JP2007071832A

JP2007071832A - Modified gold particles

Info

Publication number: JP2007071832A
Application number: JP2005262210A
Authority: JP
Inventors: Katsuyuki Maeno; 克行前野; Kazuyuki Miyazawa; 和之宮沢; Shinichi Yusa; 真一遊佐; Kenichi Fukuda; 研一福田
Original assignee: Shiseido Co Ltd
Current assignee: Shiseido Co Ltd
Priority date: 2005-09-09
Filing date: 2005-09-09
Publication date: 2007-03-22

Abstract

<P>PROBLEM TO BE SOLVED: To provide gold particles capable of highly accurately detecting target substances. <P>SOLUTION: In modified gold particles, a polymer of a molecular weight polydispersity index, between 1-1.2 specified by the ratio of the weight-average molecular weight to the number-average molecular weight is immobilized to the surfaces of gold particles by a mercapto terminal group, and a ligand, having specific affinity to the target substance, is immobilized to the other terminal of the polymer. The polymer is preferably a stimuli-responsive polymer. The modified gold particles and a sample to be measured are mixed in a solution, and the target substance is detected on the basis of the presence of an aggregate formed, only when the ligand is specifically combined with the target substance in the method. Stimuli are provided to cause the modified gold particles to aggregate, after the modified gold particles and the sample to be measured have been mixed in a solution, gold particles and/or the target substance is recovered separately in the method. <P>COPYRIGHT: (C)2007,JPO&INPIT

Description

本発明は修飾金粒子、その製造方法、及び修飾金粒子の特異的親和性を利用した分析方法に関する。 The present invention relates to modified gold particles, a method for producing the same, and an analysis method using the specific affinity of the modified gold particles.

金粒子は、分散状態の変化によって、表面プラズモン吸収由来の吸収極大波長がシフトし、色調が変化することが知られている。そこで、金粒子の表面に目的物質に対して特異的親和性を有するリガンドを固定化すると、特異的反応による凝集に由来する色調変化の有無により目的物質を検出することが可能である。
例えば、特許文献１においては、試料中のウィルス等の抗原を視覚的に検出するため、抗体が結合した金コロイド粒子が利用されている。また特許文献２においては、１本鎖ＤＮＡが表面に固定した金コロイド粒子と、ターゲットＤＮＡとを溶液中でアニール後、凝集体形成の有無により、ターゲットＤＮＡの配列を検知する方法が記載されている。 It is known that the gold particles are shifted in the absorption maximum wavelength derived from the surface plasmon absorption due to the change in the dispersion state, and the color tone is changed. Therefore, when a ligand having specific affinity for the target substance is immobilized on the surface of the gold particle, it is possible to detect the target substance based on the presence or absence of a color tone change resulting from aggregation due to a specific reaction.
For example, in Patent Document 1, colloidal gold particles bound with antibodies are used to visually detect antigens such as viruses in a sample. Patent Document 2 describes a method of detecting the target DNA sequence based on the presence or absence of aggregate formation after annealing gold colloidal particles with single-stranded DNA immobilized on the surface and target DNA in a solution. Yes.

現在、金コロイド溶液は、医薬品、化粧品、食品及び塗料等の広範な分野において利用されている。金コロイド溶液は、塩化金酸溶液に還元剤としてクエン酸塩溶液を加えて加熱し、金イオンを還元させてコロイドとする溶液内還元反応を用いて製造できる。（非特許文献１）。
しかし、一般に金コロイド粒子は水溶液中での分散安定性が悪く、わずかな塩の添加で凝集し、沈殿してしまうことが問題になっていた。 Currently, colloidal gold solutions are used in a wide range of fields such as pharmaceuticals, cosmetics, foods and paints. The colloidal gold solution can be produced by an in-solution reduction reaction in which a citrate solution as a reducing agent is added to a chloroauric acid solution and heated to reduce gold ions to form a colloid. (Non-Patent Document 1).
However, in general, colloidal gold particles have poor dispersion stability in an aqueous solution, causing a problem that they aggregate and precipitate when a slight amount of salt is added.

そこで、金粒子表面を水溶性のポリマー鎖で修飾し、金粒子の分散安定性を向上させ、該ポリマーの反対末端にリガンド分子を導入することが試みられている。例えば非特許文献２には、金粒子表面に、アニオン重合により合成されたポリマー（ポリエチレングリコール誘導体）を付着させ、該ポリマーの反対末端に糖を結合させた修飾金ナノ粒子が開示されており、これを用いて目的物質であるレクチンを捕捉する方法が記載されている。
特開平０６−２１３８９１号公報特開２００４−２７５１８７号公報化学工業１９９８年４月ｐ．２６９−２７７ J. AM. Chem. Soc., 123, 8226-8230 (2001) Therefore, attempts have been made to modify the gold particle surface with a water-soluble polymer chain to improve the dispersion stability of the gold particle and introduce a ligand molecule at the opposite end of the polymer. For example, Non-Patent Document 2 discloses modified gold nanoparticles in which a polymer (polyethylene glycol derivative) synthesized by anionic polymerization is attached to the gold particle surface, and a sugar is bonded to the opposite end of the polymer. A method of capturing a lectin, which is a target substance, using this is described.
Japanese Patent Laid-Open No. 06-213891 JP 2004-275187 A Chemical Industry April 1998 p. 269-277 J. AM. Chem. Soc., 123, 8226-8230 (2001)

しかしながら、アニオン重合を効率よく、且つ十分に制御しながら進行させるには、反応系から水分を十分に除去する必要がある。そのため上記技術においては、金粒子に付着しているポリマーの分子量が不均一であり、目的物質の検出の精度が低いという問題があった。また目的物質の回収・解析が困難であると同時に、金粒子自体を回収して再利用することも困難であった。
本発明の目的は、目的物質の精度の高い検出が可能である金粒子を提供することにある。 However, in order to proceed anionic polymerization efficiently and with sufficient control, it is necessary to sufficiently remove moisture from the reaction system. Therefore, in the above technique, there is a problem that the molecular weight of the polymer adhering to the gold particles is not uniform and the detection accuracy of the target substance is low. In addition, it is difficult to collect and analyze the target substance, and it is also difficult to collect and reuse the gold particles themselves.
An object of the present invention is to provide gold particles capable of detecting a target substance with high accuracy.

上記事情を鑑み、本発明者等が鋭意検討を行った結果、金粒子表面に結合させるポリマーとして、可逆的付加開裂連鎖移動重合法（RAFT法）により合成した分子量分布の狭いポリマーを用いることにより、均一かつ分散性が高い金粒子を得ることができ、目的物質のより精度の高い検出が可能であることを見出した。
そして、上記ポリマーとして、刺激応答性ポリマーを用いることによって、目的物質との混合後に刺激を与えることにより金粒子を凝集させ、目的物質の回収・解析、及び金粒子の再利用が可能であることを見出し、本発明を完成するに至った。 As a result of intensive studies by the present inventors in view of the above circumstances, by using a polymer with a narrow molecular weight distribution synthesized by a reversible addition-fragmentation chain transfer polymerization method (RAFT method) as a polymer to be bonded to the gold particle surface. It was found that uniform and highly dispersible gold particles can be obtained, and the target substance can be detected with higher accuracy.
In addition, by using a stimulus-responsive polymer as the polymer, it is possible to aggregate the gold particles by applying a stimulus after mixing with the target substance, and to collect and analyze the target substance and to reuse the gold particles. As a result, the present invention has been completed.

すなわち、本発明の第一の主題は、金粒子表面に、重量平均分子量／数平均分子量で規定される分子量多分散度が１〜１.２であるポリマーをメルカプト末端基により固定化させ、該ポリマーの他末端に、目的物質に対して特異的親和性を有するリガンドを固定化させたことを特徴とする修飾金粒子である。
前記修飾金粒子において、ポリマーは刺激応答性ポリマーであることが好ましい。 That is, the first subject of the present invention is that a polymer having a molecular weight polydispersity defined by weight average molecular weight / number average molecular weight of 1 to 1.2 is immobilized on a gold particle surface by a mercapto end group, The modified gold particle is characterized in that a ligand having specific affinity for a target substance is immobilized on the other end of the polymer.
In the modified gold particles, the polymer is preferably a stimulus-responsive polymer.

本発明の第二の主題は、下記（Ａ）〜（Ｃ）工程を含むことを特徴とする修飾金粒子の製造方法である。
（Ａ）ラジカル重合性モノマーを、チオカルボニルチオ基を有する連鎖移動剤の存在下で、可逆的付加開裂連鎖移動重合させて、チオカルボニルチオ基を有するポリマーを得、
該ポリマーのチオカルボニルチオ基を、メルカプト基に変換し、メルカプト末端基を有するポリマーを得る工程。
（Ｂ）（Ａ）工程で得られたメルカプト末端基を有するポリマーと、金粒子とを溶媒中で混合し、金粒子表面にメルカプト末端基によりポリマーを固定化する工程。
（Ｃ）前記ポリマーの他末端に、目的物質に対して特異的親和性を有するリガンドを結合させる工程。 The second subject of the present invention is a method for producing modified gold particles, comprising the following steps (A) to (C).
(A) A radically polymerizable monomer is subjected to reversible addition-cleavage chain transfer polymerization in the presence of a chain transfer agent having a thiocarbonylthio group to obtain a polymer having a thiocarbonylthio group,
A step of converting a thiocarbonylthio group of the polymer into a mercapto group to obtain a polymer having a mercapto end group.
(B) A step of mixing the polymer having a mercapto end group obtained in the step (A) and gold particles in a solvent, and immobilizing the polymer on the gold particle surface with the mercapto end group.
(C) A step of binding a ligand having specific affinity for the target substance to the other end of the polymer.

本発明の第三の主題は、前記修飾金粒子と、測定対象試料とを溶液中で混合し、リガンドが目的物質と特異的に結合した時にのみ形成される凝集体の有無により目的物質を検出する方法である。
また、前記修飾金粒子と、測定対象試料とを溶液中で混合後、刺激を与えることにより修飾金粒子を凝集させ、金粒子及び／又は目的物質を分離回収する方法である。 The third subject of the present invention is to detect the target substance based on the presence or absence of aggregates formed only when the modified gold particles and the sample to be measured are mixed in a solution and the ligand specifically binds to the target substance. It is a method to do.
Further, after the modified gold particles and the sample to be measured are mixed in a solution, the modified gold particles are aggregated by applying a stimulus to separate and recover the gold particles and / or the target substance.

本発明の修飾金粒子は、表面に分子量多分散度が１〜１.２であるポリマーを固定化し、該ポリマーの他末端に、目的物質に対して特異的親和性を有するリガンドを固定化したものであるため分散安定性が非常に高く、これを利用して目的物質の精度の高い検出が可能である。
また本発明の修飾金粒子は、目的物質と結合後、遠心操作等により回収することができるが、特にポリマーとして刺激応答性ポリマーを使用した場合には、目的物質と結合後に刺激を与えることにより凝集が生じるため、容易に目的物質あるいは金粒子を回収することができる。 In the modified gold particles of the present invention, a polymer having a molecular weight polydispersity of 1 to 1.2 is immobilized on the surface, and a ligand having specific affinity for a target substance is immobilized on the other end of the polymer. Therefore, dispersion stability is very high, and it is possible to detect the target substance with high accuracy using this.
The modified gold particles of the present invention can be recovered by centrifugation after binding to the target substance. In particular, when a stimulus-responsive polymer is used as the polymer, by applying a stimulus after binding to the target substance. Since aggregation occurs, the target substance or gold particles can be easily recovered.

以下、本発明の実施の形態について詳述する。
本発明にかかる修飾金粒子は、金粒子表面に、重量平均分子量／数平均分子量で規定される分子量多分散度が１〜１.２であるポリマーが結合しており、該ポリマーの他末端に、目的物質に対して特異的親和性を有する物質が結合していることを特徴とする。 Hereinafter, embodiments of the present invention will be described in detail.
In the modified gold particle according to the present invention, a polymer having a molecular weight polydispersity defined by weight average molecular weight / number average molecular weight of 1 to 1.2 is bonded to the gold particle surface, and the other end of the polymer is bonded to the gold particle surface. A substance having a specific affinity for a target substance is bound thereto.

本発明に用いられる金粒子は、通常市販のものを用いればよいが、常法、例えば塩化金酸をクエン酸ナトリウムで還元する方法により調製したものを用いることもできる。
本発明において金粒子は、金を含む合金又は金化合物であっても良い。金を含む合金としては、金合金を形成し得る金属（例えば、Ｐｔ、Ｃｕ、Ａｇ、Ｐｄ等の遷移金属等）を含む合金であって、金含有量が９０質量％以上、好ましくは９５質量％以上のものが例示される。金化合物としては、例えば、臭化金、塩化金、シアン化金、水酸化金、酸化金、シアン化金カリウム、塩化金ナトリウム、テトラクロロ金酸等が挙げられる。
本発明において、金粒子の粒径は特に限定されないが、１〜１０００ｎｍ程度、特に１０〜１００ｎｍであることが好ましい。 As the gold particles used in the present invention, commercially available particles may be used, but those prepared by a conventional method, for example, a method of reducing chloroauric acid with sodium citrate may be used.
In the present invention, the gold particles may be an alloy or gold compound containing gold. The alloy containing gold is an alloy containing a metal that can form a gold alloy (for example, transition metals such as Pt, Cu, Ag, Pd, etc.), and the gold content is 90% by mass or more, preferably 95% by mass. % Or more is exemplified. Examples of the gold compound include gold bromide, gold chloride, gold cyanide, gold hydroxide, gold oxide, potassium gold cyanide, sodium gold chloride, tetrachloroauric acid and the like.
In the present invention, the particle size of the gold particles is not particularly limited, but is preferably about 1 to 1000 nm, particularly 10 to 100 nm.

本発明において、金粒子表面に固定化するポリマーは、重量平均分子量／数平均分子量で規定される分子量多分散度が１〜１.２であることを特徴とする。分子量多分散度が大きいと、目的物質の検出の精度が低くなる。
また、Ｍｗ及びＭｎは特に限定されないが、Ｍｗは５０００以上、Ｍｎは５０００以上であることが好ましい。
なお本発明において、Ｍｗ、Ｍｎ及び多分散度はＧＰＣという方法で測定したものである。カラムはショーデックスのＫＦ−８０３Ｌカラムを用い、展開溶媒にＴＨＦ、流速１ｍＬ／ｍｉｎ、４０℃という条件で行った。 In the present invention, the polymer immobilized on the gold particle surface has a molecular weight polydispersity defined by weight average molecular weight / number average molecular weight of 1 to 1.2. When the molecular weight polydispersity is large, the detection accuracy of the target substance is lowered.
Moreover, although Mw and Mn are not specifically limited, it is preferable that Mw is 5000 or more and Mn is 5000 or more.
In the present invention, Mw, Mn and polydispersity are measured by a method called GPC. As the column, a Shodex KF-803L column was used, and the developing solvent was THF, the flow rate was 1 mL / min, and the temperature was 40 ° C.

分子量多分散度が１〜１.２であるポリマーは、例えば可逆的付加開裂連鎖移動重合法（RAFT法）を利用した以下のような方法により、調製することができる。すなわち、ラジカル重合性モノマーを、チオカルボニルチオ基を有する連鎖移動剤の存在下で、可逆的付加開裂連鎖移動重合させて、チオカルボニルチオ基を有するポリマーを得、該ポリマーのチオカルボニルチオ基を、メルカプト基に変換し、メルカプト末端基を有するポリマーを得る方法である。 A polymer having a molecular weight polydispersity of 1 to 1.2 can be prepared by, for example, the following method using a reversible addition-fragmentation chain transfer polymerization method (RAFT method). That is, a radically polymerizable monomer is subjected to reversible addition-cleavage chain transfer polymerization in the presence of a chain transfer agent having a thiocarbonylthio group to obtain a polymer having a thiocarbonylthio group. This is a method of converting to a mercapto group to obtain a polymer having a mercapto end group.

ラジカル重合性モノマーとしては、次の化合物が挙げられるが、これらに限定されない：
アクリル酸、メタクリル酸、アクリル酸メチル、アクリル酸エチル、アクリル酸ｎ−プロピル、アクリル酸イソプロピル、アクリル酸ｎ−ブチル、アクリル酸ヘキシル、アクリル酸２−エチルヘキシル、アクリル酸シクロヘキシル、アクリル酸オクチル、アクリル酸デシル、アクリル酸ドデシル、アクリル酸フェニル、アクリル酸トルイル、アクリル酸ベンジル、アクリル酸イソボルニル、アクリル酸２−メトキシエチル、アクリル酸３−メトキシブチル、アクリル酸２−ヒドロキシエチル、アクリル酸２−ヒドロキシプロピル、アクリル酸ステアリル、アクリル酸グリシジル、２−アクリロイルオキシプロピルジメトキシメチルシラン、２−アクリロイルオキシプロピルトリメトキシシラン、アクリル酸トリフルオロメチル、アクリル酸ペンタフルオロエチル、アクリル酸２，２，２−トリフルオロエチル、アクリル酸３−ジメチルアミノエチル、アクリル酸イソブチル、アクリル酸４−ヒドロキシブチル、アクリル酸ｔ−ブチル、アクリル酸ラウリル、アルキル変性ジペンタエリスリトールのアクリレート、エチレンオキサイド変性ビスフェノールＡジアクリレート、アクリル酸カルビトール、ε−カプロラクトン変性ジペンタエリスリトールのアクリレート、カプロラクトン変性テトラヒドロフルフリルアクリレート、カプロラクトン変性ヒドロキシピバリン酸ネオペンチルグリコールエステルジアクリレート、ジトリメチロールプロパンテトラアクリレート、ジペンタエリスリトールヘキサアクリレート、ジペンタエリスリトールペンタアクリレート、アクリル酸テトラエチレングリコール、アクリル酸テトラヒドロフルフリル、アクリル酸トリプロピレングリコール、トリメチロールプロパンエトキシトリアクリレート、トリメチロールプロパントリアクリレート、ネオペンチルグリコールジアクリレート、ネオペンチルグリコールヒドロキシピバリン酸エステルジアクリレート、アクリル酸１，９−ノナンジオール、アクリル酸１，４−ブタンジオール、２−プロペノイックアシッド〔２−〔１，１−ジメチル−２−〔（１−オキソ−２−プロペニル）オキシ〕エチル〕−５−エチル−１，３−ジオキサン−５−イル〕メチルエステル、アクリル酸１，６−ヘキサンジオール、ペンタエリスリトールトリアクリレート、２−アクリロイルオキシプロピルハイドロジェンフタレート、３−メトキシアクリル酸メチル、アクリル酸アリル等のアクリル酸エステル； Radical polymerizable monomers include, but are not limited to, the following compounds:
Acrylic acid, methacrylic acid, methyl acrylate, ethyl acrylate, n-propyl acrylate, isopropyl acrylate, n-butyl acrylate, hexyl acrylate, 2-ethylhexyl acrylate, cyclohexyl acrylate, octyl acrylate, acrylic acid Decyl, dodecyl acrylate, phenyl acrylate, toluyl acrylate, benzyl acrylate, isobornyl acrylate, 2-methoxyethyl acrylate, 3-methoxybutyl acrylate, 2-hydroxyethyl acrylate, 2-hydroxypropyl acrylate, Stearyl acrylate, glycidyl acrylate, 2-acryloyloxypropyldimethoxymethylsilane, 2-acryloyloxypropyltrimethoxysilane, trifluoromethyl acrylate, acrylic acid pe Tafluoroethyl, 2,2,2-trifluoroethyl acrylate, 3-dimethylaminoethyl acrylate, isobutyl acrylate, 4-hydroxybutyl acrylate, t-butyl acrylate, lauryl acrylate, alkyl-modified dipentaerythritol Acrylate, ethylene oxide modified bisphenol A diacrylate, carbitol acrylate, ε-caprolactone modified dipentaerythritol acrylate, caprolactone modified tetrahydrofurfuryl acrylate, caprolactone modified hydroxypivalic acid neopentyl glycol ester diacrylate, ditrimethylolpropane tetraacrylate , Dipentaerythritol hexaacrylate, dipentaerythritol pentaacrylate, tetraethyl acrylate Lenglycol, tetrahydrofurfuryl acrylate, tripropylene glycol acrylate, trimethylolpropane ethoxytriacrylate, trimethylolpropane triacrylate, neopentyl glycol diacrylate, neopentyl glycol hydroxypivalate ester diacrylate, acrylic acid 1,9- Nonanediol, 1,4-butanediol acrylate, 2-propenoic acid [2- [1,1-dimethyl-2-[(1-oxo-2-propenyl) oxy] ethyl] -5-ethyl-1 , 3-Dioxane-5-yl] methyl ester, 1,6-hexanediol acrylate, pentaerythritol triacrylate, 2-acryloyloxypropyl hydrogen phthalate, methyl 3-methoxyacrylate Acrylic acid esters such as allyl acrylate;

メタクリル酸メチル、メタクリル酸エチル、メタクリル酸ｎ−ブチル、メタクリル酸イソブチル、メタクリル酸ｔ−ブチル、メタクリル酸２−エチルヘキシル、メタクリル酸ラウリル、メタクリル酸トリデシル、メタクリル酸ステアリル、メタクリル酸シクロヘキシル、メタクリル酸ベンジル、メタクリル酸２−ヒドロキシエチル、メタクリル酸２−ヒドロキシプロピル、メタクリル酸Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチル、メタクリル酸Ｎ，Ｎ−ジエチルアミノエチル、メタクリル酸グリシジル、メタクリル酸テトラヒドロフルフリル、ジメタクリル酸エチレングリコール、ジメタクリル酸トリエチレングリコール、ジメタクリル酸テトラエチレングリコール、ジメタクリル酸１，３−ブチレングリコール、トリメタクリル酸トリメチロールプロパン、メタクリル酸イソプロピル、メタクリル酸ペンチル、メタクリル酸ヘキシル、メタクリル酸ヘプチル、メタクリル酸オクチル、メタクリル酸２−エチルヘキシル、メタクリル酸ノニル、メタクリル酸デシル、メタクリル酸ドデシル、メタクリル酸フェニル、メタクリル酸トルイル、メタクリル酸イソボルニル、メタクリル酸２−メトキシエチル、メタクリル酸３−メトキシブチル、メタクリル酸２−アミノエチル、メタクリル酸トリエチレングリコール、２−メタクリロイルオキシプロピルトリメトキシシラン、２−メタクリロイルオキシプロピルジメトキシメチルシラン、メタクリル酸トリフルオロメチル、メタクリル酸ペンタフルオロエチル、メタクリル酸２，２，２−トリフルオロエチル等のメタクリル酸エステル； Methyl methacrylate, ethyl methacrylate, n-butyl methacrylate, isobutyl methacrylate, t-butyl methacrylate, 2-ethylhexyl methacrylate, lauryl methacrylate, tridecyl methacrylate, stearyl methacrylate, cyclohexyl methacrylate, benzyl methacrylate, 2-hydroxyethyl methacrylate, 2-hydroxypropyl methacrylate, N, N-dimethylaminoethyl methacrylate, N, N-diethylaminoethyl methacrylate, glycidyl methacrylate, tetrahydrofurfuryl methacrylate, ethylene glycol dimethacrylate, di Triethylene glycol methacrylate, tetraethylene glycol dimethacrylate, 1,3-butylene glycol dimethacrylate, trimethylol trimethacrylate , Isopropyl methacrylate, pentyl methacrylate, hexyl methacrylate, heptyl methacrylate, octyl methacrylate, 2-ethylhexyl methacrylate, nonyl methacrylate, decyl methacrylate, dodecyl methacrylate, phenyl methacrylate, toluyl methacrylate, methacrylic acid Isobornyl, 2-methoxyethyl methacrylate, 3-methoxybutyl methacrylate, 2-aminoethyl methacrylate, triethylene glycol methacrylate, 2-methacryloyloxypropyltrimethoxysilane, 2-methacryloyloxypropyldimethoxymethylsilane, trimethacrylate Methacrylic acid esters such as fluoromethyl, pentafluoroethyl methacrylate, and 2,2,2-trifluoroethyl methacrylate;

スチレン、α−メチルスチレン、ジビニルベンゼン、ｐ−ヒドロキシスチレン、ｐ−カルボキシスチレン、ｐ−メトキシスチレン、ジエチルアミノスチレン、ジエチルアミノα−メチルスチレン、ｐ−ビニルベンゼンスルホン酸、ｐ−ビニルベンゼンスルホン酸ナトリウム、ｍ，ｍ−ジメチルスチレン等のスチレン系化合物；
エチレン、プロピレン、１−ブテン、１−ヘプテン、１−ヘキセン、１−オクテン、イソブチレン、ブタジエン、イソプレン等の脂肪族末端オレフィン化合物；
フッ化ビニル、臭化ビニル、クロロプレン、塩化ビニリデン等のハロゲン含有オレフィン化合物；アクリルアミド、メタクリルアミド、Ｎ−メチルアクリルアミド、Ｎ−メチルメタクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルメタクリルアミド、Ｎ−ｔ−ブチルアクリルアミド、Ｎ−ｔ−ブチルメタクリルアミド、Ｎ−ｎ−ブチルアクリルアミド、Ｎ−ｎ−ブチルメタクリルアミド、Ｎ−メチロールアクリルアミド、Ｎ−メチロールメタクリルアミド、Ｎ−エチロールアクリルアミド、Ｎ−エチロールメタクリルアミド、アクリロニトリル、メタクリロニトリル、Ｎ−フェニルマレイミド、Ｎ−ブチルマレイミド、４−ビニルピリジン、Ｎ−ビニルピロリドン、Ｎ−ビニルカルバゾール等の窒素含有オレフィン化合物； Styrene, α-methylstyrene, divinylbenzene, p-hydroxystyrene, p-carboxystyrene, p-methoxystyrene, diethylaminostyrene, diethylamino α-methylstyrene, p-vinylbenzenesulfonic acid, sodium p-vinylbenzenesulfonate, m , Styrene compounds such as m-dimethylstyrene;
Aliphatic terminal olefin compounds such as ethylene, propylene, 1-butene, 1-heptene, 1-hexene, 1-octene, isobutylene, butadiene, isoprene;
Halogen-containing olefin compounds such as vinyl fluoride, vinyl bromide, chloroprene, vinylidene chloride; acrylamide, methacrylamide, N-methylacrylamide, N-methylmethacrylamide, N, N-dimethylacrylamide, N, N-dimethylmethacrylamide, Nt-butylacrylamide, Nt-butylmethacrylamide, Nn-butylacrylamide, Nn-butylmethacrylamide, N-methylolacrylamide, N-methylolmethacrylamide, N-ethylolacrylamide, N-ethyl Nitrogen-containing olefin compounds such as roll methacrylamide, acrylonitrile, methacrylonitrile, N-phenylmaleimide, N-butylmaleimide, 4-vinylpyridine, N-vinylpyrrolidone, N-vinylcarbazole

ｐ−ビニル安息香酸、安息香酸ビニル、イタコン酸、無水イタコン酸、α−メチルビニル安息香酸、酢酸ビニル、ブタン酸ビニル、無水マレイン酸、酢酸アリル、安息香酸アリル等のカルボキシ基含有不飽和化合物；
ジアリルアンモニウムクロライド、１，６−ヘプタジエン、２，６−ジシアノ−１，６−ヘプタジエン、及び２，４，４，６−テトラキス（エトキシカルボニル）−１，６−ヘプタジエンのような１，６−ヘプタジエン構造を有する化合物等の環化重合可能な化合物；
ジメチルビニルシラン、トリメチルビニルシラン、ジメチルフェニルビニルシラン、ジメトキシメチルビニルシラン、ジエトキシフェニルビニルシラン、トリメトキシビニルシラン、ペンタメチルビニルジシロキサン、トリメチルアリルシラン、トリメトキシアリルシラン、ジメトキシメチルアリルシラン、ヘプタメチルビニルシクロテトラシロキサン、１，１，３，３−テトラメチルジビニルジシロキサン等のケイ素含有不飽和化合物； Carboxy group-containing unsaturated compounds such as p-vinylbenzoic acid, vinyl benzoate, itaconic acid, itaconic anhydride, α-methylvinylbenzoic acid, vinyl acetate, vinyl butanoate, maleic anhydride, allyl acetate, allyl benzoate;
1,6-heptadiene such as diallylammonium chloride, 1,6-heptadiene, 2,6-dicyano-1,6-heptadiene, and 2,4,4,6-tetrakis (ethoxycarbonyl) -1,6-heptadiene A compound capable of cyclopolymerization, such as a compound having a structure;
Dimethylvinylsilane, trimethylvinylsilane, dimethylphenylvinylsilane, dimethoxymethylvinylsilane, diethoxyphenylvinylsilane, trimethoxyvinylsilane, pentamethylvinyldisiloxane, trimethylallylsilane, trimethoxyallylsilane, dimethoxymethylallylsilane, heptamethylvinylcyclotetrasiloxane, 1,1 Silicon-containing unsaturated compounds such as 1,3,3-tetramethyldivinyldisiloxane;

アリル末端ポリエチレンオキサイド、アリル末端ポリプロピレンオキサイド、アリル末端ポリエチレンオキサイド−ポリプロピレンオキサイド共重合体、ビニル末端ポリエチレンオキサイド、ビニル末端ポリプロピレンオキサイド、ビニル末端ポリエチレンオキサイド−ポリプロピレンオキサイド共重合体、メタリル末端ポリプロピレンオキサイド、ビニル末端ポリテトラメチレンオキサイド、アクリロイル末端ポリアクリル酸、メタクリロイル末端ポリメタクリル酸、アクリロイル末端ポリアクリル酸エステル、アクリロイル末端ポリメタクリル酸エステル、メタクリロイル末端アクリル酸エステル、メタクリロイル末端メタクリル酸エステル、ビニル末端ポリシロキサン、ビニル末端ポリカーボネート、アリル末端ポリカーボネート、ビニル末端ポリエチレンテレフタレート、ビニル末端ポリブチレンテレフタレート、ビニル末端カプロラクタム、ビニル末端ポリアミド、ビニル末端ポリウレタン等の不飽和基含有マクロモノマー等。
これらは、単独で用いてもよく、複数を組み合わせて用いてもよい。 Allyl-terminated polyethylene oxide, allyl-terminated polypropylene oxide, allyl-terminated polyethylene oxide-polypropylene oxide copolymer, vinyl-terminated polyethylene oxide, vinyl-terminated polypropylene oxide, vinyl-terminated polyethylene oxide-polypropylene oxide copolymer, methallyl-terminated polypropylene oxide, vinyl-terminated poly Tetramethylene oxide, acryloyl-terminated polyacrylic acid, methacryloyl-terminated polymethacrylic acid, acryloyl-terminated polyacrylate, acryloyl-terminated polymethacrylate, methacryloyl-terminated acrylate, methacryloyl-terminated methacrylic ester, vinyl-terminated polysiloxane, vinyl-terminated polycarbonate , Allyl-terminated polycarbonate, vinyl Le terminated polyethylene terephthalate, vinyl-terminated polybutylene terephthalate, vinyl terminated caprolactam, vinyl-terminated polyamide, unsaturated group-containing macromonomers such as vinyl terminated polyurethane.
These may be used alone or in combination.

これらのモノマーのうち、特にスチレン、ブタジエン、イソプレン、クロロプレン、塩化ビニリデン、アクリル酸、メタクリル酸、アクリル酸エステル、メタクリル酸エステル、アクリルアミド、メタクリルアミド、アクリロニトリル、及び酢酸ビニルを用いることが好ましい。 Of these monomers, it is particularly preferable to use styrene, butadiene, isoprene, chloroprene, vinylidene chloride, acrylic acid, methacrylic acid, acrylic ester, methacrylic ester, acrylamide, methacrylamide, acrylonitrile, and vinyl acetate.

本発明におけるチオカルボニルチオ基を有する連鎖移動剤は、下記の一般式（１）または（２）で示される化合物からなる群より選択される１種又は２種以上である。
（化１）

（式中、Ｒ^１は炭素数１以上のｐ価の有機基であり、窒素原子、酸素原子、硫黄原子、ハロゲン原子、ケイ素原子、リン原子、及び金属原子のうちの１種又は２種以上を含んでいてもよく、高分子量体であってもよく；Ｚ^１は水素原子、ハロゲン原子、又は炭素数１以上の１価の有機基であり、該１価の有機基は、窒素原子、酸素原子、硫黄原子、ハロゲン原子、ケイ素原子、及びリン原子のうちの１種又は２種以上を含んでいてもよく、高分子量体であってもよく；Ｚ^１が複数個存在する場合には、互いに同一でも異なっていてもよく；ｐは１以上の整数である） The chain transfer agent having a thiocarbonylthio group in the present invention is one or more selected from the group consisting of compounds represented by the following general formula (1) or (2).
(Chemical formula 1)

(In the formula, R ¹ is a p-valent organic group having 1 or more carbon atoms, and one or more of nitrogen atom, oxygen atom, sulfur atom, halogen atom, silicon atom, phosphorus atom, and metal atom) Z ¹ may be a hydrogen atom, a halogen atom, or a monovalent organic group having 1 or more carbon atoms, and the monovalent organic group may be a nitrogen atom, It may contain one or more of oxygen atom, sulfur atom, halogen atom, silicon atom and phosphorus atom, and may be a high molecular weight product; when there are a plurality of Z ¹ May be the same or different; p is an integer of 1 or more)

（化２）

（式中、Ｒ^２は互いに独立して炭素数１以上の１価の有機基であり、窒素原子、酸素原子、硫黄原子、ハロゲン原子、ケイ素原子、リン原子、及び金属原子のうちの１種又は２種以上を含んでいてもよく、高分子量体であってもよく；Ｚ^２は酸素原子（ｑ＝２の場合）、硫黄原子（ｑ＝２の場合）、窒素原子（ｑ＝３の場合）、又は炭素数１以上のｑ価の有機基であり、該ｑ価の有機基は、窒素原子、酸素原子、硫黄原子、ハロゲン原子、ケイ素原子、及びリン原子のうちの１種又は２種以上を含んでいてもよく、高分子量体であってもよく；ｑは２以上の整数である） (Chemical formula 2)

(In the formula, R ² are each independently a monovalent organic group having 1 or more carbon atoms, and one of a nitrogen atom, an oxygen atom, a sulfur atom, a halogen atom, a silicon atom, a phosphorus atom, and a metal atom. Or it may contain 2 or more types and may be a high molecular weight; Z ² is an oxygen atom (when q = 2), a sulfur atom (when q = 2), a nitrogen atom (when q = 3) A q-valent organic group having 1 or more carbon atoms, and the q-valent organic group is one or two of a nitrogen atom, an oxygen atom, a sulfur atom, a halogen atom, a silicon atom, and a phosphorus atom It may contain more than one species and may be a high molecular weight product; q is an integer of 2 or more)

具体的には、トリチオ炭酸エステル、ジチオ脂肪酸エステル若しくはその誘導体、ジチオ安息香酸エステル若しくはその誘導体、ジチオナフトエ酸エステル、テトラチオテレフタル酸エステル又はチオベンゾイルチオアルキルベンゼン等を使用することができる。
トリチオ炭酸エステルとしては、トリチオ炭酸ジベンジル等を挙げることができる。
ジチオ脂肪酸エステル又はその誘導体としては、ジエトキシホスフィニルジチオギ酸ベンジル、ジチオ酢酸エトキシカルボニルメチル、ジチオ酢酸ベンジル等を挙げることができる。
ジチオ安息香酸エステル又はその誘導体としては、ジチオ安息香酸ｔ−ブチル、ジチオ安息香酸１,１,３,３−テトラメチルブチル、ジチオ安息香酸カルボキシメチル、ジチオ安息香酸１−アセトキシエチル、ジチオ安息香酸１−シアノ−１−メチルエチル、ジチオ安息香酸１−エトキシカルボニル−１−メチルエチル、ジチオ安息香酸１−シアノ−１−メチル−３−カルボキシプロピル、ジチオ安息香酸ベンジル、ジチオ安息香酸ｍ−ビニルベンジル、ジチオ安息香酸ｐ−ビニルベンジル、ジチオ安息香酸１−フェニルエチル、ジチオ安息香酸１−メチル−１−フェニルエチル、ジチオ安息香酸１−(ｐ−メトキシフェニル)エチル、ジチオ安息香酸１−(ｐ−クロロフェニル)−１−メチル、ｐ−クロロジチオ安息香酸１−メチル−１−フェニルエチル、トリチオ過安息香酸ｔ−ブチル等を挙げることができる。 Specifically, trithiocarbonate ester, dithio fatty acid ester or derivative thereof, dithiobenzoic acid ester or derivative thereof, dithionaphthoic acid ester, tetrathioterephthalic acid ester, thiobenzoylthioalkylbenzene, or the like can be used.
Examples of the trithiocarbonate include dibenzyl trithiocarbonate.
Examples of the dithio fatty acid ester or derivative thereof include benzyl diethoxyphosphinyl dithioformate, ethoxycarbonylmethyl dithioacetate, and benzyl dithioacetate.
Examples of the dithiobenzoic acid ester or derivatives thereof include t-butyl dithiobenzoate, 1,1,3,3-tetramethylbutyl dithiobenzoate, carboxymethyl dithiobenzoate, 1-acetoxyethyl dithiobenzoate, and dithiobenzoic acid 1. -Cyano-1-methylethyl, 1-ethoxycarbonyl-1-methylethyl dithiobenzoate, 1-cyano-1-methyl-3-carboxypropyl dithiobenzoate, benzyl dithiobenzoate, m-vinylbenzyl dithiobenzoate, P-vinylbenzyl dithiobenzoate, 1-phenylethyl dithiobenzoate, 1-methyl-1-phenylethyl dithiobenzoate, 1- (p-methoxyphenyl) ethyl dithiobenzoate, 1- (p-chlorophenyl) dithiobenzoate ) -1-methyl, 1-methyl-1-phenyl p-chlorodithiobenzoate Examples thereof include ethyl and t-butyl trithioperbenzoate.

ジチオナフトエ酸エステルとしては、ジチオ−１−ナフトエ酸１−メチル−１−フェニルエチル等を挙げることができる。
テトラチオテレフタル酸エステルとしては、テトラチオテレフタル酸ジベンジル等を挙げることができる。
チオベンゾイルチオアルキルベンゼンとしては、１,４−ビス(チオベンゾイルチオメチル)ベンゼン、１,２,４,５−テトラキス(チオベンゾイルチオメチル)ベンゼン、ヘキサキス(チオベンゾイルチオメチル)ベンゼン、１,４−ビス[(１−メチル−１−チオベンゾイルチオ)エチル]ベンゼン等を挙げることができる。
上記の連鎖移動剤は、１種を単独で、あるいは２種以上を組み合わせて用いることができる。 Examples of the dithionaphthoic acid ester include 1-methyl-1-phenylethyl dithio-1-naphthoate.
Examples of the tetrathioterephthalic acid ester include dibenzyl tetrathioterephthalate.
As the thiobenzoylthioalkylbenzene, 1,4-bis (thiobenzoylthiomethyl) benzene, 1,2,4,5-tetrakis (thiobenzoylthiomethyl) benzene, hexakis (thiobenzoylthiomethyl) benzene, 1,4- And bis [(1-methyl-1-thiobenzoylthio) ethyl] benzene.
Said chain transfer agent can be used individually by 1 type or in combination of 2 or more types.

本発明においては、可逆的付加開裂連鎖移動重合の際に、アゾ系重合開始剤を用いることが好ましい。本発明で使用されるアゾ系重合開始剤としては、特に制限はないが、例えば一般式（３）で示される化合物を例示することができる。
（化３）

（式中、Ｒ^３及びＲ^４はそれぞれ独立して炭素数１〜１０のアルキル基、炭素数１〜４のカルボキシ置換アルキル基、置換基を有していてもよいフェニル基を示し、同じ炭素原子に結合しているＲ^３とＲ^４とで脂肪族環を形成していても良く、Ｒ^５はシアノ基、アセトキシ基、カルバモイル基、（炭素数１〜４のアルコキシ）カルボニル基を示す。） In the present invention, an azo polymerization initiator is preferably used in the reversible addition-fragmentation chain transfer polymerization. Although there is no restriction | limiting in particular as an azo polymerization initiator used by this invention, For example, the compound shown by General formula (3) can be illustrated.
(Chemical formula 3)

(Wherein R ³ and R ⁴ each independently represent an alkyl group having 1 to 10 carbon atoms, a carboxy-substituted alkyl group having 1 to 4 carbon atoms, or an optionally substituted phenyl group, and the same carbon R ³ and R ⁴ bonded to an atom may form an aliphatic ring, and R ⁵ represents a cyano group, an acetoxy group, a carbamoyl group, or a (C 1-4 alkoxy) carbonyl group. )

本発明で用いられる一般式（３）のアゾ系重合開始剤において、Ｒ^３、Ｒ^４の炭素数１〜１０のアルキル基としてはメチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基、ヘプチル基、オクチル基、ノニル基、デシル基等が例示できる。また炭素数１〜４のカルボキシ置換アルキル基としては、例えばメチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基等が例示できる。同じ炭素原子に結合しているＲ^３とＲ^４とで形成される脂肪族環としては例えばシクロペンチル基、シクロヘキシル基、シクロヘプチル基、シクロオクチル基等が例示できる。なお、フェニル基には、例えば水酸基、メチル基、エチル基、メトキシ基、エトキシ基、ニトロ基、アミノ基、アセチル基、アセチルアミノ基等の置換基が置換されていてもよい。Ｒ^５の（炭素数１〜４のアルコキシ）カルボニル基としては例えばメトキシカルボニル基、エトキシカルボニル基、プロポキシカルボニル基、イソプロポキシカルボニル基、ブトキシカルボニル基等が例示できる。 In the azo polymerization initiator of the general formula (3) used in the present invention, the alkyl group having 1 to 10 carbon atoms of R ³ and R ⁴ is methyl group, ethyl group, propyl group, isopropyl group, butyl group, pentyl. Group, hexyl group, heptyl group, octyl group, nonyl group, decyl group and the like. Moreover, as a C1-C4 carboxy substituted alkyl group, a methyl group, an ethyl group, a propyl group, an isopropyl group, a butyl group etc. can be illustrated, for example. Examples of the aliphatic ring formed by R ³ and R ⁴ bonded to the same carbon atom include a cyclopentyl group, a cyclohexyl group, a cycloheptyl group, and a cyclooctyl group. The phenyl group may be substituted with a substituent such as a hydroxyl group, a methyl group, an ethyl group, a methoxy group, an ethoxy group, a nitro group, an amino group, an acetyl group, or an acetylamino group. Examples of the (C 1-4 alkoxy) carbonyl group of R ⁵ include methoxycarbonyl group, ethoxycarbonyl group, propoxycarbonyl group, isopropoxycarbonyl group, butoxycarbonyl group and the like.

一般式（３）のアゾ系重合開始剤は、具体的には、２，２’−アゾビス（イソブチロニトリル）、２，２’−アゾビス（２−メチルブチロニトリル）、２，２’−アゾビス（２，４−ジメチルバレロニトリル）、１，１’−アゾビス（１−シクロヘキサンカルボニトリル）、ジメチル−２，２’−アゾビスイソブチレート、４，４’−アゾビス（４−シアノバレリアン酸）、１，１’−アゾビス（１−アセトキシ−１−フェニルエタン）、２，２’−アゾビス（２−メチルブチルアミド）、１，１’−アゾビス（１−シクロヘキサンカルボン酸メチル）等が挙げられる。 Specific examples of the azo polymerization initiator of the general formula (3) include 2,2′-azobis (isobutyronitrile), 2,2′-azobis (2-methylbutyronitrile), 2,2 ′. -Azobis (2,4-dimethylvaleronitrile), 1,1'-azobis (1-cyclohexanecarbonitrile), dimethyl-2,2'-azobisisobutyrate, 4,4'-azobis (4-cyanovalerian) Acid), 1,1'-azobis (1-acetoxy-1-phenylethane), 2,2'-azobis (2-methylbutyramide), 1,1'-azobis (methyl 1-cyclohexanecarboxylate), etc. Can be mentioned.

重合の際に使用される溶剤としては、ヘプタン、オクタン、ミネラルスピリット等の炭化水素系溶剤；酢酸エチル、酢酸ｎ−ブチル、酢酸イソブチル、エチレングリコールモノメチルエーテルアセテート、ジエチレングリコールモノブチルエーテルアセテート等のエステル系溶剤；メチルエチルケトン、メチルイソブチルケトン、ジイソブチルケトン、シクロヘキサノンなどのケトン系溶剤；メタノール、エタノール、イソプロパノール、ｎ−ブタノール、ｓｅｃ−ブタノール、イソブタノール等のアルコール系溶剤；テトラヒドロフラン、ｎ−ブチルエーテル、ジオキサン、エチレングリコールジメチルエーテル、エチレングリコールジエチルエーテル等のエーテル系溶剤；トルエン、キシレン等の芳香族石油系溶剤等の溶剤が挙げられるが、これらに限定されない。これらは単独で用いてもよく、複数を組み合わせて用いてもよい。使用する溶剤の種類及び量については、使用するモノマーの溶解度や濃度、連鎖移動剤や重合開始剤濃度等を考慮して決定される。 Solvents used for polymerization include hydrocarbon solvents such as heptane, octane and mineral spirits; ester solvents such as ethyl acetate, n-butyl acetate, isobutyl acetate, ethylene glycol monomethyl ether acetate, and diethylene glycol monobutyl ether acetate Ketone solvents such as methyl ethyl ketone, methyl isobutyl ketone, diisobutyl ketone and cyclohexanone; alcohol solvents such as methanol, ethanol, isopropanol, n-butanol, sec-butanol and isobutanol; tetrahydrofuran, n-butyl ether, dioxane, ethylene glycol dimethyl ether , Ether solvents such as ethylene glycol diethyl ether; and solvents such as aromatic petroleum solvents such as toluene and xylene , But it is not limited to these. These may be used alone or in combination. The type and amount of the solvent to be used are determined in consideration of the solubility and concentration of the monomer to be used, the concentration of the chain transfer agent and the polymerization initiator, and the like.

ラジカル重合においては、重合開始剤の分解により開始剤ラジカルが発生し、開始剤ラジカルにモノマーが付加することにより、生長ラジカルが生成して重合が開始される。
一般のラジカル重合においては、２個の生長ラジカルが、再結合又は不均化することにより反応して生長が停止し、安定な重合体が生成する。また連鎖移動剤が存在すると、生長ラジカルから連鎖移動剤への連鎖移動が起こり、生長ラジカルは安定なポリマーとなり、発生した連鎖移動剤ラジカルがあらたな重合を開始する。
このように一般のラジカル重合においては、停止反応と移動反応が起こるために、分子量が小さいポリマーが生成し、ポリマーの分子量分布が広くなる。 In radical polymerization, an initiator radical is generated by decomposition of a polymerization initiator, and a monomer is added to the initiator radical, whereby a growth radical is generated and polymerization is started.
In general radical polymerization, two growth radicals react by recombination or disproportionation to stop the growth and produce a stable polymer. When a chain transfer agent is present, chain transfer from the growth radical to the chain transfer agent occurs, the growth radical becomes a stable polymer, and the generated chain transfer agent radical starts a new polymerization.
Thus, in general radical polymerization, since a stop reaction and a transfer reaction occur, a polymer having a small molecular weight is generated, and the molecular weight distribution of the polymer is widened.

これに対し、本発明のRAFT法に用いる連鎖移動剤（チオカルボニルチオ化合物）は、再結合又は不均化による停止反応が起こらない連鎖移動剤である。
（化４）

したがってRAFT法によれば、ポリマーの分子量の制御が可能であり、分子量多分散度が狭いポリマーを調製することができる。 In contrast, the chain transfer agent (thiocarbonylthio compound) used in the RAFT method of the present invention is a chain transfer agent that does not cause a termination reaction due to recombination or disproportionation.
(Chemical formula 4)

Therefore, according to the RAFT method, the molecular weight of the polymer can be controlled, and a polymer having a narrow molecular weight polydispersity can be prepared.

RAFT法にて得られたポリマーのチオカルボニルチオ基を、メルカプト基（−ＳＨ）に変換し、メルカプト末端基を有するポリマーを得る反応は、塩基、酸、及び水素−窒素結合含有化合物よりなる群から選択される１種又は２種以上である処理剤を使用することにより行われる。上記処理剤はアンモニア、沸点１００℃以下の１級アミン化合物及び２級アミン化合物であることが好ましい。 The reaction of converting a thiocarbonylthio group of a polymer obtained by RAFT method into a mercapto group (-SH) to obtain a polymer having a mercapto end group is a group consisting of a base, an acid, and a hydrogen-nitrogen bond-containing compound. It is performed by using the processing agent which is 1 type, or 2 or more types selected from. The treating agent is preferably ammonia, a primary amine compound having a boiling point of 100 ° C. or less, and a secondary amine compound.

金粒子の分散安定性を良くするために、本発明においてポリマーは、水溶性あるいは水に対する親和性が高いポリマーであることが好ましい。
また上記ポリマーは、刺激応答性ポリマーであることが好ましい。
刺激応答性ポリマーとは、温度変化、ｐＨ変化、光照射、電場印加、化学物質の添加等の、刺激の付与（環境変化）に応じて、形状や物性を著しく変える物質である。刺激としては、温度変化及び／又はｐＨ変化を含むことが好ましい。 In order to improve the dispersion stability of the gold particles, the polymer in the present invention is preferably a polymer that is water-soluble or has a high affinity for water.
The polymer is preferably a stimulus responsive polymer.
The stimulus-responsive polymer is a substance that remarkably changes its shape and physical properties according to the application of stimulus (environmental change) such as temperature change, pH change, light irradiation, electric field application, and chemical substance addition. The stimulation preferably includes temperature change and / or pH change.

温度応答性ポリマー鎖を誘導するモノマーとしては、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド等のＮ−アルキル置換アクリルアミド類；（メタ）アクリロイルオキシエチルピロリドン、ビニルメチルエーテル等のビニルエーテル類等が挙げられるが、温度応答能に影響を及ぼさない範囲で、他のビニルモノマーと共重合しても構わない。具体的な例としてはメチル（メタ）アクリレート、エチル（メタ）アクリレート、ブチル（メタ）アクリレート等の（メタ）アクリル酸エステル類；酢酸ビニル、プロピオン酸ビニル等のビニルエステル類；スチレン、塩化ビニル、Ｎ−ビニルピロリドン等のビニル化合物；（メタ）アクリルアミド類等が利用できる。 Examples of the monomer that induces a temperature-responsive polymer chain include N-alkyl-substituted acrylamides such as N-isopropylacrylamide; vinyl ethers such as (meth) acryloyloxyethylpyrrolidone and vinyl methyl ether. It may be copolymerized with other vinyl monomers as long as they do not have an influence. Specific examples include (meth) acrylic acid esters such as methyl (meth) acrylate, ethyl (meth) acrylate, and butyl (meth) acrylate; vinyl esters such as vinyl acetate and vinyl propionate; styrene, vinyl chloride, Vinyl compounds such as N-vinylpyrrolidone; (meth) acrylamides can be used.

ｐＨ応答性ポリマー鎖を誘導するモノマーとしては、（メタ）アクリル酸、スチレンスルホン酸、２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸及びこれらの塩等が挙げられるが、ｐＨ応答能に影響を及ぼさない範囲で、上述のような他のビニルモノマーと共重合可能である。 Examples of the monomer that induces a pH-responsive polymer chain include (meth) acrylic acid, styrenesulfonic acid, 2-acrylamido-2-methylpropanesulfonic acid, and salts thereof, but does not affect the pH response ability. To the extent it can be copolymerized with other vinyl monomers as described above.

〔金粒子表面へのポリマーの固定化〕
上記RAFT法で得られたポリマーは、ＳＨ末端基を有するので金粒子に付着しやすい。
液相系又は気相系において無秩序に互いに相関なく分布していた分子が、ある特定の物質表面を系に共存させるだけで、その表面上に担持され、二次元状に集合して分子一層に成長し、その集合した中で分子全てが同じ配向で表面に沿って広く規則的に並ぶことがある。このように、ある特定の担体表面上で起こるこのような分子の吸着及び分子一層の秩序構造形成の自発的な過程を経て、分子一個分の大きさに相当する厚さで形成される単分子層状の秩序構造体および境界相を自己組織化単分子膜という。本発明においてＳＨ末端基を有するポリマーは、金粒子表面に自己組織化単分子膜を構築する。 [Immobilization of polymer on the surface of gold particles]
Since the polymer obtained by the RAFT method has SH end groups, it easily adheres to gold particles.
Molecules that are randomly distributed in a liquid phase or gas phase system without any correlation are supported on the surface of a specific substance by simply coexisting with the system, and are two-dimensionally assembled into a single molecule. In the aggregate, all the molecules may grow and regularly line up along the surface with the same orientation. Thus, a single molecule formed with a thickness corresponding to the size of one molecule through the spontaneous process of adsorption of such molecules occurring on a specific support surface and formation of an ordered structure of one molecule layer. Layered ordered structures and boundary phases are called self-assembled monolayers. In the present invention, the polymer having SH end groups constructs a self-assembled monolayer on the gold particle surface.

〔ポリマーの他末端へのリガンドの固定化〕
上記ＳＨ末端基を有するポリマーの他末端へのリガンドの固定化方法としては、具体的には以下の方法が挙げられるが、これに限定されない。
ポリマーの末端がアミノ基の場合、アミノ基にグルタルアルデヒドの片方のアルデヒド基を反応させ、もう一方のアルデヒド基にリガンドのアミノ基を反応させ、リガンドを結合させる。
ポリマーの末端が水酸基の場合、水酸基を臭化シアンを用いて活性化する。ここにリガンドのアミノ基を反応させ、リガンドを結合させる。
ポリマーの末端がカルボキシル基の場合、カルボキシル基にＮ-ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）、１-エチル-３-（３-ジメチルアミノプロピル）-カルボジイミドの溶液に浸し、粒子の表面を活性エステル化する。ここにリガンドのアミノ基を反応させ、リガンドを結合させる。
ポリマーの末端がエポキシ基の場合、エポキシ基にリガンドのアミノ基、チオール基、ヒドロキシル基のどれか一つを反応させ、リガンドを結合させる。
ポリマーの末端がチオール基の場合、チオール基にリガンドのチオール基を反応させ、リガンドを結合させる。
なお、ポリマー末端の反応基に、任意の官能基を有する化合物を反応させて、その官能基にリガンドを結合させても良い。またポリマー末端とリガンドの間に任意のスペーサーを使用しても良い。 [Immobilization of ligand to other terminal of polymer]
Specific examples of the method for immobilizing a ligand on the other end of the polymer having an SH end group include the following methods, but are not limited thereto.
When the terminal of the polymer is an amino group, one aldehyde group of glutaraldehyde is reacted with the amino group, the amino group of the ligand is reacted with the other aldehyde group, and the ligand is bound.
When the polymer terminal is a hydroxyl group, the hydroxyl group is activated using cyanogen bromide. Here, the amino group of the ligand is reacted to bind the ligand.
When the terminal of the polymer is a carboxyl group, the surface of the particle is active esterified by immersing the carboxyl group in a solution of N-hydroxysuccinimide (NHS) and 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) -carbodiimide. Here, the amino group of the ligand is reacted to bind the ligand.
When the terminal of the polymer is an epoxy group, any one of the amino group, thiol group and hydroxyl group of the ligand is reacted with the epoxy group to bind the ligand.
When the terminal of the polymer is a thiol group, the thiol group of the ligand is reacted with the thiol group to bind the ligand.
In addition, the compound which has arbitrary functional groups may be made to react with the reactive group of a polymer terminal, and a ligand may be combined with the functional group. Moreover, you may use arbitrary spacers between a polymer terminal and a ligand.

リガンド及び目的物質は、生体成分、薬剤、ウィルス等である。
目的物質と、目的物質に対して特異的親和性を有するリガンドとして具体的には、例えば抗体−抗原が挙げられる。 The ligand and the target substance are biological components, drugs, viruses and the like.
Specific examples of the target substance and the ligand having specific affinity for the target substance include antibody-antigen.

本発明に於いて使用される抗体としては、例えば「免疫実験学入門、第２刷、松橋直ら、（株）学会出版センター、1981」等に記載の方法に準じて、馬、牛、羊、兎、山羊、ラット、マウス等の動物に測定対象を免疫して作製されるポリクローナル性抗体でも、或はまた常法、即ちケラーとミルスタイン（Nature,256巻,495頁,1975）により確立された細胞融合法に従い、マウスの腫瘍ラインからの細胞と測定対象物で予め免疫されたマウスの脾細胞とを融合させて得られるハイブリドーマが産生する単クローン性抗体でも何れにてもよく、これらを単独で或はこれらを適宜組み合わせて用いる等ができる。また、これら抗体は、要すればペプシン，パパイン等の酵素を用いて消化してＦ(ab')₂、Ｆab'、或はＦabとして使用しても良い。 Examples of antibodies used in the present invention include horses, cattle, sheep, and the like according to the method described in “Introduction to Immunological Experiments, Second Printing, Nao Matsuhashi, Society Publishing Center, 1981” and the like. Polyclonal antibodies prepared by immunizing animals such as rabbits, goats, rats and mice, or established by conventional methods, namely Keller and Milstein (Nature, 256, 495, 1975). According to the cell fusion method, any monoclonal antibody produced by a hybridoma obtained by fusing a cell from a mouse tumor line with a spleen cell of a mouse previously immunized with a measurement target may be used. These can be used alone or in appropriate combinations thereof. In addition, these antibodies may be used as F (ab ′) ₂ , Fab ′, or Fab after digestion with an enzyme such as pepsin or papain, if necessary.

具体的に抗体としては、抗インフルエンザウイルス抗体、抗アデノウイルス抗体、抗ＲＳウイルス抗体、抗ＨＡＶ抗体、抗ＨＢｃ抗体、ＨＣＶ抗体、抗ＨＩＶ抗体、抗ＥＢＶ抗体、抗ＮＬＶノーウォーク様ウィルス抗体等のウィルス抗体、抗クラミジア・トラコマティス抗体、抗溶連菌抗体、抗百日咳菌抗体、抗ヘリコバクター・ピロリ抗体、抗レプトスピラ抗体、抗トレポネーマ・パリダム抗体、抗トキソプラズマ・ゴンディ抗体、抗ボレリア抗体、抗炭疽菌抗体、抗ＭＲＳＡ抗原等の細菌抗体、抗マイコプラズマ脂質抗体、抗大腸菌抗体、抗サルモネラ抗体、抗ブドウ球菌抗体、抗カンピロバクター抗体、抗ウェルシュ菌抗体、抗腸炎ビブリオ菌抗体、抗ベロトキシン抗体、抗ヒトトランスフェリン抗体、抗ヒトアルブミン抗体、抗ヒト免疫グロブリン抗体、抗マイクログロブリン抗体、抗ＣＲＰ抗体、抗トロポニン抗体、抗ＨＣＧ抗体、抗クラミジア・トラコマティス抗体、抗ストレプトリジンＯ抗体、抗ヘリコバクター・ピロリ抗体、抗β−グルカン抗体、抗ＨＢｅ抗体、抗ＨＢｓ抗体、抗アデノウイルス抗体、抗ＨＩＶ抗体、抗ロタウイルス抗体、抗パルボウイルス抗体、抗ＲＳウイルス抗体、抗ＲＦ抗体、あるいは、ヒト繊毛製ゴナドトロピン等のペプチドホルモン、ステロイドホルモン等のステロイド、エピネフリンやモルヒネ等の生理活性アミン類、ビタミンＢ類等のビタミン類、プロスタングランジン類、テトラサイクリン等の抗生物質、細菌等が産生する毒素、各種腫瘍マーカー、農薬などに対する抗体、または、病原微生物に由来する核酸成分に相補的なヌクレオチド等を挙げることができるが、これらに限定されない。 Specific examples of antibodies include anti-influenza virus antibodies, anti-adenovirus antibodies, anti-RS virus antibodies, anti-HAV antibodies, anti-HBc antibodies, HCV antibodies, anti-HIV antibodies, anti-EBV antibodies, and anti-NLV norwalk-like virus antibodies. Virus antibody, anti-Chlamydia trachomatis antibody, anti-streptococcal antibody, anti-pertussis antibody, anti-helicobacter pylori antibody, anti-leptospira antibody, anti-treponema paridum antibody, anti-toxoplasma gondii antibody, anti-borrelia antibody, anti-anthrax antibody, Bacterial antibodies such as anti-MRSA antigens, anti-mycoplasma lipid antibodies, anti-E. Coli antibodies, anti-Salmonella antibodies, anti-staphylococcal antibodies, anti-Campylobacter antibodies, anti-C. Perfringens antibodies, anti-V. Enteritis antibodies, anti-verotoxin antibodies, anti-human transferrin antibodies Anti-human albumin antibody, anti-human Epidemic globulin antibody, anti-microglobulin antibody, anti-CRP antibody, anti-troponin antibody, anti-HCG antibody, anti-Chlamydia trachomatis antibody, anti-streptolysin O antibody, anti-Helicobacter pylori antibody, anti-β-glucan antibody, anti-HBe antibody, Anti-HBs antibody, anti-adenovirus antibody, anti-HIV antibody, anti-rotavirus antibody, anti-parvovirus antibody, anti-RS virus antibody, anti-RF antibody, peptide hormones such as human cilia gonadotropin, steroids such as steroid hormones, epinephrine Bioactive amines such as morphine, vitamins such as vitamin B, antibiotics such as prostaglandins, tetracycline, toxins produced by bacteria, various tumor markers, antibodies against pesticides, or pathogenic microorganisms Nuclei complementary to the nucleic acid component Although a leotide etc. can be mentioned, it is not limited to these.

図１に本発明の修飾金粒子１０の一例を示す。これは金粒子１２表面に、温度応答性ポリマー１４をメルカプト末端基により固定化させ、該ポリマーの他末端にリガンド１６を固定化させているものである。温度応答性ポリマーは、水素結合性部分を有し，水分子がポリマー鎖のまわりに強く付着し、その結果室温において水に溶解している。しかし、温度を上げると水素結合が切断され、水と相分離し縮んでしまう。このような現象を下限臨界溶解現象といい、相分離を起こす温度を下限臨界溶解温度(Lower Critical Solution Temperature :LCST)と言う。
例えば、側鎖としてアミド基とイソプロピル基を有するポリ-N-イソプロピルアクリルアミド(ＰＮＩＰＡＭ)のLCSTは32℃付近である。32℃以下ではアミド結合部分がより多くの水を抱え込もうとするので溶解(水和)する。一方32℃以上では、イソプロピル基による結合の方が強くなり、水を弾き出すので凝集(脱水和)する。よって、水中において32℃以下で溶解、32℃以上で凝集する特徴を持っている。 FIG. 1 shows an example of the modified gold particle 10 of the present invention. In this method, the temperature-responsive polymer 14 is immobilized on the surface of the gold particle 12 with mercapto end groups, and the ligand 16 is immobilized on the other end of the polymer. Temperature responsive polymers have hydrogen bonding moieties and water molecules adhere strongly around the polymer chain, resulting in dissolution in water at room temperature. However, when the temperature is raised, the hydrogen bond is broken and the phase is separated from water and contracts. Such a phenomenon is called a lower critical solution temperature, and a temperature causing phase separation is called a lower critical solution temperature (LCST).
For example, the LCST of poly-N-isopropylacrylamide (PNIPAM) having an amide group and an isopropyl group as side chains is around 32 ° C. At 32 ° C or lower, the amide bond portion dissolves (hydrates) because it tries to hold more water. On the other hand, at 32 ° C. or higher, the isopropyl group bond becomes stronger and flocculates (dehydrates) because it ejects water. Therefore, it has the characteristic of dissolving in water at 32 ° C. or lower and aggregating at 32 ° C. or higher.

本発明における目的物質の検出方法は、上記修飾金粒子と、測定対象試料とを溶液中で混合し、リガンドが目的物質と特異的に結合した時にのみ形成される凝集体の有無により検出する方法である。
具体的には、上記修飾金粒子と、測定対象試料（例えば血液、血漿、血清、髄液、尿、糞便等の生体由来の試料やこれらを適宜緩衝液等で希釈したもの等）とを混合し、その結果生ずる特異的反応に起因する金コロイド粒子の吸光度変化を測定し、その結果を、予め作成しておいた金コロイド粒子の吸光度変化と測定対象物質量との関係を表わす検量線に当てはめる等することにより、容易に実施し得る。 The target substance detection method in the present invention is a method in which the modified gold particles and the sample to be measured are mixed in a solution and detected based on the presence or absence of an aggregate formed only when the ligand specifically binds to the target substance. It is.
Specifically, the modified gold particles are mixed with a sample to be measured (for example, a sample derived from a living body such as blood, plasma, serum, cerebrospinal fluid, urine, stool, etc., or a product obtained by diluting these appropriately with a buffer solution). Then, the change in absorbance of the colloidal gold particles due to the specific reaction that occurs as a result is measured, and the result is used as a calibration curve representing the relationship between the change in absorbance of colloidal gold particles and the amount of the substance to be measured. It can be easily carried out by applying it.

特にポリマーとして刺激応答性ポリマーを使用した場合には、目的物質と結合後に刺激を与えることにより凝集が生じるため、容易に目的物質あるいは金粒子を回収することができる。
本発明について以下に実施例を挙げてさらに詳述するが、本発明はこれにより何ら限定されるものではない。配合量は特記しない限り、その成分が配合される系に対する質量％で示す。 In particular, when a stimuli-responsive polymer is used as the polymer, aggregation occurs due to stimulation after binding to the target substance, so that the target substance or gold particles can be easily recovered.
The present invention will be described in more detail with reference to the following examples, but the present invention is not limited thereto. Unless otherwise specified, the blending amount is expressed in mass% with respect to the system in which the component is blended.

I．金コロイドの調製
塩化金酸(61.74mg、0.15mmol)を283mLの水に溶解し、110℃で15分間還流した(三口フラスコ使用)。その後、クエン酸三ナトリウム(177.27mg、0.6mmol)を溶解した水溶液15mLを加え、約10分間加熱した。反応後、室温で放冷した。 I. Preparation of gold colloid Chloroauric acid (61.74 mg, 0.15 mmol) was dissolved in 283 mL of water and refluxed at 110 ° C. for 15 minutes (using a three-necked flask). Thereafter, 15 mL of an aqueous solution in which trisodium citrate (177.27 mg, 0.6 mmol) was dissolved was added and heated for about 10 minutes. After the reaction, it was allowed to cool at room temperature.

II．メルカプト末端基（−ＳＨ）を有するポリマーの合成
（１）ＲＡＦＴ法によるｐＮＩＰＡＭ-ＣＯＯＮａの合成
末端にカルボン酸ナトリウムを持つポリ(Ｎ-イソプロピルアクリルアミド)は、連鎖移動剤に１-フェニルジチオアセテートｐ-エチルベンゾイックアッシドのナトリウム塩(ＰＤＰＥＢＮａ)、開始剤に２、２'-アゾビス(４-メトキシ-２、４-ジメチルバレロニトリル)(Ｖ-７０)を用いて、Ｎ-イソプロピルアクリルアミド(ＮＩＰＡＭ)をＲＡＦＴ重合することで得られる。
まず、以下の表１のように試薬を計量した。
（表１）
M.W Weight mmol mol ratio
ＮＩＰＡＭ 113.16 2.502(g) 0.0221 149.2
ＰＤＰＥＢＮａ 338.44 50.17(mg) 0.1482 1.000
Ｖ-７０ 308.42 9.66(mg) 0.0313 0.211
メタノール 36.07 15.459(g) ---- ---- II. Synthesis of a polymer having a mercapto end group (-SH) (1) Synthesis of pNIPAM-COONa by RAFT method Poly (N-isopropylacrylamide) having sodium carboxylate at its terminal is 1-phenyldithioacetate p- N-isopropylacrylamide (NIPAM) using sodium salt of ethyl benzoic acid (PDPEBNa), 2,2′-azobis (4-methoxy-2,4-dimethylvaleronitrile) (V-70) as initiator Can be obtained by RAFT polymerization.
First, the reagents were weighed as shown in Table 1 below.
(Table 1)
MW Weight mmol mol ratio
NIPAM 113.16 2.502 (g) 0.0221 149.2
PDPEBNa 338.44 50.17 (mg) 0.1482 1.000
V-70 308.42 9.66 (mg) 0.0313 0.211
Methanol 36.07 15.459 (g) ---- ----

計量したＮＩＰＡＭ、ＰＤＰＥＢＮａ及びＶ-７０をメタノールに溶解し、ナスフラスコに入れた（表１）。アルゴン置換を30分間行った後、50℃のオイルバス上で12時間反応させた。反応後、メタノールをエバポレートして適度に除き、良溶媒にメタノール、貧溶媒にエーテルを用いた再沈殿法にて未反応のモノマーを除去した。この操作は２回行った。収量は0.6567g、収量から求めた転換率は26.2％であった。 Weighed NIPAM, PDPEBNa and V-70 were dissolved in methanol and placed in an eggplant flask (Table 1). After carrying out argon substitution for 30 minutes, it was made to react on a 50 degreeC oil bath for 12 hours. After the reaction, methanol was evaporated and removed appropriately, and unreacted monomers were removed by a reprecipitation method using methanol as a good solvent and ether as a poor solvent. This operation was performed twice. The yield was 0.6567 g, and the conversion rate determined from the yield was 26.2%.

（化５）

(Chemical formula 5)

得られたポリマーの分子量と展開溶媒をＴＨＦとしたＧＰＣの結果を表２及び図２に示す。
（表２）
数平均分子量重量平均分子量多分散度
ＭｎＭｗＭｗ/Ｍｎ
11066 11955 1.08 Table 2 and Fig. 2 show the molecular weight of the obtained polymer and the results of GPC using THF as the developing solvent.
(Table 2)
Number average molecular weight Weight average molecular weight Polydispersity
Mn Mw Mw / Mn
11066 11955 1.08

（２）ｐＮＩＰＡＭ-ＣＯＯＮａの末端チオール化
ｐＮＩＰＡＭ-ＣＯＯＮａのジチオエステルをエタノールアミンで分解してチオール化し、ＨＳ-ＰＮＩＰＡＭ-ＣＯＯＮａを得る。
ｐＮＩＰＡＭ-ＣＯＯＮａ（559.0mg）を水／ＴＨＦ＝１／９（v／v）の混合溶媒に溶解し、濃度を50mg／Lとした。アルゴン置換を30分間行った後、エタノールアミンを加えた。撹拌しながら１時間反応させた。反応後、溶媒をエバポレートして適度に除き、貧溶媒にエーエルを用いた再沈殿法によりポリマーを回収した（収量450.2mg）。 (2) Terminal thiolation of pNIPAM-COONa The dithioester of pNIPAM-COONa is decomposed with ethanolamine to thiolate to obtain HS-PNIPAM-COONa.
pNIPAM-COONa (559.0 mg) was dissolved in a mixed solvent of water / THF = 1/9 (v / v) to a concentration of 50 mg / L. After replacing with argon for 30 minutes, ethanolamine was added. The reaction was allowed to proceed for 1 hour with stirring. After the reaction, the solvent was evaporated to remove it appropriately, and the polymer was recovered by a reprecipitation method using an air as a poor solvent (yield 450.2 mg).

（化６）

(Chemical formula 6)

得られたポリマーの分子量と展開溶媒をＴＨＦとしたＧＰＣの結果を表３及び図３に示す。
（表３）
数平均分子量重量平均分子量多分散度
ピークNo. ＭｎＭｗＭｗ/Ｍｎ
１ 20144 20327 1.009
２ 10577 11633 1.1
ＡＬＬ 12160 14017 1.153
高分子量側（ピークNo.1）にＨＳ-ｐＮＩＰＡＭ-ＣＯＯＮａがジスルフィド結合により二量体（（-S-ｐＮＩＰＡＭ-ＣＯＯＮａ）_２）を形成したと考えられるピークが見られた。 The molecular weight of the obtained polymer and the result of GPC using THF as the developing solvent are shown in Table 3 and FIG.
(Table 3)
Number average molecular weight Weight average molecular weight Polydispersity
Peak No. Mn Mw Mw / Mn
1 20144 20327 1.009
2 10577 11633 1.1
ALL 12160 14017 1.153
On the high molecular weight side (peak No. 1), a peak was considered that HS-pNIPAM-COONa formed a dimer ((-S-pNIPAM-COONa) ₂ ) by a disulfide bond.

（３）ジスルフィド結合の切断
上述のようにして得られたＨＳ-ｐＮＩＰＡＭ-ＣＯＯＮａには、二量体（-Ｓ-ｐＮＩＰＡＭ-ＣＯＯＮａ）_２が含まれていたので、ＤＬ-ジチオトレイトール（ＤＴＴ）を用いてジスルフィド結合を切断することにした。まず、以下の表４のように試薬を計量した。
（表４）
M.W. 質量(mg) mmol mol ratio
(-S-pNIPAM-COONa)_２ 20144 436.1 0.022 1
ＤＴＴ 154.25 268.7 1.742 80.46
ＤＭＦ 72.11 3437.5 ---- ---- (3) Disulfide bond cleavage Since HS-pNIPAM-COONa obtained as described above contained a dimer (-S-pNIPAM-COONa) ₂ , DL-dithiothreitol (DTT) Was used to cleave disulfide bonds. First, the reagents were weighed as shown in Table 4 below.
(Table 4)
MW Mass (mg) mmol mol ratio
(-S-pNIPAM-COONa) ₂ 20144 436.1 0.022 1
DTT 154.25 268.7 1.742 80.46
DMF 72.11 3437.5 ---- ----

計量した（-Ｓ-ｐＮＩＰＡＭ-ＣＯＯＮａ）_２、ＤＴＴをＤＭＦに溶解しナスフラスコに入れた（（-Ｓ-ｐＮＩＰＡＭ-ＣＯＯＮａ）_２：100mg／L）。アルゴン置換を１時間行った後、60℃のオイルバス上で48時間反応させた。反応後、200mLのエーテルで再沈殿法により回収した。回収したポリマーをメタノールに溶解し、200mLのエーテルで再沈殿法により回収した。収量は270mgであった。 Weighed (-S-pNIPAM-COONa) ₂ , DTT was dissolved in DMF and placed in an eggplant flask ((-S-pNIPAM-COONa) ₂ : 100 mg / L). After carrying out argon substitution for 1 hour, it was made to react on a 60 degreeC oil bath for 48 hours. After the reaction, it was recovered by reprecipitation with 200 mL of ether. The recovered polymer was dissolved in methanol and recovered by reprecipitation with 200 mL of ether. Yield was 270 mg.

（化５）

(Chemical formula 5)

得られたＨＳ-ＰＮＩＰＡＭ-ＣＯＯＮａのＧＰＣ測定と１Ｈ-ＮＭＲ測定（solvent：Ｄ_２Ｏ）を行った。結果を表５と図４に示す。
（表５）
数平均分子量重量平均分子量多分散度
ＭｎＭｗＭｗ/Ｍｎ
10977 11724 1.068
二量体のジスルフィド結合が切断されたことが確認された。 The obtained HS-PNIPAM-COONa was subjected to GPC measurement and 1H-NMR measurement (solvent: D ₂ O). The results are shown in Table 5 and FIG.
(Table 5)
Number average molecular weight Weight average molecular weight Polydispersity
Mn Mw Mw / Mn
10977 11724 1.068
It was confirmed that the dimer disulfide bond was cleaved.

（４）ＨＳ-ｐＮＩＰＡＭ-ＣＯＯＨ水溶液の調製
（３）で得られたＨＳ-ｐＮＩＰＡＭ-ＣＯＯＮａ（1.12mg）をイオン交換水に溶解して０．９７８３８ｇ／Ｌのポリマー水溶液を調製した。この水溶液に１ＭＨＣｌを加えてｐＨを４に調製した。 (4) Preparation of HS-pNIPAM-COOH aqueous solution HS-pNIPAM-COONa (1.12 mg) obtained in (3) was dissolved in ion-exchanged water to prepare a 0.97838 g / L aqueous polymer solution. The pH was adjusted to 4 by adding 1 M HCl to this aqueous solution.

III．金粒子表面へのＨＳ-ｐＮＩＰＡＭ-ＣＯＯＨの固定化
Iで得られた金コロイド溶液6g、IIで得られたポリマー水溶液15.0g、イオン交換水9.0gをスクリュー管で混合した。混合後のｐＨは５．０であった。得られた金コロイド溶液中の金濃度は0.1mM、ポリマー濃度は500mg／L、クエン酸三ナトリウム濃度は0.4mMであった。 III. Immobilization of HS-pNIPAM-COOH on the surface of gold particles
6 g of the colloidal gold solution obtained in I, 15.0 g of the aqueous polymer solution obtained in II, and 9.0 g of ion-exchanged water were mixed with a screw tube. The pH after mixing was 5.0. The gold colloid solution obtained had a gold concentration of 0.1 mM, a polymer concentration of 500 mg / L, and a trisodium citrate concentration of 0.4 mM.

IV．ウシアルブミン抗体の固定化
未反応のＨＳ-ｐＮＩＰＡＭ-ＣＯＯＨを取り除くため、作製した金コロイド溶液1mLを遠心力加速度400,000g、1時間遠心した後上清を取り除いた。さらにイオン交換水1mLを加えて超音波処理を行った後、遠心力加速度400,000g、1時間遠心した後上清を取り除き、この操作を3回行った。次にカルボキシル基の活性化試薬であるNHS（N-hydroxysuccinimide：イオン交換水で11.5mg/mLに希釈）を100μlとEDC（1-Ethyl-3-(3-dimethylamino propyl)-carbodiimide hydrochloride：イオン交換水で75.0mg/mLに希釈）を100μl加えて、1時間反応させた。未反応のNHS、EDCを取り除くため、金コロイド溶液1mLを遠心力加速度400,000g、1時間遠心した後上清を取り除いた。さらにイオン交換水1mLを加えて超音波処理を行った後、遠心力加速度400,000g、1時間遠心した後上清を取り除き、この操作を3回行った。次に抗ウシアルブミン抗体（PBSで1mg/mLに希釈）を100μl加えて、1時間反応させた。未反応の抗ウシアルブミン抗体を取り除くため、金コロイド溶液1mLを遠心力加速度400,000g、1時間遠心した後上清を取り除いた。さらにイオン交換水1mLを加えて超音波処理を行った後、遠心力加速度400,000g、1時間遠心した後上清を取り除き、この操作を3回行った。最後にイオン交換水を加えて1mLの抗体感作金コロイド溶液とした。 IV. Immobilization of bovine albumin antibody In order to remove unreacted HS-pNIPAM-COOH, 1 mL of the prepared colloidal gold solution was centrifuged for 1 hour at a centrifugal force acceleration of 400,000 g, and then the supernatant was removed. Further, 1 mL of ion exchange water was added and sonication was performed, followed by centrifugation for 1 hour at a centrifugal force acceleration of 400,000 g, and then the supernatant was removed, and this operation was performed 3 times. Next, NHS (N-hydroxysuccinimide: diluted to 11.5 mg / mL with ion-exchanged water), which is a carboxyl group activation reagent, is 100 μl and EDC (1-Ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) -carbodiimide hydrochloride: ion-exchange 100 μl of the mixture was diluted to 75.0 mg / mL with water) and reacted for 1 hour. In order to remove unreacted NHS and EDC, 1 mL of the gold colloid solution was centrifuged at 400,000 g for 1 hour with a centrifugal force acceleration, and then the supernatant was removed. Further, 1 mL of ion exchange water was added and sonication was performed, followed by centrifugation for 1 hour at a centrifugal force acceleration of 400,000 g, and then the supernatant was removed, and this operation was performed 3 times. Next, 100 μl of anti-bovine albumin antibody (diluted to 1 mg / mL with PBS) was added and allowed to react for 1 hour. In order to remove the unreacted anti-bovine albumin antibody, 1 mL of the gold colloid solution was centrifuged for 1 hour at a centrifugal force acceleration of 400,000 g, and then the supernatant was removed. Further, 1 mL of ion exchange water was added and sonication was performed, followed by centrifugation for 1 hour at a centrifugal force acceleration of 400,000 g, and then the supernatant was removed, and this operation was performed 3 times. Finally, ion exchange water was added to make 1 mL of antibody-sensitized gold colloid solution.

各濃度に調製されたウシアルブミンを10μlと抗体感作金コロイド溶液100μlを96ウェルプレート上で混合し、8時間後の各濃度におけるΔA（=A₀-A）／Aの値をプロットしたグラフを図５に示す。Aはλ=523nmでの吸光度、A₀はウシアルブミンの濃度が0μg／mlの時のλ=523nmでの吸光度である。
※他のポリマー（多分散度1.2を超えるもの）を使用した場合との比較。 A graph in which 10 μl of bovine albumin prepared at each concentration and 100 μl of antibody-sensitized gold colloid solution were mixed on a 96-well plate, and ΔA (= A ₀ -A) / A values at each concentration after 8 hours were plotted Is shown in FIG. A is the absorbance at λ = 523 nm, and A ₀ is the absorbance at λ = 523 nm when the concentration of bovine albumin is ₀ μg / ml.
* Comparison with using other polymers (polydispersity exceeding 1.2).

抗体感作金コロイド溶液1mLを40℃、10分加熱すると青色の凝集物が得られた。この凝集物を取り出し、イオン交換水1mLに入れて超音波処理を行い、凝集物を溶解させた。この金コロイド溶液を遠心力加速度400,000g、1時間遠心した後上清を取り除いた。さらにグリシン−塩酸緩衝液（0.2M、pH2.0）1mLを加えて超音波処理を行った後、遠心力加速度400,000g、1時間遠心した後上清を取り除いた。さらにイオン交換水1mLを加えて超音波処理を行った後、遠心力加速度400,000g、1時間遠心した後上清を取り除き、この操作を3回行った。最後にMQ水1mLを加えて超音波処理を行い、再生金コロイド溶液が得られた。 When 1 mL of antibody-sensitized gold colloid solution was heated at 40 ° C. for 10 minutes, blue aggregates were obtained. The aggregate was taken out, placed in 1 mL of ion exchange water and subjected to ultrasonic treatment to dissolve the aggregate. The gold colloid solution was centrifuged for 1 hour at a centrifugal force acceleration of 400,000 g, and then the supernatant was removed. Further, 1 mL of glycine-hydrochloric acid buffer solution (0.2 M, pH 2.0) was added and sonicated, and then centrifuged at 400,000 g for 1 hour, and then the supernatant was removed. Further, 1 mL of ion exchange water was added and sonication was performed, followed by centrifugation for 1 hour at a centrifugal force acceleration of 400,000 g, and then the supernatant was removed, and this operation was performed 3 times. Finally, 1 mL of MQ water was added and sonicated to obtain a regenerated gold colloid solution.

各濃度に調製されたウシアルブミンを10μlと再生抗体感作金コロイド溶液100μlを96ウェルプレート上で混合し、8時間後の各濃度におけるΔA（=A₀-A）／Aの値をプロットしたグラフを図６に示す。Aはλ=523nmでの吸光度、A₀はウシアルブミンの濃度が0μg／mlの時の吸光度である。
以上のように、ポリマーとして、重量平均分子量／数平均分子量で規定される分子量多分散度が１〜１.２であるポリマーを用いることにより、本発明の修飾金粒子は、目的物質の精度の高い検出が可能であることが確認された。 10 μl of bovine albumin prepared at each concentration and 100 μl of regenerated antibody-sensitized gold colloid solution were mixed on a 96-well plate, and values of ΔA (= A ₀ -A) / A at each concentration after 8 hours were plotted. A graph is shown in FIG. A is the absorbance at λ = 523 nm, and A ₀ is the absorbance when the concentration of bovine albumin is ₀ μg / ml.
As described above, by using a polymer having a molecular weight polydispersity defined by weight average molecular weight / number average molecular weight of 1 to 1.2 as the polymer, the modified gold particles of the present invention have the accuracy of the target substance. It was confirmed that high detection was possible.

本発明の修飾金粒子の一例を示した図である。It is the figure which showed an example of the modified gold particle of this invention. 実施例工程AにおけるGPCチャートを示した図である。FIG. 6 is a diagram showing a GPC chart in an example process A. 実施例工程BにおけるGPCチャートを示した図である。FIG. 6 is a diagram showing a GPC chart in an example process B. 実施例工程CにおけるGPCチャート及び¹H-NMRを示した図である。FIG. 4 is a diagram showing a GPC chart and ¹ H-NMR in Example Process C. 各濃度のウシアルブミン液と抗体感作金コロイド液との混合液のΔA／A[ΔA=A₀-A、Aは523nm吸光度、A₀はウシアルブミン濃度0μg／mlの時の523nm吸光度]の値をプロットした図である。ΔA / A [ΔA = A ₀ -A, A is 523 nm absorbance, A ₀ is 523 nm absorbance when the bovine albumin concentration is ₀ μg / ml] of the mixed solution of bovine albumin solution and antibody-sensitized gold colloid solution of each concentration It is the figure which plotted the value. 各濃度のウシアルブミン液と再生抗体感作金コロイド液との混合液のΔA／A[ΔA=A₀-A、Aは523nm吸光度、A₀はウシアルブミン濃度0μg／mlの時の523nm吸光度]の値をプロットした図である。ΔA / A [ΔA = A ₀ -A, A is 523 nm absorbance, A ₀ is 523 nm absorbance at a bovine albumin concentration of ₀ μg / ml] of a mixed solution of bovine albumin solution at each concentration and regenerated antibody-sensitized gold colloid solution It is the figure which plotted the value of.

符号の説明Explanation of symbols

１０修飾金粒子
１２金粒子
１４温度応答性ポリマー
１６リガンド 10 modified gold particles 12 gold particles 14 temperature-responsive polymer 16 ligand

Claims

金粒子表面に、重量平均分子量／数平均分子量で規定される分子量多分散度が１〜１.２であるポリマーをメルカプト末端基により固定化させ、該ポリマーの他末端に、目的物質に対して特異的親和性を有するリガンドを固定化させたことを特徴とする修飾金粒子。 A polymer having a molecular weight polydispersity defined by weight average molecular weight / number average molecular weight of 1 to 1.2 is immobilized on the gold particle surface by a mercapto end group, and the other end of the polymer is attached to the target substance. A modified gold particle, wherein a ligand having specific affinity is immobilized.

ポリマーが刺激応答性ポリマーであることを特徴とする請求項１に記載の修飾金粒子。 The modified gold particle according to claim 1, wherein the polymer is a stimulus-responsive polymer.

下記（Ａ）〜（Ｃ）工程を含むことを特徴とする修飾金粒子の製造方法。
（Ａ）ラジカル重合性モノマーを、チオカルボニルチオ基を有する連鎖移動剤の存在下で、可逆的付加開裂連鎖移動重合させて、チオカルボニルチオ基を有するポリマーを得、
該ポリマーのチオカルボニルチオ基を、メルカプト基に変換し、メルカプト末端基を有するポリマーを得る工程。
（Ｂ）（Ａ）工程で得られたメルカプト末端基を有するポリマーと、金粒子とを溶媒中で混合し、金粒子表面にメルカプト末端基によりポリマーを固定化する工程。
（Ｃ）前記ポリマーの他末端に、目的物質に対して特異的親和性を有するリガンドを結合させる工程。 A method for producing modified gold particles, comprising the following steps (A) to (C):
(A) A radically polymerizable monomer is subjected to reversible addition-cleavage chain transfer polymerization in the presence of a chain transfer agent having a thiocarbonylthio group to obtain a polymer having a thiocarbonylthio group,
A step of converting a thiocarbonylthio group of the polymer into a mercapto group to obtain a polymer having a mercapto end group.
(B) A step of mixing the polymer having a mercapto end group obtained in the step (A) and gold particles in a solvent, and immobilizing the polymer on the gold particle surface with the mercapto end group.
(C) A step of binding a ligand having specific affinity for the target substance to the other end of the polymer.

請求項１又は２に記載の修飾金粒子と、測定対象試料とを溶液中で混合し、リガンドが目的物質と特異的に結合した時にのみ形成される凝集体の有無により目的物質を検出する方法。 A method for detecting a target substance based on the presence or absence of an aggregate formed by mixing the modified gold particle according to claim 1 or 2 and a sample to be measured in a solution, and a ligand specifically binds to the target substance. .

請求項２に記載の修飾金粒子と、測定対象試料とを溶液中で混合後、刺激を与えることにより修飾金粒子を凝集させ、金粒子及び／又は目的物質を分離回収する方法。 A method for separating and recovering gold particles and / or a target substance by mixing the modified gold particles according to claim 2 and a sample to be measured in a solution and then aggregating the modified gold particles by applying a stimulus.