JP2006500956A - 腫瘍の低酸素領域で選択的に複製する組み換えアデノウイルスベクターの使用による、標的腫瘍治療 - Google Patents

Abstract

本発明の主題は、ベクター内に存在するＨＩＦ−１誘導プロモーターが機能できる細胞を感染させることによる、ＨＩＦ−１を発現する細胞に選択的に細胞毒性を与える制限増殖コンピテントアデノウイルスベクターを提供する。また提供されるのは、ベクターを基本にした組成物および宿主細胞、ならびにベクターを増殖させおよび使用する方法である。本発明の主題は、さらに、腫瘍を制限増殖コンピテントアデノウイルスベクターおよび複製欠損アデノウイルスベクターで同時に感染させることによる、腫瘍増殖を阻害する方法を提供する。

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２００２年１０月１日出願の米国仮特許出願第６０／４１５,３１９号に基づきかつ優先権主張をしており、引用によりその全体を本明細書に包含させる。

助成金の説明
本試験は、米国国立衛生研究所(ＮＩＨ)から、助成金ＣＡ８１５１２号により援助された。したがって、米国政府は本発明の主題にある権限を有する。

技術分野
本発明の主題は、一般に、低酸素細胞中で、制限増殖コンピテント(conditionally replication competent)アデノウイルスベクターを増殖させる方法に関する。より特には、方法は、低酸素細胞、例えば腫瘍中の低酸素細胞を、低酸素細胞中で複製するアデノウイルスベクターのような制限増殖コンピテントアデノウイルスベクターで感染させ、細胞を殺すことに関する。

略語の表

背景技術
医学的研究および技術の著しい進歩にもかかわらず、癌は米国および世界中で死亡の主な原因の一つのままである。米国だけで１００万人を超える癌の新症例が報告され、５０万人以上がこの国で毎年癌により死亡している。

癌の現在の処置は腫瘍の外科的除去または放射線処置を含むが、まだ限界がある。前者の場合、一度腫瘍が周囲組織を侵襲することにより、または離れた部位に移動することにより転移したら、すべての癌細胞を除去することは外科医には事実上不可能である。取り残された任意のこのような細胞が増殖を続け、手術後に癌の再発を導き得る。現在の放射線療法戦略も、患者の癌の処置にしばしば不完全である。すべての腫瘍細胞を殺し、かつ同時に周囲の正常組織を傷害しない十分に高い線量の放射線を送達することがしばしば不可能であるため、放射線療法後に癌が再発し得る。腫瘍が放射線誘発細胞死に対して広範囲の感受性を示すため、また再発し得る。このように、腫瘍細胞を除去するための現在の処置の無力さが、不十分な癌治療を導く重要な臨床的限界である(Lindegaard et al., 1996; Suit, 1996; Valter et al., 1999)。

腫瘍性疾患を十分に処置する無力さに由来する挑戦をする新しい処置概念が必要である。医学癌専門医が向かっている主な挑戦の一つは選択性：周りの領域の正常細胞に傷害をもたらすことなく腫瘍細胞を殺す能力である。種々の現在のアプローチは、ほとんどの場合、腫瘍細胞が正常細胞より速く増殖するという事実を利用しており、したがって、急速に増殖している細胞を殺すために設計された戦略は、いくぶん腫瘍細胞に選択的である(Yazawa et al., 2002参照)。しかしながら、これらの方法はまた正常で急速に***している体内のある細胞タイプ、最も顕著には骨髄の細胞も殺し、貧血および好中球減少症のような合併症をもたらす(Vose & Armitage, 1995にレビュー)。他の戦略は、腫瘍特異的抗原に対する抗体の製造に基づいており(Sinkovics & Horvath, 2000にレビュー)、このような抗原はほとんど同定されておらず、これらのアプローチの適用性を制限する。したがって、癌処置のアプローチの選択性を促進する新たな方法の必要性がある。

最近、腫瘍細胞中で選択的に複製し、それにより殺すことができる複製コンピテントウイルスを開発しかつ使用する試みがなされている(例えば、Galanis et al., 2001参照)。このアプローチにおいて、ウイルスベクターを標的腫瘍細胞内で特異的に複製するために遺伝子操作する。うまく標的とされた腫瘍細胞を次いでウイルス介在細胞融解により殺し、これは、次いで近くの細胞の感染および死亡を導き得る(Galanis et al., 2001)。

このアプローチにより提示される攻撃は、ウイルスを、腫瘍細胞を選択的に標的とさせるおよび／または腫瘍細胞中で複製させる機構の発見である。現在までに、腫瘍細胞の特異的遺伝形質に基づいた選択的複製スキームが試みられている(Galanis et al., 2001およびその中の引用文献参照)。例えば、腫瘍特異的ウイルス複製を達成するアプローチの一つは、組み換え腫瘍細胞崩壊性アデノウイルスベクターｄｌ１５２０またはＯｎｙｘ−０１５を含む。Ｏｎｙｘ−０１５ベクターは、ｐ５３腫瘍サプレッサー遺伝子を失っている細胞で選択的複製を提供する試みにおいて設計されている(Bischoff et al., 1996; Ries & Korn, 2002)。Ｏｎｙｘ−０１５の設計は、十分なアデノウイルス複製が細胞性ｐ５３タンパク質の不活性化を必要とする事実に基づいており、それはアデノウイルスＥ１Ｂタンパク質で達成される。Ｏｎｙｘ−０１５は、Ｅ１Ｂ遺伝子の変異を有し、これはこのｐ５３不活性化能力を破壊する。Ｅ１Ｂ変異はウイルスがｐ５３機能を欠く細胞中で複製することを可能にするが、野生型ｐ５３を有する細胞での複製を防止する。ｐ５３機能が、大腸直腸癌のようなある癌の約７０％を含む、全腫瘍の５０％以上で失われているため(例えば、Beroud & Soussi, 1998; Colman et al., 2000; Hickman et al., 2002参照)、Ｏｎｙｘ−１５は理論的には全腫瘍の半分以上の処置に使用できる。不運なことに、最近の議論は、Ｏｎｙｘ−０１５の選択性に関して展開している(Goodrum & Ornelles, 1998; Rothmann et al., 1998; Dix et al., 2001; Ries & Korn, 2002参照)。いくつかの試験は、Ｏｎｙｘ−０１５が、野生型ｐ５３機能を有する腫瘍細胞でさえ複製できることを示唆する(Goodrum & Ornelles, 1998; Rothmann et al., 1998)。この見かけの差異は、おそらく正常ｐ５３機能を有するほとんどの腫瘍細胞が、ｐ５３経路の他の部分に欠損を有する可能性があるという事実により調和されるが、このベクターの広範囲な使用をそれにもかかわらず制限する。そうであっても、野生型ｐ５３機能を維持する腫瘍細胞において使用するための戦略の必要性は残る。

アデノウイルスベクター複製を腫瘍細胞にターゲティングする他の戦略は、ウイルス複製に必要な遺伝子の発現を制御するための腫瘍−および／または組織−特異的プロモーターの使用を含む(Haviv & Curiel, 2001にレビュー)。典型的な例はＣＮ７０６(Calydon, Inc., Sunnyvale, California, United States of America)であり、その中で前立腺特異的抗原(ＰＳＡ)遺伝子プロモーターがアデノウイルスＥ１Ａ遺伝子の発現を駆動する。HendersonおよびSchuurの米国特許第５,８７１,７２６号参照。他のウイルスＣＶ７８７に対しても特異性が見られ、そこではラット前立腺特異的プロバシンプロモーターがＥ１Ａの発現を駆動し、一方ＰＳＡプロモーターがＥ１Ｂの発現を駆動する(Yu et al., 1999)。この戦略の他の試みは、Ｅ１Ａの発現を制御するためのＭＵＣ１プロモーターの使用を含む(Kurihara et al., 2000)。これらのタイプの戦略の鍵は、プロモーターの特異性である。不運なことに、非常にわずかなプロモーターしか、抗−腫瘍戦略に有用である十分な特異性を示すことが同定されていない。

このように、対象中の腫瘍細胞を特異的に標的とし、殺すための有効な治療の分野の長い間のかつ継続する必要性が存在する。本発明の主題は、この分野のこのおよび他の必要性を扱う。

要約
本発明の主題は、最小プロモーターおよび低酸素反応エレメント(ＨＲＥ)を含む転写制御エレメント(ＴＲＥ)の転写制御下にアデノウイルス遺伝子を含むアデノウイルスベクターである。一つの実施態様において、アデノウイルス遺伝子はＥ１Ａ遺伝子、Ｅ１Ｂ遺伝子、Ｅ２Ａ遺伝子、Ｅ２Ｂ遺伝子およびＥ４遺伝子からなる群から選択される。一つの実施態様において、アデノウイルスベクターは、転写制御エレメント(ＴＲＥ)の転写制御下に第２のアデノウイルス遺伝子を含む。一つの実施態様において、最小プロモーターは、サイトメガロウイルス(ＣＭＶ)最小プロモーター、ヒトβ−アクチン最小プロモーター、ヒトＥＦ２最小プロモーターおよびアデノウイルスＥ１Ｂ最小プロモーターからなる群から選択される。他の実施態様において、ＣＭＶ最小プロモーターは配列番号１を含む。一つの実施態様において、低酸素反応エレメント(ＨＲＥ)はヒト血管内皮細胞増殖因子(ＶＥＧＦ)遺伝子に由来する。他の実施態様において、ＨＲＥは配列番号２の５つのタンデムコピーを含む。一つの実施態様において、アデノウイルスベクターはさらにトランス遺伝子を含む。一つの例において、トランス遺伝子は第２のアデノウイルス遺伝子を含む。他の例において、トランス遺伝子は、免疫刺激分子をコードする核酸を含む。さらに別の例において、トランス遺伝子は自殺遺伝子を含む。

本発明の主題は、また最小プロモーターおよびＨＲＥを含むＴＲＥの転写制御下にアデノウイルス遺伝子を含む組成物も提供する。一つの例において、組成物はさらに薬学的に許容される担体を含む。

本発明の主題は腫瘍増殖の抑制法も提供し、該方法は腫瘍中の低酸素細胞とアデノウイルスベクターを接触させ、それによりベクターが細胞内に入り、腫瘍増殖を阻害することを含む。一つの実施態様において、接触はベクターの腫瘍内投与によりもたらされる。他の実施態様において、接触はベクターの静脈内投与によりもたらされる。

本発明の主題は、また最小プロモーターおよびＨＲＥを含むＴＲＥの転写制御下にアデノウイルス遺伝子を含む宿主細胞も提供する。

本発明の主題は、また低酸素細胞に特異的なアデノウイルスを増殖させる方法を提供し、該方法は、低酸素細胞とアデノウイルスベクターを接触させ、それによりアデノウイルスを少なくとも１０^４ウイルス粒子／細胞の力価まで増殖させることを含む。

本発明の主題は、標的細胞に選択的細胞毒性を与える方法も提供し、該方法は、ＨＲＥが機能できる細胞とＨＲＥを含むアデノウイルスを接触させ、それによりアデノウイルスベクターが細胞内に入ることを含む。

本発明の主題は、腫瘍増殖を阻害する方法を提供し、該方法は、(ａ)腫瘍中の低酸素細胞と第１のアデノウイルスベクターを接触させ、それにより第１のアデノウイルスベクターが細胞内に入り；そして(ｂ)低酸素細胞と複製欠損アデノウイルスベクターを接触させ、それにより複製欠損アデノウイルスベクターが細胞内に入ることを含む。一つの実施態様において、第１のアデノウイルスベクターはＨＲＥを含むＴＲＥの転写制御下にアデノウイルス遺伝子を含む。他の実施態様において、複製欠損アデノウイルスベクターは構造性プロモーターの転写制御下に第２の遺伝子を含む。他の実施態様において、複製欠損ベクターはＨＲＥを含むＴＲＥの転写制御下に第２の遺伝子を含む。一つの例において、第２の遺伝子はアデノウイルス遺伝子、例えば、初期遺伝子である。他の例において、第２の遺伝子はＴＮＦ−α、Ｔｒａｉｌ、Ｂａｘ、ＨＳＶ−ｔｋ、シトシンデアミナーゼ、ｐ４５０、ジフテリア毒素、可溶性ＦＬＴ１遺伝子および細胞外ＦＬＫ−１遺伝子を含むが、これらに限定されない自殺遺伝子である。さらに別の例において、第２の遺伝子は、ＩＬ２およびＩＬ１２を含むが、これらに限定されない免疫刺激分子である。

したがって、本発明の主題は、低酸素誘引因子１(ＨＩＦ−１)を発現する標的組織中でアデノウイルスベクターの制限増殖を用いる治療法を提供するのが目的である。このおよび他の目的は、本発明の主題により全部または一部達成される。

上記の本発明の主題の目的、本発明の主題の他の目的および利点は、本発明の主題の以下の記載および非限定的実施例の熟読後に当業者には明白となろう。

詳細な記載
本発明の主題は、一般に制限増殖コンピテントアデノウイルスベクターを、転写因子低酸素誘引因子１(ＨＩＦ−１)を発現する細胞内で増殖させる方法に関する。一つの実施態様において、方法は、低酸素細胞、例えば腫瘍中の低酸素細胞を、低酸素細胞中で複製するアデノウイルスベクターのような制限増殖コンピテントアデノウイルスベクターで感染させ、細胞を殺すことを含む。

Ｉ. 一般的考察
正常組織酸素張力より低い状態である低酸素は、近年、癌を含むヒト疾患と関連している。それは、腫瘍増殖および発育に主に関連する。特に、低酸素は変異の促進および悪性腫瘍細胞の選択に重要な役割を担うことが判明した。それはまた腫瘍血管形成の促進に関与する。

低酸素への細胞性反応は、主に転写因子低酸素誘引因子１(ＨＩＦ−１)により介在される。低酸素条件下で、ＨＩＦ−１は、ある低酸素反応性遺伝子のプロモーター中に存在する低酸素反応エレメント(ＨＲＥ)と呼ばれる配列と結合する。ＨＩＦ−１のＨＲＥ−含有プロモーターへの結合は、関連遺伝子の転写の上方制御をもたらす。

ＨＩＦ−１の活性形は、制御成分(ＨＩＦ−１α)および構造性に発現するアリール炭化水素レセプター核運搬体(ＡＲＮＴ、ＨＩＦ−１βとも呼ばれる)から成るヘテロダイマーである。ＨＩＦ−１−介在転写の制御は、細胞の酸素状態に依存するＨＩＦ−１αの翻訳後修飾を介して起こる。常酸素(normoxic)条件下で、ＨＩＦ−１αは、分子酸素を酸素ドナーとして使用して、酵素プロリルヒドロキシラーゼによりヒドロキシル化される。このヒドロキシル化は、通常細胞内に存在するフォン・ヒッペル・リンドウタンパク質(ｐＶＨＬ)をＨＩＦ−１αと結合させ、ｐＶＨＬ／ＨＩＦ−１α複合体を形成させる。ｐＶＨＬ／ＨＩＦ−１α複合体はプロテアソーム中でユビキチン化および分解に付される。低酸素条件下で、他方、プロリルヒドロキシラーゼ活性は、酸素ドナーの相対的不足のためにかなり低い。これらの条件下で、ＨＩＦ−１αはヒドロキシル化されず、ＶＨＬ／ＨＩＦ−１α複合体が形成されず、細胞内のＨＩＦ−１αの安定定常レベルが増加する。ＨＩＦ−１αは、このように、ＨＩＦ−１βと複合体化して活性ＨＩＦ−１を形成するのに利用可能であり、それはＨＲＥ−含有プロモーターでのこれらの遺伝子の転写をもたらす。

ＨＩＦ−１結合は、転写因子、増殖因子およびサイトカインを含むいくつかの遺伝子、ならびに酸素輸送および鉄代謝、グリコール分解およびグルコース取り込みおよびストレス反応に関与する遺伝子の発現を増加させる。加えて、低酸素は血管形成に関連する細胞増殖および移動を制御する。その生成物が血管形成の重要な制御因子である血管内皮細胞増殖因子(ＶＥＧＦ)遺伝子は、そのプロモーター内にＨＲＥを含む。ＨＩＦ−１はＶＥＧＦおよびＦＬＴ−１、ＶＥＧＦレセプターを上方制御する。固形腫瘍を形成する細胞の速い増殖速度のために、酸素を含む適切な栄養を急速に増殖している腫瘍細胞に提供するための新しい血管は常に必要である。これらの新しく形成された血管は、頻繁に、個々の細胞が十分に酸素化されていない腫瘍の領域に非常に共通して見られるように、異常性により特徴付けられる。実際、データは、事実上１mm^３より大きい全腫瘍に低酸素の局在領域があることを示唆する(Dachs & Tozer, 2000)。

II. 定義
以下の用語は当業者には十分理解されていると考えるが、以下の定義を本発明の主題の説明を容易にするために示す。

II.Ａ. 核酸
本発明の主題にしたがって用いる核酸分子は、配列番号１および２の任意の一つ；配列番号１および２の任意の一つの配列と実質的に同一な配列；その保存的変異体、その部分配列および伸長した配列、相補的ＤＮＡ分子、および対応するＲＮＡ分子の単離核酸分子の任意の一つを含むが、これらに限定されない。本発明の主題は、また記載の核酸配列を含む遺伝子、ｃＤＮＡ、キメラ遺伝子およびベクターも包含する。

“核酸分子”なる用語は、一本鎖または二本鎖形のいずれかのデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドおよびそれらのポリマーを意味する。特に限定しない限り、本用語は、参照の天然核酸と類似の特性を有する天然ヌクレオチドの既知のアナログを含む核酸を包含する。特に指示がない限り、またその保存的に修飾された変異体(例えば、縮重コドン置換)、相補的配列、部分配列、伸長した配列、ならびに明確に示した、特定のヌクレオチド配列が必然的に含まれる。“核酸分子”または“ヌクレオチド配列”なる用語は、“遺伝子”、“ｃＤＮＡ”または“ｍＲＮＡ”の代わりにまた使用できる。核酸は、任意の生物を含む、任意の源由来であり得る。

核酸分子との関連で使用される限り、“単離”なる用語は、核酸分子がその天然環境から離れて存在し、天然の生成物ではないことを示唆する。単離ＤＮＡ分子は精製形で存在でき、または、トランスジェニック宿主細胞のような非天然環境に存在できる。

二つまたはそれ以上のヌクレオチド配列に関連して、“実質的に同一”なる用語は、比較し、最大一致に対して整列させた場合、以下の配列比較アルゴリズムの一つを使用して(本明細書中に“ヌクレオチドおよびアミノ酸配列比較”の表題の下に記載している)、または、目視検査により測定して、一つの例において少なくとも６０％、他の例において約７０％、他の例において約８０％、他の例において約９０−９５％、およびさらに別の例において約９９％ヌクレオチド同一性を有する配列または部分配列を意味する。一つの例において、実質的同一性は、少なくとも５０残基のヌクレオチド配列に、他の例において少なくとも約１００残基のヌクレオチド配列に、他の例において少なくとも約１５０残基のヌクレオチド配列に、およびさらに別の例において完全コード配列を含むヌクレオチド配列において存在する。一つの態様において、多型性配列は実質的に同一配列であり得る。“多型性”なる用語は、集団中の２個またはそれ以上の遺伝子的に決定された代替配列または対立遺伝子の発生を意味する。対立遺伝子的差異は、１塩基対ほど小さいものであり得る。

二つのヌクレオチド配列が実質的に同一であるという他の指示は、互いにストリンジェントな条件下で特異的にまたは実質的にハイブリダイズできる分子であることである。核酸ハイブリダイゼーションと関連して、比較する二つの核酸配列を“プローブ”および“標的”と名付け得る。“プローブ”は参照核酸分子であり、“標的”は、試験核酸分子であり、しばしば核酸分子の異種集団にみられる。“標的配列”は、“試験配列”と同義語である。

ハイブリダイゼーション試験またはアッセイに用いる例示的ヌクレオチド配列は、一つの態様において、本発明の主題の核酸分子の少なくとも約１４から４０ヌクレオチド配列と相補的なまたは模倣するプローブ配列を含む。一つの例において、プローブは１４から２０ヌクレオチドを含み、または、望ましい場合、３０、４０、５０、６０、１００、２００、３００または５００ヌクレオチドまたは配列番号１および２として記載の任意のものの完全長までのように、より長い。このようなフラグメントは、例えば、直接フラグメント合成により、化学合成により、核酸増幅技術の適用により、または組み換え生成のための選択配列の組み換えベクターへの挿入により容易に製造できる。“への特異的なハイブリダイゼーション”なるフレーズは、配列が複合核酸混合物(例えば、総細胞ＤＮＡまたはＲＮＡ)に存在する場合、ストリンジェントな条件下で、分子の特定のヌクレオチド配列とのみ結合し、デュプリケートしまたはハイブリダイズすることを意味する。

“との実質的なハイブリダイゼーション”なるフレーズは、プローブ核酸分子と標的核酸分子の間の相補的ハイブリダイゼーションを意味し、所望のハイブリダイゼーションを達成するためにハイブリダイゼーション媒体のストリンジェンシーを減少することにより融通できるヌクレオチド配列マイナーミスマッチを包含する。

サザンおよびノーザンブロット分析のような核酸ハイブリダイゼーション実験と関連した、“ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件”および“ストリンジェントなハイブリダイゼーション洗浄条件”は、両方とも配列−および環境−依存性である。より長い配列は、特に高温でハイブリダイズする。核酸のハイブリダイゼーションの広範囲のガイドは、Tijssen, 1993に見られる。一般に、より高いストリンジェントなハイブリダイゼーションおよび洗浄条件は、定義のイオン強度およびｐＨで特異的配列に関して約５℃または熱融解点(Ｔ_ｍ)より低く選択しなければならない。典型的に、“ストリンジェントな条件”下で、プローブは特にその標的配列にだけでなく、他の配列にもハイブリダイズする。

Ｔ_ｍは、(定義のイオン強度およびｐＨ下で)５０％の標的配列が完全にマッチしたプローブとハイブリダイズする温度である。非常にストリンジェントな条件は、特定のプローブに関して、Ｔ_ｍと同様に選択される。約１００以上の相補的残基を有する相補的核酸のサザンまたはノーザンブロット分析のためのストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の例は、５０％ホルムアミドと１mgのヘパリン中の、４２℃で一晩のハイブリダイゼーションである。非常にストリンジェントな洗浄条件の例は、１５分、０.１×ＳＳＣ、ＳＭ ＮａＣｌ中、６５℃である。ストリンジェントな洗浄条件の例は、１５分、０.２×ＳＳＣ緩衝液中、６５℃である(ＳＳＣ緩衝液の記載に関して、SambrookおよびRussell, 2001参照)。しばしば、高ストリンジェンシー洗浄を、背景プローブシグナルを除去するために低ストリンジェンシー洗浄の前に行う。約１００ヌクレオチド以上の二本鎖の中ストリンジェンシー洗浄の例は、１５分、１×ＳＳＣ中、４５℃である。約１００ヌクレオチド以上の二本鎖の低ストリンジェンシー洗浄の例は、１５分、４−６×ＳＳＣ中、４０℃である。短プローブ(例えば、約１０から５０ヌクレオチド)に関して、ストリンジェントな条件は、典型的に約１Ｍ Ｎａ^＋イオンより低い塩濃度、典型的にｐＨ ７.０−８.３で、約０.０１から１Ｍ Ｎａ^＋イオン濃度(または他の塩)であり、温度は典型的に少なくとも約３０℃である。ストリンジェントな条件はまたホルムアミドのような脱安定化剤の添加により達成できる。一般に、特定のハイブリダイゼーションアッセイにおいて非関連プローブで観察される２倍(またはそれより高い)のシグナル対ノイズ比が、特異的ハイブリダイゼーションの検出を示唆する。

以下は、本発明の主題の参照ヌクレオチド配列と実質的に同一な相同ヌクレオチド配列をクローンするために使用できる、ハイブリダイゼーションおよび洗浄条件の例である：プローブヌクレオチド配列を一例では標的ヌクレオチド配列と、７％ドデシル硫酸ナトリウム(ＳＤＳ)、０.５Ｍ ＮａＰＯ_４、１mm ＥＤＴＡ中、５０℃でハイブリダイズし、続いて２×ＳＳＣ、０.１％ＳＤＳで５０℃で洗浄する；他の例において、プローブおよび標的配列を７％ドデシル硫酸ナトリウム(ＳＤＳ)、０.５Ｍ ＮａＰＯ_４、１mm ＥＤＴＡ中、５０℃でハイブリダイズし、続いて１×ＳＳＣ、０.１％ＳＤＳで５０℃で洗浄する；他の例において、プローブおよび標的配列を７％ドデシル硫酸ナトリウム(ＳＤＳ)、０.５Ｍ ＮａＰＯ_４、１mm ＥＤＴＡ中、５０℃でハイブリダイズし、続いて０.５×ＳＳＣ、０.１％ＳＤＳで５０℃で洗浄する；他の例において、プローブおよび標的配列を７％ドデシル硫酸ナトリウム(ＳＤＳ)、０.５Ｍ ＮａＰＯ_４、１mm ＥＤＴＡ中、５０℃でハイブリダイズし、続いて０.１×ＳＳＣ、０.１％ＳＤＳで５０℃で洗浄する；さらに別の例において、プローブおよび標的配列を７％ドデシル硫酸ナトリウム(ＳＤＳ)、０.５Ｍ ＮａＰＯ_４、１mm ＥＤＴＡ中、５０℃でハイブリダイズし、続いて０.１×ＳＳＣ、０.１％ＳＤＳで６５℃で洗浄する。

二つの核酸配列が実質的に同一であるというさらなる指示は、核酸によりコードされるタンパク質が実質的に同一であり、全体的三次元構造を共有し、生物学的に機能等価であるか、または、免疫学的交差反応性であることである。これらの用語は、さらに、以下の“ポリペプチド”の表題下に定義する。ストリンジェントな条件下で互いにハイブリダイズしない核酸分子は、対応するタンパク質が実質的に同一であれば、まだ実質的に同一である。これは、例えば、二つのヌクレオチド配列が、遺伝コードにより許可されるように著しく縮重した場合、起こり得る。

“保存的に置換された変異体”は、１個またはそれ以上の選択した(またはすべての)コドンの３位が混合塩基および／またはデオキシイノシン残基で置換されている、縮重コドン置換を有する核酸配列を意味する(Ohtsuka et al., 1985; Batzer et al., 1991; Rossolini et al., 1994)。

“部分配列”なる用語は、より長い核酸配列の一部を含む核酸の配列を意味する。部分配列の例は、上記のプローブまたはプライマーである。本明細書で使用する“プライマー”なる用語は、一つの例では、選択した核酸分子の約８個またはそれ以上のデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチド、他の例において１０−２０ヌクレオチド、およびさらに別の例において２０−３０ヌクレオチドを含む、隣接する配列を意味する。本発明の主題のプライマーは、本発明の主題の核酸分子の重合化の開始を提供するために、十分な長さと適当な配列のオリゴヌクレオチドを包含する。

“伸長した配列”は、核酸に組み込まれる、ヌクレオチド(または他の類似分子)の付加を意味する。例えば、ポリメラーゼ(例えば、ＤＮＡポリメラーゼ)は、核酸分子の３'末端に配列を付加できる。加えて、ヌクレオチド配列を、プロモーター、プロモーター領域、エンハンサー、ポリアデニル化シグナル、イントロン(intronic)配列、付加的制限酵素部位、多重クローニング部位および他のコードセグメントのような他のＤＮＡ配列と組み合わせることができる。

本明細書で使用する“相補的配列”なる配列は、塩基対間の水素結合の形成により互いに対合ができる逆平行ヌクレオチド配列を含む、二つのヌクレオチド配列を意味する。本明細書で使用する“相補的配列”なる用語は、上記と同一のヌクレオチド対比により評価できるような、実質的に相補的であるか、本明細書に記載のような相対的にストリンジェントな条件で問題の核酸セグメントとハイブリダイズできると定義されるヌクレオチド配列を意味する。相補的核酸セグメントの具体例は、アンチセンスオリゴヌクレオチドである。

“遺伝子”なる用語は、広く、生物学的機能と関連するＤＮＡのセグメントである。遺伝子は、配列は、コード配列、プロモーター領域、転写制御配列、調節タンパク質の特異的認識配列である非発現ＤＮＡセグメント、遺伝子発現に寄与する非発現ＤＮＡセグメント、所望のパラメーターを有するように設計されたＤＮＡセグメントまたはこれらの組み合わせを含むが、これらに限定されない。遺伝子は、生物学的サンプルからのクローニング、既知のまたは予測される配列情報に基づく合成および既存配列の組み換え誘導体化を含む、種々の方法により得ることができる。

“遺伝子発現”なる用語は、一般に生物学的に活性なポリペプチドがＤＮＡ配列から生成される、細胞過程を意味する。

本発明の主題はまたキメラ遺伝子を用いることができる。本明細書で使用する“キメラ遺伝子”なる用語は、治療ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；アンチセンスＲＮＡ分子を産生するヌクレオチド配列；ヘアピン構造のような三次元構造を有するＲＮＡ分子；または二本鎖ＲＮＡ分子に機能し得るように連結したプロモーター領域を意味する。

本明細書で使用する“機能し得るように連結した”および“稼働し得るように連結した”なる用語は、ヌクレオチド配列の転写がプロモーター領域により調節および制御されるようにヌクレオチド配列と結合したプロモーター領域を意味する。同様に、ヌクレオチド配列は、稼働し得るように連結したプロモーターの“転写制御”下にあると言うべきである。プロモーター領域をヌクレオチド配列に機能し得るように連結する技術は、当分野で既知である。

本明細書で使用する“異種遺伝子”、“異種ＤＮＡ配列”、“異種ヌクレオチド配列”、“外来性核酸分子”または“外来性ＤＮＡセグメント”なる用語は、意図する宿主細胞と無関係の源に由来するか、または、同じ源である場合、その元の形から修飾されている配列を各々意味する。このように、宿主細胞中の異種遺伝子は、特定の宿主細胞にとって内在性であるが、例えば、変異生成によりまたは天然転写制御配列からの単離により修飾されている遺伝子を含む。この用語はまた天然に存在するヌクレオチド配列の天然に存在しない多重コピーの発生も含む。このように、この用語は細胞にとって外来または異種であるか、または細胞と同族であるが、宿主細胞核酸内の位置がそのエレメントが通常見られない場所にあるＤＮＡセグメントを含む。

本明細書で使用する“構築物”なる用語は、適当な宿主細胞中の特定のＤＮＡ配列ヌクレオチド配列の発現を指示でき、停止シグナルに機能し得るように連結した目的のヌクレオチド配列と機能し得るように連結したプロモーターを含む、ＤＮＡ配列を意味する。また典型的にヌクレオチド配列の正確な翻訳に必要な配列を含む。目的のヌクレオチド配列を含む構築物はキメラであり得る。構築物はまた天然に存在するが、異種発現に有用な組み換え形で得られているものを含み得る。

“プロモーター”または“プロモーター領域”なる用語は、各々、同じ遺伝子のコード配列の５'であり、コード配列の翻訳を指示する働きをする遺伝子のヌクレオチド配列を意味する。プロモーター領域は、転写開始部位を含み、さらに、１個またはそれ以上の転写制御エレメントを含み得る。一つの実施態様において、本発明の主題の方法は、低酸素誘導プロモーターを用いる。

“最小プロモーター”は、基底レベルの転写が起こるのを可能にするのに必要な最小エレメントを有するヌクレオチド配列を意味する。このように、最小プロモーターは完全プロモーターではなく、むしろ実験系中のレポーター構築物の基底レベルの転写を指示できるプロモーターの部分配列である。最小プロモーターは、ＣＭＶ最小プロモーター、ＨＳＶ−ｔｋ最小プロモーター、シミアン・ウイルス４０(ＳＶ４０)最小プロモーター、ヒトｂ−アクチン最小プロモーター、ヒトＥＦ２最小プロモーター、アデノウイルスＥ１Ｂ最小プロモーターおよび熱ショックタンパク質(ｈｓｐ)７０最小プロモーターを含むが、これらに限定されない。最小プロモーターは、しばしば１個またはそれ以上の転写制御エレメントで拡張されており、稼働し得るように連結した遺伝子の転写に影響を及ぼす。例えば、細胞型特異的または組織特異的転写制御エレメントを最小プロモーターに付加し、細胞型特異的または組織特異的方法で、稼働し得るように連結したヌクレオチド配列の転写を指示する組み換えプロモーターを創造できる。本発明の主題の一つの実施態様において、低酸素誘導プロモーターは、ヒトＶＥＧＦプロモーター由来のＨＲＥの５つのタンデムコピーに連結したＣＭＶ最小プロモーターを含む。

異なるプロモーターは、異なる転写制御エレメントの組み合わせを有する。遺伝子が発現するかしないかは、遺伝子のプロモーターと、細胞の核内に存在する異なる転写因子を作る特定の転写制御エレメントの組み合わせに依存する。このように、プロモーターはしばしばインビボまたはインビトロでの機能的活動に依存して、“構造性”、“組織特異的”、“細胞型特異的”または“誘導”に分類される。例えば、構造性プロモーターは、種々の細胞型の遺伝子の転写を指示できるものである。例示的構造性プロモーターは、ある構造性または“ハウスキーピング”機能をコードする以下の遺伝子のプロモーターを含む：ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ(ＨＰＲＴ)、ジヒドロフォレートレダクターゼ(ＤＨＦＲ；(Scharfmann et al., 1991))、アデノシンデアミナーゼ、ホスホグリセラートキナーゼ(ＰＧＫ)、ピルベートキナーゼ、ホスホグリセラートムターゼ、β−アクチンプロモーター(例えば、Williams et al., 1993参照)および他の当業者に既知の構造性プロモーター。“組織特異的”または“細胞型特異的”プロモーターは、他方、ある組織および細胞型で転写を指示するが、他では不活性である。例示的組織特異的プロモーターは、上記のようなＰＳＡプロモーター(Yu et al., 1999; Lee et al., 2000)、プロバシンプロモーター(Greenberg et al., 1994; Yu et al., 1999)およびＭＵＣ１プロモーター(Kurihara et al., 2000)ならびに当業者に既知の組織特異的および細胞型特異的プロモーターを含む。

“誘導”プロモーターは、稼働し得るように連結した遺伝子の転写レベルが、ある刺激の存在に基づいて変化するものである。誘導プロモーターの制御下の遺伝子は、誘導動因の存在下でのみ、またはより大きな程度まで発現する(例えば、メタロチオネインプロモーターの制御下の転写は、ある金属イオンの存在下で非常に増加する)。誘導プロモーターは、誘導因子が結合した場合、転写が刺激される転写制御エレメント(ＴＲＥ)を含む。例えば、血清因子、ステロイドホルモン、レチノイン酸およびサイクリックＡＭＰのＴＲＥがある。特定のＴＲＥを含有するプロモーターは、誘導反応を得るために選択でき、ある場合、ＴＲＥそれ自体異なるプロモーターに結合し、それにより組み換え遺伝子に誘導能を与える。本発明の主題の一つの実施態様において、アデノウイルスベクターは、アデノウイルス遺伝子にＨＩＦ−１−介在誘導能を与える低酸素誘導プロモーターを含む。

本明細書で使用する“低酸素誘導プロモーター”なる用語は、ＨＩＦ−１の活性型が存在する場合、基底レベル以上に促進すべきである稼働し得るように連結したヌクレオチド配列と結合し、転写をもたらすような低酸素反応エレメントを含むプロモーターを意味する。このように、低酸素誘導プロモーターは、常酸素条件下で、稼働し得るように連結したヌクレオチド配列を活性ＨＩＦ−１の欠損のために基底レベルでまたはそれ以下で転写するものである。

加えて、本明細書で本発明の主題に関して使用する、細胞中の活性ＨＩＦ−１の存在は、細胞が低酸素を経験している状態だけでなく、ＨＩＦ−１の活性形が蓄積され、ＨＲＥとの結合に利用可能である任意の他の状態を含む。このような他の状態は、ＨＩＦ−１αおよびｐＶＨＬの相互作用が起こらない、したがってＨＩＦ−１αのユビキチン化および分解が起こらない状態を含む。例えば、活性ＨＩＦ−１は、ＨＩＦ−１αのヒドロキシル化が起きないように、プロリルヒドロキシラーゼポリペプチド(例えば変異)の活性が修飾された結果、形成できる。あるいは、ｐＶＨＬを欠く細胞において、活性ＨＩＦ−１が蓄積する(例えば、Clifford & Maher, 2001参照)。“常酸素条件”または“常酸素状態”は、上記のようにＨＩＦ−１αポリペプチドがプロリルヒドロキシラーゼによりヒドロキシル化され、したがって、細胞がＨＩＦ−１の活性形を蓄積しない、正常酸素飽和の状態を意味する。

プロモーターと関連して使用されている場合、本明細書で使用する“連結した”なる用語は、稼働し得るように連結したヌクレオチド配列の転写を指示するために一緒に機能するような、プロモーターエレメントの物理的近接を意味する。本発明の主題の一つの実施態様において、最小プロモーターはＨＲＥと連結し、活性ＨＩＦ−１転写因子を含有する細胞中のアデノウイルス遺伝子の低酸素誘導転写をもたらす。

本明細書で使用する“転写制御配列”または“転写制御エレメント”は、転写調節性転写因子への反応を可能にするプロモーター領域内のヌクレオチド配列を各々意味する。反応は、転写アウトプットの減少または増加を含み、転写因子の転写制御エレメントを含むＤＮＡ分子への結合により介在される。一つの例において、転写制御エレメントはＨＲＥである。

“転写因子”なる用語は、一般に転写制御エレメントと転写の細胞成分の相互作用により遺伝子発現を調節するタンパク質を意味し、ＲＮＡポリメラーゼ、転写関連因子(ＴＡＦ)、クロマチンリモデリングタンパク質および、遺伝子転写に影響する他の関連タンパク質を含む。

“レポーター遺伝子”または“マーカー遺伝子”または“選択可能なマーカー”なる用語は、各々、容易に観察されおよび／または定量される生成物をコードする異種遺伝子を意味する。レポーター遺伝子は、意図する宿主細胞と無関係の源に由来するか、または、同じ源由来である場合、その元の形から修飾されている点で異種である。転写制御領域に機能し得るように連結できる検出可能なレポーター遺伝子は、Alam & Cook(1990)Anal Biochem 188:245-254およびＰＣＴ国際公開第ＷＯ９７／４７７６３号に見ることができる。転写分析のための例示的レポーター遺伝子は、ｌａｃＺ遺伝子(例えば、Rose & Botstein(1983)Meth Enzymol 101:167-180参照)、緑色蛍光タンパク質(ＧＦＰ；Cubitt et al., 1995)、ルシフェラーゼおよびクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ(ＣＡＴ)を含む。トランスジェニック動物産生のためのレポーター遺伝子は、抗生物質耐性遺伝子、例えばネオマイシン耐性を与える抗生物質耐性遺伝子を含むが、これらに限定されない。任意の適当なレポーターおよび検出法が使用でき、特定の選択が本発明の主題に必須でなく、それを限定しないことは当業者には明白である。

レポーター遺伝子の量は、レポーター遺伝子生成物の存在または活性を定質的にまたは定量的に測定するための任意の方法である。各試験プロモーター領域フラグメントにより指示されるレポーター遺伝子発現の量は、プロモーター領域フラグメントの非存在下にレポーター遺伝子発現を含む構築物を制御するために発現されるレポーター遺伝子の量と比例する。プロモーター領域フラグメントは、コントロール構築物と比較して、試験構築物中のレポーター遺伝子の量が著しく増加している場合、プロモーター活性を有すると同定される。本明細書で使用する“著しい増加”なる用語は、測定技術に固有の誤差の範囲より大きい測定可能な量の定量的変化を意味し、一つの例において、コントロール測定に対して約２倍またはそれ以上の増加、他の例において約５倍またはそれ以上の増加、およびさらに別の例において約１０倍またはそれ以上の増加である。

本発明の主題は、さらに記載のヌクレオチド配列を含むアデノウイルスベクターを含む。本明細書で使用する“ベクター”なる用語は、配列を含み、この配列を適合性の宿主細胞に運ぶことができるＤＮＡ分子を意味する。ベクターはまた、ベクター内のヌクレオチド配列とのライゲーションを可能にするためのヌクレオチド配列を含み、このようなヌクレオチド配列はまた適合性の宿主細胞中で複製する。ベクターはまたさらに下記のような治療ポリペプチドの組み換え産生を介在できる。

本発明の主題の核酸は、クローン化でき、合成でき、組み換え技術で改変でき、変異を起こさせることができ、またはこれらの組み合わせを行うことができる。核酸の単離に使用する標準組み換えＤＮＡおよび分子クローニング技術は当分野で既知である。例示的、非限定的方法はSilhavy et al., 1984; Ausubel et al., 1992; Glover & Hames, 1995; and Sambrook & Russell, 200)に記載されている。塩基対変化、欠損または小挿入を創造するための部位特異的変異生成は当分野で既知であり、刊行物に例示されている(例えば、Adelman et al., 1983; Sambrook & Russell, 2001参照)。

II.Ｂ. ポリペプチド
本発明の主題と関連して使用するポリペプチドは、下記に定義のような治療ポリペプチド；下記に定義の治療ポリペプチドと実質的に同一のポリペプチド；下記に定義の治療ポリペプチドのポリペプチドフラグメント(一つの実施態様において生物学的に機能的なフラグメント)、下記に定義の治療ポリペプチドを含む融合タンパク質、その生物学的に機能性のアナログならびに、抗体、特に下記に定義の治療ポリペプチドを認識する抗体と交差反応するポリペプチドを含むが、これらに限定されない。本発明の主題と関連して使用するポリペプチドは、単離ポリペプチド、ポリペプチドフラグメント、記載のアミノ酸配列を含む融合タンパク質、生物学的に機能性のアナログ、および、抗体、特に記載のポリペプチドを認識する抗体と交差反応性のポリペプチドを含むが、これらに限定されない。

“単離”なる用語は、ポリペプチドと関連して使用される限り、ポリペプチドがその天然の環境から離れて存在し、天然の産物ではないことを意味する。単離ポリペプチドは精製形で存在できるか、または、例えば、トランスジェニック宿主細胞中のような非天然環境で存在できる。

２個またはそれ以上のポリペプチド配列に関連した“実質的に同一”なる用語は、ポリペプチド配列が、一つの例では約３５％、または４５％、他の例において４５−５５％、そして他の例において５５−６５％の同一または機能的に等価なアミノ酸を有すると測定される。他の例において、２個またはそれ以上の“実質的に同一”なポリペプチド配列は約７０％、または他の例において約８０％、他の例において約９０％、他の例において約９５％、およびさらに別の例において約９９％同一または機能的に等価なアミノ酸配列を有する。“同一性”のパーセントおよび同一性を測定する方法は、“ヌクレオチドおよびアミノ酸配列比較”の表題下に以下に定義する。

実質的に同一なポリペプチドはまた保存的三次元構造を共有する２個またはそれ以上のポリペプチドも包含する。コンピューターを用いた方法を、構造的表現の比較に使用でき、構造モデルを製造でき、重要な活性部位またはリガンド結合部位の周りの類似性を同定するために合わせることができる(Barton, 1998; Saqi et al., 1999; Henikoff et al., 2000; Huang et al., 2000参照)。

アミノ酸配列に関連した“機能的に等価”なる用語は当業者に既知であり、アミノ酸側鎖置換基の相対的類似性に基づく(Henikoff & Henikoff, 2000参照)。考慮する関連因子は、疎水性、親水性、電荷およびサイズを含む。例えば、アルギニン、リジンおよびヒスチジンはすべて正に電荷された残基である；アラニン、グリシンおよびセリンはすべて類似のサイズである；そしてフェニルアラニン、トリプトファンおよびチロシンはすべて一般に類似の形を有する。この分析により、さらに下に記載するが、アルギニン、リジンとヒスチジン；アラニン、グリシンとセリン；そしてフェニルアラニン、トリプトファンとチロシン；は、本明細書で生物学的に機能等価と定義する。

生物学的に機能等価なアミノ酸置換を作るために、アミノ酸のハイドロパシー指標(hydropathic index)が考慮できる。各アミノ酸は、疎水性および電荷特性に基づいたハイドロパシー指標を割り当てられ、それは：イソロイシン(＋４.５)；バリン(＋４.２)；ロイシン(＋３.８)；フェニルアラニン(＋２.８)；システイン(＋２.５)；メチオニン(＋１.９)；アラニン(＋１.８)；グリシン(−０.４)；スレオニン(−０.７)；セリン(−０.８)；トリプトファン(−０.９)；チロシン(−１.３)；プロリン(−１.６)；ヒスチジン(−３.２)；グルタミン酸(−３.５)；グルタミン(−３.５)；アスパラギン酸(−３.５)；アスパラギン(−３.５)；リジン(−３.９)；およびアルギニン(−４.５)である。

タンパク質に相互に作用する生物学的機能を与えるためのアミノ酸ハイドロパシー指標の重要性は、一般に当業者に理解されている(Kyte & Doolittle, 1982)。あるアミノ酸を類似のハイドロパシー指標またはスコアを有する他のアミノ酸に置換でき、類似の生物学的活性をまだ保持することは知られている。ハイドロパシー指標に基づいた変化を成すために、アミノ酸の置換は、一つの例においては元の値の±２以内の、他の例においては元の値の±１以内の、およびさらに別の例においては元の値の±０.５以内のハイドロパシー指標のものを含む。

同様のアミノ酸の置換は、親水性を基にして有効にできることも当分野で理解されている。米国特許第４,５５４,１０１号は、タンパク質の最大局所平均親水性が、その隣接アミノ酸の親水性に左右されて、その免疫原性および抗原性と、例えば、タンパク質の生物学的特性と関連することを記載している。アミノ酸は、類似の親水性を有するアミノ酸で置換でき、また生物学的に等価なタンパク質が得られることは理解されている。

米国特許第４,５５４,１０１号に詳述されているように、以下の親水性値がアミノ酸残基に割り当てられている：アルギニン(＋３.０)；リジン(＋３.０)；アスパラギン酸(＋３.０±１)；グルタミン酸(＋３.０±１)；セリン(＋０.３)；アスパラギン(＋０.２)；グルタミン(＋０.２)；グリシン(０)；スレオニン(−０.４)；プロリン(−０.５±１)；アラニン(−０.５)；ヒスチジン(−０.５)；システイン(−１.０)；メチオニン(−１.３)；バリン(−１.５)；ロイシン(−１.８)；イソロイシン(−１.８)；チロシン(−２.３)；フェニルアラニン(−２.５)；トリプトファン(−３.４)。

類似の親水性値に基づいた変化を成すために、アミノ酸の置換は、例えば、一つの例においては元の値の±２以内、他の例においては元の値の±１以内、およびさらに別の例においては元の値の±０.５の親水性値のものである。

本発明の主題の方法は、また、インターロイキンポリペプチドのようなポリペプチドフラグメントまたはポリペプチドの機能部分も用いることができる。このような機能部分は、天然の遺伝子産物のアミノ酸配列のすべてまたは実質的にすべてを含む必要はない。“機能”なる用語は、ポリペプチドの任意の生物学的活性または性質を含む。インターロイキンポリペプチドの例では、生物学的活性は、例えば本明細書に記載のような免疫刺激性またはインビボ抗抗原活性である。

本発明の主題はまた治療ポリペプチドのより長い配列を含む。例えば、１個またはそれ以上のアミノ酸をポリペプチドのＮ−末端またはＣ−末端に付加できる。治療ポリペプチド配列(例えば、インターロイキンポリペプチド配列)を含む融合タンパク質は、また本発明の主題の範囲内で提供される。このようなタンパク質を調製する方法は、当分野で既知である。一つの例において、融合タンパク質は、治療ポリペプチドの任意の生物学的活性を含む。インターロイキンポリペプチドの例では、生物学的活性は、一つの実施態様においては、天然インターロイキンの任意の生物学的活性、例えば、本明細書に記載のような免疫刺激性またはインビボ抗脈管形成活性である。所望により、融合タンパク質は、融合した異種配列により提供される生物学的活性を有し得る。

本発明の主題は、治療ポリペプチドの機能アナログも包含する。機能アナログは少なくとも一つの生物学的機能を治療ポリペプチド(例えば、インターロイキンポリペプチド)と共有する。アミノ酸配列と関連して、生物学的機能アナログは、本明細書で使用する一定の、しかしほとんどでもすべてでもないアミノ酸が置換されているペプチドである。機能アナログは、対応する核酸分子のレベルで創造でき、このような配列を所望のアミノ酸変化をコードするように変える。一つの実施態様において、変化はポリペプチドの生物学的機能を改善するため、例えば、ポリペプチド(例えば、インターロイキンポリペプチド)の治療効果を改善するために挿入できる。

本発明の主題は、また記載のポリペプチドの組み換え産物も包含する。簡単に、治療ポリペプチドをコードする核酸配列を構築物にクローン化し、構築物を、それが組み換え的に産生される宿主細胞に挿入する。

“宿主生物”なる用語は、記載のアデノウイルスベクターが挿入されている任意の生物を意味する。一つの実施態様において、宿主生物は温血脊椎動物、他の実施態様において、哺乳動物である。

II.Ｃ. ヌクレオチドおよびアミノ酸配列比較
ヌクレオチドまたはポリペプチド配列に関連する“同一”またはその割合“同一性”なる用語は、比較し、最大一致に対して整列させた場合、本明細書に記載の配列アルゴリズムの一つを使用してまたは目視により測定して、同じまたは同じであるアミノ酸残基またはヌクレオチドの特異的な割合を有する２個またはそれ以上の配列または部分配列を意味する。

ヌクレオチドまたはポリペプチド配列に関する“実質的に同一”なる用語は、その正味の効果が、天然の遺伝子、遺伝子産物または配列の少なくともいくつかの生物学的活性を維持するためである、天然に存在する配列と１個またはそれ以上の欠損、置換または付加により異なる特定の配列を意味する。このような配列は“変異体”配列、または生物学的活性がある程度変化しているが、元の生物学的活性の少なくともいくつかを維持する配列を含む。本明細書で使用する“天然に存在する”なる用語は、人間により人工的に産生されるものと異なる天然に見ることができる組成物を記載するために使用する。例えば、天然の源から単離でき、研究室で人間により作為的に修飾されていない生物中に存在するタンパク質またはヌクレオチド配列は天然に存在する。

配列比較のために、典型的に一つの配列が、試験配列を比較する参照配列として働く。配列比較アルゴリズムを使用する場合、試験配列および参照配列をコンピュータープログラムに入れ、部分配列座標を必要に応じて設計し、そして配列アルゴリズムプログラムパラメーターを選択する。配列比較アルコリズムが次いで、選択したプログラムの配列パラメーターに基づいて、参照配列に対する設計した試験配列(複数もある)の配列同一性パーセントを計算する。

比較のための配列の最適のアラインメントを、例えば、Smith & Waterman(1981)の局所相同性アルゴリズムにより、Needleman & Wunsch(1970)の相同性アラインメントアルゴリズムにより、Pearson & Lipman(1988)の類似法の調査により、これらのアルゴリズムのコンピューター処理による実行により(Accelrys, Inc., San Diego, California, United States of Americaから入手可能なGCG(登録商標) WISCONSIN PACKAGE(登録商標)中のGAP、BESTFIT、FASTAおよびTFASTA)、または目視により(一般に、Ausubel et al., 1992参照)処理することができる。

配列の相同性パーセントおよび配列類似性を測定するための例示的アルゴリズムはＢＬＡＳＴアルゴリズムであり、これはAltschul et al., 1990に記載されている。ＢＬＡＳＴ分析を行うためのソフトウェアは、the National Center for Biotechnology Information(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)を介して入手可能である。このアルゴリズムは、最初にクエリー配列中の長さＷの短い文字列を同定することにより高スコア配列対(ＨＳＰ)を同定し、これは、データベース配列中の同じ長さの文字列と整列させた場合、いくつかの正値閾値スコアＴと適合するか満足させる。Ｔは、近隣文字列スコアと見なされる。これらの最初の近隣文字列ヒットは、それらを含むより長いＨＳＰをみつけるための研究開始の種として働く文字列ヒットを次いで、累積アラインメントスコアが高く限り、各配列の両方向に沿って伸長する。累積スコアを、ヌクレオチド配列に関して、パラメーターＭ(マッチした残基の対の報償スコア；常に＞０)およびＮ(ミスマッチの残基のペナルティスコア；常に＜０)を使用して計算する。アミノ酸配列に関して、採点マトリックスを使用して累積スコアを計算する。各方向でヒットした文字列の拡張を、累積メントスコアが量Ｘによりその達成された最大値から落ちた場合、累積スコアが１個またはそれ以上の負のスコアの残基アラインメントの累積により０以下になった場合、またはいずれかの配列の末端に到達した場合に停止する。ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメーターＷ、ＴおよびＸは、アラインメントの感受性および速度を測定する。ＢＬＡＳＴＮプログラム(ヌクレオチド配列に関して)は、文字列長Ｗ＝１１、予測値Ｅ＝１０、１００のカットオフ、Ｍ＝５、Ｎ＝−４および両方の鎖の比較をデフォルトとして使用する。アミノ酸配列に関して、ＢＬＡＳＴＰプログラムは３の文字列(Ｗ)、１０の予測値(Ｅ)およびＢＬＯＳＵＭ６２採点マトリックスをデフォルトとして使用する(Henikoff & Henikoff, 1992参照)。

配列同一性のパーセントの計算に加えて、ＢＬＡＳＴアルゴリズムはまた二つの配列の間の類似性の統計分析として実行する(例えば、Karlin & Altschul, 1993参照)。ＢＬＡＳＴアルゴリズムにより提供される類似性の一つの測定は、最小合計確率(Ｐ(Ｎ))であり、これは、二つのヌクレオチドまたはアミノ酸配列の間のマッチが偶然に起こる確率の指標を提供する。例えば、試験核酸配列と参照核酸配列の比較における最小合計確率が一つの例において約０.１より小さい、他の例において約０.０１より小さい、そしてさらに別の例において約０.００１より小さい場合、試験核酸配列は参照配列と類似と見なす。

III. アデノウイルスベクター
一つの実施態様において、本発明の主題のアデノウイルスベクターは、制限増殖コンピテントである。すなわち、それらは誘導プロモーターの転写制御下に、複製に必要な１個またはそれ以上の機能遺伝子を含む。これはインビボで非制御の複製を阻止し、ウイルス感染の望ましくない副作用を減少させる。複製コンピテント自己制御式または自己破壊式ウイルスベクターも、複製欠損ウイルスベクターが使用され得るように、使用できる。

核酸構築物のウイルスゲノムへの構築物への組み込みは、所望により構築物をウイルスゲノム中の適当な制限部位にライゲートすることにより行うことができる。ウイルスゲノムを次いで適当な方法によりウイルスコートまたはキャプシッドに封入できる。特に、任意の適当なパッケージング細胞系を使用して、本発明の主題のウイルスベクターを産生できる。これらのパッケージング系は、それらが制限増殖コンピテントベクター中で欠失した誘導プロモーター下に置かれた遺伝子を、典型的にゲノムに組み込んで含むため、本発明の主題の複製欠損ウイルスゲノムに相補的である。このように、パッケージング系の使用は、本発明の主題のウイルスベクターの培養中での産生を可能にする。

本発明の主題のアデノウイルスベクターは、腫瘍の低酸素領域に存在する細胞を含むが、これらに限定されない高レベルのＨＩＦ−１を発現する細胞で優勢に複製するように設計する。これは、複製のために必至なアデノウイルス遺伝子を、低酸素反応性プロモーター(ＨＲＰ)の転写制御下に置くことにより達成できる。このプロモーターが、低酸素細胞で優勢に転写を指示する能力は、実施例１に記載のように、強化緑色蛍光タンパク質(ＥＧＦＰ)コード配列に機能し得るように連結したプロモーターを含むプラスミドで評価した。ＨＲＰ−ＥＧＦＰ構築物を使用して二つの腫瘍細胞系から安定なサブライン：ＨＣＴ１１６(ヒト結腸癌細胞系)；および４Ｔ１(マウス***腺癌)を確立した。常酸素条件中での細胞培養ではＥＧＦＰを発現しなかった。低酸素条件(０.５から１.５％の酸素張力)に暴露した、安定に形質導入されたサブラインからの細胞は、インキュベーション２４時間後、ＥＧＦＰを強く発現した。

一つの実施態様において、腫瘍内に注入した構築物を使用した制限複製コンピテンスは、腫瘍の低酸素領域中でのベクター複製をもたらす。本発明の主題の特性は、規定された部位の近くの低酸素細胞にベクター分布および複製を効率的に集束させる方法に関する。アデノウイルスレポーター遺伝子構築物のインビボ腫瘍内複製は、実施例２に記載のような皮下腫瘍モデルで評価した。

ＨＲＰが転写を低酸素細胞に限定する能力は、実施例２に記載のように、安定なサブラインでマウスに皮下腫瘍を確立させることにより試験した。皮下腫瘍を直径１.０−１.５cmに増殖させた。腫瘍を次いで殺したマウスから除去し、ＥＧＦＰ発現を検出した。ＥＧＦＰレポーター遺伝子は、腫瘍の低酸素領域に排他的に発現した。

低酸素誘導ベクターの腫瘍内複製を最大にし、同時に同ベクターの可能性のある免疫原性全身複製を最小にする努力において、低酸素反応性プロモーターを用いる構築物を開発した。本明細書に記載のように、ベクターの高腫瘍複製が達成でき、一方、周辺細胞中での複製は排除できる。このように、本発明の主題の一つの実施態様において、腫瘍内のアデノウイルスベクターのＨＩＦ−１誘導複製が、腫瘍増殖の抑制をもたらすことができる。

ＨＩＦ−１結合配列に連結した最小プロモーターを含む組み換えプロモーターを含むが、これに限定されない任意の低酸素誘導プロモーターを本発明の主題の方法にしたがい使用できる。一つの例において、ＨＩＦ−１結合配列はＨＲＥである。ＨＲＥは、ホスホグリセラートキナーゼ−１(Firth et al., 1994; Semenza et al., 1994)、エリスロポエチン(Pugh et al., 1991; Semenza et al., 1991)およびＶＥＧＦ(Liu et al., 1995; Forsythe et al., 1996)を含むいくつかの低酸素誘導遺伝子のプロモーターとして発見されている。

低酸素誘導能に関与する厳密な配列が決定されていない低酸素に反応して上方制御される遺伝子に関して、反応配列は当業者が既知の方法により決定できる。候補プロモーター領域内で、核酸配列に結合した調節タンパク質の存在が、当業者に既知の種々の方法を使用して検出できる(Ausubel et al., 1992)。簡単に、インビボフットプリントアッセイは、生存しているまたは透過性にした細胞内の化学的および酵素的修飾から、厳密なＤＮＡ配列を証明する。同様に、インビトロフットプリントアッセイは、タンパク質抽出物を使用した、化学的または酵素的修飾からのＤＮＡ配列の保護を示す。ニトロセルロースフィルター結合アッセイおよびゲル電気泳動移動度シフトアッセイ(ＥＭＳＡ)は、候補転写因子の提供に基づき、放射能標識した調節ＤＮＡエレメントの存在を突き止める。コンピューター分析プログラム、例えばTFSEARCH version 1.3(Yutaka Akiyama:“TFSEARCH:Searching Transcription Factor Binding Sites”, http://www.rwcp.or.jp/papia/)はまたゲノム領域内の既知の転写制御エレメントのコンセンサス配列の位置を探すのに使用できる。

本発明の主題の低酸素誘導プロモーターは、転写活性を増幅するためのさらなるエレメントとコンカテマー化(concatemarized)でき、または組み合わせることができる。本発明の主題の一つの実施態様において、低酸素誘導プロモーターは、ＣＭＶ最小プロモーターに連結した、ヒトＶＥＧＦ遺伝子由来のＨＲＥの５つのタンデムコピーを含む。

これとは別にまたはこれに加えて、低酸素誘導プロモーターはｍＲＮＡ翻訳のエンハンサーとして作用するエレメントと組み合わせることができる。一つの実施態様において、ｍＲＮＡ翻訳のエンハンサーはＨＲＥである。

本発明の主題の低酸素誘導プロモーターは、さらに本明細書に記載の組み合わせ治療に使用できる非低酸素刺激に反応できる。例えば、モルタリンプロモーターは、低線量の電離放射線で誘導され(Sadekova et al., 1997)、ｈｓｐ２７プロモーターは１７β−エストラジオールおよびエストロゲンレセプターアゴニストで活性化され(Porter et al., 2001)、ＨＬＡ−Ｇプロモーターは亜ヒ酸塩により誘導され、そしてｈｓｐプロモーターは光線力学療法により活性化できる(Luna et al., 2000)。このように、本発明の主題にしたがい使用する低酸素誘導プロモーターは、組み合わせ治療処置を支持するさらなる誘導特性またはＤＮＡエレメントを含むことができる。ウイルス投与は、放射線療法の前、途中または後；化学療法の前、途中または後；および／または光線力学療法の前、途中または後にすることができる。

低酸素誘導プロモーターは、処置を意図する対象と異種の源を含む、任意の生物学的源に由来し得る。一つの例として、ヒトＶＥＧＦプロモーターは、ウシ肺動脈内皮(ＢＰＡＥ)細胞において優れた低酸素誘導発現を指示できる(Liu et al., 1995)。

IV. トランス遺伝子
本発明の主題の方法は、細胞中での複製のためにアデノウイルスベクターを使用し、それにより細胞の融解をもたらす。アデノウイルスベクターを含む細胞をより効率的に殺すために、本発明の主題はまたトランス遺伝子を含むアデノウイルスベクターも提供する。現在提供している対象にしたがい、トランス遺伝子は、腫瘍サプレッサー遺伝子、アポトーシス誘導遺伝子、抗脈管形成遺伝子、自殺プロドラッグ変換酵素遺伝子、細菌毒素遺伝子、アンチセンス遺伝子、腫瘍サプレッサー遺伝子、免疫刺激性遺伝子またはこれらの組み合わせを含む、治療遺伝子を含むことができる。

本明細書で使用する“トランス遺伝子”なる用語は、細胞内に挿入され、それによりそのヌクレオチド配列が細胞中で発現するのを可能にする、任意のヌクレオチド配列を意味する。トランス遺伝子は、細胞が由来した生物に対して部分的にまたは完全に異種(すなわち外来)である遺伝子を含み得るか、またはすでに細胞内に含まれている遺伝子と同一または相同性のヌクレオチド配列であり得る。本発明の主題の一つの実施態様において、トランス遺伝子は治療遺伝子を含む。

本発明の主題の一つの実施態様において、トランス遺伝子は、制限増殖コンピテントアデノウイルスベクターによりコードされる。しかしながら、アデノウイルスビリオンに有効に封入できる外来性ヌクレオチドの数は約２０００塩基対である。このように、本発明の主題の制限増殖コンピテントアデノウイルスベクターは、所望により、各トランス遺伝子に必須のプロモーターおよびポリアデニル化配列に加えて、約１.４−１.６キロベース(ｋｂ)を超えないトランス遺伝子を含むことができる。これより大きなトランス遺伝子は、典型的に他の機構により提供する。下記のように、本発明の主題の一つの実施態様において、複製欠損アデノウイルスベクターであり、それ自体複製コンピテントウイルスが存在する細胞中で複製コンピテントになるベクターにより、トランス遺伝子を送達する方法を提供する。これは、前者から欠失した必須初期遺伝子生成物が、後者により提供されるため起こる。

本発明の主題の方法は、アデノウイルスベクター複製により細胞死を引き起こすために使用でき、これは細胞融解をもたらす。本発明の主題のアデノウイルスベクターは、さらに、治療的生物学的活性を有するポリペプチド(本明細書ではまた“治療ポリペプチド”とも呼ぶ)をコードする核酸分子を含むトランス遺伝子を含み得る。例示的治療ポリペプチドは、免疫刺激分子、腫瘍サプレッサー遺伝子産物／抗原、自殺遺伝子産物、および抗脈管形成因子を含むが、これらに限定されない(Mackensen et al., 1997; Walther & Stein, 1999; Kirk & Mule, 2000およびその中の引用文献参照)。

脈管形成および抑制された免疫反応は、悪性疾患および腫瘍増殖、侵襲、および転移の病因の主要な役割を担う。このように、一つの例において、治療ポリペプチドはインビボで免疫反応を誘導するおよび／または抗脈管形成反応を誘導する能力を有する。一つの実施態様において、本発明の主題のアデノウイルスベクターは、免疫刺激性および抗脈管形成活性の両方を示す治療遺伝子、例えば、ＩＬ１２(Dias et al., 1998、および下記に引用する引用文献参照)、インターフェロン−α(O'Byrne et al., 2000およびその中の引用文献参照)、またはケモカイン(Nomura & Hasegawa, 2000およびその中の引用文献参照)をコードする。他の実施態様において、本発明の主題のアデノウイルスベクターは、免疫刺激性活性を伴う遺伝子産物および抗脈管形成活性を有する遺伝子産物をコードする(例えば、Narvaiza et al., 2000参照)。

ＩＬ１２は、所望により共刺激動因Ｂ７.１との組み合わせで、代表的治療ポリペプチドである。なぜなら、ＩＬ１２またはＢ７.１ならびにＩＬ１２とＢ７.１の組み合わせをコードするウイルスの局所投与は、腫瘍に対する免疫反応を改善するように見えるためである(Puetzer et al., 1997)。

一つの実施態様において、本発明の主題は、免疫反応および／または抗脈管形成反応を誘発できるＩＬ１２ポリペプチドをコードするアデノウイルスベクターを含む。インターロイキン−１２(ＩＬ１２)は、２つのサブユニット：ｐ３５およびｐ４０から成る、ジスルフィド結合したヘテロダイマーである。ＩＬ１２はＴおよびＮＫ細胞を刺激し、インターフェロン−ガンマ(ＩＦＮ−γ)を分泌させ、ＴおよびＮＫ細胞増殖および細胞融解活性を増大させる(Kobayashi et al., 1989; Wolf et al., 1991; D'Andre et al., 1992; Gately et al., 1994; Robertson et al., 1992)。これらの機能を介して、ＩＬ１２は初期炎症性反応を促進し、細胞介在免疫性を助けるＣＤ４＋ Ｔヘルパー(Ｔｈ１)細胞の分化を促進する(Manetti et al., 1993; Hsieh et al., 1993)。ＩＬ１２はさらにおそらくＮＫ細胞介在機構を介して血管形成を阻害する(Voest et al., 1995; Majewski et al., 1996; Yao et al., 1999)。一つの例において、本発明の主題の遺伝子治療構築物によりコードされるＩＬ１２ポリペプチドは、天然に存在するＩＬ１２ポリペプチドの１個またはそれ以上の生物学的特性を示す。

他の実施態様において、本発明の主題は、ＩＬ２ポリペプチドをコードするアデノウイルスベクターを含む。ＩＬ２は、腎臓癌、乳癌、膀胱癌および悪性黒色腫を含む種々の癌で治療的活性を示す免疫刺激分子である。ＩＫ１２の抗腫瘍活性は、ＩＬ２レセプターを発現するＮＫ細胞およびＴ細胞を拡大および活性化する能力に関する(例えば、Margolin, 2000; Gore, 1996; Deshmukh et al., 2001; Larchian et al., 2000; Horiguchi et al., 2000；およびその中の引用文献参照)。ＩＬ２はまた抗腫瘍ワクチンと併用した場合、好結果で使用されている(Overwijk et al., 2000およびその中の引用文献参照)。

一つの例において、本発明の主題のアデノウイルスベクターによりコードされるＩＬ２ポリペプチドは、天然に存在するＩＬ２ポリペプチドの１個またはそれ以上の生物学的特性を示す。ＩＬ２−誘導増殖は、例えば、欧州特許第０４３９０９５号に記載のようなＣＴＬＬ−２細胞による３Ｈ−チミジン取り込みにより測定できる。ＩＬ２ポリペプチドの生物学的特性は、さらに、先行する刊行物に記載の方法を使用して評価できる。

本明細書で使用する“自殺遺伝子”なる用語は、そのポリペプチドを産生する細胞を死に導くポリペプチドをコードする遺伝子を意味する。自殺遺伝子は、例えば、アポトーシスの誘導により直接細胞死を引き起こす遺伝子をコードできる。このような遺伝子は、“アポトーシス誘導遺伝子”と呼ばれ、ＴＮＦ−α(Idriss & Naismith, 2000)、Ｔｒａｉｌ(Srivastava, 2001)、ＢａｘおよびＢｃｌ−２(Shen & White, 2001)を含むが、これらに限定されない。直接細胞を殺すタンパク質をコードする他の遺伝子は、細菌毒素遺伝子を含み、これは通常ある種の細菌のゲノムに見られ、真核細胞に毒性であるポリペプチド(すなわち細菌毒素)をコードする。細菌毒素はジフテリア毒素を含むが、これに限定されない(Frankel et al., 2001)。

あるいは、自殺遺伝子は、プロドラッグを毒性化合物に変換するポリペプチドをコードできる。このような自殺プロドラッグ変換酵素は、ガンシクロビルを毒性ヌクレオチドアナログに変換するＨＳＶ−ｔｋポリペプチド(Freeman et al., 1996)；非毒性ヌクレオチドアナログ５−フルオロシトシンを５−フルオロウラシルに変換するシトシンデアミナーゼ(Yazawa et al., 2002)；およびある脂肪族アミンＮ−オキシドを毒性代謝物に変換するチトクロームｐ４５０(Patterson, 2002)を含むが、これらに限定されない。

さらに、自殺遺伝子は細胞生存または増殖に関与するシグナル伝達カスケードを妨害するポリペプチドをコードできる。このようなカスケードは、Ｆｌｔ１およびＦｌｋ１レセプターチロシンキナーゼにより介在されるカスケードを含むが、これに限定されない(Klohs, et al., 1997にレビュー)。Ｆｌｔ１および／またはＦｌｋ１シグナル伝達を妨害できるポリペプチドは、可溶性Ｆｌｔ１レセプター(s-Flt1; Shibuya, 2001)およびＦｌｋ−１レセプターの細胞外ドメイン(ex-Flk1; Lin et al., 1998)を含むが、これらに限定されない。

Ｖ. 治療法
本発明の主題の治療法は、腫瘍中の低酸素細胞とアデノウイルスベクターを接触させ、それによりベクターが細胞内に入り、腫瘍増殖を阻害することを含む。例えば、記載のアデノウイルスベクターは、***の原発性および転移性固形腫瘍および癌腫；結腸；直腸；肺；中咽頭；下咽頭；食道；胃；膵臓；肝臓；胆嚢；胆管；小腸；腎臓、膀胱および尿道内皮を含む尿管；子宮頸、子宮、卵巣、絨毛癌および妊娠性絨毛性疾患を含む、女性生殖管；前立腺、精嚢、精巣および生殖細胞腫瘍を含む、男性生殖管；甲状腺、副腎および下垂体を含む内分泌腺；血管腫、黒色腫、骨またな軟骨組織起源の肉腫およびカポジ肉腫を含む皮膚；星状細胞腫、神経膠腫、神経膠芽細胞腫、網膜芽腫、神経腫、神経芽腫、神経鞘腫および髄膜腫を含む脳、神経、眼および髄膜の腫瘍；白血病のような造血転移由来であり、クロローマ、形質細胞腫、プラークならびに、菌状息肉腫および皮膚Ｔ細胞リンパ腫／白血病由来の腫瘍を含む、固形腫瘍；ホジキン病および非ホジキン病リンパ腫を含むリンパ腫の治療に有用であり得る。

本発明の主題の組成物はまた、単独でまたは、脈管形成疾患を含む、疾患の処置のために慣用的に患者に投与されている放射線療法、光線力学療法および／または化学療法と組み合わせて使用した場合、上記の腫瘍由来の転移の予防に有用であり得る。例えば、腫瘍を手術、光線力学療法、放射線照射および／または化学療法により慣用的に処置し、その後、本発明の主題の組成物を、微小転移の活動不活性化まで、および、残っている任意の原発腫瘍の増殖が安定化し、阻害されるまで投与する。実際、ウイルス投与は、放射線療法の前、途中または後；化学療法の前、途中または後；および／または光線力学療法の前、途中または後に行い得る。

本発明の主題の組成物および方法は、低酸素のためにＨＩＦ−１発現が上昇している細胞における使用に限定されない。それらは、また、ＨＲＥが稼働し得るように連結したヌクレオチド配列の翻訳を調節するために機能できる任意の細胞内で使用できる。例えば、ｐＶＨＬ機能の損失が、家族性血管腫症候群で、および、また散発性中枢神経系血管芽細胞腫および明細胞腎癌腫の大多数で報告されている(Ivan & Kaelin, 2001にレビュー)。さらに、腎細胞癌腫および／または血管芽細胞腫に関連しているｐＶＨＬ変異はすべて、ｐＶＨＬがＨＩＦ−１α活性を制御する能力を妨害することが示されている(Maxwell et al., 2001)。このように、本発明の主題の組成物および方法は、ｐＶＨＬ機能を失っている細胞に適用できる。

加えて、近年の報告は、ＨＩＦ−１が、ある腫瘍細胞で、常酸素状態下でさえ蓄積されることを示す。ある癌細胞が、ヴァールブルク効果として既知の現象である、好気性条件下の高い割合の糖分解を示すことは長年知られている。証拠は、ヴァールブルク効果が、腫瘍の常酸素領域の形質転換細胞におけるＨＩＦ−１の蓄積により特徴付けられ、好気性条件下で糖分解を導くことを示唆する。さらにＨＩＦ−１のこれらの細胞への挿入は、ｐｐ６０^{ｃ−Ｓｒｃ}タンパク質により介在されるように見え(Karni et al., 2002参照)、これはヒト癌のいくつかの形で関係している(Brickell, 1992にレビュー)。このように、本発明の主題の組成物および方法は、上昇したｐｐ６０^{ｃ−Ｓｒｃ}活性を有する細胞に適用できる。

ｐｐ６０^{ｃ−Ｓｒｃ}の上昇またはＶＨＬ機能の損失は、したがって、ＨＩＦ−１−選択的制限増殖コンピテントアデノウイルスベクターが、低酸素の非存在下で腫瘍細胞(例えばＶＨＬ−欠損明細胞腎癌腫)で増殖することを可能にする。これらの事情により、ＨＩＦ−１がすべての細胞で活性化される限り、すべての腫瘍細胞が標的となる。

本発明の主題の一つの実施態様において、標的組織中の細胞を、異なる二つのアデノウイルスベクターで、その一つはＨＲＥの転写制御下にアデノウイルス遺伝子を含む制限増殖コンピテントベクターであり、他方はトランス遺伝子を含む複製欠損アデノウイルスベクターであるが、を共感染させることにより標的組織の増殖を阻害する方法を提供する。組み合わせアプローチの使用は、制限増殖コンピテントアデノウイルスが、トランス遺伝子を運搬するために、約２kb(外来プロモーターが小さい場合)のみのトランス遺伝子しかキャパシティーを有しないため、利点がある。このように、アデノウイルスベクターが、多くの場合、２kbを超えるトランス遺伝子を運搬するキャパシティーを拡張する必要がある。複製欠損ウイルスの制限増殖コンピテントウイルスと組み合わせた使用により、トランス遺伝子を運搬する能力は著しく拡張する。第１世代Ｅ１、Ｅ３欠損アデノウイルスベクターにおいて、そのキャパシティーは約８kbである。第３世代gutlessベクターでは、キャパシティーは約３７kbに達する。gutlessベクターの構築は、Mitani et al., 1995; Fisher et al., 1996; Kochanek et al., 1996; Kumar-Singh & Chamberlain, 1996; Hardy et al., 1997; Parks & Graham, 1997; Morsy et al., 1998；ＰＣＴ国際公開第ＷＯ９８／５４３４５号；第ＷＯ９７／４５５５０号；および第ＷＯ９６／３３２８０号；および米国特許第５,８７１,９８２号に記載されている。

Ｖ.Ａ. 対象
ほとんどの実施態様において本発明の主題で処置する対象は、ヒト対象が望まれるが、本発明の主題の原則は、本発明の主題が、非脊椎動物および哺乳動物を含むすべての脊椎動物に対して有効であり、これを用語“対象”に包含することを意図することは理解されるべきである。さらに、哺乳動物は、癌の処置または予防が望まれる任意の哺乳動物種、特に農業用または飼育用哺乳動物種を含むことは理解される。

本発明の主題の方法は特に温血脊椎動物の処置に有用である。このように、本発明の主題は、哺乳動物および鳥類を考慮する。

より特異的に、ヒトのような哺乳動物、ならびに絶滅危惧種のため重要な(アムールトラのような)、ヒトにとって経済的に重要な(ヒトが消費するために農家で飼育されている動物)および／または社会的に重要な(ペットとしてまたは動物園で飼育されている動物)哺乳動物、例えば、ヒト以外の肉食動物(ネコおよびイヌのような)、ブタ類(子ブタ(pig)、親ブタ(hog)およびイノシシ)、反芻動物(畜牛(cattles)、雄牛(oxes)、ヒツジ、キリン、シカ、ヤギ、バイソンおよびラクダ)およびウマの処置を提供する。また提供されるのは、鳥類の処置であり、絶滅危惧種、動物園で飼育されている種類の鳥類、ならびに家禽、より具体的には飼い慣らされた家禽、すなわち、七面鳥、ニワトリ、アヒル、ガチョウ、ホロホロ鳥などのような飼鳥類、ならびに、ヒトに経済的に重要である種類の鳥類の処置を含む。したがって、家畜ブタ類((子ブタ(pig)および親ブタ(hog))、反芻動物、ウマ、飼鳥類などを含むが、これらに限定されない家畜の処置が企図される。

Ｖ.Ｂ. 製剤
本発明の主題のアデノウイルスベクターは、実施態様において、薬学的に許容される担体を含む医薬組成物を構成する。任意の適当な医薬製剤を、対象に投与するためにアデノウイルスベクターを調製するために使用できる。

例えば、適当な製剤は、抗酸化剤、緩衝剤、静菌剤、殺菌性抗生物質および、製剤を意図する受け手の体液と等張にする溶質を含み得る水性および非水性滅菌注射用溶液；および、懸濁剤および濃厚剤を含み得る水性および非水性滅菌懸濁液を含み得る。製剤は単位用量または複数回用量容器、例えば、密封アンプルおよびバイアルに入れられ、使用直前に滅菌液体担体、例えば水の添加のみを必要とする冷凍またはフリーズドライ(凍結乾燥)条件下で貯蔵できる。ある例示的成分は、一つの例において０.１から１０mg／mlの範囲であり、他の例において約２.０mg／mlであるＳＤＳ；および／または、例えば１０から１００mg／mlの範囲であり、他の例において約３０mg／mlであるマンニトールまたは他の糖；および／またはリン酸緩衝化食塩水(ＰＢＳ)である。

上記に具体的に記載した成分に加えて、本発明の主題の製剤は、問題の製剤のタイプに関連して当分野で慣用の他の薬剤を含み得ることは理解されるべきである。可能性のある製剤で、滅菌無発熱原水性および非水性溶液を使用できる。

本発明の主題の治療レジメンおよび医薬組成物は、サイトカインＩＦＮ−α、ＩＦＮ−γ、ＩＬ２、ＩＬ４、ＩＬ６、ＴＮＦまたは免疫細胞に影響する他のサイトカインを含むが、これらに限定されない付加的アジュバントまたは生物学的反応修飾剤と共に使用できる。本発明の主題のこの態様にしたがい、記載のアデノウイルスベクターは、１個またはそれ以上のこれらのサイトカインとの組み合わせ治療で投与できる。

Ｖ.Ｃ. 投与
本発明の主題のアデノウイルスベクターの適当な投与法は、静脈内または腫瘍内注射を含むが、これらに限定されない。あるいは、アデノウイルスベクターを任意の他の方法で、例えばアデノウイルスベクターを含む組成物を肺経路内噴霧することにより、処置が必要な部位に付着させることができる。本発明の主題を投与する特定の形態は、処置する細胞の分布および発生量、用いるベクター、ベクターの付加的組織または細胞ターゲティング特性および投与部位からベクターが代謝または除去する機構を含む、種々の因子に依存する。例えば、相対的に表面の腫瘍は腫瘍内注射できる。対照的に、内部の腫瘍は、静脈内注射により処置できる。

一つの実施態様において、投与法は、処置の必要な部位への局在化された(regionalized)ベクター送達または蓄積のための性質を含む。一つの例において、アデノウイルスベクターは腫瘍内に送達する。他の実施態様において、アデノウイルスベクターの腫瘍への選択的送達を、構築物の静脈内注射により達成する。

アデノウイルスベクターを肺経路に送達するために、本発明の主題のアデノウイルスベクターをエアロゾルまたは粗いスプレーとして製剤できる。エアロゾルまたはスプレー製剤の製造および投与法は、例えば、Cipolla et al., 2000および米国特許第５,８５８,７８４号；第６,０１３,６３８号；第６,０２２,７３７号；および第６,１３６,２９５号にある。

Ｖ.Ｄ. 投与量
本発明の主題のアデノウイルスベクター組成物の有効な投与量を、それを必要とする対象に投与する。“治療的有効量”は、測定可能な反応(例えば、処置している対象における細胞融解反応)を産生するのに有効な治療組成物の量である。一つの実施態様において、腫瘍増殖を阻害する活性を測定する。本発明の主題の医薬組成物中の活性成分の実際の用量レベルは、特定の対象のための所望の治療的反応を達成するのに十分な活性化合物(複数もある)の量を投与するように、変化し得る。選択する投与レベルは、治療組成物の活性、投与経路、他の薬剤または処置との組み合わせ、処置する状態の重症度および処置する対象の状態および投薬歴に依存する。しかしながら、所望の治療効果を達成するのに必要なものより低いレベルで化合物の投与を開始し、所望の効果が達成するまで徐々に投与量を増加させることは、当業者の範囲内である。

治療組成物の効果は代わり得、したがって、“治療的有効”量は変わり得る。しかしながら、下記のアッセイ法を使用して、当業者はこの現在請求している対象の候補モジュレーターの有効性および効果を容易に評価でき、それにしたがい治療レジメンを調節できる。

現在請求している対象の本明細書の記載をレビューした後、当業者は、特定の製剤、その組成物で使用すべき投与法および腫瘍サイズを考慮して、個々の患者に対する投与量を調整できる。さらに、投与量の計算は、患者の身長および体重、症状の重症度および段階、付加的な有害な身体状態の存在を考慮し得る。このような調節または改変、ならびにいつおよびどのようにこのような調節または改変を行うかの評価は医学の分野の当業者には既知である。

ウイルスベクターの局所投与のために、先の臨床試験は、１０^１３プラーク形成単位(pfu)のウイルスが、最小の毒性で投与できることを証明している。ヒト患者において、１×１０^９−１×１０^１３pfuが日常的に使用される(Habib et al., 1999参照)。この範囲内での適当な投与量を測定するために、予備処置を１×１０^９pfuで開始し、投与量レベルを用量限定的毒性の非存在下で上昇できる。毒性は、国立がん研究所(National Cancer Institute)により示された基準を使用して評価でき、任意のグレード４または任意のグレード３毒性が１週間以上継続すると合理的に定義できる。投与量はまた抗腫瘍活性または抗脈管形成活性を最大にするために修飾し得る。抗腫瘍および／または抗脈管形成活性を評価するための代表的基準および方法は下に記載する。複製ウイルスベクターで、約１×１０^７から１×１０^８pfuを、ある例で使用できる。

実際、本発明の主題の一つの実施態様は、腫瘍、他の低酸素組織またはＨＩＦ−１を発現する他の組織のような標的組織に、アデノウイルスを選択的に繁殖させる方法を提供する。アデノウイルス構築物を、本明細書に記載のようにアデノウイルスベクターに封入し、調整したウイルス力価は、少なくとも１×１０^６−１×１０^７pfu／mlに到達する。アデノウイルス構築物を１.０pfu／標的細胞の用量で投与する。このように、アデノウイルス構築物の最小レベルの投与を投与し、それによりウイルスが繁殖して治療レベルを提供することは、それにより本発明の主題の態様を構成する。

実施例
以下の実施例は、本発明の主題の形態を説明するために包含させる。以下の実施例中のある態様は、現在の共発明者により、本発明の主題の実施に十分働くように発見されまたは意図された技術および方法の観点を記載している。これらの実施例は、共発明者の標準研究業務を説明する。本明細書の記載および当分野の一般的技術レベルに照らして、当業者は、以下の実施例が例示のみを意図し、多くの変化、修飾および置換を本発明の範囲から逸脱することなく用いることができることを認め得る。

実施例１
低酸素に暴露した細胞におけるＥＧＦＰのインビトロ発現
ＶＥＧＦプロモーター中のＨＩＦ−１結合エレメントに基づいたプロモーターを構築した。低酸素反応性プロモーター(ＨＲＰ)は、サイトメガロウイルス(ＣＭＶ)由来の最小プロモーターに連結した、ヒトＶＥＧＦプロモーターのＨＲＥの５つのタンデムコピーを含んだ。このプロモーターの活性を試験するために、ＨＲＰが緑色蛍光タンパク質(ＥＧＦＰ)遺伝子の発現を制御する、図１に記載のプラスミドを構築した。ＨＲＰ−ＥＧＦＰ構築物を使用して、安定な二つの腫瘍細胞系：ＨＣＴ１１６(ヒト結腸癌細胞系)；および４Ｔ１(マウス***腺癌)を確立した。低酸素条件(０.５から１.５％の酸素張力)に暴露した、安定に形質導入されたサブラインからの細胞は、インキュベーション２４時間後、ＥＧＦＰを強く発現した。

実施例２
皮下腫瘍におけるＨＲＰ−駆動ＥＧＦＰ発現
腫瘍を、１０^５−１０^６細胞をマウス皮下に注射することにより確立した。注射した細胞は、構築物(ＨＲＰ−ＥＧＦＰ；図１参照)を安定に形質導入され、ＥＧＦＰ遺伝子の発現を制御する低酸素反応性プロモーターを含む、４Ｔ１細胞であった。腫瘍を直径約５−８mmまで増殖させた。腫瘍を切除し、マウスを殺す直前、マウスにピモニダゾールを腹腔内に注射した。ピモニダゾール染色は、腫瘍内の低酸素領域の同定のための標準法である(Raleigh et al., 1998)。腫瘍の凍結切片を次いで抗ピモニダゾール抗体で染色し、蛍光顕微鏡下で観察した。同じ切片のＥＧＦＰ発現パターンも観察した。ＥＧＦＰ発現とピモニダゾール染色の一致したパターンが各切片で観察され、低酸素腫瘍領域に伝達するためのＨＲＰ−ＥＧＦＰレポーターの適切性が確認された。

実施例３
制限増殖コンピテントアデノウイルスベクターのインビトロ複製
アデノウイルスＥ１Ａ遺伝子をＨＲＰプロモーターの制御下に含むアデノウイルスベクターを構築した(ＡｄＨＲＰ−Ｅ１Ａ−ｄｓＲｅｄ２；図２参照)。赤色蛍光タンパク質(ｄｓＲｅｄ２)をコードするレポーター遺伝子をベクター内に操作して入れ、ウイルス感染と複製の追跡を容易にした。このベクターを次いでＨＣＴ１１６ヒト結腸癌細胞系で試験した。低酸素はこのウイルスベクターの活性化を導いた。蛍光顕微鏡測定は、低酸素に暴露した細胞において、有意に多くのウイルスが複製および感染したことを証明した。フローサイトメトリーで測定した場合、ｄｓＲｅｄ２発現の差は少なくとも１００倍であり、これはプラーク形成アッセイで確認された。Ｅ１Ａタンパク質のウエスタンブロット分析は、Ｅ１Ａが低酸素条件に付された細胞でのみ著しいレベルで発現されることを示した。

実施例４
制限増殖コンピテントベクターのインビボ複製
ＨＲＰ−ＥＧＦＰ構築物(図１参照)を形質導入されたＨＣＴ１１６細胞を使用して、ヌードマウスに腫瘍を確立した。これらの腫瘍を担持するマウスを、次いで、赤色蛍光タンパク質を運搬するアデノウイルスベクター(ＡｄＨＲＰ−Ｅ１Ａ−ｄｓＲｅｄ２；図２参照)で感染させた。腫瘍細胞はＥＧＦＰタンパク質をＨＲＰの制御下に発現し、一方赤色蛍光マーカーをコードするウイルスベクターは、ウイルス複製と腫瘍低酸素の相対的発現パターンの比較を可能にした。

レポーター−形質導入ＨＣＴ１１６細胞をヌードマウスに皮下的に注射した。腫瘍を３−４週間、直径８−１０mmのサイズまで増殖させた。ＡｄＨＲＰ−Ｅ１Ａ−ｄｓＲｅｄ２を１×１０^８プラーク形成単位(pfu)の量で腫瘍内注射した。動物を３−１０日後に殺し、分析のために腫瘍を摘出し、切断した。低酸素反応性ベクターは低酸素領域で非常な能率で複製し、ｄｓＲｅｄ２の高レベルの発現を導いた。ｄｓＲｅｄ２の発現はＥＧＦＰと一致し、腫瘍の低酸素領域への選択性を示唆した。加えて、低酸素反応性プロモーターは、ＣＭＶプロモーター制御下のアデノウイルスベクターＡｄ−ＣＭＶ−ｄｓＲｅｄ２遺伝子を超える、多大な利点を証明した。複製欠損ｄｓＲｅｄ２ウイルスで感染した細胞は、感染腫瘍領域の観点および蛍光強度の観点の両方で低い能率を示した。これらの結果は、低酸素選択的複製コンピテントアデノウイルスの著しい利点を証明する。

実施例５
インビボ腫瘍増殖阻害
ＨＣＴ１１６(ヒト結腸癌)細胞を、ヌードマウスに３.０×１０^６細胞／マウスで皮下注射した。腫瘍が直径５−１０mmに到達したとき、ウイルスベクターを腫瘍内注射した。制御グループ(図６Ｂ、黒四角)はＡｄＣＭＶ−ｄｓＲｅｄ２(図５)を注射し、一方、処置グループ(図６Ｂ、黒三角)はＡｄＨＲＰ−Ｅ１Ａ−ＴＮＦ−α(図６Ａ)を注射し、これは、ＨＲＰに稼働し得るように連結したＥ１Ａ遺伝子を含み、さらに構造性に発現するＴＮＦ−α遺伝子を含む制限増殖コンピテントアデノウイルスベクターであった。腫瘍あたり適当なウイルスの２.０×１０^９pfuを腫瘍内注射した。腫瘍容量を２−３日毎に測定した。相対的容量を、０日目(すなわち、ベクター注射の直前の時点)の各腫瘍の容量を１.０と設定することにより計算した。図６Ｂに示されるように、制限増殖コンピテントアデノウイルスベクターを注射された腫瘍の増殖は、コントロールと比較してかなり遅い。

実施例６
制限増殖コンピテントアデノウイルスベクター存在下でのＥ１−欠損ＡｄＣＭＶ−ＥＧＦＰの複製
制限増殖コンピテントアデノウイルスベクターが、複製欠損アデノウイルスベクターの複製を支持できる能力を試験した。構造性に活性なＥＧＦＰ遺伝子をコードする複製欠損アデノウイルスベクター、ＡｄＣＭＶ−ＥＧＦＰ(図５参照)を構築した。このベクターにおいて、Ｅ１およびＥ３遺伝子が欠損し、ＥＧＦＰ遺伝子(構造性に活性なＣＭＶプロモーターの制御下)がウイルスのＥ１領域に挿入されている。構造性に活性なｄｓＲｅｄタンパク質をコードし、上記された制限増殖コンピテントアデノウイルスベクターＡｄＨＲＰ−Ｅ１Ａ−ｄｓＲｅｄ２(図２参照)を使用した。

９０％コンフルエンシーのＨＣＴ１１６結腸癌細胞を、二つのベクターのいずれかで、各ウイルスに関して０.５の感染の多重度(ＭＯＩ)で感染させた。感染５時間後、細胞をバクトロンチャンバーで２４時間低酸素(１％Ｏ_２濃度)に付した。低酸素インキュベーション後、細胞をさらに常酸素条件下で２４時間インキュベートした。次いで、細胞を蛍光顕微鏡を使用してＥＧＦＰおよびｄｓＲｅｄ発現に関して観察した。圧倒的多数の細胞が両方の蛍光マーカーに陽性であるか、両方に陰性であった。非常にわずかな細胞が一方のまたは他方のマーカーのみに陽性であった。両方の蛍光マーカーに陽性な細胞の存在は、制限増殖コンピテントベクター細胞のアデノウイルスでの共感染が、複製欠損アデノウイルスが複製し、有効にコード遺伝子を発現することを可能にすることを示唆する。

引用文献
下に列記の引用文献ならびに明細書に引用した引用文献は、それらが本明細書で用いる方法、技術および／または組成物の背景を補い、説明し、提供するか、またはこれらを教示する範囲で、引用して本明細書に包含させる。

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現在記載している主題の種々の詳細が、現在記載している主題の範囲から逸脱することなく変えることができることは理解されよう。さらに、前記の記載は説明の目的のみであり、限定の目的はない。

プラスミドベクターＨＲＰ−ＥＧＦＰの概略図である。このベクターは、低酸素条件下でＥＧＦＰを発現する安定に形質導入された細胞を作るために使用した。これは、ＥＧＦＰ遺伝子を低酸素反応性プロモーターの制御下に含む。 制限増殖コンピテントアデノウイルスベクターＡｄＨＲＰ−Ｅ１Ａ−ｄｓＲｅｄ２の概略図である。このベクターは、Ｅ１Ａ遺伝子をＨＲＰプロモーターの制御下に含み、赤色蛍光タンパク質レポーター、ｄｓＲｅｄ２を構造性に発現する。 例示的制限増殖コンピテントアデノウイルスベクター、ＡｄＨＲＰ−Ｅ４−ｄｓＲｅｄ２の概略図であり、Ｅ４遺伝子のみがＨＲＰプロモーターの制御下である。このベクターはまた赤色蛍光タンパク質レポーターを構造性に発現する。 例示的制限増殖コンピテントアデノウイルスベクター、ＡｄＨＲＰ−Ｅ１ＡＥ４−ｄｓＲｅｄ２の概略図であり、Ｅ１ＡおよびＥ４遺伝子の両方がＨＲＰプロモーターの制御下にある。このベクターはまた赤色蛍光タンパク質レポーターを構造性に発現する。 アデノウイルスベクターＡｄＣＭＶ−ＥＧＦＰおよびＡｄＣＭＶ−ｄｓＲｅｄ２の概略図である。各ベクターは、構造性ＣＭＶプロモーターの転写制御下に蛍光マーカーを有する複製欠損アデノウイルスベクターである。ベクターは、Ｅ３ポリペプチド(ボックスΔＥ３として記載)のコード配列中の欠損の存在のために、さらに、Ｅ１ポリペプチドコード配列(ΔＥ１として記載)を中断するＣＭＶ−マーカーの存在のために複製欠損である。 マウスにおける異種移植腫瘍モデルの、本発明の主題のアデノウイルスベクターでの処置の結果を示す。図６ＡはアデノウイルスベクターＡｄＨＲＰＥ１Ａ−ＴＮＦ−αを記載する。このベクターは、ＨＲＰに稼働し得るように連結したアデノウイルスＥ１Ａ遺伝子を有する。加えて、構造性ＣＭＶプロモーターに操作可能に結合した腫瘍壊死因子−アルファ(ＴＮＦ−α)遺伝子を有する。図６Ｂは、腫瘍内注射したＡｄ−ＨＲＰＥ１Ａ−ＴＮＦ−αが、この異種移植片モデルで腫瘍増殖を阻害する能力を示すグラフである。腫瘍担持マウスに複製欠損制御ベクター(ＡｄＣＭＶ−ｄｓＲｅｄ２；図５参照；黒四角)またはＡｄＨＲＰＥ１Ａ−ＴＮＦ−α(黒三角)のいずれかを注射し、腫瘍容量を示した時点に測定し、０日目の腫瘍容量と比較した(０日目の容量を１.０と設定)。

【配列表】

Claims (36)

1. 最小プロモーターおよび低酸素反応エレメント(ＨＲＥ)を含む転写制御エレメント(ＴＲＥ)の転写制御下にアデノウイルス遺伝子を含む、アデノウイルスベクター。
2. アデノウイルス遺伝子がＥ１Ａ遺伝子、Ｅ１Ｂ遺伝子、Ｅ２Ａ遺伝子、Ｅ２Ｂ遺伝子およびＥ４遺伝子からなる群から選択される、請求項１記載のアデノウイルスベクター。
3. さらに第２のアデノウイルス遺伝子をＴＲＥの転写制御下に含む、請求項１記載のアデノウイルスベクター。
4. 最小プロモーターがサイトメガロウイルス(ＣＭＶ)最小プロモーター、ヒトβ−アクチン最小プロモーター、ヒトＥＦ２最小プロモーターおよびアデノウイルスＥ１Ｂ最小プロモーターからなる群から選択される、請求項１記載のアデノウイルスベクター。
5. ＣＭＶ最小プロモーターが配列番号１を含む、請求項４記載のアデノウイルスベクター。
6. ＨＲＥがヒト血管内皮細胞増殖因子(ＶＥＧＦ)プロモーターに由来する、請求項１記載のアデノウイルスベクター。
7. ＨＲＥが配列番号２を含む、請求項６記載のアデノウイルスベクター。
8. ＨＲＥが配列番号２の５つのタンデムコピーを含む、請求項７記載のアデノウイルスベクター。
9. さらにトランス遺伝子を含む、請求項１記載のアデノウイルスベクター。
10. トランス遺伝子が第２のアデノウイルス遺伝子である、請求項９記載のアデノウイルスベクター。
11. トランス遺伝子が免疫刺激分子をコードする、請求項９記載のアデノウイルスベクター。
12. 免疫刺激分子がＩＬ２およびＩＬ１２からなる群から選択される、請求項１１記載のアデノウイルスベクター。
13. トランス遺伝子が自殺遺伝子である、請求項９記載のアデノウイルスベクター。
14. 自殺遺伝子がＴＮＦ−α遺伝子、Ｔｒａｉｌ遺伝子、Ｂａｘ遺伝子、ＨＳＶ−ｔｋ遺伝子、シトシンデアミナーゼ遺伝子、ｐ４５０遺伝子、およびジフテリア毒素遺伝子、ｓ−Ｆｌｔ１遺伝子、およびｅｘ−Ｆｌｋ１遺伝子からなる群から選択される、請求項１３記載のアデノウイルスベクター。
15. 請求項１記載のアデノウイルスベクターを含む、組成物。
16. さらに薬学的に許容される担体を含む、請求項１５記載の組成物。
17. 腫瘍増殖を抑制する方法であり、腫瘍中の低酸素細胞と請求項１記載のアデノウイルスベクターを接触させ、それによりベクターが細胞内に入り、腫瘍増殖を阻害することを含む、方法。
18. 接触が、アデノウイルスベクターの腫瘍内注射を介した投与の結果である、請求項１７記載の方法。
19. 接触が、アデノウイルスベクターの静脈内注射による投与の結果である、請求項１７記載の方法。
20. さらに腫瘍を治療的有効量の第２の処置に暴露することを含み、該第２の処置が電離放射線照射、化学療法および光線力学療法からなる群から選択される、請求項１７記載の方法。
21. 請求項１記載のアデノウイルスベクターを含む、宿主細胞。
22. 標的細胞に選択的細胞毒性を与える方法であり、ＨＲＥが機能できる細胞と請求項１記載のアデノウイルスを接触させ、それによりアデノウイルスベクターが細胞内に入ることを含む、方法。
23. ＨＩＦ−１を発現する標的組織中でアデノウイルスを選択的に増殖させる方法であり、標的組織と請求項１記載のアデノウイルスを接触させ、それによりアデノウイルスが少なくとも１.０×１０^７pfu／mlの力価まで増殖することを含む、方法。
24. 標的組織の増殖を阻害する方法であり：
    (ａ)標的組織中の低酸素細胞と第１のアデノウイルスベクターを接触させ、それにより第１のアデノウイルスベクターが細胞内に入り；そして
    (ｂ)低酸素細胞と複製欠損アデノウイルスベクターを接触させ、それにより複製欠損アデノウイルスベクターが細胞内に入ることを含む、方法。
25. 標的組織が腫瘍である、請求項２４記載の方法。
26. 第１のアデノウイルスベクターが、ＨＲＥを含むＴＲＥの転写制御下にアデノウイルス遺伝子を含む、請求項２４記載の方法。
27. 複製欠損アデノウイルスベクターが第２の遺伝子を含む、請求項２４記載の方法。
28. 複製欠損アデノウイルスベクターが構造性プロモーターの転写制御下に第２の遺伝子を含む、請求項２７記載の方法。
29. 複製欠損アデノウイルスベクターがＨＲＥを含むＴＲＥの転写制御下に第２の遺伝子を含む、請求項２７記載の方法。
30. (ａ)第１のアデノウイルスベクターが、ＨＲＥを含むＴＲＥの転写制御下に少なくとも二つの必須アデノウイルス遺伝子を含み；そして
    (ｂ)複製欠損アデノウイルスベクターが、第１のアデノウイルスベクター中のＨＲＥを含むＴＲＥの転写制御下に必須アデノウイルス遺伝子の少なくとも二つが欠損している、請求項２４記載の方法。
31. 二つの必須アデノウイルス遺伝子が、各々Ｅ１Ａ遺伝子、Ｅ１Ｂ遺伝子、Ｅ２Ａ遺伝子、Ｅ２Ｂ遺伝子およびＥ４遺伝子からなる群から選択される、請求項３０記載の方法。
32. 第２の遺伝子が自殺遺伝子である、請求項２７記載の方法。
33. 自殺遺伝子が、ＴＮＦ−α遺伝子、Ｔｒａｉｌ遺伝子、Ｂａｘ遺伝子、ＨＳＶ−ｔｋ遺伝子、シトシンデアミナーゼ遺伝子、ｐ４５０遺伝子およびジフテリア毒素遺伝子、ｓ−Ｆｌｔ１遺伝子およびｅｘ−Ｆｌｋ１遺伝子からなる群から選択される、請求項３２記載の方法。
34. 第２の遺伝子が免疫刺激分子をコードする、請求項２７記載の方法。
35. 免疫刺激分子がＩＬ２およびＩＬ１２からなる群から選択される、請求項３２記載の方法。
36. さらに標的組織を治療的有効量の第２の処置に暴露することを含み、該第２の処置が電離放射線照射、化学療法および光線力学療法からなる群から選択される、請求項２４記載の方法。

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