JP2006501848A

JP2006501848A - 網膜色素上皮細胞の羊膜での培養及び移植

Info

Publication number: JP2006501848A
Application number: JP2004543152A
Authority: JP
Inventors: ビンデル，スザンナ; ツェング，シェファー，シー．，ジー．
Original assignee: ティシュテク，インク．
Priority date: 2002-10-04
Filing date: 2003-10-06
Publication date: 2006-01-19
Also published as: AU2003279132A1; US20060002900A1; EP1556063A2; US7824671B2; CN1720055A; WO2004033635A2; AU2003279132A8; CA2501226A1; WO2004033635A3

Abstract

本発明は、眼の網膜下腔に移植するための組成物に関し、組成物は、低温保存し得るヒト羊膜と、羊膜に存在する複数の網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞又はＲＰＥ等価細胞とを含む。羊膜は、完全なもの、上皮裸化したもの、又はその他の処理を施したものであってもよい。本発明は、ＲＰＥ細胞の培養と、基質としてのブルッフ膜の代替となる外科移植片の形成と、網膜下腔へのＲＰＥ細胞の移植のための羊膜の使用を含む。組成物は、アロ抗原又はＲＰＥ特異的自己抗原に対する免疫反応を引き起こさず、抗炎症性、抗血管新生性、及び非瘢痕性の効果を及ぼす。本発明は、羊膜とＲＰＥ細胞とを含む組成物を作成又は使用する方法及びキットを含む。更に、ＲＰＥ細胞を回収するデバイスが開示される。

Description

低温保存された羊膜を、羊膜上でのＲＰＥ細胞又はＲＰＥ等価細胞の培養に使用可能であり、基質としてブルッフ膜と交換する外科移植片として使用可能であり、網膜下腔へのＲＰＥ細胞又はＲＰＥ等価細胞の移植に使用可能であり、更に、移植片が免疫反応を引き起こさない培養及び移植組成物に関する。

関連出願の説明
本願は、出典を明示することによりその教示内容全体を本願明細書の一部とする２００２年１０月４日提出の米国暫定出願第６０／４１５，９８６号の利益を主張する。

網膜は、光エネルギーが神経インパルスに変換される多層神経組織である。眼の前面に最も近い網膜の最外層は、神経節細胞を含むニューロンの層である。神経節細胞の後方は、一体化したニューロンの層であり、一体化したニューロンの後方は、桿体及び錐体と呼ばれる光受容細胞の層である。桿体及び錐体における光受容は、細胞内の色素による光の吸収で始まり、吸収された光は受容器電位を発生させる。

光受容細胞と密接な構造及び機能的関係を形成するのは、網膜のすぐ後方に位置する特化した立方細胞の単層である網膜色素上皮である。網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞は、光受容細胞の支持を提供し、溶質輸送と、光受容細胞から剥離した廃棄済み外節膜の食細胞活動及び消化と、薬物の解毒とを含む、重要な生理的機能を実行する。

ＲＰＥ細胞は、コラーゲン、ラミニン、その他の分子から成る厚さ１乃至５ミクロンの膜であるブルッフ膜と呼ばれる特化した基底膜の上に載っている。

ＲＰＥ細胞の上には、脈絡組織の脈絡毛細管板が存在する。脈絡毛細管板は、網膜に栄養素を提供し、代謝副産物を除去する脈管構造を含む。脈絡組織の上には、強膜が存在する。

ＲＰＥ細胞がその機能を適切に実行できないと、光受容細胞の細胞外環境が変更され、光受容細胞の結果的な変性及び損失につながると考えられている。ＲＰＥの機能不全は、加齢性黄斑変性症（ＡＲＭＤ）（参考文献１）と、漿液性網膜剥離（参考文献２）と、脳回転状萎縮（参考文献３）及び先天性脈絡膜欠如（参考文献４）のような遺伝病とを含む、視力を脅かす様々な疾患の発病を助長する。

加齢性黄斑変性症
ＡＲＭＤは、西欧諸国において視力障害の主要な原因であり、光受容細胞の損傷につながるＲＰＥ、ブルッフ膜、及び脈絡毛細管板の漸進的な劣化によって生じると考えられている。ＡＲＭＤでは、ＲＰＥ細胞は機能不全となる。ＡＲＭＤの一形態では、ＲＰＥ細胞の変性に続いて、脈絡毛細管板の萎縮が生じる。別の形態では、ブルッフ膜は、脈絡膜新生血管膜（ＣＮＶ）の網膜下腔への侵襲により改変及び劣化され、網膜下腔における出血、及び瘢痕化につながり、ＲＰＥ及び光受容体の両方が更に損傷する可能性がある。

上皮下及び／又は網膜下腔へのＣＮＶの侵襲（参考文献５）は、レーザ光凝固により治療可能だが、新血管形成が中心窩下である場合、成果は貧弱である（参考文献６）。ＣＮＶ膜の外科切除は、視力の改善に殆どつながらず、或いは、ＡＲＭＤ（参考文献７）の進行を殆ど停止しない。貧弱な成果は、ＣＮＶ除去中のＲＰＥの不注意による除去（参考文献８）と、ＲＰＥの再定着の失敗と、黄斑下手術に続く脈絡毛細管板萎縮の漸進的な拡大（参考文献９）と、光受容体の損失とが原因となり得る。

ＲＰＥ移植の従来技術の方法での問題
現在の方法のＲＰＥ移植を使用した視力の回復は、自己又は同種のソースにより、限定的にしか成功していない（実験（参考文献６、１０）、及び臨床（参考文献１１乃至１４））。実験動物、特に網膜劣化の英国外科医師会（ＲＣＳ）ラットモデル（参考文献１５乃至１９）では、光受容体を救護し、脈絡毛細管板を保全し、ＣＮＶを予防するために、ＲＰＥ移植が使用されてきた。同種ＲＰＥ移植の場合、失敗の説明となる明白な理由の一つは、同種移植拒絶反応（参考文献１３、２０）である。しかしながら、自己ＲＰＥ移植の場合、視力の回復の失敗は、疾患部位に移植ＲＰＥが再定着できないこと、或いはｉｎｖｉｖｏで機能できないことが原因となり得る。ＲＰＥの成長又は機能の失敗は、ブルッフ膜の損傷が原因となり得る。

ブルッフ膜
ブルッフ膜の完全性は、ＲＰＥの再定着とその後の機能にとって決定的であることを示す証拠が存在する。例えば、ブルッフ膜への損傷のないＲＰＥの外科切除では、人間以外の霊長類及び飼育ブタにおいて、ＲＰＥ単層の部分的再生が、下の脈絡毛細管板と上の光受容体とが維持された状態で生じる（参考文献２１乃至２３）。対照的に、研磨による創面切除では、ブルッフ膜に対する損傷が多くなり、ＲＰＥの不完全な再定着と、脈絡毛細管板の萎縮と、外節での網膜劣化（参考文献２４）とにつながる。ヨザルのブルッフ膜への培養ヒトＲＰＥの実験的移植では、正常な付着と、生存能力と、接合及び形態的極性の発現とが生じる（参考文献２５）。研磨により創面切除したブルッフ膜へのＲＰＥの自己移植は、ウサギにおいて脈絡毛細管板の萎縮と光受容体の損失とを低減する（参考文献２６）。

ＡＲＭＤの人間の患者の場合、移植したヒト自己ＲＰＥにおける機能回復の失敗は、少なくとも部分的には、ＡＲＭＤが本質的に発生させ（参考文献２７）、ＣＮＶ膜の外科切除により損なわれた（参考文献２３、２４）、ブルッフ膜の改変が原因となり得る。

ＲＰＥ移植の現在の方法であるＲＰＥ細胞懸濁液の網膜下注入により達成される成功は、限られている。この方法については多数の問題点が存在し、これには結果的な網膜下線維形成と、ＲＰＥの複数の層の形成とが含まれる（参考文献６）。こうした問題は、ｉｎｖｉｖｏでの（正常な）上皮表現型及び機能の回復の欠如が原因となり得る。ＡＲＭＤの外科治療におけるブルッフ膜の回復については、現在まで、進展が見られていない。

ＲＰＥ移植の免疫学的態様
中枢神経系の一部として、眼は免疫学的な特権部位の特徴を有するが、ＲＰＥ移植により、受容者は、アロ抗原とＲＰＥ特異的自己抗原との両方に対して敏感になることが実証されている。両方とも、移植の成功にとって障害になると考えられており、免疫抑制の処方計画が必要となる（参考文献２８）。更に、免疫反応は、移植細胞の量に関連する可能性が最も高く、反応は時間と共に増加することも実証された。ＲＣＳラット内のＲＰＥ同種移植片は、一年までに渡って拒絶されなかった。

従来技術のＲＰＥ培養の基質及び方法による問題
この目的で使用されている基質には、プラスチック（参考文献３１）と、架橋コラーゲン（参考文献３２）と、ゼラチン（参考文献１）と、フィブリノーゲン（参考文献２）と、ポリ−Ｌ−乳酸（ＰＬＬＡ）（参考文献３）と、ＰＬＬＡ／ＰＬＧＡ（ポリ−ＤＬ−乳酸−コ−グリコール酸）膜（参考文献５、６）と、ヒドロゲル（参考文献７）と、基底膜含有水晶体前嚢（参考文献７）とが含まれる。移植用のＲＰＥ細胞を培養するのに使用される従来技術の基質のそれぞれには多くの欠点が付随し、多数の問題が未解決のまま残されている。

不浸透性物質
ＲＰＥ移植の試みの一つでは、完全な眼、又はＤｉｓｐａｓｅR（合同酒精株式会社、東京、日本）による生検から分離されたＲＰＥ細胞を利用し、プラスチック皿のような不浸透性基質上に接種した（参考文献３１）。こうした細胞は、移植前に、解離細胞懸濁液（参考文献６、１０）として、或いは、胎児に由来するパッチ（参考文献１１）として調製した。こうした細胞は、上皮形態を完全には保持しなかった。更に、メラノリポフスチン顆粒の色素沈着は、プラスチック培養において消滅する（参考文献３３）。

多孔性支持物（架橋コラーゲン、コラーゲン、ゼラチン、フィブリノーゲン、ＰＬＬＡ／ＰＬＧＡ、ヒドロゲル、ＣＮＶ膜、水晶体嚢）
架橋コラーゲンは、移植に使用する時、その厚さと、低い浸透性と、分解不能性とにより網膜に損傷を与える（参考文献３２）。コラーゲン膜に接種したヒトＲＰＥ細胞（参考文献３４）は、測定可能な経上皮抵抗性及び電位（参考文献３５）を示す細胞の単層を生成するが、細胞は、ｉｎｖｉｖｏでの発達及び機能状態を達成しなかった。

ゼラチンは、包埋媒体として使用されてきたが、付着用の基質としては使用されていない。フィブリノーゲン及びＰＬＬＡマイクロスフェアも、網膜下腔への移植時に単一のシートとしてＲＰＥを移植するのに適していない（参考文献２、３）。ＰＬＬＡ／ＰＬＧＡ膜は移植用のＲＰＥ単層シートを提供するが、こうした支持物上で成長させたヒト胎児ＲＰＥ細胞のｉｎｖｉｖｏ培養は、色素沈着（メラニン形成）を示さない（参考文献５、６）。ヒドロゲルも移植用のＲＰＥ単層シートを提供するが、ＺＯ−１の発現によって決定される結果的な細胞密度及び細胞密着結合は、相対的に低い（参考文献７）。

ヒトＲＰＥ細胞は、ＡＲＭＤ患者から外科的に切除されたＣＮＶ膜でも培養されてきたが、培養物は、多層を形成する（参考文献３６）。

水晶体嚢は、基底膜を含有する天然材料だが、ＲＰＥ培養及び移植にとって理想的な基質ではない。水晶体前嚢は、ＲＰＥ（参考文献７、８）及びＩＰＥ（参考文献８）の成長と、網膜下腔への水晶体嚢によるＲＰＥ及びＩＰＥ（参考文献８）の移植とに使用されてきた。ヒドロゲル及び水晶体嚢の両方では、ＲＰＥ培養の基質として使用される時、培養物内のＲＰＥ細胞による色素沈着の形成（又はメラニン形成）が可能にならない（参考文献７、８）。

本件の発明者らは、水晶体嚢をＲＰＥ／ＩＰＥ移植の自己基質として使用することを試みた。しかしながら、水晶体嚢がカールする傾向のため、この手法は、実行不可能となった。より薄いことから、後嚢を使用する考え方も、多数の理由により断念した。第一に、後嚢は、患者を高い危険に晒すことなく、外科手術中に取得するのが困難である。第二に、水晶体嚢の吸収が存在しない、或いは吸収が低速である場合、細胞のブルッフ膜及び／又は脈絡毛細管板との不十分な接触により、移植ＲＰＥ細胞の生存が阻害される可能性がある。

最近、Ｂｉｌｂａｏら（参考文献３７）は、カールを防止し、網膜下で解放する使用法を容易にするために、水晶体嚢の片側にコーティングされたＰＬＧＡの使用を開示した。しかしながら、組織学的研究では、ＰＬＧＡが四週間後に完全に溶解しただけでなく、上の網膜層が破壊され、大量の細胞浸潤が破壊に伴ったことが明らかとなった。

供血者からの寒冷沈降物も、ヒト胎児網膜色素上皮の可能な自己基質として、１９９９年にＦａｒｒｏｋｈ−Ｓｉａｒらによって試験された（参考文献３８）。Ｄｕｔｔら（参考文献３９）は、ＨＰＥ細胞株００４１の培養のために、いくつかの基質、即ち、胎盤及び羊膜からの抽出物と、ＭＡＴＲＩＧＥＬR（マサチューセッツ州ベッドフォードのＣｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅＢｉｏｍｅｄｉｃａｌＰｒｏｄｕｃｔｓ，Ｉｎｃ．）と、市販の基底膜マトリクスと、内皮細胞（ＥＣＭ）が分泌した細胞外マトリクスによりコーティングした皿と、コラーゲンＩＶ及び／又はラミニンによりコーティングした皿と、コラーゲンＩ及び／又はフィブロネクチンによりコーティングした皿とを使用した。ＭＡＴＲＩＧＥＬR上で成長させた細胞は、強く着色されたが、線維芽細胞のように見えた。

上記のように、解決されずに残された問題点には、例えば、培養及び移植ＲＰＥ細胞におけるＲＰＥ表現型の形態の維持と、生体適合基質上での自己ＲＰＥの均一な単層の形成と、欠損を良好に覆う移植手法の改良と、アロ抗原及びＲＰＥ特異的自己抗原の両方によるＲＰＥ移植の免疫拒絶の克服と、ＲＰＥ移植後の網膜下線維形成の防止とが含まれる。

羊膜は、羊膜腔の内面を覆う生体膜であり、単純な立方上皮と、厚い基底膜と、ヒアルロン酸を含む無血管間葉層とよりなる。羊膜移植は、角膜組織の化学火傷及び熱傷の治療において、眼の表面の再構築に使用されてきた（参考文献５３）。

全般的には、網膜下腔への移植に適したＲＰＥ細胞を培養する方法と、上皮表現型を維持し、下の間質に抗炎症性、非瘢痕性、及び抗血管新生性の作用を及ぼす適切なＲＰＥ移植組成物と、網膜下腔へＲＰＥ細胞を移植する方法とについての医学的な必要性が満たされていない。

本発明は、一態様において、適切に調達及び処理された時、低温保存された羊膜を、羊膜上でのＲＰＥ細胞又はＲＰＥ等価細胞の培養に使用可能であり、基質としてブルッフ膜と交換する外科移植片として使用可能であり、網膜下腔へのＲＰＥ細胞又はＲＰＥ等価細胞の移植に使用可能であり、更に、移植片が免疫反応を引き起こさないという発見に関する。本発明は、一態様において、必要とする患者の眼の網膜下腔における移植のための組成物に関し、組成物は、羊膜と、ＲＰＥ細胞又はＲＰＥ等価細胞とを含む。本発明の一実施形態において、組成物内に存在する羊膜は、ヒト羊膜である。羊膜は、完全なもの、上皮裸化したもの、又はその他の処理を施したものにしてよい。本発明の一実施形態において、羊膜は、片側を処理し、例えば、片側を薄化するか、或いは除去する。別の実施形態において、羊膜は、間質側を除去するか、或いは基底膜側を薄化するためにレーザ焼灼によって新たな形態にする。更に別の実施形態では、間葉細胞を間質側に追加する。本発明は、特に、以下を単独で、又は組み合わせて含む。

本発明の一実施形態は、羊膜と、羊膜に存在する複数の網膜色素上皮細胞又は網膜色素上皮等価細胞とを含んだ組成物を含む。

別の実施形態は、羊膜と、羊膜に存在する複数の網膜色素上皮細胞又は網膜色素上皮等価細胞と、緩衝媒体又は培養媒体とよりなるキットを含み、更にキットは、随意的に、網膜疾患を治療するキットの少なくとも一つの構成要素の同時、個別、又は連続使用についての説明書を含む。一実施形態において、キットに含まれる羊膜は、ヒト羊膜である。

本発明の別の実施形態は、組成物を形成する方法であり、方法は、少なくとも一つの網膜色素上皮細胞又は網膜色素上皮等価細胞を羊膜に供給するステップと、網膜色素上皮細胞又は網膜色素上皮等価細胞を、成長に適した条件下で、複数の培養細胞を生成するのに十分な期間に渡って膜上で培養するステップとよりなる。一実施形態において使用される羊膜は、人間のものであってよい。一実施形態では、培養ＲＰＥ細胞又は培養ＲＰＥ等価細胞と羊膜とを含む組成物を、必要とする受容者の目の網膜下腔での移植に使用する。受容者は、任意の哺乳類、例えば人間にしてよい。

更に別の態様において、本発明の実施形態は、切除又は培養網膜色素上皮細胞又は網膜色素上皮等価細胞が網膜色素上皮細胞の表現型を発現又は維持するのを誘導する方法を含み、方法は、羊膜を網膜色素上皮細胞又は網膜色素上皮等価細胞に接触させるステップと、網膜色素上皮細胞又は網膜色素上皮等価細胞を、成長に適した条件下で、複数の培養細胞を生成するのに十分な期間に渡って膜上で培養するステップと、網膜色素上皮細胞の表現型を誘導又は維持するのに十分なレベルまで細胞内カルシウムイオン濃度を引き上げる有効量の作用物質に培養細胞を接触させるステップ、或いは、網膜色素上皮細胞の表現型を誘導又は維持するのに十分な期間に渡って、培養細胞を含む膜を空気流体界面に露出するステップとよりなる。一実施形態において使用される羊膜は、人間のものであってよい。

一実施形態において、細胞内カルシウムイオン濃度を増加させる作用物質に培養細胞を接触させるステップと、網膜色素上皮細胞の表現型を誘導又は維持するために、培養細胞を含む膜を空気流体界面に露出するステップとは、両方とも、連続的に、又は本質的に同時に実行される。しかしながら、別の実施形態において、媒体は、成長因子を追加された状態で、通常の又は高いＣａ²⁺濃度を有することができる。

本発明は、更に別の実施形態では、網膜色素上皮細胞の表現型を発現する複数の細胞への少なくとも一つの網膜色素上皮等価細胞の成長及び分化を促進する羊膜の使用に関する。特定の実施形態において、羊膜は、人間のものである。

本発明の別の実施形態は、複数の網膜色素上皮細胞を、必要とする個体の網膜下腔の標的部位に送給する方法であり、個体の網膜に少なくとも一つの穴を形成するステップ、或いは網膜下腔にアクセスするために網膜を少なくとも部分的に分離するステップと、穴を介して、羊膜と膜に存在する網膜色素上皮細胞とを含む組成物を挿入するステップと、組成物を標的部位に位置決めするステップとを含む。

本発明は、更に、網膜疾患を治療する方法に関し、方法は、必要な患者の網膜下腔に、羊膜、例えば、ヒト羊膜と、膜に存在する複数の網膜色素上皮細胞とを含む組成物を挿入するステップを含む。ＲＰＥ細胞は、本発明の方法に従って、膜上で培養してよい。本発明の実施形態に従って治療される網膜疾患の非制限的な例は、加齢性黄斑変性症と、網膜変性と、脳回転状萎縮と、先天性脈絡膜欠如とである。

本発明の別の態様は、疾患を有する、或いは疾患にかかる危険性のある患者における網膜疾患の治療用組成物の製造のための、一実施形態において人間を起源とする羊膜と、少なくとも一つの網膜色素上皮細胞との使用である。

本発明は、更に、網膜色素上皮細胞の表現型を発現する複数の細胞への少なくとも一つの網膜色素上皮等価細胞の成長及び分化を促進するヒト羊膜の使用に関する。

本発明の更に別の態様は、アロ抗原と網膜色素上皮特異的自己抗原とに対して受容者が敏感になるのを防止又は軽減するために、網膜色素上皮細胞又は虹彩色素上皮細胞を網膜下腔に移植するための羊膜の使用である。特定の実施形態において、アロ抗原と網膜色素上皮特異的自己抗原とに対して受容者が敏感になるのを防止又は軽減するために、網膜下腔へＲＰＥ細胞又はＩＰＥ細胞を移植するのに使用される羊膜は、人間を起源とする。

本発明は、更に、ＲＰＥ細胞又は虹彩色素上皮（ＩＰＥ）細胞の網膜下腔への移植に続く繊維形成を阻害するヒト羊膜を含む羊膜の使用に関する。本発明の別の実施形態は、疾患を有する、或いは疾患にかかる危険性のある患者における網膜疾患の治療用組成物の製造のための、ヒト羊膜及び少なくとも一つのＲＰＥ細胞の使用である。

ＲＰＥ又はＲＰＥ等価細胞を培養する基質として、本発明の実施形態に従って処理又は低温保存された羊膜を使用することで、多数の利点を得られる。例えば、羊膜とＲＰＥ又はＲＰＥ等価細胞とを含む組成物は、網膜下腔における基質の交換及びＲＰＥ細胞の移植のための外科移植片として使用できる。組成物は、抗炎症性、抗血管新生性、抗線維形成性、及び非瘢痕性の効果を及ぼし、アロ抗原又はＲＰＥ特異的自己抗原に対する免疫反応を引き起こさない。更に、本発明の実施形態に従って使用される羊膜は、培養中のＲＰＥ細胞の成長及び分化と、培養中及び網膜下腔への移植後の両方におけるＲＰＥ細胞の形態的外観の維持とを促進する。網膜下腔へＲＰＥ細胞を送給する組成物及び方法は、基底膜を有する生体適合基質上でのＲＰＥ細胞の均一な単層を発生させる。本発明の実施形態による組成物は、代用品としてのブルッフ膜の交換と、網膜下腔へのＲＰＥ細胞の移植とに適した、外科移植片として使用できる。本発明の実施形態は、欠損を優れた形で覆い、アロ抗原及びＲＰＥ特異的自己抗原の両方によるＲＰＥ移植の免疫拒絶を克服し、ＲＰＥ移植後の網膜下線維形成を防止する改良された移植組成物及び手法を提供する。

本発明の上記その他の目的、特徴、及び利点は、添付図面に例示されたような、以下の更に詳細な本発明の例示的実施形態の説明から明らかとなろう。

本発明の例示的実施形態の説明は、次の通りである。本発明の特定の実施形態は、本発明の制限としてではなく、例示として明らかにされると理解されるであろう。最初に、本発明について、最も広義の全体的態様において説明し、その後、より詳細な説明を行う。本発明の組成及び方法の特徴その他の詳細は、請求項において更に指摘される。

本発明の主題の発明者は、最初に、ヒト臍帯血管内皮細胞を成長させる基質として羊膜の間質側を使用することを試みたが、細胞は、羊膜上で成長しなかった。実際には、内皮細胞はアポトーシスを起こした。本発明者は、更に、ヒト多形核白血球を成長させる試みにおいて、基質として羊膜の間質側を使用したが、白血球は、羊膜上で成長しなかった。

本発明は、適切に調達及び処理され、冷凍保存された羊膜、例えば、ヒト羊膜上において、ＲＰＥ細胞、ＲＰＥ等価細胞、及びＩＰＥ細胞が適切な条件下で成長するという発見に関する。組織学的には、羊膜は、厚い基底膜と、無血管間質とを含む。本発明者は、培養においてＲＰＥ等価細胞及びＲＰＥ細胞の成長及び分化を促進するのに、ヒト羊膜が理想的な細胞外マトリクス基質であることを発見した。

適切な条件下で羊膜上において成長させたＲＰＥ細胞、ＲＰＥ等価細胞、及びＩＰＥ細胞は、分化し、形態的特徴を保持する傾向にあり、脱分化の傾向を有していない。更に、上に細胞が存在する羊膜は、網膜下腔へのＲＰＥ細胞の移植と、基質の交換とのための外科移植片として使用できる。移植片は、免疫反応を引き起こさず、網膜疾患の治療のために使用できる。

したがって、本発明は、羊膜及び複数のＲＰＥ、ＲＰＥ等価細胞、又はＩＰＥ細胞を含む結果的な組成物と、加齢性黄斑変性症、網膜変性、脳回転状萎縮、及び先天性脈絡膜欠如といった網膜疾患を治療するために哺乳類の眼の網膜下腔にＲＰＥを移植する外科移植片としての組成物の使用方法とに関する。

ＲＰＥ又はＲＰＥ等価細胞
「ＲＰＥ等価細胞」という用語は、本明細書での使用において、網膜、虹彩、毛様体、成体幹細胞、又は胚幹細胞に由来し、その正常な表現型又は機能を維持するか、最適に満たない機能を有し得るか、或いは、ＲＰＥ細胞への分化のためにｉｎｖｉｔｒｏ又はｉｎｖｉｖｏで誘導された細胞を指す。

本発明の実施形態によれば、ＲＰＥ細胞のソースは、人間又はその他の哺乳類にできる。本発明の別の実施形態によれば、ＲＰＥ細胞のソースは、自己由来（受容体と同じ個体から）又は同種（受容体とは異なる個体から）にできる。後者の場合、こうした細胞は、成体又は胎児の死体又は生体から取得可能であり、後者は、ＨＬＡ適合又は非適合にできる。

更に、ヒトＲＰＥ等価細胞のソースは、網膜又は虹彩又は毛様体に由来してよい。ＲＰＥ細胞は、一実施形態において、神経網膜細胞、例えば、桿体細胞又は錐体細胞に由来する細胞を含む。虹彩に由来する場合、細胞は、虹彩色素上皮細胞（ＩＰＥ）と呼ばれ、その機能は最適状態に及ばない場合がある。ヒトＲＰＥ等価細胞のソースは、ウイルス又は非ウイルス作用物質により不死化されているが依然として正常な表現型又は機能を保持するＲＰＥ細胞に由来してもよい。

ヒトＲＰＥ等価細胞のソースは、更に、ＲＰＥへの分化がｉｎｖｉｖｏで誘導された成体幹細胞又は胚幹細胞に由来してよい。前者の場合、こうした成体幹細胞は、自己又は同種において、身体の様々な部位、例えば、末梢血又は骨髄から取得できる。

ＲＰＥ等価細胞のソースは、ヒト細胞に適合するように生体工学処理を行った、その他の非人間種に由来してもよい。例えば、本発明による組成物において使用される網膜色素上皮等価細胞のソースは、網膜色素上皮細胞への分化をｉｎｖｉｔｒｏで誘導された少なくとも一つの生体工学処理細胞を含んでよい。

ＲＰＥ細胞又はＲＰＥ等価細胞の回収
ＲＰＥ又はＩＰＥのソースが自己由来である場合、回収の手段は、網膜又は虹彩の組織部位からの外科生検となる。自己ＲＰＥ等価細胞は、成体幹細胞に由来し、末梢血又は骨髄等の対象となる部位から取得できる。ＲＰＥ又はＩＰＥのソースが同種であり、生体又は死体である場合には、それぞれ提供された組織から取得される。同種ＲＰＥ等価細胞のその他のソースは、組織培養及び移植に関する当業者に周知である。

ＲＰＥ又はＩＰＥ細胞を回収又は分離する一方法は、従来通りであり、ＥＤＴＡ又はＥＧＴＡを含有する非酵素溶液、或いは、コラゲナーゼ又はＤＩＳＰＡＳＥR溶液を使用した酵素消化を含む。幹細胞から誘導したＲＰＥ等価細胞を回収又は分離する方法は、成長因子及び誘引因子を使用してｉｎｖｉｔｒｏで実行される。

本発明の更に別の態様では、ＲＰＥ細胞を回収するデバイスの実施形態が着想及び設計された。デバイスは、本明細書において「バインダＲＰＥハーベスタカニューレ」、「ＲＰＥハーベスタカニューレ」、又は「カニューレ」と呼ばれ、ＲＰＥへの損傷を最少化し、回収率を最大化する。

デバイスは、いくつかの特徴を有し、次のように説明される。図面を参照すると、図１は、フレキシブル又は折り曲げ可能なチューブ１７によって従来型のテーパ付きＬＵＥＲメスコネクタ部品に取り付けられた注射器１８を有するハーベスタカニューレ１０の例示的実施形態を示す。遠端部１２を備えた吸引ライン１５は、注射器１８に接続され、ＬＵＥＲコネクタ１６を通過する。一実施形態において、ハーベスタカニューレ１０の外径は、強膜切開部位において、標準の２０ゲージ（ｇａ）（０．９ｍｍ）であり、現在の硝子体切除装置に一致する。近端部は、従来型ＬＵＥＲメスコネクタ部品と、例えば、容量０．５ｃｃのガラス注射器に接続された約１０ｃｍ乃至約２０ｃｍ等の短いフレキシブルチューブ１７とにより終了させてよい。「フレキシブル」という用語は、本明細書での使用において、「フレキシブル」と説明されたチューブを、外科手術中にデバイスを操作するのに十分な度合いまで曲げられることを意味する。フレキシブルチューブ１７は、好ましくは、内壁へのＲＰＥ細胞の接着を防止し、これにより、回収を最大化するために、テフロン等の非粘着材料で作成される。

カニューレ遠端部１２は、曲がっている（例えば、曲率半径約１０ｍｍ）。網膜組織と接触した状態に置かれる遠端部１２の最後の約５ｍｍは、後極でのブルッフ膜表面に一致する曲率半径を有する扁平な三日月形の中空な断面を有する。その半径は、約１１ミリメートル（ｍｍ）である。図２に図示したように、カニューレ１０の遠端部１２の拡大詳細図は、上方リップ２６と突出する下方リップ２４とを形成する先端部１２の終わりにおいて、約１０度のテーパを示している。したがって、カニューレが外科手術において使用される際には、上方又は高位リップは、前方に突出し、手術用顕微鏡（外科医の視界）を介して常に見ることができる。図２は、更に、図３及び４についての方向を示すビューを図示している。カニューレの使用時に、上方リップ２４は、網膜と接触し、網膜は僅かに持ち上げられ、下方リップ２６は、収集中のＲＰＥ細胞と接触する。

一実施形態において、各リップの厚さは、約７５マイクロメータであり、中空の内径は、高さ約１００マイクロメートルであり、先端部の厚さは約２５０マイクロメートルとなる。遠端部でのカニューレ外面の幅は、約１．５ｍｍにしてよく、中空の内径の幅は、約１．３５ｍｍにしてよい。一実施形態において、上方又は高位リップのテーパは、約３マイクロメートルの円滑で研磨済みの丸いエッジで終了する。高位リップに僅かなテーパが付いており、網膜組織は多少の弾性又は柔軟性を有することから、網膜切開の幅は、約１ｍｍあればよい。

一実施形態において、ＲＰＥハーベスタカニューレは、ＲＰＥ細胞を支持する弾性のあるブルッフ膜の表面を滑らせることが可能な前方突出リップを備えた扁平な三日月形状を有する。これにより、一通過当たり約１．２ｍｍの幅に渡って、ＲＰＥ細胞の回収が最大化される。カニューレのリップの後部の湾曲はブルッフ膜の湾曲と一致するため、膜自体への損傷が最少化される。即ち、切断、剥離、又は穿孔を、殆ど又は全く発生させない可能性がある。断面形状が網膜切開の開口部の長さ及び形状より小さいため、カニューレの外壁と網膜切開の縁部との間で良好な一致が得られる。これは、網膜への外傷を最少化し、硝子体腔へのＲＰＥ細胞の逆流を防止又は最少化する。例えば、図３において、ビュー３−３で取り出した図２のビューは、吸引ポート３２を形成する中空インチューブ３０の上方突出リップ２４と下方リップ２６とを図示する。

ＲＰＥハーベスタカニューレは、ステンレス鋼で作成可能であり、好ましくは、テフロンに似た材料等の抗粘着プラスチックで作成できる。例示的な実施形態では、完全に透明であり、外科医がカニューレ内径の内容物を見ることが可能なクロロトリフルオロエチレン（ＣＴＦＥ）プラスチックを利用する。

図５に図示したＲＰＥ回収カニューレ５０の別の実施形態は、吸引ライン５６と、上部本体に接続された補助注入ライン５２とを有する。ライン５２は、カニューレ先端部の湾曲開始位置に配置された外側注入ポート５９を有する。注入ＬＵＥＲ５７は、短いフレキシブル又は折り曲げ可能なライン１７を介して１ｃｃ注射器５４に接続される。使用中には、回収カニューレの先端部が網膜の下にある時、ステンレス鋼で作成し、吸引ライン５６に半田付けしてよい注入ライン５２を介して、食塩水の短いパルス状のボーラスを注射器５４から注入する。食塩水のボーラスは、網膜を持ち上げ、これによりブレブ、即ち、網膜下の空間又はテントを形成し、外科医が更に容易にＲＰＥ細胞を回収するのを可能にする。使用されない場合、注入ポート５９は、逆流を防ぐために、ＬＵＥＲプラグにより閉鎖するべきである。

図６は、注入ライン５２及び注入ポート５９を追加した図２と同じ側面を図示するカニューレ５０の遠端部５８の拡大図６０を示している。

図７は、図６のビュー７−７で取り出した、追加の注入ライン５２及び外側注入ポート５９を図示するカニューレ５０の遠端部５８の底面図７０である。

羊膜を調製する方法
本発明の実施形態において使用するのに適した低温保存ヒト羊膜を調整する方法は、この技術において周知であり、例えば、Ｔｓｅｎｇに対する米国特許第６，１５２，１４２号及び第６，３２６，０１９Ｂ１号において説明されており、それぞれの教示内容は、参照により全体を本明細書に組み込むものとする。羊膜の保存方法も、ＷＯ０１／０８７１６Ａ１において説明されており、その教示内容は、参照により全体を本明細書に組み込むものとする。羊膜は、凍結乾燥することもできる。

本発明の実施形態において使用するのに適した羊膜は、絨毛膜を分離した哺乳類の胎盤、特に人間の胎盤から取得される。実施形態において使用される羊膜は、例えば、ウマ、ウシ、又はアルパカのソースに由来してもよい。本発明の実施形態において使用するのに適した羊膜は、一般に、上皮層と、基底膜と、間質とを含み、三層の組み合わせは、好ましくは、約２００μｍの平均合計厚を有する。羊膜のシートは、適切な大きさに切断し、濾紙に貼り、保存溶液中で保存できる。こうしたシートは、更に、表面の側にマークが付いている限り、濾紙に貼ることなく適切なサイズに切断できる。凍結乾燥させる場合、凍結乾燥シートは、溶液中では保存しない。保存溶液は、培養媒体と高浸透圧剤とを含み、羊膜の水和が維持される。膜には、保存前又は使用前に、治療薬を浸透させることができる。

本発明の実施形態での使用のため、羊膜は、完全な状態（即ち、追加処理なし）にするか、或いは上皮の裸化を行う（即ち、以前に報告されているようにＥＤＴＡ及び機械的手段による（参考文献６２））。参照により全体を本明細書に組み込むGrueterich M, Espana E, Tseng SCG; 完全及び裸化羊膜上でのヒト輪部上皮のコネキシン（参考文献４３）の発現及び増殖, Invest Ophthalmol Vis. Sci., 43:63-71 (2002) を参照せよ。羊膜は、完全な状態か、或いは、間質表面の間質部分を除去するために焼灼される。上皮裸化膜が使用される場合、裸化膜は、培養中のＲＰＥ又はＲＰＥ等価細胞の接種前に作成される（下記参照）。しかしながら、羊膜間質を薄化する場合、間質は、こうした培養の前又は後で焼灼する。焼灼の方法は、例えばエキシマレーザ等、レーザ駆動にしてよい。別の実施形態において、羊膜は、膜に対するＲＰＥ細胞の良好な接着が可能となるように処理できる。例えば、膜は、膜上で電荷を発生させるように処理できる。

羊膜上でのＲＰＥ又はＲＰＥ等価細胞の培養方法
回収後、ＲＰＥ又はＲＰＥ等価細胞は、血清及び成長因子を含む培養捕捉物を含有する媒体において培養する。一実施形態において、媒体は、約０．０１ミリモル（ｍＭ）乃至約０．４ｍＭ、好ましくは０．１ｍＭの低Ｃａ²⁺濃度を含む。別の実施形態において、媒体は、成長因子を追加した状態で通常又は高Ｃａ²⁺濃度を含む。選択した培養基質上で、拡大培養を実行する。本発明の実施形態によれば、拡大培養は、低温保存羊膜上で実行される。

標準的な培養方法が、本発明の実施形態に従って使用される。細胞接種密度は、使用する羊膜の表面積に応じて変更できる。ＲＰＥ又はＲＰＥ等価細胞は、一般に、サブコンフルエント段階に達した時に、トリプシン及び／又はＥＤＴＡを利用した従来の方法によってプラスチック基質から取り除く。分離ＲＰＥ又はＲＰＥ等価細胞は、基底膜が露出された状態、或いは完全な羊膜上皮細胞に依然として覆われた状態である羊膜の上皮側に接種する。

羊膜上のＲＰＥの培養物において上皮表現型を誘導する方法
本発明の実施形態によれば、網膜色素上皮細胞又は網膜色素上皮等価細胞を羊膜上で培養するステップは、細胞がコンフルエントに達するまで継続する。理想的には、羊膜に存在する網膜色素上皮細胞の数は、１ｍｍ²当たり約４０００細胞である。しかしながら、理想的な数は、移植組成物によって覆うべき欠損のサイズによって決まる。例えば、４ｍｍ²の欠損を覆うには、高い生命力を備えた約１６，０００乃至約２０，０００細胞が必要となる。

ＲＰＥの線維芽細胞表現型から上皮表現型を誘導する、本発明の実施形態による一方法では、低いカルシウム濃度（例えば、約０．０１乃至約０．４ｍＭ、好ましくは０．１ｍＭ）を、約０．５乃至約２．０ｍＭ、好ましくは約１．８ｍＭの範囲の高いカルシウム濃度に上昇させる。カルシウムイオン濃度は、培養媒体に可溶性カルシウム塩を追加することで、実施形態に従って、上昇させ得る。代替として、イオンと結合することで、或いはイオンに対する障壁の浸透性を増加させることで、細胞膜の脂質障壁を越えるカルシウムイオンの輸送を促進するカルシウムイオノフォア等の作用物質を使用して、Ｃａ²⁺濃度を高めてよい。別の実施形態は、細胞質からのＣａ²⁺の搬出を遮断することで細胞内カルシウム濃度を高める作用物質を含む。別の実施形態において、媒体は、成長因子が追加された状態で、通常又は高Ｃａ²⁺濃度を含んでよい。別の実施形態によれば、培養されたＲＰＥ又はＲＰＥ等価細胞を含む羊膜は、空気流体界面に露出される。方法の組み合わせも、同時に又は連続して利用できる。

羊膜上のＲＰＥ細胞又はＲＰＥ等価細胞を含む組成物
一実施形態によれば、組成物は、基底膜と間質とを備えた完全なヒト羊膜を含む。本発明の別の実施形態において、組成物のヒト羊膜は、上皮裸化されている。

本発明は、更に、少なくとも一つの薬学的活性分子を更に含む組成物に関する。本発明の一実施形態において、組成物内の薬学的活性分子は、成長因子、酵素、又は治療薬剤のうちの一つ以上である。

網膜疾患を治療するキット
別の実施形態は、ヒト羊膜にしてよい羊膜と、羊膜に存在する複数の網膜色素上皮細胞又は網膜色素上皮等価細胞と、緩衝媒体又は培養媒体とよりなるキットを含み、更にキットは、随意的に、網膜疾患を治療するキットの少なくとも一つの構成要素の同時、個別、又は連続使用についての説明書を含む。特定の実施形態において、キットは、更に、少なくとも一つの薬学的活性物質を含む。活性物質は、成長因子、酵素、及び治療薬剤を含んでよい。成長因子は、網膜色素上皮由来成長因子及び／又はトランスフォーミング成長因子βを含んでよい。活性物質は、インターロイキン１０を含んでよい。活性物質は、組成物に存在してよく、或いは、別個にパッケージして、移植前に組成物又は網膜下腔の標的組織部位に添加してよく、若しくは、移植後に患者に投与してよい。

実施形態によるキットは、生体工学処理された細胞である網膜色素上皮等価細胞を含んでよい。

実施形態によるキットは、事前に対象受容者から回収され、研究室へ送られた自己由来の羊膜及び網膜色素上皮等価細胞によって形成された組成物を含んでよく、研究室では細胞を羊膜上で培養し、組成物に追加する。

ＲＰＥ細胞の網膜下腔への移植方法
ＲＰＥの移植の外科的手技は、眼内外科手術の標準的手技に類似する。手技は、以下のステップを含む。

ａ）扁平部の硝子体切除、及び後部硝子様の膜の除去。

ｂ）第一の網膜切開を、ＣＮＶ膜の上方において側頭側又は鼻側で実行する。

ｃ）リンゲル溶液を使用して、黄斑下ＣＮＶ膜を穏やかに水流解離させ、網膜下鉗子により取り除く。このステップ中、眼圧は上昇し、ペルフルオロカーボン（ＰＦＣＬ）を使用して、出血を防止又は最少化する。

ｄ）眼圧を約１５乃至約２０ミリメートル（ｍｍ）Ｈｇに低下させ、存在しない場合は、リンゲル溶液の網膜下注入によって、浅い網膜分離を形成する。

ｅ）注入システム、或いは、鏡面仕上げ又は抗粘着テフロン面等の非常に平滑な表面を有する特別に作成した鉗子を用いて、ＲＰＥ単層を備えた羊膜の調製済みシートを、中心窩領域において網膜下領域に送給する。

ｆ）最後に、空気又はガスタンポナーデを行い、移植シートを所定の位置に固定し、胸膜切開を閉鎖し、患者には、数日間に渡って腹臥位を維持するように求める。

ステップ「ｅ」において使用可能な鉗子については、膜がステンレス鋼に非常によく粘着し、移植物を解放できないため、未修正の市販の鉗子は、羊膜ＲＰＥ移植物の網膜下の位置への移動には容易に使用できないことに留意されたい。したがって、顎部をテフロンRのような物質でコーティングするべきである。微小な凹凸が膜に付着又は粘着し、これにより網膜とブルッフ膜との間に外科的に形成した空間に膜を解放するのを妨げるため、テフロンでコーティングした顎部は、鏡面仕上げにする必要がある。ステンレス鋼ではなく、クロロトリフルオロエチレン（ＣＴＦＥ）を含むプロトタイプの鉗子は、羊膜ＲＰＥ組成物の移植において使用するために、我々の研究室で作成している。ＣＴＦＥは、テフロンRと殆ど同じ抗粘着特性を有し、透明であり、外科医はＣＴＦＥを通して見ることができる。ＣＴＦＥが提供する付加的な利点は、ＣＴＦＥの柔軟性がステンレス鋼より高く柔らかであるため、ＣＴＦＥ顎部が羊膜ＲＰＥ移植物に対する傷を最少化することである。柔軟で透明なＣＴＦＥ顎部を備えた鉗子は、約２０ゲージ（ｇａ）である。

ＣＴＦＥ鉗子では、我々は、顎部を作動させるために多くの従来的なメカニズムの一つを使用する。こうしたメカニズムは、ハンドル又はハンドルの直前に位置し、長さ約３５乃至５０ｍｍ、外径約０．９ｍｍ以下のチューブに接続される。チューブの機能は、鉗子が胸膜切開を通過するのを容易にすることである。チューブは、眼の後極に達するのに十分な長さにする。眼は、通常、長さ約２４ｍｍだが、近視、ブドウ腫、その他の条件の存在に応じて、長さ２０乃至３５ｍｍとなり得る。閉じた時、顎部は、チューブの外径と等しいか、或いは僅かに小さい直径を有する。

ハンドルを圧縮することで、顎部をチューブに引き込み、これにより顎部が閉じるか、或いは、チューブを前方へ移動させ、これにより顎部を閉じる。チューブを前方に移動させる場合、顎部の先端は、保持している組織又は物体から一定の距離を維持する。一部のハンドルでは、ハンドルの遠端部又は直前のいずれかに位置する回転ノブにより、顎部の回転が可能となる。その他のハンドルは、円形で、片手を使って容易に回転させることができる。外科医はハンドルについて個人的好みを有するため、我々は、両方のタイプを製造する。全てのハンドルは、市販されているが（例えば、Ｓｔｏｒｚ−Ｂ＆ＬＩｎｃ、ＫａｔｅｎａＩｎｃ、ＤＯＲＣＩｎｃ、Ｇｒｉｅｓｈａｂｅｒ−ＡｌｃｏｎＩｎｃ、その他）、ＣＴＦＥ顎部は、市販されていない。

また、ステップ「ｅ」では、鉗子の代わりに注入システムを使用して、ＲＰＥを有する羊膜の調製シートを網膜下領域へ送給できる。

細胞回収のためにのみ、第二の網膜切開が網膜の鼻側で実行されることに留意されたい。

実施例
動物
ダッチベルトウサギを、ＣｏｎｖａｎｃｅＲｅｓｅａｒｃｈＰｒｏｄｕｃｔｓ，Ｉｎｃ．（米国ペンシルベニア州ドンバ）から入手した。使用した全てのウサギは、ケタミン０．３ｍｌ（３５ｍｇ／ｋｇ）及びキシラジン（５ｍｇ／ｋｇ）の筋肉内注射と、その後のＥｕｔｈａｓｏｌR（バージニア州ミッドロージアンのＤｅｌｍａｒｖａＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．）１ｍｌの注射とによって安楽死させた。

材料
ダルベッコ改変イーグル培地及びＦ１２栄養混合物１：１（Ｖ／Ｖ）と、分子遮断率１０，０００ダルトンの透析ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）と、Ｌ−グルタミンと、Ｌ−メチオニンと、Ｌ−リジンと、Ｌ−ロイシンと、塩化マグネシウムと、硫酸マグネシウムと、塩化カルシウムと、細胞培養グレードの水と、重炭酸ナトリウムと、ＦＩＴＣ共役ヤギ抗ウサギＵｇＧと、マウスモノクローナル抗サイトケラチン（ＣＫ）１８（クローンＣＹ−９０）とは、全てＳｉｇｍａ−ＡｌｄｒｉｃｈＣｈｅｍｉｃａｌＣｏｍｐａｎｙ（米国ミズーリ州セントルイス）から入手した。フェノールレッドナトリウムと、ＤＭＥＭ／Ｆ１２と、無菌リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）と、アンフォテリシンＢと、トリパンブルー染色溶液と、トリプシン／ＥＤＴＡとは、ＧｉｂｃｏＢＲＬ（米国ニューヨーク州グランドアイランド）から購入した。２４ウェルプレートを使用した（ＣｏｒｎｉｎｇＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓ）。２３９Ｕ／ｍｇのコラゲナーゼＩ型は、ＷｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（米国ニュージャージ州レイクウッド）から購入した。ペニシリン及びストレプトマイシンは、ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ（米国メリーランド州ウォークスビル）から入手した。ヤギ抗ラットＡｌｅｘａ５４６共役ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）、Ｆ（ａｂ）２、ヤギ抗マウスＡｌｅｘａ４８８共役ＩｇＧＦ（ａｂ）２は、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｒｏｂｅｓＩｎｃ．（米国オレゴン州ユージーン）から購入した。Ａｑｕａ−Ｐｏｌｙ／ｍｏｕｎｔは、ＰｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓＩｎｃ．（米国ペンシルベニア州ウォリントン）から入手した。ポリクローナルウサギ抗ＲＰＥ−６５抗体は、Ｔ．ＭｉｃｈａｅｌＲｅｄｍａｎｄから寄贈された。モノクローナルラット抗ＺＯ−１抗体（ＭＡＢ１５２０）は、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ（米国カリフォルニア州テメキュラ）から入手した。モノクローナルマウス抗パンサイトケラチンＫ８．１３Ａｂは、ＩＣＮＢｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．（米国オハイオ州オーロラ）から入手した。以前に公開されているように１３、羊膜の上皮裸化のために、角膜上皮スクラバを利用した（Ａｍｏｉｌｓ上皮スクラバ、Ｉｎｎｏｖａ、カナダオンタリオ州トロントのＩｎｎｏｖａｔｉｖｅＥｘｃｉｍｅｒＳｏｌｕｔｉｏｎｓ，Ｉｎｃ．）。羊膜を固定するために使用した培養プレートインサートは、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ（米国マサチューセッツ州ベッドフォード）から入手した。

一次ＲＰＥ培養
安楽死後、眼を迅速に摘出し、角膜輪部の後方およそ３乃至４ｍｍでのハサミによる周方向の切開によって、前部を除去した。ＲＰＥの分離は、コラゲナーゼを使用したことを除き、報告されている事項に従った（参考文献４８）。簡単に言うと、無菌ＰＢＳ、ｐＨ７．４の網膜下注入によって神経網膜を分離させ、硝子体残留物及び神経網膜の除去を容易にした。その後、ＲＰＥ表面をＰＢＳで三回濯ぎ、アイカップをＤＭＥＭ／Ｆ１２において１ｍｇ／ｍｌコラゲナーゼＩ型と共に、５％ＣＯ₂の培養機内で、一時間に渡って３７度で培養した。ＲＰＥシートは、熱研磨ガラスピペットによるブルッフ膜の穏やかな掻爬によって収集した。細胞は、８００ｒｐｍで五分間遠心分離して、Ｃａ²⁺ ０．１ｍＭに調節し、１０％透析ＦＢＳ、１００ＩＵ／ｍｌペニシリン（１００ｇ／ｍｌストレプトマイシン及び０．５ｇ／ｍｌアンフォテリシンＢ）を追加したＤＭＥＭ／Ｆ１２内で、２４ウェルプレート（一つの眼について５乃至６ウェル）で平板培養した。培養物は、媒体の５０％を新鮮な媒体と交換することで、平板培養４８時間後に破片を除去した。媒体は、その後、隔週で完全に交換した。

羊膜の調製
ヒト羊膜は、以前に説明した方法（米国特許第６，１５２，１４２号及び６，３２６，０１９号）に従って、Ｂｉｏ−ＴｉｓｓｕｅＩｎｃ．（フロリダ州マイアミ）から寄贈され、使用前にＤＭＥＭ及びグリセロール（１：１）中において−８０℃で保管した。使用時、ＡＭを室温で解凍し、無菌のハンクス平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ）により濯ぎ、余分なグリセロールを除去し、以前に説明したように（参考文献６３）、上皮側を上に向けて、２４ウェルプレート培養インサートに対して、４−０絹製外科用縫合糸（米国のＡｌｃｏｎＳｕｒｇｉｃａｌ）による縫合及び／又はゴム輪による締め付けを行った。別個の実験において、ＡＭは、以前に説明したように（参考文献６２）、ＰＢＳ内の無菌０．０２％ＥＤＴＡによる４５分間の培養と、その後の上皮スクラバ（Ａｍｏｉｌｓ上皮スクラバ、Ｉｎｎｏｖａ、カナダオンタリオ州トロントのＩｎｎｏｖａｔｉｖｅＥｘｃｉｍｅｒＳｏｌｕｔｉｏｎｓ，Ｉｎｃ．）による穏やかな研磨とにより、上皮裸化した。無菌ＨＢＳＳによる三回の濯ぎの後、ＲＰＥ細胞の接種の前に、これらのＡＭをＤＭＥＭ／Ｆ１２中で３乃至４日保存した。

ＲＰＥ細胞の継代
ＲＰＥ細胞の第一の継代は、対数期の後半に、Ｃａ²⁺及びＭｇ²⁺を含まないＨＢＳＳ中の０．０５％トリプシン及び０．０２％ＥＤＴＡの八分間の処理によって取得し、Ｃａ²⁺濃度を０．１ｍＭに調節し、１０％透析ＦＢＳ、１００ＩＵ／ｍｌＰＮＳ、及び０．５μｇ／ｍｌアンフォテリシンＢを追加したＤＭＥＭ／Ｆ１２において、１ｃｍ²当たり５，０００乃至２０，０００生存ＲＰＥ細胞（トリパンブルー染色により評価）で、プラスチック、裸化ＡＭ、又は完全ＡＭのいずれかに接種した。細胞は２６時間に渡って平静に保って付着させ、培養媒体は、その後、隔週で交換した。

カルシウム切り替え
上の各培養物のＲＰＥ細胞がコンフルエントに達した時、可溶性カルシウム塩を追加して、培養媒体のＣａ²⁺濃度を１．８ｍＭに変更した。

評価
各培養物を、平板培養３６時間後と、コンフルエンス状態と、カルシウム切り替え一週間及び四週間後とに、位相差顕微鏡下で観察した。媒体を除去し、細胞を無菌ＰＢＳにより三回濯ぐことにより、様々な間隔で、培養を終了させた。その後、サイトケラチンのために予冷（−２０℃）メタノールにおいて五分間、或いは（ＲＰＥ−６５、ＺＯ−１のために）４％パラホルムアルデヒドにおいて４℃で十分間、培養物を固定した。この後、再びＰＢＳ中で三回濯ぎを行った。その後、組織は、ＰＢＳ中の０．０１ＮａＮ_３において４℃で約二週間、更なる処理まで保存した。一次抗体は、以下の濃度で、一晩に渡って４℃で培養した：パンサイトケラチン（Ｋ８．１３）１／１００、サイトケラチン１８（ＣＹ−９０）１／３０００（両方とも［参考文献２５］による）、ＺＯ−１１／２００及びＲＰＥ−６５１／２００。この後、ＰＢＳにおいて三回洗浄し、１／２００の希釈でＦＩＴＣ（ＲＰＥ−６５用）、Ａｌｅｘａ５４６（ＺＯ−１用）、Ａｌｅｘａ４８８（パンサイトケラチン及びサイトケラチン１８用）のいずれかと共役したそれぞれの二次抗体と共に二時間培養した。全ての抗体は、１％ＢＳＡと０．１％トリトンｘ−１００を含むＰＢＳにおいて希釈した。試料をＰＢＳにおいて三回洗浄し、Ａｑｕａ−Ｐｏｌｙ／ｍｏｕｎｔ封入媒体に封入した。その後、ＣＣＤオプトロニクスカメラに接続したＺｅｉｓｓＡｘｉｏｐｈｏｔ蛍光顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ、ドイツ、オーバーコッヘン）により染色を分析した。その後、画像は、ＡｄｏｂｅＰｈｏｔｏｓｈｏｐ５．５ソフトウェアにより画質強化した。免疫染色のために、上記の抗体の特異度を、ダッチベルトウサギ組織において検証した。簡単に言うと、結果的に安楽死が必要となる別の手順で以前に使用した動物に、麻酔状態で４％ホルムアルデヒドを灌流させた。その後、ＰＢＳ中の４％パラホルムアルデヒドの注入を硝子体内に行い、眼を同じ固定剤に没入させ、氷上で二時間維持した。その後、前方部分を切り取り、硝子体を可能な限り除去した。試料は、眼の後極及び角膜から眼科用ハサミで切断し、１０、２０、及び３０％の連続的なスクロース勾配で、ＰＢＳにおいて培養し、ＯＣＴに埋め込み、液体窒素で急速冷凍した。組織切片は、Ｒｅｉｃｈｅｒｔ低温保持装置上で８μｍに切断した。

結果
様々な基質において低Ｃａ²⁺で成長させたＲＰＥの形態的外観
ウサギＲＰＥ細胞は、低Ｃａ²⁺ＤＭＥＭ／Ｆ１２において、プラスチック（Ｐ）、上皮裸化ヒト羊膜（ｄＡＭ）、又は完全ヒト羊膜（ｉＡＭ）上で、１ｃｍ²当たり約５，０００乃至約２０，０００生存ＲＰＥ細胞で接種した。ｄＡＭ上では約７乃至９日でコンフルエンスに達し、プラスチック上での９乃至１０日より早かった。こうした三種類の培養物でのＲＰＥ細胞は、一般に、紡錘状に見え、共に基質上に均一に広がったが、但し、ｉＡＭ上のＲＰＥ細胞は、より扁平で多角形となり、コンフルエンスに達した時、プラスチック培養及びｄＡＭと比較して、分布の均一性が低かった。更に、メラノリポフスチン顆粒の色素沈着は、一つには、広く認識された現象である細胞***による希釈のため、プラスチック培養では急速に消滅した（参考文献３３）。しかしながら、ｄＡＭ上のＲＰＥ細胞は、色素沈着は同じく低減したものの、ある程度の顆粒の外観を維持し、一方、ｉＡＭ上のＲＰＥ細胞は、依然として高い色素沈着を保持した。

Ｃａ²⁺切り替え一週間後のＲＰＥの形態的外観
ＲＰＥ細胞がｄＡＭ上でコンフルエンスに達した時、媒体を高Ｃａ²⁺ＤＭＥＭ／Ｆ１２に切り替えた。Ｃａ²⁺切り替え一週間後、プラスチック培養のＲＰＥ細胞は、引き続き紡錘状を維持したが、ある程度の色素沈着が再び現れたのを除き、明確な顆粒を形成しなかった。対照的に、ｄＡＭで成長させたＲＰＥ細胞は、多角形（六角形）の形状の上皮様の外観となり、細胞質での色素沈着を有する豊富な顆粒を示した。ｉＡＭ上のＲＰＥも、高い色素沈着と共に、多角形の形状となった。比較として、ｄＡＭ及び低カルシウムで成長させたＲＰＥ細胞は、依然として紡錘状を維持したが、より多くの色素沈着を有するように見えた。

免疫染色による結果的な上皮表現型の特徴付け
ＣＫ１８染色
ＲＰＥ細胞の上皮起源を特定するマーカ、ＣＫ１８（サイトケラチン１８）に対する抗体による染色を実行した。結果は、全ての細胞が陽性であったことから、実際に、低Ｃａ²⁺濃度で培養されたＲＰＥが上皮起源を有することを示した。完全及び裸化膜で成長させたＲＰＥは、鮮やかな細胞骨格パターンによる強い陽性の染色を示し、Ｃａ²⁺を上昇させた時、プラスチックで成長させた対応物より顕著となった。

ＲＰ６５染色
ＲＰ分化の新しいマーカであるＲＰ６５に対する染色を実行した。生体内ウサギ網膜のＲＰＥでの正常な陽性染色パターンが得られ、染色の写真は、光受容体（上部）と脈絡毛細管板（底部）との間のＲＰＥの単層を示し、ＲＰＥ細胞が染色された。

ＲＰ６５染色
ＲＰ６５染色は、Ｃａ²⁺切り替え１．５週間後であっても、プラスチックで成長させたＲＰＥが陰性となることを示した。対照的に、完全ＡＭ及び裸化ＡＭで成長させた時、ＲＰＥ細胞は、ＲＰ６５に対して強い陽性となった。この結果は、培養を３．５週間まで延長した時に継続した。陽性染色は、緑の蛍光で示され、一方、赤みを帯びた染色は、ＰＩによる核対比染色となった。

ＺＯ−１染色
ＺＯ−１染色は、ＲＰＥによって形成された密着結合複合体を対象とする。生体内では、このＺＯ−１に対する抗体は、ＲＰＥ及び光受容体複合体において陽性（赤みを帯びた蛍光）を示した。ＺＯ−１染色は、プラスチック、完全羊膜、及び裸化羊膜で成長させたＲＰＥ細胞においても陽性となった。

参考文献
外科医、科学者、及び研究者は、以下の論文において提供される情報から恩恵を受けると考えられる。

１．Young RW、加齢性黄斑変性症の病態生理学、Surv. Ophthalmol., 31:291-306 (1987)
２．Marmor MF、漿液性網膜剥離の病原及び治療に関する新仮説、Graefea's Arch. Clin. Exp. Ophthalmol, 226:548-52 (1988)
３．Mitchell GA, Brody LC, Sipila I, Looney JE, Wong C, Engelhardt JFら、オルニチン−Ｄ−アミノトランスフェラーゼの少なくとも二つの突然変異対立遺伝子は脈絡膜及び網膜の脳回転状萎縮を引き起こす、Finns. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 86:197-201 (1989)
４．Cremers FPM, vab de Pol DJRK, van der Kerkhoff PM, Wieinga B, Ropers HH、先天性脈絡膜欠如を有する患者において再配置される遺伝子のクローニング、Nature, 347:674-7 (1990)
５．Green WR, Wilson DJ、脈絡膜新生血管形成、Ophthalmology, 93: 1169-76 (1986)
６．Del Priore LV, Kaplan HJ, Sivermann MS, Valentino T, Mason G, Hornbeck R、網膜色素上皮細胞移植の実験的及び外科的側面、Eur. J. Implant Ref. Surg. 5:128-32 (1993)
７．Thomas MA: Lewis H, Ruan SJ編、Medical and Sugical Retina., St. Louis: Mosby, 63-81 (1994)
８．Bynoe LA, Change TS, Funata M、中心窩下新生血管膜における欠陥パターンの組織病理学的実験、Ophthalmology, 101:1112-7 (1994)
９．Castellarin A, Nasir M, Sugino IK, Zarbin MA、加齢性黄斑変性症の外科手術後の漸進的脈絡毛細管板萎、Retina, 18:143-9 (1998)
１０．Sheng Y, Gouras P, Cao H, Berglin L, Kjeldbye H, Lopez Rら、ウサギ及びサル網膜におけるヒト胎児網膜色素上皮のパッチ移植、Invest Ophthalmol. Vis. Sci., 36:381-90 (1995)
１１．Algvere PV, Berglin L, Gouras P, Sheng Y、中心窩下新生血管形成を有する加齢性黄斑変性症における胎児網膜色素上皮の移植、Graefe's Arch. Clin. Exp. Ophthalmol., 232:707-16 (1994)
１２．Marquardt T, Ashery-Padan R, Andrejewski N, Scardigli R, Guillemot F, Gruss P、Ｐａｘ６は網膜前駆細胞の多能生状態に必要となる、Cell, 105:43-55 (2001)
１３．Algvere PV, Gouras P、免疫抑制しないＡＭＤ患者におけるＲＰＥ同種移植の長期的結果、European J. Ophthalmol., 9:217-30 (1999)
１４．Binder S, Stolba U, Krebs I, Kellner L、加齢性黄斑変性症により生じた中心窩下新生血管形成を有する眼における自己網膜色素上皮の移植：予備的研究、Am J Pphthalmol, 133:215-25 (2002)
１５．Li L, Turner JE、ＲＣＳラットにおける長期的光受容細胞の救護の最適条件、健全なＲＰＥ移植の必要性、Exp. Eye Res., 52:669-79 (1991)
１６．Little CW, Cox C、ＲＣＳラットにおけるヒト胎児ＲＰＥの移植による光受容体救護の相関、Exp. Neurol., 149:151-60 (1998)
１７．Little CW, Castillo B, Diloreto DA、ヒト胎児網膜色素上皮の移植は英国外科医師会ラット網膜において光受容細胞を変性から救護する、Invest Ophthalmol Vis Sci., 37:204-11 (1996)
１８．Seaton AD, Turner JE、ＲＰＥ移植は網膜脈管構造を安定化させ、ＲＣＳラットにおける新生血管形成を防止する、Invest Ophthalmol Vis Sci., 33:83-9 (1992)
１９．Seaton AD, Sheedo HJ, Turner JE、ＲＣＳラットにおける新生血管形成の阻害及び退行におけるＲＰＥ移植の主要な役割、Invest Ophthalmol Vis Sci., 35:162-9 (1994)
２０．Weisz JM, Humayan MS, De Juan E、ジオグラフィックアトロフィの患者における同種胎児色素上皮細胞移植、Retina, 19:540-5 (1999)
２１．Valentino A, Kaplan HJ, Del Priore LV、黄斑下手術後のサルにおける網膜色素上皮再定着、Arch Ophthalmol, 113:932-8 (1995)
２２．Del Priore LV, Hornbeck R, Kaplan HJ、ブタ網膜上皮のｉｎｖｉｖｏでの創面切除、Arch Ophthalmol, 113:939-44 (1995)
２３．Del Priore LV, Kaplan HJ, Hornbeck R、加齢性黄斑変性症の病原及び治療のモデルとしての網膜色素上皮創面切除、Am J Ophthalmol, 122:629-43 (1996)
２４．Leonard DS, Zhang X-G, Panozzo G, Sugino IK, Zarbin MA、局部的網膜色素上皮創面切除の臨床病理学的相関、Invest Ophthalmol Vis Sci., 38:1094-109 (1997)
２５．Gouras P, Floord MT, Kjeldbye H, Bilek MK, Eggers H、培養ヒト網膜上皮のヨザルの眼のブルッフ膜への移植、Curr. Eye Res., 4:253-65 (1985)
２６．Phillips SJ, Sadda S, Liu H, Tso MOM, Binder S、ブルッフ膜の機械的創面切除後の網膜色素上皮の自己移植、Invest Ophthalmol Vis Sci., in press (2002)
２７．Guymer R, Luthert P, Bird A、ブルッフ膜及び関連構造の年齢による変化、Prog. Retin. Eye Res., 18:59-90 (1998)
２８．Grisanti Sら、培養網膜色素上皮細胞移植が引き起こす免疫性及び免疫特権、Invest Ophthalmol Vis Sci., 38:1019-26 (1997)
２９．Gabrielan Kら、ヒト胎児ＲＰＥ移植後のウサギの眼における細胞反応、Graefes Arch Cltn. Ophthalmol, 237: 326-35 (1999)
３０．Yamamoto Sら、ＲＣＳラットにおける網膜色素上皮移植及び網膜機能、Invest Ophthalmol Vis Sci., 34:3068-75 (1993)
３１．Prefer BA、ヒト及びサル網膜色素上皮の細胞培養の改良された方法、Prog. Rettin, Eye res., 10:251-91 (1991)
３２．Steinberg RH, Wood I、Zinn KM, Marmor MF編、網膜色素上皮、Cambridge, MA: Harvard University Press, 32-44, (1979)
３３．Floord MT, Gouras P, Kjeldbye H、ヒト網膜色素上皮のｉｎｖｉｔｒｏでの成長特性及び超微細構造、Invest Ophthalmol Vis Sci., 19:1309-20 (1980)
３４．Hu J, Bok D、ヒト網膜上皮の機能的分極単層への分化を支持する細胞培養媒体、Molecular Vision, 7:14-9 (2000)
３５．Flannery JG, Prefer BA, Bok D、ヒトＲＰＥの単層によるｉｎｖｉｔｒｏでのビタミンＡの経上皮輸送、Invest Ophthalmol Vis Sci., 26:3 (1985)
３６．Abi A, Binder S, Harrer E、Multifokale elektroretinographie (mERG) zur Verlaufskontrolle bei subretinaler Chirurgie mit autologer RPE-Transplantation bei patienten mit AMD、Spektrum Augenheilk, 15:185-8 (2001)
３７．Bilbao KV, Leng T, Fung AEら、生体分解性マトリクスは網膜下細胞移植の基質としての水晶体嚢の使用を容易にする、ARVO 2002, IOVS 43/4, 3441
３８．Farrokh-Siar L, Kourous A, Rezai Aら、寒冷沈降物：ヒト胎児網膜色素上皮のための自己基質、Ex. Eye Research, 19; 2, 89-94, (1999)
３９．Dutt Kら、細胞外マトリクスはヒト色素上皮細胞株００４１における成長及び分化を仲介した、Current Eye Research, 10(12):1089-100 (1991)
４０．LU L, Yaszemski MJ, Mikos AG、合成生体分解性ポリマを使用した網膜色素上皮のエンジニアリング、Biomaterials, 22:3345-55 (2001)
４１．Fung AE, Lee CJ, Leng Tら、ＩＰＥ及びＲＰＥ移植のための基質としての組織工学処理した水晶体嚢、ARVO 2002, IOVS 43/4, 3452
４２．Thuman G, Schaefer F, Finkham Jら、生物分解性基層上での虹彩色素上皮細胞の成長、ARVO 2002, IOVS 43/4, 3454
４３．Lappas A, Rezai KA, Bernd Tら、虹彩色素上皮移植−「網膜下外科及び網膜移植の国際会議」ウィーン、１９９８年において提示されたｉｎｖｉｔｒｏ手法
４４．Giordano GG, Thomson RC, Ishaug SLら、合成生体分解性ポリマ上で培養した網膜色素上皮細胞、J. of Biomedical Material Research, 34:87-93, (1997)
４５．Korte GE, Reppucci V, Henkind P、ＲＰＥ破壊は脈絡毛細管板萎縮を引き起こす、Invest Ophthalmol Vis Sci., 25:1135-45 (1984)
４６．Kuwabara T, Ishikawa Y, Kaiser-Kupfer M、動物における脳回転状萎縮の実験モデル、Ophthalmology, 88:331-4 (1981)
４７．Takeuchi M, Itagaki T, Takahashi K、オルニチン静脈注射後の網膜変性の中間段階における変化、日本眼科学会雑誌 Acta Soc Ophthalmol Jpn, 97:17-28 (1993)
４８．Koh S-WN、浸透性支持物上でのヒヨコ網膜色素上皮は機能極性を示す、Exp. Cell Res., 181: 331-47 (1998)
４９．Heth CA, Yankauckas MA, Adamian M, Edwards RB、微孔性フィルタ上で培養した網膜色素上皮細胞の特徴付け、Curr. Eye Res., 6:1007-19 (1987)
５０．Albert DM, Tso MOM, Rabson AS、網膜上皮の純粋培養のｉｎｖｉｔｒｏでの成長、Arch Ophthalmol, 88:63-9 (1972)
５１．Del Priore LV, Tezel TH、ヒトブルッフ膜の層へのヒト網膜色素上皮の再付着率、Arch Ophthalmol, 116:335-41 (1998)
５２．Tezel TH, Kalplan HJ, Del Priore LV、ヒトブルッフ膜の相へ接種したヒト網膜色素上皮細胞の結末、Invest Ophthalmol Vis Sci., 40:467-76 (1999)
５３．Kim JC, Tseng SCG、重篤な損傷のウサギ角膜における表面再構築のための保存ヒト羊膜の移植、Cornea, 14:473-84 (1995)
５４．Dua HS, Azuara-Blanco A、羊膜移植、Br. J. Ophthalmol, 83:748-52 (1999)
５５．Kruse FE, Voelcker HE, Rohrschneider K、眼球表面再構築のための羊膜移植（ＡＭＴ）、Ophthalmology, 122 (1998)
５６．Sippel KC, Ma JJK, Foster CS、羊膜外科、Curr. Opin. Ophthalmol, 12:269-81 (2001)
５７．Tseng SCG, Tsubota K、Holland EJ, Mannis MJ編、眼球表面疾患：医学的及び外科的管理、第一版、Springer, 226-31 (2001)
５８．Kruse FE, Joussen AM, Rohrschneider K, You L, Sinn B, Baumann Jら、眼球表面再構築のための低温保存ヒト羊膜、Graefe's Arch. Clin. Exp. Ophthalmol, 238:68-75 (2000)
５９．Gelanze M, Breipohl W, Wiedemann P, Naib-majani W, Heimann K、ＲＣＳラットの網膜下腔における最初の実験的虹彩色素上皮細胞移植、Invest Ophthalmol Vis Sci., 34:1097 (1993)
６０．Gelanze M, Meneses P, Rosenfeld MR, Duvoisin RM, Coleman DJ、網膜下腔への虹彩色素上皮細胞の自己移植の長期的結果、Invest Ophthalmol Vis Sci., 38:334 (1997)
６１．Lai W, Rezaei KA, Farrokh-Siar L, Pearlmann J, Shu J, Patel SCら、虹彩色素上皮を培養及び輸送する新しい方法、Invest Ophthalmol Vis Sci., 38:335 (1997)
６２．Grueterich M, Espana E, Tseng SCG、完全及び裸化羊膜上でのヒト輪部上皮のコネキシン４３の発現及び増殖、Invest Ophthalmol Vis. Sci., 43:63-71 (2002)
６３．Meller D, Tseng SCG、羊膜上での結膜上皮細胞の分化、Invest Ophthalmol. Vis. Sci., 40:878-86 (1999)
６４．Bhatt NS, Newsome DA, Fenech Tら、コラーゲン基質上のヒト網膜色素上皮細胞の実験的移植、Am J Ophthalmol, 117:214-21 (1994)
６５．Del priore LV, Tezel TH, Hornbeck Rら、ブタの眼の網膜下腔への網膜色素上皮シートの移植、Invest. Ophthalmol. Vis. Sci., 38:1207 (1997)
６６．Oganesian A, Gabrielian K, Verp Mら、三次元培養システムとしてのヒト胎児網膜色素上皮の移植、Invest. Ophthalmol. Vis. Sci., 38:1568 (1997)
６７．Rezai KA, Farrokh-Siar L, Godowski Kら、ヒト胎児網膜色素上皮スフェロイドの移植、Invest Ophthalmol. Vis. Sci., 40:3137 (1999)
６８．Hadlock T, Singh S, Vacanti JP, Mclaughlin BJ、生物分解性基質上で培養した眼球細胞単層、Tissue Eng., 5:187-96 (1999)
６９．Lu L, Garcia CA, Mikos AG、生物分解性ポリ（ＤＬ−乳酸−コ−グリコール酸）薄膜上での網膜色素上皮細胞培養、J Biomater Sci. Polymer Edn., 9:1187-205 (1998)
７０．Singh S, Woerly S, Mclaughlin BJ、網膜色素上皮単層移植のための天然及び人工基質、Biomaterials, 22:3337-43 (2001)
７１．Kiilgaard JF, Nicolini J, Wiencke AKら、細胞外マトリクス及びブタ前嚢におけるブタＲＰＥ細胞の成長、Invest. Ophthalmol. Vis. Sci., 39:100 (1998)

均等物
本発明について、特に、その好適な実施形態を参照して図示及び説明してきたが、当業者は、本発明の範囲から逸脱することなく、形態及び詳細における様々な変更を行い得ることは理解し得よう。当業者は、本明細書で説明した特定の実施形態に対する数多くの均等物を認識し、或いは、単なる日常的実験を使用して確認できるであろう。こうした均等物は、付記した特許請求の範囲に包含されるものである。

ＲＰＥ回収カニューレ１０の側面図カニューレ１０の遠端部１２の拡大詳細図２０ビュー３−３で取り出した図２のビューを示す図図２のビュー４−４で取り出したカニューレ１０の先端部１２の端面図補助注入ライン５２を有するＲＰＥ回収カニューレ５０の別の実施形態の側面図カニューレ５０の遠端部５８の拡大詳細図６０図６のビュー７−７で取り出したカニューレ５０の遠端部５８の底面図７０

Claims

ａ）羊膜と、
ｂ）前記羊膜に存在する複数の網膜色素上皮細胞又は羊膜色素上膜等価細胞と、よりなる組成物。
前記羊膜は、上皮裸化されている、請求項１記載の組成物。
前記羊膜は、基底膜と間質とを含む完全な羊膜である、請求項１記載の組成物。
前記羊膜は、少なくとも片側を処理された膜として存在する、請求項３記載の組成物。
前記処理は、前記間質側を薄化するエキシマレーザ焼灼、或いは前記基底膜側を薄化するエキシマレーザ焼灼である、請求項４記載の組成物。
前記処理は、前記間質側の厚さを変更するレーザ処理である、請求項４記載の組成物。
前記処理は、前記間質側への間葉細胞の追加である、請求項４記載の組成物。
前記細胞は、線維芽細胞である、請求項７記載の組成物。
前記羊膜は、ヒト羊膜である、請求項１記載の組成物。
前記羊膜における網膜色素上皮等価細胞の数は、４ｍｍ²当たり約１６，０００乃至２０，０００である、請求項１記載の組成物。
前記羊膜における網膜色素上皮等価細胞の数は、４ｍｍ²当たり約４，０００である、請求項１記載の組成物。
前記網膜色素上皮等価細胞は、虹彩色素上皮細胞を含む、請求項１記載の組成物。
前記網膜色素上皮等価細胞のソースは、ウイルス又は非ウイルス作用物質により不死化された細胞を含む、請求項１記載の組成物。
前記網膜色素上皮等価細胞のソースは、網膜色素上皮細胞への分化がｉｎｖｉｖｏで誘導された少なくとも一つの幹細胞を含む、請求項１記載の組成物。
前記幹細胞は、成体幹細胞を含む、請求項１４記載の組成物。
前記幹細胞は、胚幹細胞を含む、請求項１４記載の組成物。
前記成体幹細胞は、末梢血細胞又は骨髄細胞を含む、請求項１５記載の組成物。
前記網膜色素上皮等価細胞のソースは、網膜色素上皮細胞への分化をｉｎｖｉｔｒｏで誘導された少なくとも一つの生体工学処理細胞を含む、請求項１記載の組成物。
前記網膜色素上皮等価細胞は、前記網膜色素上皮の表現型を保持する、請求項１記載の組成物。
前記羊膜に存在する前記網膜色素上皮等価細胞は、培養細胞を含む、請求項１記載の組成物。
前記網膜色素上皮等価細胞は、神経網膜細胞又は毛様体に由来する細胞を含む、請求項１記載の組成物。
前記神経網膜細胞は、桿体細胞又は錐体細胞を含む、請求項２１記載の組成物。
更に、薬学的活性分子を含む、請求項１記載の組成物。
前記薬学的活性分子は、成長因子と、酵素と、治療薬剤とで構成された集合から独立して選択された少なくとも一つの物質を含む、請求項２３記載の組成物。
前記成長因子は、網膜色素上皮由来成長因子とトランスフォーミング成長因子βとで構成された集合から選択される、請求項２４記載の組成物。
前記薬学的活性分子は、インターロイキン１０である、請求項２３記載の組成物。
キットであって、
ａ）羊膜と、
ｂ）前記羊膜に存在する複数の網膜色素上皮細胞又は網膜色素上皮等価細胞と、
ｃ）緩衝媒体又は培養媒体と、
ｄ）随意的に、網膜疾患を治療する前記キットの少なくとも一つの構成要素の同時、個別、又は連続使用についての説明書と、よりなるキット。
更に、少なくとも一つの薬学的活性物質を含む、請求項２７記載のキット。
前記薬学的活性物質は、成長因子と、酵素と、治療薬剤とで構成された集合から独立して選択された少なくとも一つの物質を含む、請求項２８記載のキット。
前記成長因子は、網膜色素上皮由来成長因子とトランスフォーミング成長因子βとで構成された集合から選択される、請求項２９記載のキット。
前記薬学的活性物質は、インターロイキン１０である、請求項２８記載のキット。
前記網膜色素上皮等価細胞は、生体工学処理された細胞を含む、請求項２７記載のキット。
ａ）少なくとも一つの網膜色素上皮細胞又は網膜色素上皮等価細胞を羊膜に供給するステップと、
ｂ）前記網膜色素上皮細胞又は網膜色素上皮等価細胞を、成長に適した条件下で、複数の培養細胞を生成するのに十分な期間に渡って前記膜上で培養するステップと、よりなる、組成物を形成する方法。
前記膜における培養細胞の数は、４ｍｍ²当たり約１６，０００乃至２０，０００である、請求項３３記載の方法。
切除又は培養網膜色素上皮細胞又は網膜色素上皮等価細胞が網膜色素上皮細胞の表現型を発現又は維持するのを誘導する方法であって、
ａ）羊膜を前記網膜色素上皮細胞又は網膜色素上皮等価細胞に接触させるステップと、
ｂ）前記網膜色素上皮細胞又は網膜色素上皮等価細胞を、成長に適した条件下で、複数の培養細胞を生成するのに十分な期間に渡って前記膜上で培養するステップと、
ｃ）網膜色素上皮細胞の前記表現型を誘導又は維持するのに十分なレベルまで細胞内カルシウムイオン濃度を引き上げる有効量の作用物質に前記培養細胞を接触させるステップ、或いは
ｄ）網膜色素上皮細胞の前記表現型を誘導又は維持するのに十分な期間に渡って、培養細胞を含む前記膜を空気流体界面に露出するステップと、よりなる方法。
ステップｃ及びｄの両方を実行する、請求項３５記載の方法。
ステップｃにおいて、前記細胞内カルシウムイオン濃度は、約０．５ｍＭから約２．０ｍＭの濃度に引き上げられる、請求項３５記載の方法。
ステップｃにおいて、前記細胞内カルシウムイオン濃度は、約１．８ｍＭに引き上げられる、請求項３５記載の方法。
前記網膜色素上皮細胞又は網膜色素上皮等価細胞を前記膜上で培養する前記ステップは、前記細胞がコンフルエンスに達するまで継続される、請求項３５記載の方法。
網膜色素上皮細胞の表現型を発現する複数の細胞への少なくとも一つの網膜色素上皮等価細胞の成長及び分化を促進するヒト羊膜の使用。
複数の網膜色素上皮細胞を、必要とする個体の網膜下腔の標的部位に送給する方法であって、
ａ）前記個体の網膜に少なくとも一つの穴を形成するステップ、或いは前記網膜下腔にアクセスするために前記網膜を少なくとも部分的に分離するステップと、
ｂ）前記穴を介して、羊膜と前記膜に存在する前記網膜色素上皮細胞とを含む組成物を挿入するステップと、
ｃ）前記組成物を前記標的部位に位置決めするステップと、よりなる方法。
必要な患者の網膜下腔に、羊膜と前記膜に存在する複数の網膜色素上皮細胞とを含む組成物を挿入するステップよりなる、網膜疾患を治療する方法。
前記膜における網膜色素上皮等価細胞の数は、４ｍｍ²当たり約１６，０００乃至２０，０００である、請求項４２記載の方法。
治療される前記網膜疾患は、加齢性黄斑変性症である、請求項４２記載の方法。
治療される前記網膜疾患は、網膜変性と、脳回転状萎縮と、先天性脈絡膜欠如とで構成された集団から選択される、請求項４２記載の方法。
前記羊膜は、ヒト羊膜である、請求項４２記載の方法。
前記網膜色素上皮細胞は、前記羊膜上で培養された細胞を含む、請求項４２記載の方法。
前記組成物は、更に、薬学的活性分子を含む、請求項４２記載の方法。
前記薬学的活性分子は、成長因子と、酵素と、治療薬剤とで構成された集合から選択される、請求項４８記載の方法。
アロ抗原と網膜色素上皮特異的自己抗原とに対して受容者が敏感になるのを防止又は軽減するために、網膜色素上皮細胞又は虹彩色素上皮細胞を網膜下腔に移植するためのヒト羊膜の使用。
網膜色素上皮細胞又は虹彩色素上皮細胞の前記網膜下腔への移植に続く繊維形成を阻害するヒト羊膜を含む羊膜の使用。
疾患を有する、或いは疾患にかかる危険性のある患者における網膜疾患の治療用組成物の製造のための、ヒト羊膜及び少なくとも一つの網膜色素上皮細胞の使用。