JP2006527584A - プロテアーゼ - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、プロテアーゼ活性を有し、そしてノカルジオプシス プロテアーゼに対して相同である単離されたポリペプチド、及びそれをコードする単離された核酸配列に関する。さらに、本発明は、それらの核酸配列を含んで成る、核酸構造体、ベクター及び宿主細胞、例えばトランスジェニック植物及び非ヒト動物、及びプロテアーゼの生成方法及び特に動物飼料内へのプロテアーゼの使用方法に関する。
本発明のプロテアーゼは、高い比活性を有する。ペプチダーゼファミリーS2A又はS1Eのプロテアーゼの高い比活性のために適切な特徴的構造特徴が開示されている。
ノカルジオプシスsp. NRRL 18262及びノカルジオプシス・ダソンビレイNRRL18133由来のプロテアーゼは、WO88/03947号に開示されている。ノカルジオプシスsp. NRRL18262由来のプロテアーゼのDNA及びアミノ酸配列は、デンマーク出願番号199600013号に示されている。WO01/58276号は、ノカルジオプシスsp. NRRL18262由来のプロテアーゼに関連する酸−安定性プロテアーゼの動物飼料への使用、及びノカルジオプシス・アルバDSM14010由来のプロテアーゼを開示する。しかしながら、それらのプロテアーゼは、低い比活性を有する。
DD20043218号は、ノカルジオプシス・ダソンビレイ株ZIMET43647由来のタンパク質分解調製物を開示するが、しかしながら配列情報は存在しない。前記株は、もはや入手できないと思われる。
本発明の最初の出願日後に公開されたJP2003284571-A号は、ノカルジオプシスsp.TOA-1(FERM P-18676)由来のプロテアーゼのアミノ酸配列及びその対応するDNA配列を開示する。前記配列は、ADF43564としてGENESEQPに入力されている。
特に、動物飼料及び/又は洗剤への使用のための可能性を有する、ノカルジオプシスプロテアーゼに対して相同の高い比活性のプロテアーゼを供給することが、本発明の目的である。
高い比活性のプロテアーゼ、すなわちノカレジオプシス・アルバDSM15647の由来のプロテアーゼ(配列番号1及び2を参照のこと)、及びノカルジオプシス・ダソンビレイ亜種ダソンビレイDSM43235由来のプロテアーゼ(配列番号5及び6を参照のこと)が単離され、そして特徴づけられた。
(a)配列番号2のアミノ酸1−188、及び/又は配列番号6のアミノ酸1−192に対して少なくとも65%の程度の同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド;
(b)配列番号1のヌクレオチド502−1065、及び/又は配列番号5のヌクレオチド568−1143と、低い緊縮条件下でハイブリダイズする核酸配列によりコードされるポリペプチド;
(c)配列番号1のヌクレオチド502−1065、及び/又は配列番号5のヌクレオチド568−1143に対して少なくとも74%の程度の同一性を有する核酸配列によりコードされるポリペプチド;
から成る群から選択された、プロテアーゼ活性を有し、そしてpH7.5及び25℃でヘモグロビンに対して少なくとも39AU/gの比活性を有する単離されたポリペプチドに関する。
A. プロテアーゼ活性を有し、そして示される位置での次のアミノ酸の少なくとも1つを含んで成るアミノ酸を有する、ペプチダーゼファミリーS2A及び/又はペプチダーゼファミリーS1Eの単離されたポリペプチド:
25S, 38T, 42P, 44S, 49Q, 54R, 62S, 89S,91S, 92S, 95A, 99Q, 100I, 114V, 120T, 125Q, 129Q, 131L, 135N, 147F,151S, 165S, 166F,171Y, 176N, 179L,180S, 184L, 及び/又は 185T; 好ましくは、25S, 38T, 42P, 44S, 54R, 62S, 125Q,131 L, 165S,171Y, 176N, 179L, 180S, 184L, 及び/又は 185T;より好ましくは 24A, 51V, 53E, 86A, 87T, 96I, 及び/又は 186Lの少なくとも1つ; 及び/又は (H35 + D61 + S143);ここで個々の位置は配列番号2の位置に対応する。
C. 示される位置での次のアミノ酸の少なくとも1つを含んで成るAのポリペプチド;25S, 42P, 44S, 49Q, 54R, 62S,89S,91S, 95A, 99Q, 100I, 114V, 129Q, 166F, 176N, 179L, 180S, 184L, 及び/又は 185T。
E. 配列番号2のアミノ酸−167−188、好ましくは1−188、及び/又は配列番号6のアミノ酸−160−192、好ましくは1−192に対して少なくとも65%の同一性、より好ましくは配列番号2のアミノ酸1−188、又は167−188に対して少なくとも50%の同一性を有する、A, B, C又はDのいずれか1つのポリペプチド。
H. 適切な発現宿主においてポリペプチドの生成を指図する1又は複数の制御配列に作用可能に連結されるGの核酸配列を含んで成る核酸構造体。
I. 上記Hの核酸構造体を含んで成る組換え発現ベクター。
J. 上記Hの核酸構造体又はIのベクターを含んで成る組換え宿主細胞。
K. (a)A,B, C, D, E,又はFのいずれか1つのポリペプチドを含んで成る上清液を生成するために、Jの組換え宿主細胞を培養し;そして(b)前記ポリペプチドを回収することを含んで生る、前記いずれか1つのポリペプチドの生成方法。
M. 上記A, B, C, D, E又はFのいずれか1つのポリペプチドを発現できる、トランスジェニック非ヒト動物、又はその生成物又は要素。
N. (i)動物飼料への;
(ii)動物飼料への使用のための組成物の調製のための;
(iii)動物飼料の栄養価値を改良するための;
(iv)動物飼料における消化でき及び/又は溶解できるタンパク質を高めるための;
(v)動物飼料におけるタンパク質の加水分解の程度を高めるための;及び/又は
(vi)タンパク質の処理のための;
上記A, B, C, D, E又はFのいずれか1つに定義されるような少なくとも1つのポリペプチドの使用。
P. 50〜800g/kgの粗タンパク質含有物を有し、そして上記A, B, C, D, E又はFのいずれか1つに定義されるような少なくとも1つのポリペプチド、又は少なくとも1つのOの飼料添加物を含んで成る動物用飼料組成物。
R. 上記A, B, C. D. E又はFのいずれか1つに定義されるような少なくとも1つのポリペプチドの洗剤への使用。
a. (a)配列番号2のアミノ酸1−188に対して少なくとも86%、及び/又は配列番号6のアミノ酸1−192に対して少なくとも72%の程度の同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド;(b)(i)配列番号1のヌクレオチド502−1065、及び/又は配列番号5のヌクレオチド568−1143のいずれか1つ、(ii)少なくとも100個のヌクレオチドの(i)の副配列;及び/又は(iii)上記(i)−(ii)のいずれか1つの相補的鎖と、中位の高い緊縮条件下でハイブリダイズする核酸配列によりコードされるポリペプチド;(c)1又は複数のアミノ酸の置換、欠失、延長及び/又は挿入を含んで成る、配列番号2のアミノ酸1−188、又は配列番号6のアミノ酸1−192のアミノ酸配列を有するポリペプチドの変異体;(d)上記(a)、(b)又は(c)の対立遺伝子変異体;及び(e)プロテアーゼ活性を有する、上記(a)、(b)、(c)又は(d)フラグメントから成る群から選択された、プロテアーゼ活性を有する単離されたポリペプチド;
e. 上記dの核酸構造体を含んで成る組換え発現ベクター;
f. 上記dの核酸構造体又はeのベクターを含んで成る組換え宿主細胞;
g. (a)前記ポリペプチドを含んで成る上清液を生成するために、fの組換え宿主細胞を培養し;そして(b)前記ポリペプチドを回収することを含んで生る、前記いずれか1つのポリペプチドの生成方法;
h. 上記aのポリペプチドを発現できるトランスジェニック植物、又は植物部分;
i. 上記aのポリペプチドを発現できる、トランスジェニック非ヒト動物、又はその生成物又は要素;
k. (i)動物飼料への;(ii)動物飼料の使用のための組成物の調製のための;(iii)動物飼料の栄養価値を改良するための;(iv)動物飼料における消化でき及び/又は溶解できるタンパク質を高めるための;(v)動物飼料におけるタンパク質の加水分解の程度を高めるための;及び/又は(vi)タンパク質の処理のための、aに定義されるような少なくとも1つのポリペプチドの使用;
m. 50〜800g/kgの粗タンパク質含有物を有し、そしてaに定義されるような少なくとも1つのポリペプチド、又は少なくとも1つのlの飼料添加物を含んで成る動物用飼料組成物;
o. 上記aに定義されるような少なくとも1つのポリペプチドの洗剤への使用。
(a)配列番号2のアミノ酸1−188に対して少なくとも84%の程度の同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド;
(b)配列番号2のアミノ酸−167−188に対して少なくとも78%の程度の同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド;
(c)(i)プライマー配列番号3及び4の使用によりノカルジオプシス・アルバDSM15647からのゲノムDNAから得られるプロテアーゼをコードするDNA;(ii)配列番号1のヌクレオチド502−1065;(iii)配列番号1のヌクレオチド1−1065;(iv)少なくとも100個のヌクレオチドの(i)又は(ii)又は(iii)の副配列;及び/又は(v)上記(i), (ii), (iii)又は(iv)の相補的鎖と、中位の高い緊縮条件下でハイブリダイズする核酸配列によりコードされるポリペプチド;
(d)1又は複数のアミノ酸の置換、欠失、延長及び/又は挿入を含んで成る、配列番号2のアミノ酸1−188又は−167−188のアミノ酸配列を有するポリペプチドの変異体;
(e)上記(a)、(b)又は(c)の対立遺伝子変異体;及び
(f)プロテアーゼ活性を有する上記(a)、(b)、(c)、(d)又は(e)のフラグメントから成る群から選択された、プロテアーゼ活性を有する単離されたポリペプチド。
(a)配列番号2のアミノ酸1−188に対して少なくとも50%の程度の同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド;
(b)配列番号2のアミノ酸−167−188に対する同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド;
(c)(i)プライマー配列番号3及び4の使用によりノカルジオプシス・アルバDSM15647からのゲノムDNAから得られるプロテアーゼをコードするDNA;(ii)配列番号1のヌクレオチド502−1065;(iii)配列番号1のヌクレオチド1−1065;(iv)少なくとも100個のヌクレオチドの(i)又は(ii)又は(iii)の副配列;及び/又は(v)上記(i), (ii), (iii)又は(iv)の相補的鎖と、低い緊縮条件下でハイブリダイズする核酸配列によりコードされるポリペプチド;
(d)1又は複数のアミノ酸の置換、欠失、延長及び/又は挿入を含んで成る、配列番号2のアミノ酸1−188又は−167−188のアミノ酸配列を有するポリペプチドの変異体;
(e)上記(a)、(b)又は(c)の対立遺伝子変異体;及び
(f)プロテアーゼ活性を有する上記(a)、(b)、(c)、(d)又は(e)のフラグメント;
から成る群から選択された、1.5℃/分の一定の走査速度を用いて、10mMのリン酸ナトリウム、50mMの塩化ナトリウム緩衝液(pH7.0)において示差走査熱量法(DSC)により決定される場合、少なくとも78℃の溶融温度(Tm)を有する単離されたポリペプチド。
(b)プロテアーゼ活性を有し、そして(i)プライマー配列番号3及び4の使用によりノカルジオプシス・アルバDSM15647からのゲノムDNAから得られるプロテアーゼをコードするDNA;(ii)配列番号1のヌクレオチド502−1065又は1−1065;(iii)少なくとも100個のヌクレオチドの(i)又は(ii)の副配列;及び/又は(iv)上記(i), (ii), 又は(iii)の相補的鎖と、中位の高い緊縮条件下でハイブリダイズするポリペプチドをコードし;
(c)プロテアーゼ活性を有し、そして配列番号1のヌクレオチド502−1065に対して少なくとも86%の程度の同一性を有するポリペプチドをコードし;そして/又は
(d)プロテアーゼ活性を有し、そして配列番号1のヌクレオチド1−1065に対して少なくとも82%の程度の同一性を有するポリペプチドをコードする;
核酸配列を含んでなる単離された核酸配列。
(b)(i)プライマー配列番号3及び4の使用によりノカルジオプシス・アルバDSM15647からのゲノムDNAから得られるプロテアーゼをコードするDNA;(ii)配列番号1のヌクレオチド502−1065又は1−1065;(iii)少なくとも100個のヌクレオチドの(i)又は(ii)の副配列;及び/又は(iv)上記(i), (ii), 又は(iii)の相補的鎖と、低い緊縮条件下でハイブリダイズし;
(c)配列番号1のヌクレオチド502−1065に対して少なくとも50%の程度の同一性を有し;そして/又は
(d)配列番号1のヌクレオチド1−1065に対して少なくとも50%の程度の同一性を有する、
1.5℃/分の一定の走査速度を用いて、10mMのリン酸ナトリウム、50mMの塩化ナトリウム緩衝液(pH7.0)において示差走査熱量法(DSC)により決定される場合、少なくとも78℃の溶融温度(Tm)を有するポリペプチドをコードする核酸配列を含んで成る単離された核酸配列。
(b)核酸配列を単離することにより生成される単離された核酸配列。
前記核酸構造体を含んで成る組換え発現ベクター。
前記核酸構造体又はベクターを含んで成る組換え宿主細胞。
前記ポリペプチドを含んで成る上清液を生成するために、上記に定義されるような組換え宿主細胞を培養し;そして(b)前記ポリペプチドを回収することを含んで生る、上記に定義されるようなポリペプチドの生成方法。
上記に定義されるようなポリペプチドを発現できる、トランスジェニック非ヒト動物、又はその生成物又は要素。
(i)動物飼料への;(ii)動物飼料の使用のための組成物の調製のための;(iii)動物飼料の栄養価値を改良するための;(iv)動物飼料における消化でき及び/又は溶解できるタンパク質を高めるための;(v)動物飼料におけるタンパク質の加水分解の程度を高めるための;及び/又は(vi)タンパク質の処理のための、上記に定義されるような少なくとも1つのポリペプチドの使用。
50〜800g/kgの粗タンパク質含有物を有し、そして上記に定義されるような少なくとも1つのポリペプチド、又は上記に定義されるような少なくとも1つの飼料添加物を含んで成る動物用飼料組成物。
上記第2、第3及び第4の観点の態様、本発明の第1の観点の好ましい副観点、個々の好ましい副観点は、お互い独立して存在する。
プロテアーゼ活性を有するポリペプチド、又はプロテアーゼはまた、時々、企画されたペプチダーゼ、プロテイナーゼ、ペプチドヒドロラーゼ又はタンパク質分解酵素でもある。プロテアーゼは、そのいずれかの端で開始するペプチドを加水分解するエキソタイプのものであるか、又はポリペプチド鎖において内部的に作用するエンドタイプ(エンドペプチダーゼ)のものである。エンドペプチダーゼは問題のプロテアーゼの特異性のために適切であるN−及びC−末端ブロックされたペプチド基質に対する活性を示す。
(a)EC3.4_._.酵素グループに属するプロテアーゼ;
(b)上記ハンドブックのSグループに属するセリンプロテアーゼ;
(c)ペプチダーゼファミリーS2Aのセリンプロテアーゼ;及び/又は
(d)Biochem. J. 290: 205-218 (1993) and in MEROPS protease database, release 6.20, March 24,2003, (www. merops. ac. uk)に記載されるようなペプチダーゼファミリイーS1Eのセリンプロテアーゼ。
与えられるプロテアーゼがセリンプロテアーゼ及びファミリーS2Aプロテアーゼであるかどうかを決定するためには、上記ハンドブック及びそこに示される原理が言及される。そのような決定は、すべてのタイプのプロテアーゼ、例えば天然に存在するか又は野生型のプロテアーゼ;又は遺伝子的に構築された又は合成のプロテアーゼについて実施され得る。
比活性の決定が精製されたプロテアーゼのタンパク質含有率及びプロテアーゼ活性の決定を包含することはよく知られている。
特定の態様においては、タンパク質含有率は、アミノ酸分析により、例えばプロテアーゼの酸加水分解、及び開放されたアミノ酸の続く分離及び定量化により、好ましくはBiochrom 20 Plus Amino Acid Analyser上で決定される。
(i)ヘモグロビン基質が変性され;
(ii)ヘモグロビン基質が0.65%(w/w)の量で使用され;(ii)アッセイ緩衝液は、KH2PO4/NaOH緩衝液(pH7.50)であり;(ii)プロテアーゼについての反応時間は10分であり;
(iii)酵素反応の後、消化されていないヘモグロビンがトリクロロ酢酸(TCA)により沈殿され、そして好ましくは濾過により除去され;
(iv)濾液におけるTCA−可溶性ヘモグロビン分解生成物が、好ましくはFolin & Ciocalteu'sのフェノール試薬により決定され;
(v)活性単位(AU)が測定され、そしてALCALASETM酵素標準により定義され;
(vi)活性単位(AU)がアッセイEB-SM-0349, 好ましくはEB-SM-0349 02/01を用いて測定され;測定され;そして/又は
(vii)使用されたアッセイは、例3に開示されるような“Protease Activity Assay (AU/ml)”である。ALCALASETM標準及びEB-SM-0349アッセイは、Novozymes A/S, Krogshoejvej 36, DK-2880 Bagsvaerd, Denmark (それぞれ“your ref. patent 10476”及び“EB- SM-0349”, 又は“EB-SM-034902/01”を引用する)から入手できる。
本発明に関しては、2種のアミノ酸配列間の同一性の程度、及び2種のヌクレオチド配列間の同一性の程度は、Needleman-Wunsch整列(すなわち、包括的な整列)であるプログラム“align”により決定される。このプログラムは、ポリペプチド及びヌクレオチド配列の整列のために使用される。デフォールト評点マトリックスBLOSUM50はポリペプチド整列のために使用され、そしてデフォールト一致マトリックスはヌクレオチド整列のために使用される。ギャップの最初の残基についてのペナルティーは、ポリペプチドに関して、−12及びヌクレオチドに関して、−16である。ギャップの追加の残基についてのペナルティーは、ポリペプチドに関して−2及びヌクレオチドに関して、−4である。
上記で説明されたように(同一性の程度を決定するために)、参照配列、例えば配列番号2に対して整列される個々のプロテアーゼにおける個々のアミノ酸残基に関しては、参照配列、例えばそれが対応する配列番号2におけるアミノ酸残基を、直接的に及び明白に割り当てることが可能である。対応する残基は、例えば配列番号2への参照により、同じ位置又は番号を割り当てられる。
他のプロテアーゼのアミノ酸配列は、SEQ Xと命名される。配列番号2の位置Nに対応する位置は次の通りに見出される:SEQ Xは上記に特定されるように、配列番号2と整列される。この整列から、配列番号2の位置Nに対応する配列SEQ Xにおける位置は、下記に記載される原理を用いて、明確且つ明白に誘導され得る。
最初に、整列Iの整列を見ると、配列番号2のP42 は、それらの残基が整列においてお互い上部に存在するので、SEQ XのQ42に対応することが明白である。それらは両者とも、番号42、すなわち配列番号2におけるその対応する残基の番号を割り当てられる。例えば、SEQ X1が25S, 38T, 42P, 44S又は49Qのいずれも含まないことが、この整列から明らかである。
整列IIの整列においては、ギャップはSEQ X2において生成される。SEQ X2の強調されるアミノ酸残基Pは、本発明のためには、P28と称するが、但し、SEQ Xにおいては、それはP25である。
Tmに対しての上限はないが、しかしながら、Tmは150℃, 145 ℃, 140 ℃, 135 ℃, 130 ℃, 125℃, 120℃, 115℃, 110 ℃,105 ℃以下、又は100℃以下であることが現在企画されている。
さらなる他の態様においては、より早いか又はより遅い走査速度、例えば1.4℃/分、1.3℃/分、1.2℃/分、1.1℃/分、1.0℃/分又は0.9℃/分の遅い速度が用いられ得る。
走査方法についてのさらなる詳細は例2に言及されている。
2種のアミノ酸配列間の同一性の程度はまた、LASERGENE(商標)MEGALIGN(商標)ソフトウェアー (DNASTAR,Inc., Madison,WI)、同一性表及び次の複数整列パラメーターを用いて、Clustal 方法(Higgins, 1989, CABIOS 5: 151-153)により決定され得る:10のギャップペラルティー及び10のギャップ長ペナルティー。対様整列パラメーターは、Ktuple−1、ギャップペナルティー=3、窓=5及び診断=5である。2種のヌクレオチド配列間の同一性の程度は、次の設定と共に、上記に記載されるのと同じアルゴリズム及パッケージを用いて決定され得る:ギャップペナルティー=10及びギャップ長ペナルティー=10。対様整列パラメーターは、Ktuple=3、ギャップペナルティー=3及び窓=20である。
もう1つの好ましい態様においては、本発明のポリペプチドは、配列番号2又は6のいずれかの成熟ペプチド部分、又はその対立遺伝子変異体;又はプロテアーゼ活性を有するそのフラグメントから成る。
本発明はまた、1又は複数のアミノ酸の置換、欠失及び/又は挿入を含んで成る、配列番号2又は6のいずれかの成熟部分のアミノ酸配列を有するポリペプチドの変異体に関する。
さらなる特定の態様においては、本発明の及び本発明に従っての使用のためのポリペプチドは、i)60℃及びpH9で少なくとも0.05、0.10、0.15又は少なくとも0.20の相対的活性;及び/又はii)70℃で少なくとも0.40、0.50又は少なくとも0.56の相対的活性を有する。例2の温度−プロフィール試験は、それらの決定のために使用される。
本発明の及び本発明は従っての使用のためのポリペプチドは、細菌又は菌類ポリペプチドであり得る。菌類ポリペプチドは、糸状菌又は酵母に由来する。
上記種に関して、本発明は、知られている種名称にかかわらず、完全及び不完全状態、及び他の分類学的同等物、例えばアナモルフを包含することが理解されるであろう。当業者は、適切な同等物の同一性を容易に理解するであろう。
本発明はまた、本発明のポリペプチドをコードする単離された核酸配列にも関する。本発明の特定の核酸配列は、配列番号1のヌクレオチド502−1065又は1−1065(その配列番号1のヌクレオチド502−1065は成熟ポリペプチドコード領域に対応する)、及び配列番号5のヌクレオチド1−1143、好ましくは568−1143である。本発明はまた、遺伝子コードの縮重により配列番号1のその対応する部分とは異なる、配列番号2のアミノ酸−167−188、好ましくは1−188、又は配列番号6のアミノ酸−160−192、好ましくは1−192のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする核酸配列も包含する。本発明はまた、プロテアーゼ活性を有する、それぞれ、配列番号2及び6のフラグメントをコードする、配列番号1又は5の副配列にも関する。
本発明はさらに、配列番号1及び/又は5の成熟ポリペプチドコード配列又はその副配列中に少なくとも1つの突然変異を導入することを含んで成る、変異体核酸配列を生成するための方法に関し、ここで前記変異体核酸配列は、プロテアーゼ活性を有する、配列番号2のアミノ酸−167−188、好ましくは1−188又は配列番号6のアミノ酸−160-192、好ましくは1−192;又はそのフラグメントから成るポリペプチドをコードする。
本発明はまた、適切な宿主細胞においてコード配列の発現を方向づける1又は複数の制御配列に作用可能に連結される本発明の核酸配列を、制御配列と適合できる条件下で含んで成る核酸構造体にも関する。発現は、ポリペプチドの生成に包含されるいずれかの段階、例えば転写、後−転写修飾、翻訳、後−翻訳修飾及び分泌(但し、それらだけには限定されない)を、包含することが理解される方法。
糸状菌宿主細胞のための好ましいターミネーターは、アスペルギラス・オリザエTAKAアミラーゼ、アスペルギラス・ニガーグルコアミラーゼ、アスペルギラス・ニジュランスアントラニル酸シンターゼ、アスペルギラス・ニガーα−グルコシダーゼ及びフサリウム・オキシスポラムトリプシン−様プロテアーゼについての遺伝子から得られる。
細菌宿主細胞、例えばバチルス宿主細胞のための好ましいターミネーターは、バチルス・リケニホルミスα−アミラーゼ遺伝子(amyL)、Bチルス・ステアロサーモフィラスマルトゲン性アミラーゼ遺伝子(amyM)、又はバチルス・アミロリケファシエンスα−アミラーゼ遺伝子(amyQ)からのターミネーターである。
糸状菌宿主細胞のための好ましいリーダーは、アスペルギラス・オリザエTAKAアミラーゼ、アスペルギラス・ニジュランストリオースリン酸イソメラーゼについての遺伝子から得られる。
糸状菌宿主細胞のための好ましいポリアデニル化配列は、アスペルギラス・オリザエTAKAアミラーゼ、アスペルギラス・ニガーグルコアミラーゼ、アスペルギキラス・ニジュランスアントラニル酸シンターゼ、フサリウム・オキシスポラムトリプシン−様プロテアーゼ及びアスペルギラス・ニガーα−グルコシダーゼについての遺伝子から得られる。
酵母宿主細胞のための有用なポリアデニル化配列は、Guo and Sherman, 1995, Molecular Cellular Biology 15: 5983-5990により記載されている。
酵母宿主細胞のための有用なシグナルペプチドは、サッカロミセス・セレビシアエα−因子及びサッカロミセル・セレビシアエインバーターゼについての遺伝子から得られる。他の有用なシグナルペプチドコード領域は、Romanos など., 1992, 前記により記載される。
シグナルペプチド及びプロペプチド領域の両者がポリペプチドのアミノ末端に存在する場合、そのプロペプチド領域は、ポリペプチドのアミノ末端の次に位置し、そしてシグナルペプチド領域は、プロペプチド領域のアミノ末端の次に位置する。
本発明はまた、本発明の核酸配列、プロモーター、及び転写及び翻訳停止シグナルを含んで成る組換え発現ベクターにも関する。上記の種々の核酸及び制御配列は、1又は複数の便利な制限部位でポリペプチドをコードする核酸配列の挿入又は置換を可能にするためにそれらの部位を含むことができる組換え発現ベクターを生成するために一緒に連結され得る。他方では、本発明の核酸配列は、前記配列又は前記配列を含んで成る核酸構造体を、発現のための適切なベクター中に挿入することによって発現され得る。発現ベクターを創造する場合、そのコード配列はベクターに位置し、その結果、コード配列は発現のための適切な制御配列により作用可能に連結される。
本発明はまた、ポリペプチドの組換え生成において都合良く使用される、本発明の核酸配列を含んで成る組換え宿主にも関する。本発明の核酸配列を含んでなるベクターは、そのベクターが染色体組み込み体として、又は前記のような自己複製染色体外ベクターとして維持されるように、宿主細胞中に導入される。用語“宿主細胞”とは、複製の間に生じる突然変異のために、親細胞と同一ではない親細胞のいずれかの子孫を包含する。宿主細胞の選択は、ポリペプチドをコードする遺伝子及びその源に、かなりの程度依存するであろう。
有用な単細胞は、細菌細胞、例えばグラム陽性細菌、例えばバチルス細胞又はストレプトミセス細胞、又は乳酸菌の細胞;又はグラム陰性細菌、例えばE.コリ及びシュードモナスsp. である。乳酸菌は、ラクトコーカス(Lactococcus)、ラクトバシラス(Lactobacillus)、リュコノストック(Leuconostoc)、ストレプトコーカス(Streptococcus)、ペジオコーカス(Pediococcus)及びエンラロコーカス(Enterococcus)を包含するが、但しそれらだけには限定されない。
1つの特定の態様においては、宿主細胞は菌類細胞である“菌類”とは、本明細書において使用される場合、門アスコミコタ(Ascomycota)、バシジオミコタ(Basidiomycota)、キトリジオミコタ(Chytridiomycota)及びヅイゴミコタ(Zygomycota)(Hawksworth など., Ainsworth and Bisby’s Dictionary of the Fungi, 8th edition, 1995, CAB International, University Press, Cambridge, UKにより定義される)、及びオーミコタ(Oomycota)(Hawksworth など., 1995, 前記、171ページに引用される)、並びに栄養胞子菌(Hawksworh など., 1995, 前記)を包含する。
本発明はまた、(a)その野生型において、ポリペプチドを生成することができる、菌株を培養し;そして(b)ポリペプチドを回収することを含んで成る、本発明のポリペプチドを生成するための方法にも関する。好ましくは、菌株は、属ノカルジオプシス、より好ましくはN.プラシナ、N. アンタルクチカ、N. ダソンビレイ又はN.アルバ、最も好ましくはN.アルバDSM15647、又はN. タソンビレイ亜種ダソンビレイDSM43235のものである。
得られるポリペプチドは、当業界において知られている方法により回収され得る。例えば、ポリペプチドは、従来の方法、例えば遠心分離、濾過、抽出、噴霧−乾燥、蒸発又は沈殿(但し、それらだけには限定されない)により、栄養培地から回収され得る。
本発明はまた、ポリペプチドを、回収できる量で発現し、そして生成するために、本発明のフィターゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸配列により形質転換されているトランスジェニック植物、その植物部分又は植物細胞にも関する。ポリペプチドは、植物又は植物部分から回収され得る。他方では、組換えポリペプチドを含む植物又は植物部分は、食物又は飼料の品質を改良し、例えば栄養価値、嗜好性及び流動性質を改良するために、又は抗栄養因子を破壊するために使用され得る。
特定の態様においては、ポリペプチドは、種子の内生***貯蔵液胞にも標的化される。これは、適切なシグナルペプチドにより前駆体としてそれを合成することによって行われる。Horvath など .、 PNAS, Feb. 15,2000, vol. 97, no. 4, p. 1914-1919を参照のこと。
本発明のポリペプチドを発現するトランスジェニック植物又は植物細胞は、当業界において知られている方法に従って構成され得る。手短には、植物又は植物細胞は、本発明のポリペプチドをコードする、1又は複数の発現構造体を、植物宿主ゲノム中に導入し、そして得られる修飾された植物又は植物細胞をトランスジェニック植物又は植物細胞中に成長せしめることによって構成される。
さらに、コドン使用法は、発現を改良するために、問題の植物種のために最適化され得る(上記に言及されるHorvathなどを参照のこと)。
核酸構造体は、当業界において知られている従来の技法、例えばアグロバクテリウム介在性形質転換、ウィルス介在性形質転換、マイクロインジェクション、粒子衝撃、バイオリステック形質転換及びエレクトロポレーションに従って、植物ゲノム中に組込まれる(Gasserなど., 1990, Science 244: 1293; Potrykus, 1990, BiolTechnology 8 : 535; Shimamoto など., 1989, Nature 338: 274)。
本発明はまた、(a)本発明のプロテアーゼ活性有するポリペプチドをコードする核酸配列を含んで成るトランスジェニック植物又は植物細胞を、前記ポリペプチドの生成の助けとなる条件下で栽培し、そして(b)前記ポリペプチドを回収することを含んで成る、本発明のポリペプチドを生成するための方法にも関する。
本発明はまた、トランスジェニック非ヒト動物及びその生成物又は要素にも関し、その例は体液、例えば乳汁及び血液、器官、肉及び動物細胞である。例えば、哺乳類細胞においてタンパク質を発現するための技法は当業界において知られている。例えば、ハンドブック Protein Expression: A Practical Approach, Higgins and Hames (eds), Oxford University Press (1999), 及びGene Transcription, RNA processing, and Post-translational Processingに関するこのシリーズの他の3種のハンドブックを参照のこと。一般的には、トランスジェニック動物を調製するために、選択された動物の選択された細胞が、本発明のプロテアーゼ活性有するポリペプチドをコードする核酸配列により形質転換され、ポリペプチドが発現され、そして生成される。ポリペプチドが、動物から、例えば雌動物の乳汁から回収され、又はそれは動物自体の有益性のために、例えば動物の消化を助けるために発現され得る。動物の例は、下記の動物飼料及び動物飼料添加物のセクションに言及されている。
さらなる観点においては、本発明は、本発明のポリペプチドを含んで成る組成物に関する。
ポリペプチド組成物は、当業者において知られている方法に従って調製され得、そして液体又は乾燥組成物の形で存在することができる。例えば、ポリペプチド組成物は、粒子又は微粒子の形で存在することができる。組成物に含まれるポリペプチドは、当業界において知られている方法に従って安定化され得る。
本発明のポリペプチド又はポリペプチド組成物の好ましい使用の例が下記に与えられる。
本発明はまた、動物飼料への本発明のポリペプチドの使用方法、及び本発明のポリペプチドを含んで成る飼料生成物及び飼料添加物にも向けられる。
本発明従っての使用においては、プロテアーゼは、食事の前、後又は同時に動物に供給され得る。後者が好ましい。
しかしながら、動物飼料への使用に関しては、純粋であるプロテアーゼは必要ではなく;それは他の酵素を含むことができ、この場合、それはプロテアーゼ調製物と呼ばれる。
そのようなプロテアーゼ調製物はもちろん、他の酵素と共に混合され得る。
特定の態様においては、本発明の使用のためのプロテアーゼは、タンパク質を溶解することができる。溶解されたタンパク質を決定するための適切なアッセイは、例5に開示される。
特定の態様においては、植物タンパク質源は、1又は複数のマメ科植物、例えば大豆、ルピナス、エンドウ又はインゲン豆からの材料である。
もう1つの特定の態様においては、植物タンパク質源は、1又は複数のアカザ科植物、例えばビート、砂糖大根、ホウレンソウ又はキノアからの材料である。
大豆は、好ましい植物タンパク質源である。
植物タンパク質源の他の例は、穀物、例えば大麦、小麦ライ麦、オート麦、トウモロコシ、イネ、ライコムギ及びモロコシである。
少なくとも1つの本発明のプロテアーゼによるタンパク質の本発明に従っての処理が、タンパク質の高められた溶解性をもたらす。
さらなる特定の態様においては、本発明の使用のためのプロテアーゼは、タンパク質の加水分解の程度(DH)を高めることができる。特定の態様においては、加水分解の程度は、ブランクに対して、少なくとも101%、102%、103%、104%又は少なくとも105%である。加水分解の程度は、例5のインビトロモデルを用いて決定される。
1つの態様においては、処理は、動物飼料への使用のための動物飼料又はタンパク質の前−処理である。
飼料転換割合(FCR)及び体重の増加は、EEC (1986): Directive de la Commission du 9 avril 1986 fixant la methode de calcul de la valeur n rgetique des aliments composes destines la volaille. Journal Officiel des Communaut s Europ ennes,L130, 53-54に記載の通りにして計算され得る。
さらなる観点においては、本発明は、動物の飼料への使用のための組成物、例えば動物飼料及び動物飼料添加物、例えばプレミックスに関する。
本発明のプロテアーゼとは別に、本発明の動物飼料添加物は、少なくとも1つの脂溶性ビタミン、及び/又は少なくとも1つの水溶性ビタミン、及び/又は少なくとも1つの微量鉱物を含む。飼料添加物はまた、少なくとも1つのマクロ鉱物を含むことができる。
抗菌ペプチド(AMP)の例は、CAP18, Leucocin A, Tritrpticin, Protegrin-1, Thanatin, Defensin, Lactoferrin, Lactoferricin,及び Ovispirin 、例えば Novispirin (Robert Lehrer, 2000)、Plectasins, 及び Statins,例えばWO 03/044049号 及び WO 03/048148号に開示される化合物及びポリペプチド、及び抗菌活性を保持するそれらの変異体又はフラグメントである。
多不飽和脂肪酸の例は、C18, C20及びC22多不飽和脂肪酸、例えばアラキドン酸、ドコサヘキサエン酸、エイコサペンタエン酸及びγ−リノール酸である。
通常、脂−及び水−溶性ビタミン、及び微量鉱物は、飼料への添加のために意図された、いわゆるプレミックスの一部を形成し、そしてマクロ鉱物は通常、別々に飼料に添加される。本発明のプロテアーゼにより富化されたプレミックスは、本発明の動物飼料添加物の例である。
次のものは、それらの成分の例の非制限的列挙である:
脂溶性ビタミンの例は、ビタミンA、ビタミンD3、ビタミンE及びビタミンK、例えばビタミンK3である。
微量鉱物の例は、マンガン、亜鉛、鉄、銅、ヨウ素、セレン及びコバルトである。
マクロ鉱物の例は、カルシウム、リン及びナトリウムである。
それらの成分(家禽、及び子豚/豚により例示される)の栄養必要条件は、WO01/58275号の表Aに列挙される。栄養必要条件とは、それらの成分が示される濃度で規定食に供給されるべきであることを意味する。
さらに、又は他方では(上記に示される粗タンパク質含有率)、本発明の動物飼料組成物は、10−30MJ/kgの代謝可能エネルギー含有率;及び/又は0.1−200g/kgのカルシウム含有率;及び/又は0.1−200g/kgの利用できるリン含有率;及び/又は0.1−100g/kgのメチオニン含有率:及び/又は0.1−150g/kgのメチオニン及びシステイン含有率;及び/又は0.5−50g/kgのリシン含有率を有する。
粗タンパク質は、係数6.25により掛け算される窒素(N)、すなわち粗タンパク質(g/kg)=N(g/kg)×6.25として計算される。窒素含有率は、Kjeldahl方法 (A. O. A. C. , 1984, Official Methods of Analysis 14th ed., Association of Official Analytical Chemists, Washington DC)により決定され得る。
特定の態様においては、本発明の動物飼料組成物は、上記に定義されるような少なくとも1つのタンパク質の又はタンパク質源を含む。それはまた、動物タンパク質、例えば肉及び骨粉、及び/又は魚粉を、典型的には0−25%の量で含むことができる。
本発明はさらに、次の例により記載されるが、それらは本発明の範囲を制限するものではない。
本発明のプロテアーゼは、洗剤組成物に添加され得、そして従って、洗剤組成物の成分になることができる。
本発明の洗剤組成物は、手動又は機械洗濯用洗剤組成物、例えば染色された布の前処理のために適切な洗濯用添加剤組成物及びすすぎ用布ソフトナー組成物として配合され得、又は一般的な家庭用硬質表面洗浄操作における使用のための洗剤組成物として配合され得、又は手動又は機械皿洗い操作のために配合され得る。
洗剤組成物は、非イオン性、例えば半−極性及び/又はアニオン性及び/又はカチオン性及び/又は両性イオンであり得る1又は複数の界面活性剤を含んで成る。界面活性剤は典型的には、0.1〜60重量%のレベルで存在する。
洗剤は、0〜65%の洗剤ビルダー又は錯生成剤、例えばゼオライト、ジホスフェート、三リン酸、ホスホネート、カーボネート、シトレート、ニトリロ三酢酸、エチレンジアミン四酢酸、ジエチレントリアミン六酢酸、アルキル−又はアルキニル琥珀酸、可溶性シリケート又は層化されたシリケート(例えばHoechstからのSKS−6)を含むことができる。
洗剤は、H2O2源を含んで成る漂白システム、例えば過酸形成漂白活性化剤、例えばテトラアセチルエチレンジアミン又はノナノイルオキシベンゼンスルホネートと共に組合され得る過硼酸塩又は過炭酸塩を含むことができる。他方では、漂白システムは、例えばアミド、イミド又はスルホン型のペルオキシ酸を含むことができる。
洗剤組成物においては、いずれかの酵素、特に本発明の酵素は、洗浄液体1L当たり0.01−100mgの酵素タンパク質、好ましくは洗浄液体1L当たり0.05−5mgの酵素タンパク質、特に洗浄液体1L当たり0.1−1mgの酵素タンパク質に対応する量で添加され得ることが、現在企画される。
生物学的材料の寄託:
2001年にデンマークにおいて収集された土壌サンプルから単離された次の生物学的材料を、DeutscheSammiung von Mikroorganismen undZelikulturen GmbH,Mascheroder Weg 1b, D-38124 Braunschweigに、ブタペスト条件に基づいて寄託し、そして次の受託番号を付与された:
受託番号:DSM 15647
寄託日:2003年5月30日
前記株は、培養物への接近が、37 C.F.R.§1.14.及び35 U.S.C.§122下で特許及び商標局長により決定される本特許出願の係属の間、利用できることを保証する条件下で寄託された。寄託物は、寄託された株の実質的に純粋な培養物を示す。寄託物は、本出願の対応物又はその子孫が出願される国々における外国特許法により要求される場合、利用できる。しかしながら、寄託物の入手可能性は、政府の指令により許される特許権の低下において本発明を実施する許可を構成しないことが理解されるべきである。
種々の文献が本明細書に引用されており、それらの開示は引用により本明細書に組み込まれている。
試薬及び培地:
LB寒天:Ausubel, F. M. など. (eds. ) "Current protocols in Molecular Biology". JohnWiley and Sons, 1995に記載される。
LB−PG寒天:0.5%グルコース及び0.05Mのリン酸カリウム(pH7.0)により補充されたLB寒天。
PS−1:10%スクロース、4%大豆粉、1%Na3PO4・12H2O、0.5%CaCO3及び0.01%プルロン酸。
TEL:TE緩衝液中、50mg/mlのLysozym。
チオシアネート:5Mのグアニジウムチオシアネート、100mMのEDTA、0.6%(w/v)のN−ラウリルサルコシン、ナトリウム塩、60gのチオシアネート、20mlの0.5MのEDTA、pH8.0、20mlの水を65℃で溶解する。室温(RT)に冷却し、そして0.6gのN−ラウリルサルコシンを添加する。水を添加し、100mlにし、そしてそれを、0.2μの無菌フィルターを通して濾過する。
TER:TE−緩衝液中、1μg/mlのRnase A。
CIA:クロロホルム/イソアミルアルコール(24:1)
配列番号1は、ノカルジオプシス・アルバDSM15647からのプロテアーゼの前形をコードするDNA配列である。ヌクレオチド502−1065は成熟ペプチドコード部分に対応する。
配列暗号2は、配列番号1の推定されるアミノ酸配列である。アミノ酸−167〜−1はプロペプチドであり、そしてアミノ酸1−188は成熟ペプチドである。
野生型を、収穫の前、次の培地において30℃で3日間、増殖した:
トリプチカーゼ 20g
酵母抽出物 5g
塩化鉄 6mg
硫酸マグネシウム 15mg
蒸留水 1000ml
炭酸ナトリウムの添加によりpHを9に調節する。
1.5mlの培養物を収穫し、そして100μlのTELに再懸濁する。37℃で30分間インキュベートする。
500μlのチオシアネート緩衝液を添加し、そして室温で10分間、放置する。
250μlのNH4Acを添加し、そして氷上に10分間、放置する。
500μlのCIAを添加し、そして混合する。
微小遠心分離機に移し、そして十分な速度で10分間、回転する。
回転し、そしてDNAペレットを70%エタノールにより洗浄する。
100μlのTERのゲノムDNAを再懸濁する。
ゲノムDNAを、下記プライマー配列番号3及び4を用いてのPCR増殖のための鋳型として使用した。PCRフラグメントを、0.7%アガロース上で単離した。
1421: 5'-GTT CAT CGA TCG CAT CGG CTG CGA CCG GCC CCC TCC CCC AGT C-3'(配列番号3);
1604: 5'-GCG GAT CCT ATC AGG TGC GCA GGG TCA GAC C-3'(配列番号4)。
消化され、そして精製されたPCRフラグメントを、ClaI及びBamHIにより消化されたプラスミドpDG268NeoMCS-PramyQ/Prcrylil/crylilAstab/Sav (アメリカ特許第5,955,310号)に連結した。
上記のようにして形質転換されたバチルス・サブチリス宿主細胞を、6μg/mlのクロラムフェニコールにより補充されたPS−1培地100mlを含む、500mlのそらせ板付三角フラスコにおいて、回転振盪テーブル(250r.p.m)上で、37℃で16時間、及び26℃でさらに4日間、発酵した。
プロテアーゼアッセイ:
1)pNAアッセイ:
pNA基質:Suc-AAPF-pNA (Bachem L-1400)
温度:室温(25℃)
アッセイ緩衝液:HCl又はNaOHによりpHを2.0, 2.5, 3.0, 3.5, 4.0, 5.0, 6.0, 7.0, 8.0, 9.0, 10.0, 11.0, 及び 12.0に調節された、100mM 琥珀酸,100mM HEPES,100mM CHES,100mM CABS,1mM CaCl2, 150mM KCI, 0.01% Triton X-100。
基質:Protazyme AK錠剤(架橋され、そして染色されたカゼイン;Megazymeからの)
温度:調節された(アッセイ温度)
アッセイ緩衝液:HCl又はNaOHによりpHを2.0, 2.5, 3.0, 3.5, 4.0, 5.0, 6.0, 7.0, 8.0, 9.0, 10.0, 11.0, 及び 12.0に調節された、100mM 琥珀酸,100mM HEPES,100mM CHES,100mM CABS,1mM CaCl2, 150mM KCI, 0.01% Triton X-100。
pNAアッセイを、pH−活性プロフィール及びpH−安定性プロフィールを得るために使用した。pH−安定性プロフィールン関しては、プロテアーゼを、アッセイ緩衝液おいて10倍に希釈し、そして37℃で2時間インキュベートした。インキュベーションの後、プロテアーゼサンプルを、残留活性についてのアッセイの前、pH9のアッセイ緩衝液における希釈により、同じpHの緩衝液(pH9)に移した。
Protazyme AKアッセイを、pH9での温度−活性プロフィールを得るために使用した。結果は、下記表1−3に示される。
DSCを用いて、ノカルジノプシス・アルバ及びノカルジノプシスsp. NRRL 18262由来のプロテアーゼのpH7.0での温度安定性を決定した。精製されたプロテアーゼを、10mMのリン酸ナトリウム、50mMの塩化ナトリウム溶液(pH7.0)に対して、4℃で一晩、透析し、そして20〜100℃での1.5℃/分の一定走査速度でVP−DSC測定器(Micro Cal)上にゆだねた。データ処理を、MicroCal Originソフトウェアーを用いて行った。
例2に記載される精製されたプロテアーゼ調製物を、比活性の決定のために使用した。調製物の純度は、SDS−PAGEにより分析される場合、95%以上であった(WO01/58275号における例2Aに記載のようにして決定された)。プロテアーゼサンプルを2つに分割した。1つの部分を、アミノ酸分析によりタンパク質含有率(mg/ml)について分析し、他の部分をプロテアーゼ活性について分析した。
プロテアーゼサンプルのペプチド結合を、酸加水分解し、続いて、Bie & Berntsen A/S, Sandbaekvej 5-7, DK-2610 Roedovre, Denmarkから市販されているBiochrom 20 Plus Amino Acid Analyser上で、製造業者の説明書に従って、開放されるアミノ酸を分離し、そしてそれを定量化した。酸加水分解のために、タンパク質サンプルを、真空遠心分離機において乾燥し、18.5%(v/v)のHCl+0.1%(v/v)のフェノールに溶解し、そして110℃で16時間インキュベートした。インキュベーションの後、サンプルを再び真空遠心分離機において乾燥し、負荷緩衝液(0.2Mのクエン酸ナトリウム、pH2.2)に溶解し、そしてBiochrom 20 Plus Amino Acid Analyser上に負荷した。
変性されたヘモグロビン(6.7mMのKH2PO4/NaOH緩衝液(pH7.50)中、0.65%(w/w))を、プロテアーゼにより25℃で10分間、分解し、そして消化されなかったヘモグロビンをトリクロロ酢酸(TCA)により沈殿し、そして濾過により除去した。濾液におけるTCA−溶解性ヘモグロビン分解生成物を、Folin & Ciocalteuのフェノール試薬により決定し、青色がいくつかのアミノ酸を示す。活性単位(AU)を測定し、そしてALCALASETM標準に参照して定義した。アッセイの詳細な説明、及びALCALASETM標準のサンプルは、Novozymes A/S, Krogshoejvej 36, DK-2880 Bagsvaerd, Denmark (アッセイ番号EB-SM- 0349.02/01)から必要に応じ入手できる。
ノカルジオプシス・アルバDSM15647由来のプロテアーゼの比活性は、ノカルジオプシスsp. NRRL 18262由来のプロテアーゼの38.3AU/gの比活性に比較して、53.5AU/gであった。
ノカルジオプシス・ダソンビレイ亜種ダソンビレイDSM43235を、例1に記載のようにして、野生型トリプチカーゼ培地において増殖し、そしてゲノムDNAを単離した。
前−成熟プロテアーゼL1aのコード領域(配列番号1のヌクレオチド88−1143)を、ゲノムDNA上で次のプライマー1424及び1485により増幅した:
5’− gcttttagttcatcgatcgcatcggctgcgaccgtaccggccgagccag−3’
プライマー1424(配列番号8):
5’− ggagcggattgaacatgcgattactaaccggtcaccagggacagcc−3’。
L1aポリヌクレオチドを、PCRにより、Savシグナルペプチド(配列番号9)をコードする異種DNAフラグメントに、整合して融合した。
L1aプロテアーゼの比活性を、例3に記載のようにして、49.8AU/gであると決定した。
例2に記載される精製されたプロテアーゼの性能を、単胃動物において消化を刺激するインビトロモデルにおいて試験した。特に、プロテアーゼを、トウモロコシ/−SBM(トウモロコシ/−大豆粉)タンパク質の溶解性及び消化を改良するその能力について試験した。インビトロシステムは、トウモロコシ/−SBM基質が最初に、HCl/ペプチン(胃消化を刺激する)、及び続いて、パンクレアチン(腸消化を刺激する)と共にインキュベートされる10個のフラスコから成った。5個のフラスコは、胃相の開始でプロテアーゼを添加され、そして残りの5個のフラスコはブランクとして作用した。腸インキュベーション相の最後で、インビトロ消化物のサンプルを除き、そして溶解され、そして消化されたタンパク質について分析した。
基質: 4gのSBM、6gのトウモロコシ(前混合された)
pH: 3.0:胃段階/6.8〜7.0:腸段階
HCl: 1.5時間0.105M(すなわち、30分のHCl−基質前混合)
ペプシン: 1時間3000U/gの規定食
パンクレアチン:4時間8mg/gの規定食
温度: 40℃
反復: n
0.39MのNaOH
0.105MのHCl
5ml当たり6000Uのペプシンを含む0.105MのHCl
1ml当たり16mgのパンクレアチンを含む1MのNaHCO3
125mMのNaAc−緩衝液、pH6.0
すべてのサンプルを、ゲル濾過を用いて、溶解され、そして消化されたタンパク質の含有率について、及びOPA方法を用いて、加水分解の程度(DH)について分析した。
異なったサンプルにおけるタンパク質の加水分解の程度を、半自動マイクロタイタープレートに基づく熱量方法(Nielsen, P.M. ;Petersen, D.;Dambmann, C. Improved method for determining food protein degree of hydrolysis. J. Food Sci. 2001,66, 642-646)を用いて決定した。OPA試薬を次の通りにして調製した:7.620gのdl−Naテトラボレート・10水和物及び200mgのドデシル硫酸ナトリウム(SDS)を、150mgの脱イオン水に溶解した。試薬を、完全に溶解し、その後、続けた。160mgのO−フタル−ジアルデヒド97%(OPA)を、4mlのエタノールに溶解した。OPA溶液を、脱イオン水によりすすぐことにより、上記溶液に定量的に移した。176mgのジチオトレイトール99%(DTT)を、脱イオン水により200mlにされた溶液に添加した。セリン標準(0.9516m当量/l)を、500mlの脱イオン水に50mgのセリン(Merck, Germany)を溶解することにより調製した。
インビトロ消化されたサンプルからの上清液における溶解されたタンパク質の含有率を、ゲル濾過HPLCを用いて、粗タンパク質(CP)を定量化することにより評価した。上清液を融解し、0.45μmのポリカーボネートフィルターを通して濾過し、そして水により稀釈した(1:50、v/v)。稀釈されたサンプルを、Superdex Peptide PE (7.5 x 300 mm)ゲル濾過カラムを用いて、HPLCによりクロマトグラフィー処理した。定組成溶出のために使用される溶解剤は、150mMのNaCl を含む、50mMのリン酸ナトリウム緩衝液(pH7.0)であった。実験当たりの溶離剤の合計体積は26mlであり、そして流速は0.4ml/分であった。
下記表5及び6に示される結果は、プロテアーゼが消化できるタンパク質のレベル、及び加水分解の程度(両者ともブランクに対する)を有意に高めたことを示す。
ビタミン及び鉱物プレミックスの形で存在する、例2に記載のようにして調製されたプロテアーゼを含んで成る動物飼料添加物を、下記表7に示されるようにして構成する。ビタミン及びカロテノイドは、DSM Nutritional Productsから市販されている。すべての量は、g/kgによる。
Claims (16)
- (a)配列番号2のアミノ酸1−188、及び/又は配列番号6のアミノ酸1−192に対して少なくとも65%の程度の同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド;
(b)配列番号1のヌクレオチド502−1065、及び/又は配列番号5のヌクレオチド568−1143と、低い緊縮条件下でハイブリダイズする核酸配列によりコードされるポリペプチド;
(c)配列番号1のヌクレオチド502−1065、及び/又は配列番号5のヌクレオチド568−1143に対して少なくとも74%の程度の同一性を有する核酸配列によりコードされるポリペプチド;
から成る群から選択された、プロテアーゼ活性を有し、そしてpH7.5及び25℃でヘモグロビンに対して少なくとも39AU/gの比活性を有する単離されたポリペプチド。 - 請求項1記載のポリペプチドをコードする核酸配列を含んでなる単離された核酸配列。
- (a)配列番号1のヌクレオチド502−1065、及び/又は配列番号5のヌクレオチド568−1143のいずれか1つに、低い緊縮条件下でハイブリダイズし;
(b)配列番号1のヌクレオチド502−1065、及び/又は配列番号5のヌクレオチド568−1143のいずれか1つに対して少なくとも74%の程度の同一性を有し;そして/又は
(c)配列番号2のアミノ酸1−188、及び/又は配列番号6のアミノ酸1−192に対して少なくとも65%の程度の同一性を有する;
ポリペプチドをコードする、プロテアーゼ活性を有し、そしてpH7.5及び25℃でヘモグロビンに対して少なくとも39AU/gの比活性を有するポリペプチドをコードする核酸配列を含んでなる単離された核酸配列。 - 適切な発現宿主においてポリペプチドの生成を指図する1又は複数の制御配列に作用可能に連結される請求項2又は3記載の核酸配列を含んでなる核酸構造体。
- 請求項4記載の核酸構造体を含んでなる組換え発現ベクター。
- 請求項4記載の核酸構造体又は請求項5記載のベクターを含んで成る組み換え宿主細胞。
- 請求項1記載のポリペプチドの生成方法であって、(a)前記ポリペプチドを含んで成る上清液を生成するために、請求項6記載の組換え宿主細胞を培養し;そして(b)前記ポリペプチドを回収することを含んで成る方法。
- 請求項1記載のポリペプチドを発現するトランスジェニック植物又は植物部分。
- 請求項1記載のポリペプチドを発現できるトランスジェニック非ヒト動物は、又はその生成物又は要素。
- 請求項1記載のポリペプチドの生成方法であって、
(a)次の株:
(i)ノカルジオプシス・ダソンビレイ(Nocardiopsis dassonvillei)亜種ダソンビレイDSM43235,
(ii)ノカレジオプシス・アルバ(Nocardiopsis alba)DSM15647;
のいずれかを培養し;そして
b)前記ポリペプチドを回収することを含んで成る方法。 - (i)動物飼料への;
(ii)動物飼料への使用のための組成物の調製のための;
(iii)動物飼料の栄養価値を改良するための;
(iv)動物飼料における消化でき及び/又は溶解できるタンパク質を高めるための;
(v)動物飼料におけるタンパク質の加水分解の程度を高めるための;及び/又は
(vi)タンパク質の処理のための;
請求項1記載の少なくとも1つのポリペプチドの使用。 - 少なくとも1つの請求項1記載のポリペプチド;及び
(a)少なくとも1つの脂溶性ビタミン;及び/又は
(b)少なくとも1つの水溶性ビタミン;及び/又は
(c)少なくとも1つの微量鉱物;
を含んで成る動物飼料添加物。 - 50〜800g/kgの粗タンパク質含有物を有し、そして少なくとも1つの請求項1記載のポリペプチド、又は少なくとも1つの請求項12記載の飼料添加物を含んで成る動物用飼料組成物。
- 中でもアミラーゼ、フィターゼ、キシラナーゼ、ガラクタナーゼ、α−ガラクトシダーゼ、プロテアーゼ、ホスホリパーゼ及び/又はβ−グルカナーゼから選択された少なくとも1つの他の酵素と共に、少なくとも1つの請求項1記載のポリペプチドを含んで成る組成物。
- 洗剤への少なくとも1つの請求項1記載のポリペプチドの使用。
- ノカルジオプシス・アルバDSM15647。
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