JP2006325594A - 羊水由来細胞 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】この発明は、β細胞系列に分化可能な羊水由来細胞の増殖可能な個体群に関するものである。また、この発明は、上記羊水由来細胞を分離し、かつ増殖する方法、並びに糖尿病治療に上記羊水由来細胞を利用するための方法および上記羊水由来細胞を利用した組成物に関するものである。
【選択図】図1
Description
この出願は、米国出願データ:2005年5月27日付けの仮出願No60/685,607号および2006年3月27日付けの仮出願No60/743,821号に関連するものである。
この発明は、β細胞系列に分化することができ、個体群が増殖可能な羊水由来細胞に関するものである。また、この発明は、上記羊水由来細胞を分離し、かつ増殖させるための方法ばかりでなく、糖尿病治療において、上記羊水由来細胞を利用する方法および上記羊水由来細胞を利用した組成物を提供するものである。
器官機能の低下は、先天的な欠陥、外傷、あるいは疾患に起因することがある。器官機能の低下を引き起こす疾患の一例は、真性糖尿病、すなわち糖尿病である。ほとんどの糖尿病の場合は、2つの臨床型に分類される。1型は、若年型糖尿病またはインスリン依存性真性糖尿病(IDDM)としても知られており、2型は成人発症性糖尿病としても知られている。各型は、予後、治療および発症原因が異なっている。両型は、患者の血糖値の調節不能によって特徴付けられる。その結果、糖分が細胞に入ることができず、代謝要求量を満たすことができないので、血糖値は高い値に上昇する。血糖を適切に代謝することができないということは、最初に、例えば高血糖症、過度の空腹感、口渇感、多尿症および糖尿がみられ、その後に、ニューロパシー、巨大血管疾患および微小血管疾患へ段階的に拡大してゆく、初期症状および末期症状が複合化した一連の総体的症状を引き起こすことを示すものである。
1つの実施の形態では、この発明は、哺乳類の羊水由来細胞を分離する方法を提供するものである。この発明によれば、羊水由来細胞は、妊娠期間の約14週目〜約23週目までの羊水サンプルから採取される。これに代えて、羊水由来細胞は、妊娠期間の約23週目〜約40週目までの羊水サンプルから採取される。
開示内容を明確にするため、およびこの発明を限定しないものとして、この発明の詳細な記述は、この発明の一定の特徴、実施の形態あるいは用途を記述するか、あるいは図示する次のサブセクションに分けられている。
“β細胞系列”とは、転写因子PDX−1と、次の転写因子:NGN−3、Nkx2.2、Nkx6.1、ニューロD、Isl−1、HNF−3β、MAFA、Pax4およびPax6のうち、少なくとも1つの転写因子とに対する形質発現が陽性である細胞を意味する。この技術分野における当業者にとっては、上記β細胞系列の細胞特性は、周知であり、上記β細胞系列の他の特性の確認を続行する。上記転写因子は、内分泌細胞の同定に関する従来技術において十分に確立されている(「ネイチャー遺伝学概要(Nature Reviews Genetics)」2002年、第3巻第524頁〜第632頁)。
この発明の1つの態様では、羊水由来細胞は、複数段階の方法によって分離され、その方法は、
−羊水を分離するステップ、
−上記羊水を遠心分離した後に、上清を除去するステップ、
−増殖培地中に細胞沈殿物を再懸濁させるステップ、
−低酸素環境下で、上記組織および細胞を培養するステップ、
−培地を変更することなく、上記培養物を約5日間〜10日間、静かに放置するステップ、
−クローニングリングを用いて、形態学的に明瞭なコロニーを分離するステップ、
−分離されたコロニーを増殖培地中で培養するステップ、
−連続希釈してクローン化し、増殖コロニーの元となる単一細胞を同定するステップ、および
−上記クローンを増殖培地中で培養するステップを本質的に含むものである。
−羊水を分離するステップ、
−上記羊水を遠心分離した後に、上清を除去するステップ、
−増殖培地中に細胞沈殿物を再懸濁させるステップ、
−正常酸素環境下で、上記組織および細胞を培養するステップ、
−培地を変更することなく、上記培養物を約5日間〜10日間、静かに放置するステップ、
−クローニングリングを用いて、形態学的に明瞭なコロニーを分離するステップ、
−分離されたコロニーを増殖培地中で培養するステップ、
−連続希釈してクローン化し、増殖コロニーの元となる単一細胞を同定するステップ、および
−上記クローンを増殖培地中で培養するステップを本質的に含むものである。
培養され、あるいは分離された細胞中で蛋白質マーカーおよび核酸マーカーの形質発現を読み取る方法は、この技術分野において通例である。この方法には、逆転写酵素・重合酵素の計量的連鎖反応(RT−PCR)、ノーザンブロット法、切片上ハイブリッド形成法(例えば、「分子生物学における最新プロトコル(Current Protocols in Molecular Biology)」(オスベル(Ausubel)らにより編集された補遺2001年)参照)、および材料切片の免疫組織化学的検定法のような免疫検定法、ウェスタンブロット法、無傷細胞中に到達しやすいマーカーを用いた流動細胞計測分析法(FACS)(例えば、米国ニューヨーク州のコールドスプリングハーバー研究所出版社から1998年に発行された研究便覧:ハーロー(Harlow)およびレーン(Lane)による“抗体の使用(Using Antibodies)”参照)が含まれる。
1つの態様では、この発明は、この発明の増殖された羊水由来細胞を、β細胞系列の特性を有するマーカーを支持する細胞へ分化させることができる組成物を提供するものである。
1つの態様では、この発明は、1型糖尿病患者あるいは同型糖尿病を発症するリスクを負う者を治療する方法を提供するものである。この方法は、羊水由来細胞を分離し培養するステップと、分離された細胞の個体群を増殖するステップと、上記培養細胞を試験管内でβ細胞系列に分化させるステップと、上記分化細胞を直接あるいは薬剤担体内に含めた形態で、患者内に移植するステップを含むものである。適切な場合には、患者は、移植細胞の生存および機能に役立つ薬剤すなわち生理活性因子で、さらに治療可能である。上記薬剤としては、例えば、インスリン、TGFβ1、TGFβ2およびTGFβ3を含むTGFβファミリーのメンバー、骨形態形成蛋白質(BMP−2、BMP−3、BMP−4、BMP−5、BMP−6、BMP−7、BMP−11、BMP−12およびBMP−13)、線維芽細胞増殖因子−1および線維芽細胞増殖因子−2、血小板由来増殖因子AAおよび血小板由来増殖因子BB、血小板多血漿、インスリン様増殖因子(IGF−I、IGF−II)、増殖分化因子(GDF−5、GDF−6、GDF−8、GDF−10、GDF−15)、血管内皮細胞由来増殖因子(VEGF)、プレイオトロフィン(pleiotrophin)、エンドセリン、およびその他を含めてもよい。他の薬剤配合物には、例えば、ニコチンアミド、グルカゴン様ペプチドI(GLP−I)、グルカゴン様ペプチドII(GLP−II)、GLP−I擬似体、GLP−II擬似体、エキセンジン(Exendin)−4、レチノイン酸、副甲状腺ホルモン、例えば米国出願公開2004/0209901および米国出願公開2004/0132729に開示された化合物等のMAPK阻害剤を含めることができる。
この発明の羊水由来細胞を分離するのに使用される羊水を、通常、妊娠期間の16週〜22週で実行される、胎仔の核型分析用の羊水穿刺法により得られたサンプルから採取した。図1には、上記羊水由来細胞を分離するのに使用される、複数の段階を踏む方法が概略的に示されている。上記羊水を7分間、重力の400倍の遠心力で遠心分離し、上清を除去した。この結果として得られた細胞沈殿物を、この発明に使用される上記羊水サンプル用の表3〜5に表示された増殖培地中に再懸濁させた。上記細胞を、コラーゲンIV型(100mmプレート当たりの1mg)、あるいはコラーゲンI型(1cm2当たりの1μg)、ビトロネクチン(1mL当たりの10μg)あるいはフィブロネクチン(1mL当たりの10μg)のいずれかを被覆したプレート上で培養した。羊水サンプルから得られた細胞は、大きなバラツキ(1サンプル当たりの細胞数:8,000〜300,000個)を有しており、一部のサンプルには、かなりの数の血球が混入していた。上記培養物を、低酸素条件(酸素濃度:3%)下で、少なくとも5日間〜10日間、静かに放置した。平行して、培養物を正常酸素条件下で、上記同様の条件で培養した。次に、上記培養物を上記増殖培地と同一の培地に添加し、70%〜80%の培養飽和密度(confluency)に達するまで培養した。この段階の細胞を“P0”と呼ぶものとする。培養物の一部では、細胞コロニーをクローニングリングで分離し、異なる培養プレートで継代培養した。形態学的に明瞭なコロニーは、線維芽細胞(F)、羊水細胞(AF)および上皮細胞(E)の特性を有する形態で存在していた(図2)。“トリプルエクスプレスTrypLE−EXPRESS(商標)”(インビトロゲン社製)を用いて、上記P0から細胞を放出させ、この細胞を、種々の濃度(1cm2当たりの細胞数:50〜10,000個)で、フィブロネクチン、ビトロネクチンあるいはコラーゲンIV型を被覆したフラスコ/皿/プレートに播種した。連続希釈クローン化処理に、上記P0細胞の一部を使用した。最速で増殖する細胞の細胞集団倍加時間は、継代初期で、約24時間であった。種々の培地条件(表2)下で培養された増殖細胞を、細胞表面マーカー(表3〜5)で分析した。細胞は、典型的には培養飽和密度70%まで***し、1cm2当たりの細胞数100〜10,000個で、再度、播種した。細胞増殖の種々の段階で、リボ核酸(RNA)を採集し、胚性および胚葉マーカー(表9)で分析した。
実施例1で記述された方法で、羊水細胞(AF)様の形態を有する細胞を、クローニングリングを用いてP0培養物から得た。表面受容体、細胞骨格蛋白質および転写因子について異なる発現性を示す3つの明瞭な細胞固体群を同定した。簡略化のために、上記固体群を、AF−I細胞、AF−II細胞およびAF−III細胞と呼ぶ。次の実施例では、AF−I細胞、AF−II細胞およびAF−III細胞の各個体群の差異を明確にする。
トリプルエクスプレス(TRYPLE(商標)−express)発現溶液(米国カリフォルニア州のギブコ(Gibco)社製)で5分間、培養することによって培養プレートから接着細胞を取り出した。この取り出された細胞を、10%のウシ胎仔血清(FBS)添加ダルベッコ調製イーグル培地(DMEM)中に再度、懸濁させ、かつ遠心分離後に、洗浄および、リン酸緩衝食塩水(PBS)中に2%のウシ血清アルブミン(BSA)および0.05%のアジ化ナトリウム(米国ミズーリ州のシグマ(Sigma)社製)を含有させた染色緩衝液中への再度の懸濁によって、上記細胞を回収した。適切な場合には、0.1%のγ―グロブリン(米国ミズーリ州のシグマ(Sigma)社製)溶液を15分間用いて、上記細胞のFc(免疫グロブリン結晶化可能断片)受容体を阻害した。アリコート(細胞数:約105個)を、表3に示されているように、フィコエリトリン(Phycoerythirin)(PE)あるいはアロフィコシアニン(APC)のいずれかを接合したモノクローナール抗体(細胞数106個当たりの抗体量5μL)あるいは未接合型の一次抗体と共に培養した。対照区には、アイソタイプが適切に適合した抗体、非染色細胞、および接合型の二次抗体のみが染色された細胞を含めた。すべての抗体との細胞培養を、4℃、30分間、実行したのち、上記細胞を染色緩衝液で洗浄した。未接合型の一次抗体で染色した細胞サンプルについては、接合型のフィコエリスリン(PE)あるいはアロフィコシアニン(APC)標識二次抗体と共に、さらに4℃、30分間、培養した。使用した二次抗体の記載に関しては表4を参照されたい。洗浄された細胞を顆粒化し、染色緩衝液中に再度、懸濁させ、蛍光標示式細胞分取器アレイ(FACSArray:ビー・ディー・バイオサイエンス(BD Biosciences)社製)で、少なくとも10,000件の事象を収集することによって、細胞表面分子を同定した。
実施例1によって培養した細胞(1cm2当たりの細胞数:10,000個)を、ガラス製の底部を有する35mm径マイクロウェル皿(米国マサチューセッツ州のマテック(Matek)社製)の種々の増殖培地上に播種した。培養3日後に、4%のパラホルムアルデヒドで、10分間、上記細胞を固定した後、リン酸緩衝液(PBS)で2回洗浄し、さらに、0.5%のトリトン(Triton)X(シグマ(Sigma)社製)を含有させた透過処理用緩衝液を5分間、室温(RT)で添加し、リン酸緩衝液(PBS)で、さらに3回洗浄した。固定され、透過処理された細胞を、1%のウシ血清アルブミン(BSA)あるいは二次抗体が生成される種(ヤギ、ロバあるいはウサギ)から得られた4%の血清のいずれかで、阻害した。対照区サンプルには、一次抗体を省いた反応生成物、あるいは一次抗体をこの一次抗体に対応する免疫グロブリンに、上記一次抗体と同一の濃度で、置き換えた反応生成物を含めた。染色されたサンプルを、染色された核を計数するためにジアミジノ−2−フェニルインドール、ニ塩化水素化物(DAPI)を含有するプロロング(PROLONG:登録商標)抗退色性試薬(米国カリフォルニア州のインビトロゲン社製)で洗浄した。ニコン共焦エクリプスC−1型反転顕微鏡(日本国のニコン社製)および10倍〜60倍の対物レンズで、細胞画像を得た(図6〜図8)。
増殖培地中で培養した細胞からリボ核酸(RNA)を抽出した。ヒト膵臓、肝臓、脳、消化管(アンビオン(Ambion)社製)、NTERA細胞(ヒト胚性癌腫細胞系列;ATCC(アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション))、HEK293細胞(ATCC;アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション)、およびヒト気道上皮細胞(ケンブレックス(Cambrex)社製)由来の全リボ核酸(RNA)を、陽性対照区として用いた。骨髄由来間葉細胞(米国メリーランド州のケンブレックス(Cambrex)社製)を、膵臓発達過程に含まれる鍵遺伝子の発現性に関して陰性となる対照区として用いた。
リボ核酸(RNA)サンプルを、エタノール含有高塩緩衝液の存在下で、シリカゲル膜(米国カリフォルニア州のキアゲン(Qiagen)社製のルナシー(Rneasy)ミニキット)との結合によって精製すると同時に、異物を洗浄除去した。カラムに結合した状態のリボ核酸(RNA)サンプルを、デオキシリボヌクレアーゼI(DNase I)(キアゲン(Qiagen)社製)で15分間、処理することによって、さらに精製した。その後に、高純度のリボ核酸(RNA)を水中に溶出させた。収量および純度を、分光光度計のA260(260nm吸収セル)およびA280(280nm吸収セル)の測定値によって推定した。相補デオキシリボ核酸(cDNA)の複製を、エイ・ビー・アイ(米国カリフォルニア州のエイ・ビー・アイ(ABI)社製)高容量相補デオキシリボ核酸(cDNA)アーカイブキット(ABI high capacity cDNA archive kit)で、精製リボ核酸(RNA)から作製した。
他に述べない限り、すべての試薬をアプライド・バイオシステムズ(Applied Biosystems)社から入手した。エイ・ビー・アイ・プリズム(ABI PRISM:登録商標)品番7000配列検出システムで、リアルタイムの重合酵素連鎖反応(PCR)を実行した。全反応液量を20μLとして20ngの逆転写型リボ核酸(RNA)と共に、タクマン(TAQMAN:登録商標)ユニバーサル・ピー・シー・アール・マスター・ミックス(UNIVERSAL PCR MASTER MIX:登録商標)(米国カリフォルニア州のエイ・ビー・アイ(ABI)社製)を用いた。ピペット操作ミスを訂正するために、各相補デオキシリボ核酸(cDNA)サンプルについて控えをとって実行した。反応開始剤およびタクマン(TAQMAN:登録商標)のFAM標識プローブを200nMの濃度で使用した。アプライド・バイオシステムズ(Applied Biosystems)の予備培養型18Sリボソームリボ核酸(RNA)あるいはヒト・グリセルアルデヒド−3−リン酸・デヒドロゲナーゼ(GAPDH)内在性対照キットで、各標的遺伝子の発現レベルを標準化した。反応開始剤およびプローブについては、エイ・ビー・アイ・プリズム・プライマー・エクスプレス(ABI PRISM PRIMER EXPRESS:商品名)ソフトウエアで設計するか、あるいはエイ・ビー・アイ(ABI)社製の予備培養型遺伝子分析キットを用いた。各遺伝子に関して、エクソンと境界部分との距離(spanning)となるように、反応開始剤あるいはプローブのいずれか一方を設計した。この設計は、反応開始剤/プローブが、存在するいかなるゲノム・デオキシリボ核酸(DNA)に結合する可能性を無くした。反応開始剤とプローブとのセットとしては、次の組み合わせ:Nkx2.2(Hs00159616)、Pdx−1(Hs00426216)、Nkx6.1(Hs00232355)、Ngn3(Hs00360700)、Pax4(Hs00173014)、Pax6(Hs00240871)、インスリン(Hs00355773)、Glu2(Hs00165775)、グルカゴン(Hs00174967)、Isl−1(Hs00158126)、ソマトスタチン(Hs00174949)、FoxA2(HNF3β)(Hs00232764)、HlxB9(Hs00232128)、GATA−4(Hs00171403)、HNF1β(Hs00172123)、Musashi同族体−1(Msi−1)(Hs00159291)、Hes−1(Hs00172878)、ニューロテンシン(NTS)(Hs00175048)、コレシストキニン(Hs00174937)、AFP(Hs00173490)、セクレチン(Hs00360814)、GIP(Hs00175030)、GFAP(Hs00157674)、MAP2(Hs00159041)、Olig2(Hs0037782)、Oct−4(CGACCATCTGCCGCTTTGAG(配列識別番号1))およびOct−4(CCCCCTGTCCCCCA TTCCTA(配列識別番号2));Rex−1(CAGATCCTAAACAGCTCGCAGAAT(配列識別番号3))およびRex−1(GCGTACGCAAATTAAACTCCAGA(配列識別番号4));Sox−17(TGGCGCAGCAGATACCA(配列識別番号5))、Sox−17(AGCGCCTTCCACGACTTG(配列識別番号6))、Sox−17(CCAGCATCTTGCTCAACTCGGCG(配列識別番号7))、ABCG−2(GTTTATCCGTGGTGTGTCTGG(配列識別番号8))およびABCG−2(CTGAGCTATAGAGGCCTGGG(配列識別番号9))、Sox2(ATGCACCGCTACGACGTGA(配列識別番号10))およびSox2(CTTTTGCACCCCTCCCATTT(配列識別番号11))として記載されている。残りの反応開始剤を、PRIMERSプログラムソフトウエア(米国カリフォルニア州のエイ・ビー・アイ(ABI)社製)で設計し、表9中に記載した。上記サンプルについて、当初50℃で2分間、95℃で10分間処理した後に、95℃で15秒間の変性ステップと、60℃で1分間の焼鈍/伸張ステップを40回、繰り返した。ジーンアンプ(GENEAMP:登録商標)品番7000配列検出システムソフトウエアで、データ分析を実行した。各反応開始剤/プローブセットに関して、蛍光強度が指数増幅領域の中間にある特異値に到達した周期数として、Ct値を求めた。形質発現の相対レベルを、比較Ct法で算出した。簡単に言えば、各相補デオキシリボ核酸(cDNA)サンプルについては、内在性対照区のCt値を、対象遺伝子のCt値から差し引いて、ΔCt値(ΔCt)を得た。100%の効率で増幅すると仮定して、対象遺伝子の標準量を2-ΔCtとして算出した。最終データを較正サンプルの相対値として示した。上記比較Ct法は、仮に対象区および内在性対照区の増幅効率が略等しい場合にのみ、有効とされている。したがって、反応開始剤/プローブのセット毎に、連続的に希釈した相補デオキシリボ核酸(cDNA)サンプルを増幅し、上記ΔCt値を確認することによって、予備実証実験を実行した。上記ΔCt値は、仮に増幅効率が等しい場合には、希釈範囲を超えて一定となるはずである(表9)。
実施例1により分離し、かつ増殖した継代数6の羊水細胞(AF−I型)を、24ウェル組織培養プレート(米国マサチューセッツ州のコーニング社製)における培地番号11の増殖培地に1ウェル当たり細胞数10,000個で播種した。トリプルエクスプレス(TRYPLE(商標)−EXPRESS)発現溶液(米国カリフォルニア州のインビトロゲン(Invtrogen)社製)で、上記プレートの3つのウェルから細胞を除去し、グアバ(Guava)PCA−96細胞分析システムおよびビアカウント(VIACOUNT:登録商標)試薬(米国カリフォルニア州のグアバ(Guava)社製)で、細胞を計数した。図10は、低酸素条件(酸素濃度:3%)下で、培養した継代数6の細胞の増殖曲線を示している。対数グラフの直線部分で、上記細胞の細胞集団倍加時間を推定した。継代数6の細胞の細胞集団倍加時間は31時間であった。
末端TAGGGテロメア長検定法(米国インディアナ州のロッシュ社製)を用い、その製造者の指示に従って、限定された回数で行う連続希釈処理によって、単一細胞から分離したAF−I細胞系列のテロメア長を継代数12(1継代当たり細胞集団倍加:約50回)で分析した。10%のウシ胎仔血清(FBS)添加DMEM−LG培地で培養した細胞およびアムニオマックス(Amniomax(商標);ギブコ(Gibco)社製)培地で培養した細胞について、テロメア長を分析した(図12参照)。胚性癌腫細胞系列(NTERA細胞)由来のデオキシリボ核酸(DNA)を陽性の対照区とした。
複数のドナーから分離した継代数8〜10(1継代当たり細胞集団倍加:約30回)のAF細胞の核型を、Gバンド染色検定法によって確認した。5つの核型が調製し、細胞遺伝学的分析では、上記細胞が常染色体を有し、形式上、染色体数46を有していることが示された。また、分析された全細胞は、胎仔起源を裏付けるX染色体およびY染色体を含有していた。図13は、妊娠期間の16週〜22週のドナーから採取した羊水から分離された羊水由来細胞(AF−I細胞、AF−II細胞およびAF−III細胞)の核型を示している。
図14は、満期分娩時(約38週まで)の羊水由来であって5番培地で培養したAF−I細胞形態の増殖能を示している。この増殖能は、16週〜22週で採取した羊水から分離したAF−I細胞の増殖能に非常に類似している。
ルナシー(RNeasy)ミニキット(キアゲン(Qiagen)社製)で、継代数9〜11の線維芽細胞性羊水由来細胞(F細胞)、上皮性羊水由来細胞(E細胞)、羊水由来羊水細胞(AF−I細胞系列、AF−II細胞系列およびAF−III細胞系列)および満期分娩時の羊水(AF term)から全リボ核酸(RNA)を分離した。コードリンク(Codelink(商標))システム(米国ニュージャージー州のアメルシャム・バイオサイエンス(Amersham Biosciences)社ジー・イー・ヘルスケア(GE Healthcare)部門製)に従って、サンプル調製、ハイブリダイゼーションおよび画像分析を実行した。コードリンク(Codelink(商標))ヒト・ホール・ゲノム・アレイ(Codelink Human Whole Genome arrays)を用いた。このアレイは、標的遺伝子の転写部分の端から端までのエクソンを保存するように設計された約5500030の部分プローブから構成されている。チップは45000までの非反復単一遺伝子識別番号(unique Unigene IDs)を含むものである。標準化および対数変換に続けて、オムニビズ(OmniViz:登録商標)ソフトウエア(米国マサチューセッツ州のマテック(Matek)社製)およびジーンシフター(GENESIFTER:米国ワシントン州のビズエックスラボズ(VizXLabs)社製)で、データ分析を実行した。標準化サンプルの歪みに伴う変換の分散安定化を対数変換型アレイデータセットに適用した。ピアソン相関係数で、各細胞系列内および異種細胞系列間での変動を比較した。分析されたすべてのサンプルに関しては、細胞系列内の相関係数は、細胞系列間の相関係数と比較して高くなった。図15には、細胞系列間の相関係数に伴う異種細胞型間の遺伝子発現プロファイルの変動が示されている。変動分析およびP値を0.05以下に調整(ベンジャミニ(Benjamini)およびホックベルグ(Hochberg)補正)したF検定で、遺伝子発現における細胞型間の顕著な差異を求めた。表11〜表17は、種々の細胞型間で、少なくとも5倍の分化的な発現性を呈する遺伝子を示している。
AF−I細胞系列で継代数14のAFCA007クローンAを、1cm2当たりの細胞数10,000個で、アムニオマックス(AMNIOMAX(商標))完全培地中で培養した。培養飽和密度時に、上記細胞を、アムニオマックス(AMNIOMAX:商品名)完全培地中に1日当たり10μMのレチノイン酸(RA)を投与して、2週間、さらに処理した。リボ核酸(RNA)を14日目に採集し、消化管ホルモン(セクレチン、ニューロテンシン、胃抑制ペプチド(GIP)、コレシストキニン、ソマトスタチンおよびガストリン)の形質発現を、実施例4に説明されているようなリアルタイムの重合酵素連鎖反応(PCR)で推定した。ΔΔC1法で相対的な発現レベルを推定するのに腸管リボ核酸(RNA)(Ambion)を用いた。表18は、処理済みサンプルおよび未処理サンプルにおける消化管ホルモンのC1値および相対的発現レベルを示している。表18に示されているように、レチノイン酸(RA)の添加は消化管ホルモンの発現を高めた。
継代数8のAFCA007クローンA(AF−I細胞系列)由来の細胞を、1%増殖因子低減型マトリゲル(MATRIGEL:登録商標)基質(米国カリフォルニア州のベクトン・ディキンソン社製)を含むコラーゲン型I(ベクトン・ディキンソン社製)中に包理し、6ウェル・トランスウェル・インサート中に1ウェル当たり細胞数5×105個で播種した。継代数6のヒト大動脈内皮細胞(米国メリーランド州のケンブレックス(Cambrex)社製)をウェル底部に播種した。細胞を、5%のウシ胎仔血清(FBS)と、シクロパミン、塩基性線維芽細胞増殖因子(bFGF)、上皮増殖因子(EGF)、骨形態形成蛋白質(BMP)−4〜7、アクチビンA、エキセンジン−4、線維芽細胞増殖因子(FGF)−4、全トランス型レチノイン酸およびγ−セクレターゼ阻害剤を含む増殖因子を補給したDMEM地で14日間、培養した。培養物を1日おきに、供給した。全トランス型レチノイン酸によって処理した細胞は、α−胎仔性蛋白質(AFP)の反応性の向上を示した。アクチビンA、骨形態形成蛋白質(BMP)−4あるいはγ−セクレターゼ阻害剤L−685,458で処理した細胞は、HNF−3β発現反応性を向上させた。50ng/mLという高濃度の骨形態形成蛋白質(BMP)で処理した細胞は、転写因子GATA−4発現反応性を向上させた。50ng/mLの線維芽細胞増殖因子(FGF)−4で処理した細胞は、転写因子PDX−1発現反応性を向上させた(表19)。
継代数8のAFCA007(AF−I細胞系列)由来の細胞を、ある濃度範囲のノッチ経路阻害剤L−685,458(米国ミズーリ州のシグマ(Sigma)社製)で、3日間〜5日間、処理した。L−685,458の細胞毒性を、MTS検定法(米国ウィスコンシン州のプロメガ(Promega)社製)で細胞の生存力を測定することによって確認した。上記処理後に、Hes−1形質発現性を分析するために、リアルタイムの重合酵素連鎖反応(PCR)検定法を実行した。我々発明者らは、L−685,458がHes−1形質発現性に対する投与量依存型の阻害効果を示したことを確認した(図17のパネルa)。なお、Hes−1は、ノッチ経路の下流側の直接的な標的である。MTS検定法で確認されたように、細胞の生存力に対する効果は、5日間、10μMまでのL−685,458の次の処理では、観察されなかった(図17のパネルb)。
継代数10のAFCA007A(AF−I細胞系列)およびAFCA015C(AF−II細胞系列)を、集密度約70%まで増殖させた後、哺乳類細胞溶解キット(米国ミズーリ州のシグマ・アルドリッチ(Sigma−Aldrich)社製)で、細胞溶解物を収集した。米国ジョージア州のレイバイオテック(RayBiotech)社(http://www/raybiotech.com/)から提供されたサイトカイン・アレイ・パネルで、サイトカイン・アレイ分析を完了した。表20は、バックグラウンドを差し引いたデータの標準化後のサイトカイン、サイトカインおよび増殖因子の発現性を示している。各パネルについては、陽性および陰性の対照区も含まれている。上記パネルは、1つの細胞型当たり2つの異なるサンプルについて実施したものである。
以下、この発明の実施の態様を説明する。
(1)実質的に精製された羊水由来細胞の個体群。
(2)実施態様1記載の羊水由来細胞の個体群において、
前記個体群の細胞は、CD117、Oct−4、およびTra2−54からなる群より選択された少なくとも1つの蛋白質マーカーの発現に対して実質的に陰性である、羊水由来細胞の個体群。
(3)実施態様2記載の羊水由来細胞の個体群において、
前記個体群の細胞は、HNF−1β、GATA−6およびSox−17からなる群より選択された少なくとも1つの蛋白質マーカーの発現に対して実質的に陽性である、羊水由来細胞の個体群。
(4)実施態様2記載の羊水由来細胞の個体群において、
前記個体群の細胞は、HNF−3β、Hes−1、GATA−4およびMusashi−1からなる群より選択された少なくとも1つの遺伝子を発現させるものでもある、羊水由来細胞の個体群。
(5)実施態様2記載の羊水由来細胞の個体群において、
前記個体群の細胞は、肝臓活性化蛋白質、PDGF受容体β、AXL、bFGF、EGF受容体、Fas/TNFRSF6、GRO、GRO−α、ICAM−1、IL−1α、IL−3、IL−6、IL−8、MIF、オステオプロテゲリン、TIMP−2およびTRAIL R3からなる群より選択された少なくとも1つの蛋白質マーカーの発現に対して陽性である、羊水由来細胞の個体群。
(6)実施態様2記載の羊水由来細胞の個体群において、
前記個体群の細胞は、蛋白質マーカーSox−17の発現に対して実質的に陰性である、羊水由来細胞の個体群。
(7)実施態様6記載の羊水由来細胞の個体群において、
前記個体群の細胞は、サイトケラチン蛋白質の発現に対して実質的に陰性である、羊水由来細胞の個体群。
(8)実施態様6記載の羊水由来細胞の個体群において、
前記個体群の細胞は、肝臓活性化蛋白質、PDGF受容体β、bFGF、EGF受容体、GRO、GRO−α、ICAM−1、IL−1α、IL−3、IL−6、MIF、オステオプロテゲリン、TIMP−2およびTRAIL R3からなる群より選択された少なくとも1つの蛋白質マーカーの発現に対して陽性である、羊水由来細胞の個体群。
(9)実施態様1記載の羊水由来細胞の個体群において、
前記個体群の細胞は、蛋白質マーカーSox−17の発現に対して実質的に陰性であり、かつHes−1およびMusashi−1からなる群より選択された少なくとも1つの遺伝子を発現させる、羊水由来細胞の個体群。
(10)実施態様1記載の羊水由来細胞の個体群において、
前記個体群の細胞は、CD117、Oct−4、Sox−17およびTra2−54の発現に対して実質的に陰性である、羊水由来細胞の個体群。
(11)実施態様10記載の羊水由来細胞の個体群において、
前記個体群の細胞は、サイトケラチン蛋白質の発現に対して実質的に陰性である、羊水由来細胞の個体群。
(12)実施態様10記載の羊水由来細胞の個体群において、
前記個体群の細胞は、肝臓活性化蛋白質、PDGF受容体β、bFGF、EGF受容体、GRO、GRO−α、ICAM−1、IL−3、IL−6、MIF、オステオプロテゲリン、TIMP−2およびTRAIL R3からなる群より選択された少なくとも1つの蛋白質マーカーの発現に対して陽性である、羊水由来細胞の個体群。
(13)実施態様10記載の羊水由来細胞の個体群において、
前記個体群の細胞は、蛋白質マーカーSox−17の発現に対して実質的に陰性であり、かつHes−1およびMusashi−1からなる群より選択された少なくとも1つの遺伝子を発現させる、羊水由来細胞の個体群。
(14)実施態様1記載の羊水由来膵臓細胞の個体群において、
試験管内で増殖可能である、羊水由来膵臓細胞の個体群。
(15)実施態様1記載の羊水由来細胞の個体群において、
低酸素条件下の試験管内で増殖可能である、羊水由来細胞の個体群。
(16)実施態様1記載の羊水由来細胞の個体群において、
β細胞系列の特性を示す細胞に分化可能である、羊水由来細胞の個体群。
(17)実施態様1記載の羊水由来細胞の個体群において、
消化管ホルモン産生細胞に分化可能である、羊水由来細胞の個体群。
(18)羊水から細胞の個体群を採取する方法において、
a.羊水を分離するステップと、
b.前記羊水から前記細胞を分離するステップと、
c.培地中に前記細胞を配置するステップと、
d.培養容器中に前記細胞を播種するステップと、
e.少なくとも5日間、前記培地中で前記細胞を増殖させ、これにより羊水由来細胞の個体群を採取するステップと、
を含む、方法。
(19)実施態様18記載の方法において、
前記個体群の細胞は、CD117、Oct−4、およびTra2−54からなる群より選択された少なくとも1つの蛋白質マーカーの発現に対して実質的に陰性である、方法。
(20)実施態様19記載の方法において、
前記個体群の細胞は、HNF−1β、GATA−6およびSox−17からなる群より選択された少なくとも1つの蛋白質マーカーの発現に対して実質的に陽性である、方法。
(21)実施態様19記載の方法において、
前記個体群の細胞は、HNF−3β、Hes−1、GATA−4およびMusashi−1からなる群より選択された少なくとも1つの遺伝子を発現させるものでもある、方法。
(22)実施態様19記載の方法において、
前記個体群の細胞は、肝臓活性化蛋白質、PDGF受容体β、AXL、bFGF、EGF受容体、Fas/TNFRSF6、GRO、GRO−α、ICAM−1、IL−1α、IL−3、IL−6、IL−8、MIF、オステオプロテゲリン、TIMP−2およびTRAIL R3からなる群より選択された少なくとも1つの蛋白質マーカーの発現に対して陽性である、方法。
(23)実施態様19記載の方法において、
前記個体群の細胞は、蛋白質マーカーSox−17の発現に対して実質的に陰性である、方法。
(24)実施態様23記載の方法において、
前記個体群の細胞は、サイトケラチン蛋白質の発現に対して実質的に陰性である、方法。
(25)実施態様23記載の方法において、
前記個体群の細胞は、肝臓活性化蛋白質、PDGF受容体β、bFGF、EGF受容体、GRO、GRO−α、ICAM−1、IL−3、IL−6、MIF、オステオプロテゲリン、TIMP−2およびTRAIL R3からなる群より選択された少なくとも1つの蛋白質マーカーの発現に対して陽性である、方法。
(26)実施態様18記載の方法において、
前記個体群の細胞は、蛋白質マーカーSox−17の発現に対して実質的に陰性であり、かつHes−1およびMusashi−1からなる群より選択された少なくとも1つの遺伝子を発現させる、方法。
(27)実施態様18記載の方法において、
前記個体群の細胞は、CD117、Oct−4、Sox−17およびTra2−54の発現に対して実質的に陰性である、方法。
(28)実施態様27記載の方法において、
前記個体群の細胞は、サイトケラチン蛋白質の発現に対して実質的に陰性である、方法。
(29)実施態様27記載の方法において、
前記個体群の細胞は、肝臓活性化蛋白質、PDGF受容体β、bFGF、EGF受容体、GRO、GRO−α、ICAM−1、IL−3、IL−6、MIF、オステオプロテゲリン、TIMP−2およびTRAIL R3からなる群より選択された少なくとも1つの蛋白質マーカーの発現に対して陽性である、方法。
(30)実施態様27記載の方法において、
前記個体群の細胞は、蛋白質マーカーSox−17の発現に対して実質的に陰性であり、かつHes−1およびMusashi−1からなる群より選択された少なくとも1つの遺伝子を発現させる、方法。
(31)実施態様18記載の方法において、
前記個体群の細胞は、試験管内で増殖可能である、方法。
(32)実施態様18記載の方法において、
前記個体群の細胞は、低酸素条件下の試験管内で増殖可能である、方法。
(33)実施態様18記載の方法において、
前記個体群の細胞は、β細胞系列の特性を示す細胞に分化可能である、方法。
(34)実施態様18記載の方法において、前記個体群の細胞は、消化管ホルモン産生細胞に分化可能である、方法。
(35)羊水から細胞の個体群を採取する方法において、
a.羊水を分離するステップと、
b.前記羊水から前記細胞を分離するステップと、
c.SSEA−4、SSEA−3、TRA1−60およびTRA1−81からなる群より選択された少なくとも1つのマーカーを発現させる細胞を選択するステップと、
d.培地中に前記細胞を配置するステップと、
e.培養容器中に前記細胞を播種するステップと、
f.少なくとも5日間、前記培地中で前記細胞を増殖させ、これにより羊水由来細胞の個体群を採取するステップと、
を含む、方法。
(36)実施態様35記載の方法において、
前記個体群の細胞は、CD117、Oct−4、およびTra2−54からなる群より選択された少なくとも1つの蛋白質マーカーの発現に対して実質的に陰性である、方法。
(37)実施態様36記載の方法において、
前記個体群の細胞は、HNF−1β、GATA−6およびSox−17からなる群より選択された少なくとも1つの蛋白質マーカーの発現に対して実質的に陽性である、方法。
(38)実施態様36記載の方法において、
前記個体群の細胞は、HNF−3β、Hes−1、GATA−4およびMusashi−1からなる群より選択された少なくとも1つの遺伝子を発現させるものでもある、方法。
(39)実施態様36記載の方法において、
前記個体群の細胞は、肝臓活性化蛋白質、PDGF受容体β、AXL、bFGF、EGF受容体、Fas/TNFRSF6、GRO、GRO−α、ICAM−1、IL−1α、IL−3、IL−6、IL−8、MIF、オステオプロテゲリン、TIMP−2およびTRAIL R3からなる群より選択された少なくとも1つの蛋白質マーカーの発現に対して陽性である、方法。
(40)実施態様36記載の方法において、
前記個体群の細胞は、前記蛋白質マーカーSox−17の発現に対して実質的に陰性である、方法。
(41)実施態様40記載の方法において、
前記個体群の細胞は、サイトケラチン蛋白質の発現に対して実質的に陰性である、方法。
(42)実施態様40記載の方法において、
前記個体群の細胞は、肝臓活性化蛋白質、PDGF受容体β、bFGF、EGF受容体、GRO、GRO−α、ICAM−1、IL−3、IL−6、MIF、オステオプロテゲリン、TIMP−2およびTRAIL R3からなる群より選択された少なくとも1つの蛋白質マーカーの発現に対して陽性である、方法。
(43)実施態様35記載の方法において、
前記個体群の細胞は、前記蛋白質マーカーSox−17の発現に対して実質的に陰性であり、かつHes−1およびMusashi−1からなる群より選択された少なくとも1つの遺伝子を発現させる、方法。
(44)実施態様40記載の方法において、
前記個体群の細胞は、CD117、Oct−4、Sox−17およびTra2−54の発現に対して実質的に陰性である、方法。
(45)実施態様44記載の方法において、
前記個体群の細胞は、サイトケラチン蛋白質の発現に対して実質的に陰性である、方法。
(46)実施態様44記載の方法において、
前記個体群の細胞は、肝臓活性化蛋白質、PDGF受容体β、bFGF、EGF受容体、GRO、GRO−α、ICAM−1、IL−3、IL−6、MIF、オステオプロテゲリン、TIMP−2およびTRAIL R3からなる群より選択された少なくとも1つの蛋白質マーカーの発現に対して陽性である、方法。
(47)実施態様44記載の方法において、
前記個体群の細胞は、前記蛋白質マーカーSox−17の発現に対して実質的に陰性であり、かつHes−1およびMusashi−1からなる群より選択された少なくとも1つの遺伝子を発現させる、方法。
(48)実施態様35記載の方法において、
前記個体群の細胞は、試験管内で増殖可能である、方法。
(49)実施態様35記載の方法において、
前記個体群の細胞は、低酸素条件下の試験管内で増殖可能である、方法。
(50)実施態様35記載の方法において、
前記個体群の細胞は、β細胞系列の特性を示す細胞に分化可能である、方法。
(51)実施態様35記載の方法において、
前記個体群の細胞は、消化管ホルモン産生細胞に分化可能である、方法。
(52)糖尿病患者あるいは糖尿病発症のリスクを負う者を治療するための方法において、
a.ドナーから採取した羊水由来細胞の個体群を分離するステップと、
b.前記患者に前記羊水由来細胞を移すステップを含む、方法。
(53)実施態様52記載の方法において、
前記個体群の細胞は、CD117、Oct−4、およびTra2−54からなる群より選択された少なくとも1つの蛋白質マーカーの発現に対して実質的に陰性である、方法。
(54)実施態様53記載の方法において、
前記個体群の細胞は、HNF−1β、GATA−6およびSox−17からなる群より選択された少なくとも1つの蛋白質マーカーの発現に対して実質的に陽性である、方法。
(55)実施態様53記載の方法において、
前記個体群の細胞は、HNF−3β、Hes−1、GATA−4およびMusashi−1からなる群より選択された少なくとも1つの遺伝子を発現させるものでもある、方法。
(56)実施態様53記載の方法において、
前記個体群の細胞は、肝臓活性化蛋白質、PDGF受容体β、AXL、bFGF、EGF受容体、Fas/TNFRSF6、GRO、GRO−α、ICAM−1、IL−1α、IL−3、IL−6、IL−8、MIF、オステオプロテゲリン、TIMP−2およびTRAIL R3からなる群より選択された少なくとも1つの蛋白質マーカーの発現に対して陽性である、方法。
(57)実施態様53記載の方法において、
前記個体群の細胞は、前記蛋白質マーカーSox−17の発現に対して実質的に陰性である、方法。
(58)実施態様57記載の方法において、
前記個体群の細胞は、サイトケラチン蛋白質の発現に対して実質的に陰性である、方法。
(59)実施態様57記載の方法において、
前記個体群の細胞は、肝臓活性化蛋白質、PDGF受容体β、bFGF、EGF受容体、GRO、GRO−α、ICAM−1、IL−3、IL−6、MIF、オステオプロテゲリン、TIMP−2およびTRAIL R3からなる群より選択された少なくとも1つの蛋白質マーカーの発現に対して陽性である、方法。
(60)実施態様52記載の方法において、
前記個体群の細胞は、前記蛋白質マーカーSox−17の発現に対して実質的に陰性であり、かつHes−1およびMusashi−1からなる群より選択された少なくとも1つの遺伝子を発現させる、方法。
(61)実施態様57記載の方法において、
前記個体群の細胞は、CD117、Oct−4、Sox−17およびTra2−54の発現に対して実質的に陰性である、方法。
(62)実施態様61記載の方法において、
前記個体群の細胞は、サイトケラチン蛋白質の発現に対して実質的に陰性である、方法。
(63)実施態様61記載の方法において、
前記個体群の細胞は、肝臓活性化蛋白質、PDGF受容体β、bFGF、EGF受容体、GRO、GRO−α、ICAM−1、IL−3、IL−6、MIF、オステオプロテゲリン、TIMP−2およびTRAIL R3からなる群より選択された少なくとも1つの蛋白質マーカーの発現に対して陽性である、方法。
(64)実施態様61記載の方法において、
前記個体群の細胞は、前記蛋白質マーカーSox−17の発現に対して実質的に陰性であり、かつHes−1およびMusashi−1からなる群より選択された少なくとも1つの遺伝子を発現させる、方法。
(65)実施態様52記載の方法において、
前記個体群の細胞は、前記患者に移すステップの前に、膵臓ホルモン産生細胞に分化される、方法。
(66)実施態様52記載の方法において、
前記個体群の細胞は、前記患者に移すステップの後に、膵臓ホルモン産生細胞に分化される、方法。
(67)実施態様52記載の方法において、
前記個体群の細胞は、試験管内で増殖可能である、方法。
(68)実施態様52記載の方法において、
前記個体群の細胞は、低酸素条件下の試験管内で増殖可能である、方法。
(69)実施態様52記載の方法において、
前記個体群の細胞は、β細胞系列の特性を示す細胞に分化可能である、方法。
(70)実施態様52記載の方法において、
前記個体群の細胞は、消化管ホルモン産生細胞に分化可能である、方法。
Claims (52)
- 実質的に精製された羊水由来細胞の個体群。
- 請求項1記載の羊水由来細胞の個体群において、
前記個体群の細胞は、CD117、Oct−4、およびTra2−54からなる群より選択された少なくとも1つの蛋白質マーカーの発現に対して実質的に陰性である、羊水由来細胞の個体群。 - 請求項2記載の羊水由来細胞の個体群において、
前記個体群の細胞は、HNF−1β、GATA−6およびSox−17からなる群より選択された少なくとも1つの蛋白質マーカーの発現に対して実質的に陽性である、羊水由来細胞の個体群。 - 請求項2記載の羊水由来細胞の個体群において、
前記個体群の細胞は、HNF−3β、Hes−1、GATA−4およびMusashi−1からなる群より選択された少なくとも1つの遺伝子を発現させるものでもある、羊水由来細胞の個体群。 - 請求項2記載の羊水由来細胞の個体群において、
前記個体群の細胞は、肝臓活性化蛋白質、PDGF受容体β、AXL、bFGF、EGF受容体、Fas/TNFRSF6、GRO、GRO−α、ICAM−1、IL−1α、IL−3、IL−6、IL−8、MIF、オステオプロテゲリン、TIMP−2およびTRAIL R3からなる群より選択された少なくとも1つの蛋白質マーカーの発現に対して陽性である、羊水由来細胞の個体群。 - 請求項2記載の羊水由来細胞の個体群において、
前記個体群の細胞は、蛋白質マーカーSox−17の発現に対して実質的に陰性である、羊水由来細胞の個体群。 - 請求項6記載の羊水由来細胞の個体群において、
前記個体群の細胞は、サイトケラチン蛋白質の発現に対して実質的に陰性である、羊水由来細胞の個体群。 - 請求項6記載の羊水由来細胞の個体群において、
前記個体群の細胞は、肝臓活性化蛋白質、PDGF受容体β、bFGF、EGF受容体、GRO、GRO−α、ICAM−1、IL−3、IL−6、MIF、オステオプロテゲリン、TIMP−2およびTRAIL R3からなる群より選択された少なくとも1つの蛋白質マーカーの発現に対して陽性である、羊水由来細胞の個体群。 - 請求項1記載の羊水由来細胞の個体群において、
前記個体群の細胞は、蛋白質マーカーSox−17の発現に対して実質的に陰性であり、かつHes−1およびMusashi−1からなる群より選択された少なくとも1つの遺伝子を発現させる、羊水由来細胞の個体群。 - 請求項1記載の羊水由来細胞の個体群において、
前記個体群の細胞は、CD117、Oct−4、Sox−17およびTra2−54の発現に対して実質的に陰性である、羊水由来細胞の個体群。 - 請求項10記載の羊水由来細胞の個体群において、
前記個体群の細胞は、サイトケラチン蛋白質の発現に対して実質的に陰性である、羊水由来細胞の個体群。 - 請求項10記載の羊水由来細胞の個体群において、
前記個体群の細胞は、肝臓活性化蛋白質、PDGF受容体β、bFGF、EGF受容体、GRO、GRO−α、ICAM−1、IL−3、IL−6、MIF、オステオプロテゲリン、TIMP−2およびTRAIL R3からなる群より選択された少なくとも1つの蛋白質マーカーの発現に対して陽性である、羊水由来細胞の個体群。 - 請求項10記載の羊水由来細胞の個体群において、
前記個体群の細胞は、蛋白質マーカーSox−17の発現に対して実質的に陰性であり、かつHes−1およびMusashi−1からなる群より選択された少なくとも1つの遺伝子を発現させる、羊水由来細胞の個体群。 - 請求項1記載の羊水由来膵臓細胞の個体群において、
試験管内で増殖可能である、羊水由来膵臓細胞の個体群。 - 請求項1記載の羊水由来細胞の個体群において、
低酸素条件下の試験管内で増殖可能である、羊水由来細胞の個体群。 - 請求項1記載の羊水由来細胞の個体群において、
β細胞系列の特性を示す細胞に分化可能である、羊水由来細胞の個体群。 - 請求項1記載の羊水由来細胞の個体群において、
消化管ホルモン産生細胞に分化可能である、羊水由来細胞の個体群。 - 羊水から細胞の個体群を採取する方法において、
a.羊水を分離するステップと、
b.前記羊水から前記細胞を分離するステップと、
c.培地中に前記細胞を配置するステップと、
d.培養容器中に前記細胞を播種するステップと、
e.少なくとも5日間、前記培地中で前記細胞を増殖させ、これにより羊水由来細胞の個体群を採取するステップと、
を含む、方法。 - 請求項18記載の方法において、
前記個体群の細胞は、CD117、Oct−4、およびTra2−54からなる群より選択された少なくとも1つの蛋白質マーカーの発現に対して実質的に陰性である、方法。 - 請求項19記載の方法において、
前記個体群の細胞は、HNF−1β、GATA−6およびSox−17からなる群より選択された少なくとも1つの蛋白質マーカーの発現に対して実質的に陽性である、方法。 - 請求項19記載の方法において、
前記個体群の細胞は、HNF−3β、Hes−1、GATA−4およびMusashi−1からなる群より選択された少なくとも1つの遺伝子を発現させるものでもある、方法。 - 請求項19記載の方法において、
前記個体群の細胞は、肝臓活性化蛋白質、PDGF受容体β、AXL、bFGF、EGF受容体、Fas/TNFRSF6、GRO、GRO−α、ICAM−1、IL−1α、IL−3、IL−6、IL−8、MIF、オステオプロテゲリン、TIMP−2およびTRAIL R3からなる群より選択された少なくとも1つの蛋白質マーカーの発現に対して陽性である、方法。 - 請求項19記載の方法において、
前記個体群の細胞は、蛋白質マーカーSox−17の発現に対して実質的に陰性である、方法。 - 請求項23記載の方法において、
前記個体群の細胞は、サイトケラチン蛋白質の発現に対して実質的に陰性である、方法。 - 請求項23記載の方法において、
前記個体群の細胞は、肝臓活性化蛋白質、PDGF受容体β、bFGF、EGF受容体、GRO、GRO−α、ICAM−1、IL−3、IL−6、MIF、オステオプロテゲリン、TIMP−2およびTRAIL R3からなる群より選択された少なくとも1つの蛋白質マーカーの発現に対して陽性である、方法。 - 請求項18記載の方法において、
前記個体群の細胞は、蛋白質マーカーSox−17の発現に対して実質的に陰性であり、かつHes−1およびMusashi−1からなる群より選択された少なくとも1つの遺伝子を発現させる、方法。 - 請求項18記載の方法において、
前記個体群の細胞は、CD117、Oct−4、Sox−17およびTra2−54の発現に対して実質的に陰性である、方法。 - 請求項27記載の方法において、
前記個体群の細胞は、サイトケラチン蛋白質の発現に対して実質的に陰性である、方法。 - 請求項27記載の方法において、
前記個体群の細胞は、肝臓活性化蛋白質、PDGF受容体β、bFGF、EGF受容体、GRO、GRO−α、ICAM−1、IL−3、IL−6、MIF、オステオプロテゲリン、TIMP−2およびTRAIL R3からなる群より選択された少なくとも1つの蛋白質マーカーの発現に対して陽性である、方法。 - 請求項27記載の方法において、
前記個体群の細胞は、蛋白質マーカーSox−17の発現に対して実質的に陰性であり、かつHes−1およびMusashi−1からなる群より選択された少なくとも1つの遺伝子を発現させる、方法。 - 請求項18記載の方法において、
前記個体群の細胞は、試験管内で増殖可能である、方法。 - 請求項18記載の方法において、
前記個体群の細胞は、低酸素条件下の試験管内で増殖可能である、方法。 - 請求項18記載の方法において、
前記個体群の細胞は、β細胞系列の特性を示す細胞に分化可能である、方法。 - 請求項18記載の方法において、
前記個体群の細胞は、消化管ホルモン産生細胞に分化可能である、方法。 - 羊水から細胞の個体群を採取する方法において、
a.羊水を分離するステップと、
b.前記羊水から前記細胞を分離するステップと、
c.SSEA−4、SSEA−3、TRA1−60およびTRA1−81からなる群より選択された少なくとも1つのマーカーを発現させる細胞を選択するステップと、
d.培地中に前記細胞を配置するステップと、
e.培養容器中に前記細胞を播種するステップと、
f.少なくとも5日間、前記培地中で前記細胞を増殖させ、これにより羊水由来細胞の個体群を採取するステップと、
を含む、方法。 - 請求項35記載の方法において、
前記個体群の細胞は、CD117、Oct−4、およびTra2−54からなる群より選択された少なくとも1つの蛋白質マーカーの発現に対して実質的に陰性である、方法。 - 請求項36記載の方法において、
前記個体群の細胞は、HNF−1β、GATA−6およびSox−17からなる群より選択された少なくとも1つの蛋白質マーカーの発現に対して実質的に陽性である、方法。 - 請求項36記載の方法において、
前記個体群の細胞は、HNF−3β、Hes−1、GATA−4およびMusashi−1からなる群より選択された少なくとも1つの遺伝子を発現させるものでもある、方法。 - 請求項36記載の方法において、
前記個体群の細胞は、肝臓活性化蛋白質、PDGF受容体β、AXL、bFGF、EGF受容体、Fas/TNFRSF6、GRO、GRO−α、ICAM−1、IL−1α、IL−3、IL−6、IL−8、MIF、オステオプロテゲリン、TIMP−2およびTRAIL R3からなる群より選択された少なくとも1つの蛋白質マーカーの発現に対して陽性である、方法。 - 請求項36記載の方法において、
前記個体群の細胞は、前記蛋白質マーカーSox−17の発現に対して実質的に陰性である、方法。 - 請求項40記載の方法において、
前記個体群の細胞は、サイトケラチン蛋白質の発現に対して実質的に陰性である、方法。 - 請求項40記載の方法において、
前記個体群の細胞は、肝臓活性化蛋白質、PDGF受容体β、bFGF、EGF受容体、GRO、GRO−α、ICAM−1、IL−3、IL−6、MIF、オステオプロテゲリン、TIMP−2およびTRAIL R3からなる群より選択された少なくとも1つの蛋白質マーカーの発現に対して陽性である、方法。 - 請求項35記載の方法において、
前記個体群の細胞は、前記蛋白質マーカーSox−17の発現に対して実質的に陰性であり、かつHes−1およびMusashi−1からなる群より選択された少なくとも1つの遺伝子を発現させる、方法。 - 請求項40記載の方法において、
前記個体群の細胞は、CD117、Oct−4、Sox−17およびTra2−54の発現に対して実質的に陰性である、方法。 - 請求項44記載の方法において、
前記個体群の細胞は、サイトケラチン蛋白質の発現に対して実質的に陰性である、方法。 - 請求項44記載の方法において、
前記個体群の細胞は、肝臓活性化蛋白質、PDGF受容体β、bFGF、EGF受容体、GRO、GRO−α、ICAM−1、IL−3、IL−6、MIF、オステオプロテゲリン、TIMP−2およびTRAIL R3からなる群より選択された少なくとも1つの蛋白質マーカーの発現に対して陽性である、方法。 - 請求項44記載の方法において、
前記個体群の細胞は、前記蛋白質マーカーSox−17の発現に対して実質的に陰性であり、かつHes−1およびMusashi−1からなる群より選択された少なくとも1つの遺伝子を発現させる、方法。 - 請求項35記載の方法において、
前記個体群の細胞は、試験管内で増殖可能である、方法。 - 請求項35記載の方法において、
前記個体群の細胞は、低酸素条件下の試験管内で増殖可能である、方法。 - 請求項35記載の方法において、
前記個体群の細胞は、β細胞系列の特性を示す細胞に分化可能である、方法。 - 請求項35記載の方法において、
前記個体群の細胞は、消化管ホルモン産生細胞に分化可能である、方法。 - 糖尿病患者あるいは糖尿病発症のリスクを負う者を治療するための方法において、
a.ドナーから採取した羊水由来細胞の個体群を分離するステップと、
b.前記患者に前記羊水由来細胞を移すステップを含む、方法。
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