JP2006296427A - 疎水性固体支持体を利用した細胞分離方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】水接触角が70〜90°である疎水性固体支持体に、各種細胞またはウイルスを含む(血液等の臨床サンプルでも良い)pH2.5〜4ないし7の溶液を接触させる段階を含む、疎水性固体支持体を利用した、細胞またはウイルスの分離方法、およびそのための装置。支持体は、平面、ピラー、ビーズ、篩等の各種構造を取る事ができる。
【選択図】図1
Description
本発明の方法によりバクテリア細胞を効率的に分離できることを確認するために、グラム陰性細胞である大腸菌株(Escherichia coli HB101)を利用した。実験に利用された固体基板としては、OTS、DTS、OTC、PEIMを用いて調製された基板を利用した。
大腸菌細胞を一般的な手順により、37℃で対数期まで一晩培養した。
一晩培養した大腸菌細胞を800×gで5分間遠心分離して細胞を沈殿させた。次に、1×PBS(リン酸緩衝生理食塩水、pH7.4、Invitrogen corporation)5mlを利用して3回洗浄した。洗浄は、1×PBSに沈殿した大腸菌細胞を再懸濁した後、再懸濁された大腸菌細胞を800×gで5分間遠心分離する過程を反復することによって行った。洗浄の完了した大腸菌細胞を0.1Mのリン酸ナトリウム緩衝液(pH4)および0.1Mのリン酸ナトリウム緩衝液(pH7)5mlにそれぞれ懸濁した。懸濁された大腸菌細胞の初期量を、UV分光計でOD(Optical Density)値を測定することによって求めた。大腸菌細胞の初期量は、0.1Mのリン酸ナトリウム緩衝液(pH4)の場合に、600nmでOD値が0.475であり、これは、細胞懸濁液60μlに対して1.43×107細胞であり、0.1Mのリン酸ナトリウム緩衝液(pH7)の場合には、0.454であり、これは、60μlに対して1.36×107細胞ほどの量と推定される(一般的に、600nmで1のOD値は、大腸菌の場合、5.0×108細胞/mlほどの濃度に対応する)。
固体基板の調製は、SAM(Self Assembled Monolayer)法を利用した。詳細な製造過程は、下記の通りである。
ピラニア溶液にウェーハを2時間以上浸漬させた後、ガラスを1枚ずつスピン乾燥させる。
最終濃度がそれぞれ100mMになるように前記OTSおよびDTSをそれぞれトルエンと混合し、前記OTCおよびPEIMをそれぞれエタノールと混合した後、1時間撹拌する。
前記(2)で調製したそれぞれの溶液に、(1)で洗浄したガラスを入れ、4時間浸漬する。
前記浸漬されたガラスをエタノールでそれぞれ10分ずつ3回洗浄した後、真空乾燥させる。
前記乾燥されたガラスを120℃で1時間インキュベーションする。
60μlパッチを上記で製造した固体基板上に付着した後、細胞懸濁液を60μl塗布した。次に、室温で5分間インキュベーションした後、0.1Mのリン酸ナトリウム緩衝液(pH4)および0.1Mのリン酸ナトリウム緩衝液(pH7)30mlでそれぞれ10分間1回洗浄した。洗浄手順は、前記と同一に行った。
固体基板に結合された大腸菌細胞を染色するために、当業界に公知の大腸菌細胞用グラム染色液で大腸菌細胞を染色した。まず、クリスタルバイオレット溶液を細胞が結合された部位を十分に覆うほどの量を加えた後で1分間待った後、流水で洗浄した。次に、グラムヨード液、グラム脱色剤、グラムサフラニン溶液を同じ方法で処理してグラム染色を完成した。グラム染色後、固体基板を常温で自然乾燥させた。その後、光学顕微鏡を利用して2,000倍で3ポイントのイメージを撮影して単位面積当たり捕獲された細胞数を測定した。
実施例1に利用された固体基板の代わりに、水接触角が14.6°であるアルミナ基板を利用したことを除いては、実施例1と同様の方法で実験を行った。図2は、それぞれpH4およびpH7での、親水性であるアルミナ基板(水接触角20°未満を有する)の顕微鏡写真を表したものである。図2で、「1」と表示されたパネルは、pH4の場合であり、「2」と表示されたパネルは、pH7の場合である。図2で示すように、pH4およびpH7の場合のいずれも大腸菌細胞がほとんど結合されていないということが分かる。すなわち、水接触角が30°以下である親水性のアルミナでは、大腸菌細胞がほとんど結合されない。
流体制御システムにおいて、基板に対する大腸菌結合能を知るために、固体基板の表面として水接触角75°のCRS(Charge Reversible Surface、大韓民国特許出願第2005−0030286号参照)を利用した。シリンジポンプ(HARVARD、PHD2000)を利用し、流速を0.3cm/秒(900μl/分)とした。表面の総面積は、5mm×17.3mmであり、断面積は、5mm2(縦5mm×横1.05mm)であり、断面の縦横比が5以上であった。バクテリア細胞として、大腸菌HB101 200μl、pH4(バクテリア濃度が1.0×105細胞/μl)を利用した。上述の流速で、バクテリア細胞200μlを、表面を一回通過させた。流速900μl/分でリン酸ナトリウム緩衝液(pH4、0.1M)1mlを一回流して洗浄した。残りの過程は、実施例1と同じように行った。
実施例2で、大腸菌細胞HB101の代わりにグラム陰性菌である大腸菌BL21細胞およびシュードモナス・プチダ(Pseudomonas putida)、並びにグラム陽性菌であるストレプトコッカス・ミュータンス(Streptococcus mutans)およびスタフィロコッカス・エピデルミディス(Staphylococcus epidermidis)を利用したことを除いては、実施例2と同様に実験を行った。
流体制御システムで、アルコールおよび/または塩の添加による本発明の基板に対する細胞結合能を知るために、固体基板の表面として、水接触角70°のエチルトリメトキシシランを利用した。シリンジポンプ(HARVARD、PHD2000)を利用し、流速は、0.6cm/秒(900μl/分)であった。表面の総面積は、5mm×17.3mmであり、断面積は、2.5mm2(縦5mm×横0.5mm)であり、縦横比が10以上であった。バクテリア細胞は、それぞれ大腸菌BL21、スタフィロコッカス・エピデルミディス200μl(2.0×107細胞)を利用した。
二次元構造である平面の固体基板を利用した実施例2とは異なり、三次元構造の疎水性固体支持体を有するマイクロチップを利用し、流体制御システムで大腸菌結合能を調べた。二種のマイクロチップを製作した。一方は、シリコン基材チップ(Si/SiO2/SAM)であり、他方は、SU−8チップである。
ピラニア溶液(H2SO4:H2O2=3:1、120℃)で15分間処理し、流水で洗浄後に乾燥する。
洗浄の完了したウェーハをスピンコーティングでヘキサメチルジシラザン(HMDS)を5ml塗布後、500rpmで5秒、4,000rpmで40秒コーティングを行い、120℃で2分間ホットプレートでベーキングする。
フォトレジスト(PR)(GXR 601)を5ml塗布後、500rpmで5秒、4,000rpmで40秒コーティングを行う。
ホットプレートを利用して95℃で2分間ベーキングを行う。
UV aligner(i−line)にピラー製作マスクを装着後、250mJのUVを照射する。
MIF 300現像器を利用して現像を行う。
現像されたウェーハを115℃で2分間ハードベーキングを行う。
STS ICP−RIE機器を利用し、100μmのSiエッチング工程を行う。
Asher装備を利用し、フォトレジストを除去する。
残存するPR除去および洗浄のために、ピラニア溶液で5分間処理して洗浄および乾燥する。
希釈されたHFを1分間処理し、自然酸化物を除去する。
SiO2成長のために、水蒸気を利用した熱湿式酸化を行い、1,000Åの厚さに成長させる。
ピラニア溶液で5分間処理し、洗浄および乾燥する。
エタノール中の200mMのOTCに1時間浸漬し、エタノールで3回洗浄/乾燥する。110℃で40分間ベーキング工程を進める。
ピラニア溶液で15分間処理し、希釈されたHFを3分間処理後、洗浄および乾燥する。200℃のホットプレートで20分間処理する。
SU8 2100(Microchem社製)を8mlほどのウェーハに注いだ後、500rpmで30秒、3,000rpmで30秒スピンコーティングを行う。
SU8コーティングされたウェーハをホットプレートで65℃、5分および95℃、20分間処理する。
UV aligner(i−line)にピラー製作マスクを装着後、320mJのUVを照射する。
前記ウェーハを65℃、1分および95℃、20分間処理する。
SU8現像器(Microchem社製)を利用し、30分間現像を行う。
2−プロパノールで洗浄を行い、窒素で乾燥する。
平面の固体基板を利用した実施例2とは異なり、前記実施例5で製作した三次元のマイクロチップを利用し、流体制御システムで、本発明のマイクロチップに対する大腸菌結合能を調べた。大腸菌細胞は、1.0×108細胞/mlの大腸菌BL21を利用し、流速は、400μl/分であり、大腸菌細胞は、コロニー数測定方法で、マイクロチップに結合した大腸菌数を測定した。残りの過程は、実施例2と同じように行った。
本実施例では、実施例6とは異なり、低濃度の大腸菌細胞およびその他のバクテリア細胞を利用し、本発明の三次元マイクロチップの細胞の捕獲効率を調べた。大腸菌細胞としては、1.0×103細胞/mlおよび1.0×105細胞/mlの大腸菌BL21を利用し、その他のバクテリア細胞は、それぞれ1.0×108細胞/mlのシュードモナス・プチダ、スタフィロコッカス・エピデルミディスおよびストレプトコッカス・ミュータンス細胞を利用し、チップ10を利用したことを除いては、実施例6と同様に行った。
本実施例では、実際の試料に含まれたバクテリア細胞の捕獲効率を知るために、唾液試料とバクテリア細胞との懸濁液を調製した。バクテリア細胞は、SYTO−9蛍光染料で染色された大腸菌BL21を利用し、唾液試料の前処理は、0.01Mのジチオスレイトール(DTT)で15分以上処理し、遠心分離後に0.1Mのリン酸ナトリウム緩衝液(pH4)で再懸濁し、初期の唾液試料の濃度の1/4に希釈した。収得された前処理された唾液溶液に、SYTO−9染色されたバクテリアを懸濁した。流速は、400μl/分であり、バクテリアの捕獲効率は、蛍光光度計を用いて測定した。残りの過程は、前記実施例6と同じように行った。
平面構造では、pH4近辺で良好な細胞捕獲効率を示した(実施例1参照)。作製された三次元マイクロチップ(実施例6のチップ3)を利用し、100mMのリン酸ナトリウム緩衝液のpH効果をさらに検証した。大腸菌をpH4およびpH7のリン酸ナトリウム緩衝液に懸濁させて細胞捕獲効率を比較した。300μl/分で懸濁液を流して三回の試験を行った。構造物の効果により、平面構造に比べてpHの影響が小さくなることが分かった(表6参照)。すなわち、広いpH範囲で使用可能である。
ガラスビーズにOTCを利用し、実施例6のようにSAMコーティングを行った。尿を採取し、いかなる前処理もなしに、既知の濃度(5×106細胞/ml、リン酸ナトリウム、100mM、pH3)の大腸菌を含む溶液と1:1の比率で混合した。0.2gのビーズを前記混合サンプルに投入して混合した。ビーズに吸着された細胞をコロニー計数測定法を用いて定量した。ビーズとサンプルとの混合時間を1分、15分、30分(表7参照)に変化させた。尿の場合には、いかなる前処理過程もなしに、15分で50%のバクテリア細胞捕獲効率を得られた。
Claims (20)
- 水接触角が70〜90°である疎水性固体支持体に、細胞またはウイルスを含む溶液を接触させる段階を含む疎水性固体支持体を利用した細胞またはウイルスの分離方法。
- 前記接触させる段階は、静的または流体状態で行うことを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 前記細胞またはウイルスを含む溶液は、pH2.5〜7であることを特徴とする請求項1または2に記載の方法。
- 前記細胞またはウイルスを含む溶液は、pH2.5〜4であることを特徴とする請求項1または2に記載の方法。
- 前記細胞またはウイルスを含む溶液は、唾液、血液、尿、緩衝液またはこれらの混合液であることを特徴とする請求項1〜4のいずれか1項に記載の方法。
- 前記疎水性固体支持体は、平面構造、ピラー構造、ビーズ構造、または篩構造により構成されることを特徴とする請求項1〜5のいずれか1項に記載の方法。
- 前記ピラー構造の縦横比は、1:1ないし20:1であることを特徴とする請求項6に記載の方法。
- 前記ピラー構造は、ピラー高さ(H)とピラー間の距離(D)との比率が1:1〜25:1であることを特徴とする請求項6または7に記載の方法。
- 前記ピラー構造は、ピラー間の距離(D)が5μm〜100μmであることを特徴とする請求項6〜8のいずれか1項に記載の方法。
- 前記細胞またはウイルスは、バクテリア、バクテリオファージ、植物細胞、動物細胞、植物ウイルス、および動物ウイルスから構成される群から選択されることを特徴とする請求項1〜9のいずれか1項に記載の方法。
- 前記接触させる段階において、前記溶液にアルコールおよび/または塩をさらに添加することを特徴とする請求項1〜10のいずれか1項に記載の方法。
- 前記塩の濃度は、0.01M〜2Mであることを特徴とする請求項11に記載の方法。
- 前記アルコールは、エタノール、イソプロパノール、メタノールおよびn−ブタノールから構成される群から選択されることを特徴とする請求項11または12に記載の方法。
- 前記接触させる段階の後、前記細胞またはウイルスの結合された疎水性固体支持体を洗浄する段階をさらに含むことを特徴とする請求項1〜13のいずれか1項に記載の方法。
- 水接触角が70〜90°である疎水性固体支持体を含む試料内の細胞またはウイルスを分離するための装置。
- 前記疎水性固体支持体は、平面構造、ピラー構造、ビーズ構造、および篩構造から構成される群から選択されることを特徴とする請求項15に記載の装置。
- 前記ピラー構造の縦横比は、1:1〜20:1であることを特徴とする請求項16に記載の装置。
- 前記ピラー構造は、ピラー高さ(H)とピラー間の距離(D)との比率が1:1〜25:1であることを特徴とする請求項16または17に記載の装置。
- 前記ピラー構造は、ピラー間の距離(D)が5μm〜100μmであることを特徴とする請求項16〜18のいずれか1項に記載の装置。
- 試料チャンバをさらに含むことを特徴とする、請求項15〜19のいずれか1項に記載の装置。
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