JP2006223273A - 細胞培養用担体、細胞培養用治具および細胞培養方法 - Google Patents

Abstract

【課題】 細胞を容易に分離可能な細胞培養用担体を提供する。
【解決手段】
本発明に係る細胞培養用担体は、気相成長法による炭素繊維であって、底の無いカップ形状をなす炭素網層が積層し、該積層した炭素網層の端面が表面に露出しているカーボンナノチューブと、樹脂との混合材料が焼成され、樹脂が炭化されたカーボン複合体からなり、該カーボン複合体の表面が表面処理されて、表面に前記カーボンナノチューブの一部が露出されてなることを特徴とする。
【選択図】 図６

Description

本発明は、細胞培養用担体、細胞培養用治具および細胞培養方法に関する。

新薬開発における抗体・タンパク生産には、精製が困難である動物を用いる手法より、近年、生体外で細胞を培養、生育させる培養細胞が開発されつつある。この培養細胞を用いて、抗体やタンパク質を作成し、薬剤の生理活性や毒性を試験するのである。
ところで、一部の細胞、特に人由来の細胞は、何かに接着して生育する接着依存性を有していて、生体外で浮遊状態では長期間の生存は不可能で、大量培養は困難である。
発明者等は、先に、気相成長法による炭素繊維であって、底の無いカップ形状をなす炭素網層が積層し、該積層した炭素網層の端面が露出しているカーボンナノチューブ（スタックタイプＣＮＴ）を主体とする細胞培養用担体を開発した（特開２００４−１３５６６８）。
この細胞培養用担体によれば、通常の培養方法と比べて、２０〜３０％の増殖効果と培養の長期化をできるものであった。

特開２００４−１３５６６８

しかしながら、上記従来の細胞培養用担体には次のような課題がある。
すなわち、細胞はカーボンナノチューブを足場として成長するものであるが、カーボンナノチューブは微細であって、細胞に付着し、分離操作によっても完全には分離できず、細胞を利用する際、カーボンナノチューブが夾雑物となって各種試験に悪影響を及ぼすおそれがあった。
そこで本発明は、細胞を容易に分離可能な細胞培養用担体、細胞培養用治具および細胞培養方法を提供する。

上記課題を解決するため、本発明に係る細胞培養用担体は、気相成長法による炭素繊維であって、底の無いカップ形状をなす炭素網層が積層し、該積層した炭素網層の端面が表面に露出しているカーボンナノチューブと、樹脂との混合材料が焼成され、樹脂が炭化されたカーボン複合体からなり、該カーボン複合体の表面が表面処理されて、表面に前記カーボンナノチューブの一部が露出されてなることを特徴とする。
前記混合材料に対する前記カーボンナノチューブの含有量は３０〜９０ｗｔ％程度が好適である。

また、本発明に係る細胞培養用担体は、微粉化された活性炭と、樹脂との混合材料が焼成され、樹脂が炭化されたカーボン複合体からなり、該カーボン複合体の表面が表面処理されて、表面に前記活性炭の一部が露出されてなることを特徴とする。
前記混合材料に対する前記活性炭の含有量は３０〜９０ｗｔ％程度が好適である。

また、前記カーボン複合体に酸化性雰囲気中での加熱酸化処理の表面処理が施されてカーボンナノチューブが表面に露出されていることを特徴とする。
あるいは、前記カーボン複合体に酸化性雰囲気中での加熱酸化処理の表面処理が施されて活性炭が表面に露出されていることを特徴とする。

上記細胞培養用担体を、培養液および細胞の接触する部位に固定して細胞培養用治具とすることができる。

本発明によれば、カーボンナノチューブまたは活性炭が担体中に固定され、カーボンナノチューブまたは活性炭が、空洞あるいは細孔を有すること、これらカーボンナノチューブあるいは活性炭を結着する炭化した樹脂粒子間にも微細孔を有することから、細胞培養時の細胞由来の老廃物がこれら空洞等に吸着され、培養液に混ざりこまないので、良好な培養が行え、増殖率が向上し、また細胞が長期間生存することができ、細胞の利用可能期間が延びる。
また、カーボンナノチューブや活性炭は炭化した樹脂中に固定化されているので、細胞の分離が良好に行える。

以下本発明の好適な実施の形態を添付図面に基づき詳細に説明する。
本実施の形態に係る細胞培養用担体に用いるカーボンナノチューブは、上記特開２００４−１３５６６８に示されるのと同じカーボンナノチューブ（商品名カルベール：以下スタックタイプＣＮＴと称する）を用いる。
以下このスタックタイプＣＮＴの概略を説明する。

このスタックタイプＣＮＴは、気相成長法による炭素繊維であって、底の無いカップ形状をなす炭素網層が積層し、該積層した炭素網層の端面が表面に露出しているものである。スタックタイプＣＮＴは、単位炭素網層が数万〜数十万個積層した短繊維状をなし、長さは数μｍ〜数十μｍであるが、ボールミル等によって破砕処理を行うことによって分断して長さ調整をしたスタックタイプＣＮＴも良好に用いることができる。

またスタックタイプＣＮＴは、ところどころ節があったりするものも存在するが、数十ｎｍ〜数十μｍの範囲で中空状をなしている。したがって、上記のように、分断して、長さの短い（例えば数十ｎｍ〜数百ｎｍ程度）ものに調整することで、節のない、完全に筒状のものにすることができる。
このスタックタイプＣＮＴは、直径が数十ｎｍ〜数百ｎｍの極めて細いものであり、また、肉厚の薄い、空洞部が大きい中空状をなすことが特徴である。例えば、外径が１００ｎｍ程度のものの場合、内径がその半分の５０ｎｍ程度にも及ぶ大きな空洞部となっている。

気相成長法によって製造されたスタックタイプＣＮＴは、表面にアモルファス状の堆積層が形成されているが、大気中、５００℃前後の温度で１時間程度熱処理したり、あるいは超臨海水により洗浄することによって堆積層が除去され、表面に輪状に連なる炭素網層の端面（エッジ）が露出する。露出した炭素網層の端面（外表面、内表面双方の端面）は不揃いで、ｎｍ（ナノメーター）、すなわち原子の大きさレベルでの微細な凹凸を呈している。

このスタックタイプＣＮＴの露出している炭素網層の端面は、他の原子と結びつきやすく、きわめて活性度が高い点が特徴である。これは大気中での熱処理により、堆積層が除去されつつ、露出する炭素網層の端面に、フェノール性水酸基、カルボキシル基、キノン型カルボニル基、ラクトン基などの含酸素官能基が増大し、これら含酸素官能基が親水性、各種物質に対する親和性が高いからである。
露出した炭素網層の端面がカルボキシル基等で修飾されると、このカルボキシル基に各種タンパクが結合しやすくなる。
これら官能基やタンパクの存在により、細胞が付着しやすくなると考えられる。

本実施の形態の細胞培養用担体は、スタックタイプＣＮＴと、樹脂との混合材料が焼成され、樹脂が炭化されたカーボン複合体からなり、該カーボン複合体の表面が表面処理されて、表面に前記カーボンナノチューブの一部が露出していることを特徴とする。
樹脂はフェノール樹脂が好適であるが、これに限定されるものではない。スタックタイプＣＮＴと樹脂との混合材料は、例えば板状に成形した後、焼成する。この焼成は、アルゴンガス雰囲気中などの、不活性ガス雰囲気中で加熱して行い、樹脂を炭化する。

このように、スタックタイプＣＮＴと樹脂との混合材料を焼成することにより、カーボン複合体（カーボン−カーボン複合体）が形成される。すなわち、スタックタイプＣＮＴは、炭化した樹脂によって結着、固定化される。ただし、このままであると、スタックタイプＣＮＴはその表面が炭化した樹脂で覆われている。
そこで、このカーボン複合体を、大気中（酸化性雰囲気中）で、４００〜６００℃程度の温度で加熱して、カーボン複合体の表面に存在する炭化した樹脂を燃焼（酸化処理）させて除去することにより、カーボン複合体の表面にスタックタイプＣＮＴの一部を露出させるようにする。あるいは、サンドペーパー等の砥石により、カーボン複合体の表面を研削して、スタックタイプＣＮＴの一部を露出させるようにしてもよい。

前記混合材料に対するスタックタイプＣＮＴの含有量は、多ければ多いほど好ましいが、概ね３０〜９０ｗｔ％程度が好適である。９０ｗｔ％よりも多くなると、焼成して得られたカーボン複合体の強度（スタックタイプＣＮＴの結着強度）が弱く、形状保持が困難となるので好ましくない。

上記のようにして得られた細胞培養用担体を、培養容器（細胞培養用治具）の、培養液および細胞の接触する部位に固定し、細胞培養を行うのである。
図１は、ウエル（Well）１２を有する培養容器（治具）１０の一例を示す。
この培養容器１０は、ウエル１２形成用の貫通孔１２ａが形成された、例えば１ｃｍ程度の厚さの樹脂板１４と、この樹脂板１４の貫通孔１２ａを閉塞する樹脂製の底板１６を有する。

ウエル１２内に細胞培養用担体１８を配置し、適宜固定手段によって固定するようにする。
細胞培養用担体１８は、完全な板状のものとすると、底板１６の下方から検査光を当てて細胞の生育状態を観察する検鏡観察が行えなくなるので、図２に示すように細胞培養用担体１８に０．０５ｍｍ〜０．５ｍｍ程度の幅のスリット１９を形成して視認性を得、検鏡観察を行えるようにするとか、図３に示すように、担体１８を粒状に形成し、粒状の担体１８間の隙間から検鏡観察を行えるようにするとよい。なお、２０は細胞である。

図２に示すようなスリット１９を設けた担体１８をウエル１２内に固定するには、例えば図４に示すように、Ｏリング２２により担体１８の端部を押えるようにし、Ｏリング２２を樹脂板１４に底板１６により押し付けるようにして、樹脂板１４と底板１６とを溶着、あるいはビス止めするなどして、シールと担体１８の固定を行うようにするとよい。

また、図３に示すような粒状の担体１８をウエル１２内に固定するには、例えば図５に示すように、ネット状の押さえ部材２４により、粒状の担体１８が抜け出ないように押さえ、押さえ部材２４の周縁部を樹脂板１４と底板１６とで挟み込み、樹脂板１４と底板１６とを溶着してシールと担体１８の固定を行うようにするとよい。
あるいは、適宜な接着剤を用いて、担体１８をウエル１２内底部に固定するようにしてもよい。

上記のように、スリット１９を形成した担体１８や、粒状にした担体１８を用いると、検鏡観察が可能となる他、担体１８の表面積が増え、細胞が付着する面積が増えるので一層良好な細胞培養が行える。

図６は、担体１８表面のＳＥＭ写真である。
前記のように、カーボン複合体の表面を加熱酸化処理等することによって、カーボン複合体の表面にスタックタイプＣＮＴの一部を露出させることができる。スタックタイプＣＮＴは、カーボン複合体にアトランダムな方向を向いて取り込まれている。したがって、カーボン複合体の表面に露出するスタックタイプＣＮＴは、その端部の空洞部がそのまま現れる状態のもの（図６における白い輪郭の空洞部）と、スタックタイプＣＮＴが斜めになっている場合には、その表面が露出し、したがって炭素網層の端面（エッジ）が露出するような状態で現れるものとがある。
また、スタックタイプＣＮＴ同士の間にも、炭化した微細な樹脂粒子間に極めて微細な空洞ができる（図６における黒い空洞）。

細胞２０は、担体１８の表面に露出したスタックタイプＣＮＴを足場として成長する。
通常の細胞培養では、培養液はフェノールレッドなどの色素によってピンク色を呈し、培養が進展するにつれて黄色に変色する。このように培養液が黄色に変色するのは、細胞由来の老廃物（尿素など）が培養液中に排出されるからであり、老廃物が培養液中に増加してくると、培養液の栄養成分が細胞に取り込まれにくくなり、細胞培養に悪影響がでる。

しかるに、本実施の形態における上記担体１８を用いた場合、培養液は細胞培養が進展するにつれて無色となることが確認されている。
これは、細胞由来の老廃物が、スタックタイプＣＮＴの空洞内、あるいは炭化した微細な樹脂粒子間の隙間内に吸着されて取り込まれ、培養液中に混ざらないからと考えられる。これにより、細胞培養が良好に行われ、増殖率が向上し、また細胞が長期間生存することができ、細胞の利用可能期間が延びる利点がある。

細胞は、スタックタイプＣＮＴの空洞や、炭化粒子間の隙間よりも十分に大きいからこれら空洞内や隙間内には入り込まない。そして、スタックタイプＣＮＴは炭化した樹脂粒子により結着、固定化されているので、細胞を分離した際に細胞に付着してくることがなく、細胞のみを有効に利用可能となる。
分離は、通常のピペッティングやトリプシンなどの酵素を用いて容易に行うことができる。
なお、培養容器１０は再利用が可能である。

細胞には、敏感で感受性が強く、アポトーシスを誘導することで知られるMolt−４（リンパ芽球）を用いた。
担体は、樹脂との混合材料におけるスタックタイプＣＮＴ含有量が４０ｗｔ％のものと、８０ｗｔ％のものを用いた。
培養液は、ＫＢＭ４５０あるいはＲＰＭＩにＦＢＳを１０ｗｔ％添加したものを用い、培養器は２４wellplateのものを用い、細胞数は１０×１０⁴個/ｍｌに調整し、これを２ｍｌ/wellで各wellに収容し、３７℃、０．５％ＣＯ₂の培養条件で培養した。細胞数・生存率の測定は、培養６日目、８日目、１１日目、１４日目に、トリパンブルー染色後、血球計算板によった。その結果を図８に示す。
図８において、Contは、本担体１８を用いず、従来の一般的な担体を用いた場合（対象区）、４０ＣＣＣ−Ｎ−Ｈ３０、８０ＣＣＣ−Ｎ−Ｈ３０は、それぞれ、スタックタイプＣＮＴが上記４０ｗｔ％、８０ｗｔ％のもので、研削処理無し（Ｎ）、５００℃での高温熱酸化処理３０分（Ｈ３０）の担体を用いて培養したものである。
図７から明らかなように、本担体１８を用いた場合、対象区に比較して、細胞数が約２０％も多く増殖され、また対象区の細胞よりも２〜３日長期に亘って生存していることがわかる。
なお、担体からの細胞の分離は良好に行えた。

上記実施の形態では、焼成、表面処理して形成した担体１８そのものをウエル内に固定した培養治具を用いたが、図８に示すように、担体１８を棒状あるいは粒状に形成して、これを樹脂プレート２６やフィルム上に熱圧着により固定したり、ネットで覆って固定したり、あるいは接着剤を用いて固定し、この樹脂プレート２６やフィルムを培養治具の培養液や細胞が接触する部位に配置するようにして用いてもよい。このように、樹脂プレート２６やフィルム上に担体を固定することによって、担体が割れたり壊れたりすることがなく、取り扱い性が向上し、また所定部位への取り付けも容易に行えるようになる。

また、上記実施の形態では、培養治具として、ウエルプレートを示したが、組織培養フラスコ、ローラーボトル等の、あらゆる細胞培養用治具に適用できることはもちろんである。

また、上記実施の形態では、スタックタイプＣＮＴを用いたが、このスタックタイプＣＮＴの代わりに微粉化した活性炭を用いてもよい。
活性炭は、微細な細孔を有している。この細孔は、入り口側がμｍ（ミクロン）サイズの比較的大きな径をなし、奥にいくと枝分かれをしており、ｎｍ（ナノ）サイズの微細な細孔となっている。したがって、活性炭を微粉状に粉砕したものにすることにより、入り口側から既にナノサイズの径となる細孔を有するものに調整できる。

この微粉化された活性炭と、樹脂との混合材料を上記と同様に焼成し、樹脂を炭化させてカーボン複合体を形成し、このカーボン複合体の表面を上記と同様に表面処理して、表面に活性炭の一部を露出させるようにして細胞培養用担体とすることができる。
前記混合材料に対する活性炭の含有量も上記と同様に３０〜９０ｗｔ％程度が好適である。
また、前記カーボン複合体に上記と同様にして酸化性雰囲気中での加熱酸化処理の表面処理を施すようにすることができる。

この活性炭を用いた担体も、表面に活性炭の細孔と、炭化した樹脂粒子間の微細な隙間とを有するから、細胞培養時、細胞由来の老廃物を吸着し、培養液中への混ざりこみを防止できるので、良好な細胞培養が行える。

培養治具（ウエルプレート）の説明断面図である。 スリットを形成した状態の担体の説明図である。 粒状に形成した状態の担体の説明図である。 担体をＯリングを用いて固定した状態を示す説明図である。 担体をネット状の押さえ部材により固定した状態を示す説明図である。 担体表面のＳＥＭ写真である。 細胞培養の細胞増殖状態と培養日数を示すグラフである。 担体を樹脂プレートあるいはフィルム上に固定した状態を示す説明図である。

符号の説明

１０ 培養容器（治具）
１２ ウエル堆積層
１２ａ 貫通孔
１４ 樹脂板
１６ 底板
１８ 担体
２０ 細胞
２２ Ｏリング
２４ 押さえ部材
２６ 樹脂プレート

Claims (8)

1. 気相成長法による炭素繊維であって、底の無いカップ形状をなす炭素網層が積層し、該積層した炭素網層の端面が表面に露出しているカーボンナノチューブと、樹脂との混合材料が焼成され、樹脂が炭化されたカーボン複合体からなり、該カーボン複合体の表面が表面処理されて、表面に前記カーボンナノチューブの一部が露出されてなることを特徴とする細胞培養用担体。
2. 前記混合材料に対する前記カーボンナノチューブの含有量が３０〜９０ｗｔ％であることを特徴とする請求項１記載の細胞培養用担体。
3. 微粉化された活性炭と、樹脂との混合材料が焼成され、樹脂が炭化されたカーボン複合体からなり、該カーボン複合体の表面が表面処理されて、表面に前記活性炭の一部が露出されてなることを特徴とする細胞培養用担体。
4. 前記混合材料に対する前記活性炭の含有量が３０〜９０ｗｔ％であることを特徴とする請求項３記載の細胞培養用担体。
5. 前記カーボン複合体に酸化性雰囲気中での加熱酸化処理の表面処理が施されてカーボンナノチューブが表面に露出されていることを特徴とする請求項１または２記載の細胞培養用担体。
6. 前記カーボン複合体に酸化性雰囲気中での加熱酸化処理の表面処理が施されて活性炭が表面に露出されていることを特徴とする請求項３または４記載の細胞培養用担体。
7. 請求項１〜６いずれか１項記載の細胞培養用担体が、培養液および細胞の接触する部位に固定されていることを特徴とする細胞培養用治具。
8. 請求項７に記載の細胞培養用治具を用いて細胞培養を行うことを特徴とする細胞培養方法。