JP2006347982A - Ｆ−９１６３６化合物及びその製造方法 - Google Patents

Abstract

【課題】糸状菌培養液中から抗菌活性を有する新規化合物を見出し、その化合物を生産するアスペルギルス属に属する微生物を単離同定し、該微生物の培養物を用いた該化合物の製造法を提供する。
【解決手段】
下記式（Ｉ）で表される化合物又はその塩。

【選択図】なし

Description

本発明は抗菌剤として有用な新規化合物Ｆ−９１６３６Ａ及びＦ−９１６３６Ｂまたはそれらの塩、該化合物の製造方法、該化合物を生産する微生物、該化合物を含有する医薬等に関する。

従来、細菌感染症の予防および治療には各種ベータラクタム抗生物質、アミノ配糖体、マクロライド、グリコペプチド、キノロンなどが使われてきたが、最近これらの抗生物質に耐性を示す感染菌が増加しており（非特許文献１）、従来のタイプとは異なる抗生物質が渇望されている。

現在までにＦ−９１６３６化合物と同様の炭素骨格を有する抗菌物質は知られていない。
ワルシュ（Ｗａｌｓｈ，Ｃ）著、「アンチバイオティクス：アクションズ・オリジンズ・レジスタンス（Antibiotics : actions, origins, resistance）」、アメリカン・ソサエティ・フォー・マイクロバイオロジー・プレス（American Society for Microbiology press）版、２００３年

本発明者らは、糸状菌培養液中から抗菌活性を有する新規化合物Ｆ−９１６３６Ａ及びＦ−９１６３６Ｂを見出し、該化合物を生産するアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｌｌｕｓ）属に属する微生物を単離同定し、該微生物の培養物を用いた該化合物の製造方法を確立した。更に、該化合物が病原菌に対し抗菌活性を有することを見出し、本発明を完成した。

本発明は、以下に示される化合物又はその塩に関する。
（１） 下記式（Ｉ）で表される化合物又はその塩。

（２） 下記式（II）で表される化合物又はその塩。

（３） 下記の１）乃至９）の物理化学的性質を示す化合物又はその塩：
１）性質：酸性、黄色粉末；
２）溶解性：ジメチルスルホキシド、メタノールに可溶；
３）分子式：Ｃ_２７Ｈ_２４Ｏ_９；
４）分子量：４９２；
５）紫外線吸収スペクトル：λ_max ｎｍ（ε）
メタノール溶液中で測定した紫外線吸収スペクトルは、次の通りである。
３９８ (１４４００)、２２５ (４５８００)；
６）赤外線吸収スペクトル（ＫＢｒ）：ν_max ｃｍ^−１
KBｒディスク法で測定した赤外線吸収スペクトルは、次の通りである：
３３９８、１７１８、１６２６、１５４４、１５１７、１４６１、１４０４、１３２９、１３１１、１２０１、１１０８；
７） ¹Ｈ−核磁気共鳴スペクトル； δ (ppm)
重メタノール溶液中で測定した核磁気共鳴スペクトル（５００MHz）は、次の通りである。（ＴＭＳのシグナルを0.00 ppmとした。）
1.47 (3H, s), 1.76 (3H, dd, J=1.9, 7.0 Hz), 2.16 (3H, s), 2.17 (3H, s), 5.06 (1H, d, J=13.2), 5.09 (1H, d, J=13.2 Hz), 5.30 (1H, s), 5.83 (1H, dq, J=1.9, 15.4 Hz), 6.27 (1H, s), 6.29 (1H, s), 6.47 (1H, dq, J=7.0, 15.4 Hz)
８）^１３Ｃ−核磁気共鳴スペクトル； δ (ppm)
重メタノール溶液中で測定した核磁気共鳴スペクトル（１２５MHz）は、次の通りである。（重メタノールのシグナルを49.0 ppmとした。）
18.5, 23.3, 23.6, 24.8, 55.7, 65.3, 77.4, 105.3, 112.1, 114.1, 116.0, 116.4, 120.3, 125.8, 127.2, 128.4, 132.6, 133.3, 136.4, 141.4, 141.7, 146.1, 146.3, 155.7, 163.7, 194.5, 210.4
９）比旋光度；
［α］_D ^２６ １４５° （ｃ １．０、メタノール）。

（４） 下記の１）乃至９）の物理化学的性質を示す化合物又はその塩：
１）性質：酸性、黄色粉末；
２）溶解性：ジメチルスルホキシド、メタノールに可溶；
３）分子式：Ｃ_２７Ｈ_２６Ｏ_９；
４）分子量：４９４；
５）紫外線吸収スペクトル：λ_max ｎｍ（ε）
メタノール溶液中で測定した紫外線吸収スペクトルは、次の通りである。
３６７ (１０２００)、２２３ (４４８００)；
６）赤外線吸収スペクトル（ＫＢｒ）：ν_max ｃｍ^−１
KBｒディスク法で測定した赤外線吸収スペクトルは、次の通りである：
３４０８、１７２０、１６１４、１５１８、１４６１、１４００、１３１５、１２３８、１２２３、１１９９、１１０７；
７） ¹Ｈ−核磁気共鳴スペクトル； δ (ppm)
重メタノール溶液中で測定した核磁気共鳴スペクトル（５００MHz）は、次の通りである。（ＴＭＳのシグナルを0.00 ppmとした。）
0.81 (3H, t, J=7.3 Hz), 1.46 (2H, sextet, J=7.3 Hz), 1.47 (3H, s), 2.13 (2H, t, J=7.3 Hz), 2.19 (3H, s), 2.20 (3H, s), 5.05 (1H, d, J=13.2), 5.09 (1H, d, J=13.2 Hz), 5.22 (1H, s), 6.28 (1H, s), 6.31 (1H, s)
８）^１３Ｃ−核磁気共鳴スペクトル； δ (ppm)
重メタノール溶液中で測定した核磁気共鳴スペクトル（１２５MHz）は、次の通りである。（重メタノールのシグナルを49.0 ppmとした。）
13.7, 21.2, 23.4, 23.7, 24.7, 36.8, 55.7, 65.5, 77.3, 103.5, 112.0, 113.9, 116.0, 116.4, 119.3, 127.1, 128.4, 132.7, 133.3, 141.4, 141.7, 146.2, 146.3, 155.3, 172.0, 194.7, 210.5
９）比旋光度；
［α］_D ^３１ ８５° （ｃ １．０、メタノール）。

また、本発明は、以下にしめされる上記化合物の製造方法に関する。

（５） アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属に属する（１）乃至（４）のいずれか１項に記載の化合物の生産菌を培養し、その培養物より（１）乃至（４）のいずれか１項に記載の化合物を回収することを特徴とする、（１）乃至（４）のいずれか１項に記載の化合物の製造方法。
（６） アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕs）属に属する（１）乃至（４）のいずれか１項に記載の化合物の生産菌がアスペルギルス・ベルシコロル（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒ） ＳＡＮＫ ２１００５株（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０３３３）であることを特徴とする、（５）に記載の製造方法。

さらに、本発明は、以下に示される微生物に関する。

（７） アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕs）属に属する（１）乃至（４）のいずれか１項に記載の化合物を生産する微生物。

（８） アスペルギルス・ベルシコロル（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒ） ＳＡＮＫ ２１００５株（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０３３３）である（７）に記載の微生物。

またさらに、本発明は以下に示される、上記化合物又はその塩を含有する医薬に関する。

（９） （１）乃至（４）のいずれか１項に記載の化合物又はその薬理学的に許容される塩を有効成分として含有する医薬。
（１０） 感染症治療薬及び／または予防薬である（９）に記載の医薬。

本明細書において、「Ｆ−９１６３６Ａ」とは、上記式（Ｉ）で表される構造からなる化合物、又は、上記（３）に記載の物理化学的性質を有する化合物をいう。また、「Ｆ−９１６３６B」とは、上記式（ＩＩ）で表される構造からなる化合物、又は、上記（４）に記載の物理化学的性質を有する化合物をいう。本明細書では、Ｆ−９１６３６ＡとＦ−９１６３６Ｂを総称して「Ｆ−９１６３６化合物」といい、また「本発明の化合物」と呼ぶこともある。

Ｆ−９１６３６化合物は、種々の異性体を有する。本発明においては、これらの異性体がすべて単一の式で表されているが、ラセミ化合物等それらの異性体ならびにそれらの異性体の混合物も全てＦ−９１６３６化合物に含まれる。立体特異的合成法、あるいは光学活性化合物を原料化合物とする合成法により、本発明の化合物の各異性体を直接製造することができる。また、先ず各異性体の混合物を製造し、次いで該混合物より所望の各異性体を公知の手法を用いて分離することができる。

Ｆ−９１６３６化合物はフェノール性水酸基等を有し、当業者に周知の方法を用いて塩にすることができる。本発明には、このようなＦ−９１６３６化合物の塩も包含される。Ｆ−９１６３６化合物の塩としては特に限定はないが、医薬の有効成分として用いられる場合は薬理学的に許容される塩が選択される。また、Ｆ−９１６３６化合物の塩が医薬以外の用途に用いられる場合、例えば中間体として使用される場合には、該用途に用いることのできるものであれば特に限定されない。Ｆ−９１６３６化合物の塩としては、例えば、アンモニウム塩のような無機塩；ナトリウム塩、カリウム塩、リチウム塩のようなアルカリ金属塩；カルシウム塩、マグネシウム塩のようなアルカリ土類金属塩；アルミニウム塩、鉄塩、亜鉛塩、銅塩、ニッケル塩、コバルト塩等の金属塩；ｔ−オクチルアミン塩、ジベンジルアミン塩、モルホリン塩、グルコサミン塩、フェニルグリシンアルキルエステル塩、エチレンジアミン塩、Ｎ−メチルグルカミン塩、グアニジン塩、ジエチルアミン塩、トリエチルアミン塩、ジシクロヘキシルアミン塩、Ｎ，Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミン塩、クロロプロカイン塩、プロカイン塩、ジエタノールアミン塩、Ｎ−ベンジル−フェネチルアミン塩、ピペラジン塩、テトラメチルアンモニア塩、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン塩のような有機塩等のアミン塩；および、グリシン塩、リジン塩、アルギニン塩、オルニチン塩、アスパラギン塩のようなアミノ酸塩を挙げることができる。Ｆ−９１６３６化合物の好適な塩としては、薬理学的に許容される塩として好ましく使用されるもの、すなわち、ナトリウム塩、カリウム塩、リチウム塩、カルシウム塩およびマグネシウム塩等を挙げることができる。

また、Ｆ−９１６３６化合物及び／又はその塩は溶剤和物になり得る。例えば、大気中での放置、再結晶などを経て、吸着水の付加、水和物化等が時に生じ得る。それらの溶剤和物も本発明に包含される。

さらに、本発明は、生体内において代謝されてＦ−９１６３６化合物及び／又はその塩に変換される化合物、いわゆるプロドラッグも全て包含する。

１．Ｆ−９１６３６化合物生産菌
Ｆ−９１６３６化合物を生産する微生物としては、Ｆ−９１６３６化合物を生産する限り特に限定されるものではないが、例えば、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属に属する糸状菌等を挙げることができ、好適にはアスペルギルス・ベルシコロル（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒ）であり、より好適にはアスペルギルス・ベルシコロル ＳＡＮＫ ２１００５株（以下、単に「ＳＡＮＫ ２１００５株」という。）である。ＳＡＮＫ ２１００５株は、茨城県において採集した植物試料より分離された。

ＳＡＮＫ ２１００５株をクリックの文献(Klich, M. A. 2002. Identification of common Aspergillus species. The Centraalbureau voor Schimmelcultures, Utrecht)に従い、４種類の培地（ＣＹＡ培地、ＭＥＡ培地、ＣＹ２０Ｓ培地、ＣＺ培地）に接種して、菌学的性状を観察した。４種類の培地（ＣＹＡ培地、ＭＥＡ培地、ＣＹ２０Ｓ培地、ＣＺ培地）の組成は以下の通りである。
［ＣＹＡ培地｛ザペックイーストアガー（Ｃｚａｐｅｋ Ｙｅａｓｔ Ｅｘｔｒａｃｔ Ａｇａｒ） 培地｝］
（Ｋ_２ＨＰＯ_４ １．０ ｇ、＊ザペック濃縮液 １０ ｍｌ、イーストエキス ５ ｇ、シュークロース ３０ ｇ、寒天 １５ ｇ、蒸留水 １０００ ｍｌ）
＊ザペック濃縮液（ＮａＮＯ_３ ３０ ｇ、ＫＣｌ ５ ｇ、ＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ ５ ｇ、ＦｅＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ ０．１ ｇ、ＺｎＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ ０．１ ｇ、ＣｕＳＯ_４・５Ｈ_２Ｏ ０．０５ ｇ、蒸留水 １００ ｍｌ）
［ＭＥＡ培地｛モルトエキスアガー（Ｍａｌｔ Ｅｘｔｒａｃｔ Ａｇａｒ）培地｝］
（モルトエキス ２０ ｇ、ペプトン １ ｇ、グルコース ２０ ｇ、寒天 ２０ ｇ、蒸留水 １０００ ｍｌ）
［ＣＹ２０Ｓ培地｛２０％シュークロースザペックイーストアガー（Ｃｚａｐｅｋ Ｙｅａｓｔ Ｅｘｔｒａｃｔ Ａｇａｒ ｗｉｔｈ ２０％ Ｓｕｃｒｏｓｅ）培地｝］
（Ｋ_２ＨＰＯ_４ １．０ ｇ、＊ザペック濃縮液 １０ ｍｌ、イーストエキス ５ ｇ、シュークロース ２００ ｇ、寒天 １５ ｇ、蒸留水 １０００ ｍｌ）
［ＣＺ培地｛ザペックドックスアガー（Ｃｚａｐｅｋ Ｄｏｘ Ａｇａｒ）培地｝］
（＊ザペック濃縮液 １０ ｍｌ、Ｋ_２ＨＰＯ_４ １．０ ｇ、シュークロース ３０ ｇ、寒天 １７．５ ｇ、蒸留水 １０００ ｍｌ）。

色調の表示は「メチューン・ハンドブック・オブ・カラー」 （Kornerup, A. & Wanscher, J. H. 1978. Methuen handbook of colour (3rd. edition). Erye Methuen, London）に従った。

菌学的性状
ＣＹＡ培地上でのコロニーは、２５℃、７日の培養で直径２２−２４ ｍｍである。コロニーは放射状と同心円状の溝を有する。分生子形成は培養１０日目以降に旺盛で、分生子形成部はビロード状、ダルグリーン（２７Ｄ４）からグレイッシュグリーン（２６Ｅ６）を呈する。菌糸体は白色を呈する。浸出液が観察され、無色である。菌核や可溶性色素は観察されない。裏面はペールイエロー（３Ａ３）を呈する。

ＭＥＡ培地上でのコロニーは、２５℃、７日の培養で直径１４−１５ ｍｍである。分生子形成部はビロード状、グレイッシュグリーン（２７Ｄ５−２６Ｅ６）を呈する。菌糸体は目立たない。浸出液は観察されない。裏面はライトイエロー（４Ａ５）を呈する。

ＣＹ２０Ｓ培地上でのコロニーは、２５℃、７日の培養で直径２９−３０ ｍｍである。分生子形成部はビロード状、グレイッシュグリーン（２８Ｅ５）を呈する。浸出液は観察されない。裏面はペールイエロー（４Ａ３）を呈し、ペールレッド（８Ａ３）の可溶性色素が観察される。

ＣＺ培地上でのコロニーは、２５℃、７日の培養で直径９−１６ ｍｍである。分生子形成部はグレイッシュグリーン（２７Ｂ３）で気菌糸が多い。裏面はペールレッド（８Ａ３）を呈する。３７℃では生育しない。分生子頭は放射状である。分生子柄は４００−６００ × ５−７ μｍ、平滑、無色である。頂のうは幅１０−１６ μｍ、洋なし形からへら形である。アスペルジラは二列である。メトレは４−５．５ × ３−５ μｍ、頂のうの全体に形成される。フィアライドは４−５ × ２−３ μｍである。矮小な分生子頭が多く形成され、ペニシリ形である。分生子は直径２−３ μｍ、球形から亜球形、微細な粗面である。ヒューレ細胞を有し、直径１２−１８ μｍである。

以上の菌学的性状より、本菌に該当する菌を検索したところ、クリックの文献(Klich, M. A. 2002. Identification of common Aspergillus species. The Centralbureau vor Schimmelcultures, Utrecht)に記載されているアスペルギルス・ベルシコロルの性状に、ほぼ一致した。よって、ＳＡＮＫ ２１００５株をアスペルギルス・ベルシコロル（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒ）と同定した。なお、ＳＡＮＫ ２１００５株は、アスペルギルス・ベルシコロル ＳＡＮＫ ２１００５株として、２００５年５月１１日付で日本国茨城県つくば市東１−１−１の独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託され、受託番号 ＦＥＲＭ ＢＰ−１０３３３を付与された。

２．培養
周知の通り、真菌類は自然界において、または人工的な操作（例えば、紫外線照射、放射線照射、化学薬品処理等）により、変異を起こしやすく、本発明の提供するＳＡＮＫ ２１００５株も同様である。本発明において、ＳＡＮＫ ２１００５株は、Ｆ−９１６３６化合物を生産する性質を有する限り、その全ての変異株を包含する。また、これらの変異株の中には、遺伝的方法、たとえば組み換え、形質導入、形質転換等によりえられたものも包含される。即ち、Ｆ−９１６３６化合物を生産する限り、ＳＡＮＫ ２１００５株、それらの変異株およびそれらと明確に区別されない菌株は、全てＳＡＮＫ ２１００５株に包含される。

Ｆ−９１６３６化合物の製造を目的とした該化合物生産菌の培養は、通常発酵生成物を生産するために使用される培地を用いて行うことができる。このような培地には、微生物が同化し得る炭素源、窒素源および無機塩が含まれる。

炭素源としては、グルコース、フルクトース、マルトース、シュークロース、マンニトール、グリセリン、デキストリン、澱粉、オート麦、ライ麦、ジャガイモ、トウモロコシ粉、綿実油、糖蜜、クエン酸、酒石酸等を単一に、あるいは併用して用いることができる。培地の炭素源含量は、通常、培地量の１乃至１０重量％で変量する。

窒素源としては、蛋白質若しくはその加水分解物を含有する物質又は無機塩を用い、大豆粉、フスマ、落花生粉、綿実油、カゼイン加水分解物、ファーマミン、魚粉、コーンスチープリカー、ペプトン、肉エキス、イースト、イーストエキス、マルトエキス、ゼラチン、硝酸ナトリウム、硝酸アンモニウム、硫酸アンモニウム等を例示することができる。これらの窒素を単一であるいは併用して培地に含有せしめる場合の量は、通常培地量の０．２乃至１０重量％の範囲で変量する。

栄養無機塩としては、ナトリウム、アンモニウム、カルシウム、フォスフェート、サルフェート、クロライド、カーボネート等のイオンを得ることのできる通常の塩類を広く用いることができる。カリウム、カルシウム、コバルト、マンガン、鉄、マグネシウム等の金属も培地に微量含まれ得る。
液体培養に際しては、シリコン油、植物油、界面活性剤等が、消泡剤として使用される。

Ｆ−９１６３６化合物の製造を目的として該化合物生産菌を液体培養する際の液体培地のｐＨは、特に限定されるものではないが、通常４．０乃至７．０である。

Ｆ−９１６３６化合物生産菌の生育温度は、特に限定されるものではないが、通常１５乃至３５℃であり、好適には２０乃至３３℃である。また、Ｆ−９１６３６化合物の製造を目的として該化合物生産菌を培養する際の温度は、特に限定されないが、通常２０乃至３３℃であり、好適には２０℃乃至２６℃である。Ｆ−９１６３６化合物の製造を目的としてＳＡＮＫ ２１００５株を培養する際のより好適な温度は、２３℃である。

Ｆ−９１６３６化合物は、該化合物生産菌を好気的な条件下で培養することにより製造することができる。好気的条件下の培養方法としては、通常当該分野において使用される好気的培養方法であれば特に限定されないが、例えば、固体培養法、振とう培養法、通気攪拌培養法等を挙げることができる。

Ｆ−９１６３６化合物を比較的大量に製造するための該化合物生産菌の培養は、通常、小規模な培養から開始し、段階的に培養規模を拡大することが好ましい。まず、少量の種培地を用いた前培養から初め、段階的に培養の規模を拡大し、多量の栄養培地に必要量の前培養液を接種することにより本培養を行うことができる。例えば、ＳＡＮＫ ２１００５株のスラントから、少量の種培地を入れた三角フラスコへ該株を接種し、２３℃にて数日間振盪培養を行い、該株を十分成長させる。必要に応じ、該前培養の規模を段階的に拡大した後、得られた培養物の全量又は必要量を栄養培地へ接種し、本培養を行う。

Ｆ−９１６３６化合物生産菌を大量に培養するに際し、攪拌機又は通気装置を有するタンクを使用すれば、本培養用の栄養培地をタンクの中で調製し、滅菌することが可能であり好ましい。通常、栄養培地の滅菌温度は１２１℃であり、滅菌後培地が十分冷却してから前培養物を接種し、前述の温度にて通気攪拌培養を行う。

３．Ｆ−９１６３６化合物の回収
培養終了後、珪藻土等を助剤とするろ過操作又は遠心分離操作により、培養物を可溶性画分（培養上清）および不溶性画分（菌体）に分別し、次いで得られた各画分中に存在するＦ−９１６３６化合物を、その物理化学的性状を利用して通常用いられる手法により抽出精製することによってＦ−９１６３６化合物を回収することができる。例えば、以下のような分離精製操作を挙げることができる。

前述の培養により得られるＦ−９１６３６化合物生産菌の培養上清を、ｎ−ブタノール、酢酸エチルなど水と混和しない有機溶媒の１つ又は２つ以上と混合し、得られた有機層画分からＦ−９１６３６化合物を精製することができる。

得られた有機層画分を、各種吸着用樹脂を用いたクロマトグラフィーに供することができる。吸着剤としては、活性炭、アンバーライトＸＡＤ−２、ＸＡＤ−４（以上ローム・アンド・ハース社製）、ダイヤイオンＨＰ−１０、ＨＰ−２０、ＨＰ−５０、ＣＨＰ２０Ｐ（以上三菱化学（株）社製）等を挙げることができる。前記の有機層画分をこれらの吸着剤と接触させてＦ−９１６３６化合物を吸着せしめた後、メタノール水、アセトン水等の含水溶媒を用いて所望のＦ−９１６３６化合物を溶出することにより、Ｆ−９１６３６化合物含有画分を得ることができる。反対に、前記の有機画分を、不純物を吸着させる目的で通常用いられる公知の吸着剤と接触させて不純物を吸着せしめ、所望のＦ−９１６３６化合物を素通り画分中に回収することによりＦ−９１６３６化合物含有画分を得ることもできる。

得られたＦ−９１６３６化合物含有画分を、イオン交換クロマトグラフィーに供することができる。イオン交換樹脂としては、ダウエックス ５０Ｗｘ４、ダウエックス１ｘ２、ダウエックス ＳＢＲ−Ｐ（以上、ダウ・ケミカル社製）等を挙げることができる。Ｆ−９１６３６化合物含有画分をイオン交換樹脂と接触させてＦ−９１６３６化合物を吸着せしめた後、塩酸、アンモニア等の溶媒を用いて所望のＦ−９１６３６化合物を溶出することができる。反対に、前記の抽出物をこれらのイオン交換樹脂と接触させて不純物を吸着せしめ、所望のＦ−９１６３６化合物を素通り画分中に回収することもできる。

得られたＦ−９１６３６化合物含有画分を、さらに、シリカゲル、マグネシウム−シリカゲル系のフロリジル等の担体を用いた吸着カラムクロマトグラフィー、薄層クロマトグラフィー、ＴＳＫゲルトヨパールＨＷ−４０Ｆ（登録商標、トーソー（株）社製）、セファデックスＬＨ−２０（登録商標、アマシャムバイオサイエンス社製）等を用いた分配カラムクロマトグラフィー、コスモシル１４０Ｃ１８（登録商標、ナカライテスク社製）等を用いた逆相カラムクロマトグラフィー、順相もしくは逆相カラムを用いたＨＰＬＣ等により精製し、所望のＦ−９１６３６化合物を単離することができる。該精製工程において、前記のカラム分離又はクロマトグラフィー操作は単独で用いることもできるし、二つ以上の操作を組み合わせて用いてもよい。

本発明のＦ−９１６３６化合物を精製する際の、各精製工程における該物質の挙動は、例えば、次の条件によるＨＰＬＣにより追跡することができる。
［Ｆ−９１６３６化合物を検出するためのＨＰＬＣの条件］
分離カラム： ＳｕｎＦｉｒｅ Ｃ１８（５ μｍ、φ４．６ × １５０ ｍｍ： Ｗａｔｅｒｓ社製）
移動相： アセトニトリル：０．３％トリエチルアミンリン酸緩衝液（ｐＨ３）＝４：６
流速： １．０ ｍｌ／分
検出波長： ２５４ ｎｍ
保持時間： Ｆ−９１６３６Ａ：５．５分、Ｆ−９１６３６Ｂ：６．２分。

４．Ｆ−９１６３６化合物の作用
本発明は、Ｆ−９１６３６化合物又はその塩を含むことからなる医薬組成物、並びに、該物質を有効成分として含有する細菌感染症の治療又は予防剤を提供する。

本発明のＦ−９１６３６化合物又はその塩は、医薬としてヒト又はヒト以外の動物に投与されるに際し、種々の形態をとり得る。その投与形態は、製剤、年齢、性別、疾患等に依存する。例えば、錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、シロップ剤、液剤、懸濁剤、乳剤、顆粒剤、カプセル剤等は経口投与される。注射剤等は静脈内投与、筋肉内投与、皮内投与、皮下投与又は腹腔内投与される。坐剤は直腸内投与される。軟膏等は外用剤として使用される。

Ｆ−９１６３６化合物を有効成分として含有する医薬製剤は、常法に従い、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、溶解剤、矯味矯臭剤、コーティング剤等、医薬製剤分野において通常使用し得る公知の補助剤を用いて製造することができる。

錠剤の形態に成形するに際しては、担体として当該分野で公知のものを広く使用することができ、例えば、乳糖、白糖、塩化ナトリウム、ブドウ糖、尿素、澱粉、炭酸カルシウム、カオリン、結晶セルロース、珪酸等の賦形剤、水、エタノール、プロパノール、単シロップ、ブドウ糖液、澱粉液、ゼラチン溶液、カルボキシメチルセルロース、セラック、メチルセルロース、リン酸カリウム、ポリビニルピロリドン等の結合剤、乾燥澱粉、アルギン酸ナトリウム、カンテン末、ラミナラン末、炭酸水素ナトリウム、炭酸カルシウム、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル類、ラウリル硫酸ナトリウム、ステアリン酸モノグリセリド、澱粉、乳糖等の崩壊剤、白糖、ステアリン、カカオバター、水素添加油等の崩壊抑制剤、第四級アンモニウム塩基、ラウリル硫酸ナトリウム等の吸収促進剤、グリセリン、澱粉等の保湿剤、澱粉、乳糖、カオリン、ベントナイト、コロイド状珪酸等の吸着剤、精製タルク、ステアリン酸塩、硼酸末、ポリエチレングリコール等の滑沢剤等を挙げることができる。錠剤は、必要に応じ、通常の剤皮を施した錠剤、例えば、糖衣錠、ゼラチン被包錠、腸溶被錠、フィルムコーティング錠あるいは二重錠、多重錠とすることができる。

丸剤の形態に成形するに際しては、担体として当該分野で公知のものを広く使用することができ、例えば、ブドウ糖、乳糖、澱粉、カカオ脂、硬化植物油、カオリン、タルク等の賦形剤、アラビアゴム末、トラガント末、ゼラチン、エタノール等の結合剤、ラミナラン、カンテン等の崩壊剤を挙げることができる。

注射剤として調製される場合、液剤及び懸濁剤は殺菌され、且つ血液と等張であることが好ましく、これら液剤、乳剤および懸濁剤の形態に形成するに際しては、希釈剤として当該分野において公知のものを広く使用することができ、例えば、水、エチルアルコール、プロピレングリコール、エポキシ化イソステアリルアルコール、ポリオキシ化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル類等を挙げることができる。等張を維持するために充分な量の食塩、ブドウ糖又はグリセリンを含有せしめてもよい。溶解補助剤、緩衝剤、無痛化剤糖、着色剤、保存剤、香料、風味剤、甘味剤、他の薬剤等を含有せしめてもよい。

なお、注射剤を静脈内投与する場合、単独で、ブドウ糖、アミノ酸等の通常の補液と混合して、又は、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル類等とのエマルジョンとして投与される。

坐剤の形態に成形するに際しては、担体として当該分野で公知のものを広く使用することができ、例えばポリエチレングリコール、カカオ脂、高級アルコール、高級アルコールのエステル類、ゼラチン、半合成グリセライド等を挙げることができる。

軟膏等の外用剤の形態に成形するに際しては、賦型剤として、疎水性基剤（油脂性軟膏基剤）、吸水基剤、親水性基剤（クリーム）ならびに水溶性基剤（非グリース製軟膏基剤）のいずれか一つに属する、当該分野で公知のものを広く使用することができる。

上述の医薬製剤に含有せしめるＦ−９１６３６化合物又はその塩の量は、特に限定されないが、上限は３０乃至７０重量％、下限は１重量％であり、好適な範囲は１乃至３０重量％である。

Ｆ−９１６３６化合物又はその塩の投与量は、症状、年齢、体重、投与方法、剤形等に依存するが、通常成人に対して１日当たり投与するＦ−９１６３６化合物又はその塩の量は、上限が１００乃至１０００ ｍｇ、下限が１乃至１０ ｍｇであり、好適な範囲は１０乃至１００ ｍｇである。

Ｆ−９１６３６化合物又はその塩の投与回数は、数日に１回、１日１回、又は１日複数回である。

本発明の提供するＦ−９１６３６化合物は抗菌作用を示し、該化合物又はその塩を有効成分として含有する医薬は各種細菌感染症の予防薬または治療薬として有用である。

次に、実施例、試験例、製剤例を挙げて本発明を更に詳細に説明するが、本発明はそれらに限定されるものではない。

（実施例１）．Ｆ−９１６３６化合物生産菌の培養
アスペルギルス・ベルシコロル（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒ）ＳＡＮＫ ２１００５株を培地組成−２で示される種培地３０ ｍｌを含む１００ ｍｌ容三角フラスコ１本に、スラントより接種し、回転振盪培養機を用いて、２１０ ｒｐｍ、２３℃で９６時間培養したものを前培養液とした。次いで、培地組成−２で示される栄養培地５０ ｍｌを３００ ｍｌ容三角フラスコ２５本に入れ、１２１℃で２０分間加熱滅菌した。これを２３℃に冷却した後、各三角フラスコに前培養液約１ ｍｌを接種し、回転数２１０ ｒｐｍ、２３℃で１６８時間振盪することにより本培養を行った。
［培地組成−１］
可溶性澱粉 ２．０ ％
グリセリン ３．０ ％
グルコース ３．０ ％
大豆粉 １．０ ％
ゼラチン ０．２５ ％
イーストエキス ０．２５ ％
ＮＨ_４ＮＯ_３ ０．２５ ％
寒天 ０．３ ％
消泡剤ＣＢ−４４２ ０．００５ ％
（滅菌前のｐＨ６．５）

［培地組成−２］
培地組成−１の組成から寒天を除いたもの。

（実施例２）．Ｆ−９１６３６化合物の単離
実施例１で得られた培養物１ ｌを遠心分離操作により、培養物を可溶性画分（培養上清）および不溶性画分（菌体）に分別した。得られた菌体５００ ｍｌにアセトン５００ ｍｌを加えて抽出した後、これを遠心分離してアセトン抽出液を得た。このアセトン抽出液を減圧下濃縮してアセトンを留去後、培養上清と合わせて１．５ ｌとした。この合併液をｐＨ３．０に調整後、１．５ ｌの酢酸エチルで２回抽出した。抽出液を飽和食塩水で洗浄後、無水硫酸ナトリウムで脱水して脱脂綿でろ過後、減圧下濃縮乾固して、Ｆ−９１６３６化合物を含む抽出物４．５ ｇを得た。

次いで、コスモシルカラム・クロマトグラフィーを行った。すなわち、前記抽出物４．５ ｇに２０ ｍｌのＭｅＯＨで溶解後、１０ ｇのコスモシル（Ｃｏｓｍｏｓｉｌ ７５Ｃ１８−ＯＰＮ）を加え均一とした後、懸濁液を減圧下濃縮してメタノールを留去し、吸着せしめた。ここにメタノール：０．３％トリエチルアミンリン酸緩衝液（ｐＨ３）＝３：７、１０ ｍｌを加え再懸濁した後、予めアセトニトリル：０．３％トリエチルアミンリン酸緩衝液（ｐＨ３）＝３：７で平衡化したコスモシルカラム（Ｃｏｓｍｏｓｉｌ ７５Ｃ１８−ＯＰＮ、容積４００ ｍｌ）に付した。該カラムを、メタノール：０．３％トリエチルアミンリン酸緩衝液（ｐＨ３）＝３：７（１．５ ｌ）で洗浄した後、アセトニトリル：０．３％トリエチルアミンリン酸緩衝液（ｐＨ３）＝４：６（１．５ ｌ）を用いてＦ−９１６３６化合物を溶出させ回収した。得られたＦ−９１６３６化合物含有画分を減圧下で濃縮することによりアセトニトリルを留去後、９００ ｍｌの酢酸エチルで２回抽出した。抽出液を飽和食塩水で洗浄後、無水硫酸ナトリウムで脱水した。それを脱脂綿でろ過後、減圧下濃縮乾固して、Ｆ−９１６３６化合物を含む部分精製物２．３ ｇを得た。

この部分精製物をＨＰＬＣカラム（Ｃｏｓｍｏｓｉｌ ５Ｃ１８−ＡＲ φ２０×２５０ ｍｍ：ナカライテスク社製）で分離した。部分精製物５００ ｍｇをアセトニトリル：０．３％トリエチルアミンリン酸緩衝液（ｐＨ３）＝３：７、４ ｍｌに溶解したものを試料溶液とした。この試料溶液２００ μｌを、あらかじめアセトニトリル：０．３％トリエチルアミンリン酸緩衝液（ｐＨ３）＝３：７で平衡化したカラムに注入後、アセトニトリル：０．３％トリエチルアミンリン酸緩衝液（ｐＨ３）＝３：７を溶媒として、流速１５ ｍｌ／分で溶出した。検出波長２１０ ｎｍで溶出液をモニターし保持時間２９．５から３２．０分までに溶出されるＦ−９１６３６Ａ含有画分と３６．５分から３８．５分までに溶出されるＦ−９１６３６Ｂ含有画分を分取した。残りの試料溶液についても同様の操作を行い、７５０ ｍｌのＦ−９１６３６Ａ含有画分と６００ ｍｌのＦ−９１６３６Ｂ含有画分を得た。減圧下濃縮してアセトニトリルを留去後、５００ ｍｌの酢酸エチルで2回抽出し、その抽出液を飽和食塩水で洗浄後、無水硫酸ナトリウムで脱水した。それを脱脂綿でろ過後、減圧下濃縮乾固して、Ｆ−９１６３６Ａを含む黄色粉末５３ ｍｇとＦ−９１６３６Ｂを含む黄色粉末３５ ｍｇとを得た。このＦ−９１６３６Ａを含む部分精製物をＨＰＬＣカラム（Ｗａｔｅｒｓ ＳＹＭＭＥＴＲＹ Ｃ１８ φ１９×１００ｍｍ：Ｗａｔｅｒｓ社製）で分離した。部分精製物５３ ｍｇをアセトニトリル：メタノール：水＝６：３：１１．０．５ ｍｌに溶解したものを試料溶液とした。この試料溶液１００ μｌを、あらかじめアセトニトリル：メタノール：水＝６：３：１１で平衡化したカラムに注入後、アセトニトリル：メタノール：水＝６：３：１１を溶媒として、流速１５ ｍｌ／分で溶出した。検出波長２１０ ｎｍで溶出液をモニターし、保持時間１４．０から１８．０分までの溶出液を分取した。残りの試料溶液についても同様の操作を行い、Ｆ−９１６３６Ａ含有画分６００ ｍｌを得た。減圧下濃縮してアセトニトリルを留去後、３００ ｍｌの酢酸エチルで２回抽出した。その抽出液を飽和食塩水で洗浄後、無水硫酸ナトリウムで脱水した。それを脱脂綿でろ過後、減圧下濃縮乾固して、Ｆ−９１６３６Ａの黄色粉末３７ ｍｇを得た。Ｆ−９１６３６Ｂを含む部分精製物３５ ｍｇをアセトニトリル：メタノール：水＝６：３：１１．０．２ ｍｌに溶解したものを試料溶液とし同一条件で分離し、保持時間１７．０から２１．５分までの溶出液を分取し、Ｆ−９１６３６Ｂ含有画分１３５ ｍｌを得た。減圧下濃縮してアセトニトリルを留去後、７０ ｍｌの酢酸エチルで２回抽出した。その抽出液を飽和食塩水で洗浄後、無水硫酸ナトリウムで脱水した。それを脱脂綿でろ過後、減圧下濃縮乾固して、Ｆ−９１６３６Ｂの黄色粉末１０ ｍｇを得た。

（試験例１）．抗菌作用
一般グラム陽性および陰性細菌に対するＦ−９１６３６化合物の最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）の測定は、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）ＦＤＡ２０９Ｐ ＪＣ−１株（以降Ｓ．ａｕｒｅｕｓ２０９Ｐ株と略記）および大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）Ｋ１２ ＭＧ１６５５ ΔｔｏｌＣ株（以降ΔｔｏｌＣ株と略記）を被検菌として、以下のブロス希釈法で行った。Ｆ−９１６３６化合物をジメチルスルフィド：メタノール：水（１：１：２）に溶解して得られた２．５ ｍｇ／ｍｌの検体溶液を、順次ジメチルスルフィド：メタノール：水（１：１：２）にて２倍希釈し、９段階の希釈液を調製した。被検菌Ｓ．ａｕｒｅｕｓ２０９Ｐ株をトリプトソイブイヨン（ＴＳＢ）培地（栄研化学社製）にて３７℃、一夜前培養した。又、ΔｔｏｌＣ株をＬｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ（ＬＢ）培地（和光純薬工業社製）にて３７℃、一夜前培養した。試験当日、得られた菌液を、ＴＳＢまたはＬＢを用いて２０００倍に希釈し、その菌液１９０ μｌに検体溶液１０ μｌを加え、３７℃、２０時間培養した後、ＭＩＣを判定した。
結果を表１に示す。
［表１］
――――――――――――――――――――――――――――――――――――――
被検菌 最小阻止濃度（ＭＩＣ）（μg/ml）
Ｆ−９１６３６Ａ Ｆ−９１６３６Ｂ
――――――――――――――――――――――――――――――――――――――
Ｓ．ａｕｒｅｕｓ ２０９Ｐ株 ６２．５ ６２．５
ΔｔｏｌＣ ６２．５ ３１．３
――――――――――――――――――――――――――――――――――――――

（製剤例）．Ｆ−９１６３６化合物含有経口カプセル剤
―――――――――――――――――――――――――――――――
Ｆ−９１６３６化合物 ３０ ｍｇ
乳糖 １７０ ｍｇ
トウモロコシ澱粉 １５０ ｍｇ
ステアリン酸マグネシウム ２ ｍｇ
―――――――――――――――――――――――――――――――
合計 ３５２ ｍｇ
―――――――――――――――――――――――――――――――
上記処方の粉末を混合し、６０メッシュのふるいに通した後、この粉末をゼラチンカプセルに入れ、カプセル剤とする。

Claims (10)

1. 下記式（Ｉ）で表される化合物又はその塩。
   

   

   
   
2. 下記式（II）で表される化合物又はその塩。
   

   

   
   
3. 下記の１）乃至９）の物理化学的性質を示す化合物又はその塩：
   １）性質：酸性、黄色粉末；
   ２）溶解性：ジメチルスルホキシド、メタノールに可溶；
   ３）分子式：Ｃ_２７Ｈ_２４Ｏ_９；
   ４）分子量：４９２（ＥＳＩ−ＴＯＦＭＳスペクトルにより決定）；
   ５）紫外線吸収スペクトル：λ_max ｎｍ（ε）
   メタノール溶液中で測定した紫外線吸収スペクトルは、次の通りである。
   ３９８ (１４４００)、２２５ (４５８００)；
   ６）赤外線吸収スペクトル（ＫＢｒ）：ν_max ｃｍ^−１
   KBｒディスク法で測定した赤外線吸収スペクトルは、次の通りである：
   ３３９８、１７１８、１６２６、１５４４、１５１７、１４６１、１４０４、１３２９、１３１１、１２０１、１１０８；
   ７） ¹Ｈ−核磁気共鳴スペクトル； δ (ppm)
   重メタノール溶液中で測定した核磁気共鳴スペクトル（５００MHz）は、次の通りである。（ＴＭＳのシグナルを0.00 ppmとした。）
   1.47 (3H, s), 1.76 (3H, dd, J=1.9, 7.0 Hz), 2.16 (3H, s), 2.17 (3H, s), 5.06 (1H, d, J=13.2), 5.09 (1H, d, J=13.2 Hz), 5.30 (1H, s), 5.83 (1H, dq, J=1.9, 15.4 Hz), 6.27 (1H, s), 6.29 (1H, s), 6.47 (1H, dq, J=7.0, 15.4 Hz)
   ８）^１３Ｃ−核磁気共鳴スペクトル； δ (ppm)
   重メタノール溶液中で測定した核磁気共鳴スペクトル（１２５MHz）は、次の通りである。（重メタノールのシグナルを49.0 ppmとした。）
   18.5, 23.3, 23.6, 24.8, 55.7, 65.3, 77.4, 105.3, 112.1, 114.1, 116.0, 116.4, 120.3, 125.8, 127.2, 128.4, 132.6, 133.3, 136.4, 141.4, 141.7, 146.1, 146.3, 155.7, 163.7, 194.5, 210.4
   ９）比旋光度；
   ［α］_D ^２６ １４５° （ｃ １．０、メタノール）。
   
4. 下記の１）乃至９）の物理化学的性質を示す化合物又はその塩：
   １）性質：酸性、黄色粉末；
   ２）溶解性：ジメチルスルホキシド、メタノールに可溶；
   ３）分子式：Ｃ_２７Ｈ_２６Ｏ_９；
   ４）分子量：４９４（ＥＳＩ−ＴＯＦＭＳスペクトルにより決定）；
   ５）紫外線吸収スペクトル：λ_max ｎｍ（ε）
   メタノール溶液中で測定した紫外線吸収スペクトルは、次の通りである。
   ３６７ (１０２００)、２２３ (４４８００)；
   ６）赤外線吸収スペクトル（ＫＢｒ）：ν_max ｃｍ^−１
   KBｒディスク法で測定した赤外線吸収スペクトルは、次の通りである：
   ３４０８、１７２０、１６１４、１５１８、１４６１、１４００、１３１５、１２３８、１２２３、１１９９、１１０７；
   ７） ¹Ｈ−核磁気共鳴スペクトル； δ (ppm)
   重メタノール溶液中で測定した核磁気共鳴スペクトル（５００MHz）は、次の通りである。（ＴＭＳのシグナルを0.00 ppmとした。）
   0.81 (3H, t, J=7.3 Hz), 1.46 (2H, sextet, J=7.3 Hz), 1.47 (3H, s), 2.13 (2H, t, J=7.3 Hz), 2.19 (3H, s), 2.20 (3H, s), 5.05 (1H, d, J=13.2), 5.09 (1H, d, J=13.2 Hz), 5.22 (1H, s), 6.28 (1H, s), 6.31 (1H, s)
   ８）^１３Ｃ−核磁気共鳴スペクトル； δ (ppm)
   重メタノール溶液中で測定した核磁気共鳴スペクトル（１２５MHz）は、次の通りである。（重メタノールのシグナルを49.0 ppmとした。）
   13.7, 21.2, 23.4, 23.7, 24.7, 36.8, 55.7, 65.5, 77.3, 103.5, 112.0, 113.9, 116.0, 116.4, 119.3, 127.1, 128.4, 132.7, 133.3, 141.4, 141.7, 146.2, 146.3, 155.3, 172.0, 194.7, 210.5
   ９）比旋光度；
   ［α］_D ^３１ ８５° （ｃ １．０、メタノール）。
   
5. アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属に属する請求項１乃至４のいずれか１項に記載の化合物の生産菌を培養し、その培養物より請求項１乃至４のいずれか１項に記載の化合物を回収することを特徴とする、請求項１乃至４のいずれか１項に記載の化合物の製造方法。
6. アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属に属する請求項１乃至４のいずれか１項に記載の化合物の生産菌がアスペルギルス・ベルシコロル（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒ） ＳＡＮＫ ２１００５株（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０３３３）であることを特徴とする、請求項５に記載の製造方法。
7. アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕs）属に属する請求項１乃至４のいずれか１項に記載の化合物を生産する微生物。
8. アスペルギルス・ベルシコロル（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒ） ＳＡＮＫ ２１００５株（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０３３３）である請求項７に記載の微生物。
9. 請求項１乃至４のいずれか１項に記載の化合物又はその薬理学的に許容される塩を有効成分として含有する医薬。
10. 感染症治療薬及び／または予防薬である請求項９に記載の医薬。