ES2276623B1 - Nuevos adenovirus recombinantes de replicacion condicionada (crad). - Google Patents
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Abstract
Nuevos adenovirus recombinantes de replicación condicionada (CRAD). La presente invención se refiere a un adenovirus recombinante de replicación condicionada, caracterizado porque comprende un promotor unido al gen E1A que comprende elementos de respuesta a hipoxia, un promotor unido al gen E4 que comprende al menos un elemento de respuesta al factor E2F, una deleción en el dominio CR2 del gen E1A, y un gen exógeno de interés. Adicionalmente, la invención se refiere a un procedimiento para la obtención de dicho adenovirus, y una composición que lo comprende.
Description
Nuevos adenovirus recombinantes de replicación
condicionada (CRAd).
La presente invención se refiere a nuevos
adenovirus recombinantes para el tratamiento de tumores sólidos, y
en particular a nuevos adenovirus selectivamente replicativos en
células tumorales que presentan alterada la vía de la proteína del
retinoblastoma (pRB) y que se desarrollan en condiciones de
hipoxia.
A pesar de los últimos avances en las técnicas
quirúrgicas y de imagen, así como de las mejoras realizadas en los
procedimientos combinados de radioterapia y quimioterapia, la
supervivencia de pacientes con metástasis y ciertos tipos de
tumores (cerebrales, pancreáticos, hepáticos, etc.) no ha mejorado
significativamente.
En su esfuerzo por buscar terapias alternativas,
los investigadores han visto en la viroterapia, y más
particularmente en los adenovirus, una herramienta terapéutica
atractiva y prometedora.
En un primer momento se abordó la utilización de
los adenovirus como vectores adecuados para la transferencia y
terapia génica. Sin embargo, aunque los datos preclínicos obtenidos
con diversas estrategias de terapia génica adenoviral son
alentadores (buena capacidad de transducción y eficacia
anti-tumoral), los ensayos clínicos realizados no
han proporcionado todavía grandes avances. Probablemente debido a
una ineficiente transducción de toda la masa de los tumores
sólidos.
Una estrategia alternativa busca aprovechar la
capacidad natural que los adenovirus poseen para penetrar en las
células y, utilizando la maquinaria celular, replicar y empaquetar
su propio genoma viral, provocando finalmente la lisis celular y la
propagación de su progenie. Así, los adenovirus son modificados
genéticamente para que esta actividad replicativa y citopática
quede atenuada o anulada en las células normales, pero no se vea
disminuida en las células tumorales diana. Estos adenovirus se
conocen comúnmente como adenovirus de replicación condicionada
("conditionally replicative adenoviruses" o CRAds),
adenovirus oncolíticos o también como adenovirus de replicación
selectiva. Una revisión reciente de las diferentes construcciones
virales desarrolladas puede encontrarse en Chu R.L. y cols: Use of
replicating oncolytic adenoviruses in combination therapy for
cancer; Clinical Cancer Research 2004;
10:5299-5312.
Los primeros CRAds incorporan mutaciones
genómicas que provocan una pérdida funcional solamente compensada
por algunas alteraciones específicas de las células tumorales
diana. Así, la incorporación de deleciones en los genes E1A o E1B
(genes de transcripción temprana necesarios para la replicación
"immediate early genes"), resulta en la producción de
proteínas El mutadas, incapaces de unirse con proteínas celulares y
bloquear elementos de control que poseen las células normales, pero
que se encuentran ya intrínsecamente bloqueados en las células
tumorales.
Así por ejemplo, Onyx-015 - uno
de los CRAds mejor estudiados - porta 2 mutaciones en el gen que
codifica para la proteína E1B-55 Kda. De esta
manera, la proteína E1B-55 Kda, que en condiciones
normales se une e inactiva a p53 induciendo la entrada en fase S
(fase de síntesis del ciclo celular), queda impedida para la unión
a p53 y en consecuencia no activará la fase S y la replicación,
salvo en células tumorales con una vía p53 alterada.
Otra modalidad también ampliamente estudiada es
el adenovirus Delta24, que incorpora una deleción de 24 pares de
bases en la región constante 2 (CR2) del gen viral E1A. De esta
manera, la proteína E1A mutada es incapaz de unirse a la proteína
del retinoblastoma pRB, unión que en células normales es necesaria
para la inducción de la fase S y la replicación viral. Estos CRAds
solamente se replicarían en células en las que no es necesaria la
interacción E1A/pRB, por ejemplo en células tumorales con una vía
RB-p16 alterada.
Un segundo tipo de CRAds lo constituyen aquellos
en los que se introducen uno o varios promotores específicos de
tumores en sustitución de los promotores endógenos de algunos de
sus genes virales (p.ej. E1A, E1B, E4). De esta manera la
replicación viral quedaría restringida a aquellos tumores en los
que el promotor tumoral específico está re-activado
o sobre-activado. Dado que muchos de estos
promotores no están activados en todos los tumores, los desarrollos
más recientes buscan diseñar promotores cuya activación sea
universal en todo tipo de tumores. Así por ejemplo se han
desarrollado CRAds donde la transcripción del gen E1A está
controlada por el promotor del gen E2F-1, por un
promotor derivado del gen de la transcriptasa inversa de la
telomerasa (TERT), o también por un promotor inducible por
hipoxia.
US6900049, US2005/0074430 y WO2004/031357
presentan adenovirus oncolíticos cuya replicación es dependiente
del factor inducible por hipoxia
(hypoxía-inducible factor, HIF). La actividad
replicativa y citolítica de estos virus estaría limitada a células
cuya actividad HIF está aumentada, y en particular a células que
crecen en condiciones de hipoxia. A tal efecto, los virus portan
uno o varios genes (E1A, E1B, E4) cuya transcripción está
controlada por un promotor, generalmente artificial, que incorpora
uno o varios elementos de respuesta a hipoxia inducibles
por HIF.
por HIF.
En un trabajo reciente, Cuevas Y. y cols.
(Specific oncolytic effect of a new
hypoxia-inducible factor-dependent
replicative adenovirus on von
Hippel-Lindau-defective renal cell
carcinomas; Cancer Research 2003; 63:6877-6884)
presentan un adenovirus oncolítico inducible por hipoxia
(Ad9xHRE1A) en el que la expresión del gen E1A está controlada por
un promotor artificial con 9 copias en tandem del elemento de
respuesta a hipoxia procedente del promotor del gen VEGF (factor de
crecimiento del endotelio vascular). Ad9xHRE1A, porta además un gen
E4 controlado por un promotor E2F-1, de manera que
la expresión de E4 quedaría restringida a células en proliferación
con una importante actividad E2F, por ejemplo tumorales.
Se ha podido constatar sin embargo, la
existencia de un compromiso entre la selectividad replicativa de
los virus atenuados y su eficiencia
replicativa-oncolítica. Sigue siendo necesario y
deseable el diseño y selección de nuevas generaciones de adenovirus
oncolíticos para maximizar su eficiencia replicativa y oncolítica,
manteniendo su selectividad por las células tumorales, y en último
término, que presenten la máxima actividad
anti-tumoral y seguridad. Esto puede ser posible
mediante el desarrollo de nuevos CRAds que "exploten" nuevos
mecanismos reguladores, y mediante la selección de CRAds que,
combinando distintos mecanismos de control, presenten mejores
prestaciones.
A la vista de los ensayos
pre-clínicos y clínicos realizados hasta la fecha,
algunos especialistas han aventurado que la viroterapia oncolítica
por si sola difícilmente será efectiva en la completa erradicación
de los tumores. Sin embargo, los datos clínicos obtenidos les
inclinan a pensar que la utilización de adenovirus oncoliticos en
combinación con radioterapia, quimioterapia o terapia génica
permitirán una mayor eficacia anti-tumoral.
Es por tanto interesante y deseable, y
constituye el objeto de esta invención, el diseño de nuevos
adenovirus de replicación condicionada para el tratamiento de
tumores sólidos y metástasis en general que, junto con un control
optimizado de la replicación (selectividad/oncolisis), sean
portadores de genes exógenos que contribuyan a mejorar la eficacia
anti-tumoral.
Un primer objeto de la invención se refiere a un
adenovirus recombinante de replicación condicionada, al que por
simplificar nos referiremos como adenovirus recombinante de la
invención, caracterizado porque comprende:
- a)
- un promotor operativamente unido al gen adenoviral E1A que comprende al menos un elemento de respuesta a hipoxia HRE;
- b)
- un promotor operativamente unido al gen adenoviral E4 que comprende al menos un elemento de respuesta al factor E2F.
- c)
- un gen adenoviral E1A delecionado en la región constante CR2; y
- d)
- un gen exógeno de interés.
Para la construcción del adenovirus recombinante
de la invención puede utilizarse cualquier variedad o serotipo
adenoviral humano (que haya sido aislado en humanos), por ejemplo
los serotipos 2 (Ad2), 5 (Ad5), 11 (Ad11) ó 3 (Ad3). Para facilitar
la comprensión, el adenovirus recombinante de la invención se
describe e ilustra con ejemplos realizados utilizando el serotipo
Ad5, cuya secuencia completa está disponible en GeneBank (Human
adenovirus type 5, complete genome; Accesion number: AC_000008;
35938 bp DNA linear VRL
26-JAN-2005).
En el virus recombinante de la invención el
promotor viral que regula y controla la transcripción del gen que
codifica la proteína E1A ha sido sustituido por un promotor que
comprende al menos un elemento de respuesta a hipoxia (HRE)
inducible por el factor HIF-1, preferentemente más
de 3. En una realización más preferente, dicho promotor
operativamente unido al gen adenoviral E1A comprende 9 copias en
tándem de un elemento de respuesta a hipoxia (HRE). Estos elementos
de respuesta a hipoxia inducibles por HIF-1 pueden
obtenerse de promotores de otros genes que incluyen dichos
elementos. Dichos HRE pueden obtenerse por ejemplo del promotor del
gen del factor de crecimiento del endotelio vascular VEGF, del gen
de la eritropoyetina, o de algunos genes de enzimas glicolíticas,
por ejemplo enolasa-1.
Tal y como se utiliza en la presente invención,
"un promotor operativamente unido a un gen" significa un
fragmento de DNA funcionalmente asociado a la secuencia codificante
de dicho gen, de manera que dicho fragmento es suficiente para
regular y controlar la transcripción de dicha secuencia codificante
del gen. Así "un promotor mínimo" es la región mínima del
promotor que incluye las secuencias reguladoras (mínimas) que
permiten un control eficiente de la transcripción del gen.
En una realización particular del adenovirus
recombinante de la invención, el promotor que regula y controla la
transcripción del gen E1A es un promotor artificial que incluye
varias copias en tándem del HRE derivado del promotor del gen VEGF
humano. En una realización más particular, dicho promotor comprende
la secuencia SEQ. ID. NO: 1, que incluye 9 copias en tándem del
elemento de respuesta a hipoxia del gen VEGF-A,
unidas en posición 3' a una secuencia TATA procedente del promotor
del gen de la prolactina de rata. Este promotor artificial mínimo
(promotor 9xHRE) ha sido ya descrito por Cuevas y cols. (Cancer
Research 2003; citado anteriormente).
Por otra parte, en el adenovirus recombinante de
la invención, el promotor natural del gen que codifica la proteína
E4 ha sido sustituido por un promotor que comprende al menos un
elemento de respuesta al factor E2F, preferiblemente más de uno. En
una realización particular dicho promotor es un fragmento del
promotor del factor E2F-1 humano que comprende las
secuencias reguladoras del gen E2F-1, por ejemplo
un promotor mínimo. En una realización más particular, dicho
promotor comprende la secuencia SEQ. ID. NO: 2. Este promotor
artificial mínimo ha sido ya descrito por
Hernández-Alcoceba y cols ("New oncolytic
adenoviruses with hypoxia- and estrogen
receptor-regulated replication"; Human Gene
Therapy, 2002; 13:1737-1750). Por otra parte, la
utilización del promotor E2F-1 para dirigir la
expresión de los genes virales E1A, E1B y E4 ha sido descrita en
WO01/36650.
Como mecanismo adicional para el control de la
replicación, el gen que codifica la proteína E1A del virus
recombinante de la invención presenta una deleción en la región
constante CR2. Más concretamente, dicha deleción afecta, total o
parcialmente, a la región de CR2 necesaria para la unión a la
proteína del retinoblastoma pRB, de manera que la proteína E1A
mutada es incapaz de unirse a pRB.
En una realización particular la deleción
comprende 8 aminoácidos "LTCHEAGF" (aminoácidos
122-129 de la proteína E1A, correspondientes a los
nucleótidos 923-946 de la secuencia AC_000008 ya
citada). Esta deleción se corresponde con la deleción Delta24
(Fueyo J. y cols. Oncogene; 2000; 19:2-12).
En una realización preferente, el adenovirus
recombinante de la invención comprende un gen viral E1A delecionado
con la deleción Delta24 y, operativamente unido a dicho gen, un
promotor 9xHRE con secuencia SEQ. ID. NO: 1; y un gen viral E4
operativamente unido al promotor E2F-1 humano de
secuencia SEQ ID NO: 2.
Adicionalmente, el virus recombinante de la
invención comprende un gen exógeno o transgén. En una realización
preferida dicho gen exógeno se introduce en el lugar que ocupan los
genes virales que codifican para las proteínas gp19k y 6.7k, que
son delecionados (nucleótidos 28.555 a 29.355 de la secuencia del
adenovirus, Gene Bank AC_000008) . La introducción de esta
sustitución ha sido ya descrita por Hawkins y cols. ("Gene
delivery from the E3 region of replication human adenovirus:
evaluation of the 6.7 K/gp19K region"; Gene Therapy, 2001; 8:
1123-1131).
El gen exógeno introducido en el adenovirus
recombinante de la invención puede ser un gen reportero (por
ejemplo luciferasa) o un gen terapéutico, como un gen supresor de
tumor, un gen inductor de apoptosis, un gen
anti-angiogénico, un gen suicida que codifica una
enzima activadora de pro-fármacos, o un gen
inmunoestimulador.
En una realización particular de la invención el
gen exógeno es el gen reportero de la luciferasa. En otra
realización particular dicho gen exógeno es el gen suicida de la
timidina quinasa (TK). En otra realización particular de la
invención el gen exógeno es el gen de la interleuquina 12
(IL-12). WO2004/031357 describe un virus oncolítico
regulado por hipoxia con el gen de la IL-12 como
transgén.
El diseño del nuevo CRAd presenta ventajas para
su uso como virus oncolítico frente a versiones anteriores, ya que
se han optimizado diversos elementos que determinan su eficacia y
especificidad:
1.- El uso de un promotor que responde a hipoxia
para controlar el gen E1A permite que la replicación y el efecto
citopático del virus se vea estimulado en condiciones de baja
tensión de oxígeno. Estas condiciones están presentes en los
tumores sólidos, y se ha descrito que pueden disminuir la actividad
de diferentes adenovirus oncolíticos regulados por otros mecanismos
(Pipiya T. et al., Gene Therapy, 2005
12:911-917; Shen BH and Hermiston T.W., Gene
Therapy (2005), 12:902-910).
2.- El uso combinado de la deleción Delta24 en
el gen E1A con el control transcripcional del gen E1A y la región
E4 consigue una mayor atenuación del virus en células normales, sin
afectar negativamente a su capacidad de matar las células
tumorales.
3.- La posibilidad de introducir genes
terapéuticos en la estructura del virus incrementa su eficacia
porque al efecto del gen exógeno se une la capacidad oncolítica
propia del adenovirus. En el caso de los genes reporteros, se hace
posible la visualización de las células infectadas a lo largo del
tiempo.
- 1.
- Interleuquina 12 (IL-12). Esta citoquina tiene diversos mecanismos de acción que contribuyen a su efecto antitumoral. Por una parte, estimula la reacción del sistema inmunológico frente a los tumores mediante la producción de otras citoquinas y la activación de células efectoras. Por otra parte, tiene un efecto antiangiogénico, que dificulta la vascularización de los tumores e impide su crecimiento.
- Estas acciones hacen que la expresión de IL-12 en el contexto del CRAd anteriormente descrito, presente importantes ventajas.
- En primer lugar, puede haber una sinergia en la estimulación del sistema inmune frente al tumor, ya que las células tumorales serán infectadas por un agente infeccioso replicativo. Este hecho es de por sí un evento inmunoestimulador, que se refuerza por la expresión local de IL-12.
- En segundo lugar, el efecto antiangiogénico de la IL-12 dificulta la oxigenación del tumor y provoca hipoxia, lo cual estimula la replicación del CRAd.
- 2.
- Timidina kinasa del Herpes virus tipo I (HSV-TK). Esta enzima tiene como función convertir un pro-fármaco relativamente inocuo (ganciclovir) en un potente agente citotóxico. Las células que expresan HSV-TK, en presencia de ganciclovir administrado exógenamente, mueren y provocan la muerte de las células que se encuentran en su proximidad. Dado que la administración de ganciclovir puede realizarse días después de administrar el CRAd, esto puede conseguir un aumento de la destrucción de células tumorales una vez el virus se ha amplificado, y así aumentar su capacidad oncolítica. Al mismo tiempo, esto detiene la replicación viral, debido a la muerte de las células infectadas, y puede considerarse un mecanismo de seguridad en el caso de observarse replicación en tejidos sanos.
- Además, HSV-TK puede utilizarse como gen reportero en humanos mediante la técnica de Tomografía de Emisión de Positrones (PET). De este modo, permite visualizar las células infectadas y determinar la diseminación del virus.
El genoma del CRAd ha sido modificado de modo
que pueden incluirse genes exógenos en la región E3. Estos genes
ocupan el lugar de los genes virales que codifican para las
proteínas gp19k y 6.7k. (Hawkins y cols., Gene Therapy (2001) 8,
1123-1131). La deleción de estos genes (nucleótidos
28.555 a 29.355 en la secuencia del adenovirus) no afecta a la
replicación del virus en células tumorales, ya que las proteínas
gp19k y 6.7k tienen como función inhibir la respuesta inmune frente
a las células infectadas. Dado que las células tumorales tienen
mecanismos propios para inhibir su reconocimiento por el sistema
inmune, estas deleciones pueden favorecer la eliminación del virus
en las células normales, pero no en las tumorales, y por tanto
contribuyen a la especificidad de la replicación viral.
La inclusión de los genes exógenos en esta
localización tiene ventajas adicionales. Por un lado, se utiliza el
promotor endógeno y las secuencias de poli- adenilación del virus,
con lo cual no se necesita incluir estas secuencias exógenamente.
Con ello se ahorra espacio en el genoma viral y se pueden incluir
genes más grandes. Por otro lado, se ha demostrado que el promotor
endógeno que regula gp19k/6.7k se activa en la fase tardía del
ciclo viral, con lo cual la replicación del CRAd y la expresión
del gen exógeno se regulan de la misma manera. Por último, se ha
demostrado que los niveles de expresión superan los obtenidos con
los promotores habituales que se utilizan en terapia génica.
Las construcciones de DNA para la preparación
del adenovirus recombinante de la invención pueden obtenerse
mediante métodos convencionales de biología molecular, muchos de
ellos recogidos en manuales generales de laboratorio (por ejemplo,
"Molecular Cloning: a Laboratory manual". Joseph Sambrook,
David W. Russel Eds. 2001, 3ª ed. Cold Spring Harbor, Nueva York).
Pueden consultarse también en otros manuales o referencias
orientados específicamente a la preparación de adenovirus, por
ejemplo:
"Adenovirus Methods and Protocols. Methods in
Molecular Medicine". Wold, William S. M. Ed. 1998, Humana
Press;
Mizuguchi H. y Kay M.A. "Efficient
construction of a recombinant adenovirus vector by an improved
in vitro ligation method"; Hum Gene Ther., 1998; 9:
2577-2583; y
He T.C y cols. "A simplified system for
generating recombinant adenoviruses"; Proc. Batl. Acad. Sci.
USA, 1998; 95:2509-2514.
Para la propagación del adenovirus recombinante
de la invención puede utilizarse cualquier línea celular que sea
permisiva para la replicación y formación de viriones recombinantes
selectivamente replicativos del adenovirus recombinante de la
invención (línea celular empaquetadora). Podría utilizarse casi
cualquier línea celular humana tumoral convencional. Pueden
utilizarse entre otras las líneas HEK293 (derivada de células
embrionarias), PER.C6 (derivada de retinoblastos embrionarios),
A549 (derivada de cáncer de pulmón humano), HeLa (p.ej. HeLaS3;
ATCC Cat.No. CCL-2.2; Yuk et al.
"Perfusion cultures of human tumor cells: a scalable production
platform for oncolytic adenoviral vectors". Biotechnology and
Bioengineering, 2004; 86:637-642).
Para la propagación eficiente del adenovirus
recombinante de la invención es necesario también que las células
empaquetadoras transfectadas con el genoma del adenovirus tengan
aumentada la expresión y actividad HIF, excepto las células HEK293
o PER.C6, que aportan constitutivamente los genes virales El. A tal
efecto, las células pueden ser sometidas a un tratamiento inductor
de la expresión de HIF, como el cultivo en condiciones de hipoxia
(p. ej. en una cámara hipóxica ajustada a una composición gaseosa
93% N_{2}/6% CO_{2}/1% O_{2}), cultivo en presencia de cloruro
de cobalto (p.ej. 100 \muM), o cualquier otro tratamiento
mimético de condiciones de hipoxia que sea inductor de HIF.
Así, en un aspecto concreto, la presente
invención se refiere a una célula hospedadora que comprende un
adenovirus recombinante previamente descrito y objeto de la
presente invención. Por otro lado, la invención también se refiere a
un procedimiento para la propagación in vitro de dicho
adenovirus objeto de la presente invención que comprende cultivar
una célula hospedadora que contenga un adenovirus recombinante de
la invención, en condiciones que permitan la expresión de dicho
adenovirus. Las condiciones para optimizar el cultivo de la célula
hospedadora dependerán del tipo de célula hospedadora empleado. Si
se desea, el método para producir el adenovirus recombinante de la
invención incluirá el aislamiento y purificación del mismo.
Un objeto adicional de la invención se refiere a
una composición farmacéutica que comprende un adenovirus
recombinante de la invención y un excipiente farmacéuticamente
aceptable. La composición farmacéutica de la invención puede
formularse con una variedad de excipientes convencionales que
mejoran la estabilidad del adenovirus durante los procesos de
fabricación, manipulación, almacenaje y distribución del producto,
o que sean apropiadas para su administración terapéutica.
Pueden utilizarse por ejemplo, azúcares crio- o
lio-protectores, polioles, surfactantes,
aminoácidos, polímeros, tampones y sales para ajustar el pH de la
composición, antioxidantes y otros agentes quelantes, así como
bacteriostáticos y bactericidas (Parkins et al. "The
formulation of biopharmaceutical products"; Pharmaceutical
Science and Technology Today, 2000; 3:129-137).
Podría utilizarse también una suspensión estéril acuosa o no
acuosa, que puede contener agentes suspensores o agentes
espesantes. Excipientes y formulaciones concretas útiles para la
preparación de la composición farmacéutica de la invención pueden
encontrarse por ejemplo en Journal of Pharmaceutical Sciences
(Evans R.K. et al. "Development of stable liquid
formulations for adenovirus-based vaccines";
2004, 93:2458-2475), Gene Therapy (Croyle M.A. et
al. "Development of formulations that enhance physical
stability of viral vectors for gene therapy"; 2001,
8:1281-1290), J. Virol. Methods (Hosokawa M. et
al. "Preparation of purified, sterilized, and stable
adenovirus vectors using albumin"; 2002;
103:191-199), W098/02522, W000/34444, W000/61726,
W003/049763, US6544769, US20020031527, entre otros.
En una realización particular la composición
farmacéutica contendrá de 10^{3} a 10^{15} o más partículas
adenovirales en solución acuosa.
Figura 1. Representación esquemática del
plásmido genérico para la producción de CRAds. La secuencia de
Adenovirus tipo 5 se encuentra en forma de plásmido con resistencia
a kanamicina, y puede liberarse mediante digestión con el enzima de
restricción PacI. E1Ap, promotor de E1A, que se encuentra
flanqueado por secuencias de reconocimiento para BstBI. E4p,
promotor de la región E4, flanqueado por secuencias para SwaI y
I-CeuI. E1A D24, deleción del dominio CR2 de E1A
(opcional). E3Dgp19k/6.7k, deleción parcial de la región E3 para la
inserción de genes exógenos. LP, promotor tardío del virus.
Figura 2. Representación esquemática de los
virus AdHLuc, AdDHLuc y AdWTLuc. ITR, Inverted Terminal Repeat;
HRE, Hypoxia Response Element; E2F-1p, promotor del
factor de transcripción E2F-1. D24, deleción del
dominio CR2 de E1A.
Figura 3. Efecto citopático de AdHLuc, AdDHLuc y
AdWT en células de hepatocarcinoma humano Huh-7
(figura A) y en fibroblastos normales IMR-90
(figura B). Se representa la supervivencia relativa respecto a
células no infectadas cultivadas en las mismas condiciones,
comparando la supervivencia cuando las células se mantuvieron en
condiciones de hipoxia frente a la observada en condiciones de
normoxia. Las células Huh-7 se infectaron con 5
virus/célula, y los fibroblastos IMR-90 con 135
virus/célula para compensar su menor infectividad por adenovirus.
El efecto citopático se evaluó a los 5 días después de la infección
para células Huh-7 y a los 10 días para los
fibroblastos IMR-90.
Figura 4. Efecto citopático de los virus AdHLuc,
AdDHLuc y AdWT sobre células WI-38 (infectadas con
250 virus/célula) y WI38-VA13 (125 virus/célula),
cuando las células se cultivaron en condiciones de normoxia o
hipoxia. Los cultivos fueron fotografiados (200x) a los 5 días
desde la infección. Las células que sufren efecto citopático por
replicación vírica se distinguen por pérdida de adherencia, con
aumento de la refringencia y morfología redondeada.
Figura 5. Efecto citopático de los virus AdHLuc,
AdDHLuc y AdWT sobre células BJ (infectadas con 500 virus/célula)
e IMR-90 (125 virus/célula), para células
mantenidas en condiciones de normoxia o hipoxia. Fotografiados
(200x) también a los 5 días. Las células que sufren efecto
citopático por replicación vírica se distinguen por pérdida de
adherencia, con aumento de la refringencia y morfología
redondeada.
Figura 6. Ensayo de viabilidad celular en
células Huh-7 e IMR-90 infectadas
con virus AdDHLuc (línea continua) o AdWT (línea discontinua), a
diferentes dosis virales (MOI, "multiplicidad de infección",
número de virus por cada célula). Los cultivos se mantuvieron en
condiciones de hipoxia (cuadrados) o normoxia (círculos). La
supervivencia se cuantificó por tinción con cristal violeta a los 5
días (Huh-7) o los 10 días (IMR-90)
desde la infección con el virus a ensayar.
Figura 7. Control de la replicación por hipoxia.
Comparación gráfica de la cantidad de partículas virales
infectivas (i.u./ml) producidas en células Huh-7
infectadas con AdDHLuc, AdWT o
Ad-CMV-Luc, cuando se mantuvieron
en condiciones de hipoxia o normoxia. i.u., unidades
infectivas.
Figura 8. Comparación gráfica de la expresión
in vitro de luciferasa (representada como RLU/\mug de
proteína total; RLU, relative luciferasa units) en células
Huh-7 y HApT-1 infectadas por los
virus AdDHLuc y AdWTLuc, cuando se mantuvieron en condiciones de
hipoxia o normoxia. Infección: MOI de 10 virus/célula.
Figura 9. Expresión in vivo de luciferasa
en ratones atímicos con xenoinjertos de tumores humanos, tras
infección (mediante inyección intratumoral) con los virus AdDHLuc,
AdWT y Ad-CMV-Luc. A: Tumores
inducidos por inyección subcutánea de células
Huh-7; Infección con 2x10^{8} i.u. del virus a
ensayar. B: Tumores inducidos por inyección intrahepática de
células Huh-7; Infección con 10^{9} i.u. del
virus AdDHLuc. La emisión de luz (expresada en fotones/segundo) se
cuantificó a lo largo del tiempo mediante una cámara
luminométrica.
Los siguientes ejemplos pretenden ilustrar, en
modo alguno limitativo, la realización de la invención objeto de
la presente solicitud de patente.
Conforme a las especificaciones de la invención,
se construyeron 3 adenovirus recombinantes, cada uno de ellos con
un transgen diferente:
- AdDHLuc, que lleva incorporado el gen de la
luciferasa (reportero);
- AdDHTK, que incorpora el gen de la timidin
quinasa del virus Herpes simplex (HSV-TK,
gen suicida); y
- AdDHIL-12, al que se le ha
incorporado el gen de la interleucina-12
(IL-12, gen terapéutico).
En los 3 adenovirus: i) se ha sustituido el
promotor del gen E1A por un promotor sintético (SEQ. ID. NO: 1) que
responde a hipoxia; ii) se ha sustituido el promotor del gen E4
por el promotor del factor de transcripción E2F-1
(SEQ. ID. NO: 2); iii) se ha realizado una deleción (deleción
Delta24) en el dominio CR2 del gen E1A; y iv) se han introducido
los genes de interés en sustitución de los genes gp19k/6.7k de la
región E3.
Además, se prepararon y utilizaron otros
adenovirus recombinantes que han sido utilizados como controles en
los experimentos:
- AdWT, adenovirus silvestre tipo 5 (ATCC
VR-5);
- AdWTLuc, que difiere de AdWT en la inclusión
del gen de luciferasa en sustitución de los genes gp19k/6.7k de la
región E3;
- Ad-CMV-Luc, un
adenovirus defectivo que expresa el gen de la luciferasa bajo el
control del promotor CMV (Vector Biolabs, Philadelphia, Ref. 1000);
y
- AdHLuc, que difiere de AdDHLuc porque no ha
sido delecionado (deleción Delta24) en el dominio CR2 del gen
E1A.
Para la construcción de los adenovirus
recombinantes utilizados en los ejemplos se utilizó como reactivo
inicial el plásmido, pSEHE2F. Este plásmido está basado en el
genoma del adenovirus tipo 5, modificado para facilitar la
sustitución de los promotores E1A y E4 por promotores específicos
de tumores (Hernández Alcoceba R. et al. Human Gene Therapy
2002; 13: 1737-1750). Sobre el genoma adenoviral se
han introducido secuencias de reconocimiento para enzimas de
restricción en regiones concretas y promotores exógenos que pueden
ser sustituidos con
facilidad:
facilidad:
- región del promotor de E1A (ElAp) flanqueada
por secuencias de reconocimiento para el enzima BstBI (pSEHE2F
contiene en esta región el promotor artificial 5XEH3, que será
sustituido por el promotor 9XHRE en los virus objeto de la
invención);
- Región del promotor de E4 (E4p) flanqueada por
secuencias de reconocimiento para los enzimas
I-CeuI y SwaI (pSEHE2F contiene en esta región el
promotor para el factor E2F-1, que se mantendrá en
los virus objeto de la invención). Este último promotor se obtuvo
mediante Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) a partir de ADN
genómico humano utilizando los siguientes oligonucleótidos:
| SEQ ID NO 3: | 5' TACTGTAACTATAACGGTCCTAAGGTAGCGTGGTACCATCCGGACAAAGCC-3' y, |
| SEQ ID NO 4: | 5' TAAGTATTTAAATGGCGAGGGCTCGATCCCGC-3'. |
Una secuencia aislante (denominada aquí
"Ins") está presente en pSEHE2F entre la secuencia de
empaquetamiento del adenovirus y la región del promotor E1A. Esta
secuencia (secuencia de parada de la transcripción del gen de la
hormona de crecimiento bovino) se obtuvo a partir del plásmido
pCDNA3 (Invitrogen) mediante digestión con los enzimas PvuII y
NotI.
El plásmido pSHE2F se modificó en sucesivas
etapas para obtener los plásmidos necesarios para producir los
virus de la invención y sus controles:
El plásmido PSEHE2F fue digerido con BstBI, y se
sustituyó el promotor 5XEH3 por el promotor 9XHRE. Para introducir
los sitos de restricción BstBI a ambos lados del promotor, se
utilizó un adaptador consistente en el siguiente par de
oligonucleótidos:
| SEQ ID NO 5: | 5Bstbam: | 5' CGAAGATCTGACTCCAAG 3' y |
| SEQ ID NO 6: | 3Bstbam: | 5' GATCCTTGGAGTCAGATCTT 3'. |
La orientación correcta del promotor se verificó
mediante digestión con el enzima de restricción BamHI y
secuenciación utilizando los siguientes oligonucleótidos:
| SEQ ID NO 7: | 5Ad5St: | 5'TAGTGTGGCGGAAGTGTGATGTTG 3' y |
| SEQ ID NO 8: | 3Ad5St: | 5'TCTTCGGTAATAACACCTCCGTGG 3'. |
Este nuevo plásmido se llamó pSHIFE2F.
El plásmido pSHIFE2F se modificó para delecionar
los genes que codifican para gp19k/6.7k (Dgp19k/6.7K) y flanquear
esta zona con secuencias de reconocimiento para el enzima
PI-SceI, que permitirán la incorporación de genes
exógenos. Para obtener la deleción se llevaron a cabo sucesivas
etapas de subclonaje. En primer lugar se obtuvo un fragmento de 4.7
kb mediante digestión del plásmido pSHIFE2F con el enzima AgeI, y
se subclonó en el sitio AgeI del plásmido comercial
pMIB/V5-HisC (Invitrogen). Este nuevo plásmido
(llamado pMIB-AgeC) se digirió simultáneamente con
los enzimas SpeI y XbaI y se introdujo en esta posición un
fragmento obtenido mediante PCR en el que se ha introducido un
sitio de restricción para el enzima XmnI en la posición 28555
relativa al genoma del adenovirus tipo 5. Este fragmento de PCR se
obtuvo con el siguiente par de oligonucleótidos:
| SEQ ID NO 9: | 5SpeI: | 5' AAGGACTAGTTTCGCGCCCTTTCTCAAATTTAAGC 3', y |
| SEQ ID NO 10: | 3XmnI: | 5' CCGATTCTAGAGAAACCTGAATTAGAATAGCCCGTAGAGTTGCTTGAA |
| ATTGTTCTAAACCCCAC 3', |
utilizando como molde el plásmido pSEHE2F.
El nuevo plásmido se llamó
pMIB-E3Xmn.
A continuación se efectuó una digestión de
pMIB-E3Xmn con el enzima MunI (que corta en la
posición 29355 relativa al adenovirus tipo 5), y una digestión
parcial con XmnI de modo que solo se corta en la posición 28555. Una
vez abierto el plásmido por estos dos sitios y eliminado el
fragmento comprendido entre ellos, se llevó a cabo una reacción de
ligación para insertar una secuencia reconocible por el enzima
PI-SceI (adaptador PI-SceI). Este
adaptador se obtuvo mezclando el siguiente par de oligonucleótidos
que hibridan entre sí:
| SEQ ID NO 11: | 5PI-Sce: | 5' ACGTAATCTATGTCGGGTGCGGAGAAAGAGGTAATGAAATGGCA 3' y, |
| SEQ ID NO 12: | 3PI-Sce: | 5' TGCCATTTCATTACCTCTTTCTCCGCACCCGACATAGATTACGT 3' |
El plásmido resultante se denomina
pMIB-PISceI, y presenta el sitio
PI-SceI en el lugar donde han sido delecionados los
genes adenovirales que codifican para gp19K/6.7k.
Para incorporar esta deleción en el genoma de
los vectores adenovirales, el plásmido pMIB-PISceI
se digirió con los enzimas AgeI y ScaI simultáneamente, y el
fragmento de 4.7 kb obtenido se introdujo en el plásmido pSHIFE2F
digerido con los mismos enzimas. De esta manera se genera un
plásmido que contiene la deleción deseada, pero que es incompleto
por haber perdido las regiones iniciales del genoma adenoviral. Sin
embargo, a partir de este plásmido se obtuvo el fragmento de 7.7 kb
comprendido entre los enzimas SwaI y SpeI, que fue introducido en
el plásmido pSHIFE2F en sustitución del fragmento homónimo. De esta
manera, los genes que codifican para las proteínas víricas
gp19K/6.7k fueron delecionados y en su lugar se introdujo el sitio
de restricción PI-SceI que puede utilizarse para la
incorporación de genes exógenos en esta zona, ya que no está
presente en ninguna otra región del virus. El primer gen exógeno
que se introdujo en la región E3 fue el gen reportero de la
luciferasa, obtenido a partir del plásmido
pGL3-Basic (Promega). El fragmento de 1.6 kb
comprendido entre los sitios HindII y XbaI que codifica para
luciferasa fue tratado con el enzima T4 polimerasa para conseguir
extremos romos, y se introdujo en el sitio PI-SceI
que había sido tratado de la misma manera en el plásmido
adenoviral modificado anteriormente. El plásmido resultante se
denomina pSHE2F-Luc.
Para facilitar el subclonaje de otros genes en
la región E3, es más conveniente utilizar sitios de reconocimiento
para el enzima ClaI en lugar de PI-SceI, porque
este último es muy grande y su repetición simétrica puede provocar
recombinaciones en el plásmido. Para ello se puede digerir con
PI-SceI, hacer romos los extremos con T4 DNA
Polimerasa, e introducir un adaptador de ClaI consistente en el par
de oligonucleótidos:
| SEQ ID NO 13: | 5Cla: | 5' CCTATATCGATAGCCT 3' y |
| SEQ ID NO 14: | 3Cla: | 5' AGGCTATCGATATAGG 3'. |
La secuencia que se pretende introducir puede
flanquearse por sitios ClaI mediante ligación de estos adaptadores
o por reacción de PCR utilizando oligonucleótidos que incluyan la
secuencia de reconocimiento para ClaI. Si el gen exógeno de interés
posee sitios ClaI internos, como sucede con la interleuquina 12,
pueden utilizarse sitios NarI, que son compatibles con ClaI.
La deleción de las bases 922 a 947 del genoma
adenoviral se realizó mediante PCR, utilizando como molde el genoma
de adenovirus tipo 5. Inicialmente se generaron dos fragmentos. Uno
de ellos, llamado AB se amplificó utilizando el par de
oligonucleótidos:
| SEQ ID NO 15: | AE1A: | 5' TCAGTATTCGAATCGCGACTCTTGAGTGCCAGCGAG 3' y |
| SEQ ID NO 16: | BE1A: | 5'ATCGATCACCTCCGGTACAAGGTTTGG 3'. |
El segundo, llamado BC se amplificó con los
oligonucleótidos:
| SEQ ID NO 17: | CE1A: | 5' AACCTTGTACCGGAGGTGATCGATCCACCCAGTGACGACGAGGATGA |
| AGAGG 3' y, | ||
| SEQ ID NO 18: | DE1A: | 5' AAGGCGTTAACCACACACGCAATCACAGGTTTACACCTTATGGCC 3' |
Los fragmentos AB y BC poseen una región de
homología, de modo que si se mezclan pueden hibridar parcialmente.
Esta región ha sido diseñada para excluir las bases comprendidas
entre la posición 922 y 947. Si la hibridación de estos dos
fragmentos se utiliza como molde para una reacción de PCR con los
oligonucleótidos AE1A y DEJA, se obtiene un fragmento (AD)
flanqueado por sitios BstBI y HpaI en el que el dominio CR2 del gen
E1A ha sido delecionado. A continuación este fragmento debe ser
introducido en el plásmido pSHE2F-Luc. Para hacerlo
posible, pSHE2F-Luc fue digerido con el enzima EcoRV
y re-ligado. De esta manera se obtiene un plásmido
mucho menor, que contiene sólo un sitio Hpal. A continuación se
digirió este nuevo plásmido con BstBI y HpaI y se incorporó el
fragmento de PCR. Este plásmido intermedio se denominó pSdlE1A, que
ha incorporado el gen E1A modificado pero ha perdido el promotor
9XHRE y la secuencia comprendida entre las bases 9197 y 33756. El
promotor 9XHRE se volvió a introducir utlizando el sitio BstBI.
Para restituir el resto del genoma adenoviral, inicialmente se
subclonó el fragmento de 14.8 kb comprendido entre los sitios SdaI.
A continuación se llevó a cabo una ligación triple para fusionar 3
fragmentos comprendidos entre sitios RsrII que restituyen el genoma
viral modificado. El fragmento de 14 kb procede del plásmido que
contiene la deleción en el dominio CR2 de E1A y el promotor 9XHRE,
mientras que el fragmento de 17 kb (procedente del plásmido
pSHE2F-Luc) contiene el gen de la luciferasa en la
región E3. Por último, el genoma se completa con el fragmento de
7.7 kb procedente también de pSHE2F-Luc. El
plásmido resultante de esta fusión se llamó
pSDHE2F-Luc.
Para ello se obtuvo el fragmento de 12.5 kb
comprendido entre los sitios NdeI del plásmdio
pSHE2F-Luc, y se introdujo en los sitios homónimos
del plásmido pTG3602. De esta manera se obtiene un plásmido con el
gen de la luciferasa sustituyendo a los genes gp19k/6.7k en el
contexto del genoma de Adenovirus tipo 5, sin otras
modificaciones.
En la figura 1 se representa la estructura
general de los plásmidos modificados, y en la figura 2 se muestra
un esquema del genoma de los virus recombinantes.
Los plásmidos descritos anteriormente se
digirieron con el enzima PacI, que libera el genoma vírico del
resto de secuencias bacterianas, y se transfectaron en células 293
(ATCC CRL-1573) mediante el método de precipitación
con fosfato cálcico. Una vez observado el efecto citopático
(típicamente 7-10 días después de la transfección),
se lisaron las células mediante 3 ciclos consecutivos de
congelación y descongelación. Se efectuaron diluciones seriadas del
lisado y con ellas se infectaron células A549 (ATCC
CCL-185; procedente de cáncer de pulmón humano) en
condiciones de hipoxia (1% oxígeno). De esta manera se obtuvieron
varios clones de los virus, que fueron verificados mediante PCR.
Los nuevos virus obtenidos a partir de los plásmidos
pSHE2F-Luc, pSd1HE2F-Luc y pAdLuc
se denominaron AdHLuc, AdDHLuc y AdWTLuc, respectivamente.
Los virus se amplificaron en células A549
mantenidas en condiciones de hipoxia en el caso de AdHLuc y
AdDHLuc, y en células 293 en el caso de AdWTLuc.
La purificación se llevó a cabo mediante
técnicas estándar utilizando un gradiente de Cesio y posterior paso
por una columna de exclusión. El virus obtenido se conservó en un
medio tamponado con 10% glicerol a -80ºC hasta el momento de su
utilización. La titulación se llevó a cabo mediante observación del
efecto citopático tras dilución límite en células 293, verificado
por ensayos de inmunohistoquímica con un anticuerpo
anti-adenovirus (Adeno-X Rapad
Titer Kit, BD Biosciences Clontech Cat. No.
K1653-1).
Se analizó la actividad del virus AdDHLuc frente
a virus control en distintos tipos celulares, tanto en condiciones
normales como en hipoxia.
Se analizaron los siguientes parámetros:
- el efecto citopático, mediante tinción con el
colorante cristal violeta;
- la replicación y producción de nuevas
partículas virales mediante dilución límite en células 293 o
inmunohistoquímica con anticuerpos anti-adenovirus
(Adeno-X Rapad Titer Kit, BD Biosciences Clontech
Cat. No. K1653-1); y
- la expresión de genes exógenos
(luciferasa).
La principal característica que se busca en los
CRAds es su capacidad de inducir de modo selectivo la muerte de
las células tumorales.
Los ensayos para evaluar este efecto citopático
se realizaron de la siguiente manera:
1. Siembra de las células en distintos pocillos
en sendas placas (para crecimiento en normoxia e hipoxia
respectivamente): 5x10^{3} células/pocillo en placas de 96
pocillos en medio apropiado para la línea celular.
2. A las 24 horas, infección con los virus a
ensayar (un tipo de virus por pocillo, p.ej. AdWT, AdHLuc o
AdDHLuc); la concentración viral se ajustó a cada línea celular en
función de la infectividad para dicha línea.
3. Incubación a 37ºC en condiciones de hipoxia
(cámara ajustada a una composición gaseosa de 93% N_{2}/6%
CO_{2}/ 1% O_{2}) o normoxia (composición gaseosa
ambiental).
4. Cuando AdWT causó efecto citopático evidente
en los cultivos, tinción con cristal violeta y cuantificación de
las células supervivientes.
5. Cálculo de la supervivencia (%) relativa
respecto a células en pocillos control, cultivadas en las mismas
condiciones pero que no han sido infectadas por el virus.
Para el cultivo de las células
Huh-7, HaP-T1, se utilizó medio
DMEM (Gibco) y para las células IMR-90,
WI-38, WI38-VA13 y BJ se utilizó
medio MEM (Gibco). El medio de mantenimiento estaba suplementado
con suero fetal al 10%, cuya proporción se redujo durante la
infección al 2%. En todos los casos se añadió a los medios de
cultivo una mezcla de antibióticos (penicilina 50 UI/L -
estreptomicina 50 mg/mL; Biowhittaker) y antimicóticos
(anfotericina-B 2,5 mg/mL; Gibco).
\newpage
Inicialmente se infectaron células tumorales
Huh-7 (Nakabayashi y cols. 1982. Cancer Res., 42:
3858-3863; procedente de hepatocarcinoma humano) y
HaP-T1 (ECACC No. 93121054; procedente de cáncer de
páncreas de hamster), y células normales IMR-90
(ATCC CCL-186; procedentes de fibroblastos
primarios humanos de pulmón) con los distintos virus.
Como puede apreciarse en la figura 3, tanto
AdDHLuc como AdHLuc fueron capaces de eliminar las células
tumorales cuando éstas crecen en condiciones de baja tensión de
oxígeno (hipoxia). El efecto citotóxico en hipoxia fue similar al
observado con el adenovirus silvestre AdWT (figura 3A). Estas
condiciones reproducen la situación que se encuentra en los tumores
sólidos. En cambio, los virus están atenuados en presencia de
oxígeno (normoxia). Para comprobar el grado de selectividad de los
virus, se infectaron células normales (IMR-90),
figura 3B. Las condiciones más parecidas a los tejidos sanos son
las células normales en normoxia, y en estas condiciones tanto
AdDHLuc como AdHLuc están atenuados (menos de un 30% de muerte
celular). Sin embargo, cuando las células normales se exponen a una
baja tensión de oxígeno, AdHLuc es más citopático que AdDHLuc. Esto
concuerda con el diseño de estos virus, ya que en el caso de AdHLuc
la hipoxia es ' capaz de desencadenar la replicación viral por
activación del promotor E1A, tanto en células tumorales como
normales. En cambio, el mecanismo adicional de seguridad de
AdDHLuc, consistente en la deleción del dominio CR2 del gen E1A,
atenúa al virus en células normales incluso en presencia de
hipoxia. En definitiva, los datos de la figura 3 sugieren que
AdDHLuc tiene una potencia citotóxica igual que AdHLuc y cercana a
AdWT sobre células tumorales, pero ventajosamente está fuertemente
atenuado en células
normales.
normales.
Para confirmar este punto se estudió el
comportamiento de los virus en fibroblastos humanos normales
WI-38 (ATCC CCL-75) y fibroblastos
WI38-VA13 (ATCC CCL-75.1), que han
sido malignizadas por la expresión del antígeno T de SV40, que
bloquea la ruta de pRB. Las células WI38-VA13 tienen
alterado el control del ciclo celular, y por tanto se espera que
el virus AdDHLuc no esté atenuado respecto a AdHLuc. Asimismo se
realizaron ensayos con células normales BJ (ATCC
CRL-2522; procedentes de fibroblastos primarios
humanos de piel).
En la figura 4 se muestran microfotografías de
fibroblastos normales WI-38 y malignizados
WI38-VA13 infectados con los distintos virus en
condiciones de hipoxia o normoxia. Las células que están sufriendo
el efecto citopático del virus se distinguen porque pierden
adherencia a la placa de cultivo y adquieren una morfología
redondeada. Como puede observarse, AdDHLuc es el virus que está más
atenuado en células normales, mientras que conserva su capacidad de
matar células malignas.
Estas observaciones se repitieron sobre otros
tipos de células normales, como células IMR-90 y
BJ, como se muestra en la figura 5.
Con el objetivo de estudiar con más detalle el
efecto citopático del virus AdDHLuc, se determinó la viabilidad de
células tumorales (Huh-7) y normales
(IMR-90) infectadas con distintas concentraciones
virales, tanto en condiciones de normoxia como de hipoxia (como se
ha descrito anteriormente).
Como puede observarse en la figura 6, la hipoxia
activó sensiblemente la citotoxicidad de AdDHLuc en células
tumorales, logrando un efecto similar al observado con AdWT. En
cambio, la activación en células normales fue menor, y AdDHLuc se
mostró sensiblemente atenuado respecto a AdWT.
Es importante señalar que en este tipo de
experimentos la disminución de viabilidad celular a dosis bajas es
dependiente de la amplificación viral, por lo que de una manera
indirecta este ensayo también refleja el control de la replicación
del virus.
Con el objetivo de analizar de modo directo el
control de la replicación de AdDHLuc, se infectaron células
Huh-7 con el virus en condiciones de normoxia o
hipoxia, y se cuantificó la producción de nuevas partículas
infectivas al cabo de los días.
Las células se sembraron, se infectaron y
crecieron de la misma manera que en los ensayos para evaluar el
efecto citopático. En este caso, a los 3 días desde la infección,
las células se lisaron mediante 3 ciclos de congelación-
descongelación y se cuantificaron las partículas infectivas
mediante dilución límite en células 293 o mediante
inmunohistoquímica con anticuerpos anti-adenovirus
(Adeno-X Rapad Titer Kit, BD Biosciences Clontech
Cat. No. K1653-1) siguiendo las instrucciones del
fabricante. El resultado se expresó como unidades infectivas por mL
(i.u./ml).
Como puede observarse en la figura 7, la hipoxia
activó la amplificación del virus AdDHLuc, mientras que no ocurre
lo mismo con AdWT, cuya replicación no sufrió cambios. Como control
negativo de replicación se incluyó en el experimento un adenovirus
defectivo portador del gen de la luciferasa
(Ad-CMV-Luc, Vector Biolabs Cat. No.
1000).
La localización del gen reportero luciferasa en
la región E3 del virus AdDHLuc permite un seguimiento de la
expresión de los genes exógenos introducidos en el virus. Al mismo
tiempo, la expresión de luciferasa se incrementa en respuesta a la
replicación viral, debido a la activación de los promotores tardíos
y al aumento del número de copias del genoma viral en la célula.
Por lo tanto, medir la actividad luciferasa es un indicador de la
replicación viral.
Con este fin, se sembraron células
Huh-7 y HaP-T1, se infectaron con
AdDHLuc y AdWTLuc (MOI de 10 virus/célula), y se cultivaron de la
misma manera que en los ensayos para evaluación del efecto
citopático. A los 2 días desde la infección, las células se lisaron
para medir la actividad de la Luciferasa mediante un kit comercial
(Luciferase Assay System, Promega Cat. No. E4030), siguiendo las
instrucciones del fabricante. La actividad se expresó como
RLU/\mug de proteína total (RLU: Relative Luciferase Units).
En la figura 8 se muestra como esta actividad
aumenta con hipoxia en células infectadas con AdDHLuc, mientras que
no ocurre lo mismo con AdWT.
En definitiva, los experimentos descritos en
este ejemplo 2 demuestran que todos los parámetros de actividad
estudiados para AdDHLuc se incrementan en condiciones de
hipoxia.
Para evaluar la actividad in vivo de los
adenovirus recombinantes se realizaron xenotransplantes de tumores
humanos en ratones atímicos (inmunodeprimidos) mediante inyección
subcutánea (1x10^{7} células en 150 \mul de suero salino) o
intrahepática (1,5x10^{6} células en 50 \mul de suero) de
células Huh-7. A los 20 días, se inyectó el virus a
ensayar (AdDHLuc, Ad-CMV-Luc y
AdWTLuc) mediante inyección intratumoral. A las 24 horas de la
inyección del virus se inició la medición de actividad luciferasa,
realizada diariamente durante 10 días. Para ello se administró el
sustrato luciferina por vía intraperitoneal (150 \mug/ml de PBS).
Gracias al gen reportero luciferasa, la cinética de expresión y la
biodistribución de los virus pueden monitorizarse en los animales
vivos midiendo la emisión de luz mediante una cámara luminométrica
de alta sensibilidad (In vivo imaging system, Xenogen). En estas
condiciones, la emisión de luz (fotones/segundo) responde a un
equilibrio entre la replicación viral y la muerte de las células
infectadas.
También se evaluó el crecimiento tumoral por
medición de los diámetros mayor (D) y menor (d). El volumen tumoral
se calculó aplicando la fórmula: V = D x (d)^{2}/2 y se
expresó en mm^{3}.
Como puede observarse en la figura 9A, un
adenovirus defectivo (incapaz de replicarse) como
Ad-CMV-Luc mantiene los niveles de
expresión iniciales durante la primera semana y luego inicia una
lenta disminución. En cambio, AdDHLuc mostró un incremento
importante en la actividad luciferasa durante los 4 primeros días.
Esto es compatible con la consecución de varios ciclos de
replicación en el tumor. En el caso de AdWTLuc, se observó una
expresión inicial muy intensa y un incremento al segundo día,
seguido de una disminución muy pronunciada. Esto puede deberse a la
inducción de un efecto citopático más rápido en las células
infectadas.
Para comprobar el comportamiento de AdDHLuc en
tumores hepáticos, se inyectaron las células Huh-7
en el hígado de los ratones y posteriormente se administró el
virus (10^{9} i.u.).
En la figura 9B puede observarse como se
consiguen niveles de expresión muy elevados y se confirma el
incremento en los primeros días para después estabilizarse e
iniciar un descenso lento.
En resumen, estos datos indican que AdDHLuc es
un CRAd capaz de servir como vector de expresión de genes exógenos
con eficacia superior a los adenovirus no replicativos.
<110> PROYECTO DE BIOMEDICINA CIMA
S.L.
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\vskip0.400000\baselineskip
<120> NUEVOS ADENOVIRUS RECOMBINANTES DE
REPLICACIÓN CONDICIONADA (CRAd)
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\vskip0.400000\baselineskip
<130> FIMA 05019
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\vskip0.400000\baselineskip
<160> 18
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\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn version 3.1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> SEQ. ID. NO: 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 601
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Quimérico
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> SEQ. ID. NO: 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 362
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Quimérico
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> SEQ ID NO: 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 51
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
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<213> Artificial
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<400> 3
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptactgtaact ataacggtcc taaggtagcg tggtaccatc cggacaaagc c
\hfill51
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> SEQ ID NO: 4
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<211> 32
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<212> DNA
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<213> Artificial
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<400> 4
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\hskip-.1em\dddseqskiptaagtattta aatggcgagg gctcgatccc gc
\hfill32
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<210> SEQ ID NO: 5
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<211> 18
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<212> DNA
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<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcgaagatctg actccaag
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> SEQ ID NO: 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgatccttgga gtcagatctt
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> SEQ ID NO: 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptagtgtggcg gaagtgtgat gttg
\hfill24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> SEQ ID NO: 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptcttcggtaa taacacctcc gtgg
\hfill24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> SEQ ID NO: 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 35
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaaggactagt ttcgcgccct ttctcaaatt taagc
\hfill35
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> SEQ ID NO: 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 65
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> SEQ ID NO: 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 44
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipacgtaatcta tgtcgggtgc ggagaaagag gtaatgaaat ggca
\hfill44
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> SEQ ID NO: 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 44
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptgccatttca ttacctcttt ctccgcaccc gacatagatt acgt
\hfill44
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> SEQ ID NO: 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcctatatcga tagcct
\hfill16
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> SEQ ID NO: 14
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 14
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaggctatcga tatagg
\hfill16
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> SEQ ID NO: 15
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 36
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 15
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptcagtattcg aatcgcgact cttgagtgcc agcgag
\hfill36
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> SEQ ID NO: 16
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 16
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipatcgatcacc tccggtacaa ggtttgg
\hfill27
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> SEQ ID NO: 17
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 52
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 17
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaaccttgtac cggaggtgat cgatccaccc agtgacgacg aggatgaaga gg
\hfill52
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> SEQ ID NO: 18
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 45
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaaggcgttaa ccacacacgc aatcacaggt ttacacctta tggcc
\hfill45
Claims (16)
1. Un adenovirus recombinante de replicación
condicionada, caracterizado porque comprende:
- a)
- un promotor operativamente unido al gen adenoviral E1A que comprende al menos un elemento de respuesta a hipoxia HRE;
- b)
- un promotor operativamente unido al gen adenoviral E4 que comprende al menos un elemento de respuesta al factor E2F;
- c)
- un gen adenoviral E1A delecionado en el dominio CR2; y
- d)
- un gen exógeno de interés.
2. Un adenovirus recombinante según la
reivindicación 1, caracterizado porque dicho promotor
operativamente unido al gen adenoviral E1A comprende 9 copias en
tándem de un elemento de respuesta a hipoxia.
3. Un adenovirus recombinante según una
cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, caracterizado
porque dichos elementos de respuesta a hipoxia se derivan del
promotor del factor de crecimiento del endotelio vascular (VEGF)
humano.
4. Un adenovirus recombinante según una de las
reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque dicho promotor
operativamente unido al gen adenoviral E1A comprende la SEQ. ID.
NO: 1.
5. Un adenovirus recombinante según una de las
reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque dicho promotor
de respuesta E2F-1 comprende la SEQ. ID. NO: 2.
6. Un adenovirus recombinante según una
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizada
porque dicha deleción en el dominio CR2 es una deleción
Delta24.
7. Un adenovirus recombinante según una de las
reivindicaciones 1 a 6, caracterizado porque comprende:
- a)
- un promotor operativamente unido al gen adenoviral E1A de secuencia SEQ ID NO: 1;
- b)
- un promotor de respuesta E2F-1 operativamente unido al gen adenoviral E4 de secuencia SEQ. ID. NO: 2;
- c)
- un gen adenoviral E1A delecionado en el dominio CR2 con la deleción Delta24; y
- d)
- un gen exógeno de interés.
8. Un adenovirus recombinante según una
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizado
porque dicho gen exógeno es un gen reportero.
9. Un adenovirus recombinante según la
reivindicación 8, caracterizado porque dicho gen reportero
codifica la luciferasa.
10. Un adenovirus recombinante según una
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizado
porque dicho gen exógeno es un gen suicida.
11. Un adenovirus recombinante según la
reivindicación 10, caracterizado porque dicho gen exógeno es
el gen de la timidina-kinasa.
12. Un adenovirus recombinante según una
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizado
porque dicho gen exógeno es un gen terapéutico.
13. Un adenovirus recombinante según la
reivindicación 12, caracterizado porque dicho gen exógeno es
el gen de la interleuquina 12.
14. Una célula hospedadora que comprende un
adenovirus recombinante descrito en una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 13.
15. Un procedimiento para la propagación in
vitro de un adenovirus recombinante según una de las
reivindicaciones 1 a 13, caracterizado porque comprende:
- a)
- cultivar una célula hospedadora que contenga dicho adenovirus recombinante en condiciones que permitan la expresión del adenovirus; y
- b)
- aislar y purificar el adenovirus.
16. Una composición caracterizada porque
comprende un adenovirus recombinante descrito en una de las
reivindicaciones 1 a 13 y un excipiente farmacéuticamente
aceptable.
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| ES200503047A ES2276623B1 (es) | 2005-12-12 | 2005-12-12 | Nuevos adenovirus recombinantes de replicacion condicionada (crad). |
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Family Applications (1)
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| LT2379586T (lt) * | 2008-12-22 | 2017-03-10 | Targovax Oy | Auglio audinius ardantys adenovirusiniai vektoriai ir su jais susiję būdai ir panaudojimas |
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-
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- 2006-12-07 WO PCT/ES2006/000676 patent/WO2007068772A1/es active Application Filing
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| CUEVAS Y. et al. Specific Oncolytic Effect of a New Hypoxia- Inducible Factor-Dependent Replicative Adenovirus on von Hippel- Lindau-Defective Renal Cell Carcinomas. Cancer Research, 15.10.2003, vol. 63, nº 20, páginas 6877-84. * |
| JOHNSON, L. et al. Selectively replicating adenoviruses targeting deregulated E2F activity are potent systemic antitumor agents. Cancer Cell, mayo 2002, vol. 1, nº 4, páginas 325-37. * |
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| WO2007068772A1 (es) | 2007-06-21 |
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