JP2006284604A - 微生物採取用フィルタ - Google Patents

Abstract

【課題】 微生物を検査対象から効率良く採取し、また、採取された微生物を正確に検出して計量することを目的とする。
【解決手段】 本発明の微生物採取チップは異物を除去するフィルタと微生物を捕集するフィルタを基本構成とする。微生物採取キットは上記のような微生物採取チップと吸引ろ過手段とからなる。吸引ろ過手段は、例えば、口部にゴム栓が設けてある陰圧管である。また、微生物採取チップは液状検体を注入する液状検体注入容器と陰圧管の口部に設けられたゴム栓を貫通させることができる中空針を有する。液状検体注入容器へ注入された液状検体は陰圧管の圧力によって吸引ろ過される。異物は異物除去フィルタで除去され、微生物は微生物採取用フィルタ上に捕集される。その後、微生物採取用フィルタを含むユニットを用いて微生物採取用フィルタ上に捕集された微生物を検出し計量する。
【選択図】 図１

Description

本発明は、検査対象に付着した微生物を採取する手段であり、これらを発色及び発光、蛍光発光させ、検査対象に存在する生細胞及び死細胞あるいは特定の微生物を効率よく捕集し、検出し、測定するための微生物採取用フィルタに関するものである。

従来、この種の微生物採取手段としては、ポンプの作動による圧力変化によって微生物を含み得る液状検体から微生物をろ過してフィルタ上に微生物を捕集した後、ユニットを分解してピンセットのような細かい作業を行うことができる道具を用いて採取した微生物が付着しているフィルタを回収して測定するものがあった。

このような従来の微生物採取手段では、微生物の採取にポンプなど大掛かりな装置を必要としている。また、異物などの影響が直接あるような検体の場合、異物除去過程を別途必要としている。さらにフィルタ上に採取した微生物を検査するためにフィルタのみを回収する必要がある。この作業にはピンセットなど細かい作業を行うための道具を必要としているため、効率を低下し、大量のサンプルを処理することができない。さらにポンプを使用するため機器が大きな物となり、食品検査工程など、作業スペースが狭い場所ではできるものではない。これらは、迅速性が求められる微生物検査において、ある程度の検査時間及び技術を必要とする。従って、誰もが簡便に迅速に行うことができるというものではないという課題がある。

本発明は、このような従来の課題を解決するものであり、微生物採取用フィルタを暗色のフィルタとすることで、背景（バックグランド）の発光を抑制して微生物計量を精度よく行うことができる微生物採取チップを提供することを目的としている。

また、微生物採取用フィルタ上にある種の成分からなる薄膜を形成することで、背景（バックグランド）の発光を抑制して微生物計量を精度よく行うことができる微生物採取チップを提供することを目的としている。

また、薄膜の膜厚を適切な値とすることで、薄膜を形成することの効果をより確実なものとする微生物採取チップを提供することを目的としている。

本発明は、上記目的を達成するため、微生物を捕集するための微生物採取用フィルタにおいて、フィルタの分光反射率を低くし、バックグランドの発光を抑制したことを特徴とする。

また、微生物採取用フィルタを暗色のフィルタとしたことを特徴とする。そして、本発明によれば、背景（バックグランド）が発光して正確な微生物計量を阻害することを効果的に抑制することができる。

また、フィルタ上に金、銅、クロム、白金、パラジウムから選ばれる少なくとも一種類の金属成分を含む薄膜を形成したことを特徴とする。そして、本発明によれば、背景（バックグランド）が発光して正確な微生物計量を阻害することを効果的に抑制することができる。

また、薄膜の膜厚を１０乃至５０ｎｍとしたことを特徴とする。そして、本発明によれば、薄膜を形成することの効果をより確実なものとすることができる。

また、暗色のフィルタ上に金、銅、クロム、白金、パラジウムから選ばれる少なくとも一種類の金属成分を含む薄膜を形成したことを特徴とする。そして、本発明によれば、背景（バックグランド）が発光して正確な微生物計量を阻害することをより効果的に抑制することができる。

本発明によれば、背景（バックグランド）が発光して正確な微生物計量を阻害することが効果的に抑制された微生物採取用フィルタが提供される。

以下に本発明を図面を用いて説明する。しかしながら本発明は以下の説明に何ら限定されるものではない。

図１（ａ）は微生物採取キットの一態様の断面図である。微生物採取キットＡは微生物採取チップＢと吸引ろ過手段Ｃとからなる。微生物採取チップＢは基本構成として前段にあるプレフィルタとしての異物除去用フィルタ１と後段にある本発明の暗色（例えば黒色）の微生物採取用フィルタ２（例えば白色のフィルタ上に炭素薄膜を形成したもの）とからなる。異物除去用フィルタ１の孔径は異物を極力除去するために５乃至２０μｍとされ、微生物採取用フィルタ２の孔径は微生物を確実に捕集するために０．２乃至０．８μｍとされている。ここで孔径は最小孔径を意味するものとする。微生物採取チップＢは液状検体注入容器３を有し、異物除去用フィルタ１は液状検体注入容器３の底部としてなる。微生物採取用フィルタ２は台座４の上に配置され、台座４は台座保持部材５に保持されている。台座保持部材５に保持された台座４には中空針６が一体成形されている。液状検体注入容器３と台座保持部材５は着脱自在に嵌合するようになっている。吸引ろ過手段Ｃは陰圧管７であり、陰圧管７の口部はゴム栓８で封止されている。

本発明の微生物採取用フィルタ２を暗色のフィルタとすることで、背景（バックグランド）が発光して正確な微生物計量を阻害することを効果的に抑制することができる。また、フィルタ上に金、銅、クロム、白金、パラジウムから選ばれる少なくとも一種類の金属成分を含む薄膜を形成してもよい。これらの成分は３００乃至５５０ｎｍ程度の波長の励起光に対する分光反射率が低いという性質を有するので、微生物採取用フィルタ２を暗色のフィルタとし、さらにフィルタ上に上記の薄膜を形成すれば、効果はより向上する（アルミニウムや銀は上記の波長の励起光に対する分光反射率が高いので採用できない）。薄膜は、一種の金属成分からなるものの他、合金、金属酸化物、金属炭化物、金属窒化物、金属炭窒化物などからなるものであってもよい。また、積層薄膜であってもよい。薄膜の形成方法としては、真空蒸着法、イオンスパッタリング法、イオンプレーティング法などの公知の気相成長法が好適に採用される。薄膜の膜厚は１０乃至５０ｎｍとすることが望ましい。１０ｎｍを下回ると薄膜を形成することの効果が十分に発揮されない恐れがある一方、５０ｎｍを超えるとフィルタの孔が目詰まりを起し、フィルタ本来の機能に影響を及ぼす恐れがあるからである。

液状検体は、検査対象が飲料水などの液状サンプルの場合はそれ自体が液状検体となる。検査対象が野菜や肉をはじめとする食材などの固体サンプルの場合はそれをホモジナイズして液状検体を調製したり、その表面から綿棒などを用いて微生物を採取し、これを生理食塩水などに遊離させて液状検体とする。また、まな板などの調理器具などが検査対象となる場合、その表面から綿棒などを用いて微生物を採取し、これを生理食塩水などに遊離させて液状検体とする。このようにして準備された液状検体を微生物採取チップＢの液状検体注入容器３に注入する。その後、陰圧状態の陰圧管７の口部のゴム栓８に中空針６を突き刺し、図１（ｂ）に示したように中空針６にゴム栓８を貫通させることで液状検体は吸引ろ過される。なお、台座保持部材５の下部は中空針６を確実に陰圧管７のゴム栓８に突き刺すためのガイドとしての機能を持たせるためや取扱者が中空針６で怪我をしないように伸長されている。

液状検体が異物除去用フィルタ１を通過した際、微生物よりも大きな異物は異物除去用フィルタ１に捕集され除去される。異物除去用フィルタ１の前段に大型の異物、例えば、野菜屑や繊維などを捕集するためのフィルタを設け、異物の除去を目的としたフィルタを積層形態にしてもよい。異物除去用フィルタ１を通過した液状検体は本発明の微生物採取用フィルタ２に到達し、液状検体に微生物が含まれている場合、微生物は微生物採取用フィルタ２に捕集される。なお、微生物採取用フィルタ２と台座４との境界面には液状検体が微生物採取用フィルタ２の全面に満遍なく行き渡るように溝が設けてある。これにより微生物採取用フィルタ２の局部に微生物が集中して捕集されるような現象を抑制することができる。

液状検体注入容器３と台座保持部材５は着脱自在に嵌合するようになっているので、微生物採取用フィルタ２上に微生物を捕集した後、液状検体注入容器３は取り外し、図１（ｃ）に示したように微生物採取用フィルタ２を含む部位のみを微生物計量装置の計量台へ移動することが可能である。

なお、異物除去用フィルタの前段に別途液状検体注入容器を設けてもよい。

なお、陰圧管の口部のゴム栓の中心部を薄層としてもよい。

なお、液状検体の調製は別途試験管などを使用して行えばよいが、予め液状検体注入容器３に生理食塩水などを注入しておき、そこに綿棒などを用いて採取された微生物を遊離させて液状検体としてもよい。

なお、液状検体注入容器３と台座保持部材５は着脱自在に嵌合するようになっているが、両者の接合はネジを用いて行ってもよい。また、両者は製造当初は一体成形されたものであってもよく、外周に渡る適当な位置に両者の分離を容易にするための分離溝を設けておき、この分離溝を利用して両者を分離するようにしてもよい。

なお、中空針はゴム栓を貫通し、陰圧管内部に到達するものであれば、長さに制限を持つものではない。

図２（ａ）は微生物採取キットのその他の態様の断面図である。微生物採取キットＤは微生物採取チップＥと吸引ろ過手段Ｆとからなる。微生物採取チップＥが図１（ａ）に示した微生物採取チップＢと異なる点は、液状検体注入容器１３の上にその開口部を覆う綿棒５１が付いた蓋５２を備えていることである。微生物採取キットに綿棒を付属させておくことで、表面にキズが多い検査対象や調理場の角など、形状の複雑な検査対象からのサンプリングを容易かつ簡便なものとすることができる。さらに微生物採取チップＥのように綿棒５１を蓋５２と一体化することで形状を単純化することができる。図２（ａ）に示したように液状検体注入容器１３の中に予め生理食塩水５３を注入しておくとともに、綿棒５１を生理食塩水５３に浸る長さのものにしておけば、綿棒５２を用いて検査対象から微生物を採取した後、蓋５２を液状検体注入容器１３に被せて微生物採取チップＥを上下左右に振とうすることにより綿棒５１に付着していた微生物を生理食塩水５３に遊離させて液状検体を調製することが容易となる。

微生物を生理食塩水５３に遊離した後は、図２（ｂ）に示したように中空針１６にゴム栓１８を貫通させることで液状検体は吸引ろ過され、本発明の微生物採取用フィルタ１２上に微生物が捕集される。その後、図１（ｃ）に示したのと同様にして液状検体注入容器１３を取り外し、微生物採取用フィルタ１２を含む部位のみを微生物計量装置の計量台へ移動して計測を行う。

なお、綿棒は蓋とは必ずしも一体化されている必要はない。

なお、綿棒は必ずしも生理食塩水に漬かる長さのものである必要はなく、振とうすることで綿棒に付着していた微生物を生理食塩水に遊離させることができるものであればどのような長さのものであってもよい。

なお、綿棒は微生物採取キットの製造当初から生理食塩水に浸っていてもよい。その場合、生理食塩水で綿棒が濡れているため、特に乾燥した検体対象からの微生物の採取を有効に行うことができる。

なお、綿棒に付着した微生物の生理食塩水への遊離を別途試験管などで行って液状検体を調製し、調製された液状検体を液状検体注入容器に注入するようにしてもよい。

以上のようにして本発明の微生物採取用フィルタ上に捕集された微生物は種々の方法により検出することができるとともに計量することができるが、以下には生細胞と死細胞の両方またはいずれか一方と特定微生物を同時検出し計量する方法を説明する。

第一の微生物計量方法は、生死細胞を発色させる第１の化合物と死細胞を前記発色と異なる波長で発色させる第２の化合物と生細胞を前記発色と異なる波長で発色させる第３の化合物との中で１種類または複数種類と、特定微生物由来物質と反応することで前記発色と異なる波長で発色する少なくとも１種類以上の第４の化合物を液状検体に接触させ、微生物が液状検体に含まれている場合には微生物を染色した後、微生物採取チップを用いて微生物を本発明の微生物採取用フィルタ上に捕集した後、その波長差および発色量から生細胞と死細胞の両方またはいずれか一方と特定微生物を同時検出する方法である。この方法によれば、生死細胞、生細胞、死細胞、特定微生物が異なる波長で発色するので、その波長差および発色量から生細胞と死細胞の両方またはいずれか一方と特定微生物を同時検出することができる。

発色は例えば蛍光によるものが挙げられる。この場合、第１の化合物を核酸結合性の化合物とすることで生死細胞の細胞単体レベルでの高精度の計量ができる。また、第２の化合物を核酸結合性の化合物とすることで死細胞の細胞単体レベルでの高精度の計量ができる。また、第３の化合物を微生物由来物質と反応することで発色する化合物とすることでその発色量の相違により生きている微生物のみを計量することができる。この際、微生物由来物質を酵素タンパク質とすることでその反応性から微生物の生死を判別できる。また、特定微生物由来物質を酵素タンパク質とすることでその反応性から特定微生物の生死を判別できる。

微生物を蛍光染色するために使用される生死細胞を発色させる第１の化合物としては、例えば、４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール二塩酸塩（誘導体であってもよい）のような生死細胞の膜表面より非特異的に浸透し、細胞内に存在する核酸と特異的に結合することで発色する化合物が挙げられる。死細胞を前記発色と異なる波長で発色させる第２の化合物としては、例えば、プロピデュームイオダイド（誘導体であってもよい）のような死細胞の膜表面より非特異的に浸透し、細胞内に存在する核酸と特異的に結合することで発色する化合物が挙げられる。生細胞を前記発色と異なる波長で発色させる第３の化合物としては、例えば、６−カルボキシフルオレセインジアセテート、２’，７’ジクロロフルオレセインジアセテート、６−（Ｎ−スクシンイミジルオキシカルボニル）−３’，６’−０，０’−ジアセチルフルオレセイン、ジヒドロドローダミン、二酢酸フルオレセイン、二酢酸４−アジドフルオレセイン（これらは誘導体であってもよい）のような細胞内に浸透し、生細胞内に存在する酵素タンパク質、例えば、エステラーゼによって分解されることで発色する化合物が挙げられる。特定微生物由来物質と反応することで前記発色と異なる波長で発色する第４の化合物としては、例えば、４−メチルウンベリフェリル−β−Ｄ−ガラクトシド、４−メチルウンベリフェリル−β−Ｄ−グルクロニド（これらは誘導体であってもよい）が挙げられる。これらは、大腸菌や大腸菌群が生産する酵素タンパク質であるβ−グルクロニダーゼやβ−ガラクトシダーゼと特異的に反応することによって分解されて４−メチルウンベリフェロンを生成する。４−メチルウンベリフェロンは紫外光に対し、励起され蛍光を発する。

第１乃至第４の化合物は、例えば、生理食塩水に溶解された状態で使用され、液状検体に添加されることで、微生物が液状検体に含まれている場合には微生物を染色しうる。生理食塩水に溶解された状態の第１乃至第４の化合物は、その適量を点眼剤容器などに収容して用時に液状検体に添加できるようにしてもよい。なお、染色時間は検査対象の種類や液状検体の容量などに応じて適宜設定されるべきものである。

染色された微生物を含む液状検体を微生物採取キットを用いて吸引ろ過することにより、微生物採取チップにおける本発明の微生物採取用フィルタ上に染色された微生物を捕集する。この際、例えば、染色された微生物を含む液状検体にポリソルベート８０などの界面活性剤を添加しておけば、異物除去用フィルタに捕集される異物に付着してしまって微生物採取用フィルタに捕集されないような微生物も、効率よく異物除去用フィルタを通過させて微生物採取用フィルタに捕集することができる。さらに液状検体にポリペプトンなどの培地成分を添加しておけば、操作中における微生物の活性を維持することができる。界面活性剤とともに培地成分を含有する液剤、例えば、ＬＰ希釈液「ダイゴ」（日本製薬社製の商品名）はこのような目的を達成するために好適に使用される。吸引ろ過を行った後は、図１（ｃ）に示したような微生物採取用フィルタ２を含む部位のみを微生物計量装置の計量台へ移動して計測を行う。染色された微生物を含む液状検体にグリセリンなどの多価アルコールを添加しておけば、微生物採取用フィルタ表面が乾燥してしまうことによる微生物の失活や発光の減退を防止することができる。

なお、微生物採取チップにおいて、第１乃至第４の化合物を担持させたフィルタを本発明の微生物採取用フィルタの前段に設置するようなことも可能である。

図３は微生物計量装置の一態様を示す概念図である。この微生物計量装置は、光源１０４、光源集光手段としてのレンズ１１０、受光部１１１を含む。光源１０４から発せられた励起光から目的の波長を取り出すために励起光分光フィルタ１１２で分光する。分光された励起光はプリズム１１３を経て、光路を変化させられる。光路を変化させられた励起光はレンズ１１０を経て検査台１１６に設置された本発明の微生物採取用フィルタ２を含む部位、即ち、微生物採取用フィルタ２と台座４と台座保持部材５と中空針６とからなる組合せ体の微生物採取用フィルタ２の表面に集光される。そこで励起光によって励起された微生物が有する蛍光は、再びプリズム１１３を透過する。その際、蛍光はプリズム１１３をそのまま透過し、受光部１１１に到達する。受光部１１１に到達した蛍光は、目的の蛍光のみを取り出すために蛍光分光フィルタ１１４を経て、受光部１１１に内蔵された光電変換素子１１５に到達し、信号化され、認識される。また、図には示していないが、この微生物計量装置は検査台１１６を移動する手段を備えており、微生物採取用フィルタ２の表面の蛍光発光を全て、若しくは一部を受光することができる。

光電変換素子１１５に到達した蛍光は、微生物判断手段１０５において微生物若しくは異物と判断され、微生物と判断された蛍光は積算されて、その数量が計量される。

光源１０４より発生した励起光は、レンズ１１０によって集光されるが、その際、レンズ１１０によって励起光を照射する範囲は微小な一定面積に集光される。この場合、微小な一定面積とは微生物の大きさに基づいて設定した場合、一辺０．２μｍ乃至７．０μｍ程度の範囲を指し示す。また、現在最も利用されている微生物検出手段の一つである寒天培地拡散法との比較に基づいた場合、寒天培地拡散法によって培養、増殖した微生物の集団によって形成されるコロニーは、その距離が近接している場合、コロニー同士が重なり合う場合があり、最終的に目視で確認した場合、一つのコロニーとして認識してしまう事例が生ずる場合がある。そこで、この場合の微小な一定面積とは、コロニー同士が重なり合わない距離に基づいた場合、一辺１００μｍ乃至５００μｍ程度の範囲を指し示す。

レンズ１１０によって集光された励起光の照射時間は、蛍光を発する化合物の消光時間と励起光強度に依存する。化合物の種類によっては、自然界に存在する紫外光によっても分解する場合があり、２秒乃至３００秒前後の範囲内で励起光を照射することが望ましい。

発光を検出する際、光源１０４の波長の幅が広いものである場合は、励起光分光フィルタ１１２によって励起波長を調整、分光することが可能となる。励起光分光フィルタ１１２は、目的の検出対象に応じて変えられるため、様々な蛍光を発する化合物に対応できる。また、同時に、発光した蛍光波長の幅が広いものである場合は、目的の発光を検出するために蛍光分光フィルタ１１４を目的の検出対象に応じて変えることで様々な蛍光を発する化合物に対応できる。

光源１０４としては、各種ダイオード、ハロゲンランプ、キセノンランプ、冷陰極管、レーザー、ブラックライト、水銀ランプなどが挙げられる。これらの光源のうち最大励起波長が比較的限定されているダイオード、冷陰極管、ブラックライトなどは、前記励起光分光フィルタ１１２および蛍光分光フィルタ１１４を使用することなく実施できる場合がある。また、ハロゲンランプ、水銀ランプなどについては、励起光分光フィルタ１１２および蛍光分光フィルタ１１４を使用する必要がある場合がある。

プリズム１１３およびレンズ１１０は、必要に応じてそれぞれ紫外光を透過する性質を有する。紫外光を透過する性質を有するものとしては石英ガラスなどが挙げられる。これにより紫外光で励起される化合物などにも対応できる。微生物採取用フィルタ２を含む部位を設置する検査台１１６は回転能を有する。レンズ１１０により集光された励起光は、微生物採取用フィルタ２の外周部より中心部へ、若しくは、中心部より外周部へ、半径分の距離を移動する。その際、レンズ１１０により集光された励起光の位置が外周部に存在するときと中心部に存在するときで検査台１１６の回転速度を変化させることによって、レンズ１１０により集光された励起光が外周部に存在するときと中心部に存在するときで励起された化合物が発した蛍光のずれ、残像および残光の発生を防止することができる。

図３に示したように検査台１１６は本発明の微生物採取用フィルタ２を含む部位を嵌合させるための陥没部分（装置溝）を有し、ここに微生物採取用フィルタ２を含む部位をそのまま組み込むことができる形状としてある。なお、この際、例えば、検査台１１６に、微生物採取用フィルタ２がその上に位置するように金属平板を設け、微生物採取用フィルタ２が金属平板に押し付けられるような状態で組み込まれるようにすることで、検査台１１６上で微生物採取用フィルタ２が凹凸なく平滑に保持されるようにすれば、微生物採取用フィルタ２に捕集された微生物の定量をより確実なものにすることができる。

なお、集光した位置を認識する手段を設けることでレンズ１１０によって集光された励起光の位置を認識し、集光が軌道から逸れないように、また、逸れた場合は再び軌道に戻すように設定されるものである。

なお、励起光を照射する微小な一定面積は、正方形を含む多角形に限らず、円形、楕円形などでも可能であり、検体を照射できるものであればよい。

なお、励起光若しくは蛍光を分光する手段として回折格子などを利用することも可能である。

なお、検査台１１６の回転速度を調整することで蛍光の残像および残光を防ぐこととしたが、励起光を照射するレンズ１１０の移動速度を調整することで残像および残光を防ぐことも可能である。

なお、集光した位置を認識する手段は、必ずしも励起光の集光位置を直接認識する必要は無く、微生物採取用フィルタ２上の軌道を把握するものであればよい。

第二の微生物計量方法は、微生物採取チップを用いて微生物を含み得る液状検体から微生物を本発明の微生物採取用フィルタ上に捕集した後、捕捉された微生物に生死細胞を発色させる第１の化合物と死細胞を前記発色と異なる波長で発色させる第２の化合物と生細胞を前記発色と異なる波長で発色させる第３の化合物との中で１種類または複数種類と、特定微生物由来物質と反応することで前記発色と異なる波長で発色する少なくとも１種類以上の第４の化合物を接触させ、微生物を染色した後、その波長差および発色量から生細胞と死細胞の両方またはいずれか一方と特定微生物を同時検出する方法である。この方法によれば、液状検体の容量が多い場合であっても微生物を微生物採取用フィルタ上に捕集した後で微生物を染色するので、第１乃至第４の化合物の使用量は少量で、生細胞や死細胞や特定微生物を精度よく簡単に計量することができる。

液状検体に墨汁を添加することで微生物を本発明の微生物採取用フィルタ上に捕集する際にフィルタ上を黒くすることにより、背景（バックグランド）や異物の発光を抑制して微生物計量を精度よく行うことができる。墨汁は必ずしも液状検体に添加しなければならないわけではなく、微生物が捕集された微生物採取用フィルタの上から添加してもよい。

図４は微生物計量装置の正常状態確認検査用検体の一態様の斜視図（一部透過図）である。この正常状態確認検査用検体１５１は、その表面に所定個数の特定波長の励起光によって発光する発光体１５４が固定されるとともに所定個数の傾き高さ確認マーク１５５が印刷されている基材（例えば樹脂フィルム）１５２とその支持枠１５３からなる。

基材の表面に固定する発光体としては、高分子蛍光粒子や染色した微生物などが挙げられる。高分子蛍光粒子は長期間にわたって安定で均一な発光を維持するので、装置の状態の確認を正確に繰り返して何度も行うことができ、しかも人体に対する安全性が確保されている点において利用価値が高い。高分子蛍光粒子は、ポリスチレンやスチレン−ジビニルベンゼンなどを材質とする粒子であって、粒子を重合する際に特定波長の励起光によって発光する蛍光染料を添加して製造されるものであり、種々のものが市販されている。高分子蛍光粒子は０．１乃至１．０μｍの粒子径のものを使用することが望ましい。小さすぎるとその個数を精度よく計測することが困難になったり、後述するように基材として微生物採取用フィルタを採用した場合、フィルタの孔から高分子蛍光粒子が落下するので検査用検体としての加工性が悪くなったりする一方、大きすぎると発光強度が強すぎることにより計測精度に影響を及ぼす恐れがあるからである。高分子蛍光粒子は、単一種類の高分子蛍光粒子を固定してもよいし、例えば、３５０乃至４００ｎｍの波長の励起光によって青色発光する高分子蛍光粒子と、５００乃至５５０ｎｍの波長の励起光によって赤色発光する高分子蛍光粒子といったように、異なる波長の励起光によって異なる色彩で発光する複数種類の高分子蛍光粒子を固定してもよい。

染色した微生物を基材の表面に固定する場合、固定する微生物は、検査目的とする微生物が生菌であるか死菌であるかその両方であるかによって、生菌、死菌、生死混合菌の中から適宜選択される（例えば、検査目的とする微生物が死菌である場合には死菌計量用光源の正常状態を確認する必要があるので死菌を基材に固定しなければならない）。生菌や生死混合菌を固定する場合は、操作上における人体への安全性を確保しなければならないことに留意すべきである。

基材は樹脂フィルムの他、ガラス、紙、金属などであってもよい。また、微生物採取用フィルタを基材として使用してもよい。微生物採取用フィルタを基材として使用すれば、特定波長の励起光によって発光する発光体をろ過することで、当該発光体を、容易にフィルタ上に捕集、即ち、基材の表面に固定することができる。基材は暗色（例えば黒色）とすることが望ましい。背景（バックグランド）の発光を抑制して、装置の状態の確認を正確に行うことができるようにするためである。また、特定波長の励起光によって発光する発光体を表面に固定した基材上に金、銅、クロム、白金、パラジウムから選ばれる少なくとも一種類の金属成分を含む薄膜を形成すれば、これらの成分は３００乃至５５０ｎｍ程度の波長の励起光に対する分光反射率が低いという性質を有するので、基材を暗色とし、さらに特定波長の励起光によって発光する発光体を表面に固定した基材上に上記の薄膜を形成すれば、効果はより向上する（アルミニウムや銀は上記の波長の励起光に対する分光反射率が高いので採用できない）。また、このような薄膜を形成すれば、発光体の発光強度の調整、例えば、発光強度が強すぎる場合に発光強度を弱めることが可能になるとともに、基材の表面に固定した発光体の脱落などを防止することも可能になる。薄膜は、一種の金属成分からなるものの他、合金、金属酸化物、金属炭化物、金属窒化物、金属炭窒化物などからなるものであってもよい。また、積層薄膜であってもよい。薄膜の形成方法としては、真空蒸着法、イオンスパッタリング法、イオンプレーティング法などの公知の気相成長法が好適に採用される。薄膜の膜厚は１０乃至１０００ｎｍとすることが望ましく、２０乃至１００ｎｍとすることがより望ましい。１０ｎｍを下回ると薄膜を形成することの効果が十分に発揮されない恐れがある一方、１０００ｎｍを超えると基材の表面に固定した発光体の個数を精度よく計測することや発光体の発光強度の調整が困難になるからである。

図５は図４に示した表面に所定個数の特定波長の励起光によって発光する発光体１５４が固定されるとともに所定個数の傾き高さ確認マーク１５５が印刷されている樹脂フィルム１５２の正面図である。発光体１５４を染色した微生物とする場合、微生物の染色は、例えば、上記の生死細胞を発色させる第１の化合物や死細胞を発色させる第２の化合物や生細胞を発色させる第３の化合物を適宜用いて行えばよい。発光体１５４は図３に示したような微生物計量装置により検出することができる。この正常状態確認検査用検体を使用して所定個数の発光体を検出することができることを確認した後、液状検体の微生物計量を行う。所定個数の発光体を検出することができたならば、装置は正常状態にあることを意味する。一方、所定個数の発光体を検出することができなかったならば、装置は正常状態にないことを意味するので、装置の調整などを行う必要がある。

図５に示した樹脂フィルム１５２の表面には所定個数の特定波長の励起光によって発光する発光体１５４が固定されている他、４個の傾き高さ確認マーク１５５が印刷されている。４個の傾き高さ確認マーク１５５に光を照射し、その反射光の出力レベルが均等かどうかを調べることにより、例えば、図３に示した微生物計量装置における検査台１１６の傾きの有無などを検査することができる。また、出力レベルが規定値通りかどうかを調べることにより、検査台１１６が規定高さとなっているかどうかなどを検査することができる。

なお、微生物計量装置の正常状態確認検査用検体の形状については特段の制限があるわけではないが、例えば、図３に示した微生物計量装置における検査台１１６が有する陥没部分（装置溝）に微生物採取用フィルタ２を含む部位と同様に組み込むことができる形状とすることが望ましい。また、検査台１１６に、正常状態確認検査用検体１５１の基材１５２がその上に位置するように金属平板を設け、基材１５２が金属平板に押し付けられるような状態で組み込まれるようにすることで、検査台１１６上で基材１５２が凹凸なく平滑に保持されるようにして、装置の正常状態の確認をより確実なものにしてもよい。

本発明は、背景（バックグランド）が発光して正確な微生物計量を阻害することが効果的に抑制された微生物採取用フィルタを提供することができる点において産業上の利用可能性を有する。

微生物採取キットの一態様の断面図である。 微生物採取キットのその他の態様の断面図である。 微生物採取キットを使用して微生物計量を行うための装置の一態様の概略図である。 微生物計量装置の正常状態確認検査用検体の一態様の斜視図（一部透過図）である。 図４に示した検査用検体における樹脂フィルムの正面図である。

符号の説明

Ａ、Ｄ 微生物採取キット
Ｂ、Ｅ 微生物採取チップ
Ｃ、Ｆ 吸引ろ過手段
１ 異物除去用フィルタ
２、１２ 本発明の微生物採取用フィルタ
３、１３ 液状検体注入容器
４ 台座
５ 台座保持部材
６、１６ 中空針
７、１７ 陰圧管
８、１８ ゴム栓
５１ 綿棒
５２ 蓋
５３ 生理食塩水
１５１ 微生物計量装置の正常状態確認検査用検体
１５２ 特定波長の励起光によって発光する発光体を表面に固定した基材（樹脂フィルム）
１５３ 支持枠
１５４ 特定波長の励起光によって発光する発光体
１５５ 傾き高さ確認マーク

Claims (26)

1. 前段にプレフィルタとしての異物除去用フィルタと後段に微生物採取用フィルタを組み合わせてなり、微生物を含み得る液状検体から微生物をろ過して微生物採取用フィルタ上に微生物を捕集する微生物採取チップ。
2. 異物除去用フィルタの孔径が５乃至２０μｍであり、微生物採取用フィルタの孔径が０．２乃至０．８μｍである請求項１記載の微生物採取チップ。
3. 異物除去用フィルタが液状検体注入容器の底部としてなる請求項１又は２記載の微生物採取チップ。
4. 異物除去用フィルタのさらに前段に液状検体注入容器を設けた請求項１又は２記載の微生物採取チップ。
5. 液状検体注入容器開口部を覆う綿棒付き蓋を備えた請求項３又は４記載の微生物採取チップ。
6. 微生物採取用フィルタを含む部位を単独にて取り外しが可能なものとした請求項１乃至５のいずれかに記載の微生物採取チップ。
7. 微生物採取用フィルタを暗色のフィルタとした請求項１乃至６のいずれかに記載の微生物採取チップ。
8. フィルタ上に金、銅、クロム、白金、パラジウムから選ばれる少なくとも一種類の金属成分を含む薄膜が形成された請求項１乃至７のいずれかに記載の微生物採取チップ。
9. 薄膜の膜厚が１０乃至５０ｎｍである請求項８記載の微生物採取チップ。
10. 前段にプレフィルタとしての異物除去用フィルタと後段に微生物採取用フィルタを組み合わせてなり、微生物を含み得る液状検体から微生物をろ過して微生物採取用フィルタ上に微生物を捕集する微生物採取チップと吸引ろ過手段とからなる微生物採取キット。
11. 吸引ろ過手段を陰圧管とした請求項１０記載の微生物採取キット。
12. 陰圧管の口部にゴム栓が設けてある請求項１１記載の微生物採取キット。
13. ゴム栓の中心部が薄層となっている請求項１２記載の微生物採取キット。
14. 微生物採取チップの微生物採取用フィルタ下部に陰圧管内部に届く中空針を設けた請求項１１乃至１３のいずれかに記載の微生物採取キット。
15. 生死細胞を発色させる第１の化合物と死細胞を前記発色と異なる波長で発色させる第２の化合物と生細胞を前記発色と異なる波長で発色させる第３の化合物との中で１種類または複数種類と、特定微生物由来物質と反応することで前記発色と異なる波長で発色する少なくとも１種類以上の第４の化合物を液状検体に接触させ、微生物が液状検体に含まれている場合には微生物を染色した後、請求項１記載の微生物採取チップを用いて微生物を微生物採取用フィルタ上に捕集した後、その波長差および発色量から生細胞と死細胞の両方またはいずれか一方と特定微生物を同時検出する微生物計量方法。
16. 請求項１記載の微生物採取チップを用いて微生物を含み得る液状検体から微生物を微生物採取用フィルタ上に捕集した後、捕捉された微生物に生死細胞を発色させる第１の化合物と死細胞を前記発色と異なる波長で発色させる第２の化合物と生細胞を前記発色と異なる波長で発色させる第３の化合物との中で１種類または複数種類と、特定微生物由来物質と反応することで前記発色と異なる波長で発色する少なくとも１種類以上の第４の化合物を接触させ、微生物を染色した後、その波長差および発色量から生細胞と死細胞の両方またはいずれか一方と特定微生物を同時検出する微生物計量方法。
17. 液状検体に墨汁を添加する請求項１５又は１６記載の微生物計量方法。
18. 微生物を微生物採取用フィルタ上に捕集した後、微生物採取用フィルタの上から墨汁を添加して微生物採取用フィルタ上を黒くする請求項１５又は１６記載の微生物計量方法。
19. 特定波長の励起光によって発光する発光体を表面に固定した基材を含む微生物計量装置の正常状態確認検査用検体を使用し、予め当該発光体を検出して微生物計量装置が正常状態にあることを確認した後、生細胞と死細胞の両方またはいずれか一方と特定微生物を同時検出する請求項１５又は１６記載の微生物計量方法。
20. 発光体が高分子蛍光粒子である請求項１９記載の微生物計量方法。
21. 発光体が染色した微生物である請求項１９記載の微生物計量方法。
22. 特定波長の励起光によって発光する発光体を表面に固定した基材を含み、微生物計量を行う前に微生物計量装置が正常状態にあることを確認するための微生物計量装置の正常状態確認検査用検体。
23. 基材を暗色とした請求項２２記載の微生物計量装置の正常状態確認検査用検体。
24. 特定波長の励起光によって発光する発光体を表面に固定した基材上に金、銅、クロム、白金、パラジウムから選ばれる少なくとも一種類の金属成分を含む薄膜が形成された請求項２２又は２３記載の微生物計量装置の正常状態確認検査用検体。
25. 薄膜の膜厚が１０乃至１０００ｎｍである請求項２４記載の微生物計量装置の正常状態確認検査用検体。
26. 請求項１記載の微生物採取チップにおける微生物採取用フィルタの微小な一定面積に予め定められた波長域で励起光を照射する光源と、前記励起光によって発光する予め定められた波長域の光を受光する受光手段と、前記光源によって照射されて発光した光を設定した一定の時間内に受光し、その受光した光量が設定したしきい値の範囲内のときに微生物と判断する微生物判断手段と、前記微小な一定面積を連続または断続的に移動させる移動手段と、微生物判断手段から微生物と判断された信号から微生物の数量を積算する積算手段を有する微生物計量装置であって、特定波長の励起光によって発光する発光体を表面に固定した基材を含み、微生物計量を行う前に微生物計量装置が正常状態にあることを確認することができるようにした装置。

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