JP2007091669A - Casein hydrolyzate and its production method - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、カゼイン加水分解物およびその製造方法に関する。 The present invention relates to a casein hydrolyzate and a method for producing the same.
蛋白質を加水分解して得られる、ペプチドと遊離アミノ酸との混合物は、単独の蛋白質、アミノ酸混合物などと比較して種々の優位性があるため、各方面から注目されている。
例えば、栄養学的には、ジペプチドおよびトリペプチドはアミノ酸とは別の経路により、その構成アミノ酸の混合物よりも速く吸収されること、及び蛋白質の加水分解物は、その構成アミノ酸と比較して、個々のアミノ酸の吸収量に変動がないことなどが知られている。
また、食品蛋白質は、人間にとって異種蛋白質であり、消化が不十分な状態で抗原性を有するまま体内に吸収された場合、アレルギー症状を呈することがある。この解決策の一つとして、食品中の蛋白質を酵素を用いて加水分解することによって、抗原性を低減又は消失させることが行われており、このような蛋白質加水分解物を配合した食品も増加している（下記、特許文献１、非特許文献１）。
A mixture of a peptide and a free amino acid obtained by hydrolyzing a protein has various advantages compared to a single protein, a mixture of amino acids, and the like, and has attracted attention from various fields.
For example, nutritionally, dipeptides and tripeptides are absorbed faster than their constituent amino acid mixtures by a different route than amino acids, and protein hydrolysates, compared to their constituent amino acids, It is known that there is no change in the absorption of individual amino acids.
In addition, food protein is a heterogeneous protein for humans, and if it is absorbed into the body with antigenicity in a state of insufficient digestion, it may exhibit allergic symptoms. One solution is to reduce or eliminate antigenicity by hydrolyzing proteins in foods using enzymes, and the number of foods containing such protein hydrolysates is also increasing. (Patent Document 1 and Non-Patent Document 1 below).
一方、グルタミンは腸管粘膜代謝において重要な役割を果たすことが指摘されていた。近年、手術や外傷などの侵襲時にグルタミンの需要が顕著に増加することが報告され、ここ数年、侵襲下、特に中心静脈栄養法施行時のグルタミン投与の意義が注目されてきている（下記、非特許文献２）。
また、グルタミン酸は人体が生体内で合成できるため、これまでの栄養学では非必須アミノ酸とされてきたが、代謝中間体としての重要性から言えば必須なアミノ酸のひとつと言える。すなわち、グルタミン酸は、アミノ基転移反応に必須な基質であるため他の非必須アミノ酸の合成に必須であること、体内の蛋白質と炭水化物の代謝の架け橋であること、哺乳類では酸化的脱アミノ化が多く起こる唯一のアミノ酸であること、体内のＴＣＡサイクルと尿素サイクルの架け橋であること、そしてグルタミン、オルニチン、プロリン、γ−アミノ酪酸、及びグルタチオンの前駆体であることなどから、中間代謝の中心的位置を占めているといえる。
On the other hand, it has been pointed out that glutamine plays an important role in intestinal mucosal metabolism. In recent years, it has been reported that the demand for glutamine during an invasion such as surgery or trauma significantly increases. In recent years, the significance of glutamine administration under the invasion, especially during the administration of central parenteral nutrition, has attracted attention (see below). Non-patent document 2).
In addition, glutamic acid can be synthesized in vivo by the human body, so it has been regarded as a non-essential amino acid in nutrition so far, but it can be said to be one of the essential amino acids because of its importance as a metabolic intermediate. In other words, glutamate is an essential substrate for transamination reactions, so it is essential for the synthesis of other non-essential amino acids, is a bridge between protein and carbohydrate metabolism in the body, and oxidative deamination in mammals. It is the only amino acid that occurs frequently, a bridge between the TCA cycle and the urea cycle in the body, and a precursor of glutamine, ornithine, proline, γ-aminobutyric acid, and glutathione. It can be said that it occupies a position.
近年のアミノ酸代謝に関する知見の進歩により、上記のごとくグルタミンやグルタミン酸の重要性が注目されるなか、アミノ酸の形態では熱に不安定であったり化学的修飾が必要であったりすること、また蛋白質では病態食などとしては消化吸収の負担が大きくグルタミンやグルタミン酸含量が高含量になりにくいことなどの点でペプチド態である蛋白分解物が着目されている。
カゼインを原料とした従来のカゼイン加水分解物については、例えば下記特許文献２〜５に記載されている。
Conventional casein hydrolysates using casein as a raw material are described, for example, in Patent Documents 2 to 5 below.
しかしながら、従来のカゼイン加水分解物は、後記する試験例からも明らかなとおり、グルタミンまたはグルタミン酸を豊富に含有するものではなく、グルタミンまたはグルタミン酸を豊富に含有するカゼイン加水分解物が求められている。カゼインを原料とした、グルタミンまたはグルタミン酸を豊富に含有するペプチド混合物が実現すれば、新たな栄養補給原料として産業上利用価値は高い。 However, as is apparent from the test examples described below, the conventional casein hydrolyzate does not contain abundant glutamine or glutamic acid, but a casein hydrolyzate that is rich in glutamine or glutamic acid is required. If a peptide mixture containing abundant glutamine or glutamic acid using casein as a raw material is realized, the industrial utility value is high as a new nutritional supplement.
本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであって、食品素材として広く使用可能であり、グルタミンまたはグルタミン酸を豊富に含有するカゼイン加水分解物およびその製造方法を提供することを目的とするものである。 The present invention has been made in view of the above circumstances, and is intended to provide a casein hydrolyzate that is widely usable as a food material and contains abundant glutamine or glutamic acid, and a method for producing the same. It is.
上記課題を解決すべく、本発明者らは、カゼインを原料とし、グルタミンおよびグルタミン酸を豊富に含有するペプチド混合物を製造する方法を開発することを目標として鋭意研究を積み重ねた結果、牛乳由来の蛋白質であるカゼインを原料とし、特定の酵素の組合せを用いてカゼインを加水分解し、特定の精製処理を施すことにより所期の目的を達成し得ることを見出し、本発明を完成させるに至った。 In order to solve the above-mentioned problems, the present inventors have conducted extensive research aimed at developing a method for producing a peptide mixture containing casein as a raw material and containing abundant glutamine and glutamic acid. It was found that the intended purpose can be achieved by hydrolyzing casein using a combination of specific enzymes and applying a specific purification treatment using casein as a raw material, and the present invention has been completed.
すなわち本発明は、カゼインを含有する原料溶解液を、バシラス属細菌由来のエンドプロテアーゼ及びトリプシンからなる酵素群Ａ、又はバシラス属細菌由来のエンドプロテアーゼ及びトリプシン及び乳酸菌由来のペプチダーゼからなる酵素群Ｂのいずれか一方で加水分解し、得られた加水分解液を限外濾過膜処理し、得られた膜透過画分をナノフィルトレーション膜処理し、膜非透過画分としてカゼイン加水分解物を得ることを特徴とするカゼイン加水分解物の製造方法を提供する。 That is, the present invention provides a raw material solution containing casein as an enzyme group A consisting of an endoprotease and trypsin derived from Bacillus bacteria, or an enzyme group B consisting of an endoprotease derived from Bacillus bacteria and trypsin and peptidases derived from lactic acid bacteria. Either one of them is hydrolyzed, the obtained hydrolyzate is subjected to ultrafiltration membrane treatment, and the obtained membrane permeation fraction is subjected to nanofiltration membrane treatment to obtain a casein hydrolyzate as a membrane non-permeation fraction. A method for producing a casein hydrolyzate is provided.
また、本発明は下記a）〜ｅ）の理化学的性質を有することを特徴とするカゼイン加水分解物を提供する。
ａ）カゼインの分解率が１５〜３５％であること、
ｂ）分子量１０００ダルトン以下の画分の比率が７５％以上であり、かつ分子量３５００ダルトン以上の画分の比率が１％未満であること、
ｃ）エライザ（ＥＬＩＳＡ：Ｅｎｚｙｍｅ ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏ−ｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ）抑制試験法により測定した抗原性がカゼインの抗原性の１０００分の１以下であること、
ｄ）カゼイン加水分解物に含まれる全アミノ酸の質量合計に占める遊離アミノ酸の質量合計の割合が５％未満であること、
ｅ）カゼイン加水分解物の酸加水分解物に含まれる全アミノ酸の質量合計の３５％以上がグルタミン酸として定量されること。
The present invention also provides a casein hydrolyzate characterized by having the following physicochemical properties a) to e).
a) The degradation rate of casein is 15 to 35%,
b) The ratio of the fraction having a molecular weight of 1000 daltons or less is 75% or more, and the ratio of the fraction having a molecular weight of 3500 daltons or less is less than 1%,
c) the antigenicity measured by ELISA (Enzyme linked immunosorbent assay) inhibition test method is less than 1/1000 of the antigenicity of casein;
d) The ratio of the total mass of free amino acids to the total mass of all amino acids contained in the casein hydrolyzate is less than 5%,
e) 35% or more of the total mass of all amino acids contained in the acid hydrolyzate of casein hydrolyzate is quantified as glutamic acid.
本発明によれば、牛乳蛋白質であるカゼインを原料とし、低分子量で消化吸収性に優れ、抗原性が低く、遊離アミノ酸含量が低く、酸加水分解により定量されるグルタミン酸含量が高く、したがってグルタミン酸及びグルタミンの供給源として食品素材に好適に利用できる新規なカゼイン加水分解物及びその製造方法が得られる。 According to the present invention, casein, which is a milk protein, is used as a raw material, has low molecular weight, excellent digestibility and absorption, low antigenicity, low free amino acid content, and high glutamic acid content determined by acid hydrolysis. Therefore, glutamic acid and As a glutamine supply source, a novel casein hydrolyzate that can be suitably used for food materials and a method for producing the same are obtained.
まず、本発明のカゼイン加水分解物の製造方法（以下、本発明の方法と略記する。）について説明する。
本発明の方法に使用するカゼインは、牛乳由来の蛋白質であるカゼインを主成分とするものであれば、如何なるものでも使用することができる。具体的には、市販の各種カゼイン、カゼイネート、例えば、乳酸カゼイン、硫酸カゼイン、塩酸カゼイン、ナトリウムカゼイネート、カリウムカゼイネート、カルシウムカゼイネート、マグネシウムカゼイネート又はこれらの任意の混合物等が望ましい。また、牛乳、脱脂乳、全脂粉乳、脱脂粉乳から常法により精製して得られるカゼインも原料として使用できる。
First, a method for producing a casein hydrolyzate of the present invention (hereinafter abbreviated as the method of the present invention) will be described.
As the casein used in the method of the present invention, any casein can be used as long as it contains casein, which is a protein derived from milk. Specifically, various commercially available caseins and caseinates such as lactate casein, sulfate casein, hydrochloride casein, sodium caseinate, potassium caseinate, calcium caseinate, magnesium caseinate, or any mixture thereof are desirable. Casein obtained by refining milk, skim milk, whole milk powder, or skim milk by a conventional method can also be used as a raw material.
カゼイン加水分解物を製造するには、まず、上記カゼインを水に分散し溶解して原料溶解液を得る。該原料溶解液の濃度は格別の制限はないが、通常、蛋白質換算で５〜１５質量％前後の濃度範囲が効率性及び操作性の点から望ましい。
該原料溶解液のｐＨを、後工程で使用する蛋白質分解酵素の至適ｐＨ付近に調整することが好ましい。具体的には、酵素群Ａ、Ｂのいずれを用いる場合にも原料溶解液のｐＨを７〜１０に調整することが好ましい。
原料溶解液のｐＨ調整はアルカリ溶液を用いて行うことが望ましい。ｐＨ調整に用いるアルカリ剤としては、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、炭酸カリウム等が例示される。これらは１種単独で用いてもよく、２種以上を併用してもよい。
In order to produce a casein hydrolyzate, first, the above casein is dispersed and dissolved in water to obtain a raw material solution. The concentration of the raw material solution is not particularly limited, but usually a concentration range of about 5 to 15% by mass in terms of protein is desirable from the viewpoint of efficiency and operability.
It is preferable to adjust the pH of the raw material solution near the optimum pH of the proteolytic enzyme used in the subsequent step. Specifically, it is preferable to adjust the pH of the raw material solution to 7 to 10 when either enzyme group A or B is used.
It is desirable to adjust the pH of the raw material solution using an alkaline solution. Examples of the alkali agent used for pH adjustment include sodium hydroxide, potassium hydroxide, potassium carbonate and the like. These may be used alone or in combination of two or more.
次に、前記原料溶解液に蛋白質分解酵素を添加して、酵素反応によりカゼインの加水分解を行って、加水分解液を得る。
蛋白質分解酵素としては、バシラス属細菌由来のエンドプロテアーゼ及びトリプシンからなる酵素群Ａ、又はバシラス属細菌由来のエンドプロテアーゼ及びトリプシン及び乳酸菌由来のペプチダーゼからなる酵素群Ｂのいずれか一方の酵素群を用いる。
本発明において、蛋白質分解酵素として上記酵素群ＡまたはＢを用いることが、グルタミンまたはグルタミン酸を豊富に含有するペプチド混合物を得ることに寄与していると推定される。またＮ末端に存在していないペプチド態のグルタミンを豊富に含有するペプチド混合物を得ることに寄与していると推定される。また、好ましい分子量分布を達成し、抗原性を好ましく低下できることに寄与していると推定される。
特に酵素群Ｂは、より良好な風味が得られる点で好ましい。これは、カゼインの加水分解により生じる苦味ペプチドの末端の疎水性アミノ酸が乳酸菌由来のペプチダーゼによって切り離されることで、該苦味ペプチドによる苦味が低減されるためと推定される。
Next, a proteolytic enzyme is added to the raw material solution, and casein is hydrolyzed by an enzymatic reaction to obtain a hydrolyzed solution.
As the proteolytic enzyme, one of the enzyme group A consisting of an endoprotease derived from Bacillus bacteria and trypsin, or an enzyme group B consisting of endoprotease derived from Bacillus bacteria and trypsin and peptidases derived from lactic acid bacteria is used. .
In the present invention, the use of the enzyme group A or B as a proteolytic enzyme is presumed to contribute to obtaining a peptide mixture containing abundant glutamine or glutamic acid. It is also presumed that this contributes to obtaining a peptide mixture containing abundant peptide glutamine not present at the N-terminus. Moreover, it is estimated that it contributes to achieving a preferable molecular weight distribution and preferably reducing antigenicity.
In particular, the enzyme group B is preferable in that a better flavor can be obtained. This is presumed to be because the bitter taste caused by the bitter taste peptide is reduced by cleaving the hydrophobic amino acid at the end of the bitter taste peptide generated by hydrolysis of casein by a peptidase derived from lactic acid bacteria.
本発明で用いられるバシラス属細菌由来のエンドプロテアーゼ及びトリプシンは、例えば市販品を使用できる。
具体的には、バシラス属細菌由来のエンドプロテアーゼは、アルカラーゼ、ニュートラーゼ（以上、ノボザイムズ社製）、プロチンＡ、プロチンＰ（以上、大和化成社製）、プロレザー、プロテアーゼＮ（以上、天野エンザイム社製）、コロラーゼ７０８９（樋口商会社製）、ビオオプラーゼ（ナガセケムテック社製）、オリエンターゼ９０Ｎ、オリエンターゼ２２ＢＦ（以上、エイチビイアイ社製）等を例示することができる。これらのバシラス属由来のエンドプロテアーゼは単独または２種類以上を組み合わせて使用することができる。
トリプシンは、ＰＴＮ（ノボザイムズ社製）、トリプシンＶ（日本バイオコン社製）等を例示することができる。これらのトリプシンは単独または２種類以上を組み合わせて使用することができる。
As the endoprotease and trypsin derived from Bacillus bacteria used in the present invention, for example, commercially available products can be used.
Specifically, endoproteases derived from Bacillus bacteria include Alcalase, Neutase (above, Novozymes), Protin A, Protin P (above, Daiwa Kasei), Pro Leather, Protease N (above, Amano Enzyme) COLORASE 7089 (manufactured by Higuchi Trading Company), biooplase (manufactured by Nagase Chemtech Co., Ltd.), orientase 90N, orientase 22BF (manufactured by HIBI) and the like. These Bacillus-derived endoproteases can be used alone or in combination of two or more.
Examples of trypsin include PTN (manufactured by Novozymes), trypsin V (manufactured by Nippon Biocon), and the like. These trypsin can be used individually or in combination of 2 or more types.
本発明で用いられる乳酸菌由来のペプチダーゼは、例えば特公昭５４−３６２３５号公報第６欄４行「（３）使用する酵素について」の項に記載の方法により次のとおり製造することができる。
乳酸菌（ビフィズス菌を含む）を公知の方法（例えば特公昭４８−４３８７８号公報記載の方法）により培養し、得られた培養液を遠心分離して乳酸菌菌体を回収し、滅菌水に菌体を懸濁し、遠心分離して乳酸菌菌体を回収する操作を２回繰り返し、菌体を洗浄し、２０質量％の濃度で菌体を滅菌水に懸濁し、菌体破砕機[例えば、ダイノミル（Ｗｉｌｌｙ Ｂａｃｈｎｆｅｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）社製。ＫＤＬ型]により菌体を破砕し、凍結乾燥し、乳酸菌由来のペプチダーゼ粉末を得る。
乳酸菌としては、ビフィドバクテリウム属の乳酸菌であるビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍ）、ビフィドバクテリウム・インファンチス（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｎｆａｎｔｉｓ）、ビフィドバクテリウム・ブレーベ（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｒｅｖｅ）など、ラクトバシラス属の乳酸菌であるラクトバチルス・ヘルベチクス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ）、ラクトバチルス・カゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｓｅｉ）、ラクトバチルス・ブルガリクス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ）、ラクトバチルス・アシドフィルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）など、ストレプトコッカス属の乳酸菌であるストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｌｕｓ）などが例示される。
これらの乳酸菌由来のペプチダーゼは単独または２種類以上を組み合わせて使用することができる。
乳酸菌由来のペプチダーゼを使用する際は、ペプチダーゼ粉末を４〜１０℃の冷水に分散して溶解した溶解液の形態で使用することが好ましい。該溶解液の濃度は格別の制限はないが、通常３〜１０質量％程度の酵素濃度として使用することが効率性及び操作性の点から望ましい。
The peptidase derived from lactic acid bacteria used in the present invention can be produced, for example, as follows by the method described in Japanese Patent Publication No. 54-36235, column 6, line 4, “(3) About enzyme to be used”.
Lactic acid bacteria (including bifidobacteria) are cultured by a known method (for example, the method described in Japanese Patent Publication No. 48-43878), and the obtained culture solution is centrifuged to collect the lactic acid bacteria cells, which are sterilized in sterile water. Is suspended twice, and the operation of collecting the lactic acid bacteria by centrifugation is repeated twice, the cells are washed, and the cells are suspended in sterilized water at a concentration of 20% by mass. Manufactured by Willy Bachfen Engineering). KDL cells are crushed and freeze-dried to obtain peptidase powder derived from lactic acid bacteria.
Examples of the lactic acid bacteria include Bifidobacterium longum, Bifidobacterium infantis, Bifidobacterium breve, and Bifidobacterium breve, which are lactic acid bacteria belonging to the genus Bifidobacterium. Lactobacillus helveticus, Lactobacillus casei, Lactobacillus bulgaricus, Lactobacillus bulcicus, and Lactobacillus acidophilus Examples thereof include Streptococcus thermophilus which is a lactic acid bacterium.
These peptidases derived from lactic acid bacteria can be used alone or in combination of two or more.
When using a peptidase derived from lactic acid bacteria, it is preferable to use it in the form of a solution obtained by dispersing peptidase powder in cold water at 4 to 10 ° C. The concentration of the lysate is not particularly limited, but it is usually desirable to use it as an enzyme concentration of about 3 to 10% by mass from the viewpoint of efficiency and operability.
蛋白質分解酵素の使用量は、基質濃度、酵素力価、反応温度、及び反応時間により異なる。
酵素群Ａを用いる場合、バシラス属由来のエンドプロテアーゼは、原料溶解液中の蛋白質１ｇ当たり１０００〜２００００活性単位の割合で用いることが好ましく、トリプシンは、原料溶解液中の蛋白質１ｇ当たり１０００〜２００００活性単位の割合で用いることが好ましい。
バシラス属由来のエンドプロテアーゼおよびトリプシンの各使用量が上記範囲の下限値未満であると十分な分解が行われないおそれがあり、上記範囲の上限値を超えると分解が進みすぎて、Ｎ末端にグルタミンが存在していないペプチドが減少するおそれがある。
酵素群Ａを用いる場合のバシラス属由来のエンドプロテアーゼの使用量のより好ましい範囲は３０００〜１００００活性単位であり、トリプシンの使用量のより好ましい範囲は５０００〜１２０００活性単位である。
The amount of proteolytic enzyme used varies depending on the substrate concentration, enzyme titer, reaction temperature, and reaction time.
When the enzyme group A is used, the endoprotease derived from the genus Bacillus is preferably used at a rate of 1000-20000 active units per gram of protein in the raw material solution, and trypsin is used at 1000-20000 per gram of protein in the raw material solution. It is preferable to use at a ratio of active units.
If the amount of each of the Bacillus genus endoprotease and trypsin used is less than the lower limit of the above range, sufficient decomposition may not be performed. Peptides in which glutamine is not present may be reduced.
The more preferable range of the amount of Bacillus-derived endoprotease used in the enzyme group A is 3000 to 10000 active units, and the more preferable range of the amount of trypsin used is 5000 to 12000 active units.
酵素群Ｂを用いる場合、バシラス属由来のエンドプロテアーゼは、原料溶解液中の蛋白質１ｇ当たり１０００〜２００００活性単位の割合で用いることが好ましい。トリプシンは、原料溶解液中の蛋白質１ｇ当たり１０００〜２００００活性単位の割合で用いることが好ましい。乳酸菌由来のペプチダーゼは、原料溶解液中の蛋白質１ｇ当たり２０〜２０００活性単位の割合で用いることが好ましい。
バシラス属由来のエンドプロテアーゼおよびトリプシンの各使用量が上記範囲の下限値未満であると十分な分解が行われないおそれがあり、上記範囲の上限値を超えると分解が進みすぎて、Ｎ末端にグルタミンが存在していないペプチドが減少するおそれがある。
乳酸菌由来のペプチダーゼの使用量が上記範囲の下限値未満であると、期待される風味改善効果が十分に得られないおそれがあり、上記範囲の上限値を超えると分解が進みすぎて、Ｎ末端にグルタミンが存在していないペプチドが減少するおそれがあるほか、遊離アミノ酸が増大して、精製工程における目的成分の回収率の低下をまねくおそれがある。
酵素群Ｂを用いる場合のバシラス属由来のエンドプロテアーゼの使用量のより好ましい範囲は１５００〜８０００活性単位であり、トリプシンの使用量のより好ましい範囲は１５００〜１００００活性単位であり、乳酸菌由来のペプチダーゼの使用量のより好ましい範囲は２００〜１０００活性単位である。
When the enzyme group B is used, it is preferable to use the Bacillus-derived endoprotease at a rate of 1000 to 20000 active units per gram of protein in the raw material solution. Trypsin is preferably used at a rate of 1000 to 20000 active units per gram of protein in the raw solution. The peptidase derived from lactic acid bacteria is preferably used at a rate of 20 to 2000 active units per gram of protein in the raw material solution.
If the amount of each of the Bacillus genus endoprotease and trypsin used is less than the lower limit of the above range, sufficient decomposition may not be performed. Peptides in which glutamine is not present may be reduced.
If the amount of peptidase derived from lactic acid bacteria is less than the lower limit of the above range, the expected flavor improving effect may not be sufficiently obtained. There is a risk that peptides that do not contain glutamine may decrease, and free amino acids may increase, leading to a decrease in the recovery rate of the target component in the purification process.
A more preferable range of the amount of Bacillus-derived endoprotease used in the enzyme group B is 1500 to 8000 active units, and a more preferable range of the amount of trypsin used is 1500 to 10000 active units. A more preferable range of the amount used is 200 to 1000 active units.
前記活性単位は、次のとおりである。
エンドプロテアーゼおよびトリプシンの活性単位は、カゼイン（［ハマーシュタイン］メルク社製）にエンドプロテアーゼおよびトリプシンをそれぞれ作用させ、３０℃で１分間に１μｇのチロシンに相当するアリルアミノ酸のフォリン試薬での呈色反応を示す酵素活性が１活性単位である。
The active unit is as follows.
The endoprotease and trypsin activity units are casein (produced by [Hammerstein] Merck), which is reacted with endoprotease and trypsin, respectively, and coloring with an allyl amino acid corresponding to 1 μg of tyrosine per minute at 30 ° C. The enzyme activity indicating the reaction is one activity unit.
ペプチダーゼの活性単位は、次の方法により測定される。まずペプチダーゼ粉末を０．２ｇ／１００ｍｌの割合で０．１モルのリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に分散又は溶解し酵素溶液とする。一方、ロイシルパラニトロアニリド（国産化学社製。以下Ｌｅｕ−ｐＮＡと記載する）を０．１モルのリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解して２ｍＭの基質溶液を調製する。前記酵素溶液１ｍｌに基質溶液１ｍｌを加え３７℃で５分間反応させた後、濃度３０質量％の酢酸溶液２ｍｌを加えて反応を停止させる。反応液をメンブランフィルターで濾過し、波長４１０ｎｍで濾液の吸光度を測定する。ペプチダーゼの活性単位は、１分間に１μｍｏｌのＬｅｕ−ｐＮＡを分解するのに必要な酵素量が１活性単位であり、次式により算出する。
活性単位（ペプチダーゼ粉末１ｇ当たり）＝２０×（Ａ／Ｂ）
（ただし、前記の式においてＡ及びＢは、それぞれ波長４１０ｎｍにおける試料の吸光度及び０．２５ｍＭパラニトロアニリン（水溶液）の吸光度である）
The activity unit of peptidase is measured by the following method. First, peptidase powder is dispersed or dissolved in 0.1 molar phosphate buffer (pH 7.0) at a rate of 0.2 g / 100 ml to obtain an enzyme solution. On the other hand, leucylparanitroanilide (manufactured by Kokusan Kagaku Co., Ltd., hereinafter referred to as Leu-pNA) is dissolved in 0.1 molar phosphate buffer (pH 7.0) to prepare a 2 mM substrate solution. After 1 ml of the substrate solution is added to 1 ml of the enzyme solution and reacted at 37 ° C. for 5 minutes, 2 ml of acetic acid solution having a concentration of 30% by mass is added to stop the reaction. The reaction solution is filtered through a membrane filter, and the absorbance of the filtrate is measured at a wavelength of 410 nm. The activity unit of peptidase is the amount of enzyme required to degrade 1 μmol of Leu-pNA per minute, and is calculated by the following formula.
Activity unit (per 1 g of peptidase powder) = 20 × (A / B)
(In the above formula, A and B are the absorbance of the sample and the absorbance of 0.25 mM paranitroaniline (aqueous solution) at a wavelength of 410 nm, respectively)
酵素の添加に当っては、１種類ずつ水に溶解し、添加することが望ましいが、添加の順番には特に制限はない。
酵素反応の温度は格別の制限はなく、酵素作用が発現する最適温度範囲を含む実用に供され得る範囲から選ばれる。通常、３０〜６０℃の範囲から選ばれる。
酵素反応の停止は、加水分解液中の酵素の失活により行われる。例えば、常法による加熱失活処理により実施することができる。
加水分解の程度は、反応温度、初発ｐＨ、酵素添加量等の反応条件によって進行状態が異なり、酵素反応の反応継続時間を一定とすると製造バッチ毎に異なる理化学的性質を有する加水分解物が生じる可能性があるため、一概に決定することは難しい。従って、酵素反応をモニターして、酵素反応の継続時間を決定することが好ましい。好ましくは、原料溶解液中のカゼインの分解率が１５〜３５％の範囲となるように、反応温度、反応時間、酵素添加量等の反応条件を設定する。該カゼインの分解率が１５％より小さいと分解が不十分となるおそれがある。分解が不十分であると、後の精製工程における目的成分の回収率が低下する、抗原性が十分に低減されない、分子量分布において高分子量部分が多く残存してしまう等の不都合が生じる。また、３５％を超えるとＮ末端にグルタミンが位置する可能性が高くなる。より好ましい範囲は２０〜３０％である。
加熱失活処理の加熱反応時間と温度は、使用した酵素の熱安定性を考慮し、十分に失活できる条件を適宜設定する。例えば、８０〜１３０℃の温度範囲で３０分間〜２秒間の保持時間で行うことができる。
When adding enzymes, it is desirable to dissolve them in water one by one and add them, but the order of addition is not particularly limited.
The temperature of the enzyme reaction is not particularly limited, and is selected from a range that can be put to practical use, including the optimum temperature range in which the enzyme action is manifested. Usually, it is chosen from the range of 30-60 degreeC.
The enzyme reaction is stopped by deactivation of the enzyme in the hydrolyzed solution. For example, it can be carried out by heat deactivation treatment by a conventional method.
The degree of hydrolysis varies depending on the reaction conditions such as reaction temperature, initial pH, and amount of enzyme added. If the reaction duration of the enzyme reaction is constant, hydrolysates with different physicochemical properties are produced for each production batch. Because there is a possibility, it is difficult to make a general decision. Therefore, it is preferable to monitor the enzyme reaction to determine the duration of the enzyme reaction. Preferably, reaction conditions such as reaction temperature, reaction time, and enzyme addition amount are set so that the decomposition rate of casein in the raw material solution is in the range of 15 to 35%. If the casein decomposition rate is less than 15%, the decomposition may be insufficient. If the decomposition is insufficient, the recovery rate of the target component in the subsequent purification step is lowered, the antigenicity is not sufficiently reduced, and many high molecular weight portions remain in the molecular weight distribution. On the other hand, if it exceeds 35%, there is a high possibility that glutamine is located at the N-terminus. A more preferable range is 20 to 30%.
The heating reaction time and temperature of the heat deactivation treatment are appropriately set under conditions that allow for sufficient deactivation in consideration of the thermal stability of the enzyme used. For example, it can be performed in a temperature range of 80 to 130 ° C. with a holding time of 30 minutes to 2 seconds.
次いで、加熱失活処理された加水分解液を限外濾過膜処理し、膜透過画分として、目的とするカゼイン加水分解物を含む溶液を得る。
限外濾過膜は、公知の装置を用いて行うことができる。
限外濾過膜による精製を行うことにより、加水分解によって生じた粘度の高い不溶物や沈殿などを、ナノフィルトレーション膜を用いた処理工程の前に除去できる。このことは、孔径が小さいナノフィルトレーション膜の目詰まりを防止しするうえで好ましい。また、得ようとするペプチド以外の未分解蛋白成分などが混在するのを防止して、良好な理化学的性質を有するカゼイン加水分解物を効率良く得るうえでも好ましい。
Subsequently, the hydrolyzed solution that has been heat-inactivated is subjected to ultrafiltration membrane treatment to obtain a solution containing the desired casein hydrolyzate as a membrane permeation fraction.
The ultrafiltration membrane can be performed using a known apparatus.
By performing purification with an ultrafiltration membrane, highly viscous insoluble matters and precipitates generated by hydrolysis can be removed before the treatment step using the nanofiltration membrane. This is preferable for preventing clogging of the nanofiltration membrane having a small pore diameter. Further, it is also preferable for efficiently obtaining a casein hydrolyzate having good physicochemical properties by preventing the mixture of undegraded protein components other than the peptide to be obtained.
限外濾過膜の分画分子量は３０００以上１００００以下の範囲が好ましい。限外濾過膜の分画分子量が１００００より大きいと、特に分解率が上記好ましい範囲の下限値である１５質量％付近において、分子量１０００を超えるペプチドが膜を透過してしまい、最終的に得られるカゼイン加水分解物における分子量１０００以下の画分の収率が低下してしまう。
一方、限外濾過膜の分画分子量が３０００より小さいと、膜を透過することが可能な成分がジ−、トリ−ペプチドのほかに、遊離アミノ酸、ミネラルが主体となり、その結果最終的に得られるカゼイン加水分解物におけるペプチド成分の収率が低下してしまう。
具体的には、限外濾過モジュールＳＥＰ１０５３（旭化成社製、分画分子量３，０００）、ＳＩＰ１０５３（旭化成社製、分画分子量６，０００）、ＳＬＰ１０５３（旭化成社製、分画分子量１０，０００）等を用いることができる。
The molecular weight cutoff of the ultrafiltration membrane is preferably in the range of 3000 to 10,000. When the molecular weight cut-off of the ultrafiltration membrane is larger than 10,000, a peptide having a molecular weight of 1000 permeates the membrane and is finally obtained particularly when the decomposition rate is around 15% by mass, which is the lower limit of the above preferred range. The yield of the fraction having a molecular weight of 1000 or less in the casein hydrolyzate is lowered.
On the other hand, when the molecular weight cut-off of the ultrafiltration membrane is less than 3000, the components that can permeate the membrane are mainly diamino and tri-peptides, and free amino acids and minerals. The yield of the peptide component in the casein hydrolyzate to be obtained is lowered.
Specifically, ultrafiltration module SEP1053 (Asahi Kasei Co., Ltd., molecular weight cut-off 3,000), SIP 1053 (Asahi Kasei Co., Ltd., molecular weight cut-off 6,000), SLP1053 (Asahi Kasei Co., Ltd., molecular weight cut-off 10,000) Etc. can be used.
次いで、上記限外濾過膜処理の膜透過画分をナノフィルトレーション膜処理し、膜非透過画分として目的とするカゼイン加水分解物を含む溶液を得る。
ナノフィルトレーション膜は、公知の装置を用いることができる。
ペプチド成分を膜内に保持しながら遊離アミノ酸及びミネラルを膜外へ排出するために、ナノフィルトレーション膜は食塩阻止率が１０％以上５０％以下であることが好ましい。該食塩阻止率の値が大きいほど膜内に保持される食塩（指標物質）が多い、すなわち膜孔径が小さくなり膜内に保持される物質量が多くなる。
Next, the membrane permeation fraction of the ultrafiltration membrane treatment is subjected to nanofiltration membrane treatment to obtain a solution containing the desired casein hydrolyzate as a membrane non-permeation fraction.
A known apparatus can be used for the nanofiltration film.
In order to discharge free amino acids and minerals outside the membrane while retaining the peptide component in the membrane, the nanofiltration membrane preferably has a salt rejection of 10% or more and 50% or less. The larger the value of the salt rejection, the more salt (indicator substance) is retained in the membrane, that is, the membrane pore size is reduced and the amount of material retained in the membrane is increased.
食塩阻止率が１０％より低い場合には限外濾過膜の孔径に近づいてしまい、目的のペプチド成分が膜内に保持されなくなってしまう。また食塩阻止率が５０％を超える場合には水のみが透過可能なＲＯ（Reverse Osmosis逆浸透）膜に近づいてしまい、ナノフィルトレーション精製によって期待される遊離アミノ酸やミネラルなどペプチド以外の成分の膜外への排除が不十分となり、目的のグルタミン及びグルタミン酸含量が得られないという結果を招く恐れが生じる。 When the salt rejection is lower than 10%, the pore diameter of the ultrafiltration membrane is approached, and the target peptide component is not retained in the membrane. In addition, when the salt rejection exceeds 50%, it approaches a RO (Reverse Osmosis) membrane that allows only water to pass through, and free amino acids, minerals, and other components other than peptides expected by nanofiltration purification. Exclusion to the outside of the membrane becomes insufficient, and there is a possibility that the target glutamine and glutamic acid contents cannot be obtained.
また、上記ナノフィルトレーション膜処理において、荷電したナノフィルトレーション膜を用いることが好ましい。
荷電したナノフィルトレーション膜を用いることにより、遊離アミノ酸の膜外への排出を電気的に促進することができる。その結果、最終的に得られるカゼイン加水分解物中における、Ｎ末端に存在していないペプチド態のグルタミンの含有率を増大させることができる。
荷電したナノフィルトレーション膜として、具体的には、ＮＴＲ−７４１０（食塩阻止率１０％、日東電工社製）、ＮＴＲ−７４５０（食塩阻止率５０％、日東電工社製）等を用いることができる。
In the nanofiltration film treatment, a charged nanofiltration film is preferably used.
By using a charged nanofiltration membrane, the discharge of free amino acids out of the membrane can be promoted electrically. As a result, it is possible to increase the content of peptide glutamine not present at the N-terminus in the finally obtained casein hydrolyzate.
Specifically, NTR-7410 (10% salt rejection, Nitto Denko), NTR-7450 (50% salt rejection, Nitto Denko) and the like are used as the charged nanofiltration membrane. it can.
さらに、前記荷電したナノフィルトレーション膜を用いる場合、ナノフィルトレーション膜処理の前に、上記限外濾過膜処理の膜透過画分に酸を添加することによってｐＨ４以下に調整することが好ましい。
前記荷電したナノフィルトレーション膜の荷電は、例えばＳＯ３ −などによるマイナスチャージであり、酸を添加すると遊離アミノ酸のアミノ基がプラスチャージを帯びるため、荷電したナノフィルトレーション膜からより排出され易くなり、相対的にペプチド成分の膜内残存割合がより上昇する。
これによって、たとえばＮ末端に存在していないペプチド態のグルタミン含有率を、該処理を行わない場合に比べて約１．０５〜１．２０倍に増大させることができる。
荷電ナノフィルトレーション膜を用いる場合の、被処理液のｐＨは、余分な酸添加を避け、後工程で中和を行う場合の効率も考慮すると、ｐＨ２〜４が好ましく、ｐＨ４が最も好ましい。
Furthermore, when using the charged nanofiltration membrane, it is preferable to adjust the pH to 4 or less by adding an acid to the membrane permeation fraction of the ultrafiltration membrane treatment before the nanofiltration membrane treatment. .
Charge of the charged nanofiltration membrane, for example, SO 3 - is a negative charge due to the amino group of the free amino acids upon addition of acid for carry a positive charge, the more discharged from the charged nanofiltration membrane It becomes easy and the ratio of the peptide component remaining in the film is relatively increased.
Thereby, for example, the glutamine content of a peptide that is not present at the N-terminus can be increased by about 1.05-1.20 times compared to the case where the treatment is not performed.
In the case of using a charged nanofiltration membrane, the pH of the liquid to be treated is preferably pH 2 to 4 and most preferably pH 4 in consideration of the efficiency when neutralization is performed in a subsequent step while avoiding excessive acid addition.
上記ナノフィルトレーション膜処理の膜非透過画分として得られる、カゼイン加水分解物を含有する溶液（以下、カゼイン加水分解物溶液ということもある）は、そのまま使用することもでき、また、必要に応じて濃縮して濃縮液として使用することもでき、更に、この濃縮液を乾燥し、粉末として使用することもできる。 The solution containing casein hydrolyzate obtained as a membrane-impermeable fraction of the nanofiltration membrane treatment (hereinafter also referred to as casein hydrolyzate solution) can be used as it is, and is also necessary. Depending on the concentration, it can be used as a concentrated liquid, and the concentrated liquid can be dried and used as a powder.
本発明の方法によれば、下記ａ）〜ｅ）の理化学的性質を有するカゼイン加水分解物、より好ましくは、さらに下記ｆ）および／またはｇ）の理化学的性質を有するカゼイン加水分解物が得られる。
ａ）カゼインの分解率が１５〜３５％である。
本発明におけるカゼインの分解率は後述の「分解率の測定方法」方法で求められる。
According to the method of the present invention, a casein hydrolyzate having the following physicochemical properties a) to e), more preferably a casein hydrolyzate having the following physicochemical properties f) and / or g) is obtained. It is done.
a) The degradation rate of casein is 15 to 35%.
The degradation rate of casein in the present invention is determined by the “decomposition rate measurement method” method described later.
ｂ）分子量１０００ダルトン以下の画分の比率が７５％以上であり、かつ分子量３５００ダルトン以上の画分の比率が１％未満である。これらの比率は、カゼイン加水分解物の分子量分布を後述の「分子量分布の測定方法」で測定することによって求められる。
ｃ）エライザ（ＥＬＩＳＡ：Ｅｎｚｙｍｅ ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏ−ｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ）抑制試験法により測定した抗原性がカゼインの抗原性の１０００分の１以下である。カゼイン加水分解物の抗原性およびカゼインの抗原性は、具体的には、後述の「抗原性の測定方法」で求められる。
b) The ratio of the fraction having a molecular weight of 1000 daltons or less is 75% or more, and the ratio of the fraction having a molecular weight of 3500 daltons or less is less than 1%. These ratios are obtained by measuring the molecular weight distribution of the casein hydrolyzate by the “molecular weight distribution measuring method” described later.
c) Antigenicity measured by ELISA (Enzyme linked immunosorbent assay) inhibition test method is less than 1/1000 of antigenicity of casein. Specifically, the antigenicity of casein hydrolyzate and the antigenicity of casein are determined by the “antigenicity measurement method” described later.
ｄ）カゼイン加水分解物に含まれる全アミノ酸の質量合計に占める遊離アミノ酸の質量合計の割合（以下、アミノ酸遊離率ということもある。）が５％未満である。この割合は、後述の「遊離アミノ酸組成の測定方法」で求められる。
ｅ）カゼイン加水分解物の酸加水分解物に含まれる全アミノ酸の質量合計の３５％以上がグルタミン酸として定量される。この値は、後述の「アミノ酸組成の測定方法」により求められる。
本発明における「カゼイン加水分解物の酸加水分解物に含まれるグルタミン酸として定量される値」とは、カゼイン加水分解物に含まれているグルタミン及びグルタミン酸の合計を意味する。
d) The ratio of the total mass of free amino acids to the total mass of all amino acids contained in the casein hydrolyzate (hereinafter sometimes referred to as amino acid release rate) is less than 5%. This ratio is calculated | required by the "measurement method of a free amino acid composition" mentioned later.
e) 35% or more of the total mass of all amino acids contained in the acid hydrolyzate of casein hydrolyzate is quantified as glutamic acid. This value is determined by the “method for measuring amino acid composition” described later.
The “value determined as glutamic acid contained in the acid hydrolyzate of casein hydrolyzate” in the present invention means the total of glutamine and glutamic acid contained in the casein hydrolyzate.
ｆ）遊離グルタミン酸及び遊離グルタミンが共に２ｍｇ／ｇ未満である。この遊離グルタミン酸の含量および遊離グルタミンの含量は、後述の「遊離アミノ酸組成の測定方法」で測定できる。
ｇ）Ｎ末端に存在していないペプチド態のグルタミンが６５ｍｇ／ｇ以上である。このペプチド態のグルタミン含量は、後述の「Ｎ末端に存在していないペプチド態のグルタミンの測定方法」により求められる。特に、Ｎ末端に存在していないペプチド態のグルタミンの含量が多いカゼイン加水分解物は、例えば食品製造工程中の加熱工程等において、Ｎ末端にグルタミンを有するペプチドに由来する、消化不可能なピログルタミンの生成が抑えられる点で有利である。
f) Both free glutamic acid and free glutamine are less than 2 mg / g. The content of free glutamic acid and the content of free glutamine can be measured by the “method for measuring free amino acid composition” described later.
g) Peptide glutamine not present at the N-terminus is 65 mg / g or more. The glutamine content of this peptide form is determined by the following “Method for measuring peptide form glutamine not present at the N-terminus”. In particular, a casein hydrolyzate having a high content of peptide glutamine not present at the N-terminus is a non-digestible pyrolase derived from a peptide having glutamine at the N-terminus, for example, in a heating step during food production. This is advantageous in that the production of glutamine is suppressed.
本発明のカゼイン加水分解物は、本発明の方法により製造することができる。
上記の理化学的性質を有する本発明のカゼイン加水分解物は、低分子量で抗原性が低減されており、遊離アミノ酸が少ないペプチド混合物であり、グルタミン、グルタミン酸を豊富に含有するという良好な性質を有する。かかる性質を有するカゼイン加水分解物は、流動食、医療食、栄養補給食などに好適に利用できる。
The casein hydrolyzate of the present invention can be produced by the method of the present invention.
The casein hydrolyzate of the present invention having the above physicochemical properties is a peptide mixture having a low molecular weight, reduced antigenicity, low free amino acids, and rich in glutamine and glutamic acid. . Casein hydrolyzate having such properties can be suitably used for liquid foods, medical foods, nutritional supplements and the like.
以下試験例を示して本発明を詳細に説明する。尚、本発明においては、次の試験方法を採用した。 Hereinafter, the present invention will be described in detail with reference to test examples. In the present invention, the following test method was adopted.
（１）分解率の測定方法
分解率（％）は、原料蛋白質溶液の全窒素量当たりの、カゼイン加水分解物溶液のホルモル態窒素量の百分率（質量基準）であり、次の方法により求めた。なお、ここでの原料蛋白質溶液には、原料として用いたカゼイン（未分解のカゼイン）以外の蛋白質は含まれないものとする。
まずカゼイン加水分解物溶液４ｍｌと蒸留水３０ｍｌを混合し、０．２Ｎ水酸化ナトリウム溶液又は塩酸溶液でｐＨを６．８に調整する。この溶液に、０．２Ｎ水酸化ナトリウム溶液でｐＨを８．０に調整したホルマリン溶液５ｍｌを添加した後、０．１Ｎ水酸化ナトリウム溶液でｐＨが７．９に達するまで滴定する。
この時の０．１Ｎ水酸化ナトリウム溶液の滴定量をＡｍｌ、用いた０．１Ｎ水酸化ナトリウム溶液のファクターをＦ、原料蛋白質溶液の蛋白濃度をＢ（％）（質量基準）として、分解率を次式から算出する。
分解率（％）＝２２．３×Ａ×Ｆ／Ｂ
(1) Method for Measuring Degradation Rate Degradation rate (%) is the percentage (mass basis) of the amount of formal nitrogen in the casein hydrolyzate solution per total nitrogen amount in the raw protein solution, and was determined by the following method. . The raw protein solution here does not contain any protein other than casein (undegraded casein) used as a raw material.
First, 4 ml of the casein hydrolyzate solution and 30 ml of distilled water are mixed, and the pH is adjusted to 6.8 with 0.2N sodium hydroxide solution or hydrochloric acid solution. To this solution is added 5 ml of a formalin solution adjusted to pH 8.0 with 0.2N sodium hydroxide solution, and titrated with 0.1N sodium hydroxide solution until the pH reaches 7.9.
At this time, the titration amount of 0.1N sodium hydroxide solution is Aml, the factor of 0.1N sodium hydroxide solution used is F, the protein concentration of the raw protein solution is B (%) (mass basis), and the decomposition rate is Calculated from the following formula.
Decomposition rate (%) = 22.3 × A × F / B
（２）アミノ酸組成の測定方法
トリプトファン、システイン及びメチオニン以外のアミノ酸については、試料（カゼイン加水分解物溶液）を６Ｎ塩酸で１１０℃、２４時間加水分解し、トリプトファンについては、水酸化バリウムで１１０℃、２２時間アルカリ分解し、システイン及びメチオニンについては、過ギ酸処理後、６Ｎ塩酸で１１０℃、１８時間加水分解し、それぞれアミノ酸分析機（日立製作所製。８３５型）により分析し、アミノ酸の質量を測定した。
こうして測定された各アミノ酸の質量の合計を、本発明における「カゼイン加水分解物の酸加水分解物に含まれる全アミノ酸の質量合計」とする。
なお、この方法では、試料（カゼイン加水分解物溶液）に含まれているグルタミンの量およびグルタミン酸の量は、両者を合わせた合計量であるグルタミン酸分析値として定量される。
(2) Measuring method of amino acid composition For amino acids other than tryptophan, cysteine and methionine, a sample (casein hydrolyzate solution) was hydrolyzed with 6N hydrochloric acid at 110 ° C for 24 hours, and for tryptophan, 110 ° C with barium hydroxide. , And cysteine and methionine were treated with performic acid, hydrolyzed with 6N hydrochloric acid at 110 ° C. for 18 hours, and analyzed with an amino acid analyzer (manufactured by Hitachi, Ltd. Model 835) to determine the mass of amino acids. It was measured.
The total mass of each amino acid thus measured is defined as “total mass of all amino acids contained in the acid hydrolyzate of casein hydrolyzate” in the present invention.
In this method, the amount of glutamine and the amount of glutamic acid contained in the sample (casein hydrolyzate solution) are quantified as an analytical value of glutamic acid, which is the total amount of both.
（３）遊離アミノ酸組成の測定方法
スルホサリチル酸で試料（カゼイン加水分解物溶液）を除蛋白し、アミノ酸分析機（日立製作所社製。８３５型）により分析し、遊離アミノ酸の質量を測定した。そして前記「アミノ酸組成の測定方法」で測定された各アミノ酸の質量の合計に対する遊離アミノ酸質量の百分率を算出した。
(3) Measuring method of free amino acid composition A sample (casein hydrolyzate solution) was deproteinized with sulfosalicylic acid and analyzed with an amino acid analyzer (manufactured by Hitachi, Ltd., type 835) to measure the mass of the free amino acid. And the percentage of the free amino acid mass with respect to the sum total of the mass of each amino acid measured by said "method for measuring amino acid composition" was calculated.
（４）分子量分布の測定方法
高速液体クロマトグラフィーにより分子量分布を測定した（宇井信生ら編、「タンパク質・ペプチドの高速液体クロマトグラフィー」、化学増刊第１０２号、第２４１頁、株式会社化学同人、１９８４年）。
具体的には、ポリハイドロキシエチル・アスパルタミド・カラム［Ｐｏｌｙ Ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ Ａｓｐａｒｔａｍｉｄｅ Ｃｏｌｕｍｎ：ポリ・エル・シー（Ｐｏｌｙ ＬＣ）社製。直径４．６ｍｍ及び長さ２２０ｍｍ］を用い、２０ｍＭ塩化ナトリウム、５０ｍＭギ酸により溶出速度０．４ｍｌ／分で溶出した。
検出はＵＶ検出器（島津製作所社製）を用い、データ解析はＧＰＣ分析システム（島津製作所社製）を使用した。
(4) Molecular weight distribution measurement method Molecular weight distribution was measured by high performance liquid chromatography (edited by Nobuo Ui et al., “High Performance Liquid Chromatography of Proteins and Peptides”, Chemical Special Issue No. 102, page 241, Chemical Dojin Co., Ltd.) 1984).
Specifically, a polyhydroxyethyl aspartamide column (Poly Hydroxyethyl Aspartamide Column: manufactured by Poly LC). The sample was eluted with 20 mM sodium chloride and 50 mM formic acid at an elution rate of 0.4 ml / min.
A UV detector (manufactured by Shimadzu Corporation) was used for detection, and a GPC analysis system (manufactured by Shimadzu Corporation) was used for data analysis.
（５）抗原性の測定方法
エライザ（ＥＬＩＳＡ：Ｅｎｚｙｍｅ ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏ−ｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ）抑制試験法[小児アレルギー学会誌、第１巻、第２号、第３６ページ、１９８７年]により次のようにして測定した。
まず、９６穴プレート（ヌンク社製）にカゼインをコーティングし、洗浄し、被検抗原液をプレートの穴に供給して反応させ、洗浄後アルカリホスファターゼ標識ヤギ抗ウサギＩｇＧ抗体[ザイメット・ラボラトリー（Ｚｙｍｅｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）社製]を反応させ、洗浄後、酵素基質であるｐ−ニトロフェニル・リン酸ナトリウムを添加して反応を停止させた後、各穴における吸光度をマイクロプレートリーダー（和光純薬工業社製）で測定した。
被検抗原液として、カゼインを感作して調製したウサギ抗カゼイン血清と試料（カゼイン加水分解物溶液）の混合物を用いた穴の吸光度をＸとする。
被検抗原液として、カゼインを感作して調製したウサギ抗カゼイン血清と抗原を含まない試料溶媒（水）の混合物を用いた穴の対照吸光度をＹとする。
カゼイン加水分解物の抗原性の指標として、次の式で算出した抑制率を用いる。該抑制率の値が低いほど抗原性が低いことを表す。
カゼイン加水分解物による抑制率（％）＝（１−Ｘ／Ｙ）×１００
また、上記被検抗原液として、カゼインを感作して調製したウサギ抗カゼイン血清と未分解のカゼインの混合物を用いた他は同様にして、カゼインによる抑制率を求める。そして、被検抗原が（ａ）カゼイン加水分解物である場合、および（ｂ）未分解のカゼインである場合について、それぞれ被検抗原の量を変化させてＸを測定し、該被検抗原の量と抑制率との関係を示す曲線をそれぞれ得る。この曲線から抑制率が５０％となるときの被検抗原の量（上記（ａ）の場合の量をａ５０、（ｂ）の場合の量をｂ５０とする）を求め、ｂ５０／ａ５０の値を算出する。この値（ｂ５０／ａ５０）でカゼイン加水分解物の抗原性を評価する。
(5) Measurement method of antigenicity Measurement by ELISA (Enzyme linked immuno-sorbent assay) inhibition test method [Journal of Pediatric Allergy, Vol. 1, No. 2, page 36, 1987] did.
First, casein is coated on a 96-well plate (manufactured by Nunc Co.), washed, and the test antigen solution is supplied to the hole of the plate for reaction. After washing, alkaline phosphatase-labeled goat anti-rabbit IgG antibody [Zymed Laboratory (Zymed Laboratory) Laboratories)] was reacted, washed, and the enzyme substrate p-nitrophenyl / sodium phosphate was added to stop the reaction. Then, the absorbance in each hole was measured using a microplate reader (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.). ).
Let X be the absorbance of a hole using a mixture of a rabbit anti-casein serum prepared by sensitizing casein and a sample (casein hydrolyzate solution) as a test antigen solution.
Let Y be the control absorbance of a well using a mixture of a rabbit anti-casein serum prepared by sensitizing casein and a sample solvent (water) containing no antigen as a test antigen solution.
The inhibition rate calculated by the following formula is used as an index of antigenicity of casein hydrolyzate. The lower the inhibition rate, the lower the antigenicity.
Rate of inhibition by casein hydrolyzate (%) = (1−X / Y) × 100
In addition, the inhibition rate by casein is determined in the same manner except that a mixture of rabbit anti-casein serum prepared by sensitizing casein and undegraded casein is used as the test antigen solution. Then, when the test antigen is (a) casein hydrolyzate and (b) undegraded casein, X is measured by changing the amount of the test antigen, Curves showing the relationship between the amount and the inhibition rate are obtained. From this curve, the amount of the test antigen when the inhibition rate is 50% (the amount in the case (a) is a 50 and the amount in the case (b) is b 50 ) is determined, and b 50 / a A value of 50 is calculated. The antigenicity of the casein hydrolyzate is evaluated based on this value (b 50 / a 50 ).
（６）Ｎ末端に存在していないペプチド態のグルタミンの測定方法
高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用い、従来法を一部改変して測定した［ジャーナル・オブ・アグリカルチャアル・アンド・フード・ケミストリー（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ ａｎｄ Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、第４４巻、第１８０８〜１８１１ページ、１９９６年］。
具体的には、試料（カゼイン加水分解物溶液）を反応チューブに入れ、ＢＴＩ（［ｂｉｓ（ｔｒｉｆｌｕｏｒｏａｃｅｔｏｘｙ）ｉｏｄｏ］ｂｅｎｚｅｎｅ ［ビス（トリフルオロアセトキシ）イオド］ベンゼン）のＤＭＦ（ｄｉｍｅｔｈｙｌｆｏｒｍａｍｉｄｅ ジメチルホルムアミド）溶液及びピリジン水溶液を加え、ブロックヒーターにて５０℃、４時間反応させた後ＤＭＦと水を除去し、残渣をノルロイシンに溶解し、ガラス反応チューブで６規定塩酸で１５０℃、７５分間の加水分解を行った。加水分解後、生成したＤＡＢＡ（Ｌ−２，３−ｄｉａｍｉｎｏｐｒｏｐｉｏｎｉｃ ａｃｉｄ エル−２，３−ジアミノプロピオニックアシド）をＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー）にてカプセルパックカラム［Ｃａｐｃｅｌｌｐａｋ ＵＧ−８０ Ｃｏｌｕｍｎ：資生堂社製、直径２．０ｍｍ及び長さ１５０ｍｍ］を用い、ＴＨＦ（Ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｆｕｒａｎ テトラヒドロフラン）とギ酸により溶出速度０．２ｍｌ／分で溶出し、検出は蛍光検出器（島津製作所社製）を用いて定量した。
(6) Method for Measuring Peptide Glutamine Not Present at N-Terminal Measured using high performance liquid chromatography (HPLC) with partial modification of the conventional method [Journal of Agricultural and Food Chemistry (Journal of Agricultural and Food Chemistry), Vol. 44, pp. 1808-1811, 1996].
Specifically, a sample (casein hydrolyzate solution) is placed in a reaction tube, a BTI ([bis (trifluoroacetoxy) iodo] benzone [bis (trifluoroacetoxy) iodo] benzene) solution in DMF (dimethylformamide dimethylformamide) and pyridine. Aqueous solution was added and reacted with a block heater at 50 ° C. for 4 hours, then DMF and water were removed, the residue was dissolved in norleucine, and hydrolyzed with 6N hydrochloric acid at 150 ° C. for 75 minutes in a glass reaction tube. . After hydrolysis, the produced DABA (L-2,3-diaminopropionic acid L-2,3-diaminopropionic acid) is subjected to HPLC (high performance liquid chromatography) in a capsule pack column [Capcellpak UG-80 Column: Shiseido Co., Ltd.] Manufactured, 2.0 mm in diameter and 150 mm in length], and eluted with THF (Tetrahydrofuran tetrahydrofuran) and formic acid at an elution rate of 0.2 ml / min, and the detection was quantified using a fluorescence detector (manufactured by Shimadzu Corporation).
[試験例１]
（１）試験試料の調製
試験試料１：後述の実施例１で得られた本発明にかかるカゼイン加水分解物。
試験試料２：特開２００１−７８６８４号公報の実施例１に従って、カゼインをパパイン（天野エンザイム社製）で分解することにより得られたカゼイン加水分解物。
試験試料３：特開２０００−２１００３０号公報の実施例１に従って、カゼインをペプシン（ヴォルフガングミュールバウアー社製）で分解することにより得られたカゼイン加水分解物。
試験試料４：特開平８−２２８６９２号公報の実施例１に従って、カゼインをビオプラーゼｓｐ−２０（ナガセケムテック社製）、プロテア−ゼＮ（天野エンザイム社製）及びＰＴＮ６．０Ｓ（ノボザイムズ社製）で分解することにより得られたカゼイン加水分解物。
試験試料５：特公昭５４−３６２３５号公報の実施例１に従って、カゼインをラクトバチルス・ヘルベチクス（森永乳業社製）粉末破砕物、パンクレアチン（天野エンザイム社製）及びアマノＡ（天野エンザイム社製）で分解することにより得られたカゼイン加水分解物。
[Test Example 1]
(1) Preparation of test sample Test sample 1: Casein hydrolyzate according to the present invention obtained in Example 1 described later.
Test sample 2: Casein hydrolyzate obtained by degrading casein with papain (manufactured by Amano Enzyme) according to Example 1 of JP-A-2001-78684.
Test sample 3: Casein hydrolyzate obtained by decomposing casein with pepsin (manufactured by Wolfgang Mühlbauer) according to Example 1 of JP 2000-21030A.
Test sample 4: In accordance with Example 1 of JP-A-8-228692, casein was biopurase sp-20 (manufactured by Nagase Chemtech), Protease N (manufactured by Amano Enzyme) and PTN 6.0S (manufactured by Novozymes) Casein hydrolyzate obtained by digestion with
Test sample 5: Casein was prepared from Lactobacillus helvetics (manufactured by Morinaga Milk Industry Co., Ltd.), pancreatin (manufactured by Amano Enzyme) and Amano A (manufactured by Amano Enzyme) according to Example 1 of JP-B-54-36235. Casein hydrolyzate obtained by digestion with
（２）試験方法
下記の特性について、前述の試験方法により試験した。
（ｂ１）分子量１０００ダルトン以下の画分の比率、
（ｂ２）分子量３５００ダルトン以上の画分の比率、
（ｃ）抗原性（上記ｂ５０／ａ５０の値、すなわち未分解のカゼインによる抑制率を１としたときの、カゼイン加水分解物による抑制率の割合）、
（ｄ）アミノ酸遊離率（カゼイン加水分解物に含まれる全アミノ酸の質量合計に占める遊離アミノ酸の質量合計の割合）、
（ｅ）カゼイン加水分解物の酸加水分解物に含まれる全アミノ酸の質量合計に対するグルタミン酸（試料のグルタミンとグルタミン酸の合計量として定量される分析値）の割合。
(2) Test method The following characteristics were tested by the test method described above.
(B1) the fraction of fractions with a molecular weight of 1000 Dalton or less,
(B2) the proportion of fractions with a molecular weight of 3500 daltons or more,
(C) Antigenicity (b 50 / a 50 value, ie, the ratio of inhibition rate by casein hydrolyzate when the inhibition rate by undegraded casein is 1),
(D) Amino acid release rate (ratio of the total mass of free amino acids in the total mass of all amino acids contained in the casein hydrolyzate),
(E) Ratio of glutamic acid (analyzed value determined as the total amount of glutamine and glutamic acid in the sample) to the total mass of all amino acids contained in the acid hydrolyzate of casein hydrolyzate.
（３）試験結果
本試験の結果を、下記表１に示す。
なお、試験試料２における（ｃ）抗原性の評価は、未分解のカゼインと差が認められなかった。
(3) Test results The results of this test are shown in Table 1 below.
Note that (c) antigenicity evaluation in test sample 2 was not different from undegraded casein.
表１の結果から明らかなように、試験試料１〜５のうち、（ｂ１）が７５％以上、（ｂ２）が１％未満、（ｃ）が１０００分の１以下、（ｄ）が５％未満、および（ｅ）が３５％以上という理化学的性質を併せ持つカゼイン加水分解物は試験試料１のカゼイン加水分解物のみであった。さらに、酵素を固定し、出発原料の種類を変更して同様に試験したところ、同様の傾向が得られた。 As is clear from the results in Table 1, among test samples 1 to 5, (b1) is 75% or more, (b2) is less than 1%, (c) is 1/1000 or less, and (d) is 5%. The casein hydrolyzate having both physicochemical properties of less than (e) and 35% or more was only the casein hydrolyzate of Test Sample 1. Furthermore, the same tendency was obtained when the enzyme was fixed and the same test was performed by changing the kind of the starting material.
[試験例２]
（１）試験試料の調製
試験試料６：後述の実施例２で得られた本発明にかかるカゼイン加水分解物。酵素群Ａを使用し、ナノフィルトレーション膜処理においてはｐＨが４に調整された被処理液を用いた。
試験試料７：後述の実施例２において、ナノフィルトレーション膜処理を行わず、被処理液のｐＨ調整も行わなかった。その他は実施例２と同様にして得られたカゼイン加水分解物。
試験試料８：後述の実施例２において、ナノフィルトレーション膜処理に用いる被処理液のｐＨ調整を行わなかった。その他は実施例２と同様にして得られたカゼイン加水分解物。
試験試料９：後述の実施例３で得られた本発明にかかるカゼイン加水分解物。酵素群Ｂを使用した。ナノフィルトレーション膜処理の前に被処理液のｐＨ調整は行なわなかった。
試験試料１０：後述の実施例３において、ナノフィルトレーションを行わなかった。その他は実施例３と同様にして得られたカゼイン加水分解物。
試験試料１１：後述の実施例３において、ナノフィルトレーション膜処理前に被処理液のｐＨを４に調整した。その他は実施例３と同様にして得られたカゼイン加水分解物。
[Test Example 2]
(1) Preparation of test sample Test sample 6: Casein hydrolyzate according to the present invention obtained in Example 2 described later. The enzyme group A was used, and in the nanofiltration membrane treatment, a liquid to be treated whose pH was adjusted to 4 was used.
Test sample 7: In Example 2 described later, the nanofiltration membrane treatment was not performed, and the pH of the liquid to be treated was not adjusted. Others were the casein hydrolyzate obtained in the same manner as in Example 2.
Test sample 8: In Example 2 described later, the pH of the liquid to be treated used for the nanofiltration membrane treatment was not adjusted. Others were the casein hydrolyzate obtained in the same manner as in Example 2.
Test sample 9: Casein hydrolyzate according to the present invention obtained in Example 3 described later. Enzyme group B was used. The pH of the liquid to be treated was not adjusted before the nanofiltration membrane treatment.
Test sample 10: In Example 3 described later, nanofiltration was not performed. Other casesin hydrolyzate obtained in the same manner as in Example 3.
Test sample 11: In Example 3 to be described later, the pH of the liquid to be treated was adjusted to 4 before the nanofiltration membrane treatment. Other casesin hydrolyzate obtained in the same manner as in Example 3.
（２）試験方法
下記の特性について、前述の試験方法により試験した。
（ｅ）カゼイン加水分解物の酸加水分解物に含まれる全アミノ酸の質量合計に対するグルタミン酸（試料のグルタミンとグルタミン酸の合計量として定量される分析値）の割合。
（ｆ１）遊離グルタミン酸の含量、
（ｆ２）遊離グルタミンの含量、
（ｇ）Ｎ末端に存在していないペプチド態のグルタミン含量。
(2) Test method The following characteristics were tested by the test method described above.
(E) Ratio of glutamic acid (analyzed value determined as the total amount of glutamine and glutamic acid in the sample) to the total mass of all amino acids contained in the acid hydrolyzate of casein hydrolyzate.
(F1) content of free glutamic acid,
(F2) content of free glutamine,
(G) Glutamine content in peptide form not present at the N-terminus.
（３）試験結果
本試験の結果を、下記表２に示す。
(3) Test results The results of this test are shown in Table 2 below.
表２の結果から明らかなように、試験試料６，８，９，１１では、（ｅ）が３５％以上で、（ｆ１）および（ｆ２）が共に２ｍｇ／ｇ未満で、かつ（ｇ）が６５ｍｇ／ｇ以上という良好な特性が得られた。
ナノフィルトレーション膜処理を行なわなかった試験試料７および１０は、（ｅ）および（ｇ）において好ましい特性が得られず、試験試料１０は、さらに（ｆ１）遊離グルタミン酸の含量が多かった。
またナノフィルトレーション膜処理前に被処理液をｐＨ４に調整した試験試料６、１１は、試験試料８，９とそれぞれ比べて（ｅ）および（ｇ）の特性がさらに向上し、試験試料１１は（ｆ１）遊離グルタミン酸の含量も低減した。
さらに、酵素を固定し、出発原料の種類を変更して同様に試験したところ、同様の傾向が得られた。
As is clear from the results in Table 2, in test samples 6, 8, 9, and 11, (e) is 35% or more, (f1) and (f2) are both less than 2 mg / g, and (g) is Good characteristics of 65 mg / g or more were obtained.
Test samples 7 and 10 that were not subjected to nanofiltration membrane treatment did not obtain favorable characteristics in (e) and (g), and test sample 10 further had a high content of (f1) free glutamic acid.
In addition, the test samples 6 and 11 in which the liquid to be treated was adjusted to pH 4 before the nanofiltration membrane treatment were further improved in the characteristics of (e) and (g) as compared with the test samples 8 and 9, respectively. Also reduced the content of (f1) free glutamic acid.
Furthermore, the same tendency was obtained when the enzyme was fixed and the same test was conducted by changing the kind of the starting material.
以下に実施例を示して本発明を詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
＜実施例１＞
乳酸カゼイン（蛋白質含有量８５％。タツア社製）１ｋｇを精製水１０ｋｇに溶解し、水酸化ナトリウム（日本曹達社製）１３ｇ及び水酸化カリウム（日本曹達社製）３３ｇを添加してｐＨを９．３に調整して原料溶解液とした。
この原料溶解液に、バシラス属細菌由来のエンドプロテアーゼ（商品名：プロテアーゼＮ；天野エンザイム社製）１６８万活性単位（蛋白質１ｇ当たり２，０００活性単位）、バシラス属細菌由来のエンドプロテアーゼ（商品名：ビオプラーゼ；ナガセケムテック社製）１００．８万活性単位（蛋白質１ｇ当たり１，２００活性単位）、及びトリプシン（商品名：トリプシンＶ；日本バイオコン社製）５８８万活性単位（蛋白質１ｇ当たり７，０００活性単位）を添加し、５０℃で加水分解した。酵素反応を分解率によりモニターし、分解率が２４％かつアミノ酸遊離率が４．３％に達した時点で、１３０℃で２秒間加熱して酵素を失活させて加水分解液を得た。
この加水分解液を、分画分子量６，０００の限外濾過膜モジュール（商品名：ＳＩＰ１０３０；旭化成社製）により限外濾過膜処理し、得られた膜透過画分を、食塩阻止率５０％の荷電したナノフィルトレーション膜モジュール（商品名：ＮＴＲ７４５０；日東電工社製）を用いてナノフィルトレーション膜処理した。得られた膜非透過画分を濃縮し、噴霧乾燥し、粉末状のカゼイン加水分解物約０．５ｋｇを得た。
EXAMPLES Hereinafter, the present invention will be described in detail with reference to examples, but the present invention is not limited to the following examples.
<Example 1>
1 kg of lactate casein (protein content 85%, manufactured by Tatsua) is dissolved in 10 kg of purified water, 13 g of sodium hydroxide (manufactured by Nippon Soda Co., Ltd.) and 33 g of potassium hydroxide (manufactured by Nippon Soda Co., Ltd.) are added to adjust the pH to 9 .3 to prepare a raw material solution.
In this raw material solution, endoprotease derived from Bacillus bacteria (trade name: Protease N; manufactured by Amano Enzyme) 1.68 million activity units (2,000 activity units per gram of protein), endoprotease derived from Bacillus bacteria (trade name) : Biolase; manufactured by Nagase Chemtech) 1008,000 active units (1,200 active units per gram of protein) and trypsin (trade name: trypsin V; manufactured by Nippon Biocon) 588,000 active units (7, per 1 g protein) 000 active units) was added and hydrolyzed at 50 ° C. The enzymatic reaction was monitored by the degradation rate. When the degradation rate reached 24% and the amino acid release rate reached 4.3%, the enzyme was deactivated by heating at 130 ° C. for 2 seconds to obtain a hydrolyzate.
This hydrolyzate was subjected to an ultrafiltration membrane treatment with an ultrafiltration membrane module (trade name: SIP 1030; manufactured by Asahi Kasei Co., Ltd.) having a molecular weight cut off of 6,000, and the resulting membrane permeation fraction was subjected to a salt rejection of 50%. The nanofiltration membrane module (trade name: NTR7450; manufactured by Nitto Denko Corporation) was used for nanofiltration membrane treatment. The obtained membrane-impermeable fraction was concentrated and spray-dried to obtain about 0.5 kg of powdered casein hydrolyzate.
前記ナノフィルトレーション膜処理における膜非透過画分として得られたカゼイン加水分解物溶液について、前記試験方法で下記の各特性を試験した。その結果を下記表３にまとめて示す。
（ａ）カゼインの分解率、
（ｂ１）分子量１０００ダルトン以下の画分の比率、
（ｂ２）分子量３５００ダルトン以上の画分の比率、
（ｃ）抗原性（カゼインによる抑制率を１としたときの、カゼイン加水分解物による抑制率の割合）、
（ｄ）アミノ酸遊離率（カゼイン加水分解物に含まれる全アミノ酸の質量合計に占める遊離アミノ酸の質量合計の割合）、
（ｅ）カゼイン加水分解物の酸加水分解物に含まれる全アミノ酸の質量合計に対するグルタミン酸（試料のグルタミンとグルタミン酸の合計量として定量される分析値）の割合、
（ｆ１）遊離グルタミン酸の含量、
（ｆ２）遊離グルタミンの含量、
（ｇ）Ｎ末端に存在していないペプチド態のグルタミン含量。
The casein hydrolyzate solution obtained as a membrane non-permeating fraction in the nanofiltration membrane treatment was tested for the following characteristics by the test method. The results are summarized in Table 3 below.
(A) Casein degradation rate,
(B1) the fraction of fractions with a molecular weight of 1000 Dalton or less,
(B2) the proportion of fractions with a molecular weight of 3500 daltons or more,
(C) Antigenicity (ratio of inhibition rate by casein hydrolyzate when the inhibition rate by casein is 1),
(D) Amino acid release rate (ratio of the total mass of free amino acids in the total mass of all amino acids contained in the casein hydrolyzate),
(E) Ratio of glutamic acid (analyzed value determined as the total amount of glutamine and glutamic acid in the sample) to the total mass of all amino acids contained in the acid hydrolyzate of casein hydrolyzate,
(F1) content of free glutamic acid,
(F2) content of free glutamine,
(G) Glutamine content in peptide form not present at the N-terminus.
＜実施例２＞
実施例１と同様にして、原料溶解液を調製し、酵素反応による加水分解を行い、限外濾過処理を行った。
限外濾過膜処理で得られた膜透過画分にクエン酸（三栄源エフエフアイ社製）を添加してｐＨ４に調整し、食塩阻止率１０％の荷電したナノフィルトレーション膜モジュール（商品名：ＮＴＲ７４１０；日東電工社製）を用いてナノフィルトレーション膜処理した。得られた膜非透過画分を濃縮し、噴霧乾燥し、粉末状のカゼイン加水分解物約０．５ｋｇを得た。
前記ナノフィルトレーション膜処理における膜非透過画分として得られたカゼイン加水分解物溶液について、実施例１と同様にして各特性を試験した。その結果を下記表３にまとめて示す。
<Example 2>
In the same manner as in Example 1, a raw material solution was prepared, hydrolyzed by an enzymatic reaction, and subjected to ultrafiltration.
Charged nanofiltration membrane module with 10% salt rejection (trade name) by adding citric acid (manufactured by San-Ei Gen FFI Co., Ltd.) to the membrane permeate obtained by ultrafiltration membrane treatment and adjusting the pH to 4. : NTR7410; manufactured by Nitto Denko Corporation). The obtained membrane-impermeable fraction was concentrated and spray-dried to obtain about 0.5 kg of powdered casein hydrolyzate.
The characteristics of the casein hydrolyzate solution obtained as a membrane-impermeable fraction in the nanofiltration membrane treatment were tested in the same manner as in Example 1. The results are summarized in Table 3 below.
＜実施例３＞
ナトリウムカゼイネート（蛋白質含有量９０％。フォンテラ社製）１０ｋｇを精製水９０ｋｇに溶解し、水酸化ナトリウム（日本曹達社製）０．１５ｋｇを添加してｐＨを９．２に調整して原料溶解液とした。
この原料溶解液に、バシラス属細菌由来の中性エンドプロテアーゼ（商品名：アルカラーゼ；ノボザイムズ社製）１７００万活性単位、（蛋白質１ｇ当たり１８８０活性単位）、及びトリプシン（商品名：トリプシンＶ；日本バイオコン社製）１６２０万活性単位（蛋白質１ｇ当たり１８００活性単位）、及び乳酸菌ラクトバチルス・ヘルベチクス由来ペプチダーゼ（森永乳業社製）９００万活性単位（蛋白質１ｇ当たり１０００活性単位）を添加し、５０℃で加水分解した。酵素反応を分解率によりモニターし、分解率が３２％かつアミノ酸遊離率が２７％に達した時点で、１３０℃で２秒間加熱して酵素を失活させて加水分解液を得た。
この加水分解液を、分画分子量３，０００の限外濾過膜モジュール（商品名：ＳＥＰ３０５１；旭化成社製）により限外濾過膜処理し、得られた膜透過画分を、食塩阻止率１０％の荷電したナノフィルトレーション膜モジュール（商品名：ＮＴＲ７４１０；日東電工社製）を用いてナノフィルトレーション膜処理した。得られた膜非透過画分を濃縮し、噴霧乾燥し、粉末状のカゼイン加水分解物約０．４ｋｇを得た。
<Example 3>
Dissolve the raw material by dissolving 10 kg of sodium caseinate (protein content 90%, manufactured by Fontera) in 90 kg of purified water, adding 0.15 kg of sodium hydroxide (manufactured by Nippon Soda Co., Ltd.) to adjust the pH to 9.2. A liquid was used.
To this raw material solution, neutral endoprotease derived from Bacillus bacteria (trade name: Alcalase; manufactured by Novozymes) 17 million active units, (1880 active units per gram of protein), and trypsin (trade name: trypsin V; Nippon Biocon) 16.2 million active units (1800 active units per gram of protein) and 9 million active units (1000 active units per gram of protein) of lactic acid bacteria Lactobacillus helveticus derived peptidase (manufactured by Morinaga Milk Industry Co., Ltd.) Disassembled. The enzymatic reaction was monitored by the decomposition rate. When the decomposition rate reached 32% and the amino acid release rate reached 27%, the enzyme was deactivated by heating at 130 ° C. for 2 seconds to obtain a hydrolyzed solution.
This hydrolyzate was subjected to an ultrafiltration membrane treatment with an ultrafiltration membrane module (trade name: SEP3051; manufactured by Asahi Kasei Co., Ltd.) having a molecular weight cut off of 3,000, and the resulting membrane permeation fraction was subjected to a salt rejection of 10%. The nanofiltration membrane module (trade name: NTR7410; manufactured by Nitto Denko Corporation) was used for nanofiltration membrane treatment. The obtained membrane-impermeable fraction was concentrated and spray-dried to obtain about 0.4 kg of powdered casein hydrolyzate.
前記ナノフィルトレーション膜処理における膜非透過画分として得られたカゼイン加水分解物溶液について、実施例１と同様にして各特性を試験した。その結果を下記表３にまとめて示す。 Each characteristic was tested in the same manner as in Example 1 for the casein hydrolyzate solution obtained as a membrane-impermeable fraction in the nanofiltration membrane treatment. The results are summarized in Table 3 below.
実施例１〜３で得られたカゼイン加水分解物はいずれも、良好な理化学的特性を有しており、流動食、医療食、栄養補給食などにそのまま使用可能な優れたものであった。 All of the casein hydrolysates obtained in Examples 1 to 3 had good physicochemical properties and were excellent as they could be used for liquid foods, medical foods, nutritional supplements, and the like.
Claims (9)
ａ）カゼインの分解率が１５〜３５％であること、
ｂ）分子量１０００ダルトン以下の画分の比率が７５％以上であり、かつ分子量３５００ダルトン以上の画分の比率が１％未満であること、
ｃ）エライザ（ＥＬＩＳＡ：Ｅｎｚｙｍｅ ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏ−ｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ）抑制試験法により測定した抗原性がカゼインの抗原性の１０００分の１以下であること、
ｄ）カゼイン加水分解物に含まれる全アミノ酸の質量合計に占める遊離アミノ酸の質量合計の割合が５％未満であること、
ｅ）カゼイン加水分解物の酸加水分解物に含まれる全アミノ酸の質量合計の３５％以上がグルタミン酸として定量されること。 A casein hydrolyzate having the following physicochemical properties a) to e):
a) The degradation rate of casein is 15 to 35%,
b) The ratio of the fraction having a molecular weight of 1000 daltons or less is 75% or more, and the ratio of the fraction having a molecular weight of 3500 daltons or less is less than 1%,
c) the antigenicity measured by ELISA (Enzyme linked immunosorbent assay) inhibition test method is less than 1/1000 of the antigenicity of casein;
d) The ratio of the total mass of free amino acids to the total mass of all amino acids contained in the casein hydrolyzate is less than 5%,
e) 35% or more of the total mass of all amino acids contained in the acid hydrolyzate of casein hydrolyzate is quantified as glutamic acid.
Furthermore, g) Casein hydrolyzate according to claim 7 or 8, wherein the content of glutamine in a peptide form not present at the N-terminus is 65 mg / g or more.
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Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2011101627A (en) * | 2009-11-11 | 2011-05-26 | Q P Corp | Method for producing desalted protein hydrolysate |
| JP2012522498A (en) * | 2009-04-02 | 2012-09-27 | ノボザイムス アクティーゼルスカブ | Milk-derived protein hydrolyzate |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH0928306A (en) * | 1995-07-21 | 1997-02-04 | Morinaga Milk Ind Co Ltd | Casein hydrolyzate |
| JPH10271958A (en) * | 1997-03-31 | 1998-10-13 | Morinaga Milk Ind Co Ltd | Production of protein hydrolysate reduced in smell |
| JP2004081192A (en) * | 2002-07-03 | 2004-03-18 | Morinaga Milk Ind Co Ltd | Method for producing milk protein hydrolysate of which odor is reduced and the milk protein hydrolysate |
-
2005
- 2005-09-29 JP JP2005285277A patent/JP2007091669A/en active Pending
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH0928306A (en) * | 1995-07-21 | 1997-02-04 | Morinaga Milk Ind Co Ltd | Casein hydrolyzate |
| JPH10271958A (en) * | 1997-03-31 | 1998-10-13 | Morinaga Milk Ind Co Ltd | Production of protein hydrolysate reduced in smell |
| JP2004081192A (en) * | 2002-07-03 | 2004-03-18 | Morinaga Milk Ind Co Ltd | Method for producing milk protein hydrolysate of which odor is reduced and the milk protein hydrolysate |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2012522498A (en) * | 2009-04-02 | 2012-09-27 | ノボザイムス アクティーゼルスカブ | Milk-derived protein hydrolyzate |
| US9259023B2 (en) | 2009-04-02 | 2016-02-16 | Novozymes A/S | Process for making a milk-based protein hydrolysate |
| JP2011101627A (en) * | 2009-11-11 | 2011-05-26 | Q P Corp | Method for producing desalted protein hydrolysate |
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