JP2006337109A - Substrate for optical detection, and optical detection method - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、例えば蛍光等の光学検出を行うのに好適な光学検出用基板および光学検出方法に関する。 The present invention relates to an optical detection substrate and an optical detection method suitable for optical detection of, for example, fluorescence.
近年、ＤＮＡチップに代表されるバイオチップと呼ばれる検出用具またはこれを用いた分析方法の開発が盛んになっている。
バイオチップは、たとえば、ＤＮＡやタンパク質等の生体高分子を基板上の特定の位置に吸着または担持させ、これと相互作用する生体高分子等を反応させて分析を行うのに用いられる。
以下の説明において、バイオチップの代表例としてＤＮＡチップをとりあげるが、ＲＮＡ、タンパクまたは糖鎖等を検出対象とする場合も同様である。
In recent years, development of a detection tool called a biochip typified by a DNA chip or an analysis method using the same has been actively performed.
The biochip is used, for example, for performing analysis by adsorbing or carrying a biopolymer such as DNA or protein at a specific position on a substrate and reacting the biopolymer interacting with the biopolymer.
In the following description, a DNA chip is taken as a representative example of a biochip, but the same applies to a case where RNA, protein, sugar chain, or the like is to be detected.
ＤＮＡチップでは、基板上に、多種類のＤＮＡの断片（プローブＤＮＡ）を数百〜数万個の微小なスポットとして固定させ、これに人間や動物のＤＮＡで評価したいもの（検体ＤＮＡ）を作用させる（ハイブリダイゼーション）ことにより一度に多数のＤＮＡの配列を検出評価し、固体間のＤＮＡ配列の違いや、細胞状態の違いによるＤＮＡ発現（この場合、ＤＮＡを遺伝子ともいう。）量の差などを解析できる。
ＤＮＡチップによる分析では、検体ＤＮＡに予め取り付けた蛍光標識に励起光を照射して、蛍光を検出する方法が主流である。
In a DNA chip, several types of DNA fragments (probe DNA) are immobilized on a substrate as hundreds to tens of thousands of minute spots, and this is used to act on human or animal DNA (specimen DNA). (Hybridization) is used to detect and evaluate a large number of DNA sequences at once, and the difference in DNA expression between the solids and the difference in the amount of DNA expressed (in this case, DNA is also referred to as a gene), etc. Can be analyzed.
In analysis using a DNA chip, a method of detecting fluorescence by irradiating a fluorescent label previously attached to a sample DNA with excitation light is the mainstream.
該検出においては、検出光（蛍光標識から発せられるシグナル）と、基板等からくるバックグラウンドノイズとの比（以下、Ｓ／Ｎ比という）を大きくすることが、検出感度を向上させるうえで重要である。
たとえば、下記特許文献１では、プローブＤＮＡを基板上に担持させる微小領域（スポットを形成する領域）を、それ以外の領域よりも一段高く形成する方法が提案されている。この方法によれば、光学検出を行う際に、検出装置の焦点をスポットに合わせた状態で、スポット以外の領域は検出装置の焦点からずれるため、これによりスポット以外の領域から発せられるバックグラウンドノイズの検出強度を低減させることができる。
また、下記特許文献２では、基板表面をエッチング等で粗面化することにより、プローブＤＮＡを吸着または結合させる表面積を増大させる方法が提案されている。この方法によれば、スポット内に存在するプローブＤＮＡの量を増大できるため、これによりスポット内の検出光強度を増大させることができる。
For example, Patent Document 1 below proposes a method in which a micro region (a region where a spot is formed) for supporting a probe DNA on a substrate is formed one step higher than other regions. According to this method, when performing optical detection, the area other than the spot is deviated from the focus of the detection apparatus while the detection apparatus is focused on the spot. The detection intensity can be reduced.
しかしながら、前記特許文献１に記載の方法では、スポット内の基板（一段高い部分）に起因するバックグラウンドノイズは低減されない。また基板表面の微小領域を一段高くする加工を行った結果、基板表面において検出光の回折や干渉が生じ易くなり、バックグラウンドノイズの増大を招く。したがって、この方法でＳ／Ｎ比を改善することは難しい。また、一段高く形成された微小領域上に正確に物質を付与することは容易ではない、という問題もある。
また前記特許文献２に記載の方法では、基板表面を粗面化したことにより、検出光の回折や干渉が生じてバックグラウンドノイズが増大するため、結果的にＳ／Ｎ比を改善することはできない。
However, the method described in Patent Document 1 does not reduce background noise caused by the substrate in the spot (the higher step). In addition, as a result of performing a process of raising the minute area on the substrate surface by one step, diffraction and interference of detection light are likely to occur on the substrate surface, resulting in an increase in background noise. Therefore, it is difficult to improve the S / N ratio by this method. In addition, there is a problem that it is not easy to accurately apply a substance on a minute region formed one step higher.
In addition, in the method described in
本発明は、光学検出における検出感度を向上できる光学検出用基板および光学検出方法を提供する。 The present invention provides an optical detection substrate and an optical detection method capable of improving detection sensitivity in optical detection.
本発明の光学検出用基板は、基板上に定着させた物質から発せられる特定波長の検出光を検出する方法に用いられる基板であって、該基板の表面に微細な凸部が周期的に設けられており、該凸部の周期が前記検出光の波長の５０％以下であることを特徴とする。 The optical detection substrate of the present invention is a substrate used in a method for detecting detection light having a specific wavelength emitted from a substance fixed on the substrate, and fine convex portions are periodically provided on the surface of the substrate. The period of the convex portion is 50% or less of the wavelength of the detection light.
本発明の光学検出方法は、基板上に定着させた物質から発せられる特定波長の検出光を検出する方法において、前記基板として、基板の表面に微細な凸部が周期的に設けられており、該凸部の周期が前記検出光の波長の５０％以下である基板を用いることを特徴とする。 The optical detection method of the present invention is a method for detecting detection light of a specific wavelength emitted from a substance fixed on a substrate, and as the substrate, fine convex portions are periodically provided on the surface of the substrate, A substrate in which the period of the convex portions is 50% or less of the wavelength of the detection light is used.
本発明によれば、光学検出における検出感度を向上できる光学検出用基板および光学検出方法が得られる。 ADVANTAGE OF THE INVENTION According to this invention, the board | substrate for optical detection and the optical detection method which can improve the detection sensitivity in optical detection are obtained.
図１は、本発明の光学検出用基板（以下、単に基板ということもある。）の第１の実施形態を示した斜視図である。なお、図面は基板１の表面の一部を拡大して模式的に示している。基板１の厚さ方向をＺ方向、Ｚ方向に垂直な面内において互いに垂直な２方向をそれぞれＸ方向、Ｙ方向とする。
本実施形態において、基板１の表面には、Ｙ方向に沿って帯状に延びる凸部２が、Ｘ方向において一定の間隔Ｓで周期的に設けられている。すなわち、本実施形態において凸部２はＸ方向（繰り返し方向）に沿って繰り返し形成されている。
なお本明細書において、凸部２は、その頂面２１と側壁２２を含む構造を指し、隣り合う凸部２の間の部分を凹部３と言う。
本実施形態において、凸部２の、Ｙ方向に垂直な断面形状は矩形であり、Ｘ方向における凸部２の幅Ｗと、Ｘ方向における頂面２１の幅Ｗ’とは等しい。また、全部の凸部２において、Ｘ方向における幅Ｗは均一であり、凸部２の頂面２１から凹部３までの深さＤも均一である。
FIG. 1 is a perspective view showing a first embodiment of an optical detection substrate (hereinafter sometimes simply referred to as a substrate) of the present invention. The drawing schematically shows an enlarged part of the surface of the substrate 1. The thickness direction of the substrate 1 is defined as a Z direction, and two directions perpendicular to each other in a plane perpendicular to the Z direction are defined as an X direction and a Y direction, respectively.
In the present embodiment,
In the present specification, the
In this embodiment, the cross-sectional shape perpendicular to the Y direction of the
本発明において、基板１の表面に形成されている凸部２の側壁２２上の任意の点Ａから、基板の厚さ方向（Ｚ方向）に対して垂直な方向に進み、隣接する凸部２の対応する側壁上の対応する点Ｂ（一方向への平行移動により重なり合う側壁２２上の同じ位置の点）に至るまでの距離Ｐ１を周期という。本実施形態では、Ｘ方向における凸部２の幅Ｗと凸部２の間隔Ｓとの和の値（Ｗ＋Ｓ）＝Ｐ１が周期となる。
なお後述する第２の実施形態のように、点Ｂを決める際に、隣接する凸部２の対応する側壁として複数の側壁が存在する場合は、まず点Ａからの距離が最も近い側壁上の点Ｂを選び、該点Ａから点Ｂに向かう方向を第１の繰り返し方向とする。該点Ａから点Ｂに至るまでの距離Ｐ１が第１の周期となる。次いで、該第１の繰り返し方向上にある側壁を除いて、前記点Ａからの距離が最も近い側壁上の点Ｂ’を選び、該点Ａから点Ｂ’に向かう方向を第２の繰り返し方向とする。該点Ａから点Ｂ’に至るまでの距離Ｐ２が第２の周期となる。
In the present invention, from an arbitrary point A on the
As in the second embodiment to be described later, when determining the point B, if there are a plurality of side walls as the corresponding side walls of the
図１の例では、凸部２のＹ方向に垂直な断面形状断面形状が矩形であるが、これに限らず適宜変更できる。たとえばＸ方向における頂面２１の幅Ｗ’が、Ｘ方向における凸部２の幅Ｗよりも小さい台形でもよい。または頂面の幅Ｗ’がゼロの三角形であってもよい。また凸部２のＹ方向に垂直な断面形状が台形または三角形であり、凸部２の間隔Ｓがゼロで、隣り合う凸部２どうしがＶ溝を介して接している形状でもよい。いずれの形状の場合も、凸部の周期は上記と同様にして決められる。
In the example of FIG. 1, the cross-sectional shape perpendicular to the Y direction of the
本発明において凸部２の周期（本実施形態では（Ｗ＋Ｓ））は、光学検出において検出される検出光の波長の５０％以下とされる。該検出光波長の２０％以下が好ましい。凸部２の周期を前記の範囲とすることにより、検出光が、凸部２が周期的に設けられている基板１の表面に達したときに散乱、屈折、回折、干渉等が生じるのを抑えることができ、その結果、光学検出におけるバックグラウンドノイズを低減させることができる。
検出光の波長とは、検出対象物質を定性的にまたは定量的に検出するために、光学的に検出する光の波長であり、たとえば蛍光物質を標識として用いた光学検出においては、所定の波長の励起光を照射したときに該蛍光物質が放つ蛍光の波長である。
なお、凸部の形状や配列によって、前記繰り返し方向が複数存在する場合、すなわち凸部の周期が複数存在する場合は、該複数の周期の値のうちの少なくとも１つが前記の範囲であればよいが、全ての周期の値が前記の範囲であることが好ましい。
In the present invention, the period of the convex portion 2 ((W + S) in the present embodiment) is 50% or less of the wavelength of the detection light detected in the optical detection. It is preferably 20% or less of the detection light wavelength. By setting the period of the
The wavelength of the detection light is the wavelength of light that is optically detected in order to detect the detection target substance qualitatively or quantitatively. For example, in optical detection using a fluorescent substance as a label, a predetermined wavelength is used. This is the wavelength of fluorescence emitted by the fluorescent material when irradiated with the excitation light.
In addition, when there are a plurality of the repeating directions depending on the shape and arrangement of the protrusions, that is, when there are a plurality of periods of the protrusions, at least one of the values of the plurality of periods may be within the above range. However, it is preferable that the values of all the periods are in the above-mentioned range.
蛍光の波長、すなわち検出光の波長は、検出に使用される蛍光物質によって異なるが、４５０〜７００ｎｍが好ましい。たとえばＤＮＡチップの検出においては、励起波長として４７５ｎｍ、５３２ｎｍ、６３５ｎｍが多用され、対応する蛍光の波長としては、それぞれ５１０〜６４０ｎｍ、５５０〜６６５ｎｍ、６４５〜６８０ｎｍが用いられる。具体例としては、波長４７５ｎｍの励起光を照射したときに波長５０５ｎｍの蛍光を放つ蛍光物質が標識として用いられる。したがって、たとえば凸部２の周期を２５０ｎｍ以下とすれば、蛍光の波長が５０５ｎｍ以上の範囲である光学検出に用いて、前記バックグラウンドノイズを低減させる効果を得ることができる。該凸部２の周期の上限は２００ｎｍ以下がより好ましい。
The wavelength of fluorescence, that is, the wavelength of detection light, varies depending on the fluorescent substance used for detection, but is preferably 450 to 700 nm. For example, in the detection of a DNA chip, 475 nm, 532 nm, and 635 nm are frequently used as excitation wavelengths, and 510 to 640 nm, 550 to 665 nm, and 645 to 680 nm are used as the corresponding fluorescence wavelengths, respectively. As a specific example, a fluorescent substance that emits fluorescence having a wavelength of 505 nm when irradiated with excitation light having a wavelength of 475 nm is used as a label. Therefore, for example, if the period of the
凸部２の周期の下限値は特に制限されないが、成形の容易性の点で、１０ｎｍ以上が好ましく、５０ｎｍ以上がより好ましい。１００ｎｍ以上であれば十分である。
Although the lower limit of the period of the
凸部２の深さＤは、凸部２の倒れを防止するうえで、また光学検出における悪影響を防止するうえで、検出光の波長の２倍の値以下であることが好ましく、具体的には５００ｎｍ以下がより好ましい。凸部２の深さＤの下限値は、成形の容易性の点で、１０ｎｍ以上が好ましく、５０ｎｍ以上がより好ましい。
The depth D of the
また図１の例のように、凸部２のＹ方向に垂直な断面形状が矩形である場合、凸部２のＸ方向における幅Ｗは成形の容易性の点から１０ｎｍ以上が好ましく、２５ｎｍ以上がより好ましい。また凸部２のＸ方向における間隔Ｓは成形の容易性の点から１０ｎｍ以上が好ましく、２５ｎｍ以上がより好ましい。
Further, as in the example of FIG. 1, when the cross-sectional shape perpendicular to the Y direction of the
基板１を構成する材料は、特に制限されず、表面に所望の微細な凹凸パターンを形成できるものであればよい。基板１は、バイオチップに代表的に用いられる蛍光標識の蛍光波長の領域である４５０ｎｍ〜７００ｎｍの範囲で透明であってもよく、不透明であってもよい。
透明な材料の具体例としては、石英ガラス、ソーダライムガラス、ホウケイ酸ガラス等のガラス材料；フッ素樹脂；含ケイ素樹脂等が挙げられる。
不透明な材料の例としては、ステンレス鋼等の金属が挙げられる。
これらのうちでも、特に蛍光バックグラウンドの低さ、平坦性、入手のしやすさの点でホウケイ酸ガラスまたはソーダライムガラスが、より好ましい。
The material which comprises the board | substrate 1 is not restrict | limited in particular, What is necessary is just a thing which can form a desired fine uneven | corrugated pattern on the surface. The substrate 1 may be transparent or opaque in a range of 450 nm to 700 nm, which is a fluorescent wavelength region of a fluorescent label typically used for a biochip.
Specific examples of the transparent material include glass materials such as quartz glass, soda lime glass, and borosilicate glass; fluororesins; silicon-containing resins.
Examples of opaque materials include metals such as stainless steel.
Among these, borosilicate glass or soda lime glass is more preferable particularly in terms of low fluorescence background, flatness, and availability.
基板１の表面に凸部２を形成する方法は、微細な凹凸パターンを形成するための既知の方法を適宜用いることができる。
たとえば、基板表面に直接ＥＢ（電子線）を照射して加工するリソグラフィー法；基板上にリソグラフィー法によりエッチングマスクを形成した後、該エッチングマスクを介してエッチングを行う方法；マスクを介した塗布法によりエッチングマスクを形成した後、該エッチングマスクを介してエッチングを行う方法；射出成型、切削加工等の機械的な加工を行う方法；光硬化性樹脂の成形により母型を作製した後、この母型を用いて光硬化性樹脂を成形し光照射により硬化する方法（２Ｐ成型法）；ポリマーを溶剤に溶かした溶液を型に流し込んだ後に溶媒を留去して乾固させる方法；インプリント−リソグラフィー法；インクジェット法等が挙げられる。
なお、前記インプリント−リソグラフィー法は、モールド（転写型）を基板表面にプレスして、モールドの形状を基板表面に転写した後に紫外線照射するタイプのインプリント−リソグラフィー法、プレス後に加熱するタイプのインプリント−リソグラフィー法、プレス前に加熱するタイプのインプリント−リソグラフィー法、およびソフトリソグラフィー法を含む。
これらの方法のうちでも、生産性の点からは、インプリント−リソグラフィー法が好ましい。
As a method of forming the
For example, a lithography method in which a substrate surface is directly irradiated with EB (electron beam) and processed; a method in which an etching mask is formed on the substrate by a lithography method, and etching is performed through the etching mask; a coating method through the mask A method of performing etching through the etching mask, a method of performing mechanical processing such as injection molding and cutting, and the like. A method of molding a photocurable resin using a mold and curing it by light irradiation (2P molding method); A method of pouring a solution in which a polymer is dissolved in a solvent and then distilling the solvent to dryness; Imprint— Lithographic method; inkjet method and the like can be mentioned.
The imprint-lithography method is a type of imprint-lithography method in which a mold (transfer mold) is pressed onto a substrate surface, the shape of the mold is transferred to the substrate surface, and then irradiated with ultraviolet rays, and heated after pressing. Includes imprint-lithography methods, types of imprint-lithography methods that heat before pressing, and soft lithography methods.
Among these methods, the imprint-lithography method is preferable from the viewpoint of productivity.
また、図示していないが、基板１の表面に凸部２を形成した後に、基板１の表面上にバイオチップに代表的に用いられる蛍光標識の蛍光波長の領域である４５０ｎｍ〜７００ｎｍの範囲で透明な材料からなる被覆層を設けてもよい。
被覆層は、凸部２の表面および凹部３の表面を含む全面上に設けることが好ましい。該被覆層を設けることにより、基板１上に定着する検出対象物質の量を増大できる。
被覆層の材料の具体例としては、たとえばフッ素を１０質量％以上含むフッ素樹脂（スルホン酸基、カルボン酸基、水酸基等を含む親水性のフッ素樹脂、およびエステル基やアルキル基等を含む疎水性のフッ素樹脂を含む。）；シリコーン樹脂、ケイ素系低誘電率材料（略称ＳＯＧ、ＨＳＱ等）等の含ケイ素樹脂；ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）等のアクリル樹脂；ポリカーボネート樹脂；ポリ乳酸等の生分解性プラスチック；等が挙げられる。これらの材料からなる被覆層は、たとえば塗布液を塗布して乾燥、硬化させることにより形成できる。
またＩＴＯ（酸化インジウム−スズ）等の無機化合物からなる被覆層を、スパッタ法やＣＶＤ法で形成してもよい。
被覆層の膜厚は、特に限定されるものではないが、スピンコートを適用できる点からは、１ｎｍ〜５００μｍ程度が好ましく、３０ｎｍ〜１００μｍ程度がより好ましい。また該被覆層は、複数の被膜が積層されたものであってもよい。
Further, although not shown, after forming the
The covering layer is preferably provided on the entire surface including the surface of the
Specific examples of the material of the coating layer include, for example, a fluororesin containing 10% by mass or more of fluorine (hydrophilic fluororesin containing sulfonic acid group, carboxylic acid group, hydroxyl group, etc., and hydrophobicity containing ester group, alkyl group, etc. Silicon-containing resins such as silicone resins and silicon-based low dielectric constant materials (abbreviated as SOG, HSQ, etc.); acrylic resins such as polymethyl methacrylate (PMMA); polycarbonate resins; biodegradation of polylactic acid, etc. And other plastics. The coating layer made of these materials can be formed, for example, by applying a coating solution, drying and curing.
Further, a coating layer made of an inorganic compound such as ITO (indium tin oxide) may be formed by a sputtering method or a CVD method.
Although the film thickness of a coating layer is not specifically limited, From the point which can apply a spin coat, about 1 nm-500 micrometers are preferable, and about 30 nm-100 micrometers are more preferable. The coating layer may be a laminate of a plurality of coatings.
基板１上に定着される物質の種類に応じて、基板１の最表面に対して、該物質の定着を促進する表面処理を施してもよい。なお「基板の最表面」とは、基板１上に前記被覆層が形成されている場合は、該被覆層の表面を指す。 Depending on the type of substance to be fixed on the substrate 1, a surface treatment for promoting the fixation of the substance may be performed on the outermost surface of the substrate 1. The “outermost surface of the substrate” refers to the surface of the coating layer when the coating layer is formed on the substrate 1.
該表面処理に用いられる表面処理剤は、検出に使用される物質の基板１への定着を促進する機能を有するものが好ましく、具体例としてはシランカップリング剤が挙げられる。
シランカップリング剤は、有機性官能基をＲ、無機材料と反応する加水分解性基をＸとすると、ＲＳｉＸ３で表される化学構造を有するもので、有機性官能基Ｒとしては、ビニル、グリシドキシ、メタクリル、アミノ、メルカプト、アルデヒド、エポキシ、カルボキシル、水酸基等の基が挙げられる。一方、Ｘは塩素、アルコキシ基等が挙げられる。アルコキシ基としては、メトキシ基、エトキシ基、プロポキシ基、ブトキシ基、ペンチルオキシ基、ヘキシルオキシ基、等が挙げられる。
シランカップリング剤の一例としては、γ―アミノプロピルトリエトキシシラン等が挙げられる。
また、基板１の最表面にシランカップリング剤を結合させる表面処理方法は、既知の手法を用いることができる。一般的には、前記のシランカップリング剤を、その加水分解性基と同じ構造のアルコール類で希釈し、加水分解性基を活性化させるために、適当量の水分を加えたシランカップリング溶液が用いられる。
The surface treatment agent used for the surface treatment preferably has a function of accelerating the fixing of the substance used for detection to the substrate 1, and specific examples thereof include a silane coupling agent.
The silane coupling agent has a chemical structure represented by RSiX 3 where R is an organic functional group and X is a hydrolyzable group that reacts with an inorganic material. As the organic functional group R, vinyl, Examples include glycidoxy, methacryl, amino, mercapto, aldehyde, epoxy, carboxyl, hydroxyl group and the like. On the other hand, examples of X include chlorine and alkoxy groups. Examples of the alkoxy group include a methoxy group, an ethoxy group, a propoxy group, a butoxy group, a pentyloxy group, and a hexyloxy group.
An example of a silane coupling agent is γ-aminopropyltriethoxysilane.
A known method can be used as the surface treatment method for bonding the silane coupling agent to the outermost surface of the substrate 1. In general, the silane coupling agent is diluted with an alcohol having the same structure as the hydrolyzable group, and an appropriate amount of water is added to activate the hydrolyzable group. Is used.
たとえば、基板上に生体高分子を定着させる場合に、基板１の最表面にアミノシラン等のシランカップリング剤を結合させる表面処理、または基板１の最表面にシランカップリング剤を結合させ、さらに該シランカップリング剤に反応性を有する有機物を１種または１つ以上結合させる表面処理を施すことにより、基板１と生体高分子（たとえばＤＮＡチップにおいてはプローブＤＮＡ）との親和性および／または結合特異性が向上し、基板１への生体高分子の定着性が促進される。 For example, when fixing a biopolymer on a substrate, a surface treatment for bonding a silane coupling agent such as aminosilane to the outermost surface of the substrate 1 or a silane coupling agent bonded to the outermost surface of the substrate 1, Affinity and / or binding specificity between the substrate 1 and a biopolymer (eg, probe DNA in a DNA chip) by applying a surface treatment that binds one or more organic substances having reactivity to the silane coupling agent And the fixability of the biopolymer to the substrate 1 is promoted.
図２は、本発明の基板の第２の実施形態を示した斜視図である。なお、図面は基板１１の表面の一部を拡大して模式的に示している。
本実施形態が第１の実施形態と異なる点は、第１の実施形態では凸部２の繰り返し方向がＸ方向のみであるのに対し、本実施形態では、Ｘ方向とＹ方向の２つの繰り返し方向に沿って凸部１２が繰り返し形成されている点である。
本実施形態において凸部１２のＸ方向に垂直な断面形状、およびＹ方向に垂直な断面形状はいずれも矩形である。全部の凸部１２において、Ｘ方向における幅Ｗｘ、Ｙ方向における幅Ｗｙ、Ｘ方向における凸部１２の間隔Ｓｘ、Ｙ方向における凸部１２の間隔Ｓｙは、それぞれ均一である。また、凸部１２における頂面から凹部１３までの深さＤも均一である。
凸部１２におけるＸ方向の幅ＷｘとＹ方向の幅Ｗｙとは同じでもよく、異なっていてもよい。またＸ方向における凸部１２の間隔ＳｘとＹ方向における凸部１２の間隔Ｓｙとは同じでもよく、異なっていてもよい。
本実施形態における凸部１２の周期は、（Ｗｘ＋Ｓｘ）の値Ｐ１と、（Ｗｙ＋Ｓｙ）の値Ｐ２の二通り存在する。該Ｐ１とＰ２が互いに異なる場合は、少なくとも一方が光学検出において検出される検出光の波長の５０％以下であり、２０％以下が好ましい。Ｐ１とＰ２の両方が前記範囲であることが好ましい。
FIG. 2 is a perspective view showing a second embodiment of the substrate of the present invention. The drawing schematically shows an enlarged part of the surface of the
This embodiment is different from the first embodiment in that, in the first embodiment, the repeating direction of the
In the present embodiment, the cross-sectional shape perpendicular to the X direction and the cross-sectional shape perpendicular to the Y direction of the
The width Wx in the X direction and the width Wy in the Y direction of the
There are two periods of the
図２の例では凸部１２の断面形状は矩形であるが、前記第１の実施形態と同様に適宜変更できる。たとえば、凸部１２のＸ方向に垂直な断面形状およびＹ方向に垂直な断面形状の一方または両方が台形であってもよく、三角形であってもよい。また凸部１２の間隔Ｓｘおよび／またはＳｙがゼロであってもよい。
さらに、図２の例では凸部１２をＺ方向から見たときの形状が矩形であるが、これに限らず適宜変更できる。たとえば三角形であってもよく、円形であってもよい。
本実施形態における凸部２の寸法および周期の好ましい数値範囲は、第１の実施形態と同様である。
In the example of FIG. 2, the cross-sectional shape of the
Further, in the example of FIG. 2, the shape when the
The preferable numerical range of the dimension and the period of the
なお、前記第１および第２の実施形態では、基板表面の所定深さＤの一層において凸部が周期的に設けられている例を示したが、凸部が周期的に設けられている層が複数層積層された表面構造であってもよい。
すなわち、基板の最表層として、凸部の深さがＤ１である第１の凸部が周期的に形成された第１の層が設けられており、その下層として、第１の凸部の底面（第１の凸部の頂面から深さＤ１の面）からの深さがＤ２である第２の凸部が周期的に形成された第２の層が設けられていてもよい。Ｄ１とＤ２は同じであってもよく、異なっていてもよい。第１の凸部の周期構造と、第２の凸部の周期構造とは、Ｚ方向からみたときに重なり合わない構造である。両者の周期は互いに同じでもよく、異なっていてもよい。
In the first and second embodiments, the example in which the convex portions are periodically provided in one layer of the predetermined depth D on the substrate surface is shown, but the layer in which the convex portions are periodically provided. May be a surface structure in which a plurality of layers are stacked.
That is, a first layer in which first protrusions having a protrusion depth D1 are periodically formed is provided as an outermost layer of the substrate, and a bottom surface of the first protrusion is provided as a lower layer. A second layer in which second protrusions having a depth D2 from the top surface of the first protrusion (D1 from the top surface) are periodically formed may be provided. D1 and D2 may be the same or different. The periodic structure of the first convex part and the periodic structure of the second convex part are structures that do not overlap when viewed from the Z direction. Both periods may be the same or different.
本発明の光学検出用基板は、基板上に定着させた物質から発せられる特定波長の検出光を検出する方法に用いられる。検出として定性分析、定量分析等を行うことができる。
たとえば検出対象物質が生体高分子であり、これを光学検出する基板の例としてＤＮＡチップがあるが、本発明の基板はタンパクチップや細胞チップ等に用いてもよい。
The optical detection substrate of the present invention is used in a method for detecting detection light having a specific wavelength emitted from a substance fixed on a substrate. As detection, qualitative analysis, quantitative analysis, and the like can be performed.
For example, a detection target substance is a biopolymer, and a DNA chip is an example of a substrate for optically detecting the substance. However, the substrate of the present invention may be used for a protein chip, a cell chip, or the like.
基板上に定着させる物質は、特に制限されず、たとえば細胞、ＤＮＡ、ＲＮＡ、蛋白質、有機化合物、無機化合物等が挙げられる。
細胞の具体例としては、ヒトや動植物由来の細胞、ウィルス、カビ等の細菌・古細菌類等が挙げられる。
蛋白質の具体例としては、水溶性蛋白質、ケラチン、コラーゲン、フィブロイン、セリシン、糖蛋白質、バクテリオロドプシン等の膜蛋白質、コート蛋白質、アルブミン、血清等が挙げられる。
ＤＮＡやＲＮＡの具体例としては、生体物質から抽出増幅したｃＤＮＡ、人工合成されたオリゴＤＮＡ等が挙げられる。
有機化合物の具体例としては、アミノ基を含む含ケイ素化合物、アルコキシ基を含む含ケイ素化合物、フッ素を含む含ケイ素化合物等の含ケイ素化合物；スルホン酸基、カルボン酸基、水酸基、エステル基やアルキル基等を含むフッ素化合物；蛍光色素；フラーレンやフラーレン誘導体；遷移金属を含む有機金属化合物（特に希土類元素を含む有機金属化合物）；クラウンエーテル、フェナントロリンやポルフィリン等の大環式化合物；等が挙げられる。
無機化合物の具体例としては、酸化チタン、二酸化ケイ素等の金属酸化物微粒子；窒化チタン等の窒化金属；白金、金、銀、銅、ゲルマニウム等の金属微粒子；炭素化合物等が挙げられる。
基板上に定着されている物質は、１種でもよく２種以上でもよい。また検出対象物質そのものであってもよく、検出対象物質とそれ以外の物質とが結合したものであってもよい。
The substance to be fixed on the substrate is not particularly limited, and examples thereof include cells, DNA, RNA, proteins, organic compounds, and inorganic compounds.
Specific examples of the cell include cells derived from humans and animals and plants, bacteria and archaea such as viruses and molds.
Specific examples of the protein include water-soluble protein, keratin, collagen, fibroin, sericin, glycoprotein, membrane protein such as bacteriorhodopsin, coat protein, albumin, serum and the like.
Specific examples of DNA and RNA include cDNA extracted and amplified from biological materials, and artificially synthesized oligo DNA.
Specific examples of the organic compound include silicon-containing compounds containing amino groups, silicon-containing compounds containing alkoxy groups, silicon-containing compounds such as fluorine-containing silicon compounds; sulfonic acid groups, carboxylic acid groups, hydroxyl groups, ester groups and alkyls. Fluorine compounds containing groups, etc .; fluorescent dyes; fullerenes and fullerene derivatives; organometallic compounds containing transition metals (especially organometallic compounds containing rare earth elements); macrocyclic compounds such as crown ethers, phenanthrolines and porphyrins, etc. .
Specific examples of the inorganic compound include metal oxide fine particles such as titanium oxide and silicon dioxide; metal nitride such as titanium nitride; metal fine particles such as platinum, gold, silver, copper, and germanium; carbon compounds.
The substance fixed on the substrate may be one type or two or more types. Moreover, it may be the detection target substance itself, or may be a combination of the detection target substance and another substance.
基板上に物質を定着させる方法は、検出中に基板上の物質が流動しない程度に固定化できる方法であればよく、既知の手法を用いることができる。
例えば、定着させる物質を含む液体を基板上の特定の面積の領域に、特定の容積で、かつ特定のスポット形状でドット状に点着させることが好ましい。基板上に液滴を点着させる場合、光学検出における画像処理が容易であることから、液滴の平面形状（スポット形状）が真円に近いほど好ましい。また該液滴を上方から平面視したときの大きさは、最も大きい径が５０〜５００μｍの範囲が好ましく、８０〜２００μｍの範囲がより好ましい。基板上に定着されている物質は、溶剤が除去された乾燥物であってもよい。
The method for fixing the substance on the substrate may be any method that can fix the substance on the substrate so that the substance on the substrate does not flow during detection, and a known method can be used.
For example, it is preferable that the liquid containing the substance to be fixed is spotted in a specific area on the substrate in a dot shape with a specific volume and a specific spot shape. When spotting a droplet on a substrate, it is preferable that the planar shape (spot shape) of the droplet is closer to a perfect circle because image processing in optical detection is easy. In addition, the size of the droplet when viewed from above is preferably in the range of 50 to 500 μm, and more preferably in the range of 80 to 200 μm, with the largest diameter. The substance fixed on the substrate may be a dried product from which the solvent has been removed.
基板上に物質を定着させる具体的方法の一例としては、まず所定の物質を含有する液体を調製する。該液体は、溶液、コロイド溶液、懸濁液、分散液等のいずれでもよい。溶剤は任意のものを用いることができ、緩衝液に溶解または分散させてもよい。
次いで、該液体を塗布または点着して、基板上に定着させる。点着方法としては、たとえばステンレス製のピンの先端に該液体を液滴状に付着させ、該液滴を基板表面に接触させることにより、該液滴を基板表面に移動させる方法を用いることができる。
この後、必要であれば、乾燥させて液滴中の溶剤を留去してもよい。
また、基板上に定着させた物質に対して、ブロッキングと呼ばれる、基板上の不要になった化学的活性点を不活性化する処理等を施してもよい。
As an example of a specific method for fixing a substance on a substrate, first, a liquid containing a predetermined substance is prepared. The liquid may be any of a solution, a colloidal solution, a suspension, a dispersion, and the like. Any solvent can be used, and it may be dissolved or dispersed in a buffer solution.
Next, the liquid is applied or spotted and fixed on the substrate. As the spotting method, for example, a method is used in which the liquid is attached to the tip of a stainless steel pin in the form of a droplet, and the droplet is moved to the substrate surface by contacting the droplet with the substrate surface. it can.
Thereafter, if necessary, the solvent in the droplets may be distilled off by drying.
In addition, the substance fixed on the substrate may be subjected to a process called blocking, which inactivates a chemically active site that is no longer necessary on the substrate.
基板上に物質を定着させる具体的方法の他の例としては、該物質を基板材料内に、または基板表面上に設けられる被覆層内に埋め込む方法または練り込む方法を用いることもできる。また、インクジェット等の一定量の液滴を吐出させる方法によって、基板上に定着させる物質を含んだ溶液を基板上の特定位置に付着させてもよい。
また、凸部を形成する方法として、モールド（転写型）を基板表面にプレスする工程を有する方法を用いる場合には、モールドの転写面（基板と接触する面）上に所定の物質を予め存在させておき、プレスによってモールドの形状を転写すると同時に、該物質をモールド上から基板上に移動させる方法を用いることもできる。
また、予め基板の表面上に所定の物質を存在させた状態で、モールドをプレスすることによって、凸部を形成すると同時に、該物質を基板表面に固定化する方法でもよい。
As another example of a specific method for fixing a substance on a substrate, a method of embedding or kneading the substance in a substrate material or a coating layer provided on a substrate surface can be used. Alternatively, a solution containing a substance to be fixed on the substrate may be attached to a specific position on the substrate by a method of discharging a certain amount of droplets such as an ink jet.
In addition, when a method having a step of pressing a mold (transfer mold) onto the substrate surface is used as a method of forming the convex portion, a predetermined substance is present in advance on the transfer surface of the mold (the surface in contact with the substrate). It is also possible to use a method in which the shape of the mold is transferred by pressing and at the same time the substance is moved from the mold onto the substrate.
Alternatively, a method may be used in which a convex is formed by pressing a mold in a state where a predetermined substance is present on the surface of the substrate in advance, and at the same time, the substance is immobilized on the substrate surface.
基板上に定着された物質から発せられる特定波長の検出光を検出する方法は、特に制限されず、既知の各種の手法を用いることができる。例えば、共焦点顕微鏡の光学系を備えた測定装置内で基板を平面方向に動かして基板上をスキャンする方法、またはＣＣＤ等の撮像素子によって基板平面の一部または全部を一度に測定装置に取り入れる方法、等が挙げられる。 A method for detecting detection light having a specific wavelength emitted from a substance fixed on the substrate is not particularly limited, and various known methods can be used. For example, a method of scanning a substrate by moving the substrate in a plane direction in a measurement apparatus equipped with an optical system of a confocal microscope, or a part or all of the substrate plane is taken into the measurement apparatus at once by an image sensor such as a CCD. Method, etc.
本発明の基板は、表面に微細な凸部が周期的に設けられており、該微細な凸部の周期が検出光の波長の５０％以下であるため、基板表面に達した検出光が、回折や干渉を生じるのを防止することができ、バックグラウンドノイズを低レベルに抑えることができる。
また基板表面に微細な凸部を設けたことにより基板の表面積が増大するため、基板表面に定着される物質の量が増え、その結果、検出光強度を増大できる。
したがって本発明の基板を用いることにより、光学検出におけるＳ／Ｎ比を改善して、検出感度を向上させることができる。
In the substrate of the present invention, fine convex portions are periodically provided on the surface, and the period of the fine convex portions is 50% or less of the wavelength of the detection light, so that the detection light reaching the substrate surface is Generation of diffraction and interference can be prevented, and background noise can be suppressed to a low level.
Further, since the surface area of the substrate is increased by providing the fine convex portions on the substrate surface, the amount of the substance fixed on the substrate surface is increased, and as a result, the detection light intensity can be increased.
Therefore, by using the substrate of the present invention, it is possible to improve the detection sensitivity by improving the S / N ratio in optical detection.
また本発明の基板は、表面に微細な凸部が周期的に設けられているため、物質の良好な定着性が得られる。すなわち、基板上の多数の微小領域に物質を精度良く、かつスポット形状が均一となるように安定して定着させることができる。これにより、光学検出における精度を向上させることができる。 In addition, since the substrate of the present invention has fine convex portions periodically provided on the surface, good fixability of the substance can be obtained. That is, the substance can be stably fixed to a large number of minute regions on the substrate with high accuracy and a uniform spot shape. Thereby, the precision in optical detection can be improved.
１、１１ 基板
２、１２ 凸部
1,11
Claims (7)
該基板の表面に微細な凸部が周期的に設けられており、該凸部の周期が前記検出光の波長の５０％以下であることを特徴とする光学検出用基板。 A substrate used in a method for detecting detection light of a specific wavelength emitted from a substance fixed on a substrate,
A substrate for optical detection, wherein fine convex portions are periodically provided on the surface of the substrate, and the cycle of the convex portions is 50% or less of the wavelength of the detection light.
前記基板として、基板の表面に微細な凸部が周期的に設けられており、該凸部の周期が前記検出光の波長の５０％以下である基板を用いることを特徴とする光学検出方法。
In a method for detecting detection light of a specific wavelength emitted from a substance fixed on a substrate,
An optical detection method characterized by using a substrate in which fine convex portions are periodically provided on the surface of the substrate and the period of the convex portions is 50% or less of the wavelength of the detection light.
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