JP2003035710A - Substrate for biosensor and biosensor using the same - Google Patents
Substrate for biosensor and biosensor using the sameInfo
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Abstract
Description
【０００１】[0001]
【発明の属する技術分野】本発明は、バイオセンサー基
板の表面の光の反射を防止することにより、標識として
用いた蛍光色素が発光して生じる蛍光の測定のバックグ
ラウンドを減らすことができ、感度および解像度の向上
を可能にするバイオセンサー用基板、およびこれを用い
たバイオセンサーに関するものである。TECHNICAL FIELD The present invention can reduce the background of fluorescence measurement caused by the emission of a fluorescent dye used as a label by preventing the reflection of light on the surface of a biosensor substrate, thereby improving sensitivity. The present invention also relates to a biosensor substrate capable of improving resolution, and a biosensor using the same.
【０００２】[0002]
【従来の技術】バイオセンサーは、顕微鏡用のガラスス
ライド大の基板上に、例えば、多種類の遺伝子ＤＮＡを
個々のスポットに分けて貼付け、固定させ、検体として
は予め蛍光剤等で標識を付けたものを適用した後、レー
ザービームを用いたスキャニングにより、蛍光を検出す
ることにより、いずれのＤＮＡ部分が発光したかの発現
パターンを求め、既知の発現パターンと比較することに
より、遺伝子の発現プロファイルを求める等に利用され
るものである。2. Description of the Related Art A biosensor, for example, is a glass slide-sized substrate for a microscope. For example, various types of gene DNA are attached to individual spots and fixed, and a specimen is labeled with a fluorescent agent or the like in advance. After applying the above, the expression pattern of which DNA portion emitted light was obtained by detecting fluorescence by scanning with a laser beam, and the expression pattern of the gene was obtained by comparing with the known expression pattern. It is used for asking for.
【０００３】しかしながら、従来のバイオセンサーの基
板には、表面が平坦な素材が用いられており、蛍光測定
の際に、表面反射によるバックグラウンドの存在が無視
できず、測定感度の向上や解像度の向上の上で障害とな
っていた。また、多数の測定用のスポットを作成する際
に、スポット作成用液が所定の場所から移動しやすい欠
点もある。また、表面のマット加工によって反射を抑制
しようとすると、多数のスポットを位置精度よく設定す
る際の障害となる上、検出時に、例えば、蛍光の発光す
る方向が乱れる原因となり得る。However, a material having a flat surface is used for the substrate of the conventional biosensor, and the presence of the background due to the surface reflection cannot be ignored in the fluorescence measurement, so that the measurement sensitivity is improved and the resolution is improved. It was an obstacle to improvement. Further, there is a drawback that the spot forming liquid is easily moved from a predetermined place when forming a large number of measurement spots. In addition, if the reflection is suppressed by matting the surface, it may be an obstacle to setting a large number of spots with high position accuracy, and may cause, for example, the direction of fluorescence emission to be disturbed during detection.
【０００４】[0004]
【発明が解決しようとする課題】本発明においては、従
来、バイオセンサー用基板が平坦な素材からなる場合、
表面反射による測定時のバックグラウンドが無視でき
ず、測定感度、および解像度の向上の障害となっていた
点や、スポット作成の際に、スポット作成用液が移動し
やすい点、あるいは、マット加工したガラス板を用いる
ことによって反射を抑制しようとすると、スポット配置
の際の位置精度を確保しずらい原因、もしくは検出時の
蛍光の発光する方向が乱れる原因となる点を解消するこ
とを課題とする。In the present invention, conventionally, when the biosensor substrate is made of a flat material,
The background at the time of measurement due to surface reflection was not negligible, which was an obstacle to improvement of measurement sensitivity and resolution, the point that the spot preparation liquid was easily moved at the time of spot preparation, or matte processing was performed. An object of the present invention is to solve the problem that, when trying to suppress reflection by using a glass plate, it is difficult to secure the positional accuracy in spot placement, or the point that causes the fluorescence emission direction at the time of detection to be disturbed. .
【０００５】[0005]
【課題を解決する手段】例えば、透明板の表面に、光の
波長以下のピッチの微細な凹凸パターンを形成した微細
凹凸板は、凹凸の底部では、透明板の屈折率そのものを
示し、凹凸の表面側に近づくほど、透明板を構成する素
材が占める割合が低下して、代わりに空気の割合が増加
するから、あたかも、光の屈折率が連続的に変化する層
を多数積層したのと同様な効果を持ち、反射を防止し得
ることが知られている。本発明においては、このような
特殊な微細凹凸を、バイオセンサーの基板の表面の構造
として持ち込むことにより、光の反射に関する点のみな
らず、課題として挙げたいずれの点も解消することが可
能となった。Means for Solving the Problems For example, a fine uneven plate in which a fine uneven pattern having a pitch equal to or less than the wavelength of light is formed on the surface of a transparent plate shows the refractive index itself of the transparent plate at the bottom of the unevenness. The closer the surface side is, the lower the proportion of the material that makes up the transparent plate becomes, and instead the higher the proportion of air becomes, so it is as if a number of layers in which the refractive index of light changes continuously are laminated. It is known that it has various effects and can prevent reflection. In the present invention, by bringing in such a special fine unevenness as the structure of the surface of the substrate of the biosensor, it is possible to solve not only the point concerning the reflection of light but also any of the points mentioned as the problems. became.
【０００６】第１の発明は、透明基板の片面に光の波長
以下のピッチの無数の微細凹凸が形成された凹凸面を有
することを特徴とするバイオセンサー用基板に関するも
のである。第２の発明は、第１の発明において、前記微
細凹凸が、レーザー光を二もしくは三以上に分割して干
渉露光させることにより、ピッチが光の波長以下の無数
の微細凹凸が形成された凹凸型面を有する賦型用型を用
いて得られたものであることを特徴とするバイオセンサ
ー用基板に関するものである。第３の発明は、第１また
は第２の発明において、前記微細凹凸上に有機物質層が
積層されていることを特徴とするバイオセンサー用基板
に関するものである。第４の発明は、第３の発明におい
て、前記有機物質層がアミノ基もしくはメルカプト基を
有するシランカップリング剤からなることを特徴とする
バイオセンサー用基板に関するものである。第５の発明
は、第３または第４の発明のバイオセンサー用基板の前
記有機物質層上に、生理活性物質層が固定されているこ
とを特徴とするバイオセンサーに関するものである。第
６の発明は、第５の発明において、前記生理活性物質層
が、核酸、非免疫蛋白質、免疫グロブリン結合性蛋白
質、糖結合性蛋白質、糖を認識する糖類、リガンド結合
能を有するポリペプチドもしくはオリゴペプチド、もし
くは免疫性蛋白質のいずれかからなることを特徴とする
バイオセンサーに関するものである。第７の発明は、第
６の発明において、記生理活性物質層が前記有機質層を
構成する有機物質と架橋剤により架橋されて固定されて
いることを特徴とするバイオセンサーに関するものであ
る。A first aspect of the present invention relates to a substrate for a biosensor, which has a concavo-convex surface having innumerable fine concavities and convexities formed on one surface of a transparent substrate and having a pitch equal to or less than the wavelength of light. 2nd invention is 1st invention, WHEREIN: The said unevenness | corrugation formed the innumerable minute unevenness | corrugation whose pitch is below the wavelength of light by dividing laser light into 2 or 3 or more, and performing interference exposure. The present invention relates to a biosensor substrate, which is obtained by using an imprinting mold having a mold surface. A third invention relates to the biosensor substrate according to the first or second invention, wherein an organic material layer is laminated on the fine irregularities. A fourth aspect of the present invention relates to the biosensor substrate according to the third aspect, wherein the organic substance layer comprises a silane coupling agent having an amino group or a mercapto group. A fifth invention relates to a biosensor characterized in that a bioactive substance layer is fixed on the organic substance layer of the biosensor substrate of the third or fourth invention. In a sixth aspect based on the fifth aspect, the physiologically active substance layer is a nucleic acid, a non-immunity protein, an immunoglobulin-binding protein, a sugar-binding protein, a sugar that recognizes sugar, a polypeptide having a ligand-binding ability, or The present invention relates to a biosensor characterized by comprising either an oligopeptide or an immune protein. A seventh invention relates to the biosensor according to the sixth invention, wherein the physiologically active substance layer is crosslinked and fixed with an organic substance constituting the organic layer by a crosslinking agent.
【０００７】[0007]
【発明の実施の形態】図を引用して、本発明を説明す
る。図１は、本発明のバイオセンサーの概略を示す図
で、基板２上に、例えば、微小なＤＮＡスポット４が、
格子状に配列したものであり、必要に応じ、このような
スポット４の数は、数千〜数十万であり得る。基板２
は、ＤＮＡスポット４を有する側が、光の波長以下のピ
ッチの無数の微細凹凸が形成された凹凸面となっている
ものである。この微細凹凸面は、レーザー光を二もしく
は三以上に分割して干渉露光させることにより、ピッチ
が光の波長以下の無数の微細凹凸が形成された凹凸型面
を有する賦型用型を用いて得られたものであることが好
ましい。The present invention will be described with reference to the drawings. FIG. 1 is a diagram showing an outline of the biosensor of the present invention. For example, a minute DNA spot 4 is formed on a substrate 2.
The spots 4 are arranged in a grid pattern, and the number of such spots 4 can be several thousands to several hundreds of thousands, if necessary. Board 2
Shows that the side having the DNA spots 4 is an uneven surface on which innumerable fine unevenness having a pitch equal to or less than the wavelength of light is formed. This fine uneven surface is divided into two or three or more laser beams and subjected to interference exposure, by using an imprinting mold having an uneven mold surface having innumerable fine unevenness with a pitch equal to or shorter than the wavelength of light. It is preferably obtained.
【０００８】基板２の素材としては、バイオセンサー用
基板として通常、使用されているものであれば、いずれ
の素材でもよく、一般的にはガラスや、レーザー光に対
して透明な無機もしくは有機材料からなる。基板２の厚
みは、１ｍｍ〜５ｍｍ程度である。必要により、基板２
は、ＤＮＡスポット４を設けない側や側面に補強を施し
てあってもよい。基板２を構成し得る有機材料として
は、セルロースジアセテート、セルローストリアセテー
ト、セルロースアセテートブチレート、ポリエステル、
ポリアミド、ポリイミド、ポリエーテルスルフォン、ポ
リスルフォン、ポリプロピレン、ポリメチルペンテン、
ポリ塩化ビニル、ポリビニルアセタール、ポリエーテル
ケトン、ポリメタクリル酸メチル、ポリカーボネート、
もしくはポリウレタン等の熱可塑性樹脂を挙げることが
できる。The substrate 2 may be made of any material as long as it is usually used as a biosensor substrate, and is generally glass or an inorganic or organic material transparent to laser light. Consists of. The thickness of the substrate 2 is about 1 mm to 5 mm. If necessary, board 2
May be reinforced on the side or side surface where the DNA spot 4 is not provided. Examples of the organic material that can form the substrate 2 include cellulose diacetate, cellulose triacetate, cellulose acetate butyrate, polyester,
Polyamide, polyimide, polyether sulfone, polysulfone, polypropylene, polymethylpentene,
Polyvinyl chloride, polyvinyl acetal, polyether ketone, polymethylmethacrylate, polycarbonate,
Alternatively, a thermoplastic resin such as polyurethane can be used.
【０００９】光の波長以下のピッチの微細凹凸３の形状
としては、図２（ａ）〜図２（ｅ）に例示するような断
面形状のものがあり得る。光の波長以下のピッチの微細
凹凸３の形状としては、図２（ａ）に示すような断面の
上縁の形状が正弦曲線のもの以外にも、図２（ｂ）に示
すような断面の頂部が円弧状で、立ち上がり部分が直線
状であり、上へ行くほどすぼまった形状のもの、もしく
は図２（ｃ）に示すような三角波状のもの等があり得
る。As the shape of the fine unevenness 3 having a pitch equal to or less than the wavelength of light, there may be a cross-sectional shape as illustrated in FIGS. 2 (a) to 2 (e). As the shape of the fine unevenness 3 having a pitch equal to or less than the wavelength of light, in addition to the shape of the upper edge of the cross section shown in FIG. 2 (a) having a sinusoidal shape, the shape of the cross section shown in FIG. The top may be arcuate, the rising portion may be straight, and the shape may be narrower toward the top, or may be triangular as shown in FIG. 2C.
【００１０】これらの図２（ａ）〜図２（ｃ）に示す断
面形状の微細凹凸３は、微細凹凸３の水平方向の位置に
よって深さが変動するので、特に好ましく、このような
断面形状のものを使用すると、前に述べたように、深さ
によって、光の屈折率が連続的に変化し、通常、図中、
上の方が屈折率が低く、下の方が屈折率が高い。The fine unevenness 3 having the cross-sectional shape shown in FIGS. 2A to 2C is particularly preferable because the depth varies depending on the horizontal position of the fine unevenness 3. As described above, the refractive index of light continuously changes depending on the depth, as shown in FIG.
The upper part has a lower refractive index and the lower part has a higher refractive index.
【００１１】微細凹凸３の形状としては、図２（ｄ）に
示すような矩形波状のものや、図２（ｅ）に示すような
台形が倒立したような形状のものもあり得る。図２
（ｄ）に示す形状のものでは、矩形波の部分では深さに
よらず、屈折率が一定であり、ピッチや波の幅を決める
ことにより、一定でかつ所定の値の屈折率を実現するこ
とができる。また、図２（ｅ）に示す形状のものでは、
図中、上の方が屈折率が高く、下の方が屈折率が低い。
この断面形状は上すぼまりでないので、型を用いて形成
する際には離型が難しい。The shape of the fine irregularities 3 may be a rectangular wave shape as shown in FIG. 2D or an inverted trapezoidal shape as shown in FIG. 2E. Figure 2
In the case of the shape shown in (d), the refractive index is constant in the rectangular wave portion irrespective of the depth, and a constant and predetermined value is realized by determining the pitch and the width of the wave. be able to. Further, in the case of the shape shown in FIG. 2 (e),
In the figure, the upper part has a higher refractive index and the lower part has a lower refractive index.
Since this cross-sectional shape is not an upward concavity, it is difficult to release the mold when using a mold.
【００１２】微細凹凸３の平面的な配列は、微細凹凸３
のある側の上側から観察すると、図３（ａ）に斜視図で
示すように、平行な溝３ａを形成したものや、図３
（ｂ）もしくは（ｃ）に上方から見た図（同心円は等高
線を示す。）で示すように、平面的に並べて配列して形
成したものとが有り得る。いずれのタイプのものも、反
射防止性を有するが、図３（ａ）に示すような溝状のタ
イプのものは方向性を有するために、反射率の方向性が
生じる可能性があり、図３（ｂ）もしくは（ｃ）に示す
ような二次元に配列した形状のものは、事実上、方向性
が生じないので好ましい。The planar arrangement of the fine unevenness 3 is such that
When observed from the upper side of the side with the groove, as shown in a perspective view in FIG.
As shown in the view (concentric circles show contour lines) seen from above in (b) or (c), they may be formed by arranging them side by side in a plane. Both types have antireflection property, but the groove type as shown in FIG. 3 (a) has directionality, and therefore the directionality of reflectance may occur. The two-dimensionally arrayed shape as shown in 3 (b) or (c) is preferable because it does not cause directionality in practice.
【００１３】微細凹凸３ａの形状自体には種々のものが
あるにせよ、断面形状に表れる凹凸の波のピッチ（＝周
期）は、光の波長以下の微細なものである。ここで「光
の波長」とは、可視光の波長を指し、従って、微細な程
度を表現する「光の波長以下のピッチ」とは、ピッチが
４００ｎｍ以下であることを指す。ただし、測定が可視
光よりも長波長側で行なわれる場合には、４００ｎｍと
は限らない。ピッチの下限は特にないが、型を用いて形
成する際の精度を考慮すると、５０ｎｍ以上であること
が好ましい。Although there are various shapes of the fine irregularities 3a, the pitch (= period) of the waves of the irregularities appearing in the cross-sectional shape is a fine one equal to or less than the wavelength of light. Here, the “wavelength of light” refers to the wavelength of visible light, and thus “pitch equal to or less than the wavelength of light” that represents a fine degree means that the pitch is 400 nm or less. However, it is not limited to 400 nm when the measurement is performed on the longer wavelength side than visible light. The lower limit of the pitch is not particularly limited, but it is preferably 50 nm or more in consideration of accuracy when forming using a mold.
【００１４】微細凹凸３の断面形状の、波の高低差が大
きい方が、反射率が低くなり、反射防止効果があるた
め、高低差は１００ｎｍ以上であることが好ましい。上
限は特に無いが、通常のピッチである５０ｎｍ〜４００
ｎｍを想定すると、ピッチの値の１００％〜２００％程
度であることが好ましく、１００ｎｍ〜５００ｎｍ程度
である。It is preferable that the height difference be 100 nm or more because the larger the difference in wave height of the cross-sectional shape of the fine irregularities 3, the lower the reflectance and the antireflection effect. There is no particular upper limit, but the normal pitch is 50 nm to 400.
Assuming nm, the pitch value is preferably about 100% to 200%, and more preferably about 100 nm to 500 nm.
【００１５】基板２の微細凹凸３を有する面には、接着
性の向上のために、通常、行なわれ得る各種の処理、即
ち、コロナ放電処理、酸化処理等の物理的な処理のほ
か、アンカー剤（プライマー剤とも呼ばれる。）の塗布
による化学的処理を予め行なって、アンカー層を形成し
ておいてもよい。On the surface of the substrate 2 having the fine irregularities 3, in order to improve the adhesiveness, various treatments that can be usually performed, that is, physical treatments such as corona discharge treatment and oxidation treatment, and anchors are performed. The anchor layer may be formed in advance by performing a chemical treatment by applying an agent (also called a primer agent).
【００１６】アンカー層を構成する樹脂としては、ポリ
エステル樹脂、ポリウレタン樹脂、ポリエチレンイミン
樹脂、ポリブタジエン系樹脂、アクリル樹脂、ポリカー
ボネート樹脂、もしくは塩化ビニル／酢酸ビニル共重合
体等である。これらの樹脂のうち一種もしくは二種以上
を適宜な溶剤に溶解して塗料もしくはインキとしたもの
を塗付もしくは印刷してアンカー層を形成する。このほ
か、アルキルチタネート系のアンカー剤を使用してアン
カー層を形成することもできる。The resin constituting the anchor layer is polyester resin, polyurethane resin, polyethyleneimine resin, polybutadiene resin, acrylic resin, polycarbonate resin, vinyl chloride / vinyl acetate copolymer or the like. One or more of these resins are dissolved in an appropriate solvent to form a paint or ink, which is applied or printed to form the anchor layer. In addition, the anchor layer can be formed by using an alkyl titanate-based anchor agent.
【００１７】基板２の表面の微細凹凸３は、最も効率的
には、微細凹凸３の逆型形状を型面として持つ賦型用型
を用いて形成され、基板２がガラスであれば、ガラス板
製造時の溶融状態、もしくは一旦製造したガラス板を再
度溶融した状態で、賦型用型を押し付けることにより、
形成することができる。基板２が熱可塑性樹脂で構成さ
れる場合には、微細凹凸３は、基板２の製造時の溶融状
態もしくは液体状態で賦型用型を用いることにより、形
成することができる。The fine concavities and convexities 3 on the surface of the substrate 2 are most efficiently formed by using an imprinting mold having an inverse shape of the fine concavities and convexities 3 as a mold surface. By pressing the shaping mold in the molten state at the time of plate production, or in the state where the glass plate once produced is melted again,
Can be formed. When the substrate 2 is made of a thermoplastic resin, the fine irregularities 3 can be formed by using a shaping mold in a molten state or a liquid state at the time of manufacturing the substrate 2.
【００１８】あるいは、プラスチックの射出成形やアク
リル樹脂の注型重合等の際に、型の内面に、微細凹凸３
の逆型形状を形成しておき、溶融樹脂を射出、または、
モノマーもしくはプレポリマーを注入することにより、
微細凹凸３を形成することができる。また、これら射出
成形やアクリル樹脂の注型重合の際に、型の内面に、微
細凹凸３の逆型形状を有するフィルム状物を配置して
も、同様な結果を得ることができる。Alternatively, in the case of injection molding of plastic or casting polymerization of acrylic resin, fine irregularities 3 are formed on the inner surface of the mold.
Inject the molten resin in advance, or
By injecting monomer or prepolymer,
The fine unevenness 3 can be formed. Similar results can be obtained by arranging a film-like material having an inverse shape of the fine concavities and convexities 3 on the inner surface of the mold during these injection molding and cast polymerization of the acrylic resin.
【００１９】微細凹凸３は、電離放射線硬化性樹脂組成
物を用いて形成することもできる。この場合、電離放射
線硬化性樹脂組成物の硬化物からなる基板２上に微細凹
凸３が直接形成されたもの、基板２上に、電離放射線硬
化性樹脂組成物の硬化物からなる透明層が積層され、そ
の透明層上に微細凹凸３が形成されたもの、もしくは基
板２とは別の、例えば、薄い透明フィルムに微細凹凸３
が形成された透明層が積層されたものが、基板２上に積
層されたもの等があり得る。The fine irregularities 3 can also be formed by using an ionizing radiation curable resin composition. In this case, the fine unevenness 3 is directly formed on the substrate 2 made of a cured product of the ionizing radiation curable resin composition, and the transparent layer made of the cured product of the ionizing radiation curable resin composition is laminated on the substrate 2. The transparent layer has fine irregularities 3 formed thereon, or the fine irregularities 3 are formed on a thin transparent film different from the substrate 2, for example.
There may be a case where the transparent layer having the layer formed thereon is laminated and a case where the transparent layer is laminated on the substrate 2.
【００２０】電離放射線硬化性樹脂組成物としては、硬
化後の硬度が、ＪＩＳ Ｋ５４００で示す鉛筆硬度試験
で「Ｈ」以上の硬度を示すものがより好ましい。また、
透明層の光の屈折率は、反射防止性能を発揮するために
は低い方が好ましいが、長期間使用するには、表面の耐
久性、特に耐擦傷性が必要であり、硬度を高くした方が
有利になるため、密度を上げて硬度を高くする必要があ
る。従って、透明層の光の屈折率としては、１．４〜
１．７、より好ましくは、１．６以下である。As the ionizing radiation curable resin composition, it is more preferable that the hardness after curing shows a hardness of "H" or more in the pencil hardness test shown in JIS K5400. Also,
The light refractive index of the transparent layer is preferably low in order to exhibit antireflection performance, but for long-term use, surface durability, particularly scratch resistance, is required, and hardness is high. Therefore, it is necessary to increase the density to increase the hardness. Therefore, the refractive index of light of the transparent layer is 1.4 to
1.7, and more preferably 1.6 or less.
【００２１】電離放射線硬化性樹脂組成物としては、分
子中に重合性不飽和結合または、エポキシ基を有する化
合物のプレポリマー、オリゴマー、及び／又はモノマー
を適宜に混合したものであり、分子中に重合性不飽和結
合または、エポキシ基を有する化合物としては、具体的
には、ポリエステル（メタ）アクリレート、ウレタン
（メタ）アクリレート、エポキシ（メタ）アクリレー
ト、ポリエーテル（メタ）アクリレート、ポリオール
（メタ）アクリレート、メラミン（メタ）アクリレー
ト、トリアジン系アクリレート等を挙げることができ
る。The ionizing radiation-curable resin composition is a compound prepared by appropriately mixing a prepolymer, an oligomer and / or a monomer of a compound having a polymerizable unsaturated bond or an epoxy group in the molecule. Specific examples of the compound having a polymerizable unsaturated bond or an epoxy group include polyester (meth) acrylate, urethane (meth) acrylate, epoxy (meth) acrylate, polyether (meth) acrylate, polyol (meth) acrylate. , Melamine (meth) acrylate, triazine acrylate and the like.
【００２２】「電離放射線硬化性樹脂組成物」における
電離放射線とは、通常は、紫外線又は電子線を指す。電
離放射線が紫外線であるときは、電離放射線硬化性樹脂
組成物として、アセトフェノン類、ベンゾフェノン類、
チオキサントン類、ベンゾイン、ベンゾインメチルエー
テル等の公知の光重合開始剤や光重合促進剤を添加した
ものを用いる。Ionizing radiation in the "ionizing radiation-curable resin composition" usually means ultraviolet rays or electron beams. When the ionizing radiation is ultraviolet rays, as the ionizing radiation curable resin composition, acetophenones, benzophenones,
A known photopolymerization initiator or photopolymerization accelerator such as thioxanthone, benzoin, or benzoin methyl ether is added.
【００２３】電離放射線硬化性樹脂組成物の硬化物への
微細凹凸３の形成は、複製用の賦型用型を作製して行な
うことが効率的である。賦型用型を作製するには、適当
な型基材上に、感光性樹脂を積層しておき、これにレー
ザー光干渉法により露光を行なう。なお、型基材に感光
性樹脂を積層したものとして、レリーフホログラム製造
用の市販の感光材を利用してもよい。The formation of the fine irregularities 3 on the cured product of the ionizing radiation-curable resin composition is efficiently performed by preparing a mold for duplication. In order to prepare a mold for molding, a photosensitive resin is laminated on an appropriate mold base material, and this is exposed by a laser light interference method. In addition, a commercially available photosensitive material for manufacturing a relief hologram may be used by stacking the photosensitive resin on the mold base material.
【００２４】露光は、レーザー光を二もしくは三以上に
分割して干渉させることにより行ない、露光後、感光性
樹脂の種類に応じた現像を行なって、ピッチが光の波長
以下の無数の微細凹凸が形成された凹凸型面を有する賦
型用型の原型を得る。The exposure is carried out by dividing the laser light into two or three or more and making them interfere with each other. After the exposure, development is carried out according to the kind of the photosensitive resin, and a myriad of fine irregularities having a pitch of not more than the wavelength of the light. A prototype of a mold for forming having a concavo-convex mold surface on which is formed is obtained.
【００２５】得られた原型は、通常、耐久性が充分では
ないので、量産に用いる際には、この原型にニッケル等
の金属でめっきを行なって剥がし、第１の金属製の型を
形成して使用するか、または第１の金属製の型にさらに
めっきを行なって、第２の金属製の型を幾つか形成して
使用することが好ましく、このように原型から複製され
た型を使用すると、型の損傷や摩耗の問題を回避するこ
とができる。Since the obtained master mold is usually not sufficiently durable, when used for mass production, the master mold is plated with a metal such as nickel and peeled off to form a first metal mold. It is preferable to use as a second metal mold by further plating on the first metal mold to form several second metal molds. In this way, a mold duplicated from the master mold is used. The problem of mold damage and wear can then be avoided.
【００２６】賦型用型をローラ面上に形成し、必要に応
じて、殖版（同一版面上に多面付けにすること）した型
ローラや、型面の形状をローラの面長方向および円周方
向に、連続的に形成したエンドレスの型ローラを使用す
ると、連続的な生産に向く。Forming dies are formed on the roller surface and, if necessary, a stencil plate (multi-faced on the same plate surface), or the shape of the die surface is the length direction of the roller and the circle. The use of endless mold rollers formed continuously in the circumferential direction is suitable for continuous production.
【００２７】ここで、原型と第２の金属製の型とは型面
の形状が同形状であり、原型と第１の金属製の型とは片
面の形状が互いに逆型形状の関係となる。また微細凹凸
３の形状と、それを製造するための型上の型面の微細凹
凸の形状とは逆型形状となるので、バイオセンサー用基
板として欲しい微細凹凸の形状が得られるよう、必要に
応じて、めっきによる金属型の形成を繰返して、微細凹
凸の形状を逆転させるとよい。ただし、微細凹凸の断面
形状が正弦曲線のような場合には、元の型形状と逆型形
状の違いが無い場合もある。この明細書における、賦型
用型の型面の微細凹凸の形状は、上記の例外的な場合を
除き、バイオセンサー用基板上に希望する微細凹凸の形
状が形成されるよう、逆型形状に形成されているものと
する。Here, the original mold and the second metal mold have the same shape on the mold surface, and the original mold and the first metal mold have a relationship in which one surface has an opposite mold shape. . In addition, the shape of the fine concavo-convex 3 and the shape of the fine concavo-convex on the mold surface for manufacturing the mold are opposite to each other. Therefore, it is necessary to obtain the fine concavo-convex shape desired for the biosensor substrate. Accordingly, the formation of the metal mold by plating may be repeated to reverse the shape of the fine irregularities. However, when the cross-sectional shape of the fine irregularities is a sine curve, there may be no difference between the original mold shape and the reverse mold shape. In this specification, the shape of the fine irregularities on the mold surface of the imprinting die is, except for the above exceptional cases, the reverse shape so that the desired fine irregularities are formed on the biosensor substrate. It has been formed.
【００２８】電離放射線硬化性樹脂組成物の硬化物上に
微細凹凸３を形成するには、例えば基板２と上記の賦型
用型とを準備し、まず、両者を液状の電離放射線硬化性
樹脂組成物を介して積層する。電離放射線硬化性樹脂組
成物は、先に基板２側に積層してもよいし、あるいは、
先に賦型用型と積層してもよい。In order to form the fine irregularities 3 on the cured product of the ionizing radiation-curable resin composition, for example, the substrate 2 and the above-mentioned mold for forming are prepared, and first, the both are formed into a liquid ionizing radiation-curable resin. Laminate through the composition. The ionizing radiation curable resin composition may be first laminated on the substrate 2 side, or
You may laminate | stack with a shaping | molding die first.
【００２９】積層後、電離放射線硬化性樹脂組成物に電
離放射線を照射する。電離放射線の照射により、電離放
射線硬化性樹脂組成物が硬化して硬化物が生成し、か
つ、基板２に接着するので、電離放射線の照射の後、電
離放射線硬化性樹脂組成物の硬化物を透明基板ごと、賦
型用型から離型することにより、表面に微細凹凸が形成
された電離放射線硬化性樹脂組成物の硬化物からなる透
明層が、基板２上に、積層された積層体を得ることがで
きる。なお、得られた積層体から基板２を剥がすことに
より、表面に微細凹凸が形成された電離放射線硬化性樹
脂組成物の硬化物からなる透明層を単独で得ることがで
きる。After lamination, the ionizing radiation curable resin composition is irradiated with ionizing radiation. Upon irradiation with ionizing radiation, the ionizing radiation-curable resin composition is cured to form a cured product and adheres to the substrate 2. Therefore, after irradiation with ionizing radiation, a cured product of the ionizing radiation-curable resin composition is A transparent layer made of a cured product of an ionizing radiation curable resin composition having fine irregularities formed on the surface of the transparent substrate is released on the substrate 2 by releasing the transparent substrate from the imprinting die. Obtainable. By peeling the substrate 2 from the obtained laminate, a transparent layer made of a cured product of an ionizing radiation curable resin composition having fine irregularities formed on the surface can be obtained alone.
【００３０】上記の工程は、型ローラに連続する透明フ
ィルムを供給し、型ローラと透明フィルムとの間に電離
放射線硬化性組成物を供給し、電離放射線硬化性組成物
を透明フィルムごと型ローラに巻き付けた状態で電離放
射線を照射して、電離放射線硬化性組成物を硬化させる
ことにより、連続的に行なうことができる。In the above process, a continuous transparent film is supplied to the mold roller, an ionizing radiation curable composition is supplied between the mold roller and the transparent film, and the ionizing radiation curable composition is applied together with the transparent film to the mold roller. It can be continuously carried out by irradiating with ionizing radiation in a state of being wrapped around and curing the ionizing radiation-curable composition.
【００３１】基板２の微細凹凸３上には、好ましくは、
ＵＶオゾンクリーナー等により、表面の清浄化を行なっ
た後、生理活性物質層を直接形成するか、もしくは有機
物質層を介して生理活性物質層を形成してバイオセンサ
ーとする。On the fine irregularities 3 of the substrate 2, preferably,
After cleaning the surface with a UV ozone cleaner or the like, a bioactive substance layer is directly formed, or a bioactive substance layer is formed via an organic substance layer to obtain a biosensor.
【００３２】図４は、有機物質層を介して生理活性物質
層を形成する場合の一例を模式的に示す図であり、この
例では、基板２の微細凹凸３を有する側にアミノ基を導
入し（図４（ａ））、アミノ基を利用してＤＮＡを固定
し（図４（ｂ））、使用の際には、蛍光剤で標識したＲ
ＮＡが相補的な構造を有する特定のＤＮＡと結合する
（図４（ｃ））ことを示している。こののち、レーザー
光等を当てることにより、蛍光剤で標識したＲＮＡが結
合した個所から蛍光発光が得られる。FIG. 4 is a diagram schematically showing an example of forming a physiologically active substance layer via an organic substance layer. In this example, an amino group is introduced into the side of the substrate 2 having the fine irregularities 3. (FIG. 4 (a)), DNA was immobilized using an amino group (FIG. 4 (b)), and at the time of use, R labeled with a fluorescent agent was used.
It is shown that NA binds to a specific DNA having a complementary structure (FIG. 4 (c)). After that, by applying laser light or the like, fluorescence emission can be obtained from the position where the RNA labeled with the fluorescent agent is bound.
【００３３】同様に、基板２の微細凹凸３を有する側に
メルカプト基を導入し（図５（ａ））、メルカプト基を
利用して架橋剤により既知の蛋白質（符号；Ｐｒ）を一
定の位置に固定し（図５（ｂ））、蛍光剤で標識した検
体の蛋白質が、バイオセンサー上の既知の蛋白質Ｐｒと
結合するタイプである場合には、結合する（図４
（ｃ））ことを示している。やはり、レーザー光等を当
てることにより、蛍光剤で標識した検体の蛋白質が結合
した個所から蛍光発光が得られる。Similarly, a mercapto group is introduced into the side of the substrate 2 having the fine irregularities 3 (FIG. 5 (a)), and a known protein (symbol: Pr) is placed at a fixed position by a crosslinking agent using the mercapto group. If the protein of the sample immobilized on (Fig. 5 (b)) and labeled with a fluorescent agent is of a type that binds to the known protein Pr on the biosensor, it binds (Fig. 4).
(C)) is shown. Again, by applying laser light or the like, fluorescence emission can be obtained from the site where the protein of the sample labeled with the fluorescent agent is bound.
【００３４】以上は好ましい例であるが、ここで導入し
たアミノ基やメルカプト基（実際にはこれらを有する化
合物）は、広くは、有機物質層として位置づけることが
でき、また、ＤＮＡや蛋白質は、生理活性物質層として
位置付けることができる。Although the above is a preferred example, the amino group and mercapto group (actually compounds having these) introduced here can be broadly regarded as an organic material layer, and DNA and protein are It can be positioned as a physiologically active substance layer.
【００３５】有機物質層は、好ましくは下記（１）〜
（８）のような官能基を有する化合物から構成される。
（１）−ＣＯＯＨ基、−ＣＨＯ基、−ＳＨ基、−ＮＨ2
基、−ＯＨ基、＝ＮＨ基、−ＣＯＮＨ2基、−ＮＣＯ
基、−ＣＯＯＲ基（Ｒは（ＣＨ2）ｎＨ）（ｎは１以
上）である。）、−（Ｏ（ＣＨ2）ｍ）ｎＯＨ基（ｍ、
ｎはいずれも１以上）、もしくは下記「化１」で示す官
能基のいずれか一または二以上を有することを特徴とす
る化合物。The organic material layer preferably has the following (1) to
It is composed of a compound having a functional group such as (8). (1) -COOH, -CHO,, -SH group, -NH 2
Group, -OH group, = NH group, -CONH 2 group, -NCO
Group, a —COOR group (R is (CH 2 ) nH) (n is 1 or more). ), - (O (CH 2 ) m) nOH group (m,
n is 1 or more), or a compound having any one or more of the functional groups represented by the following "Chemical formula 1".
【００３６】[0036]
【化１】 [Chemical 1]
【００３７】（２）窒素を含む化合物。(2) A compound containing nitrogen.
【００３８】（３）（イ）−ＣＯＯＨ基、−ＣＯＯＲ基
（Ｒは（ＣＨ2）ｎＨ）（ｎは１以上）である。）、−
ＳＨ基、−ＮＨ2基、−ＯＨ基、＝ＮＨ基、−ＣＯＮＨ2
基、もしくは−（Ｏ（ＣＨ2）ｍ）ｎＯＨ基（ｍ、ｎは
いずれも１以上）の官能基の単独又は複数種が一分子内
に合計で二以上存在する化合物と、（ロ）−ＮＣＯ基が
二以上存在する化合物の共重合体。なお、以降の記述に
おいて、（イ）および（ロ）は、上記の内容の化合物を
指す。(3) (a) --COOH group and --COOR group (R is (CH 2 ) nH) (n is 1 or more). ),-
SH group, -NH 2 group, -OH group, = NH group, -CONH 2
Group, or - (O (CH 2) m) a compound nOH group functional group alone or a plurality of types of (m, n are both 1 or more as well) are present in total two or more in one molecule, (b) - A copolymer of a compound having two or more NCO groups. In addition, in the following description, (a) and (b) refer to the compounds having the above contents.
【００３９】（４）（イ）の化合物の複数種、（ロ）の
化合物の複数種、または（イ）の化合物の複数種、およ
び（ロ）の化合物の複数種をモノマーとする重合体。(4) A polymer having a plurality of kinds of the compound (a), a plurality of kinds of the compound (ii), or a plurality of kinds of the compound (ii), and a plurality of kinds of the compound (ii) as monomers.
【００４０】（５）（イ）の化合物であって、−ＮＨ2
基を二以上持ち、−ＣＯＯＨ基、−ＣＯＯＲ基（Ｒは
（ＣＨ2）ｎＨ）（ｎは１以上）である。）、−ＳＨ
基、−ＯＨ基、＝ＮＨ基、−ＣＯＮＨ2基、または−
（Ｏ（ＣＨ2）ｍ）ｎＯＨ基（ｍ、ｎはいずれも１以
上）を一以上持つ化合物をモノマーとする重合体。(5) The compound of (a), which is --NH 2
It has two or more groups and is a —COOH group or a —COOR group (R is (CH 2 ) nH) (n is 1 or more). ), -SH
Group, -OH group, = NH group, -CONH 2 group, or -
A polymer having as a monomer a compound having one or more (O (CH 2 ) m) nOH groups (m and n are both 1 or more).
【００４１】（６）（イ）の化合物であって、−ＮＨ2
基、−ＣＯＯＨ基、−ＳＨ基、−ＯＨ基、＝ＮＨ基、−
ＣＯＮＨ2基、または−（Ｏ（ＣＨ2）ｍ）ｎＯＨ基
（ｍ、ｎはいずれも１以上）の官能基の単独または複数
種を一分子内に二以上持ち、更に−ＣＯＯＲ基（Ｒは
（ＣＨ2）ｎＨ）（ｎは１以上）である。）を一以上持
つ化合物をモノマーとする重合体。(6) The compound of (a), which is --NH 2
Group, -COOH group, -SH group, -OH group, = NH group,-
It has two or more functional groups of CONH 2 group or — (O (CH 2 ) m) nOH group (m and n are each 1 or more) in one molecule, and further has —COOR group (R is (CH 2 ) nH) (n is 1 or more). ) Is a polymer having as a monomer a compound having one or more of.
【００４２】（７）（イ）の化合物であって、−ＮＨ2
基、−ＯＨ基又は＝ＮＨ基の官能基の単独または複数種
を一分子内に二以上持ち、更に−ＳＨ基、−ＣＯＯＨ
基、−ＣＯＯＲ基（Ｒは（ＣＨ2）ｎＨ）（ｎは１以
上）である。）、または−（Ｏ（ＣＨ2）ｍ）ｎＯＨ基
（ｍ、ｎはいずれも１以上）を一以上持つ化合物をモノ
マーとする重合体。(7) The compound of (a), wherein --NH 2
Group, -OH group or = NH group having one or more functional groups of two or more in one molecule, and further -SH group, -COOH
Group, a —COOR group (R is (CH 2 ) nH) (n is 1 or more). ), Or a polymer having as a monomer a compound having at least one — (O (CH 2 ) m) nOH group (m and n are 1 or more).
【００４３】（８）（ロ）の化合物であって、−ＮＣＯ
基を二以上持ち、かつ−ＣＯＯＲ基（Ｒは（ＣＨ2）ｎ
Ｈ）（ｎは１以上）である。）を一以上持つ化合物をモ
ノマーとする重合体。(8) The compound (b), which is --NCO
Has two or more groups, and a —COOR group (R is (CH 2 ) n
H) (n is 1 or more). ) Is a polymer having as a monomer a compound having one or more of.
【００４４】生理活性物質層を構成する生理活性物質と
しては、被測定物質と相互作用するものであれば特に限
定されないが、例えば、核酸や、非免疫蛋白質、免疫グ
ロブリン結合性蛋白質、糖結合性蛋白質、糖を認識する
糖鎖、リガンド結合能を有するポリペプチドもしくはオ
リゴペプチド、あるいは免疫性タンパク質等が挙げられ
る。The physiologically active substance constituting the physiologically active substance layer is not particularly limited as long as it interacts with the substance to be measured, and examples thereof include nucleic acid, non-immunity protein, immunoglobulin binding protein, sugar-binding property. Examples thereof include proteins, sugar chains that recognize sugars, polypeptides or oligopeptides having a ligand binding ability, and immunological proteins.
【００４５】具体的には、核酸として、ＤＮＡ、ＲＮ
Ａ、もしくはＰＮＡ（ＰｅｐｔｉｄｅＮｕｃｌｅｉｃ
Ａｃｉｄ）等、非免疫蛋白質として、アビジン（ストレ
プトアビジン）、ビオチン、もしくはレセプター等、免
疫グロブリン結合性蛋白質として、プロテインＡ、プロ
テインＧ、もしくはリウマチ因子（ＲＦ）等、糖結合性
蛋白質としてレクチン等、免疫性タンパク質として抗体
等がある。Specifically, the nucleic acids include DNA and RN.
A or PNA (Peptide Nucleic
Acid) and the like, avidin (streptavidin), biotin, or a receptor as a non-immune protein, an immunoglobulin-binding protein such as protein A, protein G, or rheumatoid factor (RF), a lectin such as a sugar-binding protein, Antibodies are examples of immune proteins.
【００４６】生理活性物質層の厚さは、生理活性物質層
を構成する生理活性物質自体の大きさにもよるが、１０
０Å〜３０００Åであることが好ましく、１００Å〜１
０００Åであることがより好ましい。The thickness of the physiologically active substance layer depends on the size of the physiologically active substance itself constituting the physiologically active substance layer, but is 10
It is preferably 0Å to 3000Å, and 100Å to 1
More preferably, it is 000Å.
【００４７】本発明のバイオセンサー用基板上におい
て、生理活性物質層がアミノ基を有する生理活性物質で
構成されている場合、アミノ基を有する生理活性物質
が、有機物質層を構成する有機物質と架橋剤により架橋
されることにより、生理活性物質層が有機物質層を介し
て固定されていてもよい。On the biosensor substrate of the present invention, when the physiologically active substance layer is composed of a physiologically active substance having an amino group, the physiologically active substance having an amino group is combined with the organic substance constituting the organic substance layer. The physiologically active substance layer may be fixed via the organic substance layer by being crosslinked with a crosslinking agent.
【００４８】架橋剤は、例えば、水溶性二価性試薬であ
って、生理活性物質を共有結合的に強固に固定化できる
ものであれば、特に限定されないが、例えば、グルタル
アルデヒド、過ヨウ素酸、Ｎ，Ｎ'−ｏ−フェニレンジ
マレイミド、Ｎ−スクシニミジル−４−（Ｎ−マレイミ
ドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート、Ｎ
−スクシニミジルマレイミド酢酸、Ｎ−スクシニミジル
−４−マレイミド酪酸、Ｎ−スクシニミジル−６−マレ
イミドヘキサン酸、Ｎ−スルホスクシニミジル−４−マ
レイミドメチルシクロヘキサン−１−カルボン酸、Ｎ−
スルホスクシニミジル−３−マレイミド安息香酸、Ｎ−
（４−マレイミドブチリロキシ）スルホスクシンイミド
・ナトリウム塩、Ｎ−（６−マレイミドカプロイロキ
シ）スルホスクシンイミド・ナトリウム塩、Ｎ−（８−
マレイミドカプリロキシ）スルホスクシンイミド・ナト
リウム塩、Ｎ−（11−マレイミドウンデカノイロキシ）
スルホスクシンイミド・ナトリウム塩、もしくはＮ［２
−（１−ピペラジニル）エチル］マレイミド・二塩酸等
を挙げることができ、それぞれ単独で又は組み合わせて
使用することができる。The cross-linking agent is not particularly limited as long as it is a water-soluble divalent reagent and can firmly immobilize a physiologically active substance covalently, and examples thereof include glutaraldehyde and periodate. , N, N'-o-phenylenedimaleimide, N-succinimidyl-4- (N-maleimidomethyl) cyclohexane-1-carboxylate, N
-Succinimidyl maleimidoacetic acid, N-succinimidyl-4-maleimidobutyric acid, N-succinimidyl-6-maleimidohexanoic acid, N-sulfosuccinimidyl-4-maleimidomethylcyclohexane-1-carboxylic acid, N-
Sulfosuccinimidyl-3-maleimidobenzoic acid, N-
(4-Maleimidobutyryloxy) sulfosuccinimide sodium salt, N- (6-maleimidocaproyloxy) sulfosuccinimide sodium salt, N- (8-
Maleimidocapryloxy) sulfosuccinimide sodium salt, N- (11-maleimidoundecanoyloxy)
Sulfosuccinimide sodium salt or N [2
Examples include-(1-piperazinyl) ethyl] maleimide and dihydrochloric acid, which may be used alone or in combination.
【００４９】このような架橋剤を使用すると、生理活性
物質層を構成する生理活性物質を共有結合で強固に固定
することができ、バイオセンサーを洗浄しても、生理活
性物質の固定を維持できるため、繰り返し測定に適する
利点が得られる。架橋剤は、層の厚みとしては１０Å〜
１００Åであることが好ましく、１０Å〜５０Åである
ことがより好ましい。By using such a cross-linking agent, the physiologically active substance constituting the physiologically active substance layer can be firmly fixed by covalent bond, and the fixing of the physiologically active substance can be maintained even if the biosensor is washed. Therefore, an advantage suitable for repeated measurement can be obtained. The cross-linking agent has a layer thickness of 10Å ~
It is preferably 100Å, more preferably 10Å to 50Å.
【００５０】本発明のバイオセンサー用基板の製造は次
のようにして行なう。まず、前記したような方法によ
り、基板２の表面にピッチが光の波長以下である微細凹
凸３を形成したものを準備し、その微細凹凸３を有する
面側に、有機物質層を積層する。有機物質層の形成は、
例えば、基板２の表面に過酸化水素水を作用させること
により、基板の表面にＯＨ基を導入し、導入されたＯＨ
基を利用して行なうことができる。例えば、アミノ系シ
ランカップリング剤やメルカプト系シランカップリング
剤を用いて、基板２の表面に、アミノ基、もしくはメル
カプト基を導入する。The biosensor substrate of the present invention is manufactured as follows. First, by the method as described above, the substrate 2 having the fine irregularities 3 having a pitch of not more than the wavelength of light is prepared, and the organic substance layer is laminated on the side having the fine irregularities 3. The formation of the organic material layer is
For example, by causing hydrogen peroxide solution to act on the surface of the substrate 2, OH groups are introduced to the surface of the substrate, and the introduced OH
It can be performed using a group. For example, an amino group or a mercapto group is introduced onto the surface of the substrate 2 using an amino silane coupling agent or a mercapto silane coupling agent.
【００５１】また、有機物質層の形成は、前述した化合
物をモノマーとする蒸着重合によって行えってもよく、
通常の蒸着重合装置を使用して行なうことができる。蒸
着重合の条件としては、成膜速度が１Å／ｍｉｎ〜３０
００Å／ｍｉｎ、特に５Å．ｍｉｎ〜２００Å／ｍｉｎ
となるように設定するのが好ましい。３０００Å／ｍｉ
ｎを超えると、均質な蒸着重合膜が得られにくくなる。
具体的には、モノマー原料の加熱温度を５０℃〜１５０
℃とし、蒸着対象となる基板、この場合は微細凹凸を有
し、金属薄膜層が積層された透明基板、の温度を室温、
または１０℃〜２０℃とし、圧力を１．０×１０-3Ｐａ
とするのが好ましい。The organic material layer may be formed by vapor deposition polymerization using the above compound as a monomer,
It can be carried out using a conventional vapor deposition polymerization apparatus. The conditions for vapor deposition polymerization include a film formation rate of 1Å / min to 30
00Å / min, especially 5Å. min-200Å / min
It is preferable to set so that 3000Å / mi
When it exceeds n, it becomes difficult to obtain a uniform vapor-deposited polymerized film.
Specifically, the heating temperature of the monomer raw material is 50 ° C to 150 ° C.
The temperature of the substrate to be vapor-deposited, in this case, a transparent substrate having fine unevenness and having a metal thin film layer laminated thereon, at room temperature,
Alternatively, the pressure is set to 10 ° C. to 20 ° C., and the pressure is 1.0 × 10 −3 Pa.
Is preferred.
【００５２】有機物質層上には、生理活性物質層を固定
化する。あるいは、生理活性物質層１２は、有機物質層
を伴なわないで、基板２に固定することもある。固定化
方法は常法によって行えばよく、例えば、所定量の生理
活性物質を、有機物質層もしくは基板２上に、所定時間
接触させることにより固定することができる。A physiologically active substance layer is immobilized on the organic substance layer. Alternatively, the physiologically active substance layer 12 may be fixed to the substrate 2 without the organic substance layer. The immobilization method may be carried out by a conventional method, for example, a predetermined amount of the physiologically active substance can be fixed by contacting the organic substance layer or the substrate 2 for a predetermined time.
【００５３】生理活性物質として抗体を用いた場合であ
って、抗体のＦａｂフラグメントを固定する場合には、
パパインを用いて抗体を部分分解した後、同様の処理を
行えばよい。一方、抗体のＦ（ａｂ’）2フラグメント
を固定する場合には、ペプシンを用いて抗体を部分分解
した後、同様の処理を行えばよい。When an antibody is used as the physiologically active substance and the Fab fragment of the antibody is immobilized,
The same treatment may be performed after partially degrading the antibody using papain. On the other hand, when the F (ab ′) 2 fragment of the antibody is immobilized, the same treatment may be performed after partially degrading the antibody with pepsin.
【００５４】生理活性物質層が、アミノ基を有する生理
活性物質で構成され、有機物質層に固定されるときに
は、アミノ基を有する生理活性物質と、有機物質層を構
成する有機物質とを架橋剤により架橋することにより、
固定することができる。具体的には、有機物質層上に架
橋剤を接触させて反応させ、有機物質と架橋剤とを結合
させた後、架橋剤が結合した有機物質層上にアミノ基を
有する生理活性物質を接触させて、架橋剤とアミノ基と
を反応させることにより固定を行なう。When the physiologically active substance layer is composed of a physiologically active substance having an amino group and is fixed to the organic substance layer, the physiologically active substance having an amino group and the organic substance constituting the organic substance layer are cross-linking agents. By crosslinking with
Can be fixed. Specifically, a cross-linking agent is brought into contact with the organic substance layer to cause a reaction, and after binding the organic substance and the cross-linking agent, a physiologically active substance having an amino group is brought into contact with the organic substance layer to which the cross-linking agent is bound. Then, the cross-linking agent and the amino group are caused to react with each other so as to fix.
【００５５】基板２の微細凹凸３を有する側の表面に、
メルカプト系シランカップリング剤を用いて、メルカプ
ト基を導入した場合には、ＳＰＤＰ（ＳＰＤＰ；Ｎ−Ｓ
ｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ−３−（２−Ｐｙｒｉｄｙｌｄ
ｉｔｈｉｏ）Ｐｒｏｐｉｏｎａｔｅ）を架橋剤として用
い、蛋白質等を固定するとよい。On the surface of the substrate 2 having the fine irregularities 3,
When a mercapto group is introduced using a mercapto silane coupling agent, SPDP (SPDP; NS)
uccinimidyl-3- (2-pyridyld
It is preferable to use itio) Propionate) as a crosslinking agent to immobilize proteins and the like.
【００５６】本発明のバイオセンサーは、本発明におい
て独特な基板を用い、生理活性物資を個々のスポットに
分ける等して貼付け、固定させ、検体としては予め蛍光
剤等で標識を付けたものを適用した後、レーザービーム
を用いたスキャニングにより、蛍光を検出することによ
り、検体中の成分を確認することができ、多種類の生理
活性物資を適用しておけば、いずれの部分が発光したか
の発現パターンを求め、既知の発現パターンと比較する
等により、検体が持つ情報を求めることができ、一例と
して、遺伝子の解析等に利用すると価値が高いものであ
る。The biosensor of the present invention uses the substrate unique to the present invention, and attaches and fixes the physiologically active substance by dividing it into individual spots and the like, and the specimen is labeled with a fluorescent agent or the like in advance. After the application, the components in the sample can be confirmed by detecting the fluorescence by scanning with a laser beam. Which part emits light if many kinds of physiologically active substances are applied. The information possessed by the sample can be obtained by obtaining the expression pattern of E. coli and comparing it with a known expression pattern, and as an example, it is highly valuable when used for gene analysis and the like.
【００５７】[0057]
【実施例】（実施例１）感光性樹脂をプラスチックフィ
ルム上に塗布して形成した感光材を準備し、感光性樹脂
に対してレーザー光干渉法による露光を行ない、その
後、現像を行なって、ピッチが光の波長以下の無数の微
細凹凸が型面に形成された原型を得た。この原型の型面
にニッケルメッキを行なって剥がし、ニッケル型を得
た。EXAMPLES Example 1 A photosensitive material formed by applying a photosensitive resin on a plastic film is prepared, and the photosensitive resin is exposed by a laser beam interference method, and then developed. A prototype was obtained in which a myriad of fine irregularities having a pitch equal to or less than the wavelength of light were formed on the mold surface. The mold surface of this prototype was nickel-plated and peeled off to obtain a nickel mold.
【００５８】得られたニッケル型を、溶融したガラスの
表面に型面側が当るよう適用して、ピッチが光の波長以
下の無数の微細凹凸が表面に形成されたガラス基板を得
た。得られたガラス基板の微細凹凸を有する側をオゾン
クリーナーで洗浄した後、洗浄面に過酸化水素水で処理
を行なって、表面にＯＨ基を導入し、導入されたＯＨ基
にメルカプト系シランカップリング剤を用いて、表面に
ＳＨ基を導入した。The obtained nickel mold was applied so that the mold surface side would contact the surface of the molten glass to obtain a glass substrate having innumerable fine irregularities with a pitch of not more than the wavelength of light. After cleaning the surface of the obtained glass substrate having fine irregularities with an ozone cleaner, the cleaned surface is treated with hydrogen peroxide water to introduce OH groups on the surface, and mercapto-based silane cups are introduced to the introduced OH groups. SH groups were introduced on the surface using a ring agent.
【００５９】このようにして得られたバイオセンサー用
基板は、例えば、ＳＰＤＰ（Ｎ−Ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄ
ｙｌ−３−（２−Ｐｙｒｉｄｙｌｄｉｔｈｉｏ）Ｐｒｏ
ｐｉｏｎａｔｅの略、ＳＨ基およびアミノ基反応性の架
橋剤）を用い、既に表面に導入されたＳＨ基と蛋白質の
アミノ基との間の架橋を行なわせることにより、表面に
被測定物質との相互作用をする蛋白質を固定して、バイ
オセンサーとし、測定に使用することができた。The biosensor substrate thus obtained is, for example, SPDP (N-Succinimid).
yl-3- (2-Pyridyldithio) Pro
abbreviated as "pinate", an SH group- and amino group-reactive cross-linking agent) is used to cross-link the SH group already introduced on the surface with the amino group of the protein, thereby allowing the surface to interact with the substance to be measured. It was possible to immobilize the acting protein and use it as a biosensor for measurement.
【００６０】このバイオセンサーは、基板が、レーザー
光を二もしくは三以上に分割して干渉露光させることに
より、ピッチが光の波長以下の無数の微細凹凸が形成さ
れた凹凸型面を有する賦型用型を用いて得られた微細凹
凸を有する面に蛋白質が固定されているので、基板のガ
ラス板の表面反射が無く、蛍光測定時のバックグラウン
ドが実質的に生じないこと、また、凹凸が波長以下の微
細なものであるために蛍光が散乱する等の支障も無く、
測定感度上、解像度上の問題が無かった。また、凹凸が
非常に微細であるため、蛋白質を固定する際のスポッテ
ィングの際に、滴下した液体が広がる事も無く、保持性
がよいため、蛋白質のスポットを精度よく作成すること
ができた。In this biosensor, a substrate is imprinted with a concavo-convex surface having innumerable fine concavities and convexities whose pitch is equal to or shorter than the wavelength of light, by subjecting a laser beam to two or three or more and performing interference exposure. Since the protein is immobilized on the surface having fine irregularities obtained by using the mold, there is no surface reflection on the glass plate of the substrate, and the background during fluorescence measurement does not substantially occur, and the irregularities are Since it is a fine one of the wavelength or less, there is no problem such as fluorescence scattering,
There were no problems in terms of measurement sensitivity or resolution. Further, since the unevenness is extremely fine, the dropped liquid does not spread during spotting when immobilizing the protein, and the retention property is good, so that the protein spots could be created accurately.
【００６１】（実施例２）トリアセチルセルロース（＝
ＴＡＣ）フィルム上に、アクリレート系の紫外線硬化性
樹脂を塗布し、実施例１で得られたニッケル型の型面を
塗付面に重ね、ＴＡＣフィルム側より、紫外線を照射し
て紫外線硬化性樹脂を硬化させ、その後、型から剥がす
ことにより、表面にピッチが光の波長以下の無数の微細
凹凸が形成された透明樹脂層がＴＡＣフィルム上に積層
した透明基板を得た。以降は、実施例１と同様に行な
い、同様な結果を得た。Example 2 Triacetyl cellulose (=
TAC) film is coated with an acrylate-based UV-curable resin, the nickel-type mold surface obtained in Example 1 is overlaid on the coated surface, and the UV-curable resin is irradiated with UV rays from the TAC film side. Was cured and then peeled off from the mold to obtain a transparent substrate in which a transparent resin layer having innumerable fine irregularities having a pitch of not more than the wavelength of light formed on the surface was laminated on a TAC film. After that, the same procedure as in Example 1 was performed, and similar results were obtained.
【００６２】[0062]
【発明の効果】請求項１の発明によれば、基板に光の波
長以下のピッチの微細凹凸が形成された構成とすること
により、表面反射が無く、光学的な測定に際してバック
グラウンドが生じる等の支障が無く、また、凹凸そのも
のは光の波長以下の微細なものなので、スポッティング
の際の位置精度が確保できるバイオセンサー用基板を提
供することができる。請求項２の発明によれば、微細凹
凸が、レーザー光による干渉露光により形成された凹凸
型面を有する賦型用型を用いて形成されたものであるの
で、請求項１の発明の効果を一層発揮できるバイオセン
サー用基板を提供することができる。請求項３の発明に
よれば、微細凹凸面に有機物質層を有しているので、生
理活性物質層を固定しやすいバイオセンサー用基板を提
供することができる。請求項４の発明によれば、有機物
質層がアミノ基、もしくはメルカプト基を有するシラン
カップリング剤からなるので、蛋白質等の固定が容易な
バイオセンサー用基板を提供することができる。請求項
５の発明によれば、請求項３または請求項４の発明のバ
イオセンサー用基板の有機物質層上に生理活性物質層が
固定されているので、そのまま、測定用に供し得るバイ
オセンサーを提供することができる。請求項６の発明に
よれば、請求項５の発明の効果に加え、生理活性物質層
を構成する物質が特定され、各物質に応じた被測定物質
の測定に利用することが可能なバイオセンサーを提供す
ることができる。請求項７の発明によれば、請求項６の
発明の効果に加え、生理活性物質層と有機物質層とが架
橋剤により架橋されて固定されているので、生理活性物
質が安定に固定されたバイオセンサーを提供することが
できる。According to the first aspect of the present invention, since the substrate is provided with fine irregularities having a pitch equal to or less than the wavelength of light, there is no surface reflection and a background is generated during optical measurement. It is possible to provide a substrate for a biosensor that does not have any problem and that the unevenness itself is a fine one that is equal to or less than the wavelength of light, and that the positional accuracy during spotting can be secured. According to the invention of claim 2, the fine concavo-convex is formed by using the imprinting mold having the concavo-convex mold surface formed by the interference exposure with the laser beam. Therefore, the effect of the invention of claim 1 is obtained. It is possible to provide a substrate for a biosensor that can exhibit even more. According to the invention of claim 3, since the organic substance layer is provided on the fine uneven surface, it is possible to provide the biosensor substrate on which the physiologically active substance layer is easily fixed. According to the invention of claim 4, since the organic material layer is composed of a silane coupling agent having an amino group or a mercapto group, it is possible to provide a biosensor substrate on which proteins and the like can be easily fixed. According to the invention of claim 5, since the physiologically active substance layer is fixed on the organic substance layer of the biosensor substrate of the invention of claim 3 or 4, a biosensor that can be directly used for measurement is provided. Can be provided. According to the invention of claim 6, in addition to the effect of the invention of claim 5, a biosensor capable of specifying a substance that constitutes the physiologically active substance layer and using the substance for measurement according to each substance Can be provided. According to the invention of claim 7, in addition to the effect of the invention of claim 6, since the physiologically active substance layer and the organic substance layer are crosslinked and fixed by a crosslinking agent, the physiologically active substance is stably fixed. A biosensor can be provided.
【図１】バイオセンサーを示す図である。FIG. 1 is a diagram showing a biosensor.
【図２】基板の微細凹凸を示す図である。FIG. 2 is a diagram showing fine irregularities on a substrate.
【図３】基板の微細凹凸の配列を示す図である。FIG. 3 is a diagram showing an array of fine irregularities on a substrate.
【図４】バイオセンサーの一例を説明する図である。FIG. 4 is a diagram illustrating an example of a biosensor.
【図５】他の例のバイオセンサーを説明する図である。FIG. 5 is a diagram illustrating another example biosensor.
１ バイオセンサー ２ 基板 ３ 微細凹凸 ４ ＤＮＡスポット 1 biosensor 2 substrates 3 Fine unevenness 4 DNA spot
フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） // Ｃ１２Ｍ 1/00 Ｃ１２Ｍ 1/00 Ａ Ｃ１２Ｎ 15/09 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ｆ Ｆターム(参考） 2G043 AA01 BA16 CA03 DA02 EA01 GA07 GB05 LA01 MA01 2G054 AA06 BB06 CA21 EA03 GA05 GB02 GE02 GE07 JA10 2G057 AA04 AB04 AC01 BA03 BD04 CB01 DA06 DA09 DA10 4B024 AA11 CA01 CA11 HA12 4B029 AA07 AA21 AA23 BB20 CC08 FA03 FA10 Continuation of front page (51) Int.Cl. 7 Identification code FI theme code (reference) // C12M 1/00 C12M 1/00 A C12N 15/09 C12N 15/00 FF term (reference) 2G043 AA01 BA16 CA03 DA02 EA01 GA07 GB05 LA01 MA01 2G054 AA06 BB06 CA21 EA03 GA05 GB02 GE02 GE07 JA10 2G057 AA04 AB04 AC01 BA03 BD04 CB01 DA06 DA09 DA10 4B024 AA11 CA01 CA11 HA12 4B029 AA07 AA21 AA23 BB20 CC08 FA03 FA10 FA10
Claims (7)
の無数の微細凹凸が形成された凹凸面を有することを特
徴とするバイオセンサー用基板。1. A substrate for a biosensor, which has an irregular surface on which one side of a transparent substrate is formed with innumerable fine irregularities having a pitch equal to or less than a wavelength of light.
は三以上に分割して干渉露光させることにより、ピッチ
が光の波長以下の無数の微細凹凸が形成された凹凸型面
を有する賦型用型を用いて得られたものであることを特
徴とする請求項１記載のバイオセンサー用基板。2. The imprinting method, wherein the fine irregularities have a concave-convex mold surface in which innumerable fine irregularities having a pitch equal to or shorter than the wavelength of light are formed by interfering the laser light by dividing the laser light into two or three or more. The biosensor substrate according to claim 1, which is obtained by using a mold.
ていることを特徴とする請求項１または２記載のバイオ
センサー用基板。3. The substrate for biosensor according to claim 1, wherein an organic material layer is laminated on the fine irregularities.
カプト基を有するシランカップリング剤からなることを
特徴とする請求項３記載のバイオセンサー用基板。4. The biosensor substrate according to claim 3, wherein the organic material layer comprises a silane coupling agent having an amino group or a mercapto group.
サー用基板の前記有機物質層上に、生理活性物質層が固
定されていることを特徴とするバイオセンサー。5. A biosensor, wherein a physiologically active substance layer is fixed on the organic substance layer of the biosensor substrate according to claim 3 or 4.
白質、免疫グロブリン結合性蛋白質、糖結合性蛋白質、
糖を認識する糖類、リガンド結合能を有するポリペプチ
ドもしくはオリゴペプチド、もしくは免疫性蛋白質のい
ずれかからなることを特徴とする請求項５載のバイオセ
ンサー。6. The physiologically active substance layer comprises a nucleic acid, a non-immunity protein, an immunoglobulin-binding protein, a sugar-binding protein,
6. The biosensor according to claim 5, comprising a saccharide that recognizes a saccharide, a polypeptide or an oligopeptide having a ligand binding ability, or an immune protein.
する有機物質と架橋剤により架橋されて固定されている
ことを特徴とする請求項６記載のバイオセンサー。7. The biosensor according to claim 6, wherein the physiologically active substance layer is crosslinked and fixed with an organic substance constituting the organic layer by a crosslinking agent.
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| JP2001222370A JP2003035710A (en) | 2001-07-24 | 2001-07-24 | Substrate for biosensor and biosensor using the same |
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