JP2011106897A - Analyzing chip and solution stirring method - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、被検物質と選択的に結合する物質を固定化した担体を備え、被検物質を含む溶液と選択結合性物質とを選択的に結合させて、担体上に選択結合性物質を介して結合した被検物質を分析するための分析チップおよび溶液の攪拌方法に関する。 The present invention includes a carrier on which a substance that selectively binds to a test substance is immobilized, and selectively binds the solution containing the test substance and the selective binding substance to form the selective binding substance on the carrier. The present invention relates to an analysis chip and a solution stirring method for analyzing a test substance that is bound thereto.
各種生物の遺伝情報解析の研究が始められており、ヒト遺伝子をはじめとして、多数の遺伝子とその塩基配列、また遺伝子配列にコードされる蛋白質およびこれら蛋白質から二次的に作られる糖鎖に関する情報が急速に明らかにされつつある。配列の明らかにされた遺伝子、蛋白質、糖鎖などの高分子体の機能は、各種の方法で調べることができる。例えば、核酸は、ノーザンブロッティング、あるいはサザンブロッティングのような、各種の核酸／核酸間の相補性を利用して、各種遺伝子とその生体機能発現との関係を調べることができる。蛋白質は、ウエスタンブロッティングに代表される蛋白質／蛋白質間の反応を利用し蛋白質の機能および発現について調べることができる。 Research on genetic information analysis of various organisms has been started, and information on many genes and their base sequences including human genes, proteins encoded by the gene sequences, and sugar chains that are secondarily produced from these proteins Is being revealed rapidly. The functions of macromolecules such as genes, proteins, and sugar chains whose sequences have been clarified can be examined by various methods. For example, for nucleic acids, the relationship between various genes and their expression of biological functions can be examined using complementarity between various nucleic acids / nucleic acids such as Northern blotting or Southern blotting. Proteins can be examined for protein function and expression using protein / protein reactions typified by Western blotting.
近年、多数の遺伝子発現を一度に解析する手法として、ＤＮＡマイクロアレイ法（ＤＮＡチップ法）と呼ばれる新しい分析法が開発され、注目を集めている。この方法は、核酸／核酸間ハイブリダイゼーション反応に基づく核酸検出・定量法である点で原理的には上記の従来の方法と同じである。このＤＮＡチップ法は、蛋白質／蛋白質間あるいは糖鎖／糖鎖間や糖鎖／蛋白質間の特異的な反応に基づく蛋白質や糖鎖検出・定量に応用が可能である。この技術は、マイクロアレイ又はＤＮＡチップと呼ばれるガラスの平面基板片上に、多数のＤＮＡ断片や蛋白質、糖鎖が高密度に整列固定化されたものが用いられている点に大きな特徴がある。 In recent years, a new analysis method called a DNA microarray method (DNA chip method) has been developed and attracts attention as a method for analyzing many gene expressions at once. This method is in principle the same as the above conventional method in that it is a nucleic acid detection / quantification method based on a nucleic acid / nucleic acid hybridization reaction. This DNA chip method can be applied to detection and quantification of proteins and sugar chains based on specific reactions between proteins / proteins or between sugar chains / sugar chains or between sugar chains / proteins. This technique has a major feature in that a large number of DNA fragments, proteins, and sugar chains are aligned and fixed on a flat glass substrate called a microarray or a DNA chip.
ＤＮＡチップ法の具体的使用法としては、例えば、研究対象細胞の発現遺伝子等を蛍光色素等で標識したサンプルを平面基板片上でハイブリダイゼーションさせ、互いに相補的な核酸（ＤＮＡあるいはＲＮＡ）同士を結合させ、その箇所を高解像度検出装置（スキャナー）で高速に読みとる方法や、電気化学反応にもとづく電流値等の応答を検出する方法が挙げられる。このようして、サンプル中のそれぞれの遺伝子量を迅速に推定できる。また、ＤＮＡチップの応用分野は、発現遺伝子の量を推定する遺伝子発現解析のみならず、遺伝子の一塩基置換（ＳＮＰ）を検出する手段としても大きく期待されている。 Specific usage of the DNA chip method includes, for example, hybridization of a sample labeled with an expression gene or the like of a cell to be studied with a fluorescent dye on a flat substrate piece, and binding complementary nucleic acids (DNA or RNA) to each other. And a method of reading the location at high speed with a high-resolution detection device (scanner) and a method of detecting a response such as a current value based on an electrochemical reaction. In this way, the amount of each gene in the sample can be quickly estimated. The application field of DNA chips is highly expected not only as a gene expression analysis for estimating the amount of expressed gene but also as a means for detecting single base substitution (SNP) of a gene.
現在、ＤＮＡチップは、チップ上に数千から数万種類の多数の遺伝子を載せ、一度に多種類の遺伝子の発現を調べる研究用として使用されていることが多い。今後、診断用途でＤＮＡチップが使用されることが期待されている。ＤＮＡチップを診断用途として使用する場合、一般に採取できる被検物質量が非常に少ないことがあり、その場合、現行のＤＮＡチップでは感度が十分ではないため、被検物質の測定が困難であることがある。また、発現量の少ない遺伝子では、ハイブリダイゼーション後に得られる蛍光シグナル強度が非常に微弱であるため、このような遺伝子は実質上解析できないこともある。以上のように、従来のＤＮＡチップでは、被検物質の量が少ない場合や発現量の少ない遺伝子の場合、ハイブリダイゼーション後の蛍光シグナル強度をいかに大きくするかということが課題である。 Currently, a DNA chip is often used for research in which many thousands to tens of thousands of genes are mounted on a chip and the expression of many kinds of genes is examined at once. In the future, DNA chips are expected to be used for diagnostic purposes. When using a DNA chip for diagnostic purposes, the amount of test substance that can be collected is generally very small. In this case, the sensitivity of the current DNA chip is insufficient, making it difficult to measure the test substance. There is. Moreover, since the intensity of the fluorescence signal obtained after hybridization is very weak for a gene with a low expression level, such a gene may not be analyzed substantially. As described above, in the case of a conventional DNA chip, the problem is how to increase the fluorescence signal intensity after hybridization when the amount of the test substance is small or the gene is low in the expression level.
この課題を解決するためには、被検物質であるＤＮＡとプローブＤＮＡとをいかに効率よく反応させるかが１つのポイントとなる。被検物質であるＤＮＡとプローブＤＮＡを効率よく反応させる方法として、被検物質の自然拡散では不十分であるため、溶液を人為的に攪拌し、効率よくプローブＤＮＡと被検物質であるＤＮＡとの反応を促進することが考えられている。 In order to solve this problem, one point is how to efficiently react the DNA as the test substance with the probe DNA. As a method for efficiently reacting the test substance DNA and the probe DNA, natural diffusion of the test substance is not sufficient. Therefore, the solution is artificially stirred, and the probe DNA and the test substance DNA are efficiently mixed. It is considered to promote the reaction.
被検物質が含まれた溶液を攪拌する例として、特許文献１には、微粒子または気泡を混合した被検物質が含まれた溶液を、被検物質と反応する選択結合性物質を固定化させた担体に接触させ、被検物質が含まれた溶液を、容器を用いてシーリングし、微粒子または気泡を移動させることにより被検物質の溶液を攪拌して、被検物質との反応効率を上げ、ハイブリダイゼーション後のシグナル強度を大きくする方法が開示されている。
As an example of stirring a solution containing a test substance,
また、特許文献２には、選択結合性物質が固定化された凸部をマトリクス状に形成させた複数のサブブロック領域を構成させ、サブブロック領域内の凹部とサブブロック領域間の凹部を微粒子またはマイクロロッドが移動することにより被検物質が含まれた溶液を攪拌させて、被検物質との反応効率を上げる方法が開示されている。このサブブロック領域間の凹部の幅は、サブブロック領域内の凹部の幅よりも広い構造を有している。
Further, in
さらに、特許文献３、特許文献４には、被検物質が含まれた溶液中で磁気ビーズを磁力により動かすことで、被検物質の溶液を撹拌し、被検物質との反応効率を上げる方法が開示されている。
Further,
上記特許文献１で開示されている分析チップでは、選択結合性物質が固定化されている部分に微粒子が接触しないように担体または容器に特別の構造を設ける必要があり、また使用できる微粒子の大きさを担体または容器の構造に適合させる必要がある。
In the analysis chip disclosed in
特許文献２で開示されている分析チップは、微粒子またはマイクロロッドが移動するための担体上の領域として、サブブロック領域内での凹部の他に、サブブロック領域間により広い凹部が設けられた構造を有している。そのため、微粒子またはマイクロロッドは、サブブロック領域内の凹部よりも、サブブロック領域間にあるより広い凹部を優先的に移動する可能性があり、攪拌時に微粒子またはマイクロロッドが担体の一部に局在化し（担体の全体に分散せず）、攪拌が不均一となる可能性がある。
The analysis chip disclosed in
特許文献３および特許文献４で開示されている分析チップでは、攪拌用の複数の磁気ビーズが磁気により凝集して大きな塊となり、攪拌効率が低下したり、攪拌が不均一となる可能性がある。
In the analysis chip disclosed in
本発明は、分析チップにおいて、微粒子を用いて被検物質を含む溶液を攪拌する際に、攪拌用の微粒子が反応溶液中で局在化しないように配置させる、換言すれば、微粒子が反応溶液で満たされた選択結合性物質が固定化された担体の領域全体に分散（拡散）するようにすることで、反応溶液全体を均一に撹拌して反応ムラを低減し、その結果分析精度や再現性を高めることが可能な分析チップおよび溶液の攪拌方法を提供することにある。 In the analysis chip, when stirring the solution containing the test substance using the fine particles, the fine particles for stirring are arranged so as not to be localized in the reaction solution, in other words, the fine particles are reacted in the reaction solution. The selective binding substance filled with is dispersed (diffused) over the entire area of the immobilized carrier to uniformly stir the entire reaction solution to reduce unevenness of the reaction, resulting in analysis accuracy and reproduction. An object of the present invention is to provide an analysis chip and a solution stirring method capable of enhancing the properties.
本発明は、分析チップの容器表面に、微粒子が反応溶液で満たされた選択結合性物質が固定化された担体の領域全体に分散（拡散）させ、一部に局在化することなく配置されるための区画構造を設けることにより、上記課題を解決した。 The present invention disperses (diffuses) the entire region of a carrier on which a selective binding substance filled with fine particles filled with a reaction solution is immobilized on the surface of a container of an analysis chip and is not localized locally. The above-mentioned problem has been solved by providing a partition structure for the purpose.
すなわち、本発明は、以下の構成からなる。
［１］表面に選択結合性物質が固定化された担体と、選択結合性物質と反応する被検物質を含む溶液を保持する容器と、該担体と該容器とによって形成される空隙内に格納された、溶液を攪拌するための微粒子と、を含む分析チップであって、該容器表面に、溶液を攪拌するときに該微粒子が局在化することなく配置されるための区画構造を有する分析チップ。
［２］区画構造が突起構造である、［１］に記載の分析チップ。
［３］区画構造が凹陥構造である、［１］に記載の分析チップ。
［４］表面に選択結合性物質が固定化された担体と、選択結合性物質と反応する被検物質を含む溶液を保持する容器と、該担体と該容器とによって形成される空隙内に格納された、溶液を攪拌するための微粒子と、を含む分析チップを用いる溶液の攪拌方法であって、分析チップの該容器表面に、該微粒子が局在化することなく配置されるための区画構造を設けることを特徴とする、溶液の撹拌方法。
That is, this invention consists of the following structures.
[1] A carrier having a selective binding substance immobilized on its surface, a container for holding a solution containing a test substance that reacts with the selective binding substance, and a space formed by the carrier and the container. An analysis chip including a microparticle for stirring a solution, and having a compartment structure for arranging the microparticle on the surface of the container without localizing the solution when the solution is stirred Chip.
[2] The analysis chip according to [1], wherein the partition structure is a protrusion structure.
[3] The analysis chip according to [1], wherein the partition structure is a recessed structure.
[4] A carrier having a selective binding substance immobilized on its surface, a container for holding a solution containing a test substance that reacts with the selective binding substance, and a space formed by the carrier and the container. A solution stirring method using an analysis chip comprising a microparticle for stirring a solution, wherein the microparticles are arranged without being localized on the surface of the container of the analysis chip A method of stirring a solution, comprising:
本発明により、微粒子を用いて被検物質を含む溶液を攪拌して被検物質と固定化された選択結合性物質とを反応させる際に、微粒子が反応溶液中で局在化することなく選択結合性物質が固定化された担体全体に分散（拡散）した状態（ばらけた状態）で配置させることが可能になる。その結果、反応溶液全体を均一に撹拌することができるため、反応溶液全体の反応を均一に行わせること、すなわち担体全体での反応ムラを低減することが可能となる。その結果、分析の精度、再現性を高めることが可能となる。 According to the present invention, when a solution containing a test substance is stirred using microparticles to cause the test substance to react with the immobilized selective binding substance, the microparticles are selected without being localized in the reaction solution. It is possible to dispose (spread) the binding substance on the entire carrier on which the binding substance is immobilized. As a result, since the whole reaction solution can be stirred uniformly, the reaction of the whole reaction solution can be performed uniformly, that is, the reaction unevenness in the whole carrier can be reduced. As a result, analysis accuracy and reproducibility can be improved.
また、従来の分析チップでは、被検物質と固定化された選択結合性物質とを反応させる際に、分析チップ設置面の傾きのために球状の微粒子が該傾き方向に偏ってしまうことがあるため、分析チップを厳密に水平に設置する必要があったが、本発明の分析チップでは、容器表面に設けられた区画構造により攪拌時に微粒子をばらけた状態で配置させることが可能であるため、分析チップを設置するにあたり水平性を厳密に設定する必要がない。 Further, in the conventional analysis chip, when the test substance and the immobilized selective binding substance are reacted, the spherical fine particles may be biased in the tilt direction due to the tilt of the analysis chip mounting surface. Therefore, although it was necessary to install the analysis chip strictly horizontally, in the analysis chip of the present invention, it is possible to arrange in a state where the fine particles are scattered at the time of stirring by the partition structure provided on the surface of the container, It is not necessary to set the levelness strictly when installing the analysis chip.
また、使用する微粒子のサイズに合わせて区画構造のサイズを設定できるため、微粒子サイズを所望のとおり任意に選択して使用することができる。。 Further, since the size of the partition structure can be set in accordance with the size of the fine particles to be used, the fine particle size can be arbitrarily selected and used as desired. .
本発明の分析チップは、表面に選択結合性物質が固定化された担体と、選択結合性物質と反応する被検物質を含む溶液を保持する容器と、該担体と該容器とによって形成される空隙内に格納された、溶液を攪拌するための微粒子と、を含み、該容器表面に、該微粒子が局在化することなく配置されるための区画構造を備える。 The analysis chip of the present invention is formed by a carrier having a selective binding substance immobilized on its surface, a container for holding a solution containing a test substance that reacts with the selective binding substance, the carrier and the container. Fine particles for agitating the solution stored in the voids, and provided with a partition structure for arranging the fine particles on the surface of the container without being localized.
ここで、担体は、その表面に選択結合性物質が固定化された基材である。また、容器は、担体の選択結合性物質が固定化された表面を覆う基材であって、被検物質溶液を保持する空隙を形成する様に担体と接着されて使用される。また、区画構造は、空隙内に格納された微粒子が凝集することを防ぎ、空隙内でばらけて配置された状態を保持するための構造体として、容器表面上に設けられる。 Here, the carrier is a substrate having a selective binding substance immobilized on the surface thereof. The container is a base material that covers the surface of the carrier on which the selective binding substance is immobilized, and is used by being adhered to the carrier so as to form a void for holding the test substance solution. Further, the partition structure is provided on the surface of the container as a structure for preventing the fine particles stored in the gap from aggregating and maintaining a state of being dispersed and arranged in the gap.
本発明の分析チップは、担体表面を重力方向に垂直な方向（水平方向）に向けて使用するものであり、担体上の選択結合性物質が固定化された表面を、下方（重力方向）に向けて使用できる。例えば、後述する図１〜８に例示する分析チップは、全て重力方向に垂直な方向（水平方向）に向けて使用する場合を示しており、選択結合性物質が固定化された表面は下方を向いており、この場合、容器は担体下部から覆設される。 The analysis chip of the present invention uses the carrier surface in a direction perpendicular to the direction of gravity (horizontal direction), and the surface on which the selective binding substance on the carrier is immobilized is directed downward (gravity direction). Can be used towards. For example, the analysis chips illustrated in FIGS. 1 to 8 to be described later show a case where they are used in a direction (horizontal direction) perpendicular to the gravitational direction, and the surface on which the selective binding substance is immobilized is below. In this case, the container is covered from the lower part of the carrier.
本発明の分析チップは、被検物質を含む溶液を当該チップにアプライし、被検物質の存在の有無や、被検物質の量や、被検物質の性状等を測定するために用いるチップである。具体的には、担体表面に固定化された選択結合性物質と被検物質との反応により、被検物質の量や、被検物質の有無を測定するバイオチップが挙げられる。具体的なバイオチップとしては、核酸を担体表面に固定化したＤＮＡチップ、抗体に代表されるタンパク質を担体表面に固定化したタンパク質チップ、糖鎖を担体表面に固定化した糖鎖チップ、及び担体表面に細胞を固定化した細胞チップ等が挙げられる。 The analysis chip of the present invention is a chip used to apply a solution containing a test substance to the chip and measure the presence / absence of the test substance, the amount of the test substance, the property of the test substance, etc. is there. Specifically, a biochip that measures the amount of the test substance and the presence or absence of the test substance by a reaction between the test substance and the selective binding substance immobilized on the surface of the carrier can be mentioned. Specific biochips include a DNA chip in which a nucleic acid is immobilized on a carrier surface, a protein chip in which a protein typified by an antibody is immobilized on the carrier surface, a sugar chain chip in which a sugar chain is immobilized on the carrier surface, and a carrier Examples thereof include a cell chip having cells immobilized on the surface.
まず、本発明の分析チップの具体的な態様について、図面を用いて例示する。 First, specific embodiments of the analysis chip of the present invention will be illustrated with reference to the drawings.
図１に示す分析チップの例は、担体２の下部から容器１が覆設されている。図２、図３、図６、図７は、図１で示される分析チップのそれぞれ異なる態様であって、それぞれ図１の矢印Ａ１方向に沿った面での断面図を示す。図４、図５は、それぞれ図２、図３で示される分析チップにおいて、担体２が設置されていない状態の分析チップを上方から見た外観を示す。図８は、図６、図７で示される分析チップにおいて、担体２が設置されていない状態の分析チップを上方から見た外観を示す。
In the example of the analysis chip shown in FIG. 1, the
図２、図３、図６、図７の分析チップの例では、担体２と容器１とで、選択結合性物質が固定化された固定化領域Ｒ１を含む空隙５を形成しており、空隙５は、必要に応じて設けることのできる貫通孔３を介して外部と連通する他は、外部と連通しない閉じた空間となっている。図２、図６の担体１の表面は平面構造（選択結合性物質がその表面に固定化される平坦部６）を有しており、図３、図７の担体２の表面は凹凸構造（選択結合性物質がその表面に固定化される凸部９）を有している。また、図２、図３の容器１の表面には区画構造である複数の突起構造８Ａが設けられており、微粒子４は、この突起構造の隙間に配置される。図６、図７の容器１の表面には区画構造である凹陥構造８Ｂが設けられており、微粒子４はこの凹陥構造の内部に収納される。
In the example of the analysis chip of FIGS. 2, 3, 6, and 7, the
ここで、本発明における容器について述べる。 Here, the container in the present invention will be described.
本発明の分析チップにおける容器には、微粒子によって反応溶液を攪拌する際に、反応溶液が満たされた容器の表面に微粒子が分散（拡散）し、その一部に局在化しないような手段として、区画構造が設けられる。この区画構造は、選択結合性物質が固定化された領域（Ｒ１）の全体を略均等にカバーするように設けられることが好ましい。ここで、微粒子が分散または拡散する状態とは、微粒子が容器表面の全体にばらばらに散らばって存在する状態を意味する。また、微粒子が局在化する状態とは、微粒子が容器表面の一部の限られた領域に偏って存在する状態を意味する。 The container in the analysis chip of the present invention is a means for preventing the fine particles from dispersing (diffusing) on the surface of the container filled with the reaction solution and localizing to the part when the reaction solution is stirred with the fine particles. A compartment structure is provided. This partition structure is preferably provided so as to cover the entire region (R1) where the selective binding substance is immobilized substantially uniformly. Here, the state in which the fine particles are dispersed or diffused means a state in which the fine particles are scattered and present on the entire surface of the container. Moreover, the state in which the fine particles are localized means a state in which the fine particles are present in a partly limited region on the surface of the container.
微粒子の分散度は、例えば、以下のような判定基準で評価することができる。分析チップの容器表面を複数の領域（例えば、図１０に示すような２×４の８個の領域）に面積が略均等になるように区分けして、微粒子によって溶液を攪拌した後に、区分けされた個々の領域内にどれだけの量の微粒子が占有しているかどうかを評価する。ここで、容器表面において区分けされた領域は、実際に構造上設けられた領域ではなく、形式上区切られた領域である。分析チップに格納される微粒子の全量を、分析チップの容器表面上の約半分の面積を占める量に設定した場合には、容器表面を観察（例えば目視で観察）し、区分けした全ての領域において微粒子が容器表面の約半分の面積を占めている場合は、微粒子が分散された状態、いわゆる「局在化なし」と判定することができる。一方、区分けした領域のうち微粒子が占める面積が約半分に満たない状態の領域が１つ以上ある場合は、微粒子の「局在化あり」と判定することができる。 The degree of dispersion of the fine particles can be evaluated by the following criteria, for example. The surface of the analysis chip container is divided into a plurality of regions (for example, 2 × 4 8 regions as shown in FIG. 10) so that the areas are substantially uniform, and the solution is stirred with fine particles and then divided. It is evaluated how much fine particles are occupied in each individual region. Here, the region divided on the surface of the container is not a region actually provided in terms of structure but a region delimited in form. When the total amount of fine particles stored in the analysis chip is set to an amount that occupies about half the area on the surface of the analysis chip container, the surface of the container is observed (eg, visually observed), and in all divided areas When the fine particles occupy about half the area of the container surface, it can be determined that the fine particles are dispersed, that is, “no localization”. On the other hand, if there is one or more regions in which the area occupied by the fine particles is less than about half of the divided regions, it can be determined that the particles are “localized”.
本発明の分析チップの容器には、区画構造として、好ましくは以下に述べる突起構造または凹陥構造が設けられる。 The analysis chip container of the present invention is preferably provided with a protruding structure or a recessed structure described below as a partition structure.
突起構造とは、容器表面上に設けられる区画構造であって、空隙内に格納された微粒子が容器表面上を移動する際に衝突する程度に容器表面から突出した構造である。突起構造は、微粒子が容器表面上を移動する際に衝突する形状を有する構造体であれば特に限定されない。突起構造は、容器表面上に複数設けられることが好ましく、この場合、微粒子は容器表面上に設けられた複数の突起構造の隙間に配置される。この複数の突起構造の隙間に配置された微粒子は、溶液を攪拌するための外場（磁場や重力や振動）を加えたときに、この突起構造が障壁となり、突起構造に衝突して跳ね返ることでランダムな動きが生じるため、微粒子は容器表面上で局在化せず、分散された状態が保持される。 The protrusion structure is a partition structure provided on the surface of the container, and is a structure protruding from the surface of the container to such an extent that the fine particles stored in the gap collide when moving on the surface of the container. The protrusion structure is not particularly limited as long as the structure has a shape in which the fine particles collide when moving on the surface of the container. A plurality of protrusion structures are preferably provided on the surface of the container. In this case, the fine particles are arranged in a gap between the plurality of protrusion structures provided on the container surface. The microparticles arranged in the gaps between the multiple protrusion structures, when an external field (magnetic field, gravity or vibration) is applied to stir the solution, this protrusion structure acts as a barrier and rebounds by colliding with the protrusion structure. Therefore, the microparticles are not localized on the surface of the container, and the dispersed state is maintained.
突起構造の配置の仕方としては、微粒子にランダムな動きを生じさせるように配置されていれば特に限定されないが、容器のどの領域においても微粒子に同程度のランダムな動きを生じさせるために、一定の繰り返しパターンで容器表面全体に配置されているのが好ましい。突起構造の間隔が広すぎると微粒子の分散度が低下するため好ましくなく、間隔が狭すぎると、使用できる微粒子のサイズが小さくなり、また微粒子の動きの自由度が低減することにより、撹拌効果が低下するため好ましくない。 The arrangement of the protrusion structure is not particularly limited as long as it is arranged so as to cause random movement in the fine particles, but it is constant in order to cause the same degree of random movement in the fine particles in any region of the container. It is preferable to arrange | position to the whole container surface by the repeating pattern of these. If the spacing between the protrusion structures is too wide, the dispersibility of the fine particles decreases, which is not preferable. If the spacing is too narrow, the size of the usable fine particles is reduced, and the degree of freedom of movement of the fine particles is reduced. Since it falls, it is not preferable.
突起構造のサイズは、微粒子のサイズや微粒子が収納される空隙の容積を考慮して選択することができる。小さすぎると微粒子の衝突効率が低減し分散度が低下するため好ましくなく、大きすぎると空隙内に格納できる微粒子の量に制限が生じ、撹拌効果が低下するため好ましくない。 The size of the protrusion structure can be selected in consideration of the size of the fine particles and the volume of the voids in which the fine particles are stored. If it is too small, it is not preferable because the collision efficiency of the fine particles is reduced and the degree of dispersion is lowered.
突起構造の高さ（図２、図３のＨ２）としては、後述するような微粒子を用いる場合には、１０μｍ以上、５００μｍ以下が好ましく、５０μｍ以上、３００μｍ以下が特に好ましい。突起構造の高さがこれより低いと、微粒子が突起構造を乗り越えてしまい、微粒子を分散させにくくなる。また、突起構造の高さが５００μｍ以上であると、分析チップにおける空隙の容積が増大し、この空隙を満たすために多量の検体溶液が必要となるため好ましくない。 The height of the protrusion structure (H2 in FIGS. 2 and 3) is preferably 10 μm or more and 500 μm or less, and particularly preferably 50 μm or more and 300 μm or less when using fine particles as described later. If the height of the protrusion structure is lower than this, the fine particles get over the protrusion structure, and it becomes difficult to disperse the fine particles. Moreover, if the height of the protrusion structure is 500 μm or more, the volume of the gap in the analysis chip increases, and a large amount of sample solution is required to fill this gap, which is not preferable.
突起構造の形状は、微粒子が衝突してランダムな動きを生じさせる形状であれば特に限定されない。例えば、円柱状、楕円柱状、角柱状、円錐状、角錐状等が挙げられる。突起構造の具体的な態様としては、例えば図４、図５のような構造がある。図４では突起構造が円柱であり、図５では四角柱である。微粒子は容器表面上でこれら突起構造の隙間に配置され、外場（磁場や重力や振動）が加えられると、微粒子は突起構造に衝突ながら、空隙内を移動する。 The shape of the protrusion structure is not particularly limited as long as the particles collide with each other to cause random movement. For example, a cylindrical shape, an elliptical columnar shape, a prismatic shape, a conical shape, a pyramid shape, and the like can be given. As a specific aspect of the protrusion structure, for example, there are structures as shown in FIGS. In FIG. 4, the protrusion structure is a cylinder, and in FIG. The fine particles are arranged in the gaps of these protruding structures on the surface of the container, and when an external field (magnetic field, gravity or vibration) is applied, the fine particles move in the gap while colliding with the protruding structures.
凹陥構造とは、容器表面上に設けられる区画構造であって、微粒子が納まる程度に容器表面より凹んだ構造である。凹陥構造は、微粒子を容器表面の一定の領域に納めてしまう構造体であれば特に限定されない。凹陥構造は、容器表面上に複数設けられることが好ましく、この場合、微粒子はこれら複数の凹陥構造の内部に略均等に収納される。この複数の凹陥構造に収納された微粒子は、外場（磁場や重力や振動）を加えると、この凹陥構造の内部を自由に移動する。基板表面上に複数の凹陥構造を略均等に偏りなく分布させて設けることにより、容器表面全体からみると、微粒子が分散された状態を保持することができる。 The recessed structure is a partition structure provided on the surface of the container and is a structure that is recessed from the surface of the container to the extent that fine particles can be accommodated. The concave structure is not particularly limited as long as it is a structure that can store fine particles in a certain region on the surface of the container. A plurality of recessed structures are preferably provided on the surface of the container. In this case, the fine particles are accommodated substantially uniformly within the plurality of recessed structures. The fine particles housed in the plurality of recessed structures freely move inside the recessed structures when an external field (magnetic field, gravity, or vibration) is applied. By providing a plurality of recessed structures on the substrate surface so as to be distributed almost evenly, it is possible to maintain a state in which fine particles are dispersed as viewed from the entire surface of the container.
凹陥構造の配置の仕方としては、基板表面上に複数の凹陥構造を略均等に偏りなく分布させて設けることが好ましく、一定の繰り返しパターンで容器表面全体に配置されていることがより好ましい。 As a method of arranging the concave structures, it is preferable to provide a plurality of concave structures on the substrate surface so as to be distributed almost evenly, and it is more preferable to arrange the concave structures over the entire surface of the container in a certain repeating pattern.
凹陥構造のサイズは、微粒子のサイズや微粒子が格納される空隙の容積を考慮して選択することができる。小さすぎると使用できる微粒子のサイズが小さくなり、また微粒子の動きの自由度が低減することにより、撹拌効果が低下するため好ましくない。 The size of the concave structure can be selected in consideration of the size of the fine particles and the volume of the voids in which the fine particles are stored. If the particle size is too small, the size of the fine particles that can be used is reduced, and the degree of freedom of movement of the fine particles is reduced.
凹陥構造の深さ（図６、図７のＨ３）としては、後述するような微粒子を用いる場合には、１０μｍ以上、５００μｍ以下が好ましく、５０μｍ以上、３００μｍ以下が特に好ましい。凹陥構造の深さがこれより深いと、微粒子が凹陥構造から外に飛び出てしまう可能性があり、微粒子を分散させにくくなる。また、凹陥構造の深さが５００μｍ以上であると、分析チップにおける空隙の容積が増大し、この空隙を満たすために多量の検体溶液が必要となるため好ましくない。 The depth of the concave structure (H3 in FIGS. 6 and 7) is preferably 10 μm or more and 500 μm or less, and particularly preferably 50 μm or more and 300 μm or less when using fine particles as described later. If the depth of the recessed structure is deeper than this, the fine particles may jump out of the recessed structure, making it difficult to disperse the fine particles. Further, if the depth of the concave structure is 500 μm or more, the volume of the gap in the analysis chip increases, and a large amount of sample solution is required to fill this gap, which is not preferable.
凹陥構造の形状は、微粒子が収納され、その内部で自由に移動できる形状であれば特に限定されない。例えば、円柱状、楕円柱状、角柱状に凹んだ形状等が挙げられる。凹陥構造の具体的な態様としては、例えば図８のような構造がある。図８では、凹陥構造が円柱状に凹んだ形状である。微粒子は容器表面上で凹陥構造の内部に収納され、外場（磁場や重力や振動）が加えられると、微粒子は凹陥構造の内部で自由に移動する。このような凹陥構造が容器表面上に略均等に分布するように一定の繰り返しパターンで複数設けられている。 The shape of the concave structure is not particularly limited as long as it is a shape in which fine particles are accommodated and can freely move inside. Examples thereof include a cylindrical shape, an elliptical columnar shape, and a concave shape in a prismatic shape. As a specific aspect of the recessed structure, there is a structure as shown in FIG. 8, for example. In FIG. 8, the concave structure is a shape recessed in a cylindrical shape. The fine particles are stored inside the recessed structure on the surface of the container, and when an external field (magnetic field, gravity, or vibration) is applied, the fine particles freely move inside the recessed structure. A plurality of such recessed structures are provided in a constant repeating pattern so as to be distributed substantially evenly on the container surface.
本発明の分析チップにおける容器は、担体に脱離可能に接着されていても、担体に脱離不可能に接着されていてもよい。容器が担体に脱離可能に接着されている場合は、被検物質とのハイブリダイゼーション反応を行った後、容器を脱離させ、担体のみをスキャナーにセットして蛍光等のシグナル強度を測定することができる。 The container in the analysis chip of the present invention may be detachably attached to the carrier or may be detachably attached to the carrier. When the container is detachably attached to the carrier, after performing a hybridization reaction with the test substance, the container is detached and only the carrier is set in the scanner to measure the signal intensity such as fluorescence. be able to.
本発明の分析チップの容器の材質は、特に限定されるものではないが、好ましく用いられる容器の材質として、ガラス、ポリマー、あるいはこれらを組み合わせたもの等が挙げられる。上記のような突起構造や凹陥構造等の区画構造が設けられた容器は、例えば切削加工や射出成型法により容易に作製可能という点から、ポリマーが好ましい。ポリマーとしては、ポリスチレン、ポリメチルメタクリレート、ポリカーボネート等のポリマーを好ましく用いることが出来る。 Although the material of the container of the analysis chip of the present invention is not particularly limited, examples of the material of the container that is preferably used include glass, polymer, or a combination thereof. The container provided with the partition structure such as the protruding structure or the recessed structure as described above is preferably a polymer because it can be easily manufactured by, for example, a cutting process or an injection molding method. As the polymer, polymers such as polystyrene, polymethyl methacrylate, and polycarbonate can be preferably used.
容器は、被検物質溶液をアプライした際に、溶液の様子を観察可能とするためには、透明な材料が好ましい。また、分析チップから容器を脱離させることなくスキャナーで読み取る分析チップにおいては、容器を透過して光を照射して検出する場合、容器の光が透過する部分は十分透明で、またノイズの要因となる自家蛍光を生じない材質であることが好ましい。 The container is preferably a transparent material so that the state of the solution can be observed when the test substance solution is applied. In addition, in an analysis chip that is read by a scanner without detaching the container from the analysis chip, when light is transmitted through the container and detected, the portion of the container through which the light is transmitted is sufficiently transparent and causes noise. It is preferable that the material does not produce autofluorescence.
本発明における微粒子の好ましい形状について述べる。 A preferred shape of the fine particles in the present invention will be described.
本発明における微粒子の大きさ（微粒子の最大径）は、１０μｍ以上のものが好ましい。微粒子の大きさが１０μｍより小さいと、溶液の抵抗により外場（磁場や重力や振動）を加えても微粒子がほとんど動かないことがあり、微粒子による攪拌効果が得られないことがある。微粒子の大きさは２０μｍ以上がより好ましい。 In the present invention, the size of the fine particles (the maximum diameter of the fine particles) is preferably 10 μm or more. If the size of the fine particles is smaller than 10 μm, the fine particles may hardly move even if an external field (magnetic field, gravity or vibration) is applied due to the resistance of the solution, and the stirring effect by the fine particles may not be obtained. The size of the fine particles is more preferably 20 μm or more.
本発明の分析チップでは、溶液を攪拌することができれば、どのような形の微粒子も用いることができる。特に好ましくは、微粒子の形状は、球状、すなわちビーズである。微粒子が球状であると、回転により反応液中で滞ることなくスムーズに移動でき、検体溶液の攪拌が良好に行えるので好ましい。球状の微粒子として、好ましくは、直径が２０μｍ〜５００μｍの球状微粒子（ビーズ）を用いることができる。直径がこの範囲であると、容易に重力、振動、旋回等による加速度などを加えることにより溶液中を移動でき、溶液の攪拌を十分に行うことができるため、良好な結果を得ることができる。 In the analysis chip of the present invention, fine particles of any shape can be used as long as the solution can be stirred. Particularly preferably, the shape of the fine particles is spherical, that is, beads. It is preferable that the fine particles are spherical, because they can move smoothly without stagnation in the reaction solution due to rotation, and the sample solution can be stirred well. As the spherical fine particles, preferably, spherical fine particles (beads) having a diameter of 20 μm to 500 μm can be used. When the diameter is within this range, it is possible to easily move through the solution by applying acceleration due to gravity, vibration, rotation, etc., and the solution can be sufficiently stirred, so that good results can be obtained.
本発明の分析チップでは、微粒子の材質としては特に限定されない。微粒子の材質としては、金属、ガラス、セラミック、ポリマー（ポリスチレン、ポリプロピレン、ナイロンなど）等を用いることができる。この中でも、比重が水よりも大きい材質（ガラス、石英、ジルコニアセラミック）が、重力や振動を加えることにより容易に溶液中を移動できるので好ましい。また、磁気ビーズを使用することも可能である。これらのうち、特に、ジルコニアセラミックからなる微粒子は、比重が大きいことから、重力、振動、旋回等による加速度などを加えることにより、移動が容易に行えることから最も好ましく用いることができる。また、ガラス、石英、ジルコニアセラミックは、検体溶液中に微粒子の成分が溶出することが少ないので好ましい。 In the analysis chip of the present invention, the material of the fine particles is not particularly limited. As the material of the fine particles, metal, glass, ceramic, polymer (polystyrene, polypropylene, nylon, etc.) and the like can be used. Among these, a material (glass, quartz, zirconia ceramic) having a specific gravity greater than that of water is preferable because it can easily move in the solution by applying gravity or vibration. It is also possible to use magnetic beads. Among these, in particular, fine particles made of zirconia ceramic are most preferably used because they have a large specific gravity and can be easily moved by applying acceleration due to gravity, vibration, turning, or the like. Further, glass, quartz, and zirconia ceramic are preferable because the components of fine particles are hardly eluted in the sample solution.
ジルコニアセラミック（イットリア安定化ジルコニア）からなる微粒子は、密度が６ｇ／ｃｍ３程度であり、石英ガラスの２．２ｇ／ｃｍ３などに比べて大きいので、攪拌効果がより発揮でき、容器でシーリングする際の溶液の動きに対してもビーズが舞い上がって動いてしまうことが少ないので、セッティングがより容易に行え、特に好ましい。 Fine particles of zirconia ceramic (yttria stabilized zirconia) is a density of about 6 g / cm 3, is greater than the like 2.2 g / cm 3 of the quartz glass, it can exhibit more agitation effect, sealing in containers This is particularly preferable because the beads are less likely to move up and move with respect to the movement of the solution at the time, so that the setting can be performed more easily.
本発明の分析チップでは、微粒子を移動させることによって溶液を撹拌する。好ましくは、重力、磁力（磁気ビーズの場合）、振動・振盪、旋回等による加速度などを加えることにより、またはこれらの組合せにより、微粒子を移動させる。 In the analysis chip of the present invention, the solution is stirred by moving the fine particles. Preferably, the fine particles are moved by applying gravity, magnetic force (in the case of magnetic beads), acceleration due to vibration / shaking, turning, or the like, or a combination thereof.
これらの中でも、担体を水平又は水平に近い面に沿って旋回したり、上下や左右に振盪（素早く移動）したりして、加速度を加えることにより、溶液中の微粒子を動かす方法は、簡便に実施でき、十分な効果が得られることから好ましい。特に、担体を水平又は水平に近い面に沿って旋回（公転）させて加速度（遠心力）を加える方法が好ましい。この時の回転速度としては、１００ｒｐｍから５００ｒｐｍが好ましい。１００ｒｐｍ未満であると十分な撹拌が行われない場合があり、５００ｒｐｍを超えると、分析チップから容器が剥がれてしまう可能性がある。特に好ましくは、２００ｒｐｍから３００ｒｐｍである。水平に近い方向とは、担体を回転させた場合に微粒子が分析チップの片側に寄らない程度の傾きを持たせた方向を意味し、例えば、水平面を基準として０度から３度の間が好ましい。 Among these, the method of moving the fine particles in the solution by turning the carrier along a horizontal or nearly horizontal surface, shaking it up and down or left and right (moving quickly), and applying acceleration is simple. This is preferable because it can be carried out and a sufficient effect can be obtained. In particular, a method of applying acceleration (centrifugal force) by turning (revolving) the carrier along a horizontal or nearly horizontal surface is preferable. The rotation speed at this time is preferably 100 rpm to 500 rpm. If it is less than 100 rpm, sufficient stirring may not be performed, and if it exceeds 500 rpm, the container may be peeled off from the analysis chip. Particularly preferred is 200 rpm to 300 rpm. The direction close to the horizontal means a direction in which the fine particles are inclined so as not to move to one side of the analysis chip when the carrier is rotated. For example, the direction is preferably between 0 and 3 degrees with respect to the horizontal plane. .
また、前記微粒子においても、分析チップを解体することなくスキャナーで読み取る際、微粒子から自家蛍光が生じる場合には、その発光がノイズとなり検出精度の低下に繋がることがある。これを防ぎ、微粒子自身からの自家蛍光を低減させるために、光照射により発光を生じない物質を含有させたポリマーで、微粒子表面にコーティング等を施して被覆処理することにより表面を形成することが好ましい。このような微粒子を用いることにより、検出の際、微粒子からの自家蛍光を低減できる。 In addition, even when the microparticles are read by a scanner without disassembling the analysis chip, if autofluorescence is generated from the microparticles, the light emission may be noise, leading to a decrease in detection accuracy. In order to prevent this and reduce autofluorescence from the microparticles themselves, a polymer containing a substance that does not emit light when irradiated with light can be coated with a coating on the surface of the microparticles to form a surface. preferable. By using such fine particles, autofluorescence from the fine particles can be reduced during detection.
選択結合性物質が固定化される担体について述べる。 The carrier on which the selective binding substance is immobilized will be described.
本発明の分析チップに用いる選択結合性物質が固定化された担体には、その表面形状が平面構造を有するものや凹凸構造を有するものを利用できる。表面が凹凸構造である担体を用いた場合、凹凸構造の凸部上面に選択性適合物質が固定化されていることが好ましい。 As the carrier on which the selective binding substance used for the analysis chip of the present invention is immobilized, a carrier having a planar structure or a concavo-convex structure can be used. In the case of using a carrier having a concavo-convex structure on the surface, it is preferable that a selectivity-compatible substance is immobilized on the upper surface of the concavo-convex structure.
本発明の分析チップで用いられる担体の材質は、特に限定されない。好ましく用いられる担体の材質は、ガラス又は各種のポリマー（例えばポリスチレン、ポリメチルメタクリレート、ポリカーボネート、ポリオレフィン）である。切削加工や射出成型法等により容易に作製可能という点から、ポリマーが好ましい。ポリマーとしては、ポリスチレン、ポリメチルメタクリレート、ポリカーボネート等のポリマーを好ましく用いることが出来る。 The material of the carrier used in the analysis chip of the present invention is not particularly limited. The material of the carrier preferably used is glass or various polymers (for example, polystyrene, polymethyl methacrylate, polycarbonate, polyolefin). A polymer is preferred because it can be easily produced by cutting or injection molding. As the polymer, polymers such as polystyrene, polymethyl methacrylate, and polycarbonate can be preferably used.
本発明の分析チップにおいて、選択結合性物質を固定化するための担体表面は、官能基を含むポリマーであることが好ましい。官能基を含むポリマーで好ましいものとしては、例えば、ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）、ポリエチルメタクリレート（ＰＥＭＡ）またはポリプロピルメタクリレートのポリメタクリル酸アルキル（ＰＡＭＡ）等がある。これらの中で特に好ましいものは、ポリメチルメタクリレートである。さらに、ポリ酢酸ビニル、ポリメタクリル酸シクロヘキシルまたはポリメタクリル酸フェニル等も用いることができる。 In the analysis chip of the present invention, the carrier surface for immobilizing the selective binding substance is preferably a polymer containing a functional group. Preferable polymers containing a functional group include, for example, polymethyl methacrylate (PMMA), polyethyl methacrylate (PEMA), or polypropyl methacrylate polyalkyl methacrylate (PMMA). Of these, polymethyl methacrylate is particularly preferred. Furthermore, polyvinyl acetate, polycyclohexyl methacrylate, polyphenyl methacrylate, or the like can also be used.
官能基（カルボキシル基、エステル基、酸無水物）を含むポリマーを有する担体表面に選択結合性物質を固定化するためには、これに前処理を施して、例えば担体表面にカルボキシル基を形成させ、これを利用して選択結合性物質を共有結合させることが好ましい。担体表面にカルボキシル基を生成する手段としては、アルカリ、酸などで処理するほか、温水中での超音波処理、酸素プラズマ、アルゴンプラズマ、放射線に担体を晒す方法などが挙げられるが、担体の損傷が少なく、また、容易に実施できるという点から、アルカリ又は酸に担体を漬け込んで表面にカルボキシル基を生成させることが好ましい。具体的な例としては、水酸化ナトリウムや硫酸の水溶液（好ましい濃度は、１Ｎ〜２０Ｎ）に担体を漬け込み、好ましくは３０℃から８０℃の温度にして、１時間から１００時間の間保持すればよい。 In order to immobilize a selective binding substance on the surface of a carrier having a polymer containing a functional group (carboxyl group, ester group, acid anhydride), this is pretreated to form a carboxyl group on the surface of the carrier, for example. It is preferable to use this to covalently bond the selective binding substance. Examples of means for generating a carboxyl group on the surface of the carrier include treatment with alkali, acid, etc., ultrasonic treatment in warm water, oxygen plasma, argon plasma, and a method in which the carrier is exposed to radiation. In view of the fact that it is small and can be easily carried out, it is preferable to immerse the carrier in an alkali or acid to generate a carboxyl group on the surface. As a specific example, if the carrier is immersed in an aqueous solution of sodium hydroxide or sulfuric acid (preferred concentration is 1N to 20N), preferably at a temperature of 30 ° C. to 80 ° C. and held for 1 to 100 hours. Good.
担体表面にカルボキシル基や酸無水物が存在する場合は、アミノ基や水酸基を有する選択結合性物質を担体表面に共有結合で固定化することが可能となる。担体表面にカルボキシル基がある場合には、これらの結合の反応を助長するため、ジシクロヘキシルカルボジイミド、Ｎ−エチル−５−フェニルイソオキサゾリウム−３’−スルホナート、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド(ＥＤＣ)などの様々な縮合剤を用いることができる。 When a carboxyl group or an acid anhydride is present on the surface of the carrier, a selective binding substance having an amino group or a hydroxyl group can be immobilized on the surface of the carrier by a covalent bond. In the case where a carboxyl group is present on the surface of the carrier, dicyclohexylcarbodiimide, N-ethyl-5-phenylisoxazolium-3′-sulfonate, 1-ethyl-3- (3- Various condensing agents such as dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDC) can be used.
上記のような材質がポリマーである担体の作製は、射出成形方法やホットエンボス法などを適用することができる。特に射出成型法は大量生産が容易であることから好ましく用いることができる。 An injection molding method, a hot embossing method, or the like can be applied to manufacture a carrier whose material is a polymer as described above. In particular, the injection molding method can be preferably used because mass production is easy.
本発明において、選択結合性物質とは、被検物質と直接的又は間接的に、選択的に結合し得る物質を意味し、代表的な例として、核酸、タンパク質、糖類及び他の抗原性化合物等を挙げることができる。 In the present invention, the selective binding substance means a substance that can selectively bind to a test substance directly or indirectly, and representative examples include nucleic acids, proteins, saccharides and other antigenic compounds. Etc.
選択結合性物質として、特に好ましいものは、核酸である。核酸は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡのいずれでもよい。特定の塩基配列を有する一本鎖核酸は、該塩基配列又はその一部と相補的な塩基配列を有する一本鎖核酸と選択的にハイブリダイズして結合するので、本発明でいう選択結合性物質に該当する。核酸の中でも、オリゴ核酸と呼ばれる、長さが１０塩基から１００塩基までの核酸は、合成機で容易に人工的に合成が可能であり、また核酸末端のアミノ基修飾が容易であるため、担体表面への固定化が容易となることから好ましい。さらに、２０塩基未満ではハイブリダイゼーションの安定性が低いという観点から２０〜１００塩基がより好ましい。ハイブリダイゼーションの安定性を保持するため、特に好ましくは４０〜１００塩基の範囲である。 Particularly preferred as the selective binding substance is a nucleic acid. The nucleic acid may be DNA, RNA, or PNA. A single-stranded nucleic acid having a specific base sequence selectively hybridizes and binds to a single-stranded nucleic acid having a base sequence complementary to the base sequence or a part thereof. Applicable to substances. Among nucleic acids, a nucleic acid called oligonucleic acid having a length of 10 to 100 bases can be easily artificially synthesized with a synthesizer and can easily be modified with an amino group at the end of the nucleic acid. It is preferable because it can be easily fixed on the surface. Furthermore, if it is less than 20 bases, 20 to 100 bases are more preferable from the viewpoint that the stability of hybridization is low. In order to maintain the stability of hybridization, the range of 40 to 100 bases is particularly preferable.
また、タンパク質としては、抗体及びFabフラグメントやF(ab')2フラグメントのような、抗体の抗原結合性断片、並びに種々の抗原を挙げることができる。抗体やその抗原結合性断片は、対応する抗原と選択的に結合し、抗原は対応する抗体と選択的に結合するので、選択結合性物質に該当する。糖類としては、多糖類が好ましく、種々の抗原を挙げることができる。また、タンパク質や糖類以外の抗原性を有する物質を選択結合性物質として固定化することもできる。 Examples of the protein include an antibody and an antigen-binding fragment of an antibody such as a Fab fragment or F (ab ′) 2 fragment, and various antigens. Since an antibody or an antigen-binding fragment thereof selectively binds with a corresponding antigen, and the antigen selectively binds with a corresponding antibody, it corresponds to a selective binding substance. As the saccharide, a polysaccharide is preferable, and various antigens can be exemplified. Moreover, antigenic substances other than proteins and saccharides can be immobilized as selective binding substances.
本発明に用いる選択結合性物質は、市販のものでもよく、また、生細胞などから得られたものでもよい。 The selective binding substance used in the present invention may be a commercially available substance or may be obtained from a living cell or the like.
被検物質を含む溶液は、例えば図１〜図８に例示する分析チップの場合、貫通孔３から空隙内にアプライすることができる。分析チップに複数の貫通孔を設けることで、被検物質を含む溶液をアプライする際、気泡の流入を抑制することができ、操作性が向上する。
For example, in the case of the analysis chip illustrated in FIGS. 1 to 8, the solution containing the test substance can be applied from the through
本発明では、被検物質として、測定すべき核酸、例えば、病原菌やウイルス等の遺伝子や、遺伝病の原因遺伝子等並びにその一部分、抗原性を有する各種生体成分、病原菌やウイルス等に対する抗体等を挙げることができるが、これらに限定されるものではない。本発明では、これらの被検物質を含む溶液としては、血液、血清、血漿、尿、便、髄液、唾液、各種組織液等の体液や、各種飲食物並びにそれらの希釈物等を挙げることができるがこれらに限定されるものではない。被検物質となる核酸は、血液や細胞から常法により抽出した核酸を標識してもよいし、該核酸を鋳型として、ＰＣＲ等の核酸増幅法によって増幅したものであってもよい。核酸を鋳型として、ＰＣＲ等の核酸増幅法によって増幅したものの場合には、測定感度を大幅に向上させることが可能である。核酸増幅産物を被検物質とする場合には、蛍光物質等で標識したヌクレオチド三リン酸の存在下で増幅を行うことにより、増幅核酸を標識することが可能である。また、被検物質が抗原又は抗体の場合には、被検物質である抗原や抗体を常法により直接標識してもよい。被検物質である抗原又は抗体を選択結合性物質と結合させた後、担体を洗浄し、該抗原又は抗体と抗原抗体反応する標識した抗体又は抗原を反応させ、担体に結合した標識を測定することもできる。 In the present invention, as a test substance, a nucleic acid to be measured, for example, a gene such as a pathogenic bacterium or a virus, a causative gene of a genetic disease and a part thereof, various biological components having antigenicity, an antibody against a pathogenic bacterium or a virus, It can be mentioned, but is not limited to these. In the present invention, examples of the solution containing these test substances include body fluids such as blood, serum, plasma, urine, feces, spinal fluid, saliva, various tissue fluids, various foods and beverages, and dilutions thereof. However, it is not limited to these. The nucleic acid to be a test substance may be labeled with a nucleic acid extracted from blood or cells by a conventional method, or may be amplified by a nucleic acid amplification method such as PCR using the nucleic acid as a template. In the case of a product amplified by a nucleic acid amplification method such as PCR using a nucleic acid as a template, the measurement sensitivity can be greatly improved. When a nucleic acid amplification product is used as a test substance, the amplified nucleic acid can be labeled by performing amplification in the presence of a nucleotide triphosphate labeled with a fluorescent substance or the like. Further, when the test substance is an antigen or an antibody, the test substance antigen or antibody may be directly labeled by a conventional method. After binding the test substance antigen or antibody to the selective binding substance, the carrier is washed, and the labeled antibody or antigen that reacts with the antigen or antibody for antigen-antibody reaction is reacted to measure the label bound to the carrier. You can also.
担体上の選択結合性物質に被検物質とを接触させて相互作用させ、被検物質と選択結合性物質とを選択的に結合させる（ハイブリダイゼーション反応）させる工程は、従来と全く同様に行うことができる。反応温度及び時間は、ハイブリダイズさせる核酸の鎖長や、免疫反応に関与する抗原及び／又は抗体の種類等に応じて適宜選択されるが、核酸のハイブリダイゼーションの場合、通常、３５℃〜７０℃程度で１分間〜十数時間、免疫反応の場合には、通常、室温〜４０℃程度で１分間〜数時間程度である。 The process of bringing the test substance into contact with and interacting with the selective binding substance on the carrier and selectively binding the test substance and the selective binding substance (hybridization reaction) is carried out in exactly the same manner as before. be able to. The reaction temperature and time are appropriately selected according to the chain length of the nucleic acid to be hybridized, the type of antigen and / or antibody involved in the immune reaction, and in the case of nucleic acid hybridization, usually 35 ° C. to 70 ° C. In the case of an immune reaction, it is usually from room temperature to about 40 ° C. for about 1 minute to several hours.
担体上に選択結合性物質を介して結合した被検物質量の測定は、従来の方法に従って行うことができる。例えば、被検物質と選択結合性物質とを選択的に結合させた後の分析チップ又は容器を脱離させた担体を、既存のスキャナー等の装置にセットし、蛍光等のシグナル強度を測定することによって行うことができる。 The amount of the test substance bound to the carrier via the selective binding substance can be measured according to a conventional method. For example, a carrier from which an analysis chip or a container after selectively binding a test substance and a selective binding substance is detached is set on an existing apparatus such as a scanner, and signal intensity such as fluorescence is measured. Can be done.
本発明を以下の実施例によってさらに詳細に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。 The invention is illustrated in more detail by the following examples. However, the present invention is not limited to the following examples.
実施例１
実施例１では、図２および図４に示される、選択結合性物質が平坦部６に固定化された担体２と、容器内部表面に円柱状の突起構造８Ａを有する容器１とで構成される分析チップを作成し、評価を行った。
Example 1
In Example 1, it is comprised by the support |
（ＤＮＡ固定化担体の作製）
公知の方法であるＬＩＧＡ（Ｌｉｔｈｏｇｒａｐｈｉｅ Ｇａｌｖａｎｏｆｏｒｍｕｎｇ Ａｂｆｏｒｍｕｎｇ）プロセスを用いて、射出成形用の型を作製し、射出成型法により、図２および図４に示す、貫通孔３を４つ有し、表面が平坦構造を有するＰＭＭＡ製の担体２を得た。この実施例で用いたＰＭＭＡの平均分子量は５万であり、ＰＭＭＡ中には１重量％の割合で、カーボンブラック（三菱化学製 ＃３０５０Ｂ）を含有させており、担体は黒色である。担体の形状は、大きさが縦７６ｍｍ、横２６ｍｍ、厚み１ｍｍであり、担体表面は平坦であった。
(Preparation of DNA immobilization carrier)
Using a known method, LIGA (Lithographie Galvanforming Abforming) process, a mold for injection molding is prepared. By injection molding, four through-
次に上記のＰＭＭＡ担体を１０Ｎの水酸化ナトリウム水溶液に７０℃で１２時間浸漬した。これを、純水、０．１ＮのＨＣｌ水溶液、純水の順で洗浄し、担体表面にカルボキシル基を生成した。 Next, the PMMA carrier was immersed in a 10N aqueous sodium hydroxide solution at 70 ° C. for 12 hours. This was washed with pure water, 0.1N HCl aqueous solution, and pure water in this order to generate carboxyl groups on the surface of the carrier.
（プローブＤＮＡの固定化）
配列番号１で表される塩基配列を有するＤＮＡ（６０塩基、５’末端アミノ化）を合成した。このＤＮＡは５’末端がアミノ化されている。
(Immobilization of probe DNA)
DNA having a base sequence represented by SEQ ID NO: 1 (60 bases, 5 ′ terminal amination) was synthesized. This DNA is aminated at the 5 ′ end.
このＤＮＡを、純水に０．３ｎｍｏｌ／μＬの濃度となるよう溶解させて、ストックソリューションとした。担体に点着する際は、ＰＢＳ（ＮａＣｌを８ｇ、Ｎａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２Ｏを２．９ｇ、ＫＣｌを０．２ｇ、ＫＨ２ＰＯ４を０．２ｇ純水に溶かし１ＬにメスアップしたものにｐＨ調整用の塩酸を加えたもの、ｐＨ５．５）で１０倍希釈して、プローブＤＮＡの終濃度を０．０３ｎｍｏｌ／μＬとし、かつ、担体表面のカルボン酸とプローブＤＮＡの末端のアミノ基とを縮合させるため、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）を加え、この終濃度を５０ｍｇ／ｍＬとした。そして、これらの混合溶液をアレイヤー（日本レーザー電子製；Ｇｅｎｅ Ｓｔａｍｐ−ＩＩ）で担体表面上に２５６（１６×１６）スポットした。次いで、担体を密閉したプラスチック容器に入れて、３７℃、湿度１００％の条件で２０時間程度インキュベートした。最後に純水で洗浄し、スピンドライヤーで遠心して乾燥した。この反応スキームを図９に示す。 This DNA was dissolved in pure water to a concentration of 0.3 nmol / μL to obtain a stock solution. When spotting on the carrier, PBS (NaCl 8 g, Na 2 HPO 4 · 12H 2 O 2.9 g, KCl 0.2 g, KH 2 PO 4 0.2 g in pure water was made up to 1 L. The sample is diluted with hydrochloric acid for pH adjustment, pH 5.5), diluted 10-fold so that the final concentration of the probe DNA is 0.03 nmol / μL, and the carboxylic acid on the carrier surface and the amino at the end of the probe DNA In order to condense with the group, 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDC) was added to bring the final concentration to 50 mg / mL. Then, 256 (16 × 16) spots of these mixed solutions were spotted on the surface of the carrier by an arrayer (manufactured by Nippon Laser Electronics; Gene Stamp-II). The carrier was then placed in a sealed plastic container and incubated for about 20 hours at 37 ° C. and 100% humidity. Finally, it was washed with pure water, dried by centrifugation with a spin dryer. This reaction scheme is shown in FIG.
（液体を保持する容器）
射出成形法により、図２および図４に示す容器１を作製した。容器の形状は、大きさが縦１７ｍｍ、横１９．５ｍｍ、厚み１ｍｍであり、容器の中央に、縦１１．０ｍｍ、横１３．５ｍｍ、深さ０．２５ｍｍの凹んだ部分が設けられており、この凹みの中に、直径０．１５ｍｍ、高さ０．１５ｍｍの突起構造を２５６箇所設けた。そして、これを洗浄剤（クリーンエース（アズワンカタログ、品番：４−０７８−０１）２５倍希釈溶液）に浸漬して５分間超音波洗浄した後、逆浸透水（ＲＯ水）で十分にすすぎ、エアブローにより乾燥させた。
(Contains liquid)
A
（チップの組み立て）
プローブＤＮＡを固定化した担体の領域を覆うように液体を保持する容器を配置し、担体と液体を保持する容器をＰＤＭＳポリマーにより接着した。接着条件は４２℃、２時間である。
(Chip assembly)
A container for holding the liquid was disposed so as to cover the region of the carrier on which the probe DNA was immobilized, and the carrier and the container for holding the liquid were adhered by PDMS polymer. The bonding condition is 42 ° C. for 2 hours.
（微粒子の調製と封入）
表面粗さが２０ｎｍ、平均粒径が３００μｍの市販ジルコニア製微粒子（東レ株式会社製）を、炭化珪素質研磨材（粒度＃２０）を用い遠心式バレル研磨機で１時間、水中にて研磨を行い、水洗して乾燥した。前記微粒子の表面粗さは、Ｒａ＝１６５ｎｍであった。かかる微粒子の表面粗さの測定は、その表面をＡｕで真空蒸着した後、走査型電子顕微鏡（株式会社エリオニクス製、型式ＥＳＡ−２０００）で表面粗さＲａ（ｎｍ）を測定した。前記表面粗さは、観察倍率を１０，０００倍、カットオフ値を０とし、任意の１０個について測定し、その平均値を求めた。かかる微粒子の粒径は、実体顕微鏡で任意の１００個以上の微粒子の画像を５０〜１５０倍で撮影した後、画像処理解析ソフト（三谷商事社株式会社製、Ｗｉｎ Ｒｏｏｆ）により円相当径を求めて平均値を算出し、それを平均粒径とした。その後エタノール溶液に浸漬し、超音波洗浄を５分間行った。さらに同様の洗浄を２回繰り返した。この微粒子を、担体の貫通孔から、容器表面上の突起構造の隙間に適切量封入した。適切量とは、分析チップの空隙内を半分程度埋め尽くす量であり、十分であることが分かっている。
(Preparation and encapsulation of fine particles)
Polishing commercially available zirconia fine particles (made by Toray Industries, Inc.) having a surface roughness of 20 nm and an average particle size of 300 μm in water for 1 hour with a centrifugal barrel polisher using a silicon carbide abrasive (particle size # 20). Performed, washed with water and dried. The surface roughness of the fine particles was Ra = 165 nm. The surface roughness of such fine particles was measured by vacuum-depositing the surface with Au and then measuring the surface roughness Ra (nm) with a scanning electron microscope (manufactured by Elionix Co., Ltd., model ESA-2000). The surface roughness was measured for any 10 samples with an observation magnification of 10,000 times and a cut-off value of 0, and the average value was obtained. The particle size of such fine particles is obtained by taking an image of an arbitrary 100 or more fine particles with a stereomicroscope at a magnification of 50 to 150 times, and then obtaining an equivalent circle diameter by image processing analysis software (Mitani Corporation, Win Roof). The average value was calculated as the average particle size. Thereafter, it was immersed in an ethanol solution and subjected to ultrasonic cleaning for 5 minutes. Further, the same washing was repeated twice. An appropriate amount of the fine particles was sealed from the through-holes of the carrier into the gaps of the protrusion structure on the container surface. The appropriate amount is an amount that fills about half of the gap in the analysis chip and has been found to be sufficient.
（被検物質ＤＮＡの調製）
被検物質ＤＮＡとして、上記ＤＮＡ固定化担体に固定化されたプローブＤＮＡとハイブリダイズ可能な配列番号４で表される塩基配列を持つＤＮＡ（９６８塩基、以下、配列番号４のＤＮＡともいう）を用いた。調製方法を以下に示す。
(Preparation of test substance DNA)
As a test substance DNA, a DNA having a base sequence represented by SEQ ID NO: 4 capable of hybridizing with the probe DNA immobilized on the DNA immobilization carrier (968 bases, hereinafter also referred to as DNA of SEQ ID NO: 4) Using. The preparation method is shown below.
配列番号２で表される塩基配列を有するＤＮＡ（以下、配列番号２のＤＮＡともいう）と配列番号３で表される塩基配列を有するＤＮＡ（以下、配列番号３のＤＮＡともいう）を合成した。これを純水に溶解して濃度を１００μＭとした。次いで、ｐＫＦ３ プラスミドＤＮＡ（タカラバイオ（株））（配列番号５で表される塩基配列を有するＤＮＡ：２２４６塩基）を用意して、これをテンプレートとし、配列番号２および配列番号３のＤＮＡをプライマーとして、ＰＣＲ反応（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）により増幅を行った。 DNA having the base sequence represented by SEQ ID NO: 2 (hereinafter also referred to as DNA of SEQ ID NO: 2) and DNA having the base sequence represented by SEQ ID NO: 3 (hereinafter also referred to as DNA of SEQ ID NO: 3) were synthesized. . This was dissolved in pure water to a concentration of 100 μM. Next, pKF3 plasmid DNA (Takara Bio Inc.) (DNA having the base sequence represented by SEQ ID NO: 5: 2246 bases) is prepared, using this as a template, and the DNAs of SEQ ID NO: 2 and SEQ ID NO: 3 as primers As a result, amplification was carried out by PCR reaction (Polymerase Chain Reaction).
ＰＣＲの条件は以下の通りである。すなわち、ＥｘＴａｑ ２μｌ、１０×ＥｘＢｕｆｆｅｒ ４０μｌ、ｄＮＴＰ Ｍｉｘ ３２μｌ（タカラバイオ（株）製）、配列番号２のＤＮＡの溶液を２μｌ、配列番号３のＤＮＡの溶液を２μｌ、テンプレート（配列番号５で表される塩基配列を有するＤＮＡ）を０．２μｌ加え、純水によりトータル４００μｌにメスアップした。これらの混合液を、４つのマイクロチューブに分け、サーマルサイクラーを用いてＰＣＲ反応を行った。これを、エタノール沈殿により精製し、４０μｌの純水に溶解した。ＰＣＲ反応後の溶液の一部をとり電気泳動で確認したところ、増幅したＤＮＡの塩基長は、およそ９６０塩基であり配列番号４のＤＮＡ（９６８塩基）が増幅されていることを確認した。
The conditions for PCR are as follows. Specifically,
次いで、９塩基のランダムプライマー（タカラバイオ（株）製）を６ｍｇ／ｍｌの濃度に溶かし、上記のＰＣＲ反応後精製したＤＮＡ溶液に２μｌ加えた。この溶液を１００℃に加熱した後、氷上で急冷した。これらにＫｌｅｎｏｗ Ｆｒａｇｍｅｎｔ（タカラバイオ（株）製）付属のバッファーを５μｌ、ｄＮＴＰ混合物（ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰの濃度はそれぞれ２．５ｍＭ、ｄＣＴＰの濃度は４００μＭ）を２．５μｌ加えた。さらに、Ｃｙ３−ｄＣＴＰ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス製）を２μｌ加えた。この溶液に１０ＵのＫｌｅｎｏｗ Ｆｒａｇｍｅｎｔを加え、３７℃で２０時間インキュベートし、Ｃｙ３で標識された被検物質ＤＮＡを得た。なお、標識の際ランダムプライマーを用いたので、被検物質ＤＮＡの長さにはばらつきがある。最も長い被検物質ＤＮＡは配列番号４のＤＮＡ（９６８塩基）となる。なお、被検物質ＤＮＡの溶液を取り出して、電気泳動で確認したところ、９６０塩基に相当する付近にもっとも強いバンドが現れ、それより短い塩基長に対応する領域に薄くスメアがかかった状態であった。そして、これをエタノール沈殿により精製し、乾燥した。 Subsequently, a 9-base random primer (manufactured by Takara Bio Inc.) was dissolved at a concentration of 6 mg / ml, and 2 μl was added to the DNA solution purified after the PCR reaction. This solution was heated to 100 ° C. and then rapidly cooled on ice. To this, 5 μl of a buffer attached to Klenow Fragment (manufactured by Takara Bio Inc.) and 2.5 μl of a dNTP mixture (dATP, dTTP, dGTP concentrations were 2.5 mM and dCTP concentrations were 400 μM, respectively) were added. Furthermore, 2 μl of Cy3-dCTP (manufactured by GE Healthcare Bioscience) was added. To this solution, 10 U of Klenow Fragment was added and incubated at 37 ° C. for 20 hours to obtain a test substance DNA labeled with Cy3. In addition, since the random primer was used in the labeling, the length of the test substance DNA varies. The longest test substance DNA is the DNA of SEQ ID NO: 4 (968 bases). When the test substance DNA solution was taken out and confirmed by electrophoresis, the strongest band appeared in the vicinity corresponding to 960 bases, and the area corresponding to the shorter base length was thinly smeared. It was. This was purified by ethanol precipitation and dried.
この標識化された被検物質ＤＮＡを、１重量％ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）、５×ＳＳＣ（５×ＳＳＣとは、２０×ＳＳＣ（シグマ製）を純水にて４倍に希釈した液を指す。同様に、２０×ＳＳＣを純水で２倍に希釈した液を１０×ＳＳＣ、１００倍に希釈した液を０．２×ＳＳＣと表記する）、０．１重量％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）、０．０１重量％サケ***ＤＮＡの溶液（各濃度はいずれも終濃度）、４００μｌに溶解し、ハイブリダイゼーション用のストック溶液とした。 This labeled test substance DNA is obtained by diluting 1% by weight BSA (bovine serum albumin), 5 × SSC (5 × SSC is 20 × SSC (manufactured by Sigma) 4 times with pure water. Similarly, a solution obtained by diluting 20 × SSC twice with pure water is expressed as 10 × SSC, and a solution diluted 100 × is expressed as 0.2 × SSC), 0.1% by weight SDS (sodium dodecyl sulfate). ), 0.01 wt% salmon sperm DNA solution (each concentration is the final concentration), dissolved in 400 μl to obtain a stock solution for hybridization.
以下の実施例、比較例において、ハイブリダイゼーション用の被検物質ＤＮＡ溶液は、特に断りのない限り、上記で調製したストック溶液を、１重量％ＢＳＡ、５×ＳＳＣ、０．０１重量％サケ***ＤＮＡ、０．１重量％ＳＤＳの溶液（各濃度はいずれも終濃度）で２００倍に希釈したものを用いた。なお、この溶液の被検物質ＤＮＡ濃度を測定したところ、３ｎｇ／μＬであった。 In the following Examples and Comparative Examples, the test substance DNA solution for hybridization is 1 wt% BSA, 5 × SSC, 0.01 wt% salmon sperm unless otherwise specified. A DNA and 0.1 wt% SDS solution (each concentration is a final concentration) diluted 200 times was used. The test substance DNA concentration of this solution was measured and found to be 3 ng / μL.
（ハイブリダイゼーション）
マイクロピペットを用いて、担体と容器とで囲まれた空隙（空間）５に上記で調製したハイブリダイゼーション用の被検物質溶液を貫通孔３からあふれないように注入した。封止材としてシリコンテープ（アズワン）を用い、４つの貫通孔を塞いだ。ハイブリダイゼーションチャンバー（Ｔａｋａｒａ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｃｈａｍｂｅｒ（タカラバイオ（株））をシート振盪台（東京理化器械（株）製 ＭＭＳ ＦＩＴ−Ｓ）に密着させて固定し、担体をハイブリダイゼーションチャンバー内にセットした。このとき、担体をセットする位置の両端の凹みに、１５μＬずつ超純水を滴下した。ハイブリダイゼーションチャンバーのふたを閉めて６本の固定ネジを締めて固定後、４２℃に設定した恒温チャンバー（東京理化器械（株）製 ＦＭＳ−１０００）内に据え付けた振盪機（東京理化器械（株）製 ＭＭＳ−３１０）の上に載せて固定した。恒温チャンバーの前面をアルミホイルで遮光して、２５０回転／分で旋回振盪しながら、４２℃で１６時間インキュベートした。インキュベート後、ハイブリダイゼーションチャンバーから担体を取り出し、溶液を保持する容器を剥がし、ＰＤＭＳポリマーを脱離した後、微粒子を除いて担体を洗浄、乾燥した。
(Hybridization)
Using a micropipette, the test substance solution for hybridization prepared above was injected into a gap (space) 5 surrounded by the carrier and the container so as not to overflow from the through
（測定）
インキュベート後、担体から容器を剥がす前に、ＤＮＡチップの空隙内の容器表面における微粒子の分散度について、目視検査を行った。分散度は、以下の基準で評価した。分析チップに格納されている微粒子の全量は、分析チップの容器表面を約半分埋め尽くす量である。図１０に示すように、分析チップの容器表面を区分線１１（破線）で示すように８等分に区分けし、区分けされた各領域において微粒子によって占められた面積の割合を目視にて観察した。全ての領域において微粒子が約半分の面積を占めている場合は、微粒子の局在化なしと判定した。一方、区分けされた領域のうち微粒子が占める面積が約半分に満たない状態の領域が１つ以上ある場合は、微粒子の局在化ありと判定した。
(Measurement)
After the incubation, before the container was peeled off from the carrier, a visual inspection was performed on the degree of dispersion of the fine particles on the surface of the container in the gap of the DNA chip. The degree of dispersion was evaluated according to the following criteria. The total amount of fine particles stored in the analysis chip is an amount that fills about half of the container surface of the analysis chip. As shown in FIG. 10, the container surface of the analysis chip was divided into eight equal parts as indicated by the dividing line 11 (broken line), and the ratio of the area occupied by the fine particles in each divided area was visually observed. . In the case where the fine particles occupy about half the area in all the regions, it was determined that the fine particles were not localized. On the other hand, when there is one or more regions in which the area occupied by the fine particles is less than about half of the divided regions, it is determined that the fine particles are localized.
微粒子の分散度を評価した後、ＤＮＡチップ用のスキャナー（Ａｘｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社製 ＧｅｎｅＰｉｘ ４０００Ｂ）に、容器を剥がした後の担体をセットし、レーザー出力３３％、フォトマルチプライヤーの電圧設定を４５０にした状態で蛍光強度の測定を行った。ここでは、担体上のプローブＤＮＡを固定化した８箇所の領域（スポット１〜８）の蛍光強度を測定して、検体ＤＮＡとプローブＤＮＡとのハイブリダイゼーション結果を評価した。蛍光強度とはスポット内の蛍光強度の平均値である。測定対象のスポット１〜８は、図１１に示すように、担体上の４隅に位置する４つのスポット（スポット１〜４）と、中心部に位置する４つのスポット（スポット５〜８）の合計８つのスポットである。結果を表１に示す。
After evaluating the degree of dispersion of the fine particles, the carrier after peeling the container was set in a scanner for DNA chip (GenePix 4000B manufactured by Axon Instruments), the laser output was set to 33%, and the voltage setting of the photomultiplier was set to 450. The fluorescence intensity was measured in the state. Here, the fluorescence intensity of 8 regions (
ハイブリダイゼーション反応後、空隙内における微粒子の分散度を目視検査した結果、空隙内の８つの領域各々において、微粒子により半分程度埋め尽くされていた。この結果から、微粒子は空隙内で局在化することなく、空隙内全体に分散して存在していることが確認できた。 After the hybridization reaction, the degree of dispersion of the fine particles in the void was visually inspected. As a result, each of the eight regions in the void was filled with about half of the particles. From this result, it was confirmed that the fine particles were dispersed and existed throughout the void without being localized in the void.
スポット１〜８における蛍光強度は、全てにおいて同程度の十分な蛍光強度が得られた。この結果から、スポットの位置による反応のむらは発生せず、反応溶液が容器内で均一に撹拌されたと考えられる。
As for the fluorescence intensities in the
実施例２
実施例２では、図６および図８に示される、選択結合性物質が平坦部６に固定化された担体２と、容器内部表面に円柱状の凹陥構造８Ｂを有する容器１とで構成される分析チップを実施例１と同様にして作成し、実施例１と同様の評価を行った。
Example 2
In Example 2, it is comprised by the support |
プローブの固定化位置は、実施例１と同じ、担体の中央とし、溶液を保持する容器の配置位置は、実施例１と同様に中央にした。測定対象のスポット１〜８は、実施例１と同じく、図１１に示すように、担体上の４隅に位置する４つのスポット（スポット１〜４）と、中心部に位置する４つのスポット（スポット５〜８）の合計８つのスポットである。結果を表１に示す。
The probe immobilization position was the same as in Example 1, the center of the carrier, and the arrangement position of the container holding the solution was the same as in Example 1. As shown in FIG. 11, the
ハイブリダイゼーション反応後、空隙内における微粒子の分散度を目視検査した結果、微粒子は空隙内で局在化することなく、空隙内全体に分散して存在していることが確認できた。 As a result of visual inspection of the degree of dispersion of the fine particles in the void after the hybridization reaction, it was confirmed that the fine particles were dispersed in the entire void without being localized in the void.
スポット１〜８における蛍光強度は、実施例１と同様、全てのスポットにおいて同程度の十分な蛍光強度が得られた。この結果から、スポットの位置による反応のむらは発生せず、反応溶液が容器内で均一に撹拌されたと考えられる。
As in Example 1, the fluorescent intensity in the
比較例１
比較例１では、容器内部表面に凹陥構造８Ａを設けず平面のままとした容器を用いたこと以外は実施例１と同様に分析チップを作成し、実施例１と同様の評価を行った。結果を表１に示す。
Comparative Example 1
In Comparative Example 1, an analysis chip was prepared in the same manner as in Example 1 except that a flat container without the
ハイブリダイゼーション反応後、空隙内における微粒子の分散度を目視検査した結果、微粒子は容器表面の中心部の４つの領域全てを埋め尽くしており、外部の４つの領域には殆ど微粒子は存在しなかった。この結果から、微粒子は空隙内で局在化していることが確認された。 After the hybridization reaction, the degree of dispersion of the fine particles in the voids was visually inspected. As a result, the fine particles filled all four regions at the center of the container surface, and there were almost no fine particles in the four outer regions. . From this result, it was confirmed that the fine particles were localized in the voids.
スポット１〜８における蛍光強度は、中心部に位置するスポットにおいては強い蛍光強度が得られたが、四隅に位置するスポットからは弱い蛍光強度が得られた。中心部に位置するスポットの中でも、スポット位置による蛍光強度のばらつきが見られた。スポット位置により反応むらが発生したことから、反応溶液の撹拌が均一に行われなかったと考えられる。
As for the fluorescence intensity in the
１ 容器
２ 担体
３ 貫通孔
４ 微粒子
５ 空隙（空間）
６ 選択結合性物質がその表面に固定化される平坦部
７ 選択結合性物質
８Ａ 突起構造
８Ｂ 凹陥構造
９ 選択結合性物質がその表面に固定化される凸部
１０ ＤＮＡ
１１ 微粒子の分散度評価用の８領域の区分線
Ｒ１ 選択結合性物質が固定化された領域
Ｌ１ 選択結合性物質が固定化されたピッチ
Ｌ２ 容器表面の突起構造ピッチ
Ｌ３ 容器表面の凹陥構造内部の最大径
Ｈ１ 容器の空隙部深さ
Ｈ２ 容器表面の突起構造の高さ
Ｈ３ 容器表面の凹陥構造の深さ
Ｈ４ 選択結合性物質をその表面に固定化する凸部高さ
1
6 Flat part where selective binding substance is immobilized on its
11 Divided lines of 8 regions for evaluation of dispersibility of fine particles R1 Area where selective binding substance is immobilized L1 Pitch where selective binding substance is immobilized L2 Projection structure pitch of container surface L3 Inside concave structure of container surface Maximum diameter H1 Depth of void in container H2 Height of protrusion structure on container surface H3 Depth of recess structure on container surface H4 Height of protrusion for immobilizing selective binding substance on the surface
Claims (4)
Stored in a void formed by a carrier having a selective binding substance immobilized on its surface, a container holding a solution containing a test substance that reacts with the selective binding substance, and the carrier and the container; A solution stirring method using an analysis chip containing fine particles for stirring a solution, wherein a partition structure is provided on the surface of the container of the analysis chip so that the fine particles are not localized. A method for stirring a solution.
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