JP2007212438A - 癌診断剤および癌診断用キット - Google Patents

Abstract

【課題】癌、特に大腸癌および胃癌をより正確に診断するための新規マーカーを見出し、これを利用した癌診断剤および癌診断用キット、並びに癌の重篤度の評価方法および予後診断方法を提供すること。
【解決手段】テネイシンＣ高分子スプライシングバリアントを認識する抗体を含有することを特徴とする癌診断剤及および癌診断用キット並びに癌の重篤度の評価方法および予後診断方法。
【選択図】 なし

Description

本発明は、癌の診断に利用することのできる癌診断剤、癌診断用キットおよび癌の重篤度の評価方法または予後診断方法に関する。より詳細には大腸癌、胃癌等の消化器癌の診断に利用することのできる診断剤および診断用キット、および上記癌の重篤度の評価方法および予後診断方法に関する。

現在、様々な腫瘍マーカーが報告されており、大腸癌や胃癌のマーカーとしては癌胎児性抗原（ＣＥＡ）や糖鎖抗原（ＣＡ１９−９）といったマーカーが報告されている。

しかしながらこれらのマーカーを指標とした場合は、その偽陽性率が高いことなどが問題とされており、より臨床所見と相関の高いマーカーが望まれていた。

本発明は、上記の事情に鑑みなされたものであり、その目的は、癌、特に大腸癌、胃癌等の消化器癌をより正確に診断するための新規マーカーを見出し、これを利用した癌診断剤および癌診断用キットや、癌の重篤度の評価方法および予後診断方法を提供することを課題とするものである。

本発明者らは、上記課題を解決すべく、癌と関連を有するマーカーについて、鋭意検索を行った結果、癌間質などの組織再構築部位に特異的に発現するテネイシンＣの高分子スプライシングバリアントと、大腸癌および胃癌とが密接な関係があることを見出した。そしてこのテネイシンＣ高分子スプライシングバリアント量を、テネイシンＣ高分子スプライシングバリアントを認識する抗体を利用した診断剤や診断用キットで測定することにより、これらの癌の診断等に使用できることを見出した。また、前記テネイシンＣ高分子スプライシングバリアント量が前記癌の重篤度や手術的根治度と相関があることも見出し、本発明を完成した。

すなわち本発明は、以下のとおりのものである。
（１）テネイシンＣ高分子スプライシングバリアントを認識する抗体を含有することを特徴とする癌診断剤。
（２）テネイシンＣ 高分子スプライシングバリアントを認識する抗体が、次の抗体（ａ）または（ｂ）である（１）に記載の癌診断剤。
（ａ）テネイシンＣのフィブロネクチンIII様ドメインの選択的スプライシング部位内
を認識する抗体
（ｂ）テネイシンＣのフィブロネクチンIII様ドメインの選択的スプライシング部位よ
りＮアミノ末端側を認識する抗体
（３）抗体（ａ）が、テネイシンＣ のフィブロネクチンIII様ドメインの選択的スプライシング部位のＢＣＤドメインを認識する抗体である（２）に記載の癌診断剤。
（４）抗体（ｂ）が、テネイシンＣの上皮成長因子様ドメインを認識する抗体である（２）に記載の癌診断剤。
（５）癌が消化器癌である、（１）〜（４）に記載の癌診断剤。
（６）消化器癌が大腸癌または胃癌である、（５）に記載の癌診断剤。
（７）テネイシンＣのフィブロネクチンIII様ドメインの選択的スプライシング部位内を認識する第一の抗体を含む第一の試薬と、テネイシンＣのフィブロネクチンIII様ドメインの選択的スプライシング部位よりＮアミノ末端側を認識する第二の抗体を含む第二の試薬とを含有することを特徴とする癌診断用キット。
（８）第一の試薬が固相化された第一の抗体を含む試薬であり、第二の試薬が標識された第二の抗体を含む試薬である（７）に記載の癌診断用キット。
（９）癌が消化器癌である、（７）または（８）に記載の癌診断用キット。
（１０）消化器癌が大腸癌または胃癌である、（９）に記載の癌診断用キット。
（１１）患者の体液中のテネイシンＣ高分子スプライシングバリアント量を測定することを特徴とする癌の重篤度の評価方法。
（１２）癌が消化器癌である、（１１）に記載の癌の重篤度の評価方法。
（１３）消化器癌が大腸癌または胃癌である、（１２）に記載の癌の重篤度の評価方法。
（１４）患者の体液中のテネイシンＣ高分子スプライシングバリアント量を測定することを特徴とする癌の予後判定方法。
（１５）癌が消化器癌である、（１４）に記載の癌の予後判定方法。
（１６）消化器癌が大腸癌または胃癌である、（１５）に記載の癌の予後判定方法。

本発明の診断剤や診断キットによれば、癌、特に消化器癌の重篤度や予後と関連のあるテネイシンＣ高分子スプライシングバリアントの発現量を測定することができる。

従って、本発明の診断剤や診断キットは、消化器癌等の癌の診断はもとより、その重篤度の判定や予後の評価に有利に利用することができる。

本発明の癌診断剤（以下、「本発明診断剤」という）は、癌の新規マーカーとしてテネイシンＣ高分子スプライシングバリアントを利用し、これを検出、測定するものである。

上記診断剤において、検出、測定の対象となるテネイシンＣ高分子スプライシングバリアントは、テネイシンＣ（Ｔｅｎａｓｃｉｎ−Ｃ）中にあるフィブロネクチンIII様ドメインがスプライシングされた結果生じるバリアントである。このテネイシンＣは、細胞外マトリックス糖タンパク質の１種であり、分子量約２５万以上のポリペプチドがＮ末端付近で、３分子でコイル上に合わさり、更に、２つのジスルフィド結合によって６量体を形成しているものである。各ポリペプチド鎖にはＮ末端側から、ＴＡドメイン、上皮増殖因子様ドメイン、フィブロネクチンIII様ドメイン、フィブリノーゲン様ドメインが含まれている（Ｊｏｎｅｓ Ｆ.Ｓ.ｅｔ ａｌ．，（２０００）Ｄｙｖ Ｄｙｎ ２０８：２３５−２５９）。

このうち、フィブロネクチンIII様ドメインは、基本的な８個の配列（１−８）が反復しており、その５番目と６番目との間に、９個のスプライシングされる反復配列（Ａ１−Ａ４、Ｂ、ＡＤ２、ＡＤ１、Ｃ、Ｄ）が選択的スプライシング部位として存在する。テネイシンＣ高分子スプライシングバリアントは、この反復配列が７個（Ａ１、Ａ２、Ａ３、Ａ４、Ｂ、Ｃ、Ｄ）挿入されるもの、７個がさまざまな組み合わせで挿入されるもの、または全く挿入されないものが大部分であろうとされている。このうち、癌などの病変組織では７個のドメインが入ったものが多く発現しており、後半の３つの反復（Ｂ、Ｃ、Ｄ）が癌間質に比較的特異的であると考えられる。他方、選択的スプライシング部位は、マトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）で切断されやすい部位であることが知られており、この部位のエピトープを測定に使用することにより、分子構造の保たれたテネイシンＣ高分子スプライシングバリアントのみを測定することができると考えられる。

本発明診断剤で用いる、テネイシンＣ高分子スプライシングバリアントを認識する抗体（以下、「抗テネイシンバリアント抗体」という）は、上記の分子構造の保たれたテネイシンＣ高分子スプライシングバリアントを測定することができるものである。この抗体は、上記のいずれかのテネイシンＣ高分子スプライシングバリアントまたはこれから得られるペプチド断片等を抗原として使用し、抗体産生の常法に従って製造されるものであり、テネイシンＣ高分子スプライシングバリアントを測定可能なものであれば、ポリクローナル抗体であってもモノクローナル抗体であっても良く、特に制限されない。

上記抗テネイシンバリアント抗体の製造において、抗原として用いられるテネイシンＣ高分子スプライシングバリアントまたはこれから得られるペプチド断片等としては、例えば、テネイシンＣを産生している組織もしくは培養細胞から抽出したもの、前記培養細胞の培養液中のテネイシンＣを濃縮・精製したもの、あるいはこれらのテネイシンＣをプロテアーゼ等の酵素もしくは化学的に断片化したものが挙げられる。また、ヒトやマウスのテネイシンＣのアミノ酸配列や塩基配列（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．：Ｘ５６１６０、Ｄ９０３４３）等から、認識させたい特定の部位をコードするｃＤＮＡに一致するポリヌクレオチドを作製し、これを常法によりベクターに組み込み、このベクターを用いて大腸菌等の宿主微生物もしくは培養細胞を形質転換し、この大腸菌等の宿主微生物・培養細胞を培養して産生させたリコンビナントタンパク質や上記配列から特定の部位のアミノ酸配列に一致したポリペプチドを合成した後ニッケルカラム等で精製したもの等も挙げられる。

本発明で使用する抗テネイシンバリアント抗体は、例えば、次のようにして製造することができる。まず上記したテネイシンＣ高分子スプライシングバリアントまたはこれから得られるペプチド断片等を抗原とし、常法により、ウサギ、マウス等の動物を免疫する。次いで、このように免疫した動物から脾細胞を取得し、この脾細胞とマウスミエローマ細胞とを融合し、限界希釈法により目的とするクローンをクローニングすることによりハイブリドーマ細胞を得ることができる。この抗体産生細胞とミエローマ細胞との融合は、例えばポリエチレングリコール等の高濃度ポリマー溶液中で行うことができる。最後に、上記のようにして得られた融合細胞を培養することにより、抗テネイシンバリアント抗体を得ることができる。

なお、上記の動物の免疫において、ペプチドを抗原として用いる場合には、エピトープのはっきりとしたモノクローナル抗体を作製することが可能である。また、動物に免疫を行う際に、内在性のテネイシンＣの影響を除くために、テネイシンＣ遺伝子欠損マウスを使用することが好ましい。そのような遺伝子欠損マウスを用いることにより、種交差性の高いモノクローナル抗体を得ることが期待できる。更に、この際に融合細胞の選択は公知のＨＡＴ（ヒポキサンチン・アミノプテリン・チミジン）選択法を用いて行うことが好ましく、ミエローマ細胞としては、融合した細胞を選択する方法が確立されている、ＨＧＰＲＴ（Ｈｙｐｏｘａｎｔｈｉｎ−ｇｕａｎｉｎ ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｂｏｓｙｌ ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）欠損株を用いることが好ましい。このＨＧＰＲＴ欠損株のミエローマ細胞は、代謝系の欠損のためにアミノプテリン非存在下では生存できないが、融合したハイブリドーマ細胞では、脾細胞よりＨＧＰＲＴが供給されるために、ＨＡＴ培地中で生存することができ、その結果非融合細胞と容易に分離することができる。更に、限界希釈法によりＨＡＴ培地中で増殖するものの抗体を産生しないクローンを除くことにより、クローニングを確立することができる。

また、得られたハイブリドーマ細胞の産生する抗体が、目的とする適当な部位を認識しているかどうかは、前記のように作製されたテネイシンＣ高分子スプライシングバリアントまたはこれから得られるペプチド断片等とウエスタンブロット法等を用いることにより、確認することが可能である。もしくは、プロテアーゼを用い酵素的にテネイシンＣの断片を作製し、反応するポリペプチドのアミノ酸解析を行い、認識する部位を決定することなどを行うこともできる。

具体的に本発明診断剤で用いる、テネイシンＣ高分子スプライシングバリアントを測定することのできる抗体の好ましい例としては、次のような抗体を挙げることができる。
（ａ）テネイシンＣのフィブロネクチンIII様ドメインの選択的スプライシング部位内
を認識する抗体
（ｂ）テネイシンＣのフィブロネクチンIII様ドメインの選択的スプライシング部位よ
りＮアミノ末端側を認識する抗体

具体的に、テネイシンＣのフィブロネクチンIII様ドメインの選択的スプライシング部位内を認識する抗体（抗体（ａ））を作製する場合には、例えば、次のようにすればよい。すなわち、前記選択的スプライシング部位内のいずれかのドメイン、好ましくは選択的スプライシング部位内のＢＣＤドメインをコードするｃＤＮＡのポリヌクレオチドをＰＣＲ法により作製し、これをｐＱＥベクター等のベクターに組み込む。次いでこのベクターを大腸菌等の宿主微生物に導入し、この宿主微生物をＬＢ培地で培養してリコンビナントタンパク質を産生させる。次いで、このリコンビナントタンパク質を上記した方法により動物に免役し、この動物から得られた脾細胞とマウスミエローマ細胞を融合させハイブリドーマ細胞を作製する。このハイブリドーマ細胞の産生する抗体の認識部位を、上記免疫に用いたリコンビナントタンパク質を用いてクローニングする。最後に、このハイブリドーマ細胞を常法により培養することによって抗体（ａ）が得られる。

また、具体的に、テネイシンＣのフィブロネクチンIII様ドメインの選択的スプライシング部位よりＮアミノ末端側を認識する抗体（抗体（ｂ））を作製する場合には、例えば、次のようにすればよい。すなわち、ヒト神経膠芽細胞腫培養細胞Ｕ−２５１ＭＧの培養液からゲルろ過カラムとイオン交換カラムを用いて精製されたヒトテネイシンＣを抗原として上記した方法により動物に免疫し、この動物から得られた脾細胞と、マウスミエローマ細胞を融合させハイブリドーマ細胞を作製する。次いで、このハイブリドーマ細胞のうち、テネイシンＣのフィブロネクチンIII様ドメインの選択的スプライシング部位よりＮアミノ末端側、すなわち、ＴＡドメイン、上皮増殖因子様ドメイン等、好ましくは上皮増殖因子様ドメインを認識する抗体を産生するハイブリドーマ細胞を、例えば前記ドメインのリコンビナントタンパク質やその断片等を用いてクローニングする。最後に、このハイブリドーマ細胞を培養することによって抗体（ｂ）が得られる。

以上のようにして得られるテネイシンＣのフィブロネクチンIII様ドメインの選択的スプライシング部位内を認識する抗体（ａ）（クローン名：１９Ｃ４ＭＳ）とテネイシンＣの選択的スプライシング部位のＮ末端側を認識する抗体（クローン名：４Ｆ１０ＴＴ）を産生するハイブリドーマ細胞（Ｈｕｍａｎ Ｔｅｎａｓｃｉｎ−Ｃ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ １９Ｃ４ＭＳおよびＨｕｍａｎ Ｔｅｎａｓｃｉｎ−Ｃ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ ４Ｆ１０ＴＴ）をそれぞれＦＥＲＭ Ｐ−１９０６４およびＦＥＲＭ Ｐ−１９０６３として、平成１４年１０月１０日付で独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター（郵便番号３０５−８５６６ 日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）に寄託した。

上記の寄託したハイブリドーマ細胞１９Ｃ４ＭＳは、テネイシンＣのフィブロネクチンIII様ドメインの選択的スプライシング部位のＢＣＤドメインを認識する抗体を産生するものであり、ハイブリドーマ細胞４Ｆ１０ＴＴはテネイシンＣの上皮成長因子様ドメインを認識する抗体を産生するものである。

上記の様にして得られるハイブリドーマ細胞を公知の方法により培養して、精製することにより、本発明診断剤で用いられるモノクローナル抗体を得ることができる。ハイブリドーマ細胞の培養は、培地中で培養することにより行うことが好ましい。また、マウス腹腔内にハイブリドーマ細胞を注射し、腹水からモノクローナル抗体を採取することもできる。このようにして得られたモノクローナル抗体は、アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ゲルろ過法、硫安塩析法等の常法により精製することができる。

また、これらの抗体は必要により標識することができる。この標識物質としては、西洋わさびペルオキシダーゼ（以下「ＨＲＰ」と言う）、アルカリフォスファターゼ等の酵素、フルオレセインイソシアネート、ローダミン等の蛍光物質、^３２Ｐ、^１２５Ｉ等の放射性物質、化学発光物質などが挙げられる。

かくして得られる抗体（ａ）および抗体（ｂ）を含有する本発明診断剤は、下記の免疫学的測定方法に用いることができる。

以上説明した抗体を利用する具体的な免疫学的測定方法としては、放射性同位元素免疫測定法（ＲＩＡ法）、ＥＬＩＳＡ法（Ｅｎｇｖａｌｌ, Ｅ, Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ, ７０, ４１９−４３９（１９８０））、蛍光抗体法、プラーク法、スポット法、凝集法、オクタロニー（Ｏｕｃｈｔｅｒｌｏｎｙ）等の、一般の免疫化学的測定法において使用されている種々の方法（「ハイブリドーマ法とモノクローナル抗体」、株式会社Ｒ＆Ｄプランニング発行、第３０頁−第５３頁、昭和５７年３月５日）を挙げることができる。そして、これらの方法は種々の観点から適宜選択することができるが、感度、簡便性等の点からはＥＬＩＳＡ法が好ましい。

より具体的に、テネイシンＣ高分子スプライシングバリアントの測定について、ＥＬＩＳＡ法の一つであるサンドイッチ法を例にとってその手順を説明すれば次の通りである。すなわち、まず、本発明の抗体（ａ）を担体に固相化し（工程（Ａ））、次いで、抗体が固相化されていない担体表面を抗原と無関係な、例えばタンパク質により、ブロッキングする（工程（Ｂ））。更に、これに各種濃度のテネイシンＣ高分子スプライシングバリアントを含む検体を加え、テネイシンＣ高分子スプライシングバリアント−抗体複合体を生成させた後（工程（Ｃ））、標識した抗体（ｂ）を加え、固相化抗原−抗体複合体と結合させ（工程（Ｄ））、最後に、標識量を測定することにより、予め作成した検量線から検体中のテネイシンＣ高分子スプライシングバリアントの量を決定することができる（工程（Ｅ））。

まず、工程（Ａ）において、抗体を固相化するために用いられる担体としては、特別な制限はなく、免疫化学的測定法において常用されるものをいずれも使用することができる。例えば、ポリスチレン製の９６穴マイクロタイタープレートあるいは、アミノ基結合型のマイクロタイタープレートが挙げられる。また、抗体を固相化させるには、例えば、抗体を含む緩衝液を担体上に加え、インキュベーションすればよい。緩衝液としては公知のものが使用でき、例えば１０ｍＭのＰＢＳを挙げることができる。緩衝液中の抗体の濃度は広い範囲から選択できるが、通常０.０１〜１００μｇ／ｍｌ程度、好ましくは０.１〜２０μｇ／ｍｌが適している。また、担体として９６ウェルのマイクロタイタープレートを使用する場合には、３００μｌ／ウェル以下で２０〜１５０μｌ／ウェル程度が望ましい。更に、インキュベーションの条件にも特に制限はないが、通常４℃程度で一晩のインキュベーションが適している。

また、工程（Ｂ）のブロッキングは、抗体を固相化した担体において、後に添加する検体中のテネイシンＣ高分子スプライシングバリアントが抗原抗体反応とは無関係に吸着される部分が存在する場合があるので、それを防ぐ目的で行う。ブロッキング剤としては、例えば、ＢＳＡやスキムミルク溶液を使用できる。あるいは、ブロックエース（Ｂｌｏｃｋ−Ａｃｅ：大日本製薬製（コードＮｏ.ＵＫ−２５Ｂ））等の市販のブロッキング剤を使用することもできる。具体的には、限定されるわけではないが、例えば抗原を固相化した部分に、ブロックエースを適量加え、約４℃で、一晩のインキュベーションをした後、緩衝液で洗浄することにより行われる。

次いで工程（Ｃ）において、テネイシンＣ高分子スプライシングバリアントを含む検体を固相化抗体と接触させ、固相化抗体でテネイシンＣ高分子スプライシングバリアントを捕捉し、固相化抗体−テネイシンＣ高分子スプライシングバリアント複合体を生成させる。反応は限定されるわけではないが、３７℃程度で約１時間行えばよい。反応終了後、緩衝液で担体を洗浄し、未反応のタンパク質等を除去させることが好ましい。この反応に用いる緩衝液としては、１０ｍＭのＰＢＳ（ｐＨ７.２）および０.０５％（ｖ／ｖ）のＴｗｅｅｎ２０の組成のものが好ましい。

更に工程（Ｄ）において、固相化抗体に捕捉されたテネイシンＣ高分子スプライシングバリアントの別のエピトープを認識する、標識抗体を加え、固相化抗体−テネイシンＣ高分子スプライシングバリアント−標識抗体複合体を形成させる。この反応終了後、緩衝液で担体を洗浄し、未反応のタンパク質等を除去させることが好ましい。この反応に用いる緩衝液としては、前記したものが使用される。この工程（Ｄ）において使用される標識抗体の量は、担体に結合した固相化抗体に対して約５０００〜１００００倍、好ましくは最終吸光度が１.０〜１.５となるように希釈した標識抗体を反応させるのが望ましい。希釈には緩衝液を用いることができ、反応は限定されるわけではないが、約４℃で約３０分間行い、反応後、緩衝液で洗浄することが好ましい。以上の反応により、担体に抗体−テネイシンＣ高分子スプライシングバリアント−標識抗体複合体を結合することができる。

最後に工程（Ｅ）において、固相化抗体−テネイシンＣ高分子スプライシングバリアント−標識抗体複合体の標識物質と反応する発色基質溶液を加え、吸光度を測定することによって検量線からテネイシンＣ高分子スプライシングバリアントの量を算出することができる。

標識抗体の標識物としては、前記したものが利用できるが、標識物として酵素であるペルオキシダーゼを使用する場合には、例えば、過酸化水素と３,３’,５,５’−テトラメチルベンジン（以下「ＴＭＢ」という）を含む発色基質溶液を使用することができる。発色反応は、限定されるわけではないが、発色基質溶液を加え約２５℃で約２０分間反応させた後、２Ｎの硫酸を加えて酵素反応を停止させことにより行うことができる。ＴＭＢを使用する場合、発色は４５０ｎｍの吸光度により測定する。一方、標識物として、酵素であるアルカリホスファターゼを使用する場合には、ｐ−ニトロフェニルリン酸を基質として発色させ、２ＮのＮａＯＨを加えて酵素反応を止め、４１５ｎｍでの吸光度を測定する方法が適している。なお、既知の濃度のテネイシンＣ高分子スプライシングバリアントを添加した反応液の吸光度により予め作成しておいた検量線を用いて、検体中のテネイシンＣ高分子スプライシングバリアントの濃度を算出できる。

本発明診断剤を用いて上記のような測定を行うためには、テネイシンＣのフィブロネクチンIII様ドメインの選択的スプライシング部位内を認識する抗体（抗体（ａ））を含む第一の試薬と、テネイシンＣのフィブロネクチンIII様ドメインの選択的スプライシング部位よりＮアミノ末端側を認識する抗体（抗体（ｂ））を含む第二の試薬とを含有させた癌診断用キット（以下、「本発明キット」という）を利用すればよい。

より好ましい本発明キットの例としては、本発明の抗体（ａ）を担体上に固相化し、本発明の抗体（ｂ）を上記した標識物質で標識化したキットを利用することが好ましい。このような本発明キットとしては、上記のようにして作製したものの他に、例えば、株式会社免疫生物研究所から市販されているＨｕｍａｎ Ｔｅｎａｓｃｉｎ−Ｃ Ｈｉｇｈ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｗｅｉｇｈｔ Ｖａｒｉａｎｔｓ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（Ｌ）−ＩＢＬ（製品番号２７７５１）を利用することもできる。

上記のように作製された本発明キットは、テネイシンＣ高分子スプライシングバリアントを定量できるものである。これを用いて血清、ＥＤＴＡ血漿等の体液中のテネイシンＣ高分子スプライシングバリアントを定量すれば癌の診断、重篤度の評価、予後判定等を行うことができる。

本発明キットを用いて癌の診断を行うには、まず、被験者から採取した体液を試料とし、この中のテネイシンＣ高分子スプライシングバリアントを定量する。次に、被験者の体液中のテネイシンＣ高分子スプライシングバリアント量と健常者の体液中のテネイシンＣ高分子スプライシングバリアント量の平均値と比べる。そして被験者の体液中のテネイシンＣ高分子スプライシングバリアント量が高い場合には癌と診断することができる。また、前記診断のためにカットオフ値を設ける場合には、例えば、平均値＋２ｘ標準偏差をカットオフ値として、この値より被験者の体液中のテネイシンＣ高分子スプライシングバリアント量が高い場合には癌、低い場合には健常と判断する。

また、本発明キットを用いて癌の重篤度の評価を行うには、上記診断と同様にして定量されたテネイシンＣ高分子スプライシングバリアント量が、平均値＋２ｘ標準偏差をカットオフ値とした場合、このカットオフ値を超え経時的な測定により増加していく場合重篤度が進行していると評価する。

更に、本発明キットを用いて癌の予後の判定を行うには、上記診断と同様にして定量されたテネイシンＣ高分子スプライシングバリアント量が、平均値＋２ｘ標準偏差をカットオフ値とした場合、このカットオフ値より測定値が低下していれば予後が良好であると評価する。

上記した本発明キットを用いて診断、重篤度の評価、予後の判定される癌としては、 大腸癌、胃癌、盲腸癌等の消化器癌が挙げられる。これらの癌の中でも大腸癌および胃癌が好ましい。

以下に実施例により本発明を説明するが、本発明はこれら実施例に何ら制約されるものではない。

実 施 例 １
テネイシンＣのフィブロネクチンIII様ドメインの選択的スプライシング部位内を
認識する抗体の作製：
（１）免疫原の調製
テネイシンＣのアミノ酸配列や塩基配列（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．：Ｘ５６１６０）から、フィブロネクチンIII様ドメインの選択的スプライシング部位のＢＣＤドメイン（以下、単に「ＢＣＤドメイン」という）をコードするｃＤＮＡであるポリヌクレオチド（配列番号１）を常法により作製し、これをｐＱＥ−３１ベクター（キアゲン製）に組換え、大腸菌のコンピテントセル（ＪＭ−１０９）に導入した。この大腸菌を培養し、イソプロピル−β−Ｄ（−）チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を添加した後一晩培養し、ｐＱＥ−３１ベクターに組込んだｃＤＮＡのリコンビナントタンパク質（配列番号２）を産生させた。大腸菌の細胞膜を破壊することによりリコンビナントタンパク質を抽出した後、Ｈｉｓ ｔｒａｐカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ製）で精製した。

（２）モノクローナル抗体の作製
テネイシンＣの遺伝子欠失マウスは三重大学医学部付属動物実験施設で継体飼育されている、ＢＡＬＢ／Ｃに戻し交配されたものを用いた。上記（１）で作製したＢＣＤ部分のリコンビナントタンパク質の１００μｇとコンプリートアジュバントとを等量混合してエマルジョンを作製し、これをマウスに２週間の間隔で２回免疫した。更に、細胞融合３日前にマウスの尾静脈内に１００μｇのリコンビナントタンパク質を注射した。免疫したマウスから脾臓を摘出し、これから脾細胞懸濁液を調整し、脾細胞とマウスミエローマ細胞（Ｓｐ２／０）を５：１で混合し、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）溶液中で細胞融合を行い、ハイブリドーマ細胞を得た。

その後、ハイブリドーマ細胞を含むＰＥＧ溶液からＰＥＧを除去し、残ったハイブリドーマ細胞をＢｒｉｃｌｏｎｅ（Ｂｉｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ製）５％と２０％ＦＣＳを添加したＩＭＤＭに再浮遊し、９６穴マイクロプレートに１×１０^５個／穴の濃度でまきこみ、ＣＯ_２濃度７％、３７℃で培養を行った。４日後、ＨＡＴ培地を添加し、７〜１０日後に精製ヒトテネイシンＣを抗原としてプレートに吸着させ、培養液を反応させ、更に希釈したペルオキシダーゼ標識抗マウスＩｇＧを反応させることにより、抗体産生を確認した。クローンはＨＴ培地を用いて更に選択培養し、限界希釈法によってクローニングを２回繰り返した。

（３）抗体の精製
ハイブリドーマ細胞を無血清培地のＧＩＴ培地（和光純薬）で細胞の８０％が死滅するまで抗体を産生させた。遠心（１,０００ｒｐｍ、１５ｍｉｎ）により細胞を取り除いた後、硫酸アンモニウム５０％飽和状態にして４℃で一晩静置し、沈殿を遠心（１,０００ｒｐｍ、３０ｍｉｎ）して回収した。この沈殿を２倍に希釈したｂｉｎｄｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ（Ｐｒｏｔｅｉｎ ＡＭＡＰＳ ＩＩｋｉｔ製）に溶解させた後、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ−Ａｍｅｒｓｈａｍ製）にＩｇＧを吸着させた。その後、ＰＢＳ透析を一晩行って抗体を精製した。

実 施 例 ２
テネイシンＣの上皮成長因子様ドメインを認識する抗体の作製：
（１）免疫原の調製精製
ヒトテネイシンＣは、オークヒル（Ａｕｋｈｉｌ Ｉ. ｅｔ ａｌ．（１９９０） Ｍａｔｒｉｘ １０：９８−１１１）の方法に従い、ヒト神経膠細胞株Ｕ２５１の細胞株から５０％硫酸アンモニウム飽和による塩析とＳｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ５００カラム、モノＱカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ製）を用いて精製した。

（２）モノクローナル抗体の作製および精製
テネイシンＣの遺伝子欠失マウスは三重大学医学部付属動物実験施設で継体飼育されている、ＢＡＬＢ／Ｃに戻し交配されたものを用いた。上記（１）で精製した精製ヒトテネイシンＣをマウスに免疫し、実施例１と同様の方法で、ハイブリドーマ細胞を得た。実施例１と同様の方法で、クローンのスクリーニングを行い、陽性クローンを培養し、培養上清から得られる抗体を精製した。

実 施 例 ３
ウエスタンブロット法による抗体の認識部位の解析：
実施例１および実施例２で作製した抗体の認識部位をウエスタンブロット法により解析した。

（１）テネイシンＣの上皮増殖因子様ドメインのリコンビナントタンパク質の作製
マウステネイシンＣ（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．：Ｄ９０３４３）の上皮増殖因子様ドメインのｃＤＮＡ配列（配列番号３）から、上皮増殖因子様ドメインの両端にプライマーを設計し、マウステネイシンＣのｃＤＮＡからＰＣＲにより、遺伝子を増幅し、ｐＳｅｃベクターに同部の遺伝子を組み込んだ。これを用いて、ＣＨＯ−Ｋ１細胞を形質転換し、テネイシンＣの上皮増殖因子ドメインのリコンビナントタンパク質（配列番号４）を発現させた。培養上清に分泌されたリコンビナントタンパク質をＨｉｓ ｔｒａｐカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ製）で精製した。

（２）ウエスタンブロット法による抗体の認識部位の解析
ポリアクリルアミド ゲル エレクトロフォレイシス（Ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ Ｇｅｌ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）ＭＵＬＴＩＧＥＬ２／１５（第一化学薬品製）上で、レムリ（Ｌａｅｍｍｌｉ）の方法を用いて電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法）を行った。電気泳動されたタンパク質は、Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｍｅｍｂｒａｎｅｓ（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ製）へ電気的に転写した。メンブレンは０.５％スキムミルク添加５０ｍＭ トリス−緩衝生理食塩水（ＴＢＳ）でブロッキングし、０.１％スキムミルク添加ＴＢＳで１,０００倍に希釈した実施例１および実施例２で作製したモノクローナル抗体と一晩反応させ、０.１％スキムミルク溶液で洗浄し、ペルオキシダーゼ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ−ｃｈａｉｎ：Ｂｉｏｒａｄ製）で５００倍に希釈して２次抗体として反応させ、洗浄後ＤＡＢ／Ｈ_２Ｏ_２溶液で発色させた。

ウエスタンブロットの結果を図１に示す。実施例２で作製したモノクローナル抗体（クローン名：４Ｆ１０ＴＴ）は幅広いバンドを認識し、特に、選択的スプライシング部位の挿入がないテネイシンＣと考えられる２１０ｋＤａ付近（図１のＬ）および７つのフィブロネクチンIII様の反復が挿入されたバリアントであると考えられる３００ｋＤａ付近（図１のＨ）に濃いバンドが見られた。この結果より、実施例２で作製したモノクローナル抗体は、ヒトテネイシンＣを認識するとともに、上皮増殖因子様ドメインと反応し、同ドメインを認識することを確認した。

一方、実施例１で作製したモノクローナル抗体（クローン名：１９Ｃ４ＭＳ）は３００ｋＤａ付近に濃いバンドがあるものの、２１０ｋＤａ付近のバンドは見られなかった。従って、このモノクローナル抗体は低分子のバリアントを認識せず高分子量のバンドのみを認識すると推測されたため、実施例１で作製したＢＣＤドメインのリコンビナントタンパク質を用いて同様にウエスタンブロットを行った。その結果を図２に示す。図２において、ＢＣＤドメインのリコンビナントタンパク質を示す３７ｋＤａ付近に濃いバンドが認められた。従って、実施例１で作製したモノクローナル抗体はＢＣＤドメイン、すなわち、テネイシンＣのフィブロネクチンIII様ドメインの選択的スプライシング部位内において正常ではスプライシングされる反復を含む、テネイシンＣ高分子スプライシングバリアントを認識することを確認した。

従って、実施例１で作製したモノクローナル抗体（１９Ｃ４ＭＳ）と実施例２で作製したモノクローナル抗体（４Ｆ１０ＴＴ）とを組合わせることにより、テネイシンＣ高分子スプライシングバリアントを測定することができると判断された。

実 施 例 ４
サンドイッチＥＬＩＳＡ系の構築：
サンドイッチＥＬＩＳＡ法の構築は以下のように作製した。実施例１で作製したテネイシンＣのフィブロネクチンIII様ドメインの選択的スプライシング部位内を認識するモノクローナル抗体（１９Ｃ４ＭＳ）の１０μｇ／ｍｌの濃度調整液を１０μｌずつ９６ｗｅｌｌＥＬＩＳＡ用プレートに加えた。４℃で一晩反応させた後、１０％ＢＳＡ／ＰＢＳ／ＮａＮ_３溶液にてブロッキングを行い、この状態をサンドイッチＥＬＩＳＡ用プレートとした。実施例２で作製したテネイシンＣの選択的スプライシング部位のＮ末端側を認識する第二のモノクローナル抗体（４Ｆ１０ＴＴ）とＨＲＰとの結合抗体を標識抗体とした。これらのサンドイッチＥＬＩＳＡ用プレートと標識抗体の組合せでサンドイッチＥＬＩＳＡ系を作製した。標準テネイシンＣは実施例２（１）で作製した精製ヒトテネイシンＣを用い、既知のタンパク質量から得られる吸光度とタンパク質濃度の標準曲線をあらかじめ求め、実際のサンプル測定で得られる吸光度よりそのタンパク質量を測定した。

実 施 例 ５
ＥＬＩＳＡ法による大腸癌患者体液中のテネイシンＣ高分子スプライシングバリア
ント量の測定：
実施例４で作製したＥＬＩＳＡ系を用いて、インフォームドコンセントを得た上で、健常者３７例および大腸癌患者１４８例（原発例１２８例および再発例２０例）について、入院時および術後経時的にＥＤＴＡ血漿を採取し、このＥＤＴＡ血漿を１０倍希釈したものを測定対象サンプルとしてテネイシンＣ高分子スプライシングバリアント濃度を測定した。血漿サンプル中のテネイシンＣ高分子量バリアント濃度はｎｇ／ｍｌ、また数値は平均±標準誤差で表した。測定の結果を表１に示す。

測定の結果、大腸癌患者の原発例および再発例中のテネイシンＣ濃度の平均は、健常者が２３.６４３±７.４９６ｎｇ／ｍｌであったのに対し、原発例が５２.６０１±３２.４３３ｎｇ／ｍｌおよび再発例が４１.０６±２２.６１１ｎｇ／ｍｌという結果となり、健常者中の濃度よりも有意に高値を認めた（統計処理はｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ−ｔｅｓｔを用いて行った）。

また、前記大腸癌患者の血漿１４８例について従来の大腸癌マーカーであるＣＥＡ濃度およびＣＡ１９−９濃度を、それぞれ三菱化学ヤトロン社製のＣＥＡ測定キットおよび東ソー株式会社製のＣＡ１９−９測定キットを用いて測定した。そして、ＣＥＡ、ＣＡ１９−９およびテネイシンＣ高分子量バリアントを大腸癌マーカーとした場合の陽性率について、平均値＋２ｘ標準偏差で導き出される値をカットオフ値として算出した。その数値を、テネイシンＣ高分子量バリアントの陽性率と比較した結果を表２に示す。

その結果、ＣＥＡおよびＣＡ１９−９を大腸癌マーカーにした場合の大腸癌患者の陽性診断効率はそれぞれ４１.２％、２４.３％であるのに対し、テネイシンＣ高分子量バリアントを大腸癌マーカーにした場合の陽性診断効率は５８.１％と、従来のマーカーを大きく上回るものであった。

また、テネイシンＣ高分子量バリアントを大腸癌マーカーとした場合の陽性サンプル、陰性サンプルそれぞれについての平均ＣＥＡ濃度および平均ＣＡ１９−９濃度を求め、両サンプル間の有意差を測定したところ有意差は見られなかった（統計処理はｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ−ｔｅｓｔを用いて行った）。その結果を表３に示す。

実 施 例 ６
ＥＬＩＳＡ法による胃癌患者体液中のテネイシンＣ高分子スプライシングバリアン
ト量の測定：
胃癌患者１０９例について入院時にＥＤＴＡ血漿を採取し、実施例５と同様にテネイシンＣ高分子スプライシングバリアント濃度を測定した。その結果、胃癌患者サンプル中のテネイシンＣ高分子スプライシングバリアントの濃度は５９.７１４±５４.２９０ｎｇ／ｍｌ（平均±標準誤差）と、健常者中の濃度２３.６４３±７.４９６ｎｇ／ｍｌよりも有意に高値であった。

実 施 例 ７
大腸癌の進行度とテネイシンＣ高分子スプライシングバリアント量の相関：
実施例５の大腸癌患者１４８例について、癌の悪性度を表すＴＮＭ分類に従って分類した母集団ごとにテネイシンＣ高分子スプライシングバリアント量の平均値を算出した。その結果を表４に示す（注：ｐ値の算出は分散分析法（ＡＮＯＶＡ）により行った）。その結果、テネイシンＣ高分子スプライシングバリアント量は癌の進行度に応じて有意に上昇することが明らかとなった。

実 施 例 ８
盲腸癌の手術的根治度とテネイシンＣ高分子スプライシングバリアント量の相関：
盲腸癌患者（５７歳、男性、ステージ３ａ）について、術前の２００５年１月２９日にＥＤＴＡ血漿をサンプリングし、実施例５の方法に従い、テネイシンＣ高分子スプライシングバリアント量、ＣＥＡ量およびＣＡ１９−９量を測定した。その後２００５年２月５日に回盲部を切除。術後の２００５年４月９日に再びＥＤＴＡ血漿を採取し、前記３種のマーカーについて濃度の測定を行った。

その結果、ＣＥＡ濃度は３.４ｎｇ／ｍｌから２.５ｎｇ／ｍｌ、ＣＡ１９−９濃度は１１.５Ｕ／ｍｌから１７.１Ｕ／ｍｌへ推移したのに対し、テネイシンＣ高分子スプライシングバリアント濃度は１０１.１７３ｎｇ／ｍｌから５０.８４５ｎｇ／ｍｌへ推移した。しかしながらこの時点でテネイシンＣ高分子スプライシングバリアント濃度については、平均値＋２ｘ標準偏差で導き出したカットオフ値（３８.６３７ｎｇ／ｍｌ）よりも上のレベルであった。そこで、当患者を再検したところ、肝臓に癌転移が認められたため、２００５年６月７日に当該箇所を切除する再手術を行った。そしてその後２００５年７月４日に再度前記３種のマーカーについて測定を行ったところ、ＣＥＡ濃度およびＣＡ１９−９濃度についてはそれぞれ、２.５ｎｇ／ｍｌ、１６Ｕ／ｍｌであったのに対し、テネイシンＣ高分子スプライシングバリアント濃度については２２.３８２ｎｇ／ｍｌとカットオフ値以下となった。この結果から、癌の手術的根治度とテネイシンＣ高分子スプライシングバリアント濃度陰転化との間に相関関係があることが明らかとなった。

本発明の癌診断剤および癌診断キットは各種癌の診断、重篤度の評価および予後の判定を診断するものとして好適に利用できる。

実施例１および実施例２で作製したモノクローナル抗体のウエスタンブロットによる反応性を示す図面である（ＣＢＢはクマシーブリリアント青染色を示し、ｈＴＮＣは精製ヒトテネイシンＣを示し、ｒＥＧＦはマウスのＥＧＦリコンビナントタンパク質を示す）。 実施例１で作製したモノクローナル抗体のウエスタンブロットによるエピトープ解析を示す図面である（６ｘＨｉｓは６ｘＨｉｓｔｉｄｉｎ部位に対する抗体を示す）。 盲腸癌の手術的根治度とテネイシンＣ高分子スプライシングバリアント量の相関を示す図面である。

Claims (16)

1. テネイシンＣ高分子スプライシングバリアントを認識する抗体を含有することを特徴とする癌診断剤。
2. テネイシンＣ 高分子スプライシングバリアントを認識する抗体が、次の抗体（ａ）または（ｂ）である請求項１に記載の癌診断剤。
   （ａ）テネイシンＣのフィブロネクチンIII様ドメインの選択的スプライシング部位内
   を認識する抗体
   （ｂ）テネイシンＣのフィブロネクチンIII様ドメインの選択的スプライシング部位よ
   りＮアミノ末端側を認識する抗体
3. 抗体（ａ）が、テネイシンＣのフィブロネクチンIII様ドメインの選択的スプライシング部位のＢＣＤドメインを認識する抗体である請求項２に記載の癌診断剤。
4. 抗体（ｂ）が、テネイシンＣの上皮成長因子様ドメインを認識する抗体である請求項２に記載の癌診断剤。
5. 診断される癌が消化器癌である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の癌診断剤。
6. 消化器癌が大腸癌または胃癌である、請求項５に記載の癌診断剤。
7. テネイシンＣのフィブロネクチンIII様ドメインの選択的スプライシング部位内を認識する第一の抗体を含む第一の試薬と、テネイシンＣのフィブロネクチンIII様ドメインの選択的スプライシング部位よりＮアミノ末端側を認識する第二の抗体を含む第二の試薬とを含有することを特徴とする癌診断用キット。
8. 第一の試薬が固相化された第一の抗体を含む試薬であり、第二の試薬が標識された第二の抗体を含む試薬である請求項７に記載の癌診断用キット。
9. 診断される癌が消化器癌である、請求項７または８に記載の癌診断用キット。
10. 消化器癌が大腸癌または胃癌である、請求項９に記載の癌診断用キット。
11. 患者の体液中のテネイシンＣ高分子スプライシングバリアント量を測定することを特徴とする癌の重篤度の評価方法。
12. 評価される癌が消化器癌である、請求項１１に記載の癌の重篤度の評価方法。
13. 消化器癌が大腸癌または胃癌である、請求項１２に記載の癌の重篤度の評価方法。
14. 患者の体液中のテネイシンＣ高分子スプライシングバリアント量を測定することを特徴とする癌の予後判定方法。
15. 判定される癌が消化器癌である、請求項１４に記載の癌の予後判定方法。
16. 消化器癌が大腸癌または胃癌である、請求項１５に記載の癌の予後判定方法。

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