JP2006518583A - Ｉｌ−１５アンタゴニスト - Google Patents

Abstract

本発明は、野生型ＩＬ−１５及びマウスＩｇＧ２ｂフラグメント以外のＩｇＧ−Ｆｃフラグメントから成る融合タンパク質、該タンパク質をコードする核酸、ベクター、修飾細胞に関し、また、例えば移植及び／又は自己免疫疾患に起因する疾患の予防及び／又は治療に用いる薬剤を調製するためのそれらの使用にも関する。

Description

本発明は、野生型ＩＬ−１５及びＩｇＧ Ｆｃフラグメントで構成される融合タンパク質、並びに免疫反応の抑制と移植続発症及び／又は自己免疫疾患の予防及び／又は治療のための製造及び使用に関する。

有効な免疫反応は活性化された免疫システムのＴ細胞により開始され、その活性化は抗原又はマイトジェンにより誘導される。Ｔ細胞の活性化には、例えばサイトカイン及びその受容体の発現を含めた多くの細胞変化が必要である。これらのサイトカインにはとりわけＩＬ−１５及びＩＬ−２が含まれる。

ＩＬ−１５及びＩＬ−２は、ヒト及びマウスのＴ細胞、マクロファージ、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）及びリンパ球活性化キラー（ＬＡＫ）細胞の増殖と分化、並びに例えば抗イムノグロブリン（抗ＩｇＭ）又はホルボールエステルにより活性化されるＢ細胞の副刺激において重要な役割を果たす公知の増殖因子である。これらの細胞の増殖は生体の免疫反応を増強する。

ＩＬ−１５は、ＩＬ−２依存性マウス細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬＬ−２）の増殖を誘導する分泌性サイトカインとして最初に記載された。ＩＬ−１５は、４８アミノ酸のリーダー配列を有する、長さ１６２アミノ酸の前駆タンパク質であり、成熟タンパク質は長さ１１４アミノ酸であることが明らかにされている（Ｇｒａｂｓｔｅｉｎら（１９９４）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６４（５１６１）：９６５−８）。

ＩＬ−１５は上皮細胞株及び線維芽細胞細胞株並びに末梢血単球において生成される。その特異的ｍＲＮＡは、胎盤、骨格筋及び腎臓中にも見出される（Ｇｒａｂｓｔｅｉｎら、上記参照）。

共通に有する生物学的特性に加えて、ＩＬ−１５とＩＬ−２は相同した構造を有する。両分子ともＴ細胞膜上の少なくとも３種類の別個の受容体サブユニットに結合するが、β及びγサブユニット複合体を介して起こるシグナル伝達は同一であるのに対して、αサブユニットはＩＬ−１５又はＩＬ−２の結合に特異的である。ＩＬ−２受容体αサブユニットに対する抗体は、ＩＬ−１５のその特異的αサブユニットへの結合に何らの効果も及ぼさないが（Ｇｒａｂｓｔｅｉｎら、上記参照）、ＩＬ−２受容体βサブユニットに対する抗体はＩＬ−１５の活性を阻害することが明らかにされている（Ｇｒｉら（１９９４）ＥＭＢＯ Ｊ．、１３：２８２２）。そのシグナル伝達はＩＬ−１５β及びγサブユニットを介して起こる。

多くの疾患では、治療上の理由から、患者の免疫システム反応を抑制することが必要である。これらの疾患には、例えば、自己免疫疾患、特にＩ型糖尿病（Ｂｏｔａｚｚｏ，Ｇ．Ｆ．ら（１９８５）Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ １１３：３５３）、関節リウマチ、多発性硬化症、慢性肝臓病、炎症性消化管疾患、移植片対宿主病［ＧＶＨＤ］及び移植片拒絶反応が含まれる（Ｓａｋａｉら（１９９８）Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ、１１４（６）：１２３７−１２４３；Ｋｉｖｉｓａｋｋら、（１９９８）Ｃｌｉｎ Ｅｘｐ Ｉｍｍｕｎｏｌ、１１１（１）：１９３−１９７）。

免疫担当細胞が遺伝的に異なる生体から移入された場合、その後これらの細胞は受容生命体に対して反応を起こす（ＧＶＨＤ）（Ｊａｎｅｗａｙ Ｃ．Ａ．及びＴｒａｖｅｒｓ Ｐ．、Ｓｐｅｋｔｒｕｍ−Ｖｅｒｌａｇ、Ｇｅｒｍａｎ ｅｄｉｔｉｏｎ、１９９５、ｐ．４６７）。

多くの生命を脅かす疾患の場合、臓器又は組織移植が標準的方法になって来ており、またさらに多くの場合、唯一の救命処置になって来ている。しかしながら、移植片の外来細胞表面抗原に対する免疫反応により誘発される受容生命体での拒絶反応という問題が存在している。

移植に際して移植片が拒絶される程度は、提供者と受容者との組織学的な差（組織適合性）の大きさに依存している。提供者と受容者が示す抗原パターンの違いは後者において免疫反応を誘発し、移植片に対する拒絶反応が惹起される。液性エフェクターは、抗体依存性の細胞介在性細胞傷害及び受容者のＨＬＡシステムの構造に対する抗体などの異なる特異性を有する抗体である。細胞性エフェクターは、特に、マクロファージとの組合わせにおける細胞傷害性Ｔ細胞である（Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｅ［Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ］、Ｊａｎｅｗａｙ Ｃ．Ａ．及びＴｒａｖｅｒｓ Ｐ．、Ｓｐｅｋｔｒｕｍ−Ｖｅｒｌａｇ、Ｇｅｒｍａｎ ｅｄｉｔｉｏｎ １９９５、ｐｐ．５２２−８）。

１つの治療アプローチは、液性または細胞性免疫反応を抑制するために免疫抑制剤、特に拮抗性のＩＬ−１５若しくはＩＬ−２抗体、又はＩＬ−１５若しくはＩＬ−２アンタゴニストを使用することである。

ＩＬ−１５又はＩＬ−２分子に対する抗体を用いた様々な治療が記載されている。従って、例えば、抗ＩＬ−２．βモノクローナル抗体（Ｍｉｋ．β−１）の投与によって、異種移植された霊長類の心臓の生存期間を延長させることが可能である（Ｔｉｎｕｂｕら（１９９４）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５３：４３３０）。移植片拒絶を阻害するために、Ｔ細胞特異的抗原ＣＤ３に対するモノクローナル抗体を用いることもまた報告されている（Ｍａｃｋｉｅら（１９９０）Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ４９：１１５０）。

さらに、ＩＬ−１５の受容体への結合に関する挙動を変える多くのＩＬ−１５アンタゴニストが記載されている。これらのアンタゴニストは、野生型ＩＬ−１５の配列に変異を導入することにより得られている。例えば、ＩＬ−１５受容体のαサブユニットには結合するがβサブユニットへの結合は阻害するような５６番目のアミノ酸（アスパラギン酸）［リーダー配列除去後の８番目］の変異が記載されている（ＷＯ９６／２６２７４号）。他のアプローチにおいて、１５６番目のアミノ酸（グルタミン）［リーダー配列除去後の１０８番目］の変異がγサブユニットとの相互作用を阻害した（ＷＯ９６／２６２７４号；ＷＯ９７／４１２３２号）。さらに、ＰＥＧ化ＩＬ−１５は、αサブユニットには結合するが、βサブユニットへの結合は立体的な理由からもはや不可能である（Ｐｅｔｔｉｔら（１９９７）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ、２７２４：２３１２−２３１８）。

上記のＩＬ−１５アンタゴニストは、自分自身が又は融合タンパク質としてアンタゴニスト作用を示す変異型ＩＬ−１５（ｍｕｔ−ＩＬ−１５）配列である。これらの融合タンパク質は、Ｎ末端ｍｕｔ−ＩＬ−１５フラグメント及び特にマウスＩｇＧ２ａ又はＩｇＧ１のＣ末端Ｆｃフラグメントから成るポリペプチドである（ＷＯ９７／４１２３２号；Ｋｉｍら（１９９８）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１６０：５７４２−５７４８）。

Ｆｃフラグメント（結晶可能フラグメント）は、どの抗原とも結合しない抗体フラグメントを意味する。抗体の他の２個の同一なＦａｂフラグメント（抗原結合性フラグメント）は抗原結合活性を有する（Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｅ［Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ］、Ｊａｎｅｗａｙ Ｃ．Ａ及びＴｒａｖｅｒｓ Ｐ．、Ｇｅｒｍａｎ ｅｄｉｔｉｏｎ（１９９５）、ｐ．１１７ｆｆ）。

しかし、これらの変異型ＩＬ−１５分子の不利な点は、それが野生型ＩＬ−１５と比較して変化した１次、２次及び３次構造を示すことであり、結果的に異なる分解点を有するため、細胞中では自然に生じ得ず、また生体に対して有毒作用を示す可能性のある分解産物が生じることである。これらの産物の性状と程度及び他の副作用を詳しく予見することはできない。

もう１つの不利な点は、これらの移植片をもつ患者が、概してこれらの移植片を生涯にわたって保持するということであり、このことは彼らが免疫抑制剤を一生涯飲み続けなくてはならないことを意味する。特に、免疫抑制剤の長期服用による副作用を私達が良く理解していないという事実のために、これらの副作用を除くか又は少なくとも制限しなくてはならないという差し迫った必要性が存在する。

サイクロスポリンＡ、ＦＫ５０６やラパマイシンなどの免疫抑制作用のある成分を投与した場合、これらの物質はＴ細胞の増殖を阻害することが証明されている（Ｐｅｎｎ（１９９１）Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ Ｐｒｏｃ、２３：１１０１；Ｂｅｖｅｒｉｄｇｅら（１９８４）Ｌａｎｃｅｔ １：７８８）。

深刻に不利な点は、概してこれら免疫抑制剤の全身投与では薬剤が全身に分布してしまうため、移植した細胞、組織又は臓器の部位に局所的に存在することが保障されないことである。また一方で、全身でのＴ細胞の増殖阻害は感染、毒性のある分解産物又は癌さえも生じさせてしまう可能性がある。

発明の詳細な説明

従って、本発明の目的は、免疫反応が阻害される生体中で、全く又は殆ど副作用を示さない免疫抑制剤を製造することである。
変異型ＩＬ−１５分子、又はｍｕｔ−ＩＬ−１５及びＦｃフラグメントを含む融合タンパク質は、受容体への結合様式を阻害又は変化させることでＩＬ−１５に対してアンタゴニスト作用を示すことが知られている。

しかし、まったく驚くべきことに、Ｎ末端野生型ＩＬ−１５とＣ末端Ｆｃフラグメント、特にマウスＩｇＧ２ａを含む融合タンパク質は、本質的にアゴニスト作用が予想されていたにもかかわらず、アンタゴニスト作用も示した。通常は免疫促進に働く天然ＩＬ−１５分子へＦｃフラグメントを結合させるだけでその作用機作を逆転させることができ、免疫反応を抑制できたのである。

融合タンパク質の野生型ＩＬ−１５セグメントは当然折り畳まれているという想定の下では、結合したＦｃフラグメントが自然に受容体への結合様式を変化させてしまい、野生型ＩＬ−１５−Ｆｃ分子全体が野生型ＩＬ−１５に対してアンタゴニスト作用を示すようになるということを想像することができなかったため、この発見はまさに驚きであった。

従って、本発明の主題の一部は、一方は野生型ＩＬ−１５、他方はマウスＩｇＧ２ｂ Ｆｃフラグメント以外のＦｃフラグメントで構成される融合タンパク質に関するものである。

本発明の融合タンパク質は、融合遺伝子の発現産物と理解されるべきである。融合遺伝子は、２個以上の遺伝子又は遺伝子フラグメントを連結させることにより生じ、新規のコンビネーションが形成される。

本発明の野生型ＩＬ−１５は、例えばＧｒａｂｓｔｅｉｎら（１９９４）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６４（５１６１）：９６５−８に記載の天然ＩＬ−１５、又はその対立遺伝子多型を意味するものと理解される。

Ｆｃフラグメント（結晶可能フラグメント）は、いずれの抗原にも結合しない抗体フラグメント、例えば可変ドメインを欠失した、又はＨ鎖及びＬ鎖の最初の定常ドメインを部分的に又は完全に欠失した抗体分子であると理解されるべきである。Ｆｃフラグメントは天然物由来であることも、組換え技術で調製することも及び／又は合成することも可能である。当業者は適当な方法に精通している。

本発明の融合タンパク質のＦｃフラグメントは、イムノグロブリンＧ（ＩｇＧ）であり、具体的にはヒト若しくはマウスＩｇＧ１、ヒトＩｇＧ２、マウスＩｇＧ２ａ、ヒト若しくはマウスＩｇＧ３又はヒトＩｇＧ４、好ましくはヒトＩｇＧ１又はマウスＩｇＧ２ａ、特にＩｇＧ１である。ＩｇＧのヒンジ領域から下方を使用することが好ましい。Ｉｇ分子中の可動領域がヒンジ領域と呼ばれる。

本発明のＩｇＧは、例えば下記のＩｇＧであると理解されるべきである：
ヒトＩｇＧ１（Ｐａｔｅｒｓｏｎ，Ｔ．ら（１９９８）Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ４（１）：３７−４７）、マウスＩｇＧ２ａ（Ｓｉｋｏｒａｖ，Ｊ．Ｌ．（１９８０）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．８（１４）：３１４３−３１５５）、マウスＩｇＧ１（Ｆｒｅｎｃｈら（１９９１）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４６（６）：２０１０−２０１６）、ヒトＩｇＧ２（Ｋｒａｗｉｎｋｅｌ，Ｕ．及びＲａｂｂｉｔｔｓ，Ｔ．Ｈ．（１９８２）ＥＭＢＯ Ｊ．１（４）：４０３−４０７；Ｗａｎｇら（１９８０）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２５（３）：１０４８−１０５４）、マウスＩｇＧ２ｂ（Ｓｃｈｌｏｍｃｈｉｋ、Ｍ．Ｊ．（１９８７）Ｎａｔｕｒｅ ３２８、８０５−８１１）、ヒトＩｇＧ３（Ｈｕｃｋ，Ｓ．ら（１９８６）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１４（４）：１７７９−１７８９）、マウスＩｇＧ３（Ｗｅｌｓら（１９８４）ＥＭＢＯ Ｊ．３（９）：２０４１−２０４６）、及びヒトＩｇＧ４（Ｐｉｎｋら（１９７０）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．１１７（１）：３３−４７）。

本発明の融合タンパク質は、好ましくはキメラ融合タンパク質であり、例えば野生型ＩＬ−１５と異種ＩｇＧ１ Ｆｃフラグメント又は異種ＩｇＧ２ａ Ｆｃフラグメントを含有する。

好ましい態様では、本発明の融合タンパク質はアミノ酸配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４又は配列番号５を含む。
本発明の主題のさらなる部分は、一方で野生型ＩＬ−１５を含有し、他方でマウスＩｇＧ２ｂ Ｆｃフラグメント以外のＩｇＧ Ｆｃフラグメントを含有する融合タンパク質をコードする核酸に関する。

本発明の核酸は、好ましくは、野生型ＩＬ−１５と、ヒト若しくはマウスＩｇＧ１、ヒトＩｇＧ２、マウスＩｇＧ２ａ、ヒト若しくはマウスＩｇＧ３又はヒトＩｇＧ４、特に好ましくはヒトＩｇＧ１又はマウスＩｇＧ２ａ、最も好ましくはＩｇＧ１をコードする。

本発明の核酸は、好ましくは、アミノ酸配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４又は配列番号５のうちの１個を有する融合タンパク質をコードする。
好ましい態様では、本発明の核酸は、ＤＮＡ配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９又は配列番号１０を含有する。

本発明の意味において、核酸はＲＮＡ又はＤＮＡ、特にゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ又は例えばホスホラミデート化（phosphoramidation）レベルで合成された合成ＤＮＡであると理解される。これら核酸のヌクレオチドの組み合わせ及び／又は修飾も同様に包含される。この用語はさらに１本鎖及び２本鎖の核酸を包含する。

機能的に連結された構成要素、例えば本発明の１個以上の融合タンパク質をコードする１個以上の融合遺伝子、又はその活性部分、並びに調節可能なエレメント及び／又はその遺伝子の発現に量的に及び／又は時間依存的に影響を与える制御ヌクレオチド配列を含む核酸も包含される。

制御エレメントの例としては、恒常的又は細胞特異的若しくは組織特異的な発現のためのプロモーターがあげられる。
制御ヌクレオチド配列には、例えば、リーダー配列、例えばＳＶ４０のポリアデニル化シグナルのようなポリアデニル化配列、エンハンサー配列、ＩＲＥＳ配列及びイントロンが含まれる。

下記のリーダー配列は、本発明の好ましいリーダー配列の例である。
Ｉｇｋリーダー：
５’−ＡＴＧＧＡＧＡＣＡＧＡＣＡＣＡＣＴＣＣＴＧＣＴＡＴＧＧＧＴＡＣＴＧＣＴＧＣＴＣＴＧＧＧＴＴＣＣＡＧＧＴＴＣＣＡＣＴＧＧＴＧＡＣ−３’、
ＣＤ５リーダー：
５’−ＡＴＧＣＣＣＡＴＧＧＧＧＴＣＴＣＴＧＣＡＡＣＣＧＣＴＧＧＣＣＡＣＣＴＴＧＴＡＣＣＴＧＣＴＧＧＧＧＡＴＧＣＴＧＧＴＣＧＣＴＴＣＣＴＧＣＣＴＣＧＧＡ−３’、
ＣＤ４リーダー：
５’−ＡＴＧＡＡＣＣＧＧＧＧＡＧＴＣＣＣＴＴＴＴＡＧＧＣＡＣＴＴＧＣＴＴＣＴＧＧＴＧＣＴＧＣＡＡＣＴＧＧＣＧＣＴＣＣＴＣＣＣＡＧＣＡＧＣＣＡＣＴＣＡＧＧＧＡ−３’、
ＩＬ−２リーダー：
５’−ＡＴＧＴＡＣＡＧＧＡＴＧＣＡＡＣＴＣＣＴＧＴＣＴＴＧＣＡＴＴＧＣＡＣＴＡＡＧＴＣＴＴＧＣＡＣＴＴＧＴＣＡＣＡＡＡＣＡＧＴ−３’、
ＭＣＰリーダー：
５’−ＴＧＡＡＡＧＴＣＴＣＴＧＣＣＧＣＣＣＴＴＣＴＧＴＧＣＣＴＧＣＴＧＣＴＣＡＴＡＧＣＡＧＣＣＡＣＣＴＴＣＡＴＴＣＣＣＣＡＡＧＧＧＣＴＣＧＣＴ−３’、
短鎖野生型ＩＬ−１５リーダー：
５’−ＡＴＧＴＣＴＴＣＡＴＴＴＴＧＧＧＣＴＧＴＴＴＣＡＧＴＧＣＡＧＧＧＣＴＴＣＣＴＡＡ−３’、
長鎖野生型ＩＬ−１５リーダー：
ＡＴＧＡＧＡＡＴＴＴＣＧＡＡＡＣＣＡＣＡＴＴＴＧＡＧＡＡＧＴＡＴＴＴＣＣＡＴＣＣＡＧＴＧＣＴＡＣＴＴＧＴＧＴＴＴＡＣＴＴＣＴＡＡＡＣＡＧＴＣＡＴＴＴＴＣＴＡＡＣＴＧＡＡＧＣＴＧＧＣＡＴＴＣＡＴＧＴＣＴＴＣＡＴＴＴＴＧＧＧＣＴＧＴＴＴＣＡＧＴＧＣＡＧＧＧＣＴＴＣＣＴＡＡＡＡＣＡＧＡＡＧＣＣ
構成成分は、転写制御の影響下で、存在している遺伝子の塩基配列が転写されるように連結されて初めて機能的に結びつく。

本発明はさらに、少なくとも１個の本発明の核酸を含有するベクターに関する。
本発明の意味において、ベクターはプラスミド、シャトルベクター、ファージミド、コスミド、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター、発現ベクター、及び遺伝子治療において有効なベクターであり得る。

本発明の意味において、発現ベクターは、真核細胞での発現のために、少なくとも１個の本発明の核酸、少なくとも１個の翻訳開始シグナル、翻訳終止シグナル及び／又はポリアデニル化シグナルを包含する。

特に哺乳動物細胞での発現に用いられる市販の発現ベクター、例えばｐＩＲＥＳ（クローンテック、パロ・アルト、ＵＳＡ）、ｐＣＩ−ｎｅｏベクター（プロメガ、マディソン、ＵＳＡ）、ｐＣＭＶ−Ｓｃｒｉｐｔ（ストラタジーン、ラ・ホーヤ、ＵＳＡ）、及びｐＣＤＮＡベクター（インビトロジェン、ペイズリー、ＵＫ）は、本発明の核酸を組み込むのに好適である。

遺伝子治療において有効な本発明のベクターは、例えば、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター、又はＲＮＡウイルスレプリコンを基にしたベクター等のウイルスベクターである（Ｌｉｎｄｅｍａｎｎら、１９９７、Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．３：４６６−７６；Ｓｐｒｉｎｇｅｒら、１９９８、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．２：５４９−５８；Ｋｈｒｏｍｙｋｈ、２０００、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．２：５５５−６９）。

遺伝子治療において有効なベクターはまた、本発明の核酸フラグメントとリポソームの複合体を形成することによっても得ることができる。リポフェクションにおいて、陽イオン性脂質で構成された微細なユニラメラ小胞は、リポソーム懸濁液を超音波処理することにより調製される。ＤＮＡは、特に陽性正味荷電が残存し、且つ１００％のプラスミドＤＮＡがリポソームと複合体を形成するような比率でリポソーム表面にイオン的に結合する。ＤＯＴＭＡ（１，２−ジオレイルオキシプロピル−３−トリメチルアンモニウムブロミド）及びＤＯＰＥ（ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン）脂質混合物に加えて、現在までに多くの新規脂質製剤が合成され、様々な細胞株において遺伝子導入効率が試験されてきている（Ｂｅｈｒら、１９８９、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：６９８２−６９８６；Ｇａｏ及びＨｕａｎｇ、１９９１、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ １１８９、１９５−２０３；Ｆｅｌｇｎｅｒら、１９９４、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９、２５５０−２５６１）。新規脂質製剤の例は、ＤＯＴＡＰ Ｎ−［１−（２，３−ジオレオイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムエチルサルフェート又はＤＯＧＳ（ＴＲＡＮＳＦＥＣＴＡＭ；ジオクタデシルアミドグリシルスペルミン）である。細胞内への核酸の輸送を増加させる補助剤としては、例えば、ＤＮＡに結合するタンパク質若しくはペプチド、又は核酸の細胞核への輸送を可能にする合成ペプチド−ＤＮＡ分子がある（Ｓｃｈｗａｒｔｚら、１９９９、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ６：２８２；Ｂｒａｎｄｅｎら、１９９９、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｓ．１７：７８４）。補助剤はまた、核酸を細胞質へ遊離させるような分子（Ｐｌａｎｃｋら、１９９４、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９、１２９１８；Ｋｉｃｈｌｅｒら、１９９７、Ｂｉｏｃｏｎｊ．Ｃｈｅｍ．８、２１３）、又は、例えばリポソーム（Ｕｈｌｍａｎｎ及びＰｅｉｍａｎｎ、１９９０、Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．９０、５４４）を包含する。

本発明の主題の一部は、少なくとも１個の本発明の核酸及び／又は少なくとも１個の本発明のベクターを含有する細胞である。
この細胞は、好ましくは、前駆細胞、不死化細胞又は幹細胞、特に全能性又は多能性の胚、胎児、新生児又は成人の幹細胞である。そのような全能性胚幹細胞又は細胞株は、未分化胚芽細胞の内部細胞塊から単離することができる（Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ、「奇形癌及び胚幹細胞」中の「胚由来幹細胞株」：実践アプローチ、Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ編、ＩＲＬプレス、ワシントンＤＣ、１９８７）。成人組織由来の、特に好ましい幹細胞は、例えば、神経幹細胞、骨髄由来幹細胞、間葉性幹細胞、造血幹細胞、上皮性幹細胞、消化管（digestive tract and duct）由来幹細胞を含む。

本発明の細胞の例は、上皮性細胞、血管細胞、肝細胞、心臓細胞、皮膚細胞、筋細胞、神経細胞、骨髄細胞、ＣＨＯ細胞（卵巣細胞）、及び膵腺、腎臓、目又は肺由来の細胞である。

本発明の細胞は、特に、ヒト細胞を含めた哺乳動物細胞である。この細胞は、例えば、ヒト、マウス、ラット、モルモット、ウサギ、雌ウシ、ヤギ、ヒツジ、ウマ、ブタ、イヌ、ネコ又はサル由来であり、好ましくはヒト由来であり得る。

本発明の細胞は、異種遺伝子の発現のためにも使用することができる。
本発明の細胞は、好ましくは細胞株の形態で存在する。本発明の細胞株は、当業者に周知の方法、例えば遺伝子導入法、形質転換法、電気穿孔法、ミクロ注入法又は感染法を用いて、本発明の核酸又は本発明のベクターを細胞に遺伝子導入、形質転換又は感染させることにより調製することができる。

本発明の主題の他の部分は、少なくとも１個の本発明の融合タンパク質、少なくとも１個の本発明の核酸、少なくとも１個の本発明のベクター及び／又は少なくとも１種類の本発明の細胞、及び、適切な場合には、適当な補助剤及び／又は添加剤を含む医薬である。

例えば、医薬又は診断薬を安定化又は保存するために使用する適当な補助剤及び／又は添加剤は当業者に周知である。これらの補助剤及び／又は添加剤の例は、生理的食塩水、グルコースリンゲル液、グルコース、乳酸リンゲル液、脱塩水、安定化剤、抗酸化剤、錯化剤、抗菌化合物、プロテイナーゼ阻害剤及び／又は不活性ガスである。

本発明の医薬は、例えば、疾患の予防、治療又は診断に使用することができる。これら疾患には、例えば以下が含まれる：
・ リウマチ性疾患、例えば関節リウマチ、シェ−グレン症候群、強皮症、皮膚筋炎、多発性筋炎、ライター症候群又はベーチェット病；
・ Ｉ型又はＩＩ型糖尿病；
・ 甲状腺の自己免疫疾患、例えばバセドー氏病、橋本甲状腺炎；
・ 中枢神経系の自己免疫疾患、例えば多発性硬化症；
・ 皮膚疾患、例えば乾癬、神経皮膚炎；
・ 炎症性消化管疾患、例えばクローン病；
・ 免疫不全疾患、例えばＡＩＤＳ；
・ 血管疾患；
・ 移植続発症、例えば移植片拒絶反応；及び
・ がん疾患。

本発明の医薬は、例えば静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、頭蓋内、眼窩内、嚢内経由、髄腔内、経筋肉、局所又は経口などの当業者に周知の方法を用いて投与される。他の投与法は、例えば、全身又は局所注入、潅流又はカテーテルを用いた投与である。

本発明の医薬は、例えば、錠剤やカプセルのような経口投与の形態で、例えば鼻や口腔の粘膜経由で、肺への噴霧の形態で、又は皮下埋め込み型（dispository）の形態で投与することが可能である。経皮吸収システム（ＴＴＳ）が、例えば、ＥＰ ０ ９４４ ３９８−Ａ１、ＥＰ ０ ９１６ ３３６−Ａ１、ＥＰ ０ ８８９ ７２３−Ａ１又はＥＰ ０ ８５２ ４９３−Ａ１に開示されている。

医薬は、細胞を患者から分離し、例えばＤＮＡ遺伝子導入により遺伝子組換えを行った後、再度患者に戻すという生体外アプローチ、又は遺伝子治療に有効な本発明のベクターをＤＮＡそのものとして、又は本発明のウイルスベクター若しくは非ウイルスベクター又は本発明の細胞を用いて患者の体に導入する生体内アプローチを用いて、生体中に導入することが可能である。

医薬の投与量は幾つかの要因、例えば体重、一般健康状態、体表面積、患者の年齢及び他の薬物との相互作用に依存することは先行技術において公知である。投与量は投与方法にも依存する。したがって、投与量は、各々の患者に対し、個々の基準に基づいて当業者によって決定されなければならない。医薬は、１日１回又は数回、及び数日に渉って投与することができる；これもまた当業者によって決定される。

本発明の主題の他の部分は、野生型ＩＬ−１５及びＦｃフラグメントを含有する少なくとも１個の融合タンパク質、該融合タンパク質をコードする少なくとも１個の核酸、少なくとも１個の該核酸を含有する少なくとも１個のベクター、及び／又は少なくとも１個の該核酸及び／又は少なくとも１個の該ベクターを含有する少なくとも１種類の細胞を含有する、ヒト若しくは動物の臓器特異的な組織及び／又はヒト若しくは哺乳動物の臓器に関するものである。

本発明のヒト若しくは動物の臓器特異的な組織及び／又は本発明のヒト若しくは哺乳動物の臓器の融合タンパク質は、好ましくは、一方で野生型ＩＬ−１５を、他方でヒト若しくはマウスＩｇＧ１、ヒトＩｇＧ２、マウスＩｇＧ２ａ、マウスＩｇＧ２ｂ、ヒト若しくはマウスＩｇＧ３、又はヒトＩｇＧ４を含有し、好ましくはヒトＩｇＧ１又はマウスＩｇＧ２ａ、特にＩｇＧ１を含有し、マウスＩｇＧ２ｂを含有しないのが特に好ましい。

本発明のヒト又は動物の臓器特異的な組織は、例えばランゲルハンス島細胞を含めた膵腺、及び心臓、心筋、腎臓、肝臓、肺、脾臓、軟骨、靭帯、網膜、角膜、骨髄、皮膚、神経及び／又は筋組織由来の組織であり得る。

本発明のヒト又は哺乳動物の臓器は、例えば膵腺、心臓、膵腺、腎臓、肝臓、肺、脾臓、目及び／又は皮膚であり得る。
本発明の主題の他の部分は、野生型ＩＬ−１５及びＦｃフラグメントを含有する少なくとも１個の融合タンパク質、該融合タンパク質をコードする少なくとも１個の核酸、少なくとも１個の該核酸を含有する少なくとも１個のベクター、及び／又は少なくとも１個の該核酸及び／又は少なくとも１個の該ベクターを含有する少なくとも１種類の細胞を含む、ヒト以外のトランスジェニック哺乳動物である。

本発明のヒト以外のトランスジェニック哺乳動物の融合タンパク質は、好ましくは、一方で野生型ＩＬ−１５を、他方でヒト若しくはマウスＩｇＧ１、ヒトＩｇＧ２、マウスＩｇＧ２ａ、マウスＩｇＧ２ｂ、ヒト若しくはマウスＩｇＧ３、又はヒトＩｇＧ４を含有し、好ましくはヒトＩｇＧ１又はマウスＩｇＧ２ａ、特にＩｇＧ１を含有し、マウスＩｇＧ２ｂを含有しないのが特に好ましい。

一般的に、トランスジェニック動物は核酸の発現が組織特異的に増加し、従って、例えば免疫反応の解析に大変好適である。トランスジェニックマウスを使用することが好ましい。

本発明のヒト以外の哺乳動物の例は、マウス、ラット、モルモット、ウサギ、雌ウシ、ヤギ、ヒツジ、ウマ、ブタ、イヌ、ネコ又はサルである。
また、本発明の主題の他の部分は、野生型ＩＬ−１５及びＦｃフラグメントを含有する融合タンパク質、該融合タンパク質をコードする核酸、少なくとも１個の該核酸を含有するベクター、及び／又は少なくとも１個の該核酸若しくは少なくとも１個の該核酸を含有する該ベクターを含有する細胞、又は本発明のヒト若しくは動物の臓器特異的な組織及び／又は本発明のヒト若しくは哺乳動物の臓器の使用であって：
・ ＩＬ−１５を介した細胞性反応の阻害；
・ ＩＬ−１５とその受容体との相互作用の阻害；及び／又は
・ 移植続発症、特に移植拒絶反応及び／又は自己免疫疾患の予防及び／又は治療、
のための使用である。

本発明の主題の他の部分は、野生型ＩＬ−１５及びＦｃフラグメントを含有する融合タンパク質、該融合タンパク質をコードする核酸、少なくとも１個の該核酸を含有するベクター、及び／又は少なくとも１個の該核酸及び／又は１個の該ベクターを含有する細胞の、ＩＬ−１５受容体を発現する細胞を溶解するための使用である。

本発明で使用される融合タンパク質は、好ましくは、一方で野生型ＩＬ−１５を、他方でヒト若しくはマウスＩｇＧ１、ヒトＩｇＧ２、マウスＩｇＧ２ａ、マウスＩｇＧ２ｂ、ヒト若しくはマウスＩｇＧ３、又はヒトＩｇＧ４を含有し、好ましくはヒトＩｇＧ１又はマウスＩｇＧ２ａ、特にＩｇＧ１を含有し、マウスＩｇＧ２ｂを含有しないのが特に好ましい。

本発明の使用は、好ましくはヒト若しくは哺乳動物において、又はそれらに関連して行われる。本発明の意味においてヒト哺乳動物とはヒトであると理解されるべきであり、一方、本発明の意味において哺乳動物とは、例えば、マウス、ラット、モルモット、ウサギ、雌ウシ、ヤギ、ヒツジ、ウマ、ブタ、イヌ、ネコ又はサルであると理解されるべきである。

本発明の主題の他の部分は、本発明のヒト若しくは動物の臓器特異的な組織及び／又は本発明のヒト若しくは哺乳動物の臓器の、ヒト又は哺乳動物への移植のための使用である。移植は、好ましくは自家移植、同種移植又は異種移植である。

移植とは、生体物質、例えば細胞、組織又は臓器を、当業者に周知の方法を用いて、体の一部から他の部位へ（自家移植）、又は１個体から他の個体へ（同種移植、同系移植及び異種移植）移すことである（Ｋｌｅｉｎ，Ｊ．Ｓ．（１９９１）Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｅ［Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ］、第１版、ＶＨＣ Ｖｅｒｌａｇｓｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ、ワインハイム、ｐ．４８３）。他の生体への移植に関しては、以下のように区別される：
・ 供与者と受容者が同一種に属し、完全に又は広範囲で遺伝的に同一である同系移植（synotransplantation）；
・ 供与者と受容者が同一種に属するが、免疫学的に異なる同種移植；及び
・ 供与者と受容者が同一種に属さず、従って免疫学的に完全に異なる異種移植。

本発明の融合タンパク質の調製方法は、以下の工程：
ａ． 本発明の少なくとも１個の核酸及び／又は本発明の少なくとも１個のベクターを細胞へ導入すること、及び
ｂ． 適当な条件下で該核酸を発現すること、
を含有し、これもまた本発明の１つの態様である。

核酸、ベクター及び遺伝子、例えば分化マーカー遺伝子又は遺伝子導入マーカー遺伝子の細胞への導入法は当業者には周知であり、先行技術において慣例の方法、例えば電気穿孔、注入、遺伝子導入及び／又は形質転換も包含される。これらの方法は、材料が核酸そのもの、特にＤＮＡを含む場合に特に好ましい。

核酸を発現させる適当な条件は、例えば上記発現ベクターのような発現ベクター、及び例えばプロモーター又は制御核酸配列のような制御エレメントを用いて作製することができる。概して発現ベクターは、任意の細胞にとって又は個々に転写される遺伝子にとって好適なプロモーターも含有する。

真核細胞において恒常的な発現を可能にする制御エレメントの例は、ＲＮＡポリメラーゼＩＩにより認識されるプロモーターである。全ての細胞及び組織タイプにおける恒常的発現のためのプロモーターの例は、ＣＤ１１ｃプロモーター、ｐＧｋ（ホスホグリセリン酸キナーゼ）プロモーター、ＣＭＶ（サイトメガロウイルス）プロモーター、ＴＫ（チミジンキナーゼ）プロモーター、ＥＦ１α（伸長因子１a）プロモーター、ＳＶ４０（シミアンウイルス）プロモーター、ＲＳＶ（ラウス肉腫ウイルス）プロモーター及びｐＵＢ（ユビキチン）プロモーターである。

真核細胞において細胞特異的又は組織特異的な発現を可能にする制御エレメントの例は、ある細胞タイプにおいてのみ発現されるタンパク質をコードする遺伝子のプロモーター又はエンハンサーで構成されるプロモーター又はアクチベーター配列である。このようなプロモーターの例は、膵臓のa細胞に対するインスリンプロモーター、神経細胞に対するＳｏｘ−２プロモーター、肝細胞に対するアルブミンプロモーター、筋細胞に対するミオシン重鎖プロモーター、内皮細胞に対するＶＥ−カドヘリンプロモーター及び上皮性細胞に対するケラチンプロモーターである。

真核細胞において制御可能な発現をする他の制御エレメントの例は、ＲＵ４８６誘導性プロモーター及びテトラサイクリンオペレーター、並びに対応するリプレッサーとの組み合わせである（Ｇｏｓｓｅｎ Ｍ．ら（１９９４）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．５、５１６−２０）。

発現は、量的に及び／又は時間依存性に発現に影響を与える制御ヌクレオチド配列により調節することも可能である。これらの配列は、例えば、エンハンサー配列、リーダー配列、ポリアデニル化配列、ＩＲＥＳ配列及びイントロンを含む。

本発明の主題の他の部分は、本発明のヒト若しくは動物の臓器特異的な組織及び／又は本発明のヒト若しくは哺乳動物の臓器を調製するための試験管内方法に関するものであって、以下の工程：
ａ． ヒト若しくは動物の臓器特異的な組織及び／又はヒト若しくは哺乳動物の臓器由来の少なくとも１種類の幹細胞、前駆細胞及び／又は不死化細胞へ、第１の場所に野生型ＩＬ−１５及びＦｃフラグメントを含有する融合タンパク質をコードする少なくとも１個の核酸及び／又は少なくとも１個の該核酸を含有する少なくとも１個のベクターを、第２の場所に少なくとも１個の適当な分化マーカー遺伝子を導入すること；
ｂ． 工程ａの細胞を分化させること；
ｃ． 工程ｂの分化した細胞を選別すること；及び
ｄ． 工程ｃで選別した細胞を、少なくとも１種類のヒト若しくは動物の臓器特異的な組織及び／又は少なくとも１種類のヒト若しくは哺乳動物の臓器へ導入すること、
を含有する。

好ましい態様では、少なくとも１個の適当な遺伝子導入マーカー遺伝子は、上記本発明の方法において、工程ａの前、後又は同時に導入され、工程ａで遺伝子導入された細胞は工程ａの後で選別されることが好ましい。

細胞を分化させる適当な条件は、例えば所望の細胞分化を起こさせる増殖因子を添加することでつくることができる。
多くの細胞選別方法が当業者に周知である。

分化した細胞を他の細胞から選別するために、本発明の方法は正の選択スキームを含有することが好ましい。これに関して、マーカー遺伝子、例えば抗生物質耐性を付与する遺伝子が分化工程の前、中間又は後で細胞に導入され、適当な条件下で発現される。これらの条件は、例えば、所望の細胞でのみ活性を示すプロモーターの制御下でのマーカー遺伝子の発現から成ることができる。

マーカー遺伝子の発現は、成功裏に分化した細胞に抗生物質に対する耐性を付与する。従って、分化の後での細胞選別は、例えば、細胞を対応する抗生物質に接触させることで容易に行うことができる。対応する抗生物質に耐性を有しない細胞は死滅するため、分化した細胞のみが生き残るる。本発明の意味において、接触とは、例えば、細胞培養の栄養培地に活性物質を添加することで行うことができる。

本発明の抗生物質は、本発明の選別カセットとして使用される抗生物質耐性遺伝子が耐性を生じさせるところの抗生物質であると理解される。抗生物質を培養幹細胞へ添加した後、生き残って分化した幹細胞だけが本質的にレポーター遺伝子発現ベクターを有する細胞である。

第２のマーカー遺伝子を細胞に導入することが好ましく、これにより核酸及び／又はベクターが該方法の工程ａにしたがって成功裏に導入された細胞を選別することが可能となる。この２重選別により、純度約９０％、好ましくは約９５〜１００％の所望の細胞集団を得ることが可能である。

これらの選別のために、例えば、分化マーカー遺伝子及び遺伝子導入マーカー遺伝子が用いることが可能である。所定の有毒物質、例えば抗生物質に対する耐性を付与する遺伝子が主にこの種の遺伝子として使用される。これに関連して最も頻繁に使用される抗生物質は、ネオマイシン、ハイグロマイシン（ｈｐｈ）、ゼオシン（Ｓｈ ｂｌｅ）及びピューロマイシン（ｐａｃＡ）である。

選別、特に幹細胞の選別に好適な他の遺伝子は、例えば、細胞表面分子又はＧＦＰなどの蛍光マーカーの発現を制御する遺伝子、及び選別する細胞をセルソーティングで精製するために使用可能な遺伝子である。他の例として、有毒物質の前駆体、即ち「プロドラッグ」と称するものを有毒物質へと変換させる酵素活性をコードする遺伝子がある。この場合選別は負であり得、即ち生き残る細胞は該遺伝子の上流に位置するプロモーターを発現していない細胞だけである。

本発明の主題の他の部分は、本発明のヒト以外のトランスジェニック哺乳動物を作製する方法であって、以下の工程：
ａ． ヒト以外の哺乳動物由来の少なくとも１種類の卵母細胞、幹細胞、前駆細胞及び／又は不死化細胞へ、一方で野生型ＩＬ−１５及びＦｃフラグメントを含有する融合タンパク質をコードする少なくとも１個の核酸、及び／又は少なくとも１個の該核酸を含有する少なくとも１個のベクターを、他方で少なくとも１個の適当な遺伝子導入マーカー遺伝子を導入すること；
ｂ． 工程ａの遺伝子導入細胞を選別すること；
ｃ． 工程ｂにしたがって選別された細胞を、少なくとも１種類のヒト以外の哺乳動物由来未分化胚芽細胞へ導入すること；
ｄ． 工程ｃで得られた未分化胚芽細胞を、ヒト以外の、好ましくは偽妊娠させた哺乳動物養母へ導入すること；及び
ｅ． 該未分化胚芽細胞から生育したヒト以外のトランスジェニック哺乳動物を特定すること、
を含む。

未分化胚芽細胞の導入法は当業者に公知である。未分化胚芽細胞は、例えば注入により導入されることが可能である（Ｈｏｇａｎ，Ｂ．、Ｂｅｄｄｉｎｇｔｏｎ，Ｒ．、Ｃｏｎｓｔａｎｔｉｎｉ，Ｆ．及びＬａｃｙ，Ｅ．、実験室マニュアル（１９９４）コールド・スプリング・ハーバー研究所出版）。

ヒト以外のトランスジェニック哺乳動物は、例えば、ヒト以外のトランスジェニック哺乳動物から、例えばマウスの尾から、ゲノムＤＮＡを抽出することにより特定することが可能である。その後のＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）では、本発明の核酸に対するトランス遺伝子を特異的に認識するプライマーが使用される。トランス遺伝子はこの方法で検出することができる。

特定を行うための他の可能性としてサザンブロッティングによる方法がある。この方法では、ゲノムＤＮＡが膜に転写され、ＤＮＡプローブ、例えば求めるトランス遺伝子に特異的な放射性標識されたＤＮＡプローブを用いて検出される。

ヒト以外の幹細胞、卵母細胞、前駆細胞又は不死化細胞を再生させることにより、ヒト以外のトランスジェニック動物、特にトランスジェニックマウスを生ずる本発明のヒト以外のトランスジェニック哺乳動物を作製する方法は、ＤＥ１９６ ２５ ０４９号並びにＵＳ４，７３６，８６６号；ＵＳ５，６２５，１２２号；ＵＳ５，６９８，７６５号；ＵＳ５，５８３，２７８号及びＵＳ５，７５０，８２５号から当業者に公知であり、また例えば本発明の発現ベクターを胚若しくは***細胞に直接注入することによって又は発現ベクターを胚幹細胞へ遺伝子導入することによって作製することができるトランスジェニック動物を包含する（Ｐｉｎｋｅｒｔ、１９９４：トランスジェニック動物技術：実験室ハンドブック、アカデミックプレス、サンディエゴ、ＵＳＡの中のＰｏｌｉｔｅｓ及びＰｉｎｋｅｒｔ：ＤＮＡマイクロインジェクション及びトランスジェニック動物の作製、ｐｐ．１５−６８；Ｈｏｕｄｅｂｉｎｅ １９９７、Ｈａｒｗｏｏｄ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、アムステルダム、オランダ；Ｐｉｎｋｅｒｔ、１９９４、上記の中のＤｏｅｔｓｃｈｍａｎ：胚幹細胞への遺伝子移入、ｐｐ．１１５−１４６；Ｐｉｎｋｅｒｔ、１９９４、上記の中のＷｏｏｄ：レトロウイルス介在遺伝子移入、ｐｐ．１４７−１７６；Ｐｉｎｋｅｒｔ、１９９４、上記の中のＭｏｎａｓｔｅｒｓｋｙ：遺伝子移入技術：代替技術及び適用、ｐｐ．１７７−２２０）。

本発明のヒト以外のトランスジェニック哺乳動物は、本発明の核酸をヒト以外の哺乳動物の前核中へ直接注入することによっても作製できる。
トランスジェニック動物、特にトランスジェニックマウスを作製する多くの方法は、とりわけＷＯ９８／３６０５２号、ＷＯ０１／３２８５５号、ＤＥ１９６ ２５ ０４９号、ＵＳ４，７３６，８６６号、ＵＳ５，６２５，１２２号、ＵＳ５，６９８，７６５号、ＵＳ５，５８３，２７８号及びＵＳ５，７５０，８２５号からも当業者に公知であり、また例えば本発明のベクターを胚又は***細胞に直接注入することによって又はベクター又は核酸を胚幹細胞へ遺伝子導入することによって作製することができるトランスジェニック動物を包含する（Ｐｉｎｋｅｒｔ（１９９４）トランスジェニック動物技術：実験室ハンドブック、アカデミックプレス、ロンドン、ＵＫ、ｐｐ．１５−６８中のＰｏｌｉｔｅｓ及びＰｉｎｋｅｒｔ；Ｐｉｎｋｅｒｔ、１９９４、上記の中のＤｏｅｔｓｃｈｍａｎｎ、ｐｐ．１１５−１４６）。

本発明の主題の他の部分は、上記本発明の方法にしたがって作製された、ヒト以外のトランスジェニック哺乳動物及びその子孫に関する。
他の態様では、本発明のヒト若しくは動物の臓器特異的な組織及び／又は本発明のヒト若しくは哺乳動物の臓器を調製するための本発明の試験管内方法において、並びに本発明のヒト以外のトランスジェニック哺乳動物を作製するための方法において使用される幹細胞は、全能性又は多能性の胚、胎児、新生児又は成人の幹細胞である。

本発明の主題の一部は、本発明のヒト以外のトランスジェニック動物の、同種移植及び／又は異種移植用に細胞、臓器特異的な組織及び／又は哺乳動物の臓器を得るための使用に関する。

細胞を移植する場合、例えば埋め込み法又は血管壁を通したカテーテルによる注入法を用いて行うことができる。
本発明の意味において、「得る」とは、本発明のヒト以外のトランスジェニック哺乳動物の体から該細胞、組織及び／又は臓器を摘出することを意味すると理解されるべきである。この摘出を実施する適当な方法は当業者に周知である。

本発明のヒト以外のトランスジェニック哺乳動物、本発明のヒト若しくは動物の臓器特異的な組織及び／又は本発明のヒト若しくは哺乳動物の臓器の、薬理的に活性な化合物の発見及び／又は有毒物質の特定のための使用も本発明の主題の一部である。

そのような方法は、例えば、本発明の細胞を９６ウェルマイクロタイタープレートへ播種し、調べる薬理的活性物質又は有毒物質を添加し、次にその物質が細胞死の比率を増加させるかどうかを細胞数の測定により解析することから成るであろう。

本発明の意味において、薬理的に活性な化合物及び有毒物質という用語は、適当な条件下で、哺乳動物またはヒトの個々の細胞、個々の組織、個々の臓器又は全身に対して薬理的な又は有毒な作用を発揮する全ての分子、化合物及び／又は組成物及び物質の混合物を意味すると理解されるべきである。可能性のある薬理的に活性な化合物及び有毒物質としては、単純な化学（有機又は無機）分子又は化合物、核酸又は核酸アナログ、核酸アンチセンス配列、ペプチド、タンパク質又は複合体及び抗体である。物質ライブラリー（substance library）に由来し、薬理活性又は毒性が解析される有機分子がその例である。

薬理的に活性な化合物の例は：
・ 細胞の***能及び／又は生存能；
・ 例えば膵臓のβ細胞によるインスリンの分泌又は神経細胞によるドーパミンの分泌のようなタンパク質分泌；
・ 筋細胞の収縮；及び／又は
・ 細胞の遊走行動、
に作用を発揮する活性化合物である。

哺乳動物又はヒトの全身に使用される場合には、これは、例えば：
・ 心臓血管系；
・ 神経系；及び
・ 代謝活性、
への作用を意味すると理解されるべきである。

有毒物質の例は：
・ シグナル、例えばストレスを与えた後、細胞を刺激してアポトーシスを起こす；
・ 心臓血管系に作用を及ぼす；
・ 神経系に影響を及ぼす；及び／又は
・ 代謝活性に影響を及ぼす、
活性化合物である。

現在までに特定されている薬理的に活性な化合物及び有毒物質は、適当な場合には好適な添加剤及び／又は補助剤と組み合わせて又は一緒に、例として上記した移植続発症及び／又は自己免疫疾患の診断、予防及び／又は治療のための診断薬又は医薬を製造するために使用することが可能である。

以下の図面及び実施例は本発明を明確にすることを意図するものであり、それらに限定されるものではない。
説明：ｈＩｇＧ１はヒトＩｇＧ１を、ｍＩｇＧ２ａはマウスＩｇＧ２ａを意味する。

本発明の主題の他の部分は次のことに関する。
（ｉ） 野生型ＩＬ−１５、及びマウスＩｇＧ２ｂ Ｆｃフラグメントを除くＩｇＧ Ｆｃフラグメントで構成される融合タンパク質。
（ｉｉ） ＩｇＧ Ｆｃフラグメントが、ヒト若しくはマウスＩｇＧ１、ヒトＩｇＧ２、マウスＩｇＧ２ａ、ヒト若しくはマウスＩｇＧ３又はヒトＩｇＧ４であることを特徴とする、（ｉ）に記載の融合タンパク質。
（ｉｉｉ） アミノ酸配列番号１又はその対立遺伝子多型を含有する、（ｉ）又は（ｉｉ）に記載の融合タンパク質。
（ｉｖ） アミノ酸配列番号２又はその対立遺伝子多型を含有する、（ｉ）又は（ｉｉ）に記載の融合タンパク質。
（ｖ） アミノ酸配列番号３又はその対立遺伝子多型を含有する、（ｉ）又は（ｉｉ）に記載の融合タンパク質。
（ｖｉ） アミノ酸配列番号４又はその対立遺伝子多型を含有する、（ｉ）又は（ｉｉ）に記載の融合タンパク質。
（ｖｉｉ） アミノ酸配列番号５又はその対立遺伝子多型を含有する、（ｉ）又は（ｉｉ）に記載の融合タンパク質。
（ｖｉｉｉ） （ｉ）〜（ｖｉｉ）の少なくとも１項に記載の融合タンパク質をコードする核酸。
（ｉｘ） ＤＮＡ配列番号６又はその対立遺伝子多型を含有する、（ｖｉｉｉ）に記載の核酸。
（ｘ） ＤＮＡ配列番号７又はその対立遺伝子多型を含有する、（ｖｉｉｉ）に記載の核酸。
（ｘｉ） ＤＮＡ配列番号８又はその対立遺伝子多型を含有する、（ｖｉｉｉ）に記載の核酸。
（ｘｉｉ） ＤＮＡ配列番号９又はその対立遺伝子多型を含含有する、（ｖｉｉｉ）に記載の核酸。
（ｘｉｉｉ） ＤＮＡ配列番号１０又はその対立遺伝子多型を含有する、（ｖｉｉｉ）に記載の核酸。
（ｘｉｖ） （ｉｘ）〜（ｘｉｉｉ）のいずれか１項に記載の核酸にコードされる融合タンパク質。
（ｘｖ） （ｖｉｉｉ）〜（ｘｉｖ）の少なくとも１項に記載の少なくとも１個の核酸を含有するベクター。
（ｘｖｉ） （ｖｉｉｉ）〜（ｘｉｖ）の少なくとも１項に記載の少なくとも１個の核酸及び／又は（ｘｖ）に記載の少なくとも１個のベクターを含有する細胞。
（ｘｖｉｉ） 幹細胞、前駆細胞及び／又は不死化細胞であることを特徴とする、（ｘｖｉ）に記載の細胞。
（ｘｖｉｉｉ） 多能性又は多分化能の胚、胎児、新生児又は成人の幹細胞であることを特徴とする、（ｘｖｉｉ）に記載の細胞。
（ｘｉｘ） 細胞株の形態である（ｘｖｉ）〜（ｘｖｉｉｉ）の少なくとも１項に記載の細胞。
（ｘｘ） （ｉ）〜（ｖｉｉ）及び（ｘｉｖ）のいずれか１項に記載の少なくとも１個の融合タンパク質、（ｖｉｉｉ）〜（ｘｉｉｉ）のいずれか１項に記載の少なくとも１個の核酸、（ｘｖ）に記載の少なくとも１個のベクター、及び／又は（ｘｖｉ）〜（ｘｖｉｉｉ）のいずれか１項に記載の少なくとも１種類の細胞、及び適当な補助剤及び／又は添加剤を包む医薬。
（ｘｘｉ） 特に（ｉ）〜（ｖｉｉ）及び（ｘｉｖ）のいずれか１項に記載の、少なくとも１個の融合タンパク質、特に（ｖｉｉｉ）〜（ｘｉｉｉ）のいずれか１項に記載の、該融合タンパク質をコードする少なくとも１個の核酸、特に（ｘｖ）に記載の、少なくとも１個の該核酸を含有する少なくとも１個のベクター、及び／又は特に（ｘｖｉ）〜（ｘｖｉｉｉ）のいずれか１項に記載の、少なくとも１個の該核酸及び／又は少なくとも１個の該ベクターを含有する少なくとも１種類の細胞を含有し、該融合タンパク質は野生型ＩＬ−１５とＦｃフラグメントを含有する、ヒト若しくは動物の臓器特異的な組織及び／又はヒト若しくは哺乳動物の臓器。
（ｘｘｉｉ） 特に（ｉ）〜（ｖｉｉ）及び（ｘｉｖ）のいずれか１項に記載の、少なくとも１個の融合タンパク質、特に（ｖｉｉｉ）〜（ｘｉｉｉ）のいずれか１項に記載の、該融合タンパク質をコードする少なくとも１個の核酸、特に（ｘｖ）に記載の、少なくとも１個の該核酸を含有する少なくとも１個のベクター、及び／又は特に（ｘｖｉ）〜（ｘｖｉｉｉ）のいずれか１項に記載の、少なくとも１個の該核酸及び／又は少なくとも１個の該ベクターを含有する少なくとも１種類の細胞を含み、該融合タンパク質は野生型ＩＬ−１５とＦｃフラグメントを含有する、ヒト以外のトランスジェニック哺乳動物。
（ｘｘｉｉｉ） 特に（ｉ）〜（ｖｉｉ）及び（ｘｉｖ）のいずれか１項に記載の、野生型ＩＬ−１５とＦｃフラグメントを含有する融合タンパク質、特に（ｖｉｉｉ）〜（ｘｉｉｉ）のいずれか１項に記載の核酸、特に（ｘｖ）に記載のベクター、及び／又は特に（ｘｖｉ）〜（ｘｖｉｉｉ）のいずれか１項に記載の細胞、又は（ｘｘｉ）に記載の、ヒト若しくは動物の臓器特異的な組織及び／又はヒト若しくは哺乳動物の臓器の、ＩＬ−１５を介した細胞性反応を阻害する医薬を製造するための使用。
（ｘｘｉｖ） 特に（ｉ）〜（ｖｉｉ）及び（ｘｉｖ）のいずれか１項に記載の、野生型ＩＬ−１５とＦｃフラグメントを含有する融合タンパク質、特に（ｖｉｉｉ）〜（ｘｉｉｉ）のいずれか１項に記載の核酸、特に（ｘｖ）に記載のベクター、及び／又は特に（ｘｖｉ）〜（ｘｖｉｉｉ）のいずれか１項に記載の細胞、又は（ｘｘｉ）に記載の、ヒト若しくは動物の臓器特異的な組織及び／又はヒト若しくは哺乳動物の臓器の、ＩＬ−１５とその受容体との相互作用を阻害する医薬を製造するための使用。
（ｘｘｖ） 特に（ｉ）〜（ｖｉｉ）及び（ｘｉｖ）のいずれか１項に記載の、野生型ＩＬ−１５とＦｃフラグメントを含有する融合タンパク質、特に（ｖｉｉｉ）〜（ｘｉｉｉ）のいずれか１項に記載の核酸、特に（ｘｖ）に記載のベクター、及び／又は特に（ｘｖｉ）〜（ｘｖｉｉｉ）のいずれか１項に記載の細胞の、ＩＬ−１５受容体を発現する細胞を溶解する医薬を製造するための使用。
（ｘｘｖｉ） 特に（ｉ）〜（ｖｉｉ）及び（ｘｉｖ）のいずれか１項に記載の、野生型ＩＬ−１５とＦｃフラグメントを含有する融合タンパク質、特に（ｖｉｉｉ）〜（ｘｉｉｉ）のいずれか１項に記載の核酸、特に（ｘｖ）に記載のベクター、及び／又は特に（ｘｖｉ）〜（ｘｖｉｉｉ）のいずれか１項に記載の細胞、又は（ｘｘｉ）に記載の、ヒト若しくは動物の臓器特異的な組織及び／又はヒト若しくは哺乳動物の臓器の、移植続発症及び／又は自己免疫疾患の予防及び／又は治療用の医薬を製造するための使用。
（ｘｘｖｉｉ） （ｘｘｉ）に記載の、ヒト若しくは動物の臓器特異的な組織及び／又はヒト若しくは哺乳動物の臓器の、ヒト又は哺乳動物への移植のための使用。
（ｘｘｖｉｉｉ） 移植が自家移植、同種移植又は異種移植であることを特徴とする、（ｘｘｖｉｉ）に記載の使用。
（ｘｘｉｘ） （ｉ）〜（ｖｉｉ）及び（ｘｉｖ）の少なくとも１項に記載の融合タンパク質を調製するための方法であって、以下の工程：
ａ． （ｖｉｉｉ）〜（ｘｉｉｉ）のいずれか１項に記載の少なくとも１個の核酸及び／又は（ｘｖ）に記載の少なくとも１個のベクターを細胞へ導入すること；及び
ｂ． 適当な条件下において該核酸を発現させること、
を含む前記方法。
（ｘｘｘ） （ｘｘｉ）に記載のヒト若しくは動物の臓器特異的な組織及び／又はヒト若しくは哺乳動物の臓器を調製するための試験管内方法であって、以下の工程：
ａ． ヒト若しくは動物の臓器特異的な組織及び／又はヒト若しくは哺乳動物の臓器由来の少なくとも１種類の幹細胞、前駆細胞及び／又は不死化細胞へ、第１の場所に野生型ＩＬ−１５及びＦｃフラグメントを含有する融合タンパク質をコードする少なくとも１個の核酸、及び／又は特に（ｖｉｉｉ）〜（ｘｉｉｉ）のいずれか１項に記載の少なくとも１個の該核酸を含有する少なくとも１個のベクターを、第２の場所に少なくとも１個の適当な分化マーカー遺伝子を導入すること；
ｂ． 工程ａの細胞を分化させること；
ｃ． 工程ｂの分化した細胞を選別すること；及び
ｄ． 工程ｃで選別した細胞を、ヒト若しくは動物の臓器特異的な組織及び／又はヒト若しくは哺乳動物の臓器へ導入すること、
を含む前記方法。
（ｘｘｘｉ） 少なくとも１個の遺伝子導入マーカー遺伝子が、工程ａの前、後又は同時に導入され、工程ａで遺伝子導入された細胞が好ましくは工程ａの後で選別されることを特徴とする、（ｘｘｘ）に記載の方法。
（ｘｘｘｉｉ） 細胞が多能性又は多分化能の胚、胎児、新生児又は成人の幹細胞であることを特徴とする、（ｘｘｘ）又は（ｘｘｘｉ）に記載の方法。
（ｘｘｘｉｉｉ） （ｘｘｉｉ）に記載のヒト以外のトランスジェニック哺乳動物を作製するための方法であって、以下の工程：
ａ． ヒト以外の哺乳動物由来の少なくとも１種類の卵母細胞、幹細胞、前駆細胞及び／又は不死化細胞へ、一方では野生型ＩＬ−１５及びＦｃフラグメントを含有する融合タンパク質をコードする、特に（ｖｉｉｉ）〜（ｘｉｉｉ）のいずれか１項に記載の少なくとも１個の核酸、及び／又は少なくとも１個の該核酸を含有する、特に（ｘｖ）に記載の少なくとも１個のベクターの導入を、他方では少なくとも１個の適当な遺伝子導入マーカー遺伝子を導入すること；
ｂ． 工程ａの遺伝子導入細胞を選別すること；
ｃ． 工程ｂにしたがって選別された細胞を、少なくとも１種類のヒト以外の哺乳動物由来の未分化胚芽細胞へ導入すること；
ｄ． 工程ｃで得られた未分化胚芽細胞をヒト以外の哺乳動物養母へ導入すること；及び
ｅ． 該未分化胚芽細胞から生育したヒト以外のトランスジェニック哺乳動物を特定すること、
を含む前記方法。
（ｘｘｘｉｖ） 細胞が多能性又は多分化能の胚、胎児、新生児又は成人の幹細胞であることを特徴とする、（ｘｘｘｉｉｉ）に記載の方法。
（ｘｘｘｖ） （ｘｘｘｉｉｉ）及び（ｘｘｘｉｖ）に記載の方法を使用して作製されたことを特徴とする、ヒト以外のトランスジェニック哺乳動物。
（ｘｘｘｖｉ） （ｘｘｘｖ）に記載の哺乳動物の子孫であることを特徴とする、ヒト以外のトランスジェニック哺乳動物。
（ｘｘｘｖｉｉ） 同種移植及び／又は異種移植用に細胞、臓器特異的な組織及び／又は哺乳動物の臓器を得るための、（ｘｘｉｉ）、（ｘｘｘｖ）及び（ｘｘｘｖｉ）の少なくとも１項に記載のヒト以外のトランスジェニック哺乳動物の使用。
（ｘｘｘｖｉｉｉ） （ｘｘｉｉ）、（ｘｘｘｖ）及び（ｘｘｘｖｉ）のいずれか１項に記載の、ヒト以外のトランスジェニック哺乳動物、又は（ｘｘｉ）に記載の、ヒト若しくは動物の臓器特異的な組織及び／又はヒト若しくは哺乳動物の臓器の、薬理的に活性な化合物の発見及び／又は有毒物質の特定のための使用。

実施例
試薬類
特に言及しない限り、細胞培地、酵素等の試薬類はインビトロジェン（以前はギブコＢＲＬ／ライフテクノロジーズ）、ペイズリー、ＵＫから入手し、実験試薬類はＲｏｔｈ（カールスルーエ、ドイツ）から入手した。

シグナル配列の置換
本工程は、変異型ヒトＩＬ−１５及びマウスＩｇＧ２ａＦｃ部分（ヒンジ−Ｃ２−Ｃ３、Ｋｉｍら、１９９８、上記）で構成される融合タンパク質に対するｃＤＮＡをｐＳｅｃＴａｇＡベクター（インビトロジェン、ペイズリー、ＵＫ）中に含有するプラスミドから開始した。ＩＬ−１５をＢａｍＨＩ切断部位でＦｃ部分と融合させ、付加的なアミノ酸（アスパラギン酸）を接合部に挿入した。

タンパク質がＩＬ−１５受容体のαサブユニットには結合できるが、β及びγサブユニットを介したシグナル伝達は阻害できるように、ＩＬ−１５中の１４９番目及び１５６番目（シグナル配列除去後の１０１番目及び１０８番目に相当）の２箇所のグルタミン残基をアスパラギン酸に変異させた。ヒトＩＬ−１５から特に効率的ではない本来のシグナル配列を除去し、相応して切断ｃＤＮＡをｐＳｅｃＴａｇＡベクター中にＨｉｎｄＩＩＩ及びＸｂａＩ切断部位を利用してクローニングし、プラスミド中に存在するＩｇ κリーダーを分泌シグナルとして使用できるようにした。クローニングの結果、１０個の付加的なアミノ酸がプラスミド中に存在するＩｇ κリーダーとＩＬ−１５配列の開始部との間に位置した。これらのアミノ酸残基を除去するために、また可能であればタンパク質の分泌を改善するために、Ｉｇ κリーダーを種々の他のタンパク質のシグナル配列と置換した。これに関して、ヒトＩＬ−２、ＭＣＰ−１、ＣＤ４及びＣＤ５のリーダー配列が、付加的なアミノ酸のみが除去されたオリジナルＩｇ κリーダーの代替としてクローニングすることができる。

ｐＳｅｃＴａｇＡプラスミドの調製
シグナル配列は、リーダー配列のＡＴＧ開始コドンから５’方向に位置するユニークＮｈｅＩ切断部位と、ＩＬ−１５配列の５’領域中に位置するＢｇｌＩＩ切断部位とを利用してクローニングされるため、まず始めにｐＳｅｃＴａｇＡベクターからもう１つのＢｇｌＩＩ切断部位を除去した。このために、インサートを有しないｐＳｅｃＴａｇＡベクターをＢｇｌＩＩで切断した（混合液：全量４０μｌ中、ＤＮＡ ９μｇ、１０×緩衝液２ ４μｌ、水 ２６μｌ、及びＢｇｌＩＩ（４０Ｕ）４μｌ、３７℃で２時間インキュベート）。

ＤＮＡをファルマシアＳ４００マイクロスピンカラム（アマシャム・ファルマシア、フライブルグ）を通して酵素及び緩衝液から精製した。５μｌの１０×ＰＣＲ緩衝液（Ｔａｑ−Ｃｏｒｅキット、キアゲン、ヒルデン）、２μｌのｄＮＴＰｓ（各々１０ｍＭ、Ｔａｑ−Ｃｏｒｅキット、キアゲン）、２μｌの水及び１μｌ（４Ｕ）のＤＮＡポリメラーゼＩ（クレノーフラグメント）を４０μｌの混合液に加え、ＢｇｌＩＩ切断部位を埋めるために全量を３７℃で１時間インキュベートした。次に、プラスミドを１％アガロースゲルで分離し、バンドをコンサートラピッド−ゲル抽出システムを用いてゲルから抽出した。全混合液を１００μｌの水に溶かした。この混合液のうちの７．５μｌを、７．５μｌの水、４μｌの５×Ｔ４リガーゼ緩衝液及び１μｌのＴ４リガーゼ（１Ｕ）と伴に室温で１時間連結反応を行った。連結反応混合液の半量を製造者（ストラタジーン、ラ・ホーヤ、ＵＳＡ）の使用説明書に従って大腸菌ＸＬ１ Ｂｌｕｅに形質転換した。

上記のプラスミドからの全インサート、すなわちＩｇ κリーダー＋１０個の付加アミノ酸−ｍｕｔＩＬ−１５−ｍＩｇＧ２ａを、得られたプラスミド中にＮｈｅＩ及びＸｂａＩ切断部位を利用して再度クローニングした。次に、オリジナルＩｇ κリーダー＋１０個のアミノ酸＋５’−ＩＬ−１５部分をＮｈｅＩ／ＢｇｌＩＩで切断して除去し、オリゴヌクレオチドクローニング法を用いて上記のシグナル配列と置換した。

Ｉｇ κリーダーのクローニング
フラグメントは次の通りである：ＩＬ−１５の５’部分にＢｇｌＩＩ切断部位を有する５’−ＮｈｅＩ−リーダー−ＩＬ−１５−３’。このフラグメントは長すぎて単一のオリゴヌクレオチドではカバーできないため、２種類の重複したオリゴ及びそれらの相補鎖（全部で４種類のオリゴヌクレオチド）をＭＷＧ−Ｂｉｏｔｅｃｈ（エーバースベルク）から入手した（オリゴヌクレオチドの塩基配列は下記を参照されたい）。１本鎖オリゴヌクレオチドは、対応する制限酵素切断部位（ＮｈｅＩ及びＢｇｌＩＩ）にクローニングするための突出末端がすでに存在するように選択した。最初にオリゴヌクレオチドをリン酸化した。このために、各々１０μｇのオリゴを、２μｌの１０×フォワード緩衝液及び１μｌのＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（１０Ｕ）を含有する２０μｌの混合液中、３７℃で１時間インキュベートした。次に、いずれの場合にも、等モル量のストランドオリゴとカウンターストランドオリゴを、９５℃に加熱し、室温までゆっくりと冷却してアニーリングした。ベクターにクローニングする前に、２本鎖オリゴヌクレオチドを１晩連結した。いずれの場合にも、５μｌの５’及び３’２本鎖オリゴ＋４μｌの５×Ｔ４リガーゼ緩衝液＋５μｌの水＋１μｌのＴ４リガーゼ（１Ｕ）を４℃で１晩インキュベートした。次に、連結反応混合液を２％アガロースゲルで分離した後、コンサートラピッドゲル抽出システムを用いてオリゴダイマーをゲルから溶出し、最終的に４０μｌに溶解した。次にオリゴダイマーをクローニングに用いた：連結反応は１２℃で１晩行った（１０μｌのオリゴダイマー、４μｌの５×Ｔ４リガーゼ緩衝液、４μｌの水、１μｌのＮｈｅＩ／ＢｇｌＩＩで切断済プラスミド、１μｌのＴ４リガーゼ（１Ｕ））。２０μｌの連結反応混合液のうちの５μｌを用いて、大腸菌ＸＬ１０−Ｇｏｌｄを形質転換した（ストラタジーン、製造業者の使用説明書に従った）。

Ｉｇ−κオリゴヌクレオチドの配列：
５−Ｉｇ−κ ｆｗｄ
ｃｔａｇｃｃａｃｃａｔｇｇａｇａｃａｇａｃａｃａｃｔｃｃｔｇｃｔａｔｇｇｇｔａｃｔｇｃｔｇｃｔｃｔｇｇｇｔｔｃｃａｇｇｔｔｃｃａｃｔｇｇｔｇａｃａａ
相補鎖 Ｉｇ−κ ｒｅｖ：
ｃｃａｇｔｔｇｔｃａｃｃａｇｔｇｇａａｃｃｔｇｇａａｃｃｃａｇａｇｃａｇｃａｇｔａｃｃｃａｔａｇｃａｇｇａｇｔｇｔｇｔｃｔｇｔｃｔｃｃａｔｇｇｔｇｇ
第２フォワードオリゴ：３’−ＩＬ−１５ ｆｗｄ１：１：
ｃｔｇｇｇｔｇａａｔｇｔａａｔａａｇｔｇａｔｔｔｇａａａａａａａｔｔｇａ
相補鎖 ＩＬ−１５ ｒｅｖ１．１
ｇａｔｃｔｔｃａａｔｔｔｔｔｔｔｃａａａｔｃａｃｔｔａｔｔａｃａｔｔｃａｃ
アニーリングと連結反応の後、次のフラグメントが得られる：
下記配列（２本鎖）を有する５’−ＮｈｅＩ−Ｉｇ−κ−リーダー−ＩＬ−１５−ＢｇｌＩＩ−３’

相補鎖：

説明：
斜体＋下線：それぞれＮｈｅＩ及びＢｇｌＩＩ切断部位；太字：Ｉｇ−κリーダー。
得られたクローンの制限酵素パターンをミニプレップ（ＱＩＡａｍｐ ＤＮＡミニキット、キアゲン、ヒルデン）を用いて解析した。このために、ＮｈｅＩ／ＢｇｌＩＩ（挿入されたリーダーを直接切り出す制限酵素）及びＸｂａＩ（Ｆｃ部分の３’を切断）を用いて３重消化を行った。

陽性のＤＮＡクローンを、キアゲンＥｎｄｏｆｒｅｅマキシキットを用い、製造業者の使用説明書に従って単離し、ＧＡＴＣ（ｃｏｎｓｔａｎｃｅ）で塩基配列を決定した。この方法で得られたプラスミド（余分な配列を除去した（cleaned-up）Ｉｇ−κリーダーを有するｍｕｔＩＬ−１５（１０１／１０８）−ｍＩｇＧ２ａ）をＩｇｋ８と命名した。

他のリーダーに対する手順は、Ｉｇ−κ構築物について記載したものと全く同一である。

構築物ＷＴ−Ｆｃ及び１４９−Ｆｃの調製：
上記のプラスミドＩｇｋ８から開始して、５’末端にＢｇｌＩＩ切断部位を有するフォワードプライマー（ＩＬ−１５ｆｗ３．１：５’−ａｔｔｇａａｇａｔｃｔｔａｔｔｃａａｔｃｔａｔｇｃ−３’）及び対応する３’リバースプライマー（ＷＴ：５’−ｇｇａｔｃｃｇａａｇｔｇｔｔｇａｔｇａａｃａｔｔｔｇｇａｃａａｔａｔｇｔａｃａａａａｃｔｃｔｇｃａａａａａｔｔｃ−３’）、（１４９：５’−ｇｇｇａｔｃｃ−ｇａａｇｔｇｔｔｇａｔｇａａｃａｔｔｔｇｇａ−３’）を用いたＰＣＲで、各々の変異体を調製した。

いずれの場合にも、２５ｐモルのプライマー、０．５μｌのｄＮＴＰｓ（Ｔａｑ−Ｃｏｒｅキット、キアゲン）及び２．５μｌの１０×ＰＣＲ緩衝液及び０．９ＵのＴａｑポリメラーゼ（長距離−高精度システム、ロシュ、マンハイム）を含有する２５μｌの混合液当たり、１０ｎｇのｍｕｔＩＬ−１５（１０１、１０８）−マウスＦｃプラスミドをＰＣＲ反応の鋳型として用いた。ＤＮＡを、９５℃、４５秒の変性、６０℃、６０秒のアニーリング、及び７２℃、４５秒の合成、の条件下で３０サイクルで増幅した後、増幅産物をアガロースゲルで精製し、ＰＣＲバンドをゲルから溶出し、５０μｌのＴＥ緩衝液に溶解した。２５μｌの混合液を、３μｌの１０×緩衝液３及びいずれの場合にも１５ＵのＢａｍＨＩとＢｇｌＩＩで処理し、３７℃で１時間インキュベートした。ＤＮＡをファルマシア マイクロスピンＳ４００カラムに通して精製した。２重変異を含有するＩＬ−１５部分を、同様にＢｇｌＩＩ／ＢａｍＨＩの２重消化によりＩｇｋ８プラスミドから切り出し、単一変異又は野生型配列を含有するＩＬ−１５部分と置換した。プラスミドの正確性は塩基配列を決定して確認した。

タンパク質の調製：
各々の変異体のタンパク質は、ＨＥＫ２９３細胞（ＡＴＣＣ、マナッサス、ＵＳＡ）に一時的に遺伝子導入することで調製した：このために、１５０ｃｍ^２プレート当たり、６０μｌのリポフェクタミン２０００を２ｍｌのＯｐｔｉｍｅｍ１培地中に希釈し、同様に３０μｇのプラスミドＤＮＡ（Ｉｇｋ８、ＷＴ−Ｆｃ及び１４９−Ｆｃ）を２ｍｌのＯｐｔｉｍｅｍ１培地中に希釈した。２種類の溶液を混合し、室温で３０分間インキュベートした。次に、ＤＮＡ／リポソーム混合液を、約８０％に集密した１５０ｃｍ^２のＨＥＫ２９３プレートの細胞培地（ダルベッコＭＥＭ＋グルタマックス＋１０％ＦＣＳ＋１％ペニシリン／ストレプトマイシン）に添加した。１日後、培地をＵｌｔｒａｃｕｌｔｕｒｅ培地（Ｂｉｏｗｈｉｔｔａｋｅｒ、ベルビエ、ベルギー）に変え、細胞培地を４日間細胞上に放置した。細胞培養上清を回収し、粗細胞構成成分を除去するために溝付きフィルター（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ及びＳｃｈｕｌｌ、ダッセル）に通した；次にそれを２μｍボトルトップフィルター（ナルゲン−ヌンク、ウィースバーデン）に通して濾過滅菌し、ＩＬ−１５−Ｆｃ融合タンパク質をプロテインＡ−セファロースで精製して単離した。このために、細胞培養上清１リットル当たり、０．４ｍｌの、洗浄緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、ｐＨ８．５、１３０ｍＭ ＮａＣｌ）（アマシャム・ファルマシア、洗浄緩衝液中５０％ｖ／ｖ）で膨潤させたプロテインＡ−セファロースを加え、混合液をオーバーヘッドシェーカー中、４℃で１晩振とうした。プロテインＡ−セファロースを空のクロマトカラムに回収し、少なくとも１５０ｍｌの洗浄緩衝液で洗浄した。タンパク質を、０．１Ｍグリシン、ｐＨ２．５を用いて１ｍｌ画分ごとにカラムから溶出し、直ちに６０μｌの１Ｍ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、ｐＨ９．５で中和した。タンパク質をＰＢＳ緩衝液に対して透析し、濾過滅菌した。タンパク質の濃度はＢＣＡアッセイ（ピアース、ロックフォード、ＵＳＡ）で測定し、その純度及び真正なものであることは銀染色及びウェスタンブロッティング（１次抗体：マウス抗ヒトＩＬ−１５モノクローナル抗体、ＢＤバイオサイエンス ファーミンジェン、サンディエゴ、ＵＳＡ；２次抗体：ＰＯＤ−ヤギ抗マウス抗体、Ｄｉａｎｏｖａ、ハンブルグ）を用いて解析した。次に、タンパク質の機能を増殖アッセイで調べた。

増殖アッセイ：
ＣＴＬＬ−２細胞（ＡＴＣＣ）はマウス細胞傷害性Ｔ細胞であり、その増殖はＩＬ−１５又はＩＬ−２に依存し、従って拮抗性タンパク質の増殖阻害作用の指標として用いることができる。細胞は、ＲＰＭＩ １６４０培地＋１０％熱非働化牛胎児血清（ＦＣＳ）＋１％ペニシリン／ストレプトマイシン＋ＣｏｎＡを含有する２０％ラットＴ−ｓｔｉｍ（ベクトン・ディッキンソン ラブウェア、ベッドフォード、ＵＳＡ）、種々の増殖因子の混合物から成る培地中で培養した。

増殖アッセイの準備のために、細胞を細胞培地（ＲＰＭＩ １６４０＋１０％ＦＣＳ＋１％ペニシリン／ストレプトマイシン）で２回洗浄することで、細胞培養に要した残留増殖因子を除き、次に細胞をこの培地中に懸濁した。このために、細胞を３４９ｇで５分間遠心し、その後上清を廃棄し、沈査を細胞培地中に再懸濁した。遠心工程を繰り返した。

アッセイは平底９６ウェルプレート中で行い、ウェル当たり、３×１０^４細胞／ウェルの細胞を含有する１５０μｌの培地を使用した。陰性コントロールとして、余計な因子を一切含まない１０％ＦＣＳ含有培地のみを細胞に加えた。陽性コントロールは、細胞の半値最大増殖を可能にする濃度（例えば１２．５ｐｇ／ウェル）の組換えヒトＩＬ−１５（Ｒ＆Ｄシステムズ、ミネアポリス、ＵＳＡ）をさらに含有した。いずれの場合にも、６個の陰性及び陽性コントロールを準備した。

上記の新規ＩＬ−１５−Ｆｃ変異体の増殖阻害効果を測定するために、細胞を陽性コントロールで記載した組換えＩＬ−１５で処理し、さらにＩｇｋ８由来の１０１／１０８ ２重変異体、野生型タンパク質（ＷＴ−Ｆｃ）又は単一変異体（１４９−Ｆｃ）の精製タンパク質を加えた。これに関しては、ウェル当りで使用した最大濃度は２μｇであり、それぞれ１：２の希釈（１μｇ、０．５μｇ、０．２５μｇ、０．１２５μｇ、他）も使用した。対照として、次の関連タンパク質を同一濃度で使用した：ｍＩｇＧ２ａ（ＢＤ バイオサイエンス ファーミンジェン、サンディエゴ、ＵＳＡ）を非特異的抗体として用い、さらに、変異を有しないサイトカイン部分を含有するために細胞増殖を刺激するＩＬ−２−Ｆｃ、並びに、やはり構造的に関連したタンパク質ではあるが増殖に対しては何らの効果も示さないＣＴＬＡ４−Ｆｃも用いた。後者の２種類のタンパク質はＣｈｉｍｅｒｉｇｅｎ（オールストン、ＵＳＡ）から入手した。全ての混合液は３回分準備した。

細胞をＣＯ_２インキュベーター中で３７℃、４４±２時間培養した後、増殖をＸＴＴ細胞増殖キット（ロシュ）を用いて、製造業者の使用説明書に従って測定した。このために、キットの２種類の構成成分を１：５０の比率（すなわち、７５μｌのＸＴＴラベリング試薬＋１．５μｌの電子カップリング試薬）で混合した。ウェル当り７５μｌの混合液を加え、ＣＯ_２インキュベーター中で３７℃で４時間インキュベートした後、プレートをＥＬＩＳＡリーダーを用いて６９０ｎｍに対する４９０ｎｍの波長で測定した。

結果を図面２３に示す。
ＷＴ−Ｆｃ、１４９−Ｆｃ、及び２重変異体１０１／１０８（プラスミドＩｇｋ８）由来のタンパク質は、ＣＴＬＬ−２細胞のＩＬ−１５を介した増殖に対して阻害効果を示した。どちらかといえば、ＩＬ−２−Ｆｃ及びＩｇＧ２ａは増殖促進効果を示した。

Ｎｅｇ：細胞を組換えヒトＩＬ−１５非存在下で培養した。
Ｐｏｓ：細胞にウェル当り１２．５ｐｇの組換えヒトＩＬ−１５を加えた。
他の混合液中の全ての細胞には、ウェル当り１２．５ｐｇの組換えヒトＩＬ−１５＋次の濃度の所定のタンパク質（左から右へ）：２μｇ、１μｇ、０．５μｇ、０．２５μｇ、０．１２５μｇ及び０．０６２５μｇ、を加えた。ＣＴＬＡ４−Ｆｃは何らの効果も示さなかった；全ての値は陽性コントロールの範囲内であった（データは示していない）。

図１ａは、ＷＴ−ＩＬ−１５−ｈＩｇＧ１のアミノ酸配列を表す。 図１ｂは、ＷＴ−ＩＬ−１５−ｍＩｇＧ２ａのアミノ酸配列を表す。 図２ａは、ＷＴ−ＩＬ−１５のアミノ酸配列を表す。 図２ｂは、ｈＩｇＧ１のアミノ酸配列を表す。 図２ｃは、ｍＩｇＧ２ａのアミノ酸配列を表す。 図３ａは、Ｉｇｋ８のアミノ酸配列を表す。 図３ｂは、１４９−Ｆｃのアミノ酸配列を表す。 図４は、ＷＴ−ＩＬ−１５−ｈＩｇＧ１の核酸配列を表す。 図５は、ＷＴ−ＩＬ−１５−ｍＩｇＧ２ａの核酸配列を表す。 図６ａは、ＷＴ−ＩＬ−１５の核酸配列を表す。 図６ｂは、ｈＩｇＧ１の核酸配列を表す。 図７は、ｍＩｇＧ２ａの核酸配列を表す。 図８ａは、マウスＩｇＫリーダーの核酸配列を表す。 図８ｂは、ヒトＣＤ５リーダーの核酸配列を表す。 図８ｃは、ヒトＣＤ４リーダーの核酸配列を表す。 図８ｄは、ヒトＩＬ−２リーダーの核酸配列を表す。 図９ａは、ヒトＭＣＰリーダーの核酸配列を表す。 図９ｂは、短鎖天然ヒトＩＬ−１５リーダーの核酸配列を表す。 図９ｃは、長鎖天然ヒトＩＬ−１５リーダーの核酸配列を表す。 図１０は、Ｉｇｋ８の核酸配列を表す。 図１１は、１４９−Ｆｃの核酸配列を表す。 図１２は、ＣＴＬＬ−２細胞のＩＬ−１５を介した増殖に対する異なるタンパク質構築物の増殖阻害又は促進効果を表す。

Claims (38)

1. 野生型ＩＬ−１５、及びマウスＩｇＧ２ｂ Ｆｃフラグメントを除くＩｇＧ Ｆｃフラグメントで構成される融合タンパク質。
2. ＩｇＧ Ｆｃフラグメントが、ヒト若しくはマウスＩｇＧ１、ヒトＩｇＧ２、マウスＩｇＧ２ａ、ヒト若しくはマウスＩｇＧ３又はヒトＩｇＧ４であることを特徴とする、請求項１に記載の融合タンパク質。
3. アミノ酸配列番号１又はその対立遺伝子多型を含有する、請求項１又は２に記載の融合タンパク質。
4. アミノ酸配列番号２又はその対立遺伝子多型を含有する、請求項１又は２に記載の融合タンパク質。
5. アミノ酸配列番号３又はその対立遺伝子多型を含有する、請求項１又は２に記載の融合タンパク質。
6. アミノ酸配列番号４又はその対立遺伝子多型を含有する、請求項１又は２に記載の融合タンパク質。
7. アミノ酸配列番号５又はその対立遺伝子多型を含有する、請求項１又は２に記載の融合タンパク質。
8. 請求項１〜７の少なくとも１項に記載の融合タンパク質をコードする核酸。
9. ＤＮＡ配列番号６又はその対立遺伝子多型を含有する、請求項８に記載の核酸。
10. ＤＮＡ配列番号７又はその対立遺伝子多型を含有する、請求項８に記載の核酸。
11. ＤＮＡ配列番号８又はその対立遺伝子多型を含有する、請求項８に記載の核酸。
12. ＤＮＡ配列番号９又はその対立遺伝子多型を含有する、請求項８に記載の核酸。
13. ＤＮＡ配列番号１０又はその対立遺伝子多型を含有する、請求項８に記載の核酸。
14. 請求項９〜１３のいずれか１項に記載の核酸にコードされる融合タンパク質。
15. 請求項８〜１４の少なくとも１項に記載の少なくとも１個の核酸を含有するベクター。
16. 請求項８〜１４の少なくとも１項に記載の少なくとも１個の核酸及び／又は請求項１５に記載の少なくとも１個のベクターを含有する細胞。
17. 幹細胞、前駆細胞及び／又は不死化細胞であることを特徴とする、請求項１６に記載の細胞。
18. 多能性又は多分化能の胚、胎児、新生児又は成人の幹細胞であることを特徴とする、請求項１７に記載の細胞。
19. 細胞株の形態である、請求項１６〜１８の少なくとも１項に記載の細胞。
20. 請求項１〜７及び１４のいずれか１項に記載の少なくとも１個の融合タンパク質、請求項８〜１３のいずれか１項に記載の少なくとも１個の核酸、請求項１５に記載の少なくとも１個のベクター、及び／又は請求項１６〜１８のいずれか１項に記載の少なくとも１種類の細胞、及び適当な補助剤及び／又は添加剤を含む医薬。
21. 特に請求項１〜７及び１４のいずれか１項に記載の、少なくとも１個の融合タンパク質、特に請求項８〜１３のいずれか１項に記載の、該融合タンパク質をコードする少なくとも１個の核酸、特に請求項１５に記載の、少なくとも１個の該核酸を含有する少なくとも１個のベクター、及び／又は特に請求項１６〜１８のいずれか１項に記載の、少なくとも１個の該核酸及び／又は少なくとも１個の該ベクターを含む少なくとも１種類の細胞を含み、該融合タンパク質は野生型ＩＬ−１５とＦｃフラグメントを含有する、ヒト若しくは動物の臓器特異的な組織及び／又はヒト若しくは哺乳動物の臓器。
22. 特に請求項１〜７及び１４のいずれか１項に記載の、少なくとも１個の融合タンパク質、特に請求項８〜１３のいずれか１項に記載の、該融合タンパク質をコードする少なくとも１個の核酸、特に請求項１５に記載の、少なくとも１個の該核酸を含有する少なくとも１個のベクター、及び／又は特に請求項１６〜１８のいずれか１項に記載の、少なくとも１個の該核酸及び／又は少なくとも１個の該ベクターを含む少なくとも１種類の細胞を含み、該融合タンパク質は野生型ＩＬ−１５とＦｃフラグメントを含有する、ヒト以外のトランスジェニック哺乳動物。
23. 特に請求項１〜７及び１４のいずれか１項に記載の、野生型ＩＬ−１５とＦｃフラグメントを含有する融合タンパク質、特に請求項８〜１３のいずれか１項に記載の核酸、特に請求項１５に記載のベクター、及び／又は特に請求項１６〜１８のいずれか１項に記載の細胞、又は請求項２１に記載の、ヒト若しくは動物の臓器特異的な組織及び／又はヒト若しくは哺乳動物の臓器の、ＩＬ−１５を介した細胞性反応を阻害する医薬を製造するための使用。
24. 特に請求項１〜７及び１４のいずれか１項に記載の、野生型ＩＬ−１５とＦｃフラグメントを含有する融合タンパク質、特に請求項８〜１３のいずれか１項に記載の核酸、特に請求項１５に記載のベクター、及び／又は特に請求項１６〜１８のいずれか１項に記載の細胞、又は請求項２１に記載の、ヒト若しくは動物の臓器特異的な組織及び／又はヒト若しくは哺乳動物の臓器の、ＩＬ−１５とその受容体との相互作用を阻害する医薬を製造するための使用。
25. 特に請求項１〜７及び１４のいずれか１項に記載の、野生型ＩＬ−１５とＦｃフラグメントを含有する融合タンパク質、特に請求項８〜１３のいずれか１項に記載の核酸、特に請求項１５に記載のベクター、及び／又は特に請求項１６〜１８のいずれか１項に記載の細胞の、ＩＬ−１５受容体を発現する細胞を溶解する医薬を製造するための使用。
26. 特に請求項１〜７及び１４のいずれか１項に記載の、野生型ＩＬ−１５とＦｃフラグメントを含有する融合タンパク質、特に請求項８〜１３のいずれか１項に記載の核酸、特に請求項１５に記載のベクター、及び／又は特に請求項１６〜１８のいずれか１項に記載の細胞、又は請求項２１に記載の、ヒト若しくは動物の臓器特異的な組織及び／又はヒト若しくは哺乳動物の臓器の、移植続発症及び／又は自己免疫疾患の予防及び／又は治療用の医薬を製造するための使用。
27. 請求項２１に記載の、ヒト若しくは動物の臓器特異的な組織及び／又はヒト若しくは哺乳動物の臓器の、ヒト又は哺乳動物への移植のための使用。
28. 移植が自家移植、同種移植又は異種移植であることを特徴とする、請求項２７に記載の使用。
29. 請求項１〜７及び１４の少なくとも１項に記載の融合タンパク質を調製するための方法であって、以下の工程：
    ａ． 請求項８〜１３のいずれか１項に記載の少なくとも１個の核酸及び／又は請求項１５に記載の少なくとも１個のベクターを細胞へ導入すること；及び
    ｂ． 適当な条件下において該核酸を発現させること、
    を含む前記方法。
30. 請求項２１に記載のヒト若しくは動物の臓器特異的な組織及び／又はヒト若しくは哺乳動物の臓器を調製するための試験管内方法であって、以下の工程：
    ａ． ヒト若しくは動物の臓器特異的な組織及び／又はヒト若しくは哺乳動物の臓器由来の少なくとも１種類の幹細胞、前駆細胞及び／又は不死化細胞へ、第１の場所に野生型ＩＬ−１５及びＦｃフラグメントを含有する融合タンパク質をコードする少なくとも１個の核酸、及び／又は特に請求項８〜１３のいずれか１項に記載の少なくとも１個の該核酸を含有する少なくとも１個のベクターを、第２の場所に少なくとも１個の適当な分化マーカー遺伝子を導入すること；
    ｂ． 工程ａの細胞を分化させること；
    ｃ． 工程ｂの分化した細胞を選別すること；及び
    ｄ． 工程ｃで選別した細胞を、ヒト若しくは動物の臓器特異的な組織及び／又はヒト若しくは哺乳動物の臓器へ導入すること、
    を含む前記方法。
31. 少なくとも１個の遺伝子導入マーカー遺伝子が、工程ａの前、後又は同時に導入され、工程ａで遺伝子導入された細胞が好ましくは工程ａの後で選別されることを特徴とする、請求項３０に記載の方法。
32. 細胞が多能性又は多分化能の胚、胎児、新生児又は成人の幹細胞であることを特徴とする、請求項３０又は３１に記載の方法。
33. 請求項２２に記載のヒト以外のトランスジェニック哺乳動物を作製するための方法であって、以下の工程：
    ａ． ヒト以外の哺乳動物由来の少なくとも１種類の卵母細胞、幹細胞、前駆細胞及び／又は不死化細胞へ、一方では野生型ＩＬ−１５及びＦｃフラグメントを含有する融合タンパク質をコードする、特に請求項８〜１３のいずれか１項に記載の少なくとも１個の核酸、及び／又は少なくとも１個の該核酸を含有する、特に請求項１５に記載の少なくとも１個のベクターを、他方では少なくとも１個の適当な遺伝子導入マーカー遺伝子を導入すること；
    ｂ． 工程ａの遺伝子導入細胞を選別すること；
    ｃ． 工程ｂにしたがって選別された細胞を、少なくとも１種類のヒト以外の哺乳動物由来の未分化胚芽細胞へ導入すること；
    ｄ． 工程ｃで得られた未分化胚芽細胞をヒト以外の哺乳動物養母へ導入すること；及び
    ｅ． 該未分化胚芽細胞から生育したヒト以外のトランスジェニック哺乳動物を特定すること、
    を含む前記方法。
34. 細胞が多能性又は多分化能の胚、胎児、新生児又は成人の幹細胞であることを特徴とする、請求項３３に記載の方法。
35. 請求項３３又は３４に記載の方法を使用して作製されたことを特徴とする、ヒト以外のトランスジェニック哺乳動物。
36. 請求項３５に記載の哺乳動物の子孫であることを特徴とする、ヒト以外のトランスジェニック哺乳動物。
37. 同種移植及び／又は異種移植用に細胞、臓器特異的な組織及び／又は哺乳動物の臓器を得るための、請求項２２、請求項３５及び３６の少なくとも１項に記載のヒト以外のトランスジェニック哺乳動物の使用。
38. 請求項２２、３５及び３６のいずれか１項に記載の、ヒト以外のトランスジェニック哺乳動物、又は請求項２１に記載の、ヒト若しくは動物の臓器特異的な組織及び／又はヒト若しくは哺乳動物の臓器の、薬理的に活性な化合物の発見及び／又は有毒物質の特定のための使用。

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