番号Ｎｏ．７６９１等が挙げられる。 When using a double-sided tape as the adhesive layer, it is preferable to use a double-sided tape with different adhesive strengths on both sides. Specifically, the surface with low adhesive strength of the double-sided tape is bonded to the carrier side, It is preferable to adhere to the cover member side. By adopting such an aspect, when peeling the cover member, the double-sided tape is easily detached from the carrier at the same time in a state of being adhered to the cover member, and thereby, in the reading step due to the remaining adhesive layer on the carrier. Inconvenience can be avoided. As such a double-sided tape, Nitto Denko Corporation product number No. 535A, product numbers 9415PC and 4591HL manufactured by Sumitomo 3M Limited, and product numbers No. 7691 etc. are mentioned.
接着層として樹脂組成物を用いる場合、当該樹脂組成物としては、アクリル系ポリマー、シリコーン系ポリマー、及びこれらの混合物からなる群より選択されるポリマーを含む樹脂組成物等を用いることができる。これらの樹脂組成物を利用することにより、両面テープに比べて密閉性を高めることが可能となるとともに、両面テープに比べて、長期間のインキュベーションに対しても安定であるため、そのような長期間のインキュベーションが必要な分析系においては特に好ましい。特に、接着層としてシリコーン系のエラストマーを用いると、密閉性が良好であり、しかも、容易に脱離が可能な状態でカバーを接着することができる。このようなエラストマーとしては、具体的には、シルガード（シルガードはダウコーニング社の登録商標）や、信越化学工業社製の二液型ＲＴＶゴム（型取り用）を挙げることができる。 When using a resin composition as an adhesive layer, as the resin composition, a resin composition containing a polymer selected from the group consisting of acrylic polymers, silicone polymers, and mixtures thereof can be used. By using these resin compositions, it becomes possible to improve the sealing property as compared with the double-sided tape, and it is more stable for long-term incubation than the double-sided tape. It is particularly preferred in analytical systems that require a period of incubation. In particular, when a silicone-based elastomer is used as the adhesive layer, the sealing property is good and the cover can be bonded in a state where it can be easily detached. Specific examples of such an elastomer include Sylgard (Silgard is a registered trademark of Dow Corning) and two-component RTV rubber (for mold making) manufactured by Shin-Etsu Chemical Co., Ltd.
上記カバー部材の形状は、前記選択結合性物質固定化担体の表面の少なくとも一面の一部を覆い、担体と、カバー部材との間に空隙を有するよう接着されうるものであれば特に限定されないが、その外周部分において、担体に近い部分より担体に遠い部分において突出した部分を有する構造、すなわちオーバーハング構造が設けられたものとすることができる。オーバーハング構造を設けることにより、担体を損傷せずにカバー部材を脱離することが容易となるので、好ましい。 The shape of the cover member is not particularly limited as long as it covers at least one part of the surface of the selective binding substance-immobilized carrier and can be bonded so as to have a gap between the carrier and the cover member. The outer peripheral portion may be provided with a structure having a protruding portion at a portion farther from the carrier than a portion near the carrier, that is, an overhang structure. Providing an overhang structure is preferable because it is easy to remove the cover member without damaging the carrier.
また、本発明の分析用チップは、カバー部材及び任意に接着層を含む構造により規定される空隙を有するが、当該空隙は、１つの空間でもよく、複数の仕切られた空間であってもよい。複数の仕切られた空間は、例えば図８に示すような仕切り構造により設けることができる。図８に示す例においては、カバー部材の凸部３Ａ及び選択結合性物質固定化担体１が接着層３０Ａを介して接着することにより、複数の仕切られた空間３１を設けている。複数の仕切られた空間を設ける別の例として、例えば図９に示すような仕切り構造を設けることもできる。図９に示す例においては、担体の凸部１４及びカバー部材３が接着層３０Ｂを介して接着することにより、複数の仕切られた空間３１を設けている。また、さらに別の例として、図１０に示すように、担体及びカバー部材に特に仕切り構造を設けるための凸部を設けず、接着層３０Ａのみで空隙を仕切り、複数の仕切られた空間を設けることもできる。これらの例においては、空間３１は、互いに連通せず、それぞれが別々に、１以上の貫通孔３２及び液面駐止用チャンバー３３を有することになる。このように、複数の仕切られた空間を設けることによって、１枚の分析用チップに複数種の検体溶液をアプライすることが可能となり、従って複数種の検体を同時に１枚の分析用チップで測定することができる。
Further, the analysis chip of the present invention has a gap defined by a structure including a cover member and optionally an adhesive layer, but the gap may be one space or a plurality of partitioned spaces. . The plurality of partitioned spaces can be provided by a partition structure as shown in FIG. 8, for example. In the example shown in FIG. 8, a plurality of partitioned
本発明の分析用チップは、一枚の担体あたり一枚のカバー部材を有していてもよく、二枚以上のカバー部材を有していてもよい。具体的には、図１１及び図１２に示す通り、一枚の選択結合性物質固定化担体１上に、複数のカバー部材３Ｂを有することができる。複数のカバー部材３Ｂのそれぞれは、それぞれ別の接着層３０Ｃを介して選択結合性物質固定化担体１上に設けることができる。好ましくは、複数のカバー部材３Ｂのそれぞれが、選択結合性物質固定化担体１との間に空隙３１を有し、且つ各空隙に連通する１つ以上の貫通孔を有することができ、そして、各カバー部材３Ｂがそれぞれ別の、選択結合性物質が固定化された領域１２を有することができる。このような態様をとることによって、上記複数の仕切られた空間を有する態様と同様に、複数種の検体を同時に１枚の分析用チップで測定する等の効果を得ることができる。さらに、このような態様をとることにより、それぞれの領域１２についてカバー部材を独立して脱離させることができるので、例えば一つの領域１２について分析を行った後に他の領域１２を用いて分析を行うといった、独立した使用を行いうる。
The analysis chip of the present invention may have one cover member per one carrier, or may have two or more cover members. Specifically, as shown in FIGS. 11 and 12, a plurality of
本発明の分析用チップを構成するカバーの材料としては、特に限定されるものではないが、検体溶液をアプライした際に、溶液の様子を観察可能とするために、透明な材料が好ましい。そのような材質としては、ガラス又はプラスチックが挙げられる。特に、貫通孔や液面駐止チャンバー等の構造を容易に作製可能という点から、ポリスチレン、ポリメチルメタクリレート、ポリカーボネート等の透明樹脂を好ましく用いることができる。カバーの作製方法も特に限定されるものではなく、切削加工や射出成型法による加工が可能である。大量生産が可能という観点から、射出成型法を好ましく用いることができる。 The material of the cover constituting the analysis chip of the present invention is not particularly limited, but a transparent material is preferable so that the state of the solution can be observed when the sample solution is applied. Such materials include glass or plastic. In particular, transparent resins such as polystyrene, polymethyl methacrylate, and polycarbonate can be preferably used from the viewpoint that structures such as through holes and liquid level holding chambers can be easily produced. The method for producing the cover is not particularly limited, and machining by cutting or injection molding is possible. From the viewpoint that mass production is possible, an injection molding method can be preferably used.
本発明の分析用チップにおける、凹凸部、カバー部材及び微粒子もしくは微粒子（マイクロロッド）の関係の好ましい例を、図１３を参照して説明する。図１３に示した例では、ＤＮＡ等の選択結合性物質４５は、選択結合性物質固定化担体１の凸部上面１１上に固定化されている。そして、微粒子（マイクロロッド）２は、選択結合性物質固定化担体１の凹部１０Ａ、１０Ｂおよび１０Ｃの空隙内に載置されている。特に、微粒子（マイクロロッド）は、サブブロック領域間の凹部１０Ａおよび１０Ｃに格納されるので、微粒子の大きさやマイクロロッドの直径に関わらず効率よく撹拌することが可能となる。選択結合性物質４５及び微粒子（マイクロロッド）２は、ＤＮＡが含まれる検体溶液（図示せず）に触れることになる。検体溶液は、選択結合性物質固定化担体１、接着層３０及びカバー部材３により規定される空隙内で保持されることになる。図１３の例においては、選択結合性物質固定化担体の凸部上面１１とカバー部材３との間隔の最短距離が、微粒子（マイクロロッド）２の直径（マイクロロッドの場合底面直径）未満となっている。それにより、微粒子等が凸部上端面１１に接触できなくなり、凸部上面１１上の選択結合性物質４５を傷つけることを防ぐことができる。微粒子の形状やマイクロロッドの底面が、例えば楕円形、多角形等の非球状の形状である場合は、凸部上面とカバー部材３との間隔の最短距離が底面最小径未満であれば、同様に凸部上面１１と微粒子（マイクロロッド）２との接触を防ぎ、選択結合性物質４５の損傷を防ぐことが可能となる。
A preferred example of the relationship between the concavo-convex portion, the cover member, and fine particles or fine particles (microrods) in the analysis chip of the present invention will be described with reference to FIG. In the example shown in FIG. 13, the selective
このような本発明の選択結合性物質固定化担体は、各種検体の分析に利用することができる。
すなわち、本発明の選択結合性物質固定化担体に、被検物質を接触させて選択的に結合させ、前記選択結合性物質固定化担体上に前記選択結合性物質を介して結合した前記被検物質量を測定することにより、検体を分析することができる。
Such a selective binding substance-immobilized carrier of the present invention can be used for analysis of various specimens.
That is, the test substance bonded to the selective binding substance-immobilized carrier of the present invention by selectively contacting the test substance with the test substance and binding to the selective binding substance-immobilized support via the selective binding substance. The sample can be analyzed by measuring the amount of the substance.
本発明の選択結合性物質固定化担体や分析用チップを用いた測定方法に供せられる被検物質としては、測定すべき核酸、例えば、病原菌やウイルス等の遺伝子や、遺伝病の原因遺伝子等並びにその一部分、抗原性を有する各種生体成分、病原菌やウイルス等に対する抗体等を挙げることができるが、これらに限定されるものではない。また、これらの被検物質を含む検体としては、血液、血清、血漿、尿、便、髄液、唾液、各種組織液等の体液や、各種飲食物並びにそれらの希釈物等を挙げることができるがこれらに限定されるものではない。また、検体となる核酸は、血液や細胞から常法により抽出した核酸を標識してもよいし、該核酸を鋳型として、ＰＣＲ等の核酸増幅法によって増幅したものであってもよい。後者の場合には、測定感度を大幅に向上させることが可能である。核酸増幅産物を検体とする場合には、蛍光物質等で標識したヌクレオシド三リン酸の存在下で増幅を行うことにより、増幅核酸を標識することが可能である。また、検体が抗原又は抗体の場合には、検体である抗原や抗体を常法により直接標識してもよいし、検体である抗原又は抗体を選択結合性物質と結合させた後、担体を洗浄し、該抗原又は抗体と抗原抗体反応する標識した抗体又は抗原を反応させ、担体に結合した標識を測定することもできる。 Examples of the test substance used in the measurement method using the selective binding substance-immobilized carrier or the analysis chip of the present invention include nucleic acids to be measured, such as genes such as pathogenic bacteria and viruses, genes causing genetic diseases, etc. In addition, a part thereof, various biological components having antigenicity, antibodies against pathogenic bacteria, viruses and the like can be exemplified, but the invention is not limited thereto. Examples of specimens containing these test substances include body fluids such as blood, serum, plasma, urine, feces, spinal fluid, saliva, various tissue fluids, various foods and beverages, and dilutions thereof. It is not limited to these. Moreover, the nucleic acid used as the specimen may be labeled with a nucleic acid extracted from blood or cells by a conventional method, or may be amplified by a nucleic acid amplification method such as PCR using the nucleic acid as a template. In the latter case, the measurement sensitivity can be greatly improved. When a nucleic acid amplification product is used as a sample, the amplified nucleic acid can be labeled by performing amplification in the presence of a nucleoside triphosphate labeled with a fluorescent substance or the like. When the specimen is an antigen or an antibody, the specimen antigen or antibody may be directly labeled by a conventional method, or after the specimen antigen or antibody is bound to a selective binding substance, the carrier is washed. Then, a labeled antibody or antigen that reacts with the antigen or antibody and an antigen antibody can be reacted, and the label bound to the carrier can be measured.
本発明の被検物質の分析方法においては、まず、前記本発明の選択結合性物質固定化担体に被検物質を接触させて選択的に結合させる。すなわち、本発明の選択結合性物質固定化担体に上述のような標識、増幅等を施した検体を水溶液や適当な緩衝液等に溶解させた検体溶液とし、担体に接触させれば良い。
担体への接触は、マイクロロッドが上記選択結合性物質固定化担体の凹凸部に検体を水溶液や適当な緩衝液等の溶液とし、ピペット等の通常の器具で注入することにより行うことができる。
In the test substance analysis method of the present invention, first, the test substance is brought into contact with the selective binding substance-immobilized carrier of the present invention and selectively bound thereto. That is, a sample solution obtained by dissolving the above-described labeling, amplification and the like on the selective binding substance-immobilized carrier of the present invention in an aqueous solution or an appropriate buffer solution may be brought into contact with the carrier.
The contact with the carrier can be carried out by using a microrod as a solution such as an aqueous solution or a suitable buffer solution in a concavo-convex portion of the selective binding substance-immobilized carrier and injecting it with a normal instrument such as a pipette.
また、本発明の分析用チップを利用する場合には、前記カバー部材の貫通孔から被検物質をアプライし、前記カバー部材に封止部材を貼付して前記貫通孔を封止し、前記被検物質を前記分析用チップを構成する担体に選択的に結合させることができる。
貫通孔からの検体のアプライは、例えば、前記貫通孔からピペット等の通常の器具で注入して行うことができる。
When the analysis chip of the present invention is used, a test substance is applied from the through hole of the cover member, a sealing member is attached to the cover member to seal the through hole, and the target The test substance can be selectively bound to the carrier constituting the analysis chip.
The sample can be applied from the through hole by, for example, injecting it from the through hole with a normal instrument such as a pipette.
カバー部材への封止部材の貼付は、貫通孔の一部又は全て、好ましくは全てを封止する態様にて行うことができる。前記封止部材としては、例えばカプトン（商標、ポリイミドフィルム、東レ・デュポン社製）、ポリエステル、セロハン、又は塩化ビニル製の粘着テープ等の可とう性のテープを好ましく挙げることができるが、これに限らず、非可とう性の板状の接着可能な任意の部材を用いることもでき、非定型のシーリング剤を用いることもできるが、液面駐止用チャンバーによる本発明の効果をより良好に得るという観点からは、可とう性のテープ及び板状の部材が好ましく、操作の簡便性などの観点から、可とう性のテープがさらに好ましい。封止部材としてテープ又は板状の部材を用いる場合、その使用枚数は任意である。具体的には、カバー部材上の全ての貫通孔を一枚の封止部材で封止してもよく、複数の封止部材を用いてそれぞれで複数の貫通孔の一部を封止してもよい。また、前記の通り一枚の担体上に複数のカバー部材が設けられている場合、カバー部材のそれぞれに別々の封止部材を用いてもよく、複数のカバー部材上の貫通孔をまとめて一枚の封止部材で封止してもよい。通常は、一枚のカバー部材あたり一枚の封止部材を用いることが、簡便且つ確実な封止を達成しうることから好ましい。 Affixing of the sealing member to the cover member can be performed in a mode in which part or all, preferably all, of the through hole is sealed. Preferred examples of the sealing member include flexible tapes such as Kapton (trademark, polyimide film, manufactured by Toray DuPont), polyester, cellophane, or vinyl chloride adhesive tape. Not limited, it is possible to use any non-flexible plate-like adhesive member, and an atypical sealing agent can be used, but the effect of the present invention by the liquid level chamber can be improved. From the viewpoint of obtaining, a flexible tape and a plate-like member are preferable, and from the viewpoint of easy operation, a flexible tape is more preferable. When a tape or plate-like member is used as the sealing member, the number of sheets used is arbitrary. Specifically, all the through-holes on the cover member may be sealed with a single sealing member, and a plurality of through-holes are sealed with a plurality of sealing members, respectively. Also good. In addition, when a plurality of cover members are provided on a single carrier as described above, separate sealing members may be used for each of the cover members, and the through holes on the plurality of cover members are combined together. You may seal with the sealing member of a sheet. Usually, it is preferable to use one sealing member per one cover member because simple and reliable sealing can be achieved.
封止の具体例を、再び図１３を参照して説明する。図１３の例では、検体溶液（図示せず）を貫通孔３２よりアプライした後、可とう性の粘着テープ３４を、液面駐止用チャンバー３３の全面を覆うように貼付し、貫通孔を封止している。このような態様により、簡便で且つ検体溶液の漏出や測定誤差を招かない封止を達成できる。
A specific example of sealing will be described with reference to FIG. 13 again. In the example of FIG. 13, after applying a sample solution (not shown) from the through
本発明の分析方法において、選択的な結合とは、選択結合性物質と被検物質とを相互作用させ、前記被検物質を前記選択結合性物質を介して前記選択結合性物質固定化担体に結合させることを意味する。本発明の選択結合性物質固定化担体や分析用チップの場合には、選択結合性物質固定化担体又はチップを揺動、回転させることにより、重量、振動、遠心力によってマイクロロッドが検体溶液中を移動するので、選択的結合を効率よく進めることができる。
選択的結合の際の反応温度及び時間は、ハイブリダイズさせる検体の核酸の鎖長や、免疫反応に関与する抗原及び／又は抗体の種類等に応じて適宜選択されるが、核酸のハイブリダイゼーションの場合、通常、４０℃〜７０℃程度で１分間〜十数時間、免疫反応の場合には、通常、室温〜４０℃程度で１分間〜数時間程度である。また、必要に応じて選択結合性物質固定化担体を揺動、回転等させ、選択的結合を促進することができる。
選択的結合が終了した後、通常はカバー部材を脱離させた後、次の工程に供することができる。
In the analysis method of the present invention, the selective binding means that the selective binding substance and the test substance interact with each other, and the test substance is made to the selective binding substance-immobilized carrier via the selective binding substance. It means to combine. In the case of the selective binding substance-immobilized carrier or the analysis chip according to the present invention, the microrod is moved in the sample solution by weight, vibration, or centrifugal force by swinging and rotating the selective binding substance-immobilized carrier or chip. Therefore, selective binding can be efficiently performed.
The reaction temperature and time for selective binding are appropriately selected according to the nucleic acid chain length of the sample to be hybridized, the type of antigen and / or antibody involved in the immune reaction, etc. In the case of an immune reaction, the temperature is usually about 40 ° C. to 70 ° C. for about 1 minute to several tens of hours. Further, the selective binding substance-immobilized carrier can be swung, rotated, etc. as necessary to promote selective binding.
After the selective bonding is completed, the cover member is usually detached and can be used for the next step.
本発明の分析方法においては、上述の選択的結合の後、前記選択結合性物質固定化担体上に前記選択結合性物質を介して結合した前記被検物質量を測定する。この測定も、従来の分析用チップにおける操作と全く同様に行うことができる。例えば、適宜蛍光標識され、選択結合性物質と結合した被検物質の質量について、公知のスキャナ等により、その蛍光量を読み取ることにより測定することができる。 In the analysis method of the present invention, after the selective binding described above, the amount of the test substance bound to the selective binding substance-immobilized carrier via the selective binding substance is measured. This measurement can also be performed in exactly the same manner as in the conventional analysis chip. For example, the mass of a test substance that is appropriately fluorescently labeled and bound to a selective binding substance can be measured by reading the amount of fluorescence with a known scanner or the like.
本発明の分析方法において、選択結合性物質として核酸を固定化した場合には、この核酸又はその一部と相補的な配列を有する核酸を測定することができる。また、選択結合性物質として抗体又は抗原等の蛋白質を固定化した場合には、この抗体又は抗原と免疫的に反応する抗原又は抗体を測定することができる。なお、本明細書でいう「測定」には、検出と定量の両者の意味が含まれる。 In the analysis method of the present invention, when a nucleic acid is immobilized as a selective binding substance, a nucleic acid having a sequence complementary to this nucleic acid or a part thereof can be measured. In addition, when a protein such as an antibody or an antigen is immobilized as a selective binding substance, an antigen or antibody that immunoreacts with this antibody or antigen can be measured. The term “measurement” used in this specification includes both detection and quantification.
本発明の選択結合性物質固定化担体、及び分析用チップは、分析用キットとして提供されることも可能である。
すなわち、本発明の分析用キットは、上記選択結合性物質固定化担体と、前記選択結合性物質固定化担体の表面を覆い前記選択結合性物質固定化担体と接着されたカバー部材と、前記カバー部材に貼付し前記貫通孔を封止する封止部材とを含むか、或いは、上記分析用チップと、前記カバー部材に貼付し前記貫通孔を封止する封止部材とを含むことを特徴とする。
The selective binding substance-immobilized carrier and the analysis chip of the present invention can be provided as an analysis kit.
That is, the analysis kit of the present invention includes the selective binding substance-immobilized carrier, a cover member that covers the surface of the selective binding substance-immobilized carrier and is bonded to the selective binding substance-immobilized carrier, and the cover A sealing member that is attached to a member and seals the through hole, or includes the analysis chip and a sealing member that is attached to the cover member and seals the through hole. To do.
本発明の分析用キットにおいて含まれうる前記カバー部材に関しては、本発明の分析用チップにおいて述べたとおりである。また、前記封止部材に関しては、前記本発明の分析方法において説明したものと同様のものを含むことができる。
このような本発明の分析用キットは、前記本発明の分析方法に従って使用することができる。
The cover member that can be included in the analysis kit of the present invention is as described in the analysis chip of the present invention. Moreover, regarding the sealing member, the same one as described in the analysis method of the present invention can be included.
Such an analysis kit of the present invention can be used according to the analysis method of the present invention.
本発明を以下の実施例によって更に詳細に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。 The invention is illustrated in more detail by the following examples. However, the present invention is not limited to the following examples.
参考例１（基板の作製）
公知の技術であるＬＩＧＡ（Lithographie Galvanoformung Abformung）法により、カーボンブラックを含有したポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）製の成形板を３種類作製した。
Reference example 1 (fabrication of substrate)
Three types of molded plates made of polymethylmethacrylate (PMMA) containing carbon black were produced by a known technique of LIGA (Lithographie Galvanoformung Abformung).
（基板１）
図１４に示す基板を作製した。すなわち、基板１の外形は７５×２５×１ｍｍであり、基板表面には、４０×２０ｍｍの凹凸部が設けられている。その中心部には凸部の集団からなる３２個のサブブロックが存在する。そのサブブロック中には、上面直径０．１ｍｍの凸部１１がピッチ０．２４５ｍｍで、１７×１７の格子状に配置されている。基板全体には１７×１７×３２＝９２４８個の凸部が設けられている。また、サブブロック間１０Ａは０．４８ｍｍのスペースが設けられている。１つのサブブロックのサイズ、および隣接するサブブロック間の距離は、それぞれ、凸部中心軸間の距離で３．９２×３．９２ｍｍ、０．５８ｍｍであり、サブブロック３２個全体のサイズは、同様に凸部中心軸間の距離で３５．４２×１７．４２ｍｍである。更に、サブブロック内における凸部上面と底面との距離（深さ）は０．１ｍｍであり、一方それ以外の基板の堀込まれている部分（サブブロック間、および、平坦部１３とサブブロックの間）の深さは０．１５ｍｍとなっている。尚、図１４中の各部位のサイズ及び距離を示す数値は、いずれも単位ｍｍによる表示である。
(Substrate 1)
A substrate shown in FIG. 14 was produced. That is, the outer shape of the
（基板２）
サブブロック間、および、平坦部とサブブロックの間の深さを０．１ｍｍとした以外は、基板１と同様なデザインで作製した。すなわち、基板の深さを全て０．１ｍｍとした以外は基板１と同じである。
(Substrate 2)
The substrate was manufactured in the same design as the
（基板３）
凸部のピッチを０．２６ｍｍとして等間隔に凸部を配置した基板を作製した。図１５に示す。すなわち、この基板においてはサブブロックに相当するものはない。なお、凸部とその底面までの深さ、および、平坦部と凸部の間の深さを０．１ｍｍとした。すなわち、基板の凹部の深さを全て０．１ｍｍとした。尚、図１５中の各部位のサイズ及び距離を示す数値は、いずれも単位ｍｍによる表示である。
(Substrate 3)
A substrate having protrusions arranged at equal intervals with a pitch of the protrusions of 0.26 mm was produced. As shown in FIG. That is, there is no sub-block corresponding to this substrate. In addition, the depth to a convex part and its bottom face, and the depth between a flat part and a convex part were 0.1 mm. That is, all the depths of the concave portions of the substrate were set to 0.1 mm. Note that the numerical values indicating the size and distance of each part in FIG. 15 are all displayed in units of mm.
参考例２（プローブＤＮＡの固定化）
上記３種類の基板を１０Ｎの水酸化ナトリウム水溶液に６５℃で１２時間浸漬した。次いで、純水、０．１Ｎ ＨＣｌ水溶液、純水の順で洗浄した。このようにして、板表面のＰＭＭＡの側鎖を加水分解して、カルボキシル基を生成した。
配列番号１（６０塩基、５’末端アミノ化）で表される塩基配列を有するＤＮＡ（以下、配列番号１のＤＮＡと記載することがある）を合成した。配列番号１のＤＮＡは５’末端がアミノ化されている。
Reference Example 2 (Immobilization of probe DNA)
The three types of substrates were immersed in a 10N aqueous sodium hydroxide solution at 65 ° C. for 12 hours. Subsequently, it wash | cleaned in order of the pure water, 0.1N HCl aqueous solution, and a pure water. Thus, the side chain of PMMA on the plate surface was hydrolyzed to generate a carboxyl group.
A DNA having the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 (60 bases, 5 ′ terminal amination) (hereinafter sometimes referred to as the DNA of SEQ ID NO: 1) was synthesized. The DNA of SEQ ID NO: 1 is aminated at the 5 ′ end.
これらのＤＮＡを、純水に０．２７ｎｍｏｌ／μｌの濃度で溶かして、ストックソリューションとした。基板に点着する際は、ＰＢＳ（ＮａＣｌを８ｇ、Ｎａ2ＨＰＯ4・１２Ｈ2Ｏを２．９ｇ、ＫＣｌを０．２ｇ、ＫＨ2ＰＯ4を０．２ｇ純水に溶かし１ｌにメスアップしたものにｐＨ調整用の塩酸を加えたもの、ｐＨ５．５）でプローブの終濃度を０．０２７ｎｍｏｌ／μｌとし、かつ、担体表面のカルボン酸とプローブＤＮＡの末端のアミノ基とを縮合させるため、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）を加え、この終濃度を５０ｍｇ／ｍｌとした。そして、これらの混合溶液をおよそ４０μｌ取り出して、スポッティング用ロボット（日本レーザー電子（株）、ＧＴＭＡＳ Ｓｔａｍｐ−２）を用い、上記３種類の基板について、図１で示すＳ１２、Ｓ１３、Ｓ２０、Ｓ２１サブブロックに相当する全ての凸部上面にＤＮＡのスポットを行った。すなわち、プローブＤＮＡをスポットした凸部の数は、基板一枚あたり１７×１７×４＝１１５６個となる。なお、基板３については上記４つのサブブロックの位置に相当する同じ数の凸部上面にスポットを行った。次いで、基板を密閉したプラスチック容器に入れて、３７℃、湿度１００％の条件で２０時間程度インキュベートして、純水で洗浄した。
These DNAs were dissolved in pure water at a concentration of 0.27 nmol / μl to obtain a stock solution. When spotting on the substrate, PBS (NaCl 8g, Na 2 HPO 4 · 12H 2 O 2.9g, KCl 0.2g, KH 2 PO 4 0.2g in pure water was made up to 1 l. In order to condense the carboxylic acid on the surface of the carrier and the amino group at the end of the probe DNA, the final concentration of the probe is 0.027 nmol / μl with hydrochloric acid for pH adjustment added to the product, pH 5.5) 1-Ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDC) was added to bring the final concentration to 50 mg / ml. Then, about 40 μl of these mixed solutions are taken out, and using the spotting robot (Nippon Laser Electronics Co., Ltd., GTMAS Stamp-2), the above-mentioned three types of substrates are subjected to S12, S13, S20, and S21 subs shown in FIG. DNA spots were spotted on the upper surfaces of all convex portions corresponding to the blocks. That is, the number of convex portions spotted with the probe DNA is 17 × 17 × 4 = 1156 per substrate. In addition, about the board |
参考例３（検体ＤＮＡの調製）
検体ＤＮＡとして、上記ＤＮＡ固定化基板とハイブリダイズ可能な塩基配列を持つ配列番号２で表される塩基配列を有するＤＮＡ（９６８塩基、以下、配列番号２のＤＮＡと記載することがある）を用いた。調製方法を以下に示す。配列番号３で表される塩基配列を有するＤＮＡ（以下、配列番号３のＤＮＡと記載することがある）と配列番号４で表される塩基配列を有するＤＮＡ（以下、配列番号４のＤＮＡと記載することがある）を合成した。これを純水にとかして濃度を１００μＭとした。次いで、ｐＫＦ３ プラスミドＤＮＡ（タカラバイオ（株）製品番号；３１００）（配列番号５で表される塩基配列を有するＤＮＡ：２２６４塩基）を用意して、これをテンプレートとし、配列番号３および配列番号４のＤＮＡをプライマーとして、ＰＣＲ反応（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）により増幅を行った。
Reference Example 3 (Preparation of sample DNA)
As a sample DNA, a DNA having a base sequence represented by SEQ ID NO: 2 having a base sequence capable of hybridizing with the DNA-immobilized substrate (968 bases, hereinafter sometimes referred to as DNA of SEQ ID NO: 2) is used. It was. The preparation method is shown below. DNA having the base sequence represented by SEQ ID NO: 3 (hereinafter sometimes referred to as DNA of SEQ ID NO: 3) and DNA having the base sequence represented by SEQ ID NO: 4 (hereinafter referred to as DNA of SEQ ID NO: 4) Was synthesized). This was dissolved in pure water to a concentration of 100 μM. Next, pKF3 plasmid DNA (Takara Bio Inc. product number: 3100) (DNA having the base sequence represented by SEQ ID NO: 5: 2264 bases) is prepared, and this is used as a template. SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4 Amplification was carried out by PCR reaction (Polymerase Chain Reaction) using the DNA of.
ＰＣＲの条件は以下の通りである。すなわち、ＥｘＴａｑ ２μｌ、１０×ＥｘＢｕｆｆｅｒ ４０μｌ、ｄＮＴＰ Ｍｉｘ ３２μｌ（以上はタカラバイオ（株）製 製品番号ＲＲ００１Ａに付属）、配列番号３で表される塩基配列を有するＤＮＡの溶液を２μｌ、配列番号４のＤＮＡの溶液を２μｌ、テンプレート（配列番号５で表される塩基配列を有するＤＮＡ）を０．２μｌを加え、純水によりトータル４００μｌにメスアップした。これらの混合液を、４つのマイクロチューブに分け、サーマルサイクラーを用いてＰＣＲ反応を行った。これを、エタノール沈殿により精製し、４０μｌの純水に溶解した。ＰＣＲ反応後の溶液の一部をとり電気泳動で確認したところ、増幅したＤＮＡの塩基長は、およそ９６０塩基であり配列番号２のＤＮＡ（９６８塩基）が増幅されていることを確認した。
The conditions for PCR are as follows. That is,
次いで、９塩基のランダムプライマー（タカラバイオ（株）製；製品番号３８０２）を６ｍｇ／ｍｌの濃度に溶かし、上記のＰＣＲ反応後精製したＤＮＡ溶液に２μｌ加えた。この溶液を１００℃に加熱した後、氷上で急冷した。これらにＫｌｅｎｏｗ Ｆｒａｇｍｅｎｔ（タカラバイオ（株）製；製品番号２１４０ＡＫ）付属のバッファーを５μｌ、ｄＮＴＰ混合物（ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰの濃度はそれぞれ２．５ｍＭ、ｄＣＴＰの濃度は４００μＭ）を２．５μｌ加えた。さらに、Ｃｙ３−ｄＣＴＰ（アマシャムファルマシアバイオテク製；製品番号ＰＡ５３０２１）を２μｌ加えた。この溶液に１０ＵのＫｌｅｎｏｗ Ｆｒａｇｍｅｎｔを加え、３７℃で２０時間インキュベートし、Ｃｙ３で標識された検体ＤＮＡを得た。なお、標識の際ランダムプライマーを用いたので検体ＤＮＡの長さには、ばらつきがある。最も長い検体ＤＮＡは配列番号２のＤＮＡ（９６８塩基）となる。なお、検体ＤＮＡの溶液を取り出して、電気泳動で確認したところ、９６０塩基に相当する付近にもっとも強いバンドが現れ、それより短い塩基長に対応する領域に薄くスメアがかかった状態であった。そして、これをエタノール沈殿により精製し、乾燥した。 Subsequently, a 9-base random primer (manufactured by Takara Bio Inc .; product number 3802) was dissolved at a concentration of 6 mg / ml, and 2 μl was added to the DNA solution purified after the PCR reaction. This solution was heated to 100 ° C. and then rapidly cooled on ice. To this, 5 μl of the buffer attached to Klenow Fragment (Takara Bio Inc .; product number 2140AK) and 2.5 μl of dNTP mixture (dATP, dTTP, and dGTP concentrations of 2.5 mM and dCTP concentration of 400 μM, respectively) were added. . Furthermore, 2 μl of Cy3-dCTP (manufactured by Amersham Pharmacia Biotech; product number PA53021) was added. To this solution, 10 U of Klenow Fragment was added and incubated at 37 ° C. for 20 hours to obtain sample DNA labeled with Cy3. Since the random primer is used for labeling, the length of the sample DNA varies. The longest sample DNA is the DNA of SEQ ID NO: 2 (968 bases). When the sample DNA solution was taken out and confirmed by electrophoresis, the strongest band appeared in the vicinity corresponding to 960 bases, and the region corresponding to a shorter base length was thinly smeared. This was purified by ethanol precipitation and dried.
この標識化された検体ＤＮＡを、１重量％ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）、５×ＳＳＣ（５×ＳＳＣとはＮａＣｌを４３．８ｇ、クエン酸３ナトリウム水和物を２２．１ｇの純水にとかし、２００ｍｌにメスアップしたものを意味する。またＮａＣｌを４３．８ｇ、クエン酸３ナトリウム水和物を２２．１ｇ純水にとかし、１ｌにメスアップしたものを１×ＳＳＣと表記し、これの１０倍濃縮液を１０×ＳＳＣ、５倍希釈液を０．２×ＳＳＣと表記する。）、０．１重量％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）、０．０１重量％サケ***ＤＮＡの溶液（各濃度はいずれも終濃度）、８００μｌに溶解し、ハイブリダイゼーション用の検体溶液とした。 This labeled sample DNA is dissolved in 1% by weight BSA (bovine serum albumin), 5 × SSC (5 × SSC is 43.8 g of NaCl and trisodium citrate hydrate is dissolved in 22.1 g of pure water. 200 ml of NaCl, 43.8 g of NaCl and 22.1 g of trisodium citrate hydrate dissolved in pure water, and 1 ml of which is made up to 1 l. A 10-fold concentrated solution is expressed as 10 × SSC, and a 5-fold diluted solution is expressed as 0.2 × SSC.), 0.1 wt% SDS (sodium dodecyl sulfate), 0.01 wt% salmon sperm DNA solution (each concentration Were dissolved in 800 μl to obtain a sample solution for hybridization.
実施例１
基板１に図５及び図６で示す、ＰＭＭＡのカバーを両面テープ（日東電工製、Ｎｏ．５３５Ａ）で貼り付けた。その結果、凸部上面とカバー下面との間のスペースは１００μｍ程度となった。
次いで、直径１８０μｍのジルコニア製ビーズ（東レ製）をカバーの穴から入れたところ特に問題なく入れることが可能であり、このビーズはブロック領域の間に充填することが可能であった。次いで、検体溶液１２０μＬをカバーの穴から、マイクロピペットを用いて注意深く注入した。さらに検体溶液の蒸発などを防ぐため、粘着テープによりカバーの穴を塞いだ。カバーに液面駐止チャンバーがあるために、毛細管現象などによる不具合が起きることなく、検体溶液のシーリングが可能であった。
Example 1
The PMMA cover shown in FIGS. 5 and 6 was attached to the
Next, when a bead made of zirconia having a diameter of 180 μm (manufactured by Toray Industries Inc.) was put through the hole of the cover, it was possible to put it without any problem, and this bead could be filled between the block regions. Then, 120 μL of the sample solution was carefully injected from the hole of the cover using a micropipette. Furthermore, in order to prevent the sample solution from evaporating, the hole in the cover was closed with an adhesive tape. Since the cover has a liquid level chamber, it was possible to seal the sample solution without causing troubles such as capillary action.
次いで、この基板をハイブリダイゼーション用のチャンバー（（株）カケンジェネティック製）に入れ、このチャンバーを振とう機（タイテック製、ＮＲ−８０）に貼り付け、２５０ｒｐｍで回転振とうをしつつ、４２℃で１６時間インキュベートした。インキュベート後カバーを取り除き、洗浄を行った後、ＤＮＡチップ用のスキャナー（Ａｘｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社のＧｅｎｅＰｉｘ ４０００Ｂ）に上記処理後の担体をセットし、レーザー出力３３％、フォトマルチプライヤーの電圧設定を５００にした状態で測定を行った。スポットのシグナル強度の平均値とそのＣＶ値とを表１に示す。ここで、シグナル強度の平均とは各スポット（凸部）１１５６個の蛍光強度の平均値である。 Next, the substrate was placed in a hybridization chamber (manufactured by Kaken Genetics Co., Ltd.), and the chamber was attached to a shaker (manufactured by Taitec Co., Ltd., NR-80). And incubated for 16 hours. After incubation, the cover was removed, and after washing, the carrier after the above treatment was set on a DNA chip scanner (Axon Instruments GenePix 4000B), the laser output was set to 33%, and the voltage setting of the photomultiplier was set to 500. Measurements were made in the state. The average value of the signal intensity of the spot and its CV value are shown in Table 1. Here, the average signal intensity is an average value of fluorescence intensity of 1156 spots (convex parts).
実施例２
基板２を使用した以外は実施例１と同様な操作を行った。ただし、この場合は、カバーと基板との間に直径１８０μｍのビーズが引っかかることがあり、実施例１に比較しビーズの動きが悪かったが、ブロック領域の間にビーズを充填することは可能であった。
実施例１と同様にハイブリダイゼーションを行い、シグナル強度とＣＶ値とを測定した結果を表１に示す。
Example 2
The same operation as in Example 1 was performed except that the
Table 1 shows the results of hybridization performed in the same manner as in Example 1 and measurement of signal intensity and CV value.
比較例１
基板３を使用した以外は、実施例１と同様な操作を行った。この場合、基板にサブブロック構造がないため、直径１８０μｍのビーズを入れても、凸部の周りの領域（図１５−２に示す１０Ｃの領域）にしか充填できなかった。
実施例１と同様にシグナル強度とＣＶ値とを測定した結果を表１に示す。
Comparative Example 1
The same operation as in Example 1 was performed except that the
The results of measuring the signal intensity and the CV value in the same manner as in Example 1 are shown in Table 1.
比較例２
基板３に直径９０μｍのビーズを入れた以外は、比較例１と同様な操作を行った。ビーズ直径を小さくしたためにビーズは柱の間に充填された。
実施例１と同様にシグナル強度とＣＶ値とを測定した結果を表１に示す。
Comparative Example 2
The same operation as in Comparative Example 1 was performed except that beads having a diameter of 90 μm were placed on the
The results of measuring the signal intensity and the CV value in the same manner as in Example 1 are shown in Table 1.
実施例３
検体溶液中に充填するビーズを１８０μｍのものと９０μｍのものを重量比で１：１で混合したものを使用した以外は実施例１と同様の実験を行った。この時、ブロック領域の間には直径１８０μｍのビーズと９０μｍのビーズが充填され、ブロック領域内の柱の間に直径９０μｍのビーズが充填された。
実施例１と同様にシグナル強度とＣＶ値を測定した結果を表１に示す。
Example 3
The same experiment as in Example 1 was performed except that beads filled in the sample solution were mixed with 180 μm and 90 μm in a weight ratio of 1: 1. At this time, beads having a diameter of 180 μm and beads having a diameter of 90 μm were filled between the block regions, and beads having a diameter of 90 μm were filled between the pillars in the block region.
The results of measuring the signal intensity and the CV value in the same manner as in Example 1 are shown in Table 1.
何れの実施例でも、シグナル強度、ＣＶ値とも比較例より優れていた。実施例では、サブブロック領域の間により大きなビーズを添加することが可能であったために、このビーズが移動することにより、より効率的に溶液の撹拌が行われたためであると推定される。その中でも、実施例３がシグナル強度、ＣＶ値とも最も優れていた。これは、２種類の大きさのビーズを組み合わせることにより、溶液の撹拌が最も効率的に行われたためであると推定される。一方、比較例については、大きいビーズを入れた場合、充填可能な領域が限られ、実施例のようにサブブロック領域間に大きいビーズを充填することが不可能なため、また、ビーズを小さくして柱の間にビーズを充填しても、ビーズの大きさが小さいため、十分な攪拌が行われず、結果的にシグナル強度、ＣＶ値とも実施例に比べて劣ったものと考えられる。 In any of the examples, both the signal intensity and the CV value were superior to the comparative example. In the examples, it was possible to add larger beads between the sub-block regions, and it is estimated that the solution was stirred more efficiently by moving the beads. Among them, Example 3 was the most excellent in signal intensity and CV value. This is presumed to be because the solution was most efficiently stirred by combining two types of beads. On the other hand, in the comparative example, when large beads are inserted, the area that can be filled is limited, and it is impossible to fill large beads between sub-block areas as in the example. Even if the beads are filled between the pillars, the size of the beads is small, so that sufficient stirring is not performed. As a result, it is considered that the signal intensity and the CV value are inferior to those of the examples.
１ 担体
１０ 凹部
１０Ａ サブブロック領域間の凹部
１０Ｂ サブブロック領域内の凹部
１０Ｃ サブブロック（または凸部領域）と平坦部領域間の凹部
１１ 凸部
１２ 選択結合性物質が固定化された領域（凹凸部）
１３ 平坦部
１４ 担体凸部
２ 微粒子またはマイクロロッド
３、３Ｂ カバー部材
３Ａ カバー部材凸部
３０、３０Ｃ 接着層
３０Ａ、３０Ｂ 仕切り構造の接着層
３１ 空隙（空間）
３２、３２Ａ、３２Ｂ 貫通孔
３３ 液面駐止用チャンバー
３４ 封止部材（テープ）
３５ 担体とカバー部材との隙間
４０ マイクロアレイを治具に突き当てるためのバネ
４１ 治具
４２ 治具突き当て面
４３ 対物レンズ
４４ レーザー励起光
４５ 担体に固定化された選択結合性物質（ＤＮＡ）
Ｌ１ 凸部ピッチ
Ｓ１〜３２、Ｓｋ、Ｓｋ＋１ サブブロック領域
DESCRIPTION OF
13
32, 32A, 32B Through
35
L1 convex pitches S1 to 32, Sk, Sk + 1 sub-block region
Claims (16)
前記凹凸部は、凸部がマトリクス状に形成された複数のサブブロック領域からなることを特徴とする選択結合性物質固定化担体。 A carrier having a concave and convex portion composed of a concave portion and a convex portion on the carrier, and a selective binding substance immobilized on the upper surfaces of the plurality of convex portions constituting the concave and convex portion,
The selective binding substance-immobilized carrier according to claim 1, wherein the concavo-convex portion includes a plurality of sub-block regions having convex portions formed in a matrix.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2007002503A JP5092405B2 (en) | 2006-01-12 | 2007-01-10 | Selective binding substance immobilization carrier |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2006005027 | 2006-01-12 | ||
| JP2006005027 | 2006-01-12 | ||
| JP2007002503A JP5092405B2 (en) | 2006-01-12 | 2007-01-10 | Selective binding substance immobilization carrier |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2007212446A true JP2007212446A (en) | 2007-08-23 |
| JP5092405B2 JP5092405B2 (en) | 2012-12-05 |
Family
ID=38491000
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2007002503A Active JP5092405B2 (en) | 2006-01-12 | 2007-01-10 | Selective binding substance immobilization carrier |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP5092405B2 (en) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP2026273A1 (en) | 2007-08-16 | 2009-02-18 | Kabushiki Kaisha Toshiba | Apparatus, method and computer program product for processing email, and apparatus for searching email |
| JP2009250698A (en) * | 2008-04-03 | 2009-10-29 | Sumitomo Bakelite Co Ltd | Plastic substrate for microarray |
| WO2010106989A1 (en) | 2009-03-16 | 2010-09-23 | 東レ株式会社 | Analysis chip, analysis method and method for stirring solution |
| WO2012077324A1 (en) * | 2010-12-07 | 2012-06-14 | パナソニック株式会社 | Biochip and array substrate using same |
Citations (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2001068834A1 (en) * | 2000-03-16 | 2001-09-20 | Matsushita Electric Industrial Co., Ltd. | Nucleotide detector, process for producing the same and process for forming fine particle membrane |
| JP2002065274A (en) * | 2000-08-31 | 2002-03-05 | Canon Inc | Method for detecting object component in specimen and substrate for detection to be used therefor |
| JP2002253233A (en) * | 2001-06-04 | 2002-09-10 | Hitachi Ltd | Biochemical sensor and biochemical survey instrument using the same |
| JP2003202343A (en) * | 2001-10-24 | 2003-07-18 | Toray Ind Inc | Method for hybridizing selective bonding substance, hybridization apparatus, and substrate for arranging selective bonding substance |
| JP2003307518A (en) * | 2002-02-14 | 2003-10-31 | Ngk Insulators Ltd | Probe reactive chip, sample analyzer and sample analyzing method |
| WO2004011643A1 (en) * | 2002-07-26 | 2004-02-05 | Kabushiki Kaisha Toshiba | Nucleic acid probe immobilization support and method of detecting target nucleic acid using the same |
| JP2005021015A (en) * | 2003-06-30 | 2005-01-27 | Eiken Chem Co Ltd | Method for detecting trace nucleic acid |
| WO2005090997A1 (en) * | 2004-03-23 | 2005-09-29 | Toray Industries, Inc. | Method of agitating solution |
-
2007
- 2007-01-10 JP JP2007002503A patent/JP5092405B2/en active Active
Patent Citations (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2001068834A1 (en) * | 2000-03-16 | 2001-09-20 | Matsushita Electric Industrial Co., Ltd. | Nucleotide detector, process for producing the same and process for forming fine particle membrane |
| JP2002065274A (en) * | 2000-08-31 | 2002-03-05 | Canon Inc | Method for detecting object component in specimen and substrate for detection to be used therefor |
| JP2002253233A (en) * | 2001-06-04 | 2002-09-10 | Hitachi Ltd | Biochemical sensor and biochemical survey instrument using the same |
| JP2003202343A (en) * | 2001-10-24 | 2003-07-18 | Toray Ind Inc | Method for hybridizing selective bonding substance, hybridization apparatus, and substrate for arranging selective bonding substance |
| JP2003307518A (en) * | 2002-02-14 | 2003-10-31 | Ngk Insulators Ltd | Probe reactive chip, sample analyzer and sample analyzing method |
| WO2004011643A1 (en) * | 2002-07-26 | 2004-02-05 | Kabushiki Kaisha Toshiba | Nucleic acid probe immobilization support and method of detecting target nucleic acid using the same |
| JP2005021015A (en) * | 2003-06-30 | 2005-01-27 | Eiken Chem Co Ltd | Method for detecting trace nucleic acid |
| WO2005090997A1 (en) * | 2004-03-23 | 2005-09-29 | Toray Industries, Inc. | Method of agitating solution |
Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP2026273A1 (en) | 2007-08-16 | 2009-02-18 | Kabushiki Kaisha Toshiba | Apparatus, method and computer program product for processing email, and apparatus for searching email |
| JP2009250698A (en) * | 2008-04-03 | 2009-10-29 | Sumitomo Bakelite Co Ltd | Plastic substrate for microarray |
| WO2010106989A1 (en) | 2009-03-16 | 2010-09-23 | 東レ株式会社 | Analysis chip, analysis method and method for stirring solution |
| CN102356319A (en) * | 2009-03-16 | 2012-02-15 | 东丽株式会社 | Analysis chip, analysis method and method for stirring solution |
| JP5696477B2 (en) * | 2009-03-16 | 2015-04-08 | 東レ株式会社 | Analysis chip, analysis method, and solution stirring method |
| WO2012077324A1 (en) * | 2010-12-07 | 2012-06-14 | パナソニック株式会社 | Biochip and array substrate using same |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP5092405B2 (en) | 2012-12-05 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP5396857B2 (en) | Analysis chip and analysis method | |
| JP4420020B2 (en) | How to stir the solution | |
| JP5696477B2 (en) | Analysis chip, analysis method, and solution stirring method | |
| JP4857882B2 (en) | Sample solution agitation method | |
| JP5092405B2 (en) | Selective binding substance immobilization carrier | |
| JP5504587B2 (en) | Analysis chip | |
| JP4797619B2 (en) | Analysis chip and analysis method of test substance | |
| JP2007304094A (en) | Analytical chip | |
| JP5145752B2 (en) | Analysis chip | |
| JP4946044B2 (en) | Analytical carrier using microrod and analytical method using the analytical carrier | |
| JP2007171144A (en) | Microarray having cover | |
| JP2011106897A (en) | Analyzing chip and solution stirring method | |
| JP2007114191A (en) | Analysis chip, analysis method, and analysis kit | |
| JP2008249677A (en) | Device for introducing liquid, fixing holder, and analysis kit | |
| JP2007285927A (en) | Substrate for immobilizing selective binding material | |
| JP2010014669A (en) | Analysis chip | |
| JP6187259B2 (en) | Method of stirring the solution | |
| JP2011164112A (en) | Ceramic fine particles for use in analysis chip | |
| JP5087898B2 (en) | Analysis chip | |
| JP2015045579A (en) | Agitation method of solution | |
| JP2011101623A (en) | Microarray | |
| JP2007192734A (en) | Manufacturing method of biochip | |
| JP2012233752A (en) | Analysis chip |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20100105 |
|
| A977 | Report on retrieval |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A971007 Effective date: 20120203 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20120214 |
|
| A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20120410 |
|
| A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20120508 |
|
| A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20120723 |
|
| A911 | Transfer of reconsideration by examiner before appeal (zenchi) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A911 Effective date: 20120731 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20120821 |
|
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20120903 |
|
| R151 | Written notification of patent or utility model registration |
Ref document number: 5092405 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R151 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20150928 Year of fee payment: 3 |