JP2006254766A - Protein having activity modulating insulin bioactivation - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、インスリンの生理活性を調節し、ＩＲＳのチロシンリン酸化および糖取込みを調節する活性を有する新規ポリペプチド、該ポリペプチドをコードするＤＮＡに関する。 The present invention relates to a novel polypeptide having an activity of regulating physiological activity of insulin and regulating tyrosine phosphorylation and sugar uptake of IRS, and a DNA encoding the polypeptide.
糖尿病は、今や有病率が全人口の約５％を占め、高齢化社会を迎える２１世紀においては更に患者数は増加し、深刻な社会問題になろうことが予想されている。 Diabetes now accounts for about 5% of the total population, and the number of patients is expected to increase further in the 21st century, which is expected to become a serious social problem.
糖尿病は、インスリンの絶対的または相対的欠乏を原因とし、インスリン依存性糖尿病（Ｉ型糖尿病）とインスリン非依存性糖尿病（II型糖尿病）に大別される。特に、II型糖尿病においては、インスリンが血中に存在するにも拘わらず、インスリンの生理活性が発現されない、いわゆる「インスリン抵抗性」が認められ、臨床上大きな問題となっている。 Diabetes is caused by an absolute or relative deficiency of insulin and is roughly divided into insulin-dependent diabetes (type I diabetes) and non-insulin-dependent diabetes (type II diabetes). In particular, in type II diabetes, so-called “insulin resistance” in which the physiological activity of insulin is not expressed despite the presence of insulin in the blood is a serious clinical problem.
インスリンは、糖代謝制御をはじめとした広範な生理活性を有し、代謝維持に重要な役割を果たしていることが示されている。一方、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）は、多くの細胞の増殖および分化を誘導し、ｉｎ ｖｉｖｏ系においても、動物の正常な発生、発達および成長に必須であることが示されている。しかし、ＩＧＦ活性の増強機構またはインスリン抵抗性の発生機構の詳細は、未だ不明である。 Insulin has a wide range of physiological activities including control of glucose metabolism and has been shown to play an important role in maintaining metabolism. Insulin-like growth factor (IGF), on the other hand, induces the proliferation and differentiation of many cells and has been shown to be essential for the normal development, development and growth of animals in the in vivo system. However, the details of the mechanism for enhancing IGF activity or the mechanism for generating insulin resistance are still unclear.
ＩＧＦ及びインスリンは、細胞膜上のレセプターに結合後レセプターチロシンキナーゼを活性化し、これらが複数種のインスリンレセプター基質（ＩＲＳ）をチロシンリン酸化、引き続きＩＲＳのリン酸化チロシン残基を認識してＳＨ２ドメインを持つさまざまなシグナル分子が結合し、下流のシグナル伝達系の活性化を引き起こす結果、広範な生理活性を発現すると考えられている。 IGF and insulin activate receptor tyrosine kinases after binding to receptors on the cell membrane, which tyrosine phosphorylates multiple insulin receptor substrates (IRS), and subsequently recognizes the phosphorylated tyrosine residues of IRS, resulting in the SH2 domain. It is thought that various physiological molecules are expressed as a result of binding of various signal molecules and causing activation of the downstream signal transduction system.
したがって、ＩＧＦ活性の増強やインスリン活性の抑制には、このシグナル伝達系のいずれかの段階で、他の因子のシグナルとのクロストークが起こるというメカニズムが想定される。 Therefore, a mechanism that crosstalk with signals of other factors occurs at any stage of this signal transduction system is considered to enhance IGF activity or suppress insulin activity.
本発明者らは、II型糖尿病の原因と考えられるインスリン抵抗性の発生機構を研究する過程で、インスリン抵抗性の一部は、ＩＲＳに相互作用するタンパク質（ＩＲＳＡＰ）がＩＲＳのチロシンリン酸化の減弱を引き起こし、その結果、インスリン活性の抑制が起こることを発見した（特許文献１）。 In the process of studying the mechanism of insulin resistance, which is thought to be the cause of type II diabetes, the present inventors have found that a part of insulin resistance is a protein that interacts with IRS (IRSAP) of tyrosine phosphorylation of IRS. It was discovered that attenuation was caused, and as a result, suppression of insulin activity occurred (Patent Document 1).
すなわち、ＩＲＳと相互作用するタンパク質が、インスリンレセプター又はＩＧＦレセプターによるＩＲＳのチロシンリン酸化に及ぼす影響を解析することができれば、インスリン抵抗性発生の分子機構に新たな観点を与えるものと期待される。さらに、ＩＲＳと相互作用する新たな分子または新たな分子機構が明らかとなれば、ＩＲＳ結合タンパク質のインスリンシグナル抑制活性を特異的に阻害するような薬剤をスクリーニングする系を容易に構築できると考えられる。 That is, if the influence of a protein that interacts with IRS on tyrosine phosphorylation of IRS by an insulin receptor or IGF receptor can be analyzed, it is expected to give a new viewpoint to the molecular mechanism of insulin resistance generation. Furthermore, if a new molecule or a new molecular mechanism that interacts with IRS is clarified, it is considered that a system for screening a drug that specifically inhibits the insulin signal suppression activity of an IRS-binding protein can be easily constructed. .
一方、ジアシルグリセロールキナーゼ（ＤＧＫ）は、ジアシルグリセロール（ＤＧ）をホスファチジン酸（ＰＡ）に分解する酵素であり、これらはいずれも細胞内においてセカンドメッセンジャーとして働いている。また、ＤＧＫζは、ＤＧによって活性化されるＰＫＣαをはじめとしたいくつかのタンパク質と相互作用し、アダプタータンパク質として機能することも明らかにされている（非特許文献１〜３）。
On the other hand, diacylglycerol kinase (DGK) is an enzyme that degrades diacylglycerol (DG) into phosphatidic acid (PA), both of which act as second messengers in the cell. It has also been clarified that DGKζ interacts with several proteins including PKCα activated by DG and functions as an adapter protein (
本発明は、II型糖尿病におけるインスリン抵抗性の発生機構を解明するために、インスリン生理活性発現機構の初期段階においてシグナル伝達の異常を引き起こす分子、特に、インスリンレセプター又はＩＧＦレセプターによるＩＲＳのチロシンリン酸化を調節する分子、または、ＩＲＳのチロシンリン酸化以降のシグナル伝達を調節する分子を見出すことを目的とする。 In order to elucidate the mechanism of generation of insulin resistance in type II diabetes, the present invention provides tyrosine phosphorylation of IRS by molecules that cause abnormal signal transduction in the early stage of insulin bioactivity expression mechanism, in particular, insulin receptor or IGF receptor. It aims to find a molecule that regulates or a signal that regulates signal transduction after tyrosine phosphorylation of IRS.
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意検討を行った結果、ＩＲＳと結合したＤＧＫζがＤＧＫ活性を有しインスリン刺激によってその活性が変化すること、インスリン標的細胞では、全長ＤＧＫζと同時に触媒ドメインを欠いたスプライシングバリアントであるｓｈｏｒｔ−ｆｏｒｍ ＤＧＫζ（ｓＤＧＫζ）が発現していること、ｓＤＧＫζとＤＧＫζはＩＲＳとの結合で競合すること、更に、ｓＤＧＫζの過剰発現は基底状態およびインスリン依存的な糖取込みを増強すること見いだし、本発明を完成するに至った。 As a result of intensive studies to solve the above problems, the present inventors have found that DGKζ combined with IRS has DGK activity and its activity is changed by insulin stimulation. Short-form DGKζ (sDGKζ), a splicing variant lacking a domain, is expressed, sDGKζ and DGKζ compete for binding to IRS, and overexpression of sDGKζ is a basal state and insulin-dependent sugar It has been found that the uptake is enhanced and the present invention has been completed.
すなわち、本発明は以下の発明を包含する。
（１）以下の(a)または(b)のポリペプチド：
(a)配列番号１のアミノ酸配列からなるポリペプチド、
(b)配列番号１のアミノ酸配列において、１または複数のアミノ酸が欠失、付加、挿入または置換されたアミノ酸配列からなるポリペプチド。
That is, the present invention includes the following inventions.
(1) The following polypeptide (a) or (b):
(a) a polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1,
(b) A polypeptide comprising an amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted, added, inserted or substituted in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.
（２）以下の(a)または(b)のＤＮＡ：
(a)配列番号２の塩基配列からなるＤＮＡ、
(b)配列番号２の塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ。
(2) DNA of the following (a) or (b):
(a) DNA consisting of the base sequence of SEQ ID NO: 2,
(b) A DNA that hybridizes under stringent conditions with a DNA comprising a base sequence complementary to the base sequence of SEQ ID NO: 2.
（３）（２）記載のＤＮＡを備えたベクター。
（４）（２）記載のＤＮＡを備えた形質転換体。
（５）（１）記載のポリペプチドまたは（２）記載のＤＮＡを有効成分とするＩＲＳのチロシンリン酸化調節剤。
（６）（１）記載のポリペプチドまたは（２）記載のＤＮＡを有効成分とする、糖取込み調節剤。
(3) A vector comprising the DNA according to (2).
(4) A transformant comprising the DNA according to (2).
(5) An IRS tyrosine phosphorylation regulator comprising the polypeptide according to (1) or the DNA according to (2) as an active ingredient.
(6) A sugar uptake regulator comprising the polypeptide according to (1) or the DNA according to (2) as an active ingredient.
（７）ゲノムＤＧＫζのＤＮＡを備えた細胞に被検物質を接触させる工程と、
前記細胞におけるＤＧＫζおよび／またはｓＤＧＫζの発現を検出する工程と、を含む、
ＩＲＳチロシンリン酸化調節剤のスクリーニング方法。
(7) a step of bringing a test substance into contact with a cell comprising genomic DGKζ DNA;
Detecting the expression of DGKζ and / or sDGKζ in the cell,
Screening method for IRS tyrosine phosphorylation regulator.
（８）ゲノムＤＧＫζのＤＮＡを備えた細胞に被検物質を接触させる工程と、
前記細胞におけるＤＧＫζおよび／またはｓＤＧＫζの発現を検出する工程と、を含む、糖取込み調節剤のスクリーニング方法。
(8) a step of bringing a test substance into contact with a cell comprising genomic DGKζ DNA;
Detecting the expression of DGKζ and / or sDGKζ in the cell.
（９）下記(i)〜(iii)記載の工程を含むＩＲＳチロシンリン酸化調節剤のスクリーニング方法：
(i)ゲノムＤＧＫζのＤＮＡを備えた細胞におけるｓＤＧＫζの発現を検出する工程、
(ii)被検物質を接触させた後に前記細胞におけるｓＤＧＫζの発現を検出する工程、
(iii)被検物質非存在下におけるｓＤＧＫζの発現と比べて、ｓＤＧＫζの発現を促進する被検物質を選択する工程。
(9) Screening method for an IRS tyrosine phosphorylation regulator comprising the following steps (i) to (iii):
(i) a step of detecting the expression of sDGKζ in a cell comprising genomic DGKζ DNA;
(ii) detecting the expression of sDGKζ in the cell after contacting the test substance;
(iii) A step of selecting a test substance that promotes the expression of sDGKζ compared to the expression of sDGKζ in the absence of the test substance.
（１０）下記(i)〜(iii)記載の工程を含む糖取込み調節剤のスクリーニング方法：
(i)ゲノムＤＧＫζのＤＮＡを備えた細胞におけるｓＤＧＫζの発現を検出する工程、
(ii)被検物質を接触させた後に前記細胞におけるｓＤＧＫζの発現を検出する工程、
(iii)被検物質非存在下におけるｓＤＧＫζの発現と比べて、ｓＤＧＫζの発現を促進する被検物質を選択する工程。
(10) A screening method for a sugar uptake regulator comprising the following steps (i) to (iii):
(i) a step of detecting the expression of sDGKζ in a cell comprising genomic DGKζ DNA;
(ii) detecting the expression of sDGKζ in the cell after contacting the test substance;
(iii) A step of selecting a test substance that promotes the expression of sDGKζ compared to the expression of sDGKζ in the absence of the test substance.
（１１）下記(i)〜(iii)記載の工程を含むＩＲＳチロシンリン酸化調節剤のスクリーニング方法：
(i)被検物質存在下または非存在下でＤＧＫζとＩＲＳとを相互作用させる工程
(ii)ＩＲＳに相互作用したＤＧＫζを測定する工程
(iii)被検物質存在下における相互作用ＤＧＫζ量が被検物質非存在下における相互作用ＤＧＫζ量よりも低いときに、当該被検物質をＩＲＳチロシンリン酸化調節剤の候補として選択する工程。
(11) A screening method for an IRS tyrosine phosphorylation regulator comprising the following steps (i) to (iii):
(i) A step of causing DGKζ and IRS to interact in the presence or absence of a test substance
(ii) A step of measuring DGKζ interacting with IRS
(iii) A step of selecting the test substance as a candidate for an IRS tyrosine phosphorylation regulator when the amount of interacting DGKζ in the presence of the test substance is lower than the amount of interacting DGKζ in the absence of the test substance.
（１２）下記(i)〜(iii)記載の工程を含む糖取込み調節剤のスクリーニング方法：
(i)被検物質存在下または非存在下でＤＧＫζとＩＲＳとを相互作用させる工程
(ii)ＩＲＳに相互作用したＤＧＫζを測定する工程
(iii)被検物質存在下における相互作用ＤＧＫζ量が被検物質非存在下における相互作用ＤＧＫζ量よりも低いときに、当該被検物質を糖取込み調節剤の候補として選択する工程。
(12) A screening method for a sugar uptake regulator comprising the following steps (i) to (iii):
(i) A step of causing DGKζ and IRS to interact in the presence or absence of a test substance
(ii) A step of measuring DGKζ interacting with IRS
(iii) A step of selecting the test substance as a candidate for sugar uptake regulator when the amount of interacting DGKζ in the presence of the test substance is lower than the amount of interacting DGKζ in the absence of the test substance.
本発明により、ＩＲＳチロシンリン酸化調節剤および糖取込み調節剤が提供される。また、本発明により、ＩＲＳチロシンリン酸化調節剤および糖取込み調節剤をスクリーニングする方法が提供される。 According to the present invention, an IRS tyrosine phosphorylation regulator and a sugar uptake regulator are provided. The present invention also provides a method for screening for an IRS tyrosine phosphorylation regulator and a sugar uptake regulator.
本発明者らは、チロシンキナーゼ活性がほとんど検出されない酵母を用いたツーハイブリッドスクリーニングを行い、インスリンレセプター基質（ＩＲＳ）と相互作用するタンパク質をコードする遺伝子の単離および同定を進めた。そして、スクリーニングによって得られたｃＤＮＡの全塩基配列を決定したところ、ジアシルグリセロールキナーゼ（ＤＧＫ）のアイソフォームの１つであるＤＧＫζのスプライシングバリアントを得た。このｃＤＮＡは、ＤＧＫζのＮ末端部分に存在している、ほぼＣ１ドメイン（ｃＰＫＣ、ｎＰＫＣなどがジアシルグリセロールと結合する部分にホモロジーが高いドメイン）のみからなるポリペプチドをコードしていた（実施例１参照）。本発明は上記知見に基づくものである。 The present inventors conducted a two-hybrid screening using yeast in which tyrosine kinase activity is hardly detected, and proceeded with the isolation and identification of a gene encoding a protein that interacts with an insulin receptor substrate (IRS). Then, when the entire nucleotide sequence of the cDNA obtained by screening was determined, a splicing variant of DGKζ, which is one of isoforms of diacylglycerol kinase (DGK), was obtained. This cDNA encoded a polypeptide that was present in the N-terminal part of DGKζ and consisted only of the C1 domain (a domain having high homology at the part where cPKC, nPKC, etc. bind to diacylglycerol) (Example 1). reference). The present invention is based on the above findings.
一実施形態において本発明は、ｓｈｏｒｔ ｆｏｒｍ ＤＧＫζ（ｓＤＧＫζ）およびｓＤＧＫζをコードするＤＮＡに関する。本明細書中ｓＤＧＫζは、ＩＲＳと相互作用するＤＧＫζのスプライシングバリアントであって、ＤＧＫζの触媒ドメインを欠いたものをさす。ｓＤＧＫとＤＧＫζはＩＲＳとの結合に関して競合し、ｓＤＧＫζは、ＩＲＳのチロシンリン酸化を調節する活性、より具体的にはＩＧＦ−Ｉ依存的なＩＲＳ−１のチロシンリン酸化を増強し、ＩＧＦ−Ｉ依存的なＩＲＳ−２のチロシンリン酸化を抑制する活性を有するとともに、糖取込みを調節する活性、具体的には糖取込みを増強する活性を有するポリペプチドである。本発明においてポリペプチドには、オリゴペプチドおよびタンパク質が包含される。 In one embodiment, the present invention relates to DNA encoding short form DGKζ (sDGKζ) and sDGKζ. In the present specification, sDGKζ refers to a splicing variant of DGKζ that interacts with IRS and lacks the catalytic domain of DGKζ. sDGK and DGKζ compete for binding to IRS, and sDGKζ enhances the activity that regulates tyrosine phosphorylation of IRS, more specifically, IGF-I-dependent tyrosine phosphorylation of IRS-1, and IGF-I It is a polypeptide having an activity to suppress the dependent tyrosine phosphorylation of IRS-2 and an activity to regulate sugar uptake, specifically an activity to enhance sugar uptake. In the present invention, polypeptides include oligopeptides and proteins.
本発明においてＩＲＳのチロシンリン酸化を調節する活性とは、該ポリペプチドが細胞内に産生された細胞または組織において、該ポリペプチドの発現がＩＲＳのチロシンリン酸化の調節に関与することを意味する。さらに詳しくは、該ポリペプチドの発現がＩＲＳのチロシンリン酸化を促進又は抑制する活性を有することを意味する。 In the present invention, the activity that regulates tyrosine phosphorylation of IRS means that the expression of the polypeptide is involved in regulation of tyrosine phosphorylation of IRS in the cell or tissue in which the polypeptide is produced intracellularly. . More specifically, it means that the expression of the polypeptide has the activity of promoting or suppressing tyrosine phosphorylation of IRS.
本発明において糖取込みを調節する活性とは、該ポリペプチドが細胞内に産生された細胞または組織において、該ポリペプチドの発現が基底状態またはインスリンもしくはＩＧＦ刺激依存の細胞の糖取込み量の調節に関与することを意味する。さらに詳しくは、該ポリペプチドの発現が細胞の糖取込み量を促進又は抑制する活性を有することを意味する。 In the present invention, the activity of regulating sugar uptake refers to the regulation of the amount of sugar uptake in cells dependent on the ground state or insulin or IGF stimulation, in the cells or tissues in which the polypeptide is produced intracellularly. Means to be involved. More specifically, it means that the expression of the polypeptide has an activity of promoting or suppressing the amount of sugar taken up by cells.
本発明のｓＤＧＫζの具体例としては、配列番号１のアミノ酸配列からなるポリペプチドが挙げられる。ｓＤＧＫζには、配列番号１のアミノ酸配列からなるポリペプチドと機能的に同等のポリペプチドが包含される。「機能的に同等」とは、対象となるポリペプチドが、配列番号１のアミノ酸配列からなるポリペプチドと同等の生物学的機能、生化学的機能を有することを指す。 A specific example of sDGKζ of the present invention includes a polypeptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1. sDGKζ includes a polypeptide functionally equivalent to the polypeptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1. “Functionally equivalent” means that the target polypeptide has the same biological function and biochemical function as the polypeptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.
配列番号１のアミノ酸配列からなるポリペプチドと機能的に同等のポリペプチドとしては、配列番号１のアミノ酸配列において、１または複数のアミノ酸が欠失、付加、挿入または置換されたアミノ酸配列からなるポリペプチドが挙げられる。当該ポリペプチドは、上記のｓＤＧＫζの活性、すなわちＩＲＳと相互作用し、ＩＲＳのチロシンリン酸化を調節する活性および糖取込みを調節する活性を有する。 The polypeptide functionally equivalent to the polypeptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 is a polypeptide consisting of an amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted, added, inserted or substituted in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1. Peptides are mentioned. The polypeptide has the activity of the above-described sDGKζ, that is, the activity that interacts with IRS, regulates tyrosine phosphorylation of IRS, and regulates sugar uptake.
本発明のポリペプチドのうち、配列番号１のアミノ酸配列からなるポリペプチドについては、例えば、配列番号２の塩基配列における一連の３塩基を、当業者に公知の解析ソフトを用いて、その塩基の組合わせ（すなわち、コドン）によりコードされている１つのアミノ酸に置き換えることにより得ることができる。また、例えば配列番号１に示すように、一旦そのアミノ酸配列が決定された本発明のポリペプチドについては、その配列を元に当業者に公知の手法、例えば、アミノ酸１つ１つを化学的に重合してポリペプチドを合成する方法（ペプチド合成法）に従って調製することができる。さらに、ｓＤＧＫζをコードする塩基配列からなるＤＮＡを含む組換えベクターを作製し、該ベクターを適切な宿主細胞中に導入して得られる形質転換体を培地に培養または飼育し、その培養物または飼育体から採取することによっても本発明のポリペプチドを得ることができる。ここで使用する組換えベクター、宿主細胞、培地、各操作法および条件等については、当業者に公知のものの中から目的に応じて適宜選択することができる。 Among the polypeptides of the present invention, for the polypeptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, for example, a sequence of 3 bases in the base sequence of SEQ ID NO: 2 is analyzed using the analysis software known to those skilled in the art. It can be obtained by substituting one amino acid encoded by the combination (ie codon). For example, as shown in SEQ ID NO: 1, for the polypeptide of the present invention whose amino acid sequence has been once determined, a method known to those skilled in the art based on the sequence, for example, chemically treating each amino acid one by one. It can be prepared according to a method of synthesizing a polypeptide by polymerization (peptide synthesis method). Furthermore, a recombinant vector containing a DNA comprising a base sequence encoding sDGKζ is prepared, and a transformant obtained by introducing the vector into an appropriate host cell is cultured or bred in a medium, and the culture or bred The polypeptide of the present invention can also be obtained by collecting from the body. The recombinant vector, host cell, culture medium, each operating method and conditions used here can be appropriately selected from those known to those skilled in the art according to the purpose.
配列番号１のアミノ酸配列における、１または複数のアミノ酸の欠失、付加、挿入または置換は、常用される技術、例えば、部位特異的変異誘発法（Ｚｏｌｌｅｒら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１０ ６４７８−６５００，１９８２）により、配列番号１のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするＤＮＡの配列（例えば、配列番号２の塩基配列）を改変することにより実施することができる。 Deletion, addition, insertion or substitution of one or more amino acids in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 may be performed using conventional techniques such as site-directed mutagenesis (Zoller et al., Nucleic Acids Res. 10 6478-6500, 1982) can be carried out by modifying the sequence of DNA encoding the polypeptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 (for example, the base sequence of SEQ ID NO: 2).
ここで、ポリペプチドの構成要素となるアミノ酸の側鎖は、疎水性、電荷、大きさなどにおいてそれぞれ異なるものであるが、実質的にポリペプチド全体の３次元構造（立体構造とも言う）に影響を与えないという意味で保存性の高い幾つかの関係が、経験的にまた物理化学的な実測により知られている。例えば、異なるアミノ酸残基間の保存的置換の例としては、グリシン（Ｇｌｙ）とプロリン（Ｐｒｏ）、グリシンとアラニン（Ａｌａ）またはバリン（Ｖａｌ）、ロイシン（Ｌｅｕ）とイソロイシン（Ｉｌｅ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ）とグルタミン（Ｇｌｎ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ）とアスパラギン（Ａｓｎ）、システイン（Ｃｙｓ）とスレオニン（Ｔｈｒ）、スレオニンとセリン（Ｓｅｒ）またはアラニン、リジン（Ｌｙｓ）とアルギニン（Ａｒｇ）等のアミノ酸の間での置換が知られている。 Here, the side chains of amino acids that are constituent elements of a polypeptide differ in hydrophobicity, charge, size, etc., but substantially affect the three-dimensional structure (also referred to as a three-dimensional structure) of the entire polypeptide. Some relationships that are highly conserved in the sense that they do not give the empirical properties are known empirically and by physicochemical measurements. For example, conservative substitutions between different amino acid residues include glycine (Gly) and proline (Pro), glycine and alanine (Ala) or valine (Val), leucine (Leu) and isoleucine (Ile), glutamic acid ( Amino acids such as Glu) and glutamine (Gln), aspartic acid (Asp) and asparagine (Asn), cysteine (Cys) and threonine (Thr), threonine and serine (Ser) or alanine, lysine (Lys) and arginine (Arg) The substitution between is known.
従って、配列番号１のアミノ酸配列において１または複数のアミノ酸の欠失、付加、挿入または置換が生じた結果得られたアミノ酸配列からなる変異型ポリペプチドであっても、その変異が配列番号１に記載のアミノ酸配列の３次元構造において保存性が高い変異であって、その変異型ポリペプチドが上記ｓＤＧＫζの活性を有しているのであれば、これらの変異型ポリペプチドもまた本発明のポリペプチドに包含される。ここで、複数とは、通常２〜５個、好ましくは２〜３個である。 Therefore, even in the case of a mutant polypeptide comprising an amino acid sequence obtained as a result of deletion, addition, insertion or substitution of one or more amino acids in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, the mutation is changed to SEQ ID NO: 1. If the mutation is highly conserved in the three-dimensional structure of the amino acid sequence described and the mutant polypeptide has the activity of sDGKζ, these mutant polypeptides are also polypeptides of the present invention. Is included. Here, the term “multiple” means usually 2 to 5, preferably 2 to 3.
また本発明においてｓＤＧＫζには、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性、好ましくは少なくとも９０％の同一性、より好ましくは少なくとも９５％の同一性、さらに好ましくは少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドも包含される。 In the present invention, sDGKζ has at least 80% identity, preferably at least 90% identity, more preferably at least 95% identity, more preferably at least 99% identity with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1. A polypeptide comprising an amino acid sequence having
ｓＤＧＫζは、脳、心臓、大腸、脾臓、腎臓、肝臓、小腸、胎盤などインスリンやＩＧＦの標的組織の多くでその発現が認められ、特に心臓、肝臓において強く発現される（実施例２参照）。 sDGKζ is expressed in many target tissues of insulin and IGF such as brain, heart, large intestine, spleen, kidney, liver, small intestine, and placenta, and is particularly strongly expressed in heart and liver (see Example 2).
本発明はまた、ｓＤＧＫζをコードするＤＮＡに関する。ｓＤＧＫζをコードするＤＮＡの具体例としては、配列番号２の塩基配列からなるＤＮＡが挙げられる。本発明のｓＤＧＫζをコードするＤＮＡには、配列番号２の塩基配列からなるＤＮＡと機能的に同等のＤＮＡが包含される。ここで「機能的に同等」とは、対象となるＤＮＡによってコードされるポリペプチドが、配列番号２の塩基配列からなるＤＮＡによってコードされるポリペプチドと同等の生物学的機能、生化学的機能を有することを指す。 The present invention also relates to DNA encoding sDGKζ. A specific example of DNA encoding sDGKζ is DNA consisting of the base sequence of SEQ ID NO: 2. The DNA encoding sDGKζ of the present invention includes DNA functionally equivalent to the DNA consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2. Here, “functionally equivalent” means that the polypeptide encoded by the target DNA has the same biological function and biochemical function as the polypeptide encoded by the DNA consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2. It means having.
あるポリペプチドと機能的に同等のポリペプチドをコードするＤＮＡを調製する当業者によく知られた方法としては、ハイブリダイゼーション技術（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ２ｎｄ ｅｄ．，９．４７−９．５８，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂ．ｐｒｅｓｓ（１９８９））を利用する方法が挙げられる。 Methods well known to those skilled in the art for preparing DNA encoding a polypeptide functionally equivalent to a certain polypeptide include hybridization techniques (Sambrook, J et al., Molecular Cloning 2nd ed., 9.47-). 9.58, Cold Spring Harbor Lab.press (1989)).
配列番号２の塩基配列からなるＤＮＡと機能的に同等のＤＮＡとしては、配列番号２の塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡが挙げられる。当該ＤＮＡによってコードされるポリペプチドは、上記のｓＤＧＫζの活性、すなわちＩＲＳと相互作用し、ＩＲＳのチロシンリン酸化を調節する活性および糖取込みを調節する活性を有する。 Examples of DNA functionally equivalent to the DNA consisting of the base sequence of SEQ ID NO: 2 include DNA that hybridizes with a DNA consisting of a base sequence complementary to the base sequence of SEQ ID NO: 2 under stringent conditions. The polypeptide encoded by the DNA has the above-described activity of sDGKζ, that is, the activity that interacts with IRS, regulates tyrosine phosphorylation of IRS, and regulates sugar uptake.
ストリンジェントな条件とは、ＤＩＧ ＤＮＡ Ｌａｂｅｌｉｎｇ ｋｉｔ（ベーリンガー・マンハイム社製、カタログ番号１１７５０３３）でプローブをラベルした場合に、３２℃のＤＩＧ Ｅａｓｙ Ｈｙｂ溶液（ベーリンガー・マンハイム社製カタログ番号１６０３５５８）中でハイブリダイズさせ、５０℃の０．５×ＳＳＣ溶液（０．１％［ｗ／ｖ］ＳＤＳを含む）中でメンブレンを洗浄する条件（１×ＳＳＣは０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．０１５Ｍクエン酸ナトリウムである）を意味する。 The stringent conditions include hybridization in a DIG Easy Hyb solution (Catalog No. 1603558, Boehringer Mannheim) at 32 ° C. when the probe is labeled with a DIG DNA Labeling kit (Boehringer Mannheim, Cat. No. 1175033). Conditions for washing the membrane in a 0.5 × SSC solution (containing 0.1% [w / v] SDS) at 50 ° C. (1 × SSC is 0.15 M NaCl, 0.015 M sodium citrate) Mean).
すなわち、配列番号２に記載の塩基配列全長において、種々の人為的処理、例えば部位特異的変異導入、変異剤処理によるランダム変異、制限酵素切断によるＤＮＡ断片の変異、欠失、連結等により、部分的にその配列が変化したものであっても、これらの変異型ＤＮＡが配列番号２の塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、上記ｓＤＧＫζの活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡであれば、配列番号２に示した塩基配列との相違に関わらず、本発明のｓＤＧＫζをコー祖するＤＮＡに含まれる。 In other words, in the full length of the base sequence shown in SEQ ID NO: 2, a portion is obtained by various artificial treatments such as site-directed mutagenesis, random mutation by treatment with a mutagen, mutation of a DNA fragment by restriction enzyme cleavage, deletion, ligation, etc. Even if the sequence is changed, these mutant DNAs hybridize under stringent conditions with DNA consisting of a base sequence complementary to the base sequence of SEQ ID NO: 2, and the activity of sDGKζ is increased. Any DNA that encodes a polypeptide having the sDGKζ of the present invention is included in the DNA regardless of the difference from the base sequence shown in SEQ ID NO: 2.
また本発明においてｓＤＧＫζをコードするＤＮＡには、配列番号２の塩基配列と少なくとも８０％の同一性、好ましくは少なくとも９０％の同一性、より好ましくは少なくとも９５％の同一性、さらに好ましくは少なくとも９９％の同一性を有する塩基配列からなるＤＮＡも包含される。 In the present invention, the DNA encoding sDGKζ has at least 80% identity, preferably at least 90% identity, more preferably at least 95% identity, more preferably at least 99, with the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2. DNA consisting of a base sequence having% identity is also included.
本発明はまた、ｓＤＧＫζをコードするＤＮＡを備えたベクターに関する。本発明のベクターは、本発明のＤＮＡを、一般的な遺伝子組み換え技術に従って適当なベクターに挿入することにより得ることができる。 The present invention also relates to a vector comprising DNA encoding sDGKζ. The vector of the present invention can be obtained by inserting the DNA of the present invention into an appropriate vector according to a general gene recombination technique.
本発明のＤＮＡを挿入する適当なベクターとしては、宿主中で複製可能なものであれば特に限定されないが、例えば、大腸菌由来のプラスミド（例、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１１８他）、枯草菌由来のプラスミド（例、ｐＵＢ１１０、ｐＣ１９４他）、酵母由来のプラスミド（例、ｐＳＨ１９他）、さらにバクテリオファージやレトロウィルスやワクシニアウィルス等の動物ウィルス等が利用できる。 A suitable vector for inserting the DNA of the present invention is not particularly limited as long as it can be replicated in the host. For example, plasmids derived from E. coli (eg, pBR322, pUC118, etc.), plasmids derived from Bacillus subtilis (eg, PUB110, pC194, etc.), yeast-derived plasmids (eg, pSH19, etc.), and animal viruses such as bacteriophages, retroviruses and vaccinia viruses.
また、挿入した遺伝子が確実に発現されるようにするため、該遺伝子の上流に適当な発現プロモーターを接続する。使用する発現プロモーターは、宿主に応じて当業者が適宜選択すればよく、例えば宿主が大腸菌である場合には、Ｔ７プロモーター、ｌａｃプロモーター、ｔｒｐプロモーター、λ−ＰＬプロモーターなどが、宿主がバチルス属菌である場合にはＳＰＯ系プロモーター等が、宿主が酵母である場合にはＰＨＯ５プロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーター等が、宿主が動物細胞である場合にはＳＶ４０由来プロモーター、レトロウィルスプロモーター等が、それぞれ使用できるが、これらに限定されない。 In order to ensure that the inserted gene is expressed, an appropriate expression promoter is connected upstream of the gene. The expression promoter to be used may be appropriately selected by those skilled in the art depending on the host. For example, when the host is E. coli, the T7 promoter, lac promoter, trp promoter, λ-PL promoter, etc. When the host is yeast, the PHO5 promoter, the GAP promoter, the ADH promoter, etc., and when the host is an animal cell, the SV40-derived promoter, the retrovirus promoter, etc. Although it can be used, it is not limited to these.
本発明のベクターには更に、所望により、エンハンサー、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー、リボソーム結合部位等を挿入してもよい。 If desired, an enhancer, a splicing signal, a poly A addition signal, a selection marker, a ribosome binding site and the like may be further inserted into the vector of the present invention.
本発明はまた、ｓＤＧＫζをコードするＤＮＡを備えた形質転換体に関する。本発明の形質転換体は、前記ベクターを、常法または各宿主に対して一般に用いられる形質転換方法に従って、ｓＤＧＫζが発現し得るように宿主中に導入することにより得ることができる。 The present invention also relates to a transformant provided with DNA encoding sDGKζ. The transformant of the present invention can be obtained by introducing the vector into a host so that sDGKζ can be expressed according to a conventional method or a transformation method generally used for each host.
本発明のベクターの宿主への導入は、限定するものではないが、例えばカルシウムイオン法、エレクトロポレーション法、リポフェクション法を用いて実施することができる。 The introduction of the vector of the present invention into the host is not limited, but can be carried out using, for example, a calcium ion method, an electroporation method, or a lipofection method.
宿主としては、限定するものではないが、エシェリヒア属菌であるＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉの各種菌株、バチルス属菌であるＢａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓの各種菌株、酵母としてはＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの各種菌株、動物細胞としてはＣＯＳ−７細胞、ＣＨＯ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、Ｌ６細胞およびＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞等が利用できる。 As a host, although not limited, various strains of Escherichia coli which is an Escherichia genus, various strains of Bacillus subtilis which is a genus Bacillus , various strains of Saccharomyces cerevisiae , COS-7 cells as animal cells, CHO cells, HEK293 cells, L6 cells, SH-SY5Y cells and the like can be used.
本発明のポリペプチドは、前記形質転換体を、当業者に公知の通常の方法に従って培養し、当該培養物から本発明のポリペプチドを回収することにより製造できる。ここで「培養物」とは、培養上清のほか、培養細胞もしくは培養菌体または細胞もしくは菌体の破砕物のいずれをも包含する。 The polypeptide of the present invention can be produced by culturing the transformant according to a conventional method known to those skilled in the art and recovering the polypeptide of the present invention from the culture. Here, the “culture” includes not only the culture supernatant but also any of cultured cells or cultured cells or disrupted cells or cells.
本発明のポリペプチドはまた、他のポリペプチド（例、グルタチオンＳトランスフェラーゼ、プロテインＡその他）との融合型ポリペプチドとして発現させてもよい。このようにして発現させた融合型ポリペプチドは、適当なプロテアーゼ（例、トロンビンその他）を用いて切り出すことができる。 The polypeptide of the present invention may also be expressed as a fusion polypeptide with other polypeptides (eg, glutathione S transferase, protein A, etc.). The fusion polypeptide thus expressed can be excised using an appropriate protease (eg, thrombin or the like).
本発明者らは、ＤＧＫζがＩＲＳ、特にＩＲＳ−１およびＩＲＳ−２と結合する特性を有すること、およびＤＧＫのアイソフォームのうちＤＧＫζのみがＩＲＳと結合することを見いだした。また、ＤＧＫζとＩＲＳの結合にはＣ１ドメインが必要であること、ならびにＩＲＳ−１およびＩＲＳ−２に結合したＤＧＫζがＤＧＫ活性を有することを見いだした（実施例５参照）。 The present inventors have found that DGKζ has the property of binding to IRS, particularly IRS-1 and IRS-2, and that only DGKζ of DGK isoforms binds to IRS. It was also found that the C1 domain is required for the binding of DGKζ and IRS, and that DGKζ bound to IRS-1 and IRS-2 has DGK activity (see Example 5).
そして、ＤＧＫζが、該ポリペプチドを発現する細胞内におけるチロシンリン酸化に関する活性について、以下のような特徴を有することを見いだした。２９３Ｔ細胞では、ＩＧＦ−Ｉ刺激に応答したＩＲＳ−１のチロシンリン酸化を抑制するものの、ＩＲＳ−２のチロシンリン酸化を増強する（実施例５参照）。さらに、ＤＧＫζが、ＩＲＳのチロシンリン酸化以降の（さらに下流の）シグナル伝達の調節に関して以下のような特性を有することも見いだした。ＤＧＫζはＩＧＦ−Ｉ刺激に応答したＡｋｔの活性化には影響しないが、Ｅｒｋの活性化を抑制する（実施例５参照）。これらの結果は、ＤＧＫζがＩＧＦ−ＩによるＰＩ ３−キナーゼ経路の活性化には影響を与えないが、ＭＡＰキナーゼ経路の活性化を抑制することを示すものである。以上から、ＩＲＳと結合したＤＧＫζにおけるＤＧＫ活性が、インスリンまたはＩＧＦ−Ｉの生理活性、すなわちＩＲＳのチロシンリン酸化および糖取込みを調節していることが示された。 The inventors have found that DGKζ has the following characteristics with respect to the activity related to tyrosine phosphorylation in cells expressing the polypeptide. In 293T cells, although tyrosine phosphorylation of IRS-1 in response to IGF-I stimulation is suppressed, tyrosine phosphorylation of IRS-2 is enhanced (see Example 5). In addition, DGKζ has also been found to have the following properties with respect to the regulation of signal transduction (further downstream) following tyrosine phosphorylation of IRS. DGKζ does not affect the activation of Akt in response to IGF-I stimulation, but suppresses the activation of Erk (see Example 5). These results indicate that DGKζ does not affect the activation of the PI 3-kinase pathway by IGF-I, but suppresses the activation of the MAP kinase pathway. From the above, it was shown that DGK activity in DGKζ bound to IRS regulates physiological activity of insulin or IGF-I, that is, tyrosine phosphorylation and sugar uptake of IRS.
一方、ｓＤＧＫζは、ＤＧＫζのうちＩＲＳとの結合に必須の領域であるＣ１ドメインの少なくとも一部を含むが、ＤＧＫζの触媒ドメインおよびＡｎｋｙｒｉｎ ｒｅｐｅａｔを含まない（図１参照）。ｓＤＧＫζは、ＤＧＫζと同様に、ＩＲＳ、特にＩＲＳ−１およびＩＲＳ−２と結合する特性を有する。そして、発現量依存的に、ＤＧＫζとＩＲＳ−１およびＩＲＳ−２との結合を抑制する、すなわちｓＤＧＫζはＩＲＳとの結合に関してＤＧＫζと競合する。 On the other hand, sDGKζ contains at least a part of the C1 domain, which is an essential region for binding to IRS, but does not contain the catalytic domain of DGKζ and Ankyrin repeat (see FIG. 1). Like DGKζ, sDGKζ has the property of binding to IRS, particularly IRS-1 and IRS-2. Then, depending on the expression level, the binding between DGKζ and IRS-1 and IRS-2 is suppressed, that is, sDGKζ competes with DGKζ for binding with IRS.
また、ｓＤＧＫζは、該ポリペプチドを発現する細胞内におけるチロシンリン酸化に関する活性について、ＤＧＫζと相反する特徴を有する。すなわち、ｓＤＧＫζは、２９３Ｔ細胞で、ＩＧＦ−Ｉ刺激に応答したＩＲＳ−１のチロシンリン酸化を増強するものの、ＩＲＳ−２のチロシンリン酸化を抑制する（実施例５参照）。従って、本発明のｓＤＧＫζは、ＩＲＳ−１およびＩＲＳ−２のＩＧＦ−Ｉ誘導性チロシンリン酸化を調節する活性を有するものである。 In addition, sDGKζ has a feature that is contrary to DGKζ with respect to the activity relating to tyrosine phosphorylation in cells expressing the polypeptide. That is, sDGKζ enhances tyrosine phosphorylation of IRS-1 in response to IGF-I stimulation in 293T cells, but suppresses tyrosine phosphorylation of IRS-2 (see Example 5). Accordingly, the sDGKζ of the present invention has an activity of regulating IGF-I-induced tyrosine phosphorylation of IRS-1 and IRS-2.
さらに、ｓＤＧＫζは、ＩＲＳのチロシンリン酸化以降の（さらに下流の）シグナル伝達の調節に関しても、ＤＧＫと相反する特徴を有する。すなわち、ｓＤＧＫζはＩＧＦ−Ｉ刺激に応答したＡｋｔの活性化には影響しないが、Ｅｒｋの活性化を増強する。また、ｓＤＧＫζは発現量依存的にＥｒｋの活性化を増強するが、Ａｋｔの活性化には影響しない（実施例５参照）。これらの結果は、ｓＤＧＫζがＩＧＦ−ＩによるＰＩ ３−キナーゼ経路の活性化には影響を与えないが、ＭＡＰキナーゼ経路の活性化を増強することを示すものである。 Furthermore, sDGKζ has a characteristic that is contrary to DGK in terms of regulation of signal transduction (further downstream) after tyrosine phosphorylation of IRS. That is, sDGKζ does not affect the activation of Akt in response to IGF-I stimulation, but enhances the activation of Erk. In addition, sDGKζ enhances Erk activation in an expression-dependent manner, but does not affect Akt activation (see Example 5). These results indicate that sDGKζ does not affect the activation of the PI 3-kinase pathway by IGF-I, but enhances the activation of the MAP kinase pathway.
さらに、本発明者らは、ｓＤＧＫζを細胞内で過剰発現させると、基底状態およびインスリン依存的な糖取込みが促進されることを見いだした（実施例６参照）。 Furthermore, the inventors have found that overexpression of sDGKζ in cells promotes basal state and insulin-dependent sugar uptake (see Example 6).
以上から、ＩＲＳと結合したＤＧＫζにおけるＤＧＫ活性がインスリン生理活性、すなわちＩＲＳのチロシンリン酸化および糖取込みを調節していること、ＩＲＳとの結合に関してＤＧＫζと競合するｓＤＧＫζによりインスリン生理活性、すなわちＩＲＳのチロシンリン酸化および糖取込みを調節できることが示された。 From the above, it can be seen that DGK activity in DGKζ bound to IRS regulates insulin physiological activity, that is, tyrosine phosphorylation and sugar uptake of IRS, and sDGKζ competes with DGKζ for binding to IRS. It has been shown that tyrosine phosphorylation and sugar uptake can be regulated.
従って、一実施形態において本発明は、ｓＤＧＫζおよび／またはｓＤＧＫζをコードするＤＮＡを有効成分とするＩＲＳのチロシンリン酸化調節剤に関する。さらに本発明は、ｓＤＧＫζおよび／またはｓＤＧＫζをコードするＤＮＡを有効成分とする糖取込み調節剤に関する。本発明のＩＲＳのチロシンリン酸化調節剤は、細胞におけるＩＲＳのチロシンリン酸化を調節することができ、より具体的にはＩＲＳ−１のチロシンリン酸化を増強し、ＩＲＳ−２のチロシンリン酸化を抑制することができる。本発明の糖取込み調節剤は、細胞の糖取込みを増強することができる。ｓＤＧＫζおよびｓＤＧＫζをコードするＤＮＡについては上記のとおりである。本発明のＩＲＳチロシンリン酸化調節剤および糖取込み調節剤により、インスリンの生理活性を調節できることから、これらは糖尿病に対する治療薬、特にII型糖尿病におけるインスリン抵抗性に対する治療薬として期待できる。 Therefore, in one embodiment, the present invention relates to a tyrosine phosphorylation regulator of IRS comprising sDGKζ and / or DNA encoding sDGKζ as an active ingredient. Furthermore, the present invention relates to a sugar uptake regulator comprising sDGKζ and / or DNA encoding sDGKζ as an active ingredient. The IRS tyrosine phosphorylation regulator of the present invention can regulate tyrosine phosphorylation of IRS in cells, more specifically, enhances tyrosine phosphorylation of IRS-1, and inhibits tyrosine phosphorylation of IRS-2. Can be suppressed. The sugar uptake regulating agent of the present invention can enhance the sugar uptake of cells. The DNA encoding sDGKζ and sDGKζ is as described above. Since the physiological activity of insulin can be regulated by the IRS tyrosine phosphorylation regulator and the sugar uptake regulator of the present invention, they can be expected as therapeutic agents for diabetes, particularly therapeutic agents for insulin resistance in type II diabetes.
ｓＤＧＫζおよび／またはｓＤＧＫζをコードするＤＮＡは、通常は薬学的に許容される一つ以上の担体と一緒に混合し、製剤学の技術分野においてよく知られる任意の方法により製剤化することができる。投与経路は、最も効果的なものを使用するのが望ましく、経口投与、または口腔内、気道内、直腸内、皮下、筋肉内および静脈内等の非経口投与を挙げることができる。 sDGKζ and / or DNA encoding sDGKζ can be mixed with one or more pharmaceutically acceptable carriers and formulated by any method well known in the technical field of pharmaceutics. It is desirable to use the most effective route for administration, and examples thereof include oral administration and parenteral administration such as buccal, intratracheal, rectal, subcutaneous, intramuscular and intravenous.
ｓＤＧＫζをコードするＤＮＡを投与する場合は、該ＤＮＡを注射により直接投与する方法のほか、該ＤＮＡが組込まれたベクターを投与する方法が挙げられる。上記ベクターとしては、アデノウイルスベクター、アデノ関連ウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、レトロウイルスベクター等が挙げられ、これらのウイルスベクターを用いることにより効率よく投与することができる。また、本発明のＤＮＡをリポソームなどのリン脂質小胞に導入し、そのリポソームを投与する方法を採用してもよい。ｓＤＧＫζをコードするＤＮＡの投与経路としては、通常の静脈内、動脈内等の全身投与のほか、免疫系組織（骨髄、リンパ節など）に局所投与を行うことができる。さらに、カテーテル技術、外科的手術等と組み合わせた投与経路を採用することもできる。 In the case of administering DNA encoding sDGKζ, in addition to a method of directly administering the DNA by injection, a method of administering a vector in which the DNA is incorporated may be mentioned. Examples of the vector include an adenovirus vector, an adeno-associated virus vector, a herpes virus vector, a vaccinia virus vector, a retrovirus vector, and the like, and can be efficiently administered by using these virus vectors. Further, a method of introducing the DNA of the present invention into a phospholipid vesicle such as a liposome and administering the liposome may be employed. As a route of administration of DNA encoding sDGKζ, local administration can be carried out to immune system tissues (bone marrow, lymph nodes, etc.) in addition to systemic administration such as normal intravenous and intraarterial administration. Furthermore, administration routes combined with catheter techniques, surgical operations, and the like can also be employed.
本発明はまた、ＩＲＳチロシンリン酸化調節剤および糖取込み調節剤のスクリーニング方法に関する。 The present invention also relates to methods for screening for IRS tyrosine phosphorylation regulators and sugar uptake regulators.
本発明のスクリーニング方法の一態様は、ＤＧＫζおよび／またはＳＤＧＫζの発現を指標とする方法である。ゲノムＤＧＫζのＤＮＡを備えた細胞におけるＤＧＫζおよび／またはｓＤＧＫζの発現量を変化させる物質は、ＩＲＳチロシンリン酸化調節剤および糖取込み調節剤の候補物質となることが期待される。より具体的には、ＤＧＫζの発現を促進するおよび／またはｓＤＧＫζの発現を抑制する物質は、ＩＲＳ−１のチロシンリン酸化を抑制しＩＲＳ−２のチロシンリン酸化を増強する物質および糖取込みを抑制する物質として期待できる。一方、ＤＧＫζの発現を抑制させるおよび／またはｓＤＧＫζの発現を促進する物質は、ＩＲＳ−１のチロシンリン酸化を増強しＩＲＳ−２のチロシンリン酸化を抑制する物質および糖取込みを増強する物質として期待でき、さらには、糖尿病、特にII型糖尿病におけるインスリン抵抗性に対する医薬品候補物質となることが期待される。 One aspect of the screening method of the present invention is a method using DGKζ and / or S DGKζ expression as an index. Substances that change the expression level of DGKζ and / or sDGKζ in cells provided with DNA of genomic DGKζ are expected to be candidates for IRS tyrosine phosphorylation regulators and sugar uptake regulators. More specifically, a substance that promotes DGKζ expression and / or suppresses sDGKζ expression suppresses tyrosine phosphorylation of IRS-1 and enhances tyrosine phosphorylation of IRS-2 and suppresses sugar uptake It can be expected as a substance to On the other hand, a substance that suppresses the expression of DGKζ and / or promotes the expression of sDGKζ is expected as a substance that enhances tyrosine phosphorylation of IRS-1 and suppresses tyrosine phosphorylation of IRS-2 and a substance that enhances sugar uptake In addition, it is expected to be a drug candidate for insulin resistance in diabetes, particularly type II diabetes.
本発明において、ＤＧＫζは、ジアシルグリセロール（ＤＧ）をホスファチジン酸（ＰＡ）に分解する酵素のアイソフォームの１つを指す。ＤＧＫζの具体例としては、配列番号３の塩基配列からなるポリペプチドが挙げられる。ＤＧＫζには、配列番号３のアミノ酸配列からなるポリペプチドと機能的に同等のポリペプチドが包含される。配列番号３のアミノ酸配列からなるポリペプチドと機能的に同等のポリペプチドとしては、配列番号３のアミノ酸配列において、１または複数のアミノ酸が欠失、付加、挿入または置換されたアミノ酸配列からなるポリペプチドが挙げられる。当該ポリペプチドは、ＤＧＫζの活性、例えば、ジアシルグリセロールキナーゼ活性を有する。 In the present invention, DGKζ refers to one of the isoforms of an enzyme that decomposes diacylglycerol (DG) into phosphatidic acid (PA). A specific example of DGKζ includes a polypeptide having the base sequence of SEQ ID NO: 3. DGKζ includes a polypeptide functionally equivalent to the polypeptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3. A polypeptide functionally equivalent to the polypeptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 is a polypeptide consisting of an amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted, added, inserted or substituted in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3. Peptides are mentioned. The polypeptide has DGKζ activity, for example, diacylglycerol kinase activity.
ＤＧＫζをコードするＤＮＡの具体例としては、配列番号４の塩基配列からなるＤＮＡが挙げられる。ＤＧＫζをコードするＤＮＡには、配列番号４の塩基配列からなるＤＮＡと機能的に同等のＤＮＡが包含される。配列番号４の塩基配列からなるＤＮＡと機能的に同等のＤＮＡとしては、配列番号４の塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡが包含される。当該ＤＮＡによってコードされるポリペプチドは、ＤＧＫζの活性、例えば、ジアシルグリセロールキナーゼ活性を有する。 A specific example of DNA encoding DGKζ is DNA consisting of the base sequence of SEQ ID NO: 4. The DNA encoding DGKζ includes DNA functionally equivalent to the DNA consisting of the base sequence of SEQ ID NO: 4. The DNA functionally equivalent to the DNA consisting of the base sequence of SEQ ID NO: 4 includes DNA that hybridizes with a DNA consisting of a base sequence complementary to the base sequence of SEQ ID NO: 4 under stringent conditions. The polypeptide encoded by the DNA has DGKζ activity, eg, diacylglycerol kinase activity.
一実施形態において本発明のスクリーニング方法は、ゲノムＤＧＫζのＤＮＡを備えた細胞に被検物質を接触させる工程と、前記細胞におけるＤＧＫζおよび／またはｓＤＧＫζの発現を検出する工程とを含む。 In one embodiment, the screening method of the present invention comprises a step of bringing a test substance into contact with a cell comprising genomic DGKζ DNA, and a step of detecting expression of DGKζ and / or sDGKζ in the cell.
本方法においては、まず、ゲノムＤＧＫζのＤＮＡを備えた細胞に、被検物質を接触させる。本発明のスクリーニング方法において細胞の由来としては、ヒト、マウス、ネコ、イヌ、ウシ、ヒツジ、鳥など、ペット、家畜等に由来する細胞が挙げられるが、これら由来に制限されない。また本発明のスクリーニング方法においては、被検物質も特に制限されず、例えば、天然化合物、有機化合物、無機化合物、タンパク質、ペプチドなどの単一化合物、ならびに、化合物ライブラリー、遺伝子ライブラリーの発現産物、細胞抽出物、細胞培養上清、発酵微生物産生物、海洋生物抽出物、植物抽出物等が挙げられる。 In this method, first, a test substance is brought into contact with a cell having genomic DGKζ DNA. Examples of cell origin in the screening method of the present invention include cells derived from humans, mice, cats, dogs, cows, sheep, birds, pets, livestock, etc., but are not limited to these origins. In the screening method of the present invention, the test substance is not particularly limited, and examples thereof include single compounds such as natural compounds, organic compounds, inorganic compounds, proteins, peptides, and expression products of compound libraries and gene libraries. , Cell extracts, cell culture supernatants, fermented microorganism products, marine organism extracts, plant extracts and the like.
ゲノムＤＧＫζのＤＮＡを備えた細胞への被検物質の接触は、通常、ゲノムＤＧＫζのＤＮＡを備えた細胞の培養液に被検物質を添加することによって行うが、この方法に限定されない。被検物質がタンパク質等の場合には、該タンパク質を発現するＤＮＡベクターを、該細胞へ導入することにより接触を行うことができる。 The contact of the test substance with the cell provided with the genomic DGKζ DNA is usually performed by adding the test substance to the culture medium of the cell provided with the genomic DGKζ DNA. However, the method is not limited to this method. When the test substance is a protein or the like, the contact can be made by introducing a DNA vector expressing the protein into the cell.
本方法においては、次いで、該ＤＧＫζおよび／またはｓＤＧＫζの発現を検出する。ここで発現には、転写および翻訳の双方が含まれる。発現の検出は、当業者に公知の方法によって行うことができる。例えば、ゲノムＤＧＫζのＤＮＡを備えた細胞からｍＲＮＡを定法に従って抽出し、このｍＲＮＡを鋳型としたノーザンハイブリダイゼーション法またはＲＴ−ＰＣＲ法を実施することによって転写レベルの測定を行うことができる。また、ゲノムＤＧＫζのＤＮＡを備えた細胞からタンパク質画分を回収し、ＤＧＫζおよび／またはｓＤＧＫζの発現をＳＤＳ−ＰＡＧＥ等の電気泳動法で検出することにより、翻訳レベルを検出することもできる。さらに、ＤＧＫζおよび／またはｓＤＧＫζに対する抗体を用いて、ウェスタンブロッティング法を実施してＤＧＫζおよび／またはｓＤＧＫζの発現を検出することにより、翻訳レベルの検出を行うことも可能である。ＤＧＫζおよび／またはｓＤＧＫζの検出に用いる抗体としては、検出可能な抗体であれば、特に制限はないが、例えばモノクローナル抗体、またはポリクローナル抗体の両方を利用することができる。 In this method, the expression of the DGKζ and / or sDGKζ is then detected. Here, expression includes both transcription and translation. Expression can be detected by methods known to those skilled in the art. For example, mRNA can be extracted from cells containing genomic DGKζ DNA according to a standard method, and the transcription level can be measured by performing Northern hybridization or RT-PCR using this mRNA as a template. Moreover, a protein fraction is collect | recovered from the cell provided with DNA of genomic DGKζ, and a translation level can also be detected by detecting the expression of DGKζ and / or sDGKζ by an electrophoresis method such as SDS-PAGE. Furthermore, it is also possible to detect the translation level by detecting the expression of DGKζ and / or sDGKζ by performing Western blotting using an antibody against DGKζ and / or sDGKζ. The antibody used for detecting DGKζ and / or sDGKζ is not particularly limited as long as it is a detectable antibody. For example, both a monoclonal antibody and a polyclonal antibody can be used.
ＤＧＫζおよび／またはｓＤＧＫζの発現は、レポーター遺伝子を用いて検出することもできる。 Expression of DGKζ and / or sDGKζ can also be detected using a reporter gene.
本方法においては、まず、ＤＧＫζおよび／またはｓＤＧＫζの転写調節領域とレポーター遺伝子とが機能的に結合した構造を有するＤＮＡを含む細胞または細胞抽出液と、被検物質を接触させる。機能的に結合したとは、ＤＧＫζおよび／またはｓＤＧＫζの転写調節領域に転写因子が結合することにより、レポーター遺伝子の発現が誘導されるように、ＤＧＫζおよび／またはｓＤＧＫζの転写調節領域とレポーター遺伝子とが結合していることをいう。従って、レポーター遺伝子が他の遺伝子と結合しており、他の遺伝子産物との融合タンパク質を形成する場合であっても、ＤＧＫζおよび／またはｓＤＧＫζの転写調節領域に転写因子が結合することによって、該融合タンパク質の発現が誘導されるものであればよい。当業者であれば、ＤＧＫζおよび／またはｓＤＧＫζのｃＤＮＡ塩基配列に基づいて、ゲノム中に存在するＤＧＫζおよび／またはｓＤＧＫζの転写調節領域を周知の方法により取得することが可能である。 In this method, first, a test substance is brought into contact with a cell or a cell extract containing DNA having a structure in which a transcriptional regulatory region of DGKζ and / or sDGKζ and a reporter gene are functionally linked. Functionally bound means that a transcription factor binds to the transcriptional regulatory region of DGKζ and / or sDGKζ, so that expression of the reporter gene is induced, and the transcriptional regulatory region of DGKζ and / or sDGKζ and the reporter gene Is connected. Accordingly, even when the reporter gene is bound to another gene and forms a fusion protein with another gene product, the transcription factor binds to the transcriptional regulatory region of DGKζ and / or sDGKζ, thereby What is necessary is just to induce the expression of the fusion protein. A person skilled in the art can obtain the transcriptional regulatory region of DGKζ and / or sDGKζ present in the genome based on the cDNA base sequence of DGKζ and / or sDGKζ by a well-known method.
レポーター遺伝子としては、その発現が検出可能であれば特に制限はなく、例えば、ＣＡＴ遺伝子、ｌａｃＺ遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子、およびＧＦＰ遺伝子等が挙げられる。 The reporter gene is not particularly limited as long as its expression can be detected, and examples thereof include a CAT gene, a lacZ gene, a luciferase gene, and a GFP gene.
本方法においては、次いで、該レポーター遺伝子の発現レベルを測定する。レポーター遺伝子の発現レベルは、該レポーター遺伝子の種類に応じて、当業者に公知の方法により測定することができる。例えば、レポーター遺伝子がＣＡＴ遺伝子である場合には、該遺伝子産物によるクロラムフェニコールのアセチル化を検出することによって、レポーター遺伝子の発現量を測定することができる。レポーター遺伝子がｌａｃＺ遺伝子である場合には、該遺伝子発現産物の触媒作用による色素化合物の発色を検出することにより、また、ルシフェラーゼ遺伝子である場合には、該遺伝子発現産物の触媒作用による蛍光化合物の蛍光を検出することにより、さらに、ＧＦＰ遺伝子である場合には、ＧＦＰタンパク質による蛍光を検出することにより、レポーター遺伝子の発現量を測定することができる。 In this method, the expression level of the reporter gene is then measured. The expression level of the reporter gene can be measured by methods known to those skilled in the art depending on the type of the reporter gene. For example, when the reporter gene is a CAT gene, the expression level of the reporter gene can be measured by detecting acetylation of chloramphenicol by the gene product. When the reporter gene is a lacZ gene, by detecting the color development of the dye compound catalyzed by the gene expression product, and when the reporter gene is a luciferase gene, the fluorescent compound catalyzed by the gene expression product By detecting fluorescence, and in the case of the GFP gene, the expression level of the reporter gene can be measured by detecting fluorescence due to the GFP protein.
本方法においては、次いで、測定したレポーター遺伝子の発現レベルを、被検物質の非存在下において測定した場合と比較して、変化させる物質を選択する。 In this method, the substance to be changed is then selected by comparing the measured expression level of the reporter gene with that measured in the absence of the test substance.
本発明のスクリーニング方法の別の態様は、ｓＤＧＫζの発現を指標とし、被検物質非存在下におけるｓＤＧＫζの発現と比べて、ｓＤＧＫζの発現を促進する被検物質を選択する方法である。ｓＤＧＫζの発現を促進する物質は、ＩＲＳチロシンリン酸化調節剤、特にＩＲＳ−１のチロシンリン酸化を増強しＩＲＳ−２のチロシンリン酸化を抑制する物質、および糖取込み調節剤、特に糖取込みを増強する物質の候補物質となることが期待される。さらには、被検物質非存在下におけるｓＤＧＫζの発現と比べてｓＤＧＫζの発現を促進する物質は、糖尿病、特にII型糖尿病におけるインスリン抵抗性に対する医薬品候補物質となることが期待される。 Another aspect of the screening method of the present invention is a method of selecting a test substance that promotes the expression of sDGKζ as compared with the expression of sDGKζ in the absence of the test substance using the expression of sDGKζ as an index. Substances that promote the expression of sDGKζ are IRS tyrosine phosphorylation regulators, especially substances that enhance tyrosine phosphorylation of IRS-1 and suppress tyrosine phosphorylation of IRS-2, and sugar uptake regulators, particularly enhance sugar uptake It is expected to be a candidate substance for the substance to be used. Furthermore, a substance that promotes the expression of sDGKζ as compared to the expression of sDGKζ in the absence of a test substance is expected to be a drug candidate for insulin resistance in diabetes, particularly type II diabetes.
従って、一実施形態において本発明は、以下の(i)〜(iii)の工程を含むスクリーニング方法に関する：
(i)ゲノムＤＧＫζのＤＮＡを備えた細胞におけるｓＤＧＫζの発現を検出する工程、
(ii)被検物質を接触させた後に前記細胞におけるｓＤＧＫζの発現を検出する工程、
(iii)被検物質非存在下におけるｓＤＧＫζの発現と比べて、ｓＤＧＫζの発現を促進する被検物質を選択する工程。
Accordingly, in one embodiment, the present invention relates to a screening method comprising the following steps (i) to (iii):
(i) a step of detecting the expression of sDGKζ in a cell comprising genomic DGKζ DNA;
(ii) detecting the expression of sDGKζ in the cell after contacting the test substance;
(iii) A step of selecting a test substance that promotes the expression of sDGKζ compared to the expression of sDGKζ in the absence of the test substance.
ゲノムＤＧＫζのＤＮＡを備えた細胞におけるｓＤＧＫζの発現を検出する工程、使用する細胞、被検物質、被検物質と細胞との接触等については、上記と同様である。 The step of detecting the expression of sDGKζ in a cell provided with the DNA of genomic DGKζ, the cell to be used, the test substance, the contact between the test substance and the cell, etc. are the same as described above.
本発明のスクリーニング方法の別の態様は、ＤＧＫζとＩＲＳとの相互作用を指標とする方法である。ＩＲＳとの相互作用に関してＤＧＫζと競合し、ＤＧＫζとＩＲＳとの相互作用、すなわち結合を阻害する物質は、ＩＲＳチロシンリン酸化調節剤、特にＩＲＳ−１のチロシンリン酸化を増強しＩＲＳ−２のチロシンリン酸化を抑制する物質として、および糖取込み調節剤、特に糖取込みを増強する物質の候補として期待される。さらには、ＤＧＫζとＩＲＳの相互作用を阻害する物質は、糖尿病、特にII型糖尿病におけるインスリン抵抗性に対する医薬品候補物質となることが期待される。 Another aspect of the screening method of the present invention is a method using the interaction between DGKζ and IRS as an index. Substances that compete with DGKζ for interaction with IRS and inhibit the interaction, ie binding, between DGKζ and IRS enhance the tyrosine phosphorylation of IRS tyrosine phosphorylation, particularly IRS-1, and the tyrosine of IRS-2 It is expected as a substance that suppresses phosphorylation and as a candidate for a sugar uptake regulator, particularly a substance that enhances sugar uptake. Furthermore, a substance that inhibits the interaction between DGKζ and IRS is expected to be a drug candidate for insulin resistance in diabetes, particularly type II diabetes.
従って、一実施形態において本発明は、以下の(i)〜(iii)の工程を含むスクリーニング方法に関する：
(i)被検物質存在下または非存在下でＤＧＫζとＩＲＳとを相互作用させる工程
(ii)ＩＲＳに相互作用したＤＧＫζを測定する工程
(iii)被検物質存在下における相互作用ＤＧＫζ量が被検物質非存在下における相互作用ＤＧＫζ量よりも低いときに、当該被検物質をＩＲＳチロシンリン酸化調節剤および糖取込み調節剤の候補として選択する工程。
Accordingly, in one embodiment, the present invention relates to a screening method comprising the following steps (i) to (iii):
(i) A step of causing DGKζ and IRS to interact in the presence or absence of a test substance
(ii) A step of measuring DGKζ interacting with IRS
(iii) When the amount of interacting DGKζ in the presence of the test substance is lower than the amount of interacting DGKζ in the absence of the test substance, the test substance is used as a candidate for an IRS tyrosine phosphorylation regulator and a sugar uptake regulator. Process to select.
本方法において、ＩＲＳに相互作用したＤＧＫζの測定は、ＤＧＫζとＩＲＳとの相互作用の阻害または促進が確認できる方法であれば特に制限されないが、例えば、一例として以下のような方法が挙げられる。 In this method, the measurement of DGKζ interacting with IRS is not particularly limited as long as inhibition or promotion of the interaction between DGKζ and IRS can be confirmed, but examples thereof include the following method.
例えば、標識（例えば、ＲＩ標識、蛍光標識など）を付したＩＲＳを、非標識の被検物質とともに混合して用いる通常の競合アッセイ法が挙げられる。 For example, a normal competitive assay method using IRS with a label (for example, RI label, fluorescent label, etc.) mixed with an unlabeled test substance is used.
また、ツーハイブリッド系の技術を利用し、形質転換体でのレポーター遺伝子の発現量を測定することにより検出する、ツーハイブリッドスクリーニング方法によっても実施できる。ツーハイブリッドスクリーニングは、当該技術分野で公知の方法を用いて実施することができるが、具体的には、以下のように行うことができる。 It can also be carried out by a two-hybrid screening method in which detection is performed by measuring the expression level of a reporter gene in a transformant using a two-hybrid system technique. The two-hybrid screening can be performed using a method known in the technical field, and specifically, can be performed as follows.
本発明のＤＧＫζと転写制御因子のＤＮＡ結合ドメインとを融合させたタンパク質を発現せしめるベクターと、ＩＲＳと転写制御因子の転写活性化ドメインとを融合させたタンパク質を発現せしめるベクターとを導入した形質転換体内で、本発明のＤＧＫζとＩＲＳとが結合することによりレポーター遺伝子の転写が活性化されるツーハイブリッドスクリーニングにおいて、被験物質の存在化および非存在下におけるレポーター遺伝子の発現量を比較することにより、被験物質がＤＧＫζとＩＲＳとの相互作用、すなわち結合を阻害または促進するか否かを確認する。 Transformation in which a vector that expresses a protein in which DGKζ of the present invention and a DNA binding domain of a transcriptional regulator are fused, and a vector that expresses a protein in which IRS and the transcriptional activation domain of a transcriptional regulator are fused are introduced. In the two-hybrid screening where the transcription of the reporter gene is activated by the binding of DGKζ of the present invention and IRS in the body, by comparing the expression level of the reporter gene in the presence and absence of the test substance, It is confirmed whether or not the test substance inhibits or promotes the interaction, that is, the binding between DGKζ and IRS.
レポーター遺伝子およびレポーター遺伝子の発現量を測定する方法については、上記と同様である。宿主細胞としては、酵母、大腸菌等が使用可能であるが、特に、酵母ＣＧ−１９４５株（遺伝子型；ＭＡＴａ，ｕｒａ３−５２，ｈｉｓ３−２００，ｌｙｓ２−８０１，ａｄｅ２−１０１，ｔｒｐ１−９０１，ｌｅｕ２−３，１１２，ｇａｌ４−５４２，ｇａｌ８０−５３８，ｃｙｈｒ２，ＬＹＳ２：：ＧＡＬ１ＵＡＳ−ＧＡＬ１ＴＡＴＡ−ＨＩＳ３，ＵＲＡ３：：ＧＡＬ４１７−ｍｅｒ（ｘ３）−ＣｙＣ１ＴＡＴＡ−ｌａｃＺ）を用いるのが好ましい。転写制御因子としては、ＧＡＬ４等を利用することができる。
The reporter gene and the method for measuring the expression level of the reporter gene are the same as described above. As the host cell, yeast, Escherichia coli and the like can be used. In particular, yeast strain CG-1945 (genotype: MATa, ura3-52, his3-200, lys2-801, ade2-101, trp1-901,
本発明のスクリーニング方法においては、被検物質の評価は、被検物質非存在下と比較して、２倍以上発現を増加または減少させる被検物質、または２倍以上相互作用を阻害する物質を選択することが好ましい。 In the screening method of the present invention, the test substance is evaluated by a test substance that increases or decreases the expression by 2 times or more, or a substance that inhibits the interaction by 2 times or more compared to the absence of the test substance. It is preferable to select.
以下に実施例を示すことにより本発明を更に具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。 EXAMPLES The present invention will be described more specifically with reference to the following examples, but the present invention is not limited to these examples.
（一般的方法）
大腸菌を用いたＤＮＡの取り扱い
プラスミドの構築などの一般的な遺伝子操作の宿主としてはＤＨ５α（遺伝子型；ｓｕｐＥ４４ ΔｌａｃＵ１６９（φ８０ｌａｃＺ ΔＭ１５）ｈｓｄＲ１ ｒｅｃＡ１ ｅｎｄＡ１ ｇｙｒＡ９６ ｔｈｉ−１ ｒｅｌＡ１）、ＸＬ１−Ｂｌｕｅ（遺伝子型；ｓｕｐＥ４４ ｈｓｄＲ１７ ｒｅｃＡ１ ｇｙｒＡ４６ ｔｈｉ ｒｅｌＡ１ ｌａｃ−Ｆ’［ｐｒｏＡＢ＋ｌａｃＩｑ ｌａｃＺΔＭ１５ Ｔｎ１０（ｔｅｔｒ）］）を用い、通常の培養にはＴＹ培地（１％ポリペプトン，０．５％酵母抽出物，０．５％ＮａＣｌ，ｐＨ７．０）を用いた。ベクターのもつ抗生物質耐性マーカーにより、アンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）またはカナマイシン（液体培地：５０μｇ／ｍｌ、固体培地：１５μｇ／ｍｌ）を加え、固体培地には上記の培地にアガーを１．５％添加して作成した。ＤＮＡの制限酵素による切断、結合、平滑末端化、アガロースゲル電気泳動、大腸菌の形質転換などの操作は標準的なプロトコールに従った（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．１９８９）。
(General method)
Hosts for general genetic manipulation such as construction of plasmids for handling DNA using E. coli include DH5α (genotype; supE44 ΔlacU169 (φ80 lacZ ΔM15) hsdR1 recA1 endA1 gyrA96 thi-1 relA1), XL1-Blue (genotype; supE44 hsdR17 recA1 gyrA46 thi relA1 lac-F ′ [proAB + lacIq lacZΔM15 Tn10 (tetr)]) and TY medium (1% polypeptone, 0.5% yeast extract, 0.5% NaCl, pH 7.0) for normal culture. ) Was used. Depending on the antibiotic resistance marker of the vector, ampicillin (50 μg / ml) or kanamycin (liquid medium: 50 μg / ml, solid medium: 15 μg / ml) is added, and 1.5% agar is added to the above medium for the solid medium And created. Procedures such as DNA restriction enzyme cleavage, ligation, blunt end, agarose gel electrophoresis, E. coli transformation, etc., followed standard protocols (Sambrook et al. 1989).
プラスミド
ｐ３×ＦＬＡＧ−ＣＭＶ−ＤＧＫζ及びＤＧＫζの欠失変異体はＴｏｐｈａｍ博士（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｕｔａｈ，Ｕ．Ｓ．Ａ）に御供与頂いた。ｐＥＧＦＰ−ＤＧＫα、ｐＥＧＦＰ−ＤＧＫγ、ｐＥＧＦＰ−ＤＧＫδ、ｐＥＧＦＰ−ＤＧＫηは坂根郁夫博士（札幌医科大学医学部）に御供与頂いた。ｐＧＥＸ−ｓｈｏｒｔ ｆｏｒｍ ＤＧＫζは、スクリーニングによって取得されたｃＤＮＡ断片をＥｃｏＲＩ−ＸｈｏＩ断片で切断し、ｐＧＥＸ−４Ｔ−２のＥｃｏＲＩ−ＸｈｏＩ部位に挿入し、ｐＥＧＦＰ−ｓｈｏｒｔ ｆｏｒｍ ＤＧＫζはスクリーニングによって取得されたｃＤＮＡ断片をＥｃｏＲＩ−ＸｈｏＩ断片で切断し、ｐＥＧＦＰ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ）に挿入した。
Deletion mutants of plasmids p3xFLAG-CMV-DGKζ and DGKζ were kindly provided by Dr. Topham (University of Utah, USA). pEGFP-DGKα, pEGFP-DGKγ, pEGFP-DGKδ, and pEGFP-DGKη were provided by Dr. Ikuo Sakane (Sapporo Medical University School of Medicine). pGEX-short form DGKζ is a cDNA fragment obtained by screening, cleaved with an EcoRI-XhoI fragment and inserted into the EcoRI-XhoI site of pGEX-4T-2, and pEGFP-short form DGKζ is a cDNA fragment obtained by screening. Was cut with EcoRI-XhoI fragment and inserted into pEGFP (CLONTECH).
細胞培養
ＣＯＳ−７細胞（東京大学大学院新領域創成科学研究科片岡宏誌博士から御供与頂いた）及び、ＨＥＫ（ｈｕｍａｎ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｋｉｄｎｅｙ）２９３Ｔ細胞（東京大学大学院農学生命科学研究科塩田邦郎博士から御供与頂いた）は、ダルベッコ改変イーグル培地（ニッスイ）に最終濃度１０％になるように仔ウシ血清（ニチレイ）を加え、抗生物質を１００ｕｎｉｔ／ｍｌペニシリン（萬有製薬）、５０μｇ／ｍｌストレプトマイシン（Ｎａｃａｌａｉ ｔｅｓｑｕｅ）、１００μｇ／ｍｌカナマイシン（Ｎａｃａｌａｉ ｔｅｓｑｕｅ）となるように加えた培地で１５０ｃｍ２組織培養フラスコ（ＩＷＡＫＩ）を用い、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーター条件下で培養した。培地交換は３日おきに行い、植え継ぎはＰＢＳ（リン酸緩衝化食塩水，ニッスイ）＋０．２５％トリプシン＋０．０２％ＥＤＴＡで細胞を剥がして行った。
Cell culture COS-7 cells (provided by Dr. Hiroshi Kataoka, Graduate School of Frontier Sciences, The University of Tokyo) and HEK (human embryonic kidney) 293T cells (supplied by Dr. Kunio Shioda, Graduate School of Agricultural and Life Sciences, University of Tokyo) The calf serum (Nichirei) was added to Dulbecco's modified Eagle medium (Nissui) to a final concentration of 10%, and antibiotics were added at 100 unit / ml penicillin (Ashiyu Pharmaceutical), 50 μg / ml streptomycin (Nacalai). tesque) and 100 μg / ml kanamycin (Nacalai tesque) in a medium added at 150 ° C. and 5% CO 2 incubator using a 150 cm 2 tissue culture flask (IWAKI). Medium exchange was performed every 3 days, and transplantation was performed by peeling the cells with PBS (phosphate buffered saline, Nissui) + 0.25% trypsin + 0.02% EDTA.
細胞抽出液の調製及びタンパク濃度定量
イムノブロッティング分析に用いる細胞は、ディッシュから培地を除去した後、氷上で溶解バッファを４００μｌ（または２００μｌ）加え、細胞を溶解し、ｃｅｌｌ ｓｃｒａｐｅｒ（Ｎｕｎｃ）を用いて回収後、パスツールピペットを用いて２０回ピペッティングした。これを１４，０００×ｇ、４℃で２０分間遠心し、細胞抽出液を作製した後、−８０℃で保存した。
Preparation of cell extract and determination of protein concentration After removing the medium from the dish, add 400 μl (or 200 μl) of lysis buffer on ice, lyse the cells, and use cell scraper (Nunc). After collection, pipetting was performed 20 times using a Pasteur pipette. This was centrifuged at 14,000 × g for 20 minutes at 4 ° C. to prepare a cell extract, and then stored at −80 ° C.
リン酸カルシウム法により遺伝子導入を行った２９３Ｔ細胞を用いてＩＧＦ−Ｉ刺激後の細胞内シグナルの解析を行う際は、無血清培地［ダルベッコ改変イーグル培地（ニッスイ），０．１％ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン，Ｎａｃａｌａｉ ｔｅｓｑｕｅ），１００ｕｎｉｔ／ｍｌペニシリン（萬有製薬）、５０μｇ／ｍｌストレプトマイシン（Ｎａｃａｌａｉ ｔｅｓｑｕｅ）、１００μｇ／ｍｌカナマイシン（Ｎａｃａｌａｉ ｔｅｓｑｕｅ）］で２４時間インキュベートし、細胞を静止期に同調した。この細胞を、１００ｎｇ／ｍｌＩＧＦ−Ｉ［組換えヒトＩＧＦ−Ｉ（藤沢薬品株式会社 大熊利明氏に御供与頂いた）を０．３Ｎ酢酸に溶解したもの］で種々の時間処理し、溶解バッファで掻き取った後、細胞抽出液を１ｍｇ／ｍｌに調整し、解析まで−８０℃で保存した。 When analyzing intracellular signals after IGF-I stimulation using 293T cells transfected with the calcium phosphate method, serum-free medium [Dulbecco's modified Eagle medium (Nissui), 0.1% BSA (bovine serum albumin) , Nacalai tesque), 100 unit / ml penicillin (Ashiyu Pharmaceutical Co., Ltd.), 50 μg / ml streptomycin (Nacalai tesque), 100 μg / ml kanamycin (Nacalai tesque)], and the cells were synchronized in stationary phase. The cells were treated with 100 ng / ml IGF-I [recombinant human IGF-I (provided by Toshiaki Okuma, Fujisawa Pharmaceutical Co., Ltd.) dissolved in 0.3N acetic acid for various times, and lysis buffer was used. After scraping, the cell extract was adjusted to 1 mg / ml and stored at −80 ° C. until analysis.
凍結保存した細胞抽出液を融解後、Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いて、ブラッドフォード法により、５９５ｎｍの吸光度を測定してタンパク濃度を算出した。詳細は、添付されていたプロトコールに従った。 After thawing the cryopreserved cell extract, the absorbance at 595 nm was measured by the Bradford method using Bio-Rad Protein Assay Kit (Bio-Rad) to calculate the protein concentration. For details, the attached protocol was followed.
タンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びイムノブロッティング
ＳＤＳ−ＰＡＧＥは、Ｈｏｅｆｅｒ Ｓｔａｎｄａｒｄ Ｓｌａｂ Ｇｅｌ Ｕｎｉｔｓ ＳＥ６００（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を用いて、５０〜７５Ｖの定電圧下で１０時間〜１５時間泳動を行った。あるいは、ＡＥ−６５００ラピダス・ミニスラブ電気泳動槽（ＡＴＴＯ）を用いて、３０ｍＡの定電流下で１〜３時間泳動を行った。分離ゲルのアクリルアミド濃度は、〜５０ｋＤａタンパク質を検出する場合で１２％，５０〜１００ｋＤａで１０％，１００ｋＤａ〜で７％とした。
Protein SDS-PAGE and immunoblotting SDS-PAGE were performed for 10 to 15 hours under constant voltage of 50 to 75 V using Hoefer Standard Slab Gel Units SE600 (Amersham-Pharmacia). Alternatively, electrophoresis was performed for 1 to 3 hours under a constant current of 30 mA using an AE-6500 rapids mini slab electrophoresis tank (ATTO). The acrylamide concentration of the separation gel was 12% when detecting a ˜50 kDa protein, 10% at 50-100 kDa, and 7% at 100 kDa˜.
ニトロセルロース膜（ＢＡ−８５，Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ＆Ｓｃｈｕｅｌｌ）への転写はＴｒａｎｓ Ｂｌｏｔ Ｃｅｌｌ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用い、２００ｍＡの定電流下で〜５０ｋＤａタンパク質を検出する場合４時間、５０〜１００ｋＤａで４．５時間、１００〜１５０ｋＤａで５時間，１５０ｋＤａ〜で５．５〜６時間行った。 The transfer to a nitrocellulose membrane (BA-85, Schleicher & Schuell) uses Trans Blot Cell (Bio-Rad), and when detecting a ˜50 kDa protein under a constant current of 200 mA, 4 hours, 50 to 100 kDa for 4.5 hours, The test was carried out at 100 to 150 kDa for 5 hours and at 150 kDa to 5.5 to 6 hours.
転写終了後、ニトロセルロース膜をｒｉｎｓｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓｏｌｕｔｉｏｎ［１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．２），５０ｍＭ ＮａＣｌ，１ｍＭ ＥＤＴＡ］で洗浄した後、ブロッキングバッファ溶液（ＢＢＳ；ｒｉｎｓｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓｏｌｕｔｉｏｎ＋３％ウシ血清アルブミン，０，０２５％ＮａＮ３）に浸し、室温で１時間、あるいは４℃で一晩ブロッキングした。抗原抗体反応は以下の方法で行った。すなわち、ブロッキング済のニトロセルロース膜を、抗ＧＦＰ抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）及び抗ＦＬＡＧ Ｍ２抗体（ＳＩＧＭＡ）、抗ＤＧＫζ抗体（Ｔｏｐｈａｍ博士に御供与頂いた，Ｔｏｐｈａｍ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３９４：６９７−７００，１９９８）、抗リン酸化チロシン抗体（ＩＣＮ）、抗ｐｈｏｓｐｈｏ−Ｅｒｋ抗体［ｐｈｏｓｐｈｏ−ｐ４４／４２ ＭＡＰキナーゼ（Ｔｈｒ２０２／Ｔｙｒ２０４）］（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ）、抗ｐｈｏｓｐｈｏ−Ａｋｔ抗体（Ｓｅｒ４７３）（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ）の希釈液（ＢＢＳを用いて希釈）とともにパッキングし、室温で２時間、あるいは４℃で一晩インキュベートした。続いて、Ｔｒｉｓ ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ−Ｔｗｅｅｎ ２０［ＴＢＳ−Ｔ；２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６），１３７ｍＭ ＮａＣｌ，１ｍＭ ＥＤＴＡ，０．１％Ｔｗｅｅｎ ２０］で１０分間１回、５分間２回洗浄を行った。次に、ホースラディッシュペルオキシダーゼを結合した抗マウスＩｇＧ抗体または抗ウサギＩｇＧ抗体とともにパッキングし、４０分〜２時間インキュベートした後、ＴＢＳ−Ｔで先と同様に洗浄した。なお、室温での抗原抗体反応は、ベリーダンサー上で行った。 After the transfer, the nitrocellulose membrane was washed with rinsing buffered solution [10 mM Tris-HCl (pH 7.2), 50 mM NaCl, 1 mM EDTA], and then a blocking buffer solution (BBS; rinsing buffered solution + 3% bovine serum albumin, 0,025). % NaN 3 ) and blocked at room temperature for 1 hour or at 4 ° C. overnight. The antigen-antibody reaction was performed by the following method. That is, the blocked nitrocellulose membrane was prepared using anti-GFP antibody (Santa Cruz), anti-FLAG M2 antibody (SIGMA), anti-DGKζ antibody (Topham et al., Nature 394: 697-700, provided by Dr. Topham). 1998), anti-phosphotyrosine antibody (ICN), anti-phospho-Erk antibody [phospho-p44 / 42 MAP kinase (Thr202 / Tyr204)] (New England BioLabs), anti-phospho-Akt antibody (Ser473) (New England BioLab) And diluted with BBS (diluted with BBS) and incubated at room temperature for 2 hours or overnight at 4 ° C. Subsequently, washing with Tris buffered saline-Tween 20 [TBS-T; 20 mM Tris-HCl (pH 7.6), 137 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0.1% Tween 20] was performed once for 10 minutes and twice for 5 minutes. It was. Next, it was packed with anti-mouse IgG antibody or anti-rabbit IgG antibody conjugated with horseradish peroxidase, incubated for 40 minutes to 2 hours, and then washed with TBS-T in the same manner as described above. The antigen-antibody reaction at room temperature was performed on a belly dancer.
発光反応はＥｎｈａｎｃｅｄ ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ ｋｉｔ（ＥＣＬ ｋｉｔ，Ｄｕ Ｐｏｎｄ）を用い、添付されたプロトコールに従って行い、Ｘ線フィルム（Ｘ−Ｏｍａｔ，Ｋｏｄａｋ）に露光した。現像・定着後、分子量マーカーとの位置関係から目的のバンドを特定した。 The luminescence reaction was performed using an enhanced chemiluminescence kit (ECL kit, Du Pond) according to the attached protocol, and exposed to an X-ray film (X-Omat, Kodak). After development and fixing, the target band was identified from the positional relationship with the molecular weight marker.
（実施例１）酵母ツーハイブリッドスクリーニングを用いたＩＲＳと結合するタンパク質の単離および同定
[方法]
出芽酵母の培養方法
出芽酵母株はＣＧ−１９４５（遺伝子型；ＭＡＴａ，ｕｒａ３−５２，ｈｉｓ３−２００，ｌｙｓ２−８０１，ａｄｅ２−１０１，ｔｒｐ１−９０１，ｌｅｕ２−３，１１２，ｇａｌ４−５４２，ｇａｌ８０−５３８，ｃｙｈｒ２，ＬＹＳ２：：ＧＡＬ１ＵＡＳ−ＧＡＬ１ＴＡＴＡ−ＨＩＳ３，ＵＲＡ３：：ＧＡＬ４１７−ｍｅｒ（ｘ３）−ＣｙＣ１ＴＡＴＡ−ｌａｃＺ）を用い、培養にはＹＰＤ（１％酵母抽出物，２％ポリペプトン，２％グルコース）、もしくは最小培地としてＳＤ（Ｓｈｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．，１９８６）を用いた。またマーカーとして適宜アミノ酸を加え、ＳＤ／−Ｈｉｓ／−Ｌｅｕ／−Ｔｒｐ［０．６７％ ｙｅａｓｔ ｎｉｔｒｏｇｅｎ ｂａｓｅ（ｗ／ｏ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ），１％グルコース，０．０３％Ｌ−Ｉｓｏｌｅｕｃｉｎｅ，０．１５％Ｌ−Ｖａｌｉｎｅ，０．０２％Ｌ−Ａｄｅｎｉｎｅ ｈｅｍｉｓｕｌｆａｔｅ ｓａｌｔ，０．０２％Ｌ−Ａｒｇｉｎｉｎｅ ＨＣｌ，０．０３％Ｌ−Ｌｙｓｉｎｅ ＨＣｌ，０．０２％Ｌ−Ｍｅｔｈｉｏｎｅ，０．０５％Ｌ−Ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ，０．２％Ｌ−Ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ，０．０２％Ｌ−Ｕｒａｃｉｌ］、ＳＤ／−Ｌｅｕ／−Ｔｒｐ（ＳＤ／−Ｈｉｓ／−Ｌｅｕ／−Ｔｒｐ＋０．０２％Ｌ−Ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ ＨＣｌ ｍｏｎｏｈｙｄｒａｔｅ）、またはＳＤ／−Ｔｒｐ（ＳＤ／−Ｌｅｕ／−Ｔｒｐ＋０．１％Ｌ−Ｌｅｕｃｉｎｅ）を用いた。固体培地は上記の培地にアガーを１．５％添加して作成した。
Example 1 Isolation and Identification of Proteins that Bind to IRS Using Yeast Two-Hybrid Screening
[Method]
Culture method of budding yeast Saccharomyces cerevisiae strains are CG-1945 (genotype: MATa, ura3-52, his3-200, lys2-801, ade2-101, trp1-901, leu2-3, 112, gal4-542, gal80-. 538, cyhr2, LYS2 :: GAL1UAS-GAL1TATA-HIS3, URA3 :: GAL4 17-mer (x3) -CyC1TATA-lacZ), and YPD (1% yeast extract, 2% polypeptone, 2% glucose) was used for the culture. Alternatively, SD (Sherman et al., 1986) was used as the minimum medium. In addition, an amino acid was appropriately added as a marker, and SD / -His / -Leu / -Trp [0.67% yeast nitrogen base (w / o amino acid), 1% glucose, 0.03% L-Isolucine, 0.15% L-Valine, 0.02% L-Adenine hemisulfate salt, 0.02% L-Arginine HCl, 0.03% L-Lycine HCl, 0.02% L-Methione, 0.05% L-Phenylalanine, 0. 2% L-Threoneine, 0.02% L-Uracil], SD / -Leu / -Trp (SD / -His / -Leu / -Trp + 0.02% L-Histide HCl monohydrate), or SD / -Trp (SD / -Leu -Trp + 0.1% L-Leucine) was used. The solid medium was prepared by adding 1.5% agar to the above medium.
酵母の形質転換
スモールスケールでの形質転換は以下の方法に従った。酵母をＹＰＤ ４ｍｌでＯＤ２６０＝０．２〜０．３となるまで培養した後、培養液を１．５ｍｌチューブに３本に分注し、１，０００×ｇで３０秒間遠心後、菌体を回収した。次に１×ＴＥ／ＬｉＡｃ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，１ｍＭ ＥＤＴＡ，０．１Ｍ 酢酸リチウム，ｐＨ７．５）を１ｍｌ加えて懸濁し、このうち０．１ｍｌを新しい１．５ｍｌチューブに移した。これにＤＮＡ０．１μｇ，１×ＰＥＧ／ＬｉＡｃ（１×ＴＥ／ＬｉＡｃ＋４０％ＰＥＧ６０００）０．６ｍｌを入れ攪拌した後、３０℃で３０分間インキュベートした。ＤＭＳＯ ７０μｌを加え攪拌した後、４２℃で１５分間インキュベートした。１，０００×ｇで５分間遠心後、上清を取り除き、沈殿を滅菌水に縣濁して適当なアミノ酸マーカーを含むＳＤプレートに播種した。
Transformation of yeast on a small scale was according to the following method. After culturing the yeast with 4 ml of YPD until OD 260 = 0.2-0.3, the culture solution was dispensed into three 1.5 ml tubes, centrifuged at 1,000 × g for 30 seconds, and the cells Was recovered. Next, 1 ml of 1 × TE / LiAc (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, 0.1 M lithium acetate, pH 7.5) was added and suspended, and 0.1 ml of this was transferred to a new 1.5 ml tube. To this was added 0.1 μg of DNA, 0.6 ml of 1 × PEG / LiAc (1 × TE / LiAc + 40% PEG6000), and the mixture was stirred and then incubated at 30 ° C. for 30 minutes. After adding 70 μl of DMSO and stirring, it was incubated at 42 ° C. for 15 minutes. After centrifugation at 1,000 × g for 5 minutes, the supernatant was removed, and the precipitate was suspended in sterilized water and seeded on an SD plate containing an appropriate amino acid marker.
ラージスケールでの形質転換は以下の方法に従った。酵母をＳＤ／−Ｔｒｐ ５０ｍｌでＯＤ２６０＝０．２〜０．３となるまで培養した後、培養液をＹＰＤ ３００ｍｌに移し、３０℃で３時間インキュベートした。この培養液を５０ｍｌの遠心管８本に分注し、１，０００×ｇで５分間遠心後、上清を除去した。次に、酵母の沈殿を１本あたり５ｍｌの滅菌水に懸濁し、これらを２本に２０ｍｌずつ集めた。１，０００×ｇで５分間遠心後、上清を除去した。酵母の沈殿に１×ＴＥ／ＬｉＡｃ １ｍｌを加えて懸濁し、１５ｍｌの遠心管１本にまとめた。これにｃＤＮＡライブラリー１００μｇ，１×ＰＥＧ／ＬｉＡｃ ９ｍｌを入れ攪拌した後、３０℃で３０分間インキュベートした。ＤＭＳＯ １ｍｌを加え攪拌した後、４２℃で１５分間インキュベートした。１，０００×ｇで５分間遠心後、上清を取り除き、沈殿を滅菌水に懸濁して、適当なアミノ酸マーカーを含むＳＤプレート２０枚に分けて播種した。 Large scale transformation was performed according to the following method. After culturing the yeast with 50 ml of SD / -Trp until OD 260 = 0.2 to 0.3, the culture solution was transferred to 300 ml of YPD and incubated at 30 ° C. for 3 hours. This culture solution was dispensed into eight 50 ml centrifuge tubes, centrifuged at 1,000 × g for 5 minutes, and the supernatant was removed. Next, the yeast precipitates were suspended in 5 ml of sterilized water per bottle, and 20 ml each of these were collected. After centrifugation at 1,000 × g for 5 minutes, the supernatant was removed. To the yeast precipitate, 1 ml of 1 × TE / LiAc was added and suspended, and the suspension was collected into one 15 ml centrifuge tube. This was mixed with 100 μg of cDNA library and 9 ml of 1 × PEG / LiAc and stirred, and then incubated at 30 ° C. for 30 minutes. After adding 1 ml of DMSO and stirring, it was incubated at 42 ° C. for 15 minutes. After centrifugation at 1,000 × g for 5 minutes, the supernatant was removed, the precipitate was suspended in sterilized water, and seeded on 20 SD plates containing appropriate amino acid markers.
β−ガラクトシダーゼアッセイ
適当なアミノ酸マーカーを含むＳＤプレートの上にニトロセルロースフィルター（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ＆Ｓｃｈｕｅｌｌ）を置き、このフィルター上にコロニーを播種し培養した。２日後、フィルターを取り出し、液体窒素をかけて細胞を破壊した。新しいディッシュに濾紙を置き、３ｍｌのＺバッファ／Ｘ−ｇａｌ溶液［Ｚバッファ（Ｎａ２ＨＰＯ４・７Ｈ２Ｏ １６．１ｍｇ／ｍｌ，ＮａＨ２ＰＯ４・Ｈ２Ｏ ５．５ｍｇ／ｍｌ，ＫＣｌ ０．７５ｍｇ／ｍｌ，ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．２４６ｍｇ／ｍｌ，ｐＨ７．０）３ｍｌにβ−メルカプトエタノール ８．１μｌ，Ｘ−ｇａｌ溶液（Ｘ−ｇａｌ；５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド ３ｍｇをＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド ３０μｌに溶解したもの）３０μｌを混合して作成］をしみこませ、この上に破壊した細胞の乗ったフィルターを置き、３０℃で２時間インキュベートした。
β-galactosidase assay A nitrocellulose filter (Schleicher & Schuell) was placed on an SD plate containing an appropriate amino acid marker, and colonies were seeded and cultured on the filter. Two days later, the filter was removed and the cells were destroyed by applying liquid nitrogen. Place filter paper on a new dish, and add 3 ml of Z buffer / X-gal solution [Z buffer (Na 2 HPO 4 .7H 2 O 16.1 mg / ml, NaH 2 PO 4 .H 2 O 5.5 mg / ml,
プラスミドの大腸菌への回収
適当なアミノ酸マーカーを含むＳＤ液体培地４ｍｌで陽性コロニーを培養し、この培養液を３本の１．５ｍｌチューブに移し、１，０００×ｇで３０秒間遠心後、上清を除去した。次に、ｙｅａｓｔ ｌｙｓｉｓ ｓｏｌｕｔｉｏｎ（２％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００，１％ＳＤＳ，１００ｍＭ ＮａＣｌ，１０ｍＭ Ｔｒｉｓ，１．０ｍＭ ＥＤＴＡ，ｐＨ８．０）０．２ｍｌ、フェノール：クロロホルム（１：１）０．２ｍｌ、酸洗浄ガラスビーズ（０．５ｍｍのガラスビーズを一晩濃硝酸に浸した後、水で数回洗浄し、エタノールで１回洗浄し乾燥させた）０．３ｇを加え、５分間攪拌した後、１０，０００×ｇで５分間遠心し、上清を新しい１．５ｍｌチューブに移した。エタノールによりＤＮＡを沈殿し、ＴＥ ２０μｌに溶解した。この溶液を用いて大腸菌を形質転換し、アンピシリン耐性を賦与するプラスミドを回収した。
Recovery of plasmid into Escherichia coli Positive colonies are cultured in 4 ml of SD liquid medium containing an appropriate amino acid marker, this culture is transferred to three 1.5 ml tubes, centrifuged at 1,000 × g for 30 seconds, and the supernatant Was removed. Next, 0.2 ml of yeast lysis solution (2% Triton X-100, 1% SDS, 100 mM NaCl, 10 mM Tris, 1.0 mM EDTA, pH 8.0), 0.2 ml of phenol: chloroform (1: 1), acid washing After adding 0.3 g of glass beads (0.5 mm glass beads soaked in concentrated nitric acid overnight, washed several times with water, washed once with ethanol and dried), stirred for 5 minutes, Centrifugation was performed at 000 × g for 5 minutes, and the supernatant was transferred to a new 1.5 ml tube. DNA was precipitated with ethanol and dissolved in 20 μl of TE. Escherichia coli was transformed with this solution, and a plasmid conferring ampicillin resistance was recovered.
酵母ツーハイブリッド系を用いたＩＲＳ結合タンパク質（ＩＲＳＡＰ）のクローニング
Ｂａｉｔとしてｒａｔ ＩＲＳ−１ ｃＤＮＡ（東京大学医学部門脇孝博士から供与された）をｐＡＳ２−１ Ｎｄｅ Ｉ−ＢａｍＨＩ部位に導入したものを、ＣＧ−１９４５にスモールスケールで形質転換し、ＳＤ／−Ｔｒｐプレートに播種した。このスモールスケール形質転換によりプレートに生えてきたコロニーを再び液体培地ＳＤ／−Ｔｒｐで培養し、これにｈｕｍａｎ ｐｌａｃｅｎｔａ ｃＤＮＡライブラリー（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）がｐＡＣＴ２のＥｃｏＲ Ｉ−Ｘｈｏ Ｉ部位に導入されたものをラージスケールで形質転換し、ＳＤ／−Ｈｉｓ／−Ｌｅｕ／−Ｔｒｐ＋０．５ｍＭ ３ＡＴ（３−アミノ−１，２，４−トリアゾール，ＳＩＧＭＡ）プレート２０枚に分けて播種した。この際、一部をＳＤ／−Ｌｅｕ／−Ｔｒｐプレートに播種し、スクリーニングクローン数を計算した。以上２回の形質転換によりｂａｉｔ及びｃＤＮＡライブラリーが導入され、プレート上に生えてきたコロニーについてβ−ガラクトシダーゼアッセイを行った。このβ−ガラクトシダーゼアッセイにおいて陽性なコロニーは、さらにプラスミドの大腸菌への回収を行った。
Cloning of IRS-binding protein (IRSAP) using yeast two-hybrid system Rat IRS-1 cDNA (provided by Dr. Takashi Waki, University of Tokyo) introduced into pAS2-1 Nde I-BamHI site as CG -1945 was transformed on a small scale and seeded on SD / -Trp plates. A colony that has grown on the plate by this small-scale transformation was cultured again in the liquid medium SD / -Trp, and a human plasmid cDNA library (Clontech) introduced into the EcoR I-Xho I site of pACT2 was large. The cells were transformed on a scale and seeded on 20 SD / -His / -Leu / -Trp + 0.5 mM 3AT (3-amino-1,2,4-triazole, SIGMA) plates. At this time, a part was seeded on an SD / -Leu / -Trp plate, and the number of screening clones was calculated. The bait and cDNA library were introduced by the above two transformations, and a β-galactosidase assay was performed on colonies that had grown on the plate. Colonies that were positive in this β-galactosidase assay were further recovered in E. coli.
塩基配列の決定
スクリーニングによって取得された、ＤＧＫζ遺伝子を含む約２．０ｋｂｐのＥｃｏＲＩ−ＸｈｏＩ断片をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ−ＫＳ＋（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）に導入した。その後ＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄIII断片、ＨｉｎｄIII−ＸｈｏＩ断片をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ−ＫＳ＋（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）に再導入した。さらに、ＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄIII断片を導入したものからＡｐａＩ断片をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ−ＫＳ＋（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）導入し、ＨｉｎｄIII−ＸｈｏＩ断片を導入したものからＳｍａＩ断片、ＰｓｔＩ断片をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ−ＫＳ＋（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）導入した。これらを鋳型ＤＮＡとしてＢｉｇ Ｄｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ ｖ３．１ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）及び、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ３１００−Ａｖａｎｔ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて、５’側と３’側の両方向に塩基配列を決定した。ＰＣＲのプライマーには、Ｍ１３Ｕ（５’−ＦＣＧＡＣＧＴＴＧＴＡＡＡＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧＴ−３’（配列番号５），Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）及びＭ１３Ｒ（５’−ＦＴＴＴＣＡＣＡＣＡＧＧＡＡＡＣＡＧＣＴＡＴＧＡＣ−３’（配列番号６），Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いた。また、決定した塩基配列の解析は、塩基配列解析用ソフト ＤＹＮＡＳＩＳ（日立）及び、ＢＬＡＳＴサーバー（ＵＲＬ＝ ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／）、ＵＣＳＣ Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｒｏｗｓｅｒ（ＵＲＬ＝ｈｔｔｐ：／／ｇｅｎｏｍｅ．ｕｃｓｃ．ｅｄｕ／）を用いて行った。
An about 2.0 kbp EcoRI-XhoI fragment containing the DGKζ gene obtained by the base sequence determination screening was introduced into pBluescript-KS + (Stratagene). Thereafter, the EcoRI-HindIII fragment and HindIII-XhoI fragment were reintroduced into pBluescript-KS + (Stratagene). Furthermore, the ApaI fragment was introduced into the pBluescript-KS + (Stratagene) from the EcoRI-HindIII fragment introduced, and the SmaI fragment and the PstI fragment were introduced into the pBluescript-KS + (Stratagene) from the HindIII-XhoI fragment introduced. Using these as template DNA, the Big Dye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems) and the ABI PRISM 3100-Ant Genetic Analyzer (Applied Biosystems) side and the 3 ′ base sequence were used. . As PCR primers, M13U (5′-FCGACGTTGTAAAACACGCGCCAGGT-3 ′ (SEQ ID NO: 5), Amersham Biosciences) and M13R (5′-FTTTCACACGAGAAACAGCTATGAC-3 ′ (SEQ ID NO: 6), Amersham Biosc.) Were used. In addition, analysis of the determined base sequence includes base sequence analysis software DYNASIS (Hitachi), BLAST server (URL = http: //www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/), UCSC Genome Browser (URL = http://genome.ucsc.edu/).
[結果]
スクリーニングにより得られたｃＤＮＡは３５４ｂｐ、１１８アミノ酸からなるＯＲＦ（オープンリーディングフレーム）をコードしている
スクリーニングにより得られたプラスミドは、約２．０ｋｂｐからなるｃＤＮＡを含んでいた。そこで、この約２．０ｋｂｐからなるｃＤＮＡの全塩基配列を決定したところ、３５４ｂｐ、１１８アミノ酸からなるＯＲＦが存在し、これまで報告されているＤＧＫζと相同な部分が一部存在していることが分かった。
[result]
The cDNA obtained by screening encoded the ORF (open reading frame) consisting of 354 bp and 118 amino acids, and the plasmid obtained by screening contained cDNA consisting of about 2.0 kbp. Therefore, when the entire nucleotide sequence of the cDNA consisting of about 2.0 kbp was determined, there was an ORF consisting of 354 bp and 118 amino acids, and a portion similar to DGKζ reported so far existed. I understood.
ｓｈｏｒｔ ｆｏｒｍ ＤＧＫζｃＤＮＡは、ＤＧＫζｃＤＮＡのスプライシングバリアントであり、ＤＧＫζｃＤＮＡと２８２ｂｐ、９４アミノ酸が相同な配列である
スクリーニングにより得られたｃＤＮＡの塩基配列を、ＢＬＡＳＴサーバー、ＵＣＳＣ Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｒｏｗｓｅｒを利用してさらに解析を進めた。その結果、このｃＤＮＡはヒト１１番染色体短腕１１．２に位置し、既知のＤＧＫζ遺伝子座から生成することが明らかとなった。既知のＤＧＫζは、３１エキソンからなり、２，７８７ｂｐ、９２８アミノ酸のＯＲＦを持つのに対し、今回得られたｃＤＮＡは４エキソンから構成されていた。また、それぞれのエキソン配列を解析したところ、得られたｃＤＮＡは、ＤＧＫζと第１エキソンは異なるが、第２、第３エキソンと第４エキソンの途中までは同じエキソンであるという、スプライシングバリアントであることが明らかとなった（図１）。
The short form DGKζ cDNA is a splicing variant of DGKζ cDNA, and further analysis was performed using the BLAST server and UCSC Genome Browser for the base sequence of cDNA obtained by screening 282 bp, 94 amino acids homologous to DGKζ cDNA. . As a result, it was revealed that this cDNA is located on the short arm 11.2 of human chromosome 11, and is generated from a known DGKζ locus. The known DGKζ consists of 31 exons and has an ORF of 2,787 bp and 928 amino acids, whereas the cDNA obtained this time was composed of 4 exons. In addition, when each exon sequence was analyzed, the obtained cDNA is a splicing variant in which DGKζ and the first exon are different, but the second, third and fourth exons are the same exon. It became clear (Fig. 1).
スプライシングサイトの指標として、イントロンとエキソンの間にはアデニンとグアニンを含み、エキソンとイントロンの間にはグアニンとチミンを含むというＡＧ−ＧＴルールが知られている。ｓＤＧＫζの第１エキソンにおいてもエキソンとイントロンの間にグアニン、チミンを含んでおり、この法則が満たされていたため、スプライシングが起こりうる場所であるといえる。同様の法則がＤＧＫζの第４エキソンについても満たされた。 As an index of a splicing site, an AG-GT rule is known in which adenine and guanine are included between introns and exons, and guanine and thymine are included between exons and introns. The first exon of sDGKζ also contains guanine and thymine between exons and introns. Since this rule is satisfied, it can be said that splicing can occur. A similar rule was satisfied for the fourth exon of DGKζ.
今回、このスクリーニングにより得られた分子を、ｓｈｏｒｔ ｆｏｒｍ ＤＧＫζ（ｓＤＧＫζ）と命名した。ｓＤＧＫζとＤＧＫζの間では、２８２ｂｐが相同な配列であり、その部分は互いにフレームも一致していたため、９４アミノ酸がｓＤＧＫζとＤＧＫζとの間で相同であることが明らかとなった（図１）。この相同である部分は、ＤＧＫζにおいてＣ１ドメインを構成している部分である。このように、ｓＤＧＫζは、ほぼＣ１ドメインのみで構成されている分子であることが明らかになった。 This time, the molecule obtained by this screening was named short form DGKζ (sDGKζ). Between sDGKζ and DGKζ, 282 bp was a homologous sequence, and the portions were also in frame with each other, so that 94 amino acids were found to be homologous between sDGKζ and DGKζ (FIG. 1). This homologous part is a part constituting the C1 domain in DGKζ. Thus, it was revealed that sDGKζ is a molecule composed almost only of the C1 domain.
（実施例２）ｓＤＧＫζが発現する組織の同定
発現組織の同定
プローブは、ｓＤＧＫζｃＤＮＡ ＥｃｏＲＩ−ＸｈｏＩ断片を鋳型として、Ｍｅｇａｐｒｏｍｅ ＤＮＡ Ｌａｂｅｌｌｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて、添付のプロトコールに従って作製した。また、ｃＤＮＡのラベルには、［α−３２Ｐ］ｄＣＴＰ（３０００Ｃｉ／ｍｍｐｌｅ，Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を用いた。ラベル後のプローブは、スピンカラム法（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，１９８９）によって、ＳＴＥバッファ［１００ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０），１０ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０），１００ｍＭ ＮａＣｌ］で膨潤させたＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−５０（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて精製した。以上のように作製した物をプローブとし、Ｈｕｍａｎ １２−Ｌａｎｅ Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｔｉｓｓｕｅ Ｎｏｒｔｈｅｒｎ Ｂｌｏｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を用いてノーザンブロットを行った。手順としては、メンブレンをプレハイブリダイゼーション溶液［２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５），０．７５Ｍ ＮａＣｌ，２．５ｍＭ ＥＤＴＡ，５０％ ホルムアミド，５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ ｓｏｌｕｔｉｏｎ（０．１％ＢＳＡ，１％Ｆｉｃｏｌｌ４０００，１％ポリビニルピロリドン），ｓａｌｍｏｎ ｓｐｅｒｍ（１００μｇ／ｍｌ，熱変性後使用）］に浸し、４２℃で２時間以上、ハイブリダイゼーション用オーブン内でインキュベート後、［３２Ｐ］で標識したｃＤＮＡプローブ（５×１０５ｃｐｍ／ｍｌプレハイブリダイゼーション溶液）を添加し、さらに４２℃で１２時間以上インキュベートした。
(Example 2) Identification of tissue expressing sDGKζ
The probe for identifying the expression tissue was prepared using Megaprome DNA Labeling System (Amersham Biosciences) using the sDGKζ cDNA EcoRI-XhoI fragment as a template according to the attached protocol. In addition, [α- 32 P] dCTP (3000 Ci / mmple, Amersham Bioscience) was used as a label for cDNA. The probe after labeling was separated by Sephadex G-50 (Sambrook et al., 1989) swollen with STE buffer [100 mM Tris (pH 8.0), 10 mM EDTA (pH 8.0), 100 mM NaCl]. Purified using Amersham Biosciences). Using the product prepared as described above as a probe, Northern blotting was performed using Human 12-Lane Multiple Tissue Northern Blot (Clontech). As a procedure, the membrane was prehybridized solution [20 mM Tris-HCl (pH 7.5), 0.75 M NaCl, 2.5 mM EDTA, 50% formamide, 5 × Denhardt's solution (0.1% BSA, 1% Ficoll4000, 1% polyvinylpyrrolidone), salmon sperm (100 μg / ml, used after heat denaturation)], incubated in a hybridization oven at 42 ° C. for 2 hours or longer, and then a cDNA probe labeled with [ 32 P] ( 5 × 10 5 cpm / ml prehybridization solution) was added, and further incubated at 42 ° C. for 12 hours or more.
その後、メンブレンを洗浄液１（１×ＳＳＣ，０．１％ＳＤＳ）を用いて室温で１０分間洗浄を２回行い、洗浄液２（０．１×ＳＳＣ，０．１％ＳＤＳ）を用いて６５℃で５分間、さらに必要な場合は時間を徐々に増やして洗浄した。バックグラウンド放射活性の十分な減少を確認したのち、プラスチックバックに密封し、ＢＡＳ２０００ Ｂｉｏ Ｉｍａｇｅ Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ｆｕｊｉｘ）、あるいは、Ｘ線フィルムを用いたオートラジオグラフィーに供した。 Thereafter, the membrane was washed twice for 10 minutes at room temperature with washing solution 1 (1 × SSC, 0.1% SDS), and at 65 ° C. with washing solution 2 (0.1 × SSC, 0.1% SDS). For 5 minutes, and if necessary, gradually increase the time for washing. After confirming a sufficient decrease in background radioactivity, it was sealed in a plastic bag and subjected to autoradiography using BAS2000 Bio Image Analyzer (Fujix) or X-ray film.
[結果]
ｓＤＧＫζｍＲＮＡは心臓、肝臓に多く発現している
ｓＤＧＫζの様々な組織における発現様式を調べるために、ヒト各組織由来のｍＲＮＡから作られたメンブレンを用いてノーザンブロットを行った。その結果、約１．５ｋｂｐの位置にｓＤＧＫζｍＲＮＡのバンドが確認された（図２）。また、ｓＤＧＫζは調べたすべての組織に発現しており、特に心臓、肝臓に多く発現していることが明らかとなった。
[result]
In order to examine the expression pattern of sDGKζ mRNA expressed in various tissues in the heart and liver, Northern blotting was performed using membranes made from mRNA derived from human tissues. As a result, a band of sDGKζ mRNA was confirmed at a position of about 1.5 kbp (FIG. 2). In addition, sDGKζ was expressed in all the tissues examined, and it was revealed that it was highly expressed particularly in the heart and liver.
（実施例３）ｓＤＧＫζおよびＤＧＫζの内在的発現
[方法]
ｓＤＧＫζがｍＲＮＡレベルで発現していることが確認されたため、タンパク質レベルでの、内在的な発現を確認した。３Ｔ３−Ｌ１細胞から細胞抽出液を調製し、抗ＤＧＫζ抗体を用いてイムノブロットを行った。
Example 3 Intrinsic Expression of sDGKζ and DGKζ
[Method]
Since it was confirmed that sDGKζ was expressed at the mRNA level, endogenous expression at the protein level was confirmed. A cell extract was prepared from 3T3-L1 cells and immunoblotted with anti-DGKζ antibody.
[結果]
３Ｔ３−Ｌ１細胞において、ｓＤＧＫζ、ＤＧＫζは内在的に発現している
抗ＤＧＫζ抗体はＤＧＫζのアミノ末端の配列を用いて作られた抗体であるため（Ｔｏｐｈａｍ ｅｔ ａｌ．，１９９８）、相同な配列を有する部分もあることから、ｓＤＧＫζもこの抗体で認識できると予想した。その結果、約３０ｋＤａの位置にｓＤＧＫζのバンドが検出された（図３）。同時に、約１１０ｋＤａの位置に全長のＤＧＫζのバンドが検出された（図３）。このことから、ＤＧＫζ、ｓＤＧＫζともに、３Ｔ３−Ｌ１細胞において内在的に発現していることが明らかとなった。
[result]
In 3T3-L1 cells, sDGKζ and DGKζ are endogenously expressed. The anti-DGKζ antibody is an antibody produced using the amino terminal sequence of DGKζ (Topham et al., 1998). Since there is also a part having, sDGKζ was expected to be recognized by this antibody. As a result, a band of sDGKζ was detected at a position of about 30 kDa (FIG. 3). At the same time, a full-length DGKζ band was detected at a position of about 110 kDa (FIG. 3). This revealed that both DGKζ and sDGKζ are endogenously expressed in 3T3-L1 cells.
（実施例４）ｓＤＧＫζとＩＲＳ−１の結合の確認
[方法]
大腸菌からＧＳＴの精製
ｐＧＥＸ−４Ｔ−２ベクターで形質転換した大腸菌ＨＢ１０１（遺伝子型；ｓｕｐＥ４４ ｈｓｄＳ２０（ｒＢ −ｍＢ −）ｒｅｃＡ１３ ａｒａ−１４ ｐｒｏＡ２ ｌａｃＹ１ ｇａｌＫ２ ｒｐｓＬ２０ ｘｙｌ−５ ｍｔｌ−１）をＴＹ培地４ｍｌで一晩培養した後、１００ｍｌのＴＹ培地に希釈した。３７℃で１．５時間培養した後、ＩＰＴＧ（イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド，ＴＡＫＡＲＡ）を終濃度０．４ｍＭとなるように添加してＧＳＴの発現を誘導し、さらに３時間３０℃で培養した。
(Example 4) Confirmation of binding between sDGKζ and IRS-1
[Method]
E. coli HB101 from E. coli transformed with purified pGEX-4T-2 vector GST (genotype; supE44 hsdS20 (r B - m B -) recA13 ara-14 proA2 lacY1 galK2 rpsL20 xyl-5 mtl-1) to TY medium 4ml And then diluted in 100 ml of TY medium. After culturing at 37 ° C. for 1.5 hours, IPTG (isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside, TAKARA) was added to a final concentration of 0.4 mM to induce GST expression, and for another 3 hours. Cultured at 30 ° C.
以下の実験は、４℃で行った。培養液を７５００×ｇで遠心し、大腸菌を回収し、溶解バッファ １０ｍｌに懸濁後、超音波処理により大腸菌を破壊した。７５００×ｇで遠心し、上清をろ過後、カラムを用いた精製を行った。まず、グルタチオン−セファロース（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）５００μｌをカラムに詰め、ＰＢＳ １０ｍｌで洗浄後、サンプルをカラムに吸着させた。さらにＰＢＳ ５ｍｌで洗浄後、溶離バッファ［１０ｍＭ 還元型グルタチオン，５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）］５ｍｌを用いてＧＳＴを溶出した。ＧＳＴ−ｓｈｏｒｔ ｆｏｒｍ ＤＧＫζの精製は、ｐＧＥＸ−ｓｈｏｒｔ ｆｏｒｍ ＤＧＫζベクターを用いて、ＧＳＴの精製と同様に行った。 The following experiments were performed at 4 ° C. The culture solution was centrifuged at 7500 × g to collect E. coli, suspended in 10 ml of lysis buffer, and then disrupted by sonication. Centrifugation was performed at 7500 × g, and the supernatant was filtered, followed by purification using a column. First, 500 μl of glutathione-sepharose (Amersham Biosciences) was packed in a column, washed with 10 ml of PBS, and then the sample was adsorbed onto the column. After further washing with 5 ml of PBS, GST was eluted with 5 ml of an elution buffer [10 mM reduced glutathione, 50 mM Tris-HCl (pH 8.0)]. Purification of GST-short form DGKζ was carried out in the same manner as GST purification using the pGEX-short form DGKζ vector.
ＣＯＳ−７細胞への遺伝子導入（ＤＥＡＥ−デキストラン法）
ＣＯＳ−７細胞を、６０ｍｍ組織培養ディッシュ（ＩＷＡＫＩ）で５０％コンフルエントになるまで培養した。トランスフェクションバッファ（１０ｇ／Ｌ ＤＭＥＭ，５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．４）２ｍｌに２０ｍｇ／ｍｌ ＤＥＡＥ−デキストラン０．０３ｍｌ、１μｇ／μｌプラスミドＤＮＡ溶液 ５μｌを混合してＤＮＡ−ＤＥＡＥ−デキストラン溶液を調製した。培地を取り除いた後ＨＢＳＳで３回洗浄し、ＤＮＡ−ＤＥＡＥ−デキストラン溶液を２ｍｌ加え、３７℃で４時間から８時間インキュベートした。その後培地を取り除き、グリセロールバッファ（１０％グリセロール，１０ｇ／Ｌ ＤＭＥＭ，５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．４）を２ｍｌを加えて２分間刺激した。ＨＢＳＳで３回洗浄後、ＤＭＥＭ／ＣＳ培地を加え３７℃で２日間インキュベートし、実験に用いた。
Gene transfer to COS-7 cells (DEAE-dextran method)
COS-7 cells were cultured in a 60 mm tissue culture dish (IWAKI) until 50% confluent. A DNA-DEAE-dextran solution was prepared by mixing 2 ml of transfection buffer (10 g / L DMEM, 50 mM Tris-HCl, pH 7.4) with 0.03 ml of 20 mg / ml DEAE-dextran and 5 μl of 1 μg / μl plasmid DNA solution. . After removing the medium, the plate was washed 3 times with HBSS, 2 ml of the DNA-DEAE-dextran solution was added, and the mixture was incubated at 37 ° C. for 4 to 8 hours. Thereafter, the medium was removed, and 2 ml of glycerol buffer (10% glycerol, 10 g / L DMEM, 50 mM Tris-HCl, pH 7.4) was added and stimulated for 2 minutes. After washing 3 times with HBSS, DMEM / CS medium was added and incubated at 37 ° C. for 2 days and used for the experiment.
プルダウンアッセイ
ｐＥＧＦＰ−ＩＲＳ−１をＤＥＡＥ−デキストラン法によりトランスフェクションし、ＧＦＰ−ＩＲＳ−１を高発現させたＣＯＳ７細胞を、１００ｍｍディッシュ１枚あたり溶解バッファ（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４），１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００，１５０ｍＭ ＮａＣｌ，１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２，５００μＭ Ｎａ３ＶＯ４，１０μｇ／ｍｌロイペプチン，５μｇ／ｍｌペプスタチン，２０μｇ／ｍｌＰＭＳＦ（フェニルメタンスルホニルフルオリド），１００ＫＩＵ／ｍｌアプロチニン，１０ｍｇ／ｍｌＰＮＰＰ（ｐ−ニトロフェニルホスフェート）２５０μｌで掻き取った。２枚分のサンプルを合わせ、５００μｌとし、１００００×ｇで遠心した。上清２０μｌに３×Ｌａｅｍｍｌｉ’ｓ ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓｏｌｕｔｉｏｎ［３０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．８），９％ＳＤＳ，１５％グリセロール，６％２−ＭＥ（２−メルカプトエタノール），０．０５％ブロモフェノールブルー］１０μｌを加え、５分間煮沸してインプット用のサンプルとした。
Pull - down assay COS7 cells transfected with pEGFP-IRS-1 by DEAE-dextran method and highly expressing GFP-IRS-1 were lysed with a lysis buffer (50 mM Tris-HCl (pH 7.4), 1) per 100 mm dish. % Triton X-100, 150 mM NaCl, 1.5 mM MgCl 2 , 500 μM Na 3 VO 4 , 10 μg / ml leupeptin, 5 μg / ml pepstatin, 20 μg / ml PMSF (phenylmethanesulfonyl fluoride), 100 KIU / ml aprotinin, 10 mg / ml PNPP ( p-nitrophenyl phosphate) was scraped with 250 μl, the two samples were combined, made 500 μl, centrifuged at 10000 × g, and 3 × Laemmli's buffer was added to 20 μl of the supernatant. d solution [30 mM Tris-HCl (pH 7.8), 9% SDS, 15% glycerol, 6% 2-ME (2-mercaptoethanol), 0.05% bromophenol blue] 10 μl is added and boiled for 5 minutes. A sample for input was used.
以下の実験は、４℃で行った。上清２００μｌずつにそれぞれＧＳＴ １００ｐｍｏｌ、ＧＳＴ−ｓｈｏｒｔ ｆｏｒｍ ＤＧＫζ １００ｐｍｏｌを加え、２時間インキュベート後、それぞれにグルタチオン−セファロース ３０μｌを加え、さらに２時間インキュベートした。７０００×ｇで遠心し、上清を除いた後、溶解バッファを用いて４回ビーズを洗浄し、溶解バッファ ２０μｌと３×Ｌａｅｍｍｌｉ’ｓ ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓｏｌｕｔｉｏｎ １０μｌを加え、５分間煮沸してサンプルとし、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。なお、Ｎａ３ＶＯ４，ロイペプチン，ペプスタチン，ＰＭＳＦ，アプロチニン，ＰＮＰＰは使用する直前に細胞溶解液に加えた。また、ロイペプチン，ペプスタチンは、青柳高明博士（微生物化学研究所・東京）より御供与頂いた。 The following experiments were performed at 4 ° C. GST (100 pmol) and GST-short form DGKζ (100 pmol) were added to 200 μl each of the supernatant, and incubated for 2 hours. Then, 30 μl of glutathione-Sepharose was added to each, and further incubated for 2 hours. After centrifuging at 7000 × g and removing the supernatant, the beads were washed 4 times with lysis buffer, 20 μl of lysis buffer and 10 μl of 3 × Laemmli's buffered solution were added, and the mixture was boiled for 5 minutes to obtain a sample, and then SDS -Subject to PAGE. Na 3 VO 4 , leupeptin, pepstatin, PMSF, aprotinin, and PNPP were added to the cell lysate immediately before use. Leupeptin and pepstatin were provided by Dr. Takaaki Aoyagi (Microbial Chemistry Laboratory, Tokyo).
[結果]
無細胞系において、ＧＳＴ−ｓＤＧＫζとＧＦＰ−ＩＲＳ−１は結合する
無細胞系でのＤＧＫζとＩＲＳ−１との相互作用を確認するためにプルダウンアッセイを行った。まず、大腸菌を用いてＧＳＴタンパク質、ＧＳＴ−ｓＤＧＫζタンパク質を発現させ、精製した。ＧＦＰ−ＩＲＳ−１を高発現させたＣＯＳ７の細胞抽出液とＧＳＴ−ｓＤＧＫζまたはＧＳＴをインキュベートし、グルタチオン−セファロースビーズを用いてプルダウンアッセイを行った。ＧＳＴ−ｓＤＧＫζとＩＲＳ−１が結合するため、抗ＧＦＰ抗体によりＧＦＰ−ＩＲＳ−１のバンドが検出された（図４）。
[result]
In the cell-free system, GST-sDGKζ and GFP-IRS-1 were subjected to a pull-down assay to confirm the interaction between DGKζ and IRS-1 in the cell-free system. First, GST protein and GST-sDGKζ protein were expressed using E. coli and purified. A cell extract of COS7 highly expressing GFP-IRS-1 was incubated with GST-sDGKζ or GST, and a pull-down assay was performed using glutathione-sepharose beads. Since GST-sDGKζ and IRS-1 bound to each other, a GFP-IRS-1 band was detected by the anti-GFP antibody (FIG. 4).
（実施例５）ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を用いたＤＧＫζおよびｓＤＧＫζの機能解析
[方法]
２９３Ｔ細胞への遺伝子導入（リン酸カルシウム法）
２９３Ｔ細胞を遺伝子導入２４時間前に１００ｍｍディッシュに１×１０６個ずつ培養した。トランスフェクション溶液は以下のように調製した。滅菌水４４０μｌにＤＮＡを８μｇ加え、２×Ｈｅｂｓ（２９０ｍＭ ＮａＣｌ，４２ｍＭ ＨＥＰＥＳ，ｐＨ７．１）５００μｌ、７０ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４を１０μｌ混合した後、２．５Ｍ ＣａＣｌ２を徐々に滴下してよく混ぜあわせ、室温にて３０分間放置した。インキュベート後、この溶液１ｍｌを攪拌してトランスフェクション溶液とした。その後、１ディッシュあたり１ｍｌのトランスフェクション溶液を滴下しながら加え、３７℃で６〜９時間インキュベートした。その後、培養液を交換し、さらに２４時間後、ＢＳＡ／ＤＭＥＭ培養液に交換し、細胞を２４時間休止させた。その後、溶解バッファを用いてタンパク質を回収し、実験に用いた。
(Example 5) Functional analysis of DGKζ and sDGKζ using HEK293T cells
[Method]
Gene transfer to 293T cells (calcium phosphate method)
1 × 10 6 293T cells were cultured in 100
免疫沈降
リン酸カルシウム法により、それぞれのプラスミドを導入した２９３Ｔ細胞から、タンパク質を回収した後にタンパク濃度を定量してそれぞれを１ｍｇ／ｍｌに調製した。それらの細胞抽出液に抗ＩＲＳ−１抗体、抗ＩＲＳ−２抗体、非免疫血清もしくは、抗ＧＦＰ抗体を３μｇ加え４℃で２時間インキュベートした。その後、それぞれにプロテインＡ−セファロース（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を２０μｌ加え、さらに４℃で３０分間インキュベートした後、７０００×ｇで遠心して上清を除き、溶解バッファを用いて４回ビーズを洗浄した。これに溶解バッファ ２０μｌと３×Ｌａｅｍｍｌｉ’ｓ ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓｏｌｕｔｉｏｎ １０μｌを加え、５分間煮沸してサンプルとし、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。
Proteins were recovered from 293T cells introduced with the respective plasmids by immunoprecipitation calcium phosphate method, and then the protein concentration was quantified to prepare each at 1 mg / ml. 3 μg of anti-IRS-1 antibody, anti-IRS-2 antibody, non-immune serum or anti-GFP antibody was added to these cell extracts and incubated at 4 ° C. for 2 hours. Thereafter, 20 μl of protein A-sepharose (Amersham Biosciences) was added to each, and the mixture was further incubated at 4 ° C. for 30 minutes, centrifuged at 7000 × g to remove the supernatant, and the beads were washed four times with a lysis buffer. To this, 20 μl of lysis buffer and 10 μl of 3 × Laemmli's buffered solution were added and boiled for 5 minutes to prepare a sample, which was subjected to SDS-PAGE.
なお、抗ＩＲＳ−１抗体及び抗ＩＲＳ−２抗体は、Ｏｇｉｈａｒａらが用いたペプチド（ＩＲＳ−１：ＲＲＳＳＥＤＬＳＮＹＡＳＩＮＦＱＫＱＰＥＤＲＱ（配列番号７），ＩＲＳ−２：ＴＹＡＳＩＤＦＬＳＨＨＬＫＥＡＴＶＶＫＥ（配列番号８））と同様の配列を有する物を合成し、ウサギに免疫して作製した（Ｏｇｉｈａｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：１２８６８−７３，１９９７）。 The anti-IRS-1 antibody and the anti-IRS-2 antibody have the same sequences as the peptides used by Ogihara et al. (IRS-1: RRSSEDLSNYASINQQQPEDRQ (SEQ ID NO: 7), IRS-2: TYASIDFLSHHLKEATVVKE (SEQ ID NO: 8)). The product was synthesized and immunized to rabbits (Ogihara et al., J. Biol. Chem. 272: 12868-73, 1997).
ＤＧＫ活性アッセイ
２９３Ｔ細胞に種々のプラスミドをリン酸カルシウム法で導入した。２日後に溶解バッファ（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．４，０．２５Ｍ スクロース，１ｍＭ ＤＴＴ）で細胞を掻き取り、超音波破砕機で細胞を破砕したのち、遠心し上清を細胞抽出液とした。それぞれの細胞抽出液１ｍｇに抗ＩＲＳ−１抗体または抗ＩＲＳ−２抗体を加え、２時間撹拌しながら４℃でインキュベートした。プロテインＡ−セファロースを１０ｍｌ加え、さらに１時間撹拌しながら４℃でインキュベートした。ＬｉＣｌバッファ（０．５Ｍ ＬｉＣｌ，１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．５）、水、ＴＮＥ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．５，１５０ｍＭ ＮａＣｌ，１ｍＭ ＥＤＴＡ）で一度ずつ洗浄し、免疫沈降サンプルとした。免疫沈降サンプルまたは細胞抽出液を反応液量５０ｍｌ、反応液（５０ｍＭ ＭＯＰＳ ｐＨ７．２，２０ｍＭ ＮａＦ，１ｍＭ ＤＴＴ，１０ｍＭ ホスファチジルセリン，２ｍＭ ジアシルグリセロール（１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロール），５０ｍＭ オクチル−β−Ｄ−グリコピラノシド，１０ｍＭ ＭｇＣｌ２，１ｍＭ［γ−３２Ｐ］ＡＴＰ）の条件下で、３０℃、１０分間反応した。１Ｍ ＨＣｌを加えて反応を停止し、クロロホルム／メタノール（１：１）および０．１Ｍ ＨＣｌ／メタノール（１：１）で生成物であるホスファチジン酸を抽出した。抽出物を展開溶媒［酢酸エチル／イソオクタン／酢酸／水（９０：５０：２０：１０）］でＴＬＣプレート（Ｓｉｌｉｃａｇｅｌ ６０）に展開し、イメージアナライザー（ＦＬＡ−３０００）を用いて、ホスファチジン酸のスポットを定量した。この値をジアシルグリセロールキナーゼ活性とした。
DGK activity assay Various plasmids were introduced into 293T cells by the calcium phosphate method. Two days later, the cells were scraped with a lysis buffer (20 mM Tris-HCl, pH 7.4, 0.25 M sucrose, 1 mM DTT), disrupted with an ultrasonic disrupter, and then centrifuged to obtain a supernatant as a cell extract. . Anti-IRS-1 antibody or anti-IRS-2 antibody was added to 1 mg of each cell extract and incubated at 4 ° C. with stirring for 2 hours. 10 ml of protein A-sepharose was added, and the mixture was further incubated at 4 ° C. with stirring for 1 hour. The sample was washed once with LiCl buffer (0.5 M LiCl, 100 mM Tris-HCl, pH 7.5), water, and TNE (10 mM Tris-HCl pH 7.5, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA) to prepare an immunoprecipitation sample. An immunoprecipitation sample or cell extract was mixed with 50 ml of reaction solution, reaction solution (50 mM MOPS pH 7.2, 20 mM NaF, 1 mM DTT, 10 mM phosphatidylserine, 2 mM diacylglycerol (1,2-dioleoyl-sn-glycerol), 50 mM octyl- The reaction was carried out at 30 ° C. for 10 minutes under the conditions of β-D-glycopyranoside, 10
[結果]
２９３Ｔ細胞において、ＧＦＰ−ｓＤＧＫζ及びＦＬＡＧ−ＤＧＫζはＩＲＳ−１、ＩＲＳ−２と結合する
無細胞系でのｓＤＧＫζとＩＲＳ−１の結合が確認されたため、細胞内におけるｓＤＧＫζとＩＲＳ−１およびＩＲＳ−２との結合の確認を試みた。ｐＥＧＦＰにｓＤＧＫζｃＤＮＡを導入したプラスミドを作製し、２９３Ｔ細胞に導入したところ、ＧＦＰ−ｓＤＧＫζは効率よく細胞内で発現した。そこで、ＧＦＰ−ｓＤＧＫζを高発現する２９３Ｔ細胞の細胞抽出液を用いて共免疫沈降アッセイを行った。すなわち、抗ＧＦＰ抗体で免疫沈降後、抗ＩＲＳ−１抗体または抗ＩＲＳ−２抗体でイムノブロットを行った結果、ｓＤＧＫζがＩＲＳ−１およびＩＲＳ−２と結合することを示す、ＩＲＳ−１、ＩＲＳ−２のバンドが検出された（図５のＡおよびＢ）。
[result]
In 293T cells, GFP-sDGKζ and FLAG-DGKζ were confirmed to bind sDGKζ and IRS-1 and IRS-1 in cells without binding to IRS-1 and IRS-2. An attempt was made to confirm the binding to 2. When a plasmid in which sDGKζ cDNA was introduced into pEGFP was prepared and introduced into 293T cells, GFP-sDGKζ was efficiently expressed in the cells. Therefore, a co-immunoprecipitation assay was performed using a cell extract of 293T cells that highly express GFP-sDGKζ. That is, as a result of immunoblotting with anti-IRS-1 antibody or anti-IRS-2 antibody after immunoprecipitation with anti-GFP antibody, it is shown that sDGKζ binds to IRS-1 and IRS-2. -2 bands were detected (A and B in FIG. 5).
次に、ＤＧＫζの全長もＩＲＳ−１およびＩＲＳ−２と結合することを確認するため、同様に共免疫沈降アッセイを行った。ＦＬＡＧ−ＤＧＫζを高発現する２９３Ｔ細胞の細胞抽出液を非免疫血清（ＮＩＳ）または抗ＩＲＳ−１抗体、抗ＩＲＳ−２抗体で免疫沈降後、抗ＦＬＡＧ抗体でイムノブロットを行った。その結果、ＤＧＫζとＩＲＳ−１、ＩＲＳ−２との結合を示す、抗ＦＬＡＧ抗体によるＦＬＡＧ−ＤＧＫζのバンドが検出された（図５のＣおよびＤ）。 Next, in order to confirm that the full length of DGKζ also binds to IRS-1 and IRS-2, a co-immunoprecipitation assay was performed in the same manner. A cell extract of 293T cells highly expressing FLAG-DGKζ was immunoprecipitated with non-immune serum (NIS), anti-IRS-1 antibody or anti-IRS-2 antibody, and then immunoblotted with anti-FLAG antibody. As a result, bands of FLAG-DGKζ due to anti-FLAG antibody showing binding of DGKζ to IRS-1 and IRS-2 were detected (C and D in FIG. 5).
２９３Ｔ細胞において、ＩＲＳ−１とＩＲＳ−２には、ＤＧＫ活性を有したＤＧＫが結合している
ｐＦＬＡＧにＤＧＫζｃＤＮＡを導入したプラスミドを作製し、２９３Ｔ細胞に導入し、非免疫抗血清、抗ＩＲＳ−１抗血清、抗ＩＲＳ−２抗血清でそれぞれ免疫沈降後、免疫沈降物中のＤＧＫ活性を測定した。その結果、ＩＲＳ−１とＩＲＳ−２の免疫沈降物中には、有意なＤＧＫ活性が確認され、ＩＲＳ−１またはＩＲＳ−２にＤＧＫが結合していることが明らかとなった（図６）。
In 293T cells, a plasmid in which DGKζ cDNA is introduced into pFLAG to which DGK having DGK activity is bound is prepared for IRS-1 and IRS-2, introduced into 293T cells, and nonimmune antiserum, anti-IRS- After immunoprecipitation with 1 antiserum and anti-IRS-2 antiserum, respectively, DGK activity in the immunoprecipitate was measured. As a result, significant DGK activity was confirmed in the immunoprecipitates of IRS-1 and IRS-2, and it was revealed that DGK was bound to IRS-1 or IRS-2 (FIG. 6). .
２９３Ｔ細胞において、ＦＬＡＧ−ＤＧＫζとＩＲＳ−２との結合にはＣ１ドメインが必要である
次に、ＤＧＫζがどの部分においてＩＲＳ−２と結合するかを検討するため、ＤＧＫζの欠失変異体であるＢ、Ｌ、Ｂｓｕ（Ｌｕｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ，，１６０：９２９−９３７，２００３）を用いて共免疫沈降アッセイを行った。それぞれのプラスミドは、効率よく２９３Ｔ細胞内で発現したため、それらが高発現する２９３Ｔ細胞の細胞抽出液を非免疫血清（ＮＩＳ）及び抗ＩＲＳ−２抗体で免疫沈降後、抗ＦＬＡＧ抗体でイムノブロットを行った。その結果、Ｂ、Ｂｓｕにおいて、抗ＦＬＡＧ抗体によってＩＲＳ−２との結合を示す欠失変異体のバンドが検出されたが、Ｌにおいては、バンドは検出されなかった（図７）。この結果から、ＤＧＫζとＩＲＳ−２との結合において、Ｃ１ドメインが必要であることが明らかとなった。
In 293T cells, the C1 domain is required for the binding of FLAG-DGKζ and IRS-2. Next, in order to investigate in which part DGKζ binds to IRS-2, it is a deletion mutant of DGKζ. Co-immunoprecipitation assays were performed using B, L, Bsu (Luo et al., J. Cell Biol, 160: 929-937, 2003). Since each plasmid was efficiently expressed in 293T cells, the cell extracts of 293T cells that highly express them were immunoprecipitated with non-immune serum (NIS) and anti-IRS-2 antibody, and then immunoblotted with anti-FLAG antibody. went. As a result, in B and Bsu, a band of a deletion mutant showing binding to IRS-2 was detected by an anti-FLAG antibody, but no band was detected in L (FIG. 7). From this result, it became clear that the C1 domain is required for the binding of DGKζ and IRS-2.
２９３Ｔ細胞において、ＤＧＫの他のアイソフォームはＩＲＳと結合しない
上記の結果から、ＤＧＫζとＩＲＳ−２との結合において、Ｃ１ドメインが必要であることが示された。Ｃ１ドメインは、相同性は異なるもののＤＧＫのすべてのアイソフォームに共通するドメインである（図８）。そのため、ζ以外のアイソフォームについても共免疫沈降アッセイによりＩＲＳとの結合を検討した。それぞれのアイソフォームが高発現する２９３Ｔ細胞の細胞抽出液を非免疫血清及び抗ＩＲＳ−１抗体、抗ＩＲＳ−２抗体で免疫沈降後、抗ＧＦＰ抗体でイムノブロットを行った。その結果、ζ以外のアイソフォームでは、ＩＲＳとの結合は確認できなかった（図９）。
In 293T cells, other isoforms of DGK do not bind to IRS. The above results indicate that the C1 domain is required for binding of DGKζ and IRS-2. The C1 domain is a domain common to all isoforms of DGK with different homology (FIG. 8). Therefore, the binding of IRS to isoforms other than ζ was also examined by co-immunoprecipitation assay. A cell extract of 293T cells that highly express each isoform was immunoprecipitated with non-immune serum, anti-IRS-1 antibody, and anti-IRS-2 antibody, and then immunoblotted with anti-GFP antibody. As a result, it was not possible to confirm the binding with IRS in isoforms other than ζ (FIG. 9).
２９３Ｔ細胞において、ｓＤＧＫζは発現量依存的に、ＤＧＫζとＩＲＳ−２との結合を抑制する
細胞内においてｓＤＧＫζ、ＤＧＫζともにＩＲＳ−２と結合することを確認したため、ＤＧＫζとＩＲＳ−２との結合にｓＤＧＫζが影響を及ぼすかどうかを共免疫沈降アッセイによって検討した。一定量のＦＬＡＧ−ＤＧＫζと、種々の量のＧＦＰ−ｓＤＧＫζを２９３Ｔ細胞に共に高発現させた。その後、細胞抽出液を非免疫血清または抗ＩＲＳ−２抗体で免疫沈降後、抗ＦＬＡＧ抗体でイムノブロットを行った。その結果、ＤＧＫζとＩＲＳ−２との結合を示す、抗ＦＬＡＧ抗体によるＦＬＡＧ−ＤＧＫζのバンドがＩＲＳ−２で免疫沈降した時にのみ検出された。また、ＧＦＰ−ｓＤＧＫζの発現量依存的にＦＬＡＧ−ＤＧＫζとＩＲＳ−２の結合量が減少することを見出した（図１０）。同様な方法で、ＩＲＳ−２と結合しているＤＧＫ活性を測定したところ、ｓＤＧＫζの高発現によって、結合しているＤＧＫ活性が抑制される、言い換えれば、ｓＤＧＫζの発現によって、ＩＲＳ−２と結合しているＤＧＫが競合的に追い出されるということが明らかとなった（図１１）。
In 293T cells, it was confirmed that both sDGKζ and DGKζ bind to IRS-2 in cells that suppress the binding of DGKζ and IRS-2 in an expression level-dependent manner. Whether sDGKζ had an effect was examined by co-immunoprecipitation assay. A certain amount of FLAG-DGKζ and various amounts of GFP-sDGKζ were both highly expressed in 293T cells. Thereafter, the cell extract was immunoprecipitated with non-immune serum or anti-IRS-2 antibody, and then immunoblotted with anti-FLAG antibody. As a result, a FLAG-DGKζ band by anti-FLAG antibody showing binding between DGKζ and IRS-2 was detected only when IRS-2 was immunoprecipitated. Further, it was found that the binding amount of FLAG-DGKζ and IRS-2 decreases depending on the expression level of GFP-sDGKζ (FIG. 10). When the DGK activity bound to IRS-2 was measured in the same manner, the bound DGK activity was suppressed by high expression of sDGKζ, in other words, binding to IRS-2 by the expression of sDGKζ. It has become clear that the DGK that is running is competitively driven out (FIG. 11).
２９３Ｔ細胞において、ｓＤＧＫζはＩＲＳ−２のみでなくＩＲＳ−１とＤＧＫζとの結合も抑制する
ｓＤＧＫζがＤＧＫζとＩＲＳ−２との結合を抑制することが明らかとなったため、ｓＤＧＫζがＤＧＫζとＩＲＳ−１との結合においても同様の機能を有するか検討した。同時に、ＩＧＦ−Ｉ刺激時間に応じて、ｓＤＧＫζによるＩＲＳとＤＧＫζの結合の抑制に変化が生じるかを検討するために、種々の時間ＩＧＦ−Ｉで刺激した後に共免疫沈降アッセイを行った。ＦＬＡＧ−ＤＧＫζとＧＦＰまたはＧＦＰ−ｓＤＧＫζを共に一過的に高発現させた２９３Ｔ細胞を種々の時間ＩＧＦ−Ｉで刺激した。その後、細胞抽出液を抗ＩＲＳ−１抗体または抗ＩＲＳ−２抗体を用いて免疫沈降し、抗ＦＬＡＧ抗体を用いたイムノブロットに供した。その結果、ｓＤＧＫζはいずれのＩＧＦ−Ｉ刺激時間においても、ＤＧＫζとＩＲＳ−１及びＩＲＳ−２の結合を抑制することが示された（図１２）。また、ＩＧＦ−Ｉによる刺激を行っていない細胞の免疫沈降物においても結合を確認できたことから、ＤＧＫζはＩＲＳ−１及びＩＲＳ−２のチロシンリン酸化を介さずに、ＩＲＳ−１、ＩＲＳ−２と結合していることが確認できた（図１２）。
In 293T cells, it was revealed that sDGKζ suppresses not only IRS-2 but also binding of IRS-1 and DGKζ, and that sDGKζ suppresses binding of DGKζ and IRS-2. Whether it has the same function also in the combination with. At the same time, co-immunoprecipitation assay was performed after stimulation with IGF-I for various times in order to examine whether the inhibition of the binding of IRS and DGKζ by sDGKζ changes depending on the IGF-I stimulation time. 293T cells that transiently highly expressed both FLAG-DGKζ and GFP or GFP-sDGKζ were stimulated with IGF-I for various times. Thereafter, the cell extract was immunoprecipitated using anti-IRS-1 antibody or anti-IRS-2 antibody and subjected to immunoblotting using anti-FLAG antibody. As a result, it was shown that sDGKζ suppresses the binding of DGKζ to IRS-1 and IRS-2 at any IGF-I stimulation time (FIG. 12). In addition, since binding could be confirmed in an immunoprecipitate of cells not stimulated with IGF-I, DGKζ was not affected by tyrosine phosphorylation of IRS-1 and IRS-2, but IRS-1, IRS- 2 was confirmed (FIG. 12).
更に、ＩＲＳとＤＧＫζとの結合量は、ＩＧＦ−Ｉ刺激時間に応じて変化することを見出した。ＩＲＳ−１とＤＧＫζの結合量は、ＩＧＦ−Ｉ刺激時間に応じて減少するが、ＩＲＳ−２とＤＧＫζの結合量は、ＩＧＦ−Ｉ刺激時間に応じて増加することが明らかとなった（図１２）。 Furthermore, it has been found that the amount of binding between IRS and DGKζ varies depending on the IGF-I stimulation time. It was clarified that the binding amount of IRS-1 and DGKζ decreases according to the IGF-I stimulation time, but the binding amount of IRS-2 and DGKζ increases according to the IGF-I stimulation time (FIG. 12).
２９３Ｔ細胞において、ＤＧＫζはＩＧＦ−Ｉ刺激に応答したＩＲＳ−１のチロシンリン酸化を抑制し、ＩＲＳ−２のチロシンリン酸化を増強する
ＤＧＫζがＩＲＳ−１、ＩＲＳ−２と相互作用することが明らかとなったため、ＤＧＫζ高発現がＩＧＦ−Ｉ受容体キナーゼによるＩＲＳ−１、ＩＲＳ−２のチロシンリン酸化に与える影響について検討した。ＦＬＡＧ−ＤＧＫζを一過的に高発現させた２９３Ｔ細胞を種々の時間ＩＧＦ−Ｉで刺激し、その細胞抽出液を抗ＩＲＳ−１抗体または抗ＩＲＳ−２抗体を用いて免疫沈降を行い、その後抗リン酸化チロシン抗体を用いたイムノブロットに供した。
In 293T cells, DGKζ suppresses tyrosine phosphorylation of IRS-1 in response to IGF-I stimulation, and DGKζ that enhances tyrosine phosphorylation of IRS-2 interacts with IRS-1 and IRS-2 Therefore, the effect of high expression of DGKζ on tyrosine phosphorylation of IRS-1 and IRS-2 by IGF-I receptor kinase was examined. 293T cells in which FLAG-DGKζ was transiently highly expressed were stimulated with IGF-I for various times, and the cell extract was subjected to immunoprecipitation using anti-IRS-1 antibody or anti-IRS-2 antibody. The sample was subjected to immunoblotting using an anti-phosphotyrosine antibody.
その結果、ＤＧＫζを高発現させた細胞では、ＦＬＡＧのみを発現させた細胞と比較して、ＩＧＦ−Ｉ刺激に応答したＩＲＳ−１のチロシンリン酸化が抑制されることが明らかとなった。これに対して、ＩＧＦ−Ｉ刺激に応答したＩＲＳ−２のチロシンリン酸化は、ＤＧＫζを高発現させた細胞において増強された（図１３）。 As a result, it was clarified that in cells in which DGKζ was highly expressed, tyrosine phosphorylation of IRS-1 in response to IGF-I stimulation was suppressed compared to cells in which only FLAG was expressed. In contrast, tyrosine phosphorylation of IRS-2 in response to IGF-I stimulation was enhanced in cells that highly expressed DGKζ (FIG. 13).
さらに、これらの免疫沈降物について抗ＦＬＡＧ抗体を用いてイムノブロットを行ったところ、ＦＬＡＧ−ＤＧＫζとＩＲＳ−１及びＩＲＳ−２との結合も確認された（図１３）。また、その結合量はＩＲＳ−１においてはＩＧＦ−Ｉ刺激時間に応じて減少し、ＩＲＳ−２においては刺激時間に応じて増加した（図１３）。 Furthermore, immunoblotting was performed on these immunoprecipitates using an anti-FLAG antibody, and binding between FLAG-DGKζ and IRS-1 and IRS-2 was also confirmed (FIG. 13). Moreover, the amount of binding decreased with IGF-I stimulation time in IRS-1 and increased with stimulation time in IRS-2 (FIG. 13).
この結果から、ＤＧＫζはＩＧＦ−Ｉ刺激依存性チロシンリン酸化において、ＩＲＳ−１とＩＲＳ−２とで異なる修飾を行うことが明らかとなった。 From this result, it was revealed that DGKζ performs different modifications between IRS-1 and IRS-2 in IGF-I stimulation-dependent tyrosine phosphorylation.
２９３Ｔ細胞において、ＤＧＫζはＩＧＦ−Ｉ刺激に応答したＡｋｔの活性化には影響しないが、Ｅｒｋの活性化を抑制する
続いて、ＤＧＫζがＩＲＳ下流のシグナルに与える影響について検討した。ＩＧＦ−Ｉの刺激に応答してＭＡＰキナーゼ経路、ＰＩ３−キナーゼ経路が活性化されると、下流経路にあるセリン／スレオニンキナーゼがリン酸化を介して活性化される。今回は、ＭＡＰキナーゼ経路の下流キナーゼであるＥｒｋ、ＰＩ３−キナーゼ経路の下流キナーゼであるＡｋｔの活性化をそれぞれのキナーゼリン酸化抗体を用いて解析した。すなわち、ＦＬＡＧ−ＤＧＫζを一過的に高発現させた２９３Ｔ細胞を種々の時間ＩＧＦ−Ｉで刺激し、その細胞抽出液を抗ｐｈｏｓｐｈｏ−Ａｋｔ抗体及び抗ｐｈｏｓｐｈｏ−Ｅｒｋ抗体を用いてイムノブロットを行った。その結果、ＤＧＫζ高発現は、ＩＧＦ−Ｉ刺激によるＡｋｔの活性化には影響を与えないが、Ｅｒｋの活性化を抑制することが明らかとなった（図１３）。
In 293T cells, DGKζ did not affect the activation of Akt in response to IGF-I stimulation. However, the effect of DGKζ on the signal downstream of IRS was examined following suppression of Erk activation . When the MAP kinase pathway and the PI3-kinase pathway are activated in response to IGF-I stimulation, serine / threonine kinases in the downstream pathway are activated through phosphorylation. In this study, activation of Erk, a downstream kinase of the MAP kinase pathway, and Akt, a downstream kinase of the PI3-kinase pathway, were analyzed using respective kinase phosphorylated antibodies. That is, 293T cells in which FLAG-DGKζ was transiently highly expressed were stimulated with IGF-I for various times, and the cell extract was subjected to immunoblotting using anti-phospho-Akt antibody and anti-phospho-Erk antibody. It was. As a result, it was clarified that high expression of DGKζ does not affect the activation of Akt by IGF-I stimulation, but suppresses the activation of Erk (FIG. 13).
これらの結果から、ＤＧＫζは、ＩＧＦ−ＩによるＩＲＳのチロシンリン酸化の変動を介して、ＰＩ３−キナーゼ経路の活性化には影響を与えないが、ＭＡＰキナーゼ経路の活性化を抑制すると結論した。 From these results, it was concluded that DGKζ does not affect the activation of the PI3-kinase pathway through the change in tyrosine phosphorylation of IRS by IGF-I, but suppresses the activation of the MAP kinase pathway.
２９３Ｔ細胞において、ｓＤＧＫζはＩＧＦ−Ｉ刺激に応答したＩＲＳ−１のチロシンリン酸化を増強し、ＩＲＳ−２のチロシンリン酸化を抑制する
続いて、ｓＤＧＫζが受容体キナーゼによるＩＲＳ−１、ＩＲＳ−２のチロシンリン酸化に与える影響について検討した。ＦＬＡＧ−ｓＤＧＫζを一過的に高発現させた２９３Ｔ細胞を種々の時間ＩＧＦ−Ｉで刺激し、その細胞抽出液を抗ＩＲＳ−１抗体あるいは抗ＩＲＳ−２抗体を用いて免疫沈降を行い、その後抗リン酸化チロシン抗体を用いたイムノブロット分析を行った。
In 293T cells, sDGKζ enhances tyrosine phosphorylation of IRS-1 in response to IGF-I stimulation and suppresses tyrosine phosphorylation of IRS-2, followed by sDGKζ by IRS-1 and IRS-2 by receptor kinases. We investigated the effect of tyrosine on tyrosine phosphorylation. 293T cells in which FLAG-sDGKζ was transiently highly expressed were stimulated with IGF-I for various times, and the cell extract was subjected to immunoprecipitation using anti-IRS-1 antibody or anti-IRS-2 antibody. Immunoblot analysis using anti-phosphotyrosine antibody was performed.
その結果、ＦＬＡＧ−ｓＤＧＫζを高発現させた細胞では、ＧＦＰのみを発現させた細胞と比較して、ＩＧＦ−Ｉ刺激に応答したＩＲＳ−１のチロシンリン酸化が増強されることが明らかとなった（図１３）。一方、ＩＧＦ−Ｉ刺激に応答したＩＲＳ−２のチロシンリン酸化は、ｓＤＧＫζを高発現させた細胞において抑制されることがわかった。 As a result, it was clarified that in cells expressing FLAG-sDGKζ at a high level, tyrosine phosphorylation of IRS-1 in response to IGF-I stimulation was enhanced compared to cells expressing only GFP. (FIG. 13). On the other hand, it was found that tyrosine phosphorylation of IRS-2 in response to IGF-I stimulation was suppressed in cells that highly expressed sDGKζ.
さらに、これらの免疫沈降物について抗ＤＧＫζ抗体を用いてイムノブロットを行ったところ、２９３Ｔ細胞に内在的に発現しているＤＧＫζとＩＲＳ−１及びＩＲＳ−２との結合が確認され、その結合はｓＤＧＫζの高発現によって減少していた（図１３）。また、ＩＧＦ−Ｉによる刺激を行っていない細胞の免疫沈降物においても結合を確認できたことから、内在的に発現しているＤＧＫζも過剰発現させた際と同様に、ＩＲＳ−１及びＩＲＳ−２のチロシンリン酸化を介さずに、ＩＲＳ−１、ＩＲＳ−２と結合していることが明らかとなった（図１３）。 Furthermore, immunoblotting of these immunoprecipitates using an anti-DGKζ antibody confirmed the binding of DGKζ endogenously expressed in 293T cells with IRS-1 and IRS-2. It was decreased by high expression of sDGKζ (FIG. 13). In addition, since binding was confirmed in the immunoprecipitates of cells not stimulated with IGF-I, IRS-1 and IRS- were expressed in the same manner as when DGKζ that was endogenously expressed was overexpressed. It became clear that it couple | bonded with IRS-1 and IRS-2 not through tyrosine phosphorylation of 2 (FIG. 13).
この結果から、ｓＤＧＫζは、ＩＧＦ−Ｉ刺激依存性チロシンリン酸化においてＩＲＳ−１、ＩＲＳ−２とで異なる修飾を行い、ＤＧＫζの修飾とは逆の変動が起こることが明らかとなった。 From this result, it was revealed that sDGKζ was modified differently from IRS-1 and IRS-2 in IGF-I stimulation-dependent tyrosine phosphorylation, and a change opposite to that of DGKζ occurred.
２９３Ｔ細胞において、ｓＤＧＫζはＩＧＦ−Ｉ刺激に応答したＡｋｔの活性化には影響しないが、Ｅｒｋの活性化を増強する
次に、先と同様の実験系を用いて、ｓＤＧＫζの高発現が、下流のＰＩ３−キナーゼ経路及びＭＡＰキナーゼ経路の活性化に及ぼす影響について調べた。抗ｐｈｏｓｐｈｏ−Ａｋｔ抗体及び抗ｐｈｏｓｐｈｏ−Ｅｒｋ抗体を用いてイムノブロットを行った結果、ｓＤＧＫζ高発現はＩＧＦ−Ｉの刺激によるＡｋｔの活性化には影響を与えないが、Ｅｒｋの活性化を増強することが明らかとなった（図１３）。
In 293T cells, sDGKζ does not affect the activation of Akt in response to IGF-I stimulation, but enhances the activation of Erk. Next, using the same experimental system as described above, high expression of sDGKζ The effect on the activation of PI3-kinase pathway and MAP kinase pathway was investigated. As a result of immunoblotting using anti-phospho-Akt antibody and anti-phospho-Erk antibody, high sDGKζ expression does not affect Akt activation by stimulation with IGF-I, but enhances Erk activation It became clear (FIG. 13).
これらの結果は、ｓＤＧＫζの発現がＩＧＦ−ＩによるＰＩ３−キナーゼ経路の活性化には影響を与えないが、ＭＡＰキナーゼ経路の活性化を増強することを示している。 These results indicate that sDGKζ expression does not affect the activation of the PI3-kinase pathway by IGF-I, but enhances the activation of the MAP kinase pathway.
２９３Ｔ細胞において、ｓＤＧＫζは発現量依存的にＥｒｋの活性化を増強するが、Ａｋｔの活性化には影響しない
ｓＤＧＫζの発現量がＤＧＫζとＩＲＳ−２との結合を抑制することから、一定量のＦＬＡＧ−ＤＧＫζと、種々の量のＧＦＰ−ｓＤＧＫζを２９３Ｔ細胞に一過的に高発現させた際の、ＰＩ３−キナーゼ経路及びＭＡＰキナーゼ経路の活性化に及ぼす影響について調べた。それぞれの細胞を種々の時間ＩＧＦ−Ｉで刺激した後、抗ｐｈｏｓｐｈｏ−Ａｋｔ抗体及び抗ｐｈｏｓｐｈｏ−Ｅｒｋ抗体を用いてイムノブロットを行った。その結果、ｓＤＧＫζはＩＧＦ−Ｉの刺激によるＡｋｔの活性化には影響を与えないが、Ｅｒｋの活性化を発現量依存的に増強することが明らかとなった（図１４）。
In 293T cells, sDGKζ enhances Erk activation in an expression-dependent manner, but the expression level of sDGKζ, which does not affect Akt activation, suppresses the binding of DGKζ and IRS-2. The effect of transiently high expression of FLAG-DGKζ and various amounts of GFP-sDGKζ on 293T cells on the activation of PI3-kinase pathway and MAP kinase pathway was examined. After each cell was stimulated with IGF-I for various times, immunoblotting was performed using anti-phospho-Akt antibody and anti-phospho-Erk antibody. As a result, it was revealed that sDGKζ does not affect the activation of Akt by stimulation with IGF-I, but enhances the activation of Erk depending on the expression level (FIG. 14).
ＤＧＫζを高発現した２９３Ｔ細胞において、ｓＤＧＫζの高発現はＥｒｋの活性化を増強する
ｓＤＧＫζはＩＧＦ−Ｉのいずれの刺激時間においても、ＤＧＫζとＩＲＳ−１及びＩＲＳ−２の結合を抑制することが示されたことから（図１３）、結合の抑制が、ＰＩ３−キナーゼ経路及びＭＡＰキナーゼ経路の活性化にどのように反映されるかについて調べることにした。ＦＬＡＧ−ＤＧＫζとＧＦＰまたはＧＦＰ−ｓＤＧＫζを共に一過的に高発現させた２９３Ｔ細胞を種々の時間ＩＧＦ−Ｉで刺激し、その細胞抽出液を抗ｐｈｏｓｐｈｏ−Ａｋｔ抗体及び抗ｐｈｏｓｐｈｏ−Ｅｒｋ抗体を用いてイムノブロットを行った。その結果、ＦＬＡＧ−ＤＧＫζとＧＦＰ−ｓＤＧＫζの高発現は、ＦＬＡＧ−ＤＧＫζとＧＦＰの高発現と比較してＥｒｋの活性化が増強されていることが明らかとなった（図１５）。また、Ａｋｔの活性化には違いは認められなかった（図１５）。
In 293T cells that highly express DGKζ, high expression of sDGKζ enhances the activation of Erk . SDGKζ can inhibit the binding of DGKζ to IRS-1 and IRS-2 at any stimulation time of IGF-I. From what was shown (FIG. 13), it was decided to investigate how binding inhibition is reflected in the activation of the PI3-kinase pathway and the MAP kinase pathway. 293T cells in which both FLAG-DGKζ and GFP or GFP-sDGKζ were transiently highly expressed were stimulated with IGF-I for various times, and the cell extract was used with anti-phospho-Akt antibody and anti-phospho-Erk antibody. Immunoblots were performed. As a result, it was revealed that the high expression of FLAG-DGKζ and GFP-sDGKζ has enhanced Erk activation compared to the high expression of FLAG-DGKζ and GFP (FIG. 15). In addition, there was no difference in the activation of Akt (FIG. 15).
この結果から、ｓＤＧＫζ高発現によるＥｒｋの活性化は、ＤＧＫζとＩＲＳとの結合の抑制によると考えられた。 From this result, it was considered that the activation of Erk due to the high expression of sDGKζ was due to the suppression of the binding between DGKζ and IRS.
ＤＧＫζはＩＲＳと相互作用することにより、ｓＤＧＫζはＤＧＫζとＩＲＳとの相互作用を競合阻害することにより、ＩＧＦシグナルを修飾する
２９３Ｔ細胞にＤＧＫζまたはｓＤＧＫζを一過的に高発現し、ＩＧＦ−Ｉ刺激に応答したＩＲＳ−１、ＩＲＳ−２のチロシンリン酸化の動態を解析した。その結果、ＤＧＫζの高発現は、ＩＲＳ−１のＩＧＦ−Ｉ依存性チロシンリン酸化を抑制したのに対して、ＩＲＳ−２のチロシンリン酸化を増強することを見出した。一方、ｓＤＧＫζの高発現は、ＩＲＳ−１のＩＧＦ−Ｉ依存性チロシンリン酸化を増強、ＩＲＳ−２のチロシンリン酸化を抑制するという、ＤＧＫζ高発現細胞とは逆の挙動を示した。そこで、高発現細胞における、ＩＲＳ下流のシグナルを検討した。ＭＡＰキナーゼ経路及びＰＩ３−キナーゼ経路の活性化の指標として、Ｅｒｋ、Ａｋｔの活性化の様子を調べたところ、高発現は、Ａｋｔの活性化には影響を与えなかったが、Ｅｒｋの活性化は、ＤＧＫζを高発現させた場合には抑制されるが、ｓＤＧＫζを高発現させた場合に増強されるというように、異なる影響が観察された。また、ＤＧＫζ、ｓＤＧＫζ共に高発現させた場合、ｓＤＧＫζの発現量依存的にＥｒｋの活性化が増強された。先に述べたＤＧＫζとＩＲＳの相互作用の結果も併せると、内在性ＤＧＫζはＩＲＳと相互作用することにより、ＩＲＳ−１を介したシグナルを抑制しているという新しい機構が考えられた。
DGKζ interacts with IRS, and sDGKζ competitively inhibits the interaction between DGKζ and IRS, thereby transiently overexpressing DGKζ or sDGKζ in 293T cells that modify the IGF signal, and stimulating IGF-I. Was analyzed for tyrosine phosphorylation of IRS-1 and IRS-2. As a result, it was found that high expression of DGKζ enhanced tyrosine phosphorylation of IRS-2 while suppressing IGF-I-dependent tyrosine phosphorylation of IRS-1. On the other hand, high expression of sDGKζ showed the opposite behavior to that of DGKζ high-expressing cells, in which IRS-I-dependent tyrosine phosphorylation of IRS-1 was enhanced and tyrosine phosphorylation of IRS-2 was suppressed. Therefore, IRS downstream signals in highly expressing cells were examined. As an index of activation of the MAP kinase pathway and the PI3-kinase pathway, the state of activation of Erk and Akt was examined. High expression did not affect the activation of Akt, but the activation of Erk Different effects were observed, such as being suppressed when DGKζ was highly expressed but enhanced when sDGKζ was highly expressed. Further, when both DGKζ and sDGKζ were highly expressed, Erk activation was enhanced depending on the expression level of sDGKζ. Combined with the results of the interaction between DGKζ and IRS described above, a new mechanism was considered that endogenous DGKζ interacts with IRS to suppress signals via IRS-1.
（実施例６）ＧＬＵＴ４細胞膜移行の解析
[方法]
３Ｔ３−Ｌ１細胞を脂肪細胞へ分化させる際は、次の方法で分化誘導を行った。予め、細胞を約１×１０６ｃｅｌｌｓ／３ｍｌ ＣＳ培地／６０ｍｍ組織培養ディッシュ（ＩＷＡＫＩ）の条件で播種し、３〜４日間培養した。細胞密度がコンフルエントに達してから２日後に、細胞を、ダルベッコ改変イーグル培地に最終濃度１０％になるようにウシ胎児血清（ＪＲＨ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を加え、抗生物質を１００ｕｎｉｔ／ｍｌペニシリン、５０μｇ／ｍｌストレプトマイシン、１００μｇ／ｍｌカナマイシンとなるように加えた培地に０．１μｇ／ｍｌデキサメタゾン、２７．８μｇ／ｍｌイソブチルメチルキサンチン、１．０μｇ／ｍｌインスリンを加えた培地で４日間培養し、続いて、１０％ＦＢＳ培地に１．０μｇ／ｍｌインスリンを含む培地で４日間培養することによって、脂肪細胞へ分化させた。
(Example 6) Analysis of GLUT4 cell membrane migration
[Method]
When differentiating 3T3-L1 cells into adipocytes, differentiation induction was performed by the following method. In advance, the cells were seeded under conditions of about 1 × 10 6 cells / 3 ml CS medium / 60 mm tissue culture dish (IWAKI) and cultured for 3 to 4 days. Two days after the cell density reaches confluence, the cells are added to Dulbecco's modified Eagle medium to a final concentration of 10% fetal bovine serum (JRH Bioscience), and antibiotics are added in 100 units / ml penicillin, 50 μg / ml streptomycin. Culturing for 4 days in a medium supplemented with 0.1 μg / ml dexamethasone, 27.8 μg / ml isobutylmethylxanthine, 1.0 μg / ml insulin in a medium added to 100 μg / ml kanamycin, followed by 10% The cells were differentiated into adipocytes by culturing in a medium containing 1.0 μg / ml insulin in FBS medium for 4 days.
ＧＬＵＴ４細胞膜移行の解析
ｐＧＦＰ−ＤＧＫｚ、ｐＧＦＰ−ｓＤＧＫｚを１００ｍｇ、ｐＧｌｕｔ４−ｍｙｃ ２００ｍｇとともにエレクトロポレーションで３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞に遺伝子導入し、これらを共に発現させた細胞をＢＳＡ培地で培養し、静止期に同調させた。３時間後に１０−７Ｍ インスリンで２５分間処理、あるいは処理せず、ＰＢＳ（−）で洗浄後、ＰＢＳ／４％ パラホルムアルデヒドで１０分間固定した。次に、ＰＢＳ（−）で３回洗浄後ＰＢＳ／３％ ＢＳＡを用い室温で１時間ブロッキングを行った後、一次抗体としてＰＢＳ／３％ ＢＳＡで１：１００に希釈した抗ｍｙｃ抗体（Ｕｐｓｔａｔｅ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）で４℃、一晩インキュベートした。ＰＢＳ（−）で１０分間ずつ３回緩やかに振とうしながら洗浄し、二次抗体として１：１，０００にＰＢＳ／３％ ＢＳＡで希釈したＡｌｅｘａ５９４抗ヤギＩｇＧ抗体（Ｍｏｌｅｃｕｌｅｒ Ｐｒｏｂｅｓ）で３７℃、１時間インキュベートした。その後ＰＢＳ（−）で１０分間ずつ３回緩やかに振とうしながら洗浄した。スライドガラス上にＶＥＣＴＡＳＨＩＥＬＤ ｍｏｕｎｔｉｎｇ ｍｅｄｉｕｍを滴下し、カバーガラスをその上に置き、マニキュアで周囲を固定した。これらのサンプルを共焦点顕微鏡で観察した。ＧＦＰの蛍光が観察された細胞を計数し、そのうち細胞膜上にｍｙｃが染色された細胞を計数した。各サンプルについて５０個を計数し、ｍｙｃが染色された細胞の割合を計算した。実験は、１細胞処理群について３試料以上同時に行い、統計処理を施した。得られた各データについて、ＡＮＯＶＡにより有意水準５％で有意差の有無の検討を行った。
Analysis of GLUT4
[結果]
ｓＤＧＫζ高発現は、３Ｔ３−Ｌ１細胞において、基底状態のＧＬＵＴ４の細胞膜移行を促進する
ＧＦＰ−ＤＧＫζ、ＧＦＰ−ｓＤＧＫζを一過的に高発現させた３Ｔ３−Ｌ１細胞にＧＵＬＵ４−ｍｙｃを共発現させ、これをインスリンで処理し、２０分後にＧＬＵＴ４−ｍｙｃが細胞膜への移行している細胞数を調べた。この値は、糖の取込み量を反映していると考えられている。インスリン刺激によって、ＧＬＵＴ４の細胞膜移行が観察され、系は機能していることが確認された。ＧＦＰ−ｓＤＧＫζを発現した細胞では、インスリン依存性ＧＬＵＴ４の細胞膜移行には大きな影響はなかったが、インスリン非依存的糖取込み、すなわち基底状態のＧＬＵＴ４の膜移行を促進することを発見した。これに対してＧＦＰ−ＤＧＫζの発現は、ＧＬＵＴ４の膜移行には有意な影響を及ぼさなかった（図１６）。
[result]
High expression of sDGKζ allows GULU4-myc to be co-expressed in 3T3-L1 cells in which GFP-DGKζ and GFP-sDGKζ are transiently highly expressed to promote cell membrane translocation of GLUT4 in the ground state in 3T3-L1 cells, This was treated with insulin, and after 20 minutes, the number of cells in which GLUT4-myc had migrated to the cell membrane was examined. This value is believed to reflect the amount of sugar taken up. By insulin stimulation, cell membrane translocation of GLUT4 was observed, confirming that the system was functioning. Cells expressing GFP-sDGKζ did not have a significant effect on insulin-dependent GLUT4 cell membrane translocation, but were found to promote insulin-independent sugar uptake, ie, basal GLUT4 membrane translocation. In contrast, GFP-DGKζ expression did not significantly affect GLUT4 membrane translocation (FIG. 16).
Claims (12)
(a)配列番号１のアミノ酸配列からなるポリペプチド、
(b)配列番号１のアミノ酸配列において、１または複数のアミノ酸が欠失、付加、挿入または置換されたアミノ酸配列からなるポリペプチド。 The following polypeptide (a) or (b):
(a) a polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1,
(b) A polypeptide comprising an amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted, added, inserted or substituted in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.
(a)配列番号２の塩基配列からなるＤＮＡ、
(b)配列番号２の塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ。 The following DNA (a) or (b):
(a) DNA consisting of the base sequence of SEQ ID NO: 2,
(b) A DNA that hybridizes under stringent conditions with a DNA comprising a base sequence complementary to the base sequence of SEQ ID NO: 2.
前記細胞におけるＤＧＫζおよび／またはｓＤＧＫζの発現を検出する工程と、を含む、
ＩＲＳチロシンリン酸化調節剤のスクリーニング方法。 Contacting a test substance with a cell comprising genomic DGKζ DNA;
Detecting the expression of DGKζ and / or sDGKζ in the cell,
Screening method for IRS tyrosine phosphorylation regulator.
前記細胞におけるＤＧＫζおよび／またはｓＤＧＫζの発現を検出する工程と、を含む、糖取込み調節剤のスクリーニング方法。 Contacting a test substance with a cell comprising genomic DGKζ DNA;
Detecting the expression of DGKζ and / or sDGKζ in the cell.
(i)ゲノムＤＧＫζのＤＮＡを備えた細胞におけるｓＤＧＫζの発現を検出する工程、
(ii)被検物質を接触させた後に前記細胞におけるｓＤＧＫζの発現を検出する工程、
(iii)被検物質非存在下におけるｓＤＧＫζの発現と比べて、ｓＤＧＫζの発現を促進する被検物質を選択する工程。 A screening method for an IRS tyrosine phosphorylation regulator comprising the following steps (i) to (iii):
(i) a step of detecting the expression of sDGKζ in a cell comprising genomic DGKζ DNA;
(ii) detecting the expression of sDGKζ in the cell after contacting the test substance;
(iii) A step of selecting a test substance that promotes the expression of sDGKζ compared to the expression of sDGKζ in the absence of the test substance.
(i)ゲノムＤＧＫζのＤＮＡを備えた細胞におけるｓＤＧＫζの発現を検出する工程、
(ii)被検物質を接触させた後に前記細胞におけるｓＤＧＫζの発現を検出する工程、
(iii)被検物質非存在下におけるｓＤＧＫζの発現と比べて、ｓＤＧＫζの発現を促進する被検物質を選択する工程。 A screening method for a sugar uptake regulator comprising the following steps (i) to (iii):
(i) a step of detecting the expression of sDGKζ in a cell comprising genomic DGKζ DNA;
(ii) detecting the expression of sDGKζ in the cell after contacting the test substance;
(iii) A step of selecting a test substance that promotes the expression of sDGKζ compared to the expression of sDGKζ in the absence of the test substance.
(i)被検物質存在下または非存在下でＤＧＫζとＩＲＳとを相互作用させる工程
(ii)ＩＲＳに相互作用したＤＧＫζを測定する工程
(iii)被検物質存在下における相互作用ＤＧＫζ量が被検物質非存在下における相互作用ＤＧＫζ量よりも低いときに、当該被検物質をＩＲＳチロシンリン酸化調節剤の候補として選択する工程。 A screening method for an IRS tyrosine phosphorylation regulator comprising the following steps (i) to (iii):
(i) A step of causing DGKζ and IRS to interact in the presence or absence of a test substance
(ii) A step of measuring DGKζ interacting with IRS
(iii) A step of selecting the test substance as a candidate for an IRS tyrosine phosphorylation regulator when the amount of interacting DGKζ in the presence of the test substance is lower than the amount of interacting DGKζ in the absence of the test substance.
(i)被検物質存在下または非存在下でＤＧＫζとＩＲＳとを相互作用させる工程
(ii)ＩＲＳに相互作用したＤＧＫζを測定する工程
(iii)被検物質存在下における相互作用ＤＧＫζ量が被検物質非存在下における相互作用ＤＧＫζ量よりも低いときに、当該被検物質を糖取込み調節剤の候補として選択する工程。 A screening method for a sugar uptake regulator comprising the following steps (i) to (iii):
(i) A step of causing DGKζ and IRS to interact in the presence or absence of a test substance
(ii) A step of measuring DGKζ interacting with IRS
(iii) A step of selecting the test substance as a candidate for sugar uptake regulator when the amount of interacting DGKζ in the presence of the test substance is lower than the amount of interacting DGKζ in the absence of the test substance.
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