JP2006223251A - Cartridge for extraction of nucleic acid - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、核酸を含む試料溶液から該核酸を自動抽出する核酸抽出装置に供される核酸抽出用のカートリッジに関する。 The present invention relates to a cartridge for nucleic acid extraction used in a nucleic acid extraction apparatus for automatically extracting nucleic acid from a sample solution containing nucleic acid.
現在、ポストゲノム（post-genome）の研究等のため、ＤＮＡやＲＮＡの自動抽出処理を行う自動核酸抽出システムが提案されている（例えば、下記特許文献１）。 Currently, an automatic nucleic acid extraction system that performs an automatic extraction process of DNA or RNA has been proposed for post-genome research or the like (for example, Patent Document 1 below).
図５は、自動核酸抽出システムの概略を示す図である。
自動核酸抽出システム１００は、複数のカートリッジ１０４を配列させた状態で保持するカートリッジホルダ１０３と、カートリッジ１０４に加圧エアを供給する加圧ノズル１０１と、該加圧ノズル１０１を保持し、カートリッジ１０４の配列方向に移動可能な移動ヘッド１０２とを備えている。また、自動核酸抽出システム１００には、カートリッジ１０４に設けられた吸着媒体に一旦吸着された核酸を回収液によって回収する工程で、カートリッジ１０４から排出された該回収液を回収する回収容器１０６と、回収容器１０６を保持するラック１０５とが備えられている。
このような自動核酸抽出システム１００では、分注ノズルから核酸を含む試料溶液や洗浄液や回収液等の溶液をカートリッジ１０４に分注した後、加圧ノズル１０１をカートリッジ１０４の開放側端部に押圧させ、加圧ノズル１０１からカートリッジ１０４の内部に加圧エアを供給することで、溶液を吸着媒体に通過させ、カートリッジ１０４から回収容器１０６や図示しない廃液容器に排出する。
FIG. 5 is a diagram showing an outline of an automatic nucleic acid extraction system.
The automatic nucleic
In such an automatic nucleic
ところで、従来、図５に示す核酸抽出システム１００のように、回収液を分注する際にカートリッジ１０４の空気流入口に加圧ノズル１０１を上方から圧力を加えつつ、該空気流入口に図示しないキャップを取り付けてカートリッジ１０４の内部を加圧密閉する構成において、ろ過フィルタの面積を増加させることで処理液量を増加させたいという要望があり、カートリッジ１０４の断面積を従来よりも大きくすることが検討されている。
Conventionally, as in the nucleic
一方、上記のような従来の構成では、仮に、カートリッジ１０４の断面積を拡大することに伴い径ｄを大きくすると、加圧密閉する際のカートリッジ１０４のキャップにかかる加圧力も断面積の拡大に比例して増加するため、装置の構造、強度を向上するように変更する必要がある。
On the other hand, in the conventional configuration as described above, if the diameter d is increased as the cross-sectional area of the
また、加圧ノズル１０１をゴム製のものを使用し、図６に示すように、フィルタＦから核酸抽出する際に、該加圧ノズル１０１をカートリッジ１０４の空気流入口に押圧させてエアを送る構造の場合には、加圧ノズル１０１を空気流入口に押圧させる押圧力をＡとし、エアの圧力をＰとし、カートリッジ１０４の断面積Ｓとすると、加圧ノズル１０１に押圧させる方向に対して反対側に押し上げられる力Ｒ＝Ｐ×Ｓが負荷される。
Further, when the
カートリッジ１０４内の気密性を維持するために、押圧力Ａを押し上げられる力Ｒよりも大きくする必要があり、カートリッジ１０４の断面積Ｓが大きくなるほど押圧力Ａを大きくする必要があった。例えば、断面積Ｓを１０倍とした場合に加圧ノズル１０１にかかる力ＲはＰ×１０×Ｓとなり、押圧力Ａも１０倍とする必要がある。このような押圧力Ａについて装置側だけで対応するには、押圧構造及び駆動を大幅に変更する必要があることが懸念される。
In order to maintain the airtightness in the
このように、カートリッジ１０４の気密性を維持することができるとともに、装置側の構成に大きな変更を行うことなく、径の大きいカートリッジを使用したいといった要望があった。
As described above, there is a demand for maintaining the airtightness of the
本発明は、上記事情に鑑みてなされたもので、その目的は、加圧エア供給時に気密性を維持することができる核酸抽出用のカートリッジを提供することにある。 The present invention has been made in view of the above circumstances, and an object thereof is to provide a cartridge for nucleic acid extraction that can maintain airtightness when pressurized air is supplied.
本発明の上記目的は、試料溶液に含まれる核酸を捕捉し、加圧ノズルから供給される加圧エアによって、分注された溶液を排出し、前記核酸を抽出させる核酸抽出用のカートリッジであって、有底円筒形状を有し、前記核酸を捕捉する核酸吸着性固相担体が底部に配置され、且つ、前記底部に漏斗状の排出部が形成されたカートリッジ本体と、前記カートリッジ本体の開放側端部に固定されるカートリッジキャップとを備え、前記カートリッジキャップに、前記カートリッジ本体より径が小さく、前記加圧ノズルが押圧される円孔状のノズル押圧口が形成されていることを特徴とする核酸抽出用のカートリッジによって達成される。 The object of the present invention is a cartridge for nucleic acid extraction that captures nucleic acid contained in a sample solution, discharges the dispensed solution with pressurized air supplied from a pressure nozzle, and extracts the nucleic acid. A cartridge main body having a bottomed cylindrical shape, a nucleic acid-adsorbing solid phase carrier that captures the nucleic acid is disposed at the bottom, and a funnel-shaped discharge portion formed at the bottom; and opening of the cartridge main body A cartridge cap fixed to a side end portion, wherein the cartridge cap is formed with a circular nozzle pressing port that is smaller in diameter than the cartridge main body and that presses the pressure nozzle. Achieved by a cartridge for nucleic acid extraction.
本発明にかかるカートリッジは、加圧ノズルに押圧される円孔状のノズル押圧口がカートリッジキャップに形成され、該カートリッジキャップがカートリッジ本体に固定されている構成である。そして、核酸吸着性固相担体の面積を大きくすることに伴ってカートリッジ本体の径を大きくする構成としても、該カートリッジキャップに形成されるノズル押圧口の寸法については、カートリッジ本体の径にかかわらず、加圧ノズルに押圧する同じ形状とすることができる。こうすれば、カートリッジ本体の径を大きくすることに伴い、加圧エア供給時においてカートリッジ本体内部の圧力が大きくなったとしても、カートリッジキャップでこの圧力を抑制し、ノズル押圧口に押圧された加圧ノズルにかかる、カートリッジ本体内部から押し上げられる圧力を最小限に抑えることができる。このため、加圧ノズルがカートリッジキャップのノズル押圧口から離れて、カートリッジ本体の内部から加圧エアが漏れ出ることを抑制でき、溶液を確実に排出することができる。 The cartridge according to the present invention has a configuration in which a circular nozzle pressing port that is pressed by the pressure nozzle is formed in the cartridge cap, and the cartridge cap is fixed to the cartridge body. Even when the diameter of the cartridge main body is increased as the area of the nucleic acid-adsorbing solid phase carrier is increased, the size of the nozzle pressing port formed in the cartridge cap is not limited to the diameter of the cartridge main body. The same shape can be applied to the pressure nozzle. In this way, even if the pressure inside the cartridge body increases when the pressurized air is supplied as the diameter of the cartridge body increases, the pressure is suppressed by the cartridge cap and the pressure applied to the nozzle pressing port is increased. It is possible to minimize the pressure applied to the pressure nozzle from the inside of the cartridge main body. For this reason, it can suppress that a pressurization nozzle leaves | separates from the nozzle press opening of a cartridge cap, and pressurization air leaks from the inside of a cartridge main body, and can discharge | release a solution reliably.
上記カートリッジは、カートリッジキャップが、ねじ嵌合によって前記カートリッジ本体に固定されていることが好ましい。
また、上記カートリッジは、カートリッジキャップが、溶着接合によって前記カートリッジ本体に固定されていることが好ましい。
こうすれば、カートリッジキャップとカートリッジ本体との密着力が強固になり、加圧エア供給時にカートリッジ本体とカートリッジキャップとの隙間から加圧エアが漏れ出ることをより確実に防止することができる。
In the cartridge, a cartridge cap is preferably fixed to the cartridge body by screw fitting.
Moreover, it is preferable that the cartridge cap is fixed to the cartridge main body by welding and joining.
In this way, the adhesive force between the cartridge cap and the cartridge body is strengthened, and it is possible to more reliably prevent the pressurized air from leaking from the gap between the cartridge body and the cartridge cap when the pressurized air is supplied.
さらに、上記カートリッジは、ノズル押圧口の直径が５ｍｍから１５ｍｍの範囲であることが好ましい。 Furthermore, the cartridge preferably has a nozzle pressing port with a diameter in the range of 5 mm to 15 mm.
本発明によれば、加圧エア供給時に気密性を維持することができる核酸抽出用のカートリッジを提供できる。 ADVANTAGE OF THE INVENTION According to this invention, the cartridge for nucleic acid extraction which can maintain airtightness at the time of pressurized air supply can be provided.
以下、本発明の実施形態を図面に基づいて詳しく説明する。
図１は、本発明にかかるカートリッジの第１実施形態を示す分解斜視図である。図２は、第１実施形態のカートリッジの断面図である。
Hereinafter, embodiments of the present invention will be described in detail with reference to the drawings.
FIG. 1 is an exploded perspective view showing a first embodiment of a cartridge according to the present invention. FIG. 2 is a cross-sectional view of the cartridge according to the first embodiment.
本発明にかかるカートリッジは、ＤＮＡやＲＮＡの抽出処理に使用され、特に、ＤＮＡやＲＮＡの自動抽出処理を行う核酸抽出装置に用いることができる。核酸抽出処理では、（１）核酸を含む試料溶液をカートリッジに配置された核酸吸着性多孔膜に通過させて、該核酸吸着性多孔性膜内に核酸を吸着させる工程、（２）核酸が吸着させた状態で核酸吸着性多孔性膜を洗浄する工程、（３）該核酸吸着性多孔性膜に回収液を通過させて、核酸吸着性多孔性膜から核酸を分離させて回収する工程を順に行うものである。 The cartridge according to the present invention is used for DNA and RNA extraction processing, and in particular, can be used for a nucleic acid extraction apparatus that performs automatic DNA or RNA extraction processing. In the nucleic acid extraction process, (1) a step of allowing a sample solution containing nucleic acid to pass through a nucleic acid-adsorbing porous membrane disposed in a cartridge and adsorbing the nucleic acid in the nucleic acid-adsorbing porous membrane, (2) adsorbing the nucleic acid A step of washing the nucleic acid-adsorbing porous membrane in a state of being allowed to stand, and (3) a step of passing the recovery liquid through the nucleic acid-adsorbing porous membrane and separating and recovering the nucleic acid from the nucleic acid-adsorbing porous membrane in order Is what you do.
試料溶液や洗浄液や回収液（以下、これらを総称して溶液という。）を分注ノズルによってカートリッジに注入した後、加圧ノズルによってカートリッジ内に加圧エアを供給することで、該カートリッジから溶液を回収容器等に排出する。このように、本発明にかかるカートリッジは、試料溶液に含まれる核酸を核酸吸着性固相担体で捕捉し、加圧ノズルから供給される加圧エアによって、予め分注された溶液を排出し、核酸を抽出させるものである。 A sample solution, a cleaning solution, and a recovery solution (hereinafter collectively referred to as a solution) are injected into the cartridge by a dispensing nozzle, and then pressurized air is supplied into the cartridge by the pressure nozzle, whereby the solution is removed from the cartridge. Is discharged into a collection container. Thus, the cartridge according to the present invention captures the nucleic acid contained in the sample solution with the nucleic acid-adsorbing solid phase carrier, and discharges the pre-dispensed solution by the pressurized air supplied from the pressure nozzle, Nucleic acid is extracted.
図１に示すように、カートリッジ１０は、上方端部が開放され、下方端部が漏斗状に形成された有底円筒形状のカートリッジ本体１１を有している。カートリッジ本体１１は、筒状胴部１１ａと、筒状胴部１１ａの底部の端面中央から外部に延設された細管ノズル状の排出部１１ｂとを有している。排出部１１ｂの内部には排出口１１ｃが開口している。本実施形態では、筒状胴部１１ａの直径を、５ｍｍから３０ｍｍとする。
As shown in FIG. 1, the
カートリッジ本体１１の筒状胴部１１ａの底部１１ｄには核酸吸着性多孔膜Ｆが保持されている。核酸吸着性多孔膜Ｆについては後で詳述する。
A nucleic acid-adsorptive porous membrane F is held on the
筒状胴部１１ａの開放側端部の外周面にはねじ溝１１ｅが形成されている。
A
また、カートリッジ１０は、カートリッジ本体１１の開放側端部に固定されるカートリッジキャップ１２を備えている。カートリッジキャップ１２は、円盤状の天板部１２ａと、天板部１２ａの一方の面（図１において下側の面）から略垂直に立設された環状の側板部１２ｂと、天板部１２ａの他方の面（図１において上側の面）から上方に突出するリブ１２ｃとを有している。リブ１２ｃには上方から下方に連通するように開口する、上面視において円形状のノズル押圧口が形成されている。ここで、ノズル押圧口の直径を、５ｍｍから１５ｍｍの範囲とすることが好ましい。
The
カートリッジキャップ１２の側板部１２ｂの内周面には、ねじ溝１２ｄが形成されている。
A
カートリッジキャップ１２をカートリッジ本体１１に固定するには、カートリッジキャップ１２の側板部１２ｂをカートリッジ本体１１の開放側端部に嵌め込み、側板部１２の内周面に形成されたねじ溝１２ｄをカートリッジ本体１１のねじ溝１１ｅにねじ嵌合させる。こうすることで、カートリッジキャップ１２をカートリッジ本体１１に固定することができる。
In order to fix the
加圧エア供給時には、加圧ノズル１６をカートリッジキャップ１２の上方から下降させ、ノズル先端部１６ａをカートリッジキャップ１２におけるリブ１２ｃのノズル押圧口に押圧させる。このとき、ノズル先端部１６ａとノズル押圧口との間が完全に密着して該ノズル先端部１６ａから供給される加圧エアが漏れ出ることがないように、ノズル押圧口がノズル先端部１６ａの最先端の径より僅かに大きく且つ該ノズル先端部１６ａの基端側の径より僅かに小さくなるように形成されることによって、ノズル先端部１６の先端側における一部がリブ１２ｃの内部に嵌め込まれた状態で密着する。
When supplying pressurized air, the
カートリッジ１０は、加圧ノズル１６に押圧される円孔状のノズル押圧口がカートリッジキャップ１２に形成され、該カートリッジキャップ１２がカートリッジ本体１１に固定されている構成である。そして、核酸吸着性固相担体Ｆの面積を大きくすることに伴ってカートリッジ本体１１の径を大きくする構成としても、カートリッジキャップ１２に形成されるノズル押圧口の寸法については、カートリッジ本体１１の径にかかわらず、ノズル押圧口に押圧する加圧ノズル１６と常に同じ形状とすることができる。こうすれば、カートリッジ本体１１の径を大きくすることに伴い、加圧エア供給時においてカートリッジ本体１１内部の圧力が大きくなったとしても、カートリッジキャップ１２でこの圧力を抑制し、ノズル押圧口に押圧された加圧ノズルにかかる、カートリッジ本体１１の内部から押し上げられる圧力を最小限に抑えることができる。このため、加圧ノズル１６がカートリッジキャップ１２のノズル押圧口から離れて、カートリッジ本体１１の内部から加圧エアが漏れ出ることを抑制でき、溶液を確実に排出することができる。
The
また、カートリッジ１０は、カートリッジキャップ１２が、ねじ溝１１ｅ，１２ｄ同士のねじ嵌合によってカートリッジ本体１１に固定されているため、カートリッジキャップ１２とカートリッジ本体１１との密着力が強固になり、加圧エア供給時にカートリッジ本体１１とカートリッジキャップ１２との隙間から加圧エアが漏れ出ることをより確実に防止することができる。
Further, since the
次に、本発明にかかる第２実施形態を示す。図３は、第２実施形態のカートリッジを示す分解斜視図である。図４は、本実施形態のカートリッジの断面図である。なお、以下に説明する実施形態において、すでに説明した部材などと同等な構成・作用を有する部材等については、図中に同一符号又は相当符号を付すことにより、説明を簡略化或いは省略する。
本実施形態のカートリッジ２０は、カートリッジ本体２１とカートリッジキャップ２２とを溶着によって固定する構成である。
Next, 2nd Embodiment concerning this invention is shown. FIG. 3 is an exploded perspective view showing the cartridge of the second embodiment. FIG. 4 is a cross-sectional view of the cartridge of this embodiment. In the embodiments described below, members having the same configuration / action as those already described are denoted by the same or corresponding reference numerals in the drawings, and description thereof is simplified or omitted.
The
カートリッジ２０は、上記実施形態と基本的に同じ構成のカートリッジ本体２１を備えているが、カートリッジ本体２１には開放側端部にねじ溝１１ｅが形成されていない。
The
また、カートリッジキャップ２２は、円盤状の天板部２２ａと、該天板部２２ａの中央に突出するリブ２２ｃとを有し、上記実施形態のカートリッジキャップ１２における側板部１２ｂを有していない形状である。
The
本実施形態では、カートリッジキャップ２２の天板部２２ａの下面周縁をカートリッジ本体２１の筒状胴部２１ａの上端部に溶着させることで固定する。
In the present embodiment, the lower surface periphery of the
溶着の手段としては、例えば、熱溶着や超音波溶着である。熱溶着は、加熱部材をカートリッジ本体１１の筒状胴部１１ａ及びカートリッジキャップ１２の溶着部位に当接させて、溶融させ、その後、両者の溶融した部位同士を押し合わせて冷却する手段がある。また、超音波溶着は、カートリッジ本体１１の筒状胴部１１ａ及びカートリッジキャップ１２の溶着部位のいずれかに、微細な突部を設け、超音波溶着機のホーンをカートリッジキャップ１２の上面から当接させ、超音波振動を加えることで、突部を振動による摩擦熱によって溶融させ、カートリッジ本体１１とカートリッジキャップ１２とを接合する手段である。
Examples of the welding means include thermal welding and ultrasonic welding. The thermal welding includes means for bringing the heating member into contact with the
カートリッジ２０は、加圧ノズル１６に押圧される円孔状のノズル押圧口がカートリッジキャップ２２に形成され、該カートリッジキャップ２２がカートリッジ本体２１に固定されている構成である。そして、核酸吸着性固相担体Ｆの面積を大きくすることに伴ってカートリッジ本体２１の径を大きくする構成としても、カートリッジキャップ２２に形成されるノズル押圧口の寸法については、カートリッジ本体２１の径にかかわらず、ノズル押圧口に押圧する加圧ノズル１６と常に同じ形状とすることができる。こうすれば、カートリッジ本体２１の径を大きくすることに伴い、加圧エア供給時においてカートリッジ本体２１内部の圧力が大きくなったとしても、カートリッジキャップ２２でこの圧力を抑制し、ノズル押圧口に押圧された加圧ノズルにかかる、カートリッジ本体２１の内部から押し上げられる圧力を最小限に抑えることができる。このため、加圧ノズル１６がカートリッジキャップ２２のノズル押圧口から離れて、カートリッジ本体２１の内部から加圧エアが漏れ出ることを抑制でき、溶液を確実に排出することができる。
The
また、カートリッジ２０は、カートリッジキャップ２２が、溶着嵌合によってカートリッジ本体２１に固定されているため、カートリッジキャップ２２とカートリッジ本体２１との密着力が強固になり、加圧エア供給時にカートリッジ本体２１とカートリッジキャップ２２との隙間から加圧エアが漏れ出ることをより確実に防止することができる。
In addition, since the
次に、上記実施形態のカートリッジが備える核酸吸着性多孔膜（核酸吸着性多孔質体）について詳細に説明する。
前記カートリッジに内有する核酸吸着性多孔膜は、基本的には核酸が通過可能な多孔性であり、その表面は試料溶液中の核酸を化学的結合力で吸着する特性を有し、洗浄液による洗浄時にはその吸着を保持し、回収液による回収時に核酸の吸着力を弱めて離すように構成されてなる。
Next, the nucleic acid-adsorptive porous membrane (nucleic acid-adsorptive porous body) provided in the cartridge of the above embodiment will be described in detail.
The nucleic acid-adsorbing porous membrane contained in the cartridge is basically porous so that the nucleic acid can pass through, and its surface has a characteristic of adsorbing the nucleic acid in the sample solution with a chemical binding force, and is washed with a washing solution. In some cases, the adsorption is retained and the nucleic acid adsorption force is weakened and separated during the recovery by the recovery liquid.
前記核酸抽出カートリッジに内有する核酸吸着性多孔膜は、イオン結合が実質的に関与しない相互作用で核酸が吸着する多孔性膜であることを特徴とする。これは、多孔性膜側の使用条件で「イオン化」していないことを意味し、環境の極性を変化させることで、核酸と多孔性膜が引き合うようになると推定される。これにより分離性能に優れ、しかも洗浄効率よく、核酸を単離精製することができる。好ましくは、核酸吸着性多孔性膜は、親水基を有する多孔性膜であり、環境の極性を変化させることで、核酸と多孔性膜の親水基同士が引きあるようになると推定される。 The nucleic acid-adsorbing porous membrane contained in the nucleic acid extraction cartridge is a porous membrane that adsorbs nucleic acids by an interaction that does not substantially involve ionic bonds. This means that it is not “ionized” under the usage conditions on the porous membrane side, and it is presumed that the nucleic acid and the porous membrane come to attract each other by changing the polarity of the environment. As a result, the nucleic acid can be isolated and purified with excellent separation performance and good washing efficiency. Preferably, the nucleic acid-adsorptive porous membrane is a porous membrane having a hydrophilic group, and it is presumed that the hydrophilic group of the nucleic acid and the porous membrane are attracted to each other by changing the polarity of the environment.
親水基を有する多孔性膜とは、多孔性膜を形成する材料自体が、親水性基を有する多孔性膜、または多孔性膜を形成する材料を処理またはコーティングすることによって親水基を導入した多孔性膜を意味する。多孔性膜を形成する材料は有機物、無機物のいずれでも良い。例えば、多孔性膜を形成する材料自体が親水基を有する有機材料である多孔性膜、親水基を持たない有機材料の多孔性膜を処理して親水基を導入した多孔性膜、親水基を持たない有機材料の多孔性膜に対し親水基を有する材料でコーティングして親水基を導入した多孔性膜、多孔性膜を形成する材料自体が親水基を有する無機材料である多孔性膜、親水基を持たない無機材料の多孔性膜を処理して親水基を導入した多孔性膜、親水基を持たない無機材料の多孔性膜に対し親水基を有する材料でコーティングして親水基を導入した多孔性膜などを使用することができるが、加工の容易性から、多孔性膜を形成する材料は有機高分子などの有機材料を用いることが好ましい。 A porous membrane having a hydrophilic group is a porous membrane in which a porous membrane is introduced by treating or coating a porous membrane having a hydrophilic group or a material forming a porous membrane. It means a sex membrane. The material for forming the porous film may be either organic or inorganic. For example, a porous film in which the material forming the porous film itself is an organic material having a hydrophilic group, a porous film in which a hydrophilic group is introduced by treating a porous film of an organic material having no hydrophilic group, A porous film in which a hydrophilic group is introduced by coating a porous film made of an organic material that does not have a hydrophilic group, a porous film in which the material forming the porous film itself is an inorganic material having a hydrophilic group, hydrophilic Porous membranes with hydrophilic groups introduced by treating porous membranes of inorganic materials that do not have groups, and inorganic groups without inorganic groups coated with materials having hydrophilic groups to introduce hydrophilic groups A porous film or the like can be used, but an organic material such as an organic polymer is preferably used as a material for forming the porous film from the viewpoint of ease of processing.
親水基とは、水との相互作用を持つことができる有極性の基（原子団）を指し、核酸の吸着に関与する全ての基（原子団）が当てはまる。親水基としては、水との相互作用の強さが中程度のもの（化学大事典、共立出版株式会社発行、「親水基」の項の「あまり親水性の強くない基」参照）が良く、例えば、水酸基、カルボキシル基、シアノ基、オキシエチレン基、アミノ基、アミド基などを挙げることができる。好ましくは水酸基である。 The hydrophilic group refers to a polar group (atomic group) capable of interacting with water, and all groups (atomic groups) involved in nucleic acid adsorption are applicable. As the hydrophilic group, one having a moderate interaction with water is good (see Chemical Encyclopedia, Kyoritsu Shuppan Co., Ltd., “Hydrophilic group”, “Group that is not very hydrophilic”), Examples thereof include a hydroxyl group, a carboxyl group, a cyano group, an oxyethylene group, an amino group, and an amide group. Preferably it is a hydroxyl group.
本発明で実施可能な親水基を有する多孔性膜としては、アミド基を有する有機材料の多孔性膜を挙げることができる。アミド基を有する有機材料としては、ポリアミドを好ましく用いることができる。ポリアミドとしては、フィブロイン、ポリアミノ酸、ポリペプチド、ポリアクリルアミド、ナイロン４６、ナイロン６６、ナイロン６１０、ナイロン６１２、ナイロン６、ナイロン７、ナイロン１１、ナイロン１２が挙げられるが特にこれらに限定されることはない。また、N-メチル変性ナイロン、N-アルコキシメチル変性ナイロン、N-アルキルチオメチル変性ナイロン等の変性ナイロンも用いることができる。ポリアミドの多孔性膜については、米国特許第２,７８３,８９４号、同第３，４０８，３１５号、同第４，３４０，４７９号、同第４，３４０，４８０号、同第４，４５０，１２６号、ドイツ特許ＤＥ３,１３８,５２５号、特開昭５８−３７８４２号等に記載の原料、方法で得られるものを使用することができるが、これらに限定されるものではない。
Examples of the porous film having a hydrophilic group that can be used in the present invention include a porous film of an organic material having an amide group. As the organic material having an amide group, polyamide can be preferably used. Examples of the polyamide include fibroin, polyamino acid, polypeptide, polyacrylamide, nylon 46, nylon 66, nylon 610, nylon 612, nylon 6, nylon 7,
本発明で実施可能な水酸基を有する有機材料の多孔性膜としては、ポリヒドロキシエチルアクリル酸、ポリヒドロキシエチルメタアクリル酸、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、ポリオキシエチレン、アセチルセルロース、アセチル価の異なるアセチルセルロース混合物等の多糖類で、形成された多孔性膜を挙げることができるが、特に多糖構造を有する有機材料の多孔性膜を好ましく使用することができる。 Examples of the porous film of an organic material having a hydroxyl group that can be used in the present invention include polyhydroxyethyl acrylic acid, polyhydroxyethyl methacrylic acid, polyvinyl alcohol, polyvinyl pyrrolidone, polyacrylic acid, polymethacrylic acid, polyoxyethylene, acetyl Examples of the porous membrane formed include polysaccharides such as cellulose and acetylcellulose mixtures having different acetyl values. Particularly, a porous membrane made of an organic material having a polysaccharide structure can be preferably used.
さらに、有する多孔性膜の有機材料としては、ビニルアシレートの重合体の鹸化物、または少なくともビニルアシレートのモノマーユニットを含む２種類以上のモノマー共重合体の鹸化物についても好ましく用いることができる。また、前記ビニルアシレートの重合体の鹸化物、または少なくとも１ｍｏｌ％以上のビニルアシレートのモノマーユニットを含む２種類以上のモノマー共重合体の鹸化物の鹸化率が１％以上であることが好ましく、さらに前記ビニルアシレートのアシル基がアセチル基、プロピオニル基、ブチロイル基、バレル基、ペプタノイル基、オクタノイル基、デカノイル基、ドデカノイル基、トリデカノイル基、ヘキサデカノイル基、オクタデカノイル基の少なくとも一つ以上から選ばれることが好ましい。 Further, as the organic material of the porous membrane, a saponified product of a vinyl acylate polymer or a saponified product of two or more kinds of monomer copolymers containing at least a vinyl acylate monomer unit can be preferably used. . The saponification rate of the saponified product of the vinyl acylate polymer or the saponified product of two or more monomer copolymers containing at least 1 mol% or more of vinyl acylate monomer units is preferably 1% or more. Further, the acyl group of the vinyl acylate is at least one of acetyl group, propionyl group, butyroyl group, barrel group, peptanoyl group, octanoyl group, decanoyl group, dodecanoyl group, tridecanoyl group, hexadecanoyl group, and octadecanoyl group. It is preferable to be selected from the above.
前記の多糖構造としては、セルロース、ヘミセルロース、デキストラン、アガロース、デキストリン、アミロース、アミロペクチン、デンプン、グリコーゲン、プルラン、マンナン、グルコマンナン、リケナン、イソリケナン、ラミナラン、カラギーナン、キシラン、フルクタン、アルギン酸、ヒアルロン酸、コンドロイチン、キチン、キトサン等を挙げることができ、さらに前記いずれかの多糖構造の誘導体についても挙げることができ、特にエステル誘導体が好ましく用いることができる。多糖構造およびその誘導体であれば前記に挙げた材料に限定されることはない。
また、前記いずれかの多糖構造のエステル誘導体の鹸化物についてもさらに好ましく用いることができる。
Examples of the polysaccharide structure include cellulose, hemicellulose, dextran, agarose, dextrin, amylose, amylopectin, starch, glycogen, pullulan, mannan, glucomannan, lichenan, isolikenan, laminaran, carrageenan, xylan, fructan, alginic acid, hyaluronic acid, chondroitin , Chitin, chitosan and the like, and any of the aforementioned polysaccharide structure derivatives, and ester derivatives can be preferably used. The polysaccharide materials and derivatives thereof are not limited to the materials listed above.
Further, saponified products of ester derivatives having any of the above polysaccharide structures can be more preferably used.
前記多糖構造のエステル誘導体のエステルとしては、カルボン酸エステル、硝酸エステル、硫酸エステル、スルホン酸エステル、リン酸エステル、ホスホン酸エステル、ピロリン酸エステルのいずれか一つ以上から選ばれることが好ましい。また、前記いずれかの多糖構造の、カルボン酸エステル、硝酸エステル、硫酸エステル、スルホン酸エステル、リン酸エステル、ホスホン酸エステル、ピロリン酸エステルの鹸化物についてもさらに好ましく用いることができる。 The ester of the ester derivative having a polysaccharide structure is preferably selected from any one or more of carboxylic acid ester, nitrate ester, sulfate ester, sulfonate ester, phosphate ester, phosphonate ester, and pyrophosphate ester. Further, saponified products of any of the above-mentioned polysaccharide structures, such as carboxylic acid esters, nitrate esters, sulfate esters, sulfonate esters, phosphate esters, phosphonate esters, and pyrophosphate esters, can be further preferably used.
前記いずれかの多糖構造のカルボン酸エステルとしては、アルキルカルボニルエステル、アルケニルカルボニルエステル、芳香族カルボニルエステル、芳香族アルキルカルボニルエステルのいずれか一つ以上から選ばれることが好ましい。また、前記いずれかの多糖構造のアルキルカルボニルエステル、アルケニルカルボニルエステル、芳香族カルボニルエステル、芳香族アルキルカルボニルエステルの鹸化物についてもさらに好ましく用いることができる。 The carboxylic acid ester having any polysaccharide structure is preferably selected from any one or more of alkyl carbonyl ester, alkenyl carbonyl ester, aromatic carbonyl ester, and aromatic alkyl carbonyl ester. Furthermore, saponified products of any of the above-mentioned polysaccharide-structured alkylcarbonyl esters, alkenylcarbonyl esters, aromatic carbonyl esters, and aromatic alkylcarbonyl esters can be further preferably used.
前記いずれかの多糖構造のアルキルカルボニルエステルのエステル基としては、アセチル基、プロピオニル基、ブチロイル基、バレル基、ペプタノイル基、オクタノイル基、デカノイル基、ドデカノイル基、トリデカノイル基、ヘキサデカノイル基、オクタデカノイル基のいずれか一つ以上から選ばれることが好ましい。また、前記アセチル基、プロピオニル基、ブチロイル基、バレル基、ペプタノイル基、オクタノイル基、デカノイル基、ドデカノイル基、トリデカノイル基、ヘキサデカノイル基、オクタデカノイル基のいずれか一つ以上から選ばれるエステル基を持つ前記いずれかの多糖構造の鹸化物についてもさらに好ましく用いることができる。 Examples of the ester group of the alkylcarbonyl ester having any polysaccharide structure include acetyl group, propionyl group, butyroyl group, barrel group, peptanoyl group, octanoyl group, decanoyl group, dodecanoyl group, tridecanoyl group, hexadecanoyl group, octadecanoyl group, octadecanoyl group, and octadecanoyl group. It is preferably selected from any one or more of noyl groups. Further, an ester group selected from any one or more of the acetyl group, propionyl group, butyroyl group, barrel group, peptanoyl group, octanoyl group, decanoyl group, dodecanoyl group, tridecanoyl group, hexadecanoyl group and octadecanoyl group Any of the polysaccharide saponified products having the above can also be preferably used.
前記いずれかの多糖構造のアルケニルカルボニルエステルのエステル基がアクリル基、メタクリル基のいずれか一つ以上から選ばれることが好ましい。また、前記アクリル基、メタクリル基のいずれか一つ以上から選ばれるエステル基を持つ前記いずれかの多糖構造の鹸化物についてもさらに好ましく用いることができる。 It is preferable that the ester group of the alkenylcarbonyl ester having any polysaccharide structure is selected from one or more of an acryl group and a methacryl group. Moreover, the saponified product of any one of the polysaccharide structures having an ester group selected from any one or more of the acryl group and the methacryl group can be further preferably used.
前記いずれかの多糖構造の芳香族カルボニルエステルのエステル基がベンゾイル基、ナフタロイル基の少なくとも一つ以上から選ばれることが好ましい。また、前記ベンゾイル基、ナフタロイル基の少なくとも一つ以上から選ばれるエステル基を持つ前記いずれかの多糖構造の鹸化物についてもさらに好ましく用いることができる。 It is preferable that the ester group of the aromatic carbonyl ester having any one of the polysaccharide structures is selected from at least one of a benzoyl group and a naphthaloyl group. Further, any of the polysaccharide structure saponified products having an ester group selected from at least one of the benzoyl group and naphthaloyl group can be used more preferably.
前記いずれかの多糖構造の硝酸エステルとしては、ニトロセルロース、ニトロヘミセルロース、ニトロデキストラン、ニトロアガロース、ニトロデキストリン、ニトロアミロース、ニトロアミロペクチン、ニトログリコーゲン、ニトロプルラン、ニトロマンナン、ニトログルコマンナン、ニトロリケナン、ニトロイソリケナン、ニトロラミナラン、ニトロカラギーナン、ニトロキシラン、ニトロフルクタン、ニトロアルギン酸、ニトロヒアルロン酸、ニトロコンドロイチン、ニトロキチン、ニトロキトサンなどを好ましく用いることができる。
また、前記、ニトロセルロース、ニトロヘミセルロース、ニトロデキストラン、ニトロアガロース、ニトロデキストリン、ニトロアミロース、ニトロアミロペクチン、ニトログリコーゲン、ニトロプルラン、ニトロマンナン、ニトログルコマンナン、ニトロリケナン、ニトロイソリケナン、ニトロラミナラン、ニトロカラギーナン、ニトロキシラン、ニトロフルクタン、ニトロアルギン酸、ニトロヒアルロン酸、ニトロコンドロイチン、ニトロキチン、ニトロキトサンなどの鹸化物についてもさらに好ましく用いることができる。
Nitric esters of any of the above polysaccharide structures include nitrocellulose, nitrohemicellulose, nitrodextran, nitroagarose, nitrodextrin, nitroamylose, nitroamylopectin, nitroglycogen, nitropullulan, nitromannan, nitroglucomannan, nitrolicenan, Sorikenan, nitrolaminaran, nitrocarrageenan, nitroxylan, nitrofructan, nitroalginic acid, nitrohyaluronic acid, nitrochondroitin, nitrochitin, nitrochitosan and the like can be preferably used.
In addition, nitrocellulose, nitrohemicellulose, nitrodextran, nitroagarose, nitrodextrin, nitroamylose, nitroamylopectin, nitroglycogen, nitropullulan, nitromannan, nitroglucomannan, nitroligenanan, nitroisoliquenan, nitrolaminaran, nitrocarrageenan Further, saponified products such as nitroxylan, nitrofructan, nitroalginic acid, nitrohyaluronic acid, nitrochondroitin, nitrochitin and nitrochitosan can be used more preferably.
前記いずれかの多糖構造の硫酸エステルとしては、セルロース硫酸、ヘミセルロース硫酸、デキストラン硫酸、アガロース硫酸、デキストリン硫酸、アミロース硫酸、アミロペクチン硫酸、グリコーゲン硫酸、プルラン硫酸、マンナン硫酸、グルコマンナン硫酸、リケナン硫酸、イソリケナン硫酸、ラミナラン硫酸、カラギーナン硫酸、キシラン硫酸、フルクタン硫酸、アルギン酸硫酸、ヒアルロン酸硫酸、コンドロイチン硫酸、キチン硫酸、キトサン硫酸などを好ましく用いることができる。また、前記、セルロース硫酸、ヘミセルロース硫酸、デキストラン硫酸、アガロース硫酸、デキストリン硫酸、アミロース硫酸、アミロペクチン硫酸、グリコーゲン硫酸、プルラン硫酸、マンナン硫酸、グルコマンナン硫酸、リケナン硫酸、イソリケナン硫酸、ラミナラン硫酸、カラギーナン硫酸、キシラン硫酸、フルクタン硫酸、アルギン酸硫酸、ヒアルロン酸硫酸、コンドロイチン硫酸、キチン硫酸、キトサン硫酸などの鹸化物についてもさらに好ましく用いることができる。 Examples of the sulfate ester having a polysaccharide structure include cellulose sulfate, hemicellulose sulfate, dextran sulfate, agarose sulfate, dextrin sulfate, amylose sulfate, amylopectin sulfate, glycogen sulfate, pullulan sulfate, mannan sulfate, glucomannan sulfate, lichenan sulfate, and isolikenan. Sulfuric acid, laminaran sulfate, carrageenan sulfate, xylan sulfate, fructan sulfate, alginate sulfate, hyaluronic acid sulfate, chondroitin sulfate, chitin sulfate, chitosan sulfate and the like can be preferably used. In addition, cellulose sulfate, hemicellulose sulfate, dextran sulfate, agarose sulfate, dextrin sulfate, amylose sulfate, amylopectin sulfate, glycogen sulfate, pullulan sulfate, mannan sulfate, glucomannan sulfate, lichenan sulfate, isolikenane sulfate, laminaran sulfate, carrageenan sulfate, Saponified products such as xylan sulfate, fructan sulfate, alginic acid sulfuric acid, hyaluronic acid sulfuric acid, chondroitin sulfuric acid, chitin sulfuric acid, chitosan sulfuric acid and the like can be further preferably used.
前記いずれかの多糖構造のスルホン酸エステルとしては、アルキルスルホン酸エステル、アルケニルスルホン酸エステル、芳香族スルホン酸エステル、芳香族アルキルスルホン酸エステルのいずれか一つ以上から選ばれることが好ましい。また、前記いずれかの多糖構造のアルキルスルホン酸エステル、アルケニルスルホン酸エステル、芳香族スルホン酸エステル、芳香族アルキルスルホン酸エステルの鹸化物についてもさらに好ましく用いることができる。 The polysaccharide structure sulfonic acid ester is preferably selected from any one or more of alkyl sulfonic acid esters, alkenyl sulfonic acid esters, aromatic sulfonic acid esters, and aromatic alkyl sulfonic acid esters. Furthermore, saponified products of any of the above-described polysaccharide-structured alkyl sulfonates, alkenyl sulfonates, aromatic sulfonates, and aromatic alkyl sulfonates can be more preferably used.
前記いずれかの多糖構造のリン酸エステルとしては、セルロースリン酸、ヘミセルロースリン酸、デキストランリン酸、アガロースリン酸、デキストリンリン酸、アミロースリン酸、アミロペクチンリン酸、グリコーゲンリン酸、プルランリン酸、マンナンリン酸、グルコマンナンリン酸、リケナンリン酸、イソリケナンリン酸、ラミナランリン酸、カラギーナンリン酸、キシランリン酸、フルクタンリン酸、アルギン酸リン酸、ヒアルロン酸リン酸、コンドロイチンリン酸、キチンリン酸、キトサンリン酸などを好ましく用いることができる。また、前記、セルロースリン酸、ヘミセルロースリン酸、デキストランリン酸、アガロースリン酸、デキストリンリン酸、アミロースリン酸、アミロペクチンリン酸、グリコーゲンリン酸、プルランリン酸、マンナンリン酸、グルコマンナンリン酸、リケナンリン酸、イソリケナンリン酸、ラミナランリン酸、カラギーナンリン酸、キシランリン酸、フルクタンリン酸、アルギン酸リン酸、ヒアルロン酸リン酸、コンドロイチンリン酸、キチンリン酸、キトサンリン酸などの鹸化物についてもさらに好ましく用いることができる。 Examples of the phosphate ester having any polysaccharide structure include cellulose phosphate, hemicellulose phosphate, dextran phosphate, agarose phosphate, dextrin phosphate, amylose phosphate, amylopectin phosphate, glycogen phosphate, pullulan phosphate, mannan phosphate. Acids, glucomannan phosphates, lichenan phosphates, isolikenan phosphates, laminaran phosphates, carrageenan phosphates, xylan phosphates, fructan phosphates, alginate phosphates, hyaluronic acid phosphates, chondroitin phosphates, chitin phosphates, chitosan phosphates, etc. Can be used. In addition, cellulose phosphate, hemicellulose phosphate, dextran phosphate, agarose phosphate, dextrin phosphate, amylose phosphate, amylopectin phosphate, glycogen phosphate, pullulan phosphate, mannan phosphate, glucomannan phosphate, lichenan phosphate Further, saponified products such as isolikenan phosphate, laminaran phosphate, carrageenan phosphate, xylan phosphate, fructan phosphate, alginate phosphate, hyaluronic acid phosphate, chondroitin phosphate, chitin phosphate, chitosan phosphate can be used more preferably. .
前記いずれかの多糖構造のホスホン酸エステルとしては、セルロースホスホン酸、ヘミセルロースホスホン酸、デキストランホスホン酸、アガロースホスホン酸、デキストリンホスホン酸、アミロースホスホン酸、アミロペクチンホスホン酸、グリコーゲンホスホン酸、プルランホスホン酸、マンナンホスホン酸、グルコマンナンホスホン酸、リケナンホスホン酸、イソリケナンホスホン酸、ラミナランホスホン酸、カラギーナンホスホン酸、キシランホスホン酸、フルクタンホスホン酸、アルギン酸ホスホン酸、ヒアルロン酸ホスホン酸、コンドロイチンホスホン酸、キチンホスホン酸、キトサンホスホン酸などを好ましく用いることができる。また、前記、セルロースホスホン酸、ヘミセルロースホスホン酸、デキストランホスホン酸、アガロースホスホン酸、デキストリンホスホン酸、アミロースホスホン酸、アミロペクチンホスホン酸、グリコーゲンホスホン酸、プルランホスホン酸、マンナンホスホン酸、グルコマンナンホスホン酸、リケナンホスホン酸、イソリケナンホスホン酸、ラミナランホスホン酸、カラギーナンホスホン酸、キシランホスホン酸、フルクタンホスホン酸、アルギン酸ホスホン酸、ヒアルロン酸ホスホン酸、コンドロイチンホスホン酸、キチンホスホン酸、キトサンホスホン酸などの鹸化物についてもさらに好ましく用いることができる。 Examples of the phosphonic acid ester having any polysaccharide structure include cellulose phosphonic acid, hemicellulose phosphonic acid, dextran phosphonic acid, agarose phosphonic acid, dextrin phosphonic acid, amylose phosphonic acid, amylopectin phosphonic acid, glycogen phosphonic acid, pullulan phosphonic acid, and mannan. Phosphonic acid, glucomannan phosphonic acid, lichenan phosphonic acid, isolikenane phosphonic acid, laminaran phosphonic acid, carrageenan phosphonic acid, xylan phosphonic acid, fructan phosphonic acid, alginic acid phosphonic acid, hyaluronic acid phosphonic acid, chondroitin phosphonic acid, chitin phosphonic acid, Chitosan phosphonic acid and the like can be preferably used. In addition, cellulose phosphonic acid, hemicellulose phosphonic acid, dextran phosphonic acid, agarose phosphonic acid, dextrin phosphonic acid, amylose phosphonic acid, amylopectin phosphonic acid, glycogen phosphonic acid, pullulan phosphonic acid, mannan phosphonic acid, glucomannan phosphonic acid, lichenane phosphonic acid Saponification products such as acid, isollikenan phosphonic acid, laminaran phosphonic acid, carrageenan phosphonic acid, xylan phosphonic acid, fructan phosphonic acid, alginic acid phosphonic acid, hyaluronic acid phosphonic acid, chondroitin phosphonic acid, chitin phosphonic acid, chitosan phosphonic acid Furthermore, it can be preferably used.
前記いずれかの多糖構造のリン酸エステルとしては、セルロースピロリン酸、ヘミセルロースピロリン酸、デキストランピロリン酸、アガロースピロリン酸、デキストリンピロリン酸、アミロースピロリン酸、アミロペクチンピロリン酸、グリコーゲンピロリン酸、プルランピロリン酸、マンナンピロリン酸、グルコマンナンピロリン酸、リケナンピロリン酸、イソリケナンピロリン酸、ラミナランピロリン酸、カラギーナンピロリン酸、キシランピロリン酸、フルクタンピロリン酸、アルギン酸ピロリン酸、ヒアルロン酸ピロリン酸、コンドロイチンピロリン酸、キチンピロリン酸、キトサンピロリン酸などを好ましく用いることができる。また、前記、セルロースピロリン酸、ヘミセルロースピロリン酸、デキストランピロリン酸、アガロースピロリン酸、デキストリンピロリン酸、アミロースピロリン酸、アミロペクチンピロリン酸、グリコーゲンピロリン酸、プルランピロリン酸、マンナンピロリン酸、グルコマンナンピロリン酸、リケナンピロリン酸、イソリケナンピロリン酸、ラミナランピロリン酸、カラギーナンピロリン酸、キシランピロリン酸、フルクタンピロリン酸、アルギン酸ピロリン酸、ヒアルロン酸ピロリン酸、コンドロイチンピロリン酸、キチンピロリン酸、キトサンピロリン酸などの鹸化物についてもさらに好ましく用いることができる。 Examples of the phosphate ester having any polysaccharide structure include cellulose pyrophosphate, hemicellulose pyrophosphate, dextran pyrophosphate, agarose pyrophosphate, dextrin pyrophosphate, amylose pyrophosphate, amylopectin pyrophosphate, glycogen pyrophosphate, pullulan pyrophosphate, mannan Pyrophosphoric acid, glucomannan pyrophosphate, lichenane pyrophosphate, isollichenane pyrophosphate, laminaran pyrophosphate, carrageenan pyrophosphate, xylan pyrophosphate, fructan pyrophosphate, alginate pyrophosphate, hyaluronic acid pyrophosphate, chondroitin pyrophosphate, chitin pyrolin Acid, chitosan pyrophosphate and the like can be preferably used. In addition, cellulose pyrophosphate, hemicellulose pyrophosphate, dextran pyrophosphate, agarose pyrophosphate, dextrin pyrophosphate, amylose pyrophosphate, amylopectin pyrophosphate, glycogen pyrophosphate, pullulan pyrophosphate, mannan pyrophosphate, glucomannan pyrophosphate, Saponified products such as Kenan pyrophosphate, Isolicenan pyrophosphate, Laminaran pyrophosphate, Carrageenan pyrophosphate, Xylan pyrophosphate, Fructan pyrophosphate, Alginate pyrophosphate, Hyaluronic acid pyrophosphate, Chondroitin pyrophosphate, Chitin pyrophosphate, Chitosan pyrophosphate Further, it can be preferably used.
前記いずれかの多糖構造のエーテル誘導体としては、メチルセルロース、エチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、カルボキシエチルセルロース、カルボキシエチル−カルバモイルエチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシエチルメチルセルロース、シアノエチルセルロース、カルバモイルエチルセルロース等を用いることができるが、これらに限定されることはない。好ましくは、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロースを用いることができる。 Examples of the ether derivative having any polysaccharide structure include methylcellulose, ethylcellulose, carboxymethylcellulose, carboxyethylcellulose, carboxyethyl-carbamoylethylcellulose, hydroxymethylcellulose, hydroxyethylcellulose, hydroxypropylcellulose, hydroxypropylmethylcellulose, hydroxyethylmethylcellulose, cyanoethylcellulose, carbamoyl. Although ethyl cellulose etc. can be used, it is not limited to these. Preferably, hydroxymethyl cellulose and hydroxyethyl cellulose can be used.
前記いずれかの多糖構造の水酸基が、任意の置換度でハロゲン化したものについても好ましく用いることができる。 Any of the above-mentioned polysaccharides having a hydroxyl group halogenated with an arbitrary degree of substitution can be preferably used.
前記セルロースエステル誘導体について、以下に記す。前記セルロースエステル誘導体原料のセルロースとしては、綿花リンタや木材パルプ（広葉樹パルプ，針葉樹パルプ）、麻、酢酸菌培養過程で生成するセルロース等の天然セルロース、それらを酸加水分解、機械的に粉砕、爆砕処理、高温下に押出機処理によって重合度を調整したものなどがあり、何れの原料セルロースから得られるセルロースエステル誘導体でも使用でき、場合により混合して使用してもよい。これらの原料セルロースについての詳細な記載は、例えばプラスチック材料講座（１７）繊維素系樹脂（丸澤、宇田著、日刊工業新聞社、１９７０年発行）に見られる。 The cellulose ester derivative is described below. Examples of cellulose used as the cellulose ester derivative raw material include cotton linter, wood pulp (hardwood pulp, conifer pulp), hemp, natural cellulose such as cellulose produced during the cultivation process of acetic acid bacteria, acid hydrolysis, mechanical crushing, and explosion. For example, cellulose ester derivatives obtained from any raw material cellulose can be used, or they may be mixed and used in some cases. Detailed descriptions of these raw material celluloses can be found in, for example, Plastic Material Course (17) Fibrous resin (manufactured by Marusawa and Uda, published by Nikkan Kogyo Shimbun, 1970).
それによると、セルロースの分子量は広範囲であり例えば天然セルロースは６０万〜１５０万（重合度概算３５００〜１万）であり、精製リンタは８万〜５０万（重合度概算５００〜３０００）であり、木材パルプは８万〜１３４万（重合度概算５００〜２１００）である。ここで分子量は、セルロースあるいはその誘導体の強度的性質は大きく影響し、分子量が小さくなるとある重合度から急にその力学的強度が低下するが、本発明の核酸吸着性多孔性膜の原料としては問題なく使用できる。 According to it, the molecular weight of cellulose is wide, for example, natural cellulose is 600,000 to 1,500,000 (degree of polymerization approx. 3500 to 10,000), and purified linter is 80,000 to 500,000 (degree of polymerization approx. 500 to 3000). The wood pulp is 80,000 to 1,340,000 (the degree of polymerization is approximately 500 to 2100). Here, the molecular weight greatly affects the strength properties of cellulose or its derivatives, and as the molecular weight decreases, the mechanical strength suddenly decreases from a certain degree of polymerization. However, as a raw material for the nucleic acid-adsorbing porous membrane of the present invention, Can be used without problems.
前記核酸吸着性多孔性膜の一例として、セルロースからエステル化して得られるセルロースエステル誘導体の多孔性膜が使用できるが、特に好ましい前述のセルロースがそのまま利用できる訳ではなく、リンタやパルプを精製して精製リンタと精製高級木材パルプとして用いられる。リンタは綿実に綿繊維の中で繊維長が短い短繊維でありα−セルロース含量（例えば８８〜９２質量％）が多く純度が高く、不純物も少ない。この粗リンタはゴミ取り、アルカリ蒸煮、漂白、酸処理、脱水および乾燥によって精製リンタを得ることができる。これらの詳細はプラスチック材料講座（１７）繊維素系樹脂（丸澤、宇田著、日刊工業新聞社、１９７０年発行）の２５〜２８頁に記述され、表２・３にその特性が記載されており、本発明でより好ましい精製リンタが得られる。 As an example of the nucleic acid-adsorptive porous membrane, a porous membrane of a cellulose ester derivative obtained by esterification from cellulose can be used, but the above-mentioned particularly preferable cellulose is not necessarily usable as it is, and is obtained by purifying linter or pulp. Used as refined linter and refined premium wood pulp. Linter is a short fiber having a short fiber length among cotton fibers, has a high α-cellulose content (for example, 88 to 92% by mass), has a high purity, and has few impurities. This crude linter can be obtained by purifying litter, alkali cooking, bleaching, acid treatment, dehydration and drying. Details of these are described on pages 25 to 28 of the plastic material course (17) Fibrous resin (Maruzawa, Uda, Nikkan Kogyo Shimbun, published in 1970), and the characteristics are described in Tables 2.3. Thus, a more preferred purified linter can be obtained in the present invention.
さらに、精製パルプについても同著の２８〜３２頁に記述されており、表２・４に特性も記載されており、該手法などで精製されたパルプもセルロースエステル誘導体原料として好ましい。ここで、精製された綿花リンタと木材パルプを混合して用いることも好ましく、その割合は特に限定されないが好ましくは５／９５〜９５／５であり、より好ましくは１０／９０〜９０／１０である。混合することによって溶解性を向上させて、セルロースエステル誘導体多孔性膜の面状、力学特性を改良することができる。 Further, the refined pulp is also described on pages 28 to 32 of the same book, and the characteristics are also described in Tables 2 and 4, and the pulp refined by such a method is also preferable as the cellulose ester derivative raw material. Here, it is also preferable to use a mixture of refined cotton linter and wood pulp, and the ratio is not particularly limited, but is preferably 5/95 to 95/5, more preferably 10/90 to 90/10. is there. By mixing, the solubility can be improved, and the planarity and mechanical properties of the cellulose ester derivative porous membrane can be improved.
この中で、パルプの純度の指標となるα−セルロース含有量は、例えば８０〜１００質量％程度の範囲から選択でき、木材パルプでは、通常８５〜９８％程度である。本発明では低純度パルプ、例えばα−セルロース含有量８０〜９６％（特に９２〜９６％）程度のパルプも使用できる。これらのパルプのうち、通常木材パルプが使用される。 Among these, the α-cellulose content that serves as an indicator of the purity of the pulp can be selected from a range of, for example, about 80 to 100% by mass, and is usually about 85 to 98% for wood pulp. In the present invention, low-purity pulp, for example, pulp having an α-cellulose content of about 80 to 96% (particularly 92 to 96%) can also be used. Of these pulps, wood pulp is usually used.
さらに本発明の核酸吸着性多孔性膜においては、特開平１１−１３０３０１号公報に記載のように、パルプあるいは綿花中の中性構成糖成分には、グルコースが主成分であるがマンノースとキシロースとを含んでいてもよい。その比率は特に限定されないが、マンノース／キシロース（モル比）＝０．３５／１〜３．０／１、好ましくは０．３５／１〜２．５／１、さらに好ましくは０．３５／１〜２／１である。その場合に作製されたセルローストリアセテートにおいて、マンノースおよびキシロースの総含有量は、０．０１〜５モル％、好ましくは０．１〜４モル％である。なお、「マンノース」「キシロース」は、パルプ中に含まれるヘミセルロース（キシラン，グルコマンナンなど）の主たる構成糖である。これらの原料パルプおよび得られたセルロースエステル誘導体（セルローストリアセテートについて）の構成糖成分は、具体的には特開平１１−１３０３０１号に記載の方法で分析できる。 Furthermore, in the nucleic acid-adsorbing porous membrane of the present invention, as described in JP-A-11-130301, neutral constituent sugar components in pulp or cotton are mainly composed of glucose, but mannose and xylose. May be included. The ratio is not particularly limited, but mannose / xylose (molar ratio) = 0.35 / 1 to 3.0 / 1, preferably 0.35 / 1 to 2.5 / 1, more preferably 0.35 / 1. ~ 2/1. In the cellulose triacetate produced in that case, the total content of mannose and xylose is 0.01 to 5 mol%, preferably 0.1 to 4 mol%. “Mannose” and “xylose” are the main constituent sugars of hemicellulose (xylan, glucomannan, etc.) contained in pulp. The constituent sugar components of these raw material pulp and the obtained cellulose ester derivative (cellulose triacetate) can be specifically analyzed by the method described in JP-A-11-130301.
また、セルロースの多孔性膜としては、再生セルロースの多孔性膜を好ましく使用する事ができる。再生セルロースとは、アセチルセルロースの固体の表面または全体を、鹸化処理によりセルロース化したもの、セルロースの銅アンモニア溶液から作製したもの、セルロースのビスコース溶液から作製したもの、セルロースのアルカリ溶液から作製したものを挙げることができ、本来のセルロースとは、結晶状態等の点で異なっている。セルロースにはI、II、III、IVの結晶型が存在するが、本発明においては、どの結晶型でも好ましく使用でき、またI、II、III、IVの結晶型それぞれが任意の割合で含まれていてよい。アセチルセルロース多孔性膜から作製する再生セルロース多孔性膜については、特公昭４５−４６３３号公報、特開昭５６−１００６０４号公報、等に記載の原料、方法で得られるものを使用することができるが、これらに限定するものではない。また、セルロースの銅アンモニア溶液から作製する再生セルロース多孔性膜については、特開昭５８−８９６２５号公報、特開昭５８−８９６２６号公報、特開昭５８−８９６２７号公報、特開昭５８−８９６２８号公報、特開昭５９−４５３３３号公報、特開昭５９−４５３３４号公報、特開昭５９−１９９７２８号公報、特開昭６１−２７４７０７号公報、特開昭６２−１４０３号公報、特開昭６３−１６１９７２号公報、特開平７−３３０９４５号公報、等に記載の原料、方法で得られるものを使用することができるが、これらに限定するものではない。また、セルロースにアルカリと二硫化炭素を作用させて得られるビスコース溶液からも同様に原液組成や凝固方法を工夫することによって、再生セルロース多孔膜が得られ、本発明に使用することができる。また、セルロースのアルカリ溶液から作製する再生セルロース多孔性膜は、特開昭６２−２４０３２８号公報、特開昭６２−２４０３２９号公報、特開平１−１８８５３９号公報、等に記載の原料、方法で得られるものを使用することができるが、これらに限定されるものではない。 As the porous membrane of cellulose, a porous membrane of regenerated cellulose can be preferably used. Regenerated cellulose is obtained by saponifying the surface or the whole of acetylcellulose solids, prepared from a copper ammonia solution of cellulose, prepared from a viscose solution of cellulose, or prepared from an alkaline solution of cellulose. What is different from the original cellulose in terms of crystal state and the like. Cellulose has crystal forms of I, II, III, and IV. In the present invention, any crystal form can be preferably used, and each of crystal forms of I, II, III, and IV is included in an arbitrary ratio. It may be. As the regenerated cellulose porous membrane prepared from the acetylcellulose porous membrane, those obtained by the raw materials and methods described in JP-B No. 45-4633, JP-A No. 56-1000060, and the like can be used. However, it is not limited to these. Regarding the regenerated cellulose porous membrane prepared from a copper ammonia solution of cellulose, JP-A-58-89625, JP-A-58-89626, JP-A-58-89627, JP-A-58- No. 89628, JP-A-59-45333, JP-A-59-45334, JP-A-59-199728, JP-A-61-274707, JP-A-62-1403, Materials obtained by the raw materials and methods described in JP-A-63-161972, JP-A-7-330945, and the like can be used, but are not limited thereto. Further, a regenerated cellulose porous membrane can be obtained from a viscose solution obtained by reacting an alkali and carbon disulfide with cellulose to devise the stock solution composition and coagulation method, and can be used in the present invention. Further, a regenerated cellulose porous membrane prepared from an alkaline solution of cellulose can be produced by the raw materials and methods described in JP-A-62-240328, JP-A-62-240329, JP-A-1-188539, and the like. What is obtained can be used, but is not limited thereto.
本発明の核酸吸着性多孔性膜においては、前記セルロースエステル誘導体の粘度平均重合度が２００〜３０００であることが好ましい。また、前記セルロースエステル誘導体の重量平均分子量と数平均分子量の比が０．８〜２であることが好ましい。さらに、前記セルロースエステル誘導体が酸解離指数１．９３〜４．５の酸またはその塩を含有することが好ましい。 In the nucleic acid-adsorptive porous membrane of the present invention, the cellulose ester derivative preferably has a viscosity average polymerization degree of 200 to 3,000. Moreover, it is preferable that ratio of the weight average molecular weight and number average molecular weight of the said cellulose ester derivative is 0.8-2. Furthermore, the cellulose ester derivative preferably contains an acid having an acid dissociation index of 1.93 to 4.5 or a salt thereof.
前記セルロースエステル誘導体が、残存酢酸量あるいは炭素数３〜２２の脂肪酸が０．５質量％以下であることが好ましい。また、セルロースエステル誘導体が、アルカリ金属及び／又はアルカリ土類金属の少なくとも一種を１ｐｐｂ〜１００００ｐｐｍ含有していることが好ましい。さらに、前記セルロースアシレートが、アルミニウム、ビスマス、ケイ素、重金属（クロム、マンガン、鉄、コバルト、ニッケル、銅、亜鉛、砒素、銀、カドミウム、スズ、アンチモン、金、白金、水銀、鉛など）の少なくとも一種を、１ｐｐｂ〜１０００ｐｐｍ含有したことが好ましい。 The cellulose ester derivative is preferably 0.5% by mass or less of residual acetic acid or a fatty acid having 3 to 22 carbon atoms. Moreover, it is preferable that the cellulose ester derivative contains 1 ppb to 10000 ppm of at least one kind of alkali metal and / or alkaline earth metal. Further, the cellulose acylate is made of aluminum, bismuth, silicon, heavy metals (chromium, manganese, iron, cobalt, nickel, copper, zinc, arsenic, silver, cadmium, tin, antimony, gold, platinum, mercury, lead, etc.) It is preferable to contain 1 ppb to 1000 ppm of at least one kind.
特に好ましいセルロースエステル誘導体の多孔性膜としては、アセチル価の異なるアセチルセルロースの混合物から成る有機高分子の多孔性膜を挙げることができる。アセチル価の異なるアセチルセルロースの混合物として、トリアセチルセルロースとジアセチルセルロースの混合物、トリアセチルセルロースとモノアセチルセルロースの混合物、トリアセチルセルロースとジアセチルセルロースとモノアセチルセルロースの混合物、ジアセチルセルロースとモノアセチルセルロースの混合物を好ましく使用する事ができる。特にトリアセチルセルロースとジアセチルセルロースの混合物を好ましく使用することができる。トリアセチルセルロースとジアセチルセルロースの混合比（質量比）は、９９：１〜１：９９である事が好ましく、９０：１０〜５０：５０である事がより好ましい。 As a particularly preferred porous membrane of cellulose ester derivative, an organic polymer porous membrane comprising a mixture of acetylcelluloses having different acetyl values can be mentioned. As a mixture of acetyl cellulose having different acetyl values, a mixture of triacetyl cellulose and diacetyl cellulose, a mixture of triacetyl cellulose and monoacetyl cellulose, a mixture of triacetyl cellulose, diacetyl cellulose and monoacetyl cellulose, a mixture of diacetyl cellulose and monoacetyl cellulose Can be preferably used. In particular, a mixture of triacetyl cellulose and diacetyl cellulose can be preferably used. The mixing ratio (mass ratio) of triacetyl cellulose and diacetyl cellulose is preferably 99: 1 to 1:99, and more preferably 90:10 to 50:50.
以上記述したセルロースエステル誘導体については、特開平１０−４５８０３、特開平１１−２６９３０４、特開平８−２３１７６１、特開平８−２３１７６１、特開平１０−６０１７０、特開平９−４０７９２、特開平１１−５８５１、特開平１１−２６９３０４、特開平９−９０１０１、特開昭５７−１８２７３７、特開平４−２７７５３０、特開平１１−２９２９８９、特開平１２−１３１５２４、特開平１２−１３７１１５号などに記載のセルロースエステル誘導体を利用することも好ましい。これらの素材も、本発明の核酸吸着性多孔性膜に対しては特に限定されるものではない。 The cellulose ester derivatives described above are disclosed in JP-A-10-45803, JP-A-11-269304, JP-A-8-2311761, JP-A-8-231761, JP-A-10-60170, JP-A-9-40792, JP-A-11-5851. Cellulose esters described in JP-A-11-269304, JP-A-9-90101, JP-A-57-182737, JP-A-4-277530, JP-A-11-292989, JP-A-12-131524, JP-A-12-137115, and the like. It is also preferable to use a derivative. These materials are not particularly limited to the nucleic acid-adsorbing porous membrane of the present invention.
セルロースの構造を評価する手段として、Ｘ線解析もまた用いられる。それによるとセルロース分子は繊維軸方向に平行に配列し水素結合によって引き合い、５個のセルロース分子のセルビオース単位によって１個の単位胞を形成していることが記載されている。また、Ｘ線法によればその結晶化度は天然セルロースで約７０％であることが示されており、これらのセルロースも本発明のセルロースエステル誘導体作製に対して使用できる。 X-ray analysis is also used as a means of evaluating the structure of cellulose. According to this document, it is described that the cellulose molecules are arranged in parallel to the fiber axis direction and attracted by hydrogen bonds to form one unit cell by the cellobiose unit of five cellulose molecules. The X-ray method shows that the crystallinity of natural cellulose is about 70%, and these celluloses can also be used for preparing the cellulose ester derivative of the present invention.
ここで、本発明でも利用されるセルロースはその分析については種々行われており、ＡＳＴＭ ｓｔａｎｄａｒｄ Ｐａｒｔ １５、 ＴＡＰＰＩ Ｓｔａｎｄａｒｄ （Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｐｕｌｐ ａｎｄ Ｐａｐｅｒ Ｉｎｄｕｓｔｒｙ）やＪＩＳ Ｐ ８１０１などに詳細に掲げられている。測定項目としては、灰分、酸化カルシウムと酸化マグネシウムの含量、α−セルロース、β−セルロース、銅価などである。 Here, the cellulose used in the present invention has been analyzed in various ways and is described in detail in ASTM standard Part 15, TAPPI Standard (Technical Association of the Pull and Paper Industry), JIS P 8101, and the like. . Measurement items include ash, calcium oxide and magnesium oxide content, α-cellulose, β-cellulose, copper value, and the like.
鹸化とは、エステル誘導体を鹸化処理液(例えば水酸化ナトリウム水溶液)に接触させることを言う。これにより、鹸化処理液に接触したエステル誘導体のエステル部位が加水分解され、水酸基が導入される。鹸化率を変えるには、水酸化ナトリウムの濃度、処理温度、処理時間を変えて鹸化処理を行えば良い。鹸化率は、ＮＭＲ、ＩＲ又はＸＰＳにより、容易に測定することができる（例えば、カルボニル基のピーク減少の程度で定めることができる）。 Saponification refers to bringing an ester derivative into contact with a saponification solution (for example, an aqueous sodium hydroxide solution). Thereby, the ester site | part of the ester derivative which contacted the saponification process liquid is hydrolyzed, and a hydroxyl group is introduce | transduced. In order to change the saponification rate, the saponification treatment may be performed by changing the concentration of sodium hydroxide, the treatment temperature, and the treatment time. The saponification rate can be easily measured by NMR, IR, or XPS (for example, it can be determined by the degree of peak reduction of the carbonyl group).
多糖構造を有する有機材料の多孔性膜の具体例としては、特開２００３−１２８６９１号公報に記載の、アセチルセルロースの表面鹸化物が挙げられる。アセチルセルロースの表面鹸化物とは、アセチル価の異なるアセチルセルロースの混合物を鹸化処理したものであり、トリアセチルセルロースとジアセチルセルロース混合物の鹸化物、トリアセチルセルロースとモノアセチルセルロース混合物の鹸化物、トリアセチルセルロースとジアセチルセルロースとモノアセチルセルロース混合物の鹸化物、ジアセチルセルロースとモノアセチルセルロース混合物の鹸化物も好ましく使用することができる。より好ましくは、トリアセチルセルロースとジアセチルセルロース混合物の鹸化物を使用することである。トリアセチルセルロースとジアセチルセルロース混合物の混合比（質量比）は、９９：１〜１：９９であることが好ましい。更に好ましくは、トリアセチルセルロースとジアセチルセルロース混合物の混合比は、９０：１０〜５０：５０であることである。この場合、鹸化処理の程度（鹸化率）で固相表面の水酸基の量（密度）をコントロールすることができる。核酸の分離効率をあげるためには、水酸基の量（密度）が多い方が好ましい。例えば、トリアセチルセルロース等のアセチルセルロースの場合には、鹸化率（表面鹸化率）が約５％以上であることが好ましく、１０％以上であることが更に好ましい。また、水酸基を有する有機高分子の表面積を大きくするために、アセチルセルロースの多孔性膜を鹸化処理することが好ましい。この場合、多孔性膜は、表裏対称性の多孔性膜を使うと膜の表裏を区別することなく製造できるメリットがあり好ましく、また、表裏非対称性の多孔性膜を使用することで目詰まりのリスクを低減できるメリットがあり、好ましく使用することができる。 Specific examples of the porous film made of an organic material having a polysaccharide structure include a surface saponified product of acetyl cellulose described in JP-A No. 2003-128691. The surface saponified product of acetylcellulose is a saponified mixture of acetylcellulose having different acetyl values, saponified product of triacetylcellulose and diacetylcellulose mixture, saponified product of triacetylcellulose and monoacetylcellulose mixture, triacetyl A saponified product of a mixture of cellulose, diacetylcellulose and monoacetylcellulose, and a saponified product of a mixture of diacetylcellulose and monoacetylcellulose can also be preferably used. More preferably, a saponified product of a mixture of triacetyl cellulose and diacetyl cellulose is used. The mixing ratio (mass ratio) of the triacetyl cellulose and diacetyl cellulose mixture is preferably 99: 1 to 1:99. More preferably, the mixing ratio of the mixture of triacetyl cellulose and diacetyl cellulose is 90:10 to 50:50. In this case, the amount (density) of hydroxyl groups on the solid surface can be controlled by the degree of saponification treatment (saponification rate). In order to increase the nucleic acid separation efficiency, it is preferable that the amount (density) of hydroxyl groups is large. For example, in the case of acetylcellulose such as triacetylcellulose, the saponification rate (surface saponification rate) is preferably about 5% or more, and more preferably 10% or more. In order to increase the surface area of the organic polymer having a hydroxyl group, it is preferable to saponify the porous membrane of acetylcellulose. In this case, the porous membrane is advantageous in that it can be manufactured without distinguishing between the front and back of the membrane if a porous membrane with front and back symmetry is used, and clogging can be achieved by using a porous membrane with asymmetrical front and back. There is an advantage that the risk can be reduced, and it can be preferably used.
親水基を持たない有機材料の多孔性膜に親水基を導入する方法として、ポリマー鎖内または側鎖に親水基を有すグラフトポリマー鎖を多孔性膜に結合することができる。
有機材料の多孔性膜にグラフトポリマー鎖を結合する方法としては、多孔性膜とグラフトポリマー鎖とを化学結合させる方法と、多孔性膜を起点として重合可能な二重結合を有する化合物を重合させグラフトポリマー鎖とする２つの方法がある。
As a method for introducing a hydrophilic group into a porous film made of an organic material having no hydrophilic group, a graft polymer chain having a hydrophilic group in a polymer chain or in a side chain can be bonded to the porous film.
As a method of bonding the graft polymer chain to the porous film of the organic material, a method of chemically bonding the porous film and the graft polymer chain, and a compound having a double bond that can be polymerized starting from the porous film are polymerized. There are two ways to make the graft polymer chain.
まず、多孔性膜とグラフトポリマー鎖とを化学結合にて付着させる方法においては、ポリマーの末端または側鎖に多孔性膜と反応する官能基を有するポリマーを使用し、この官能基と、多孔性膜の官能基とを化学反応させることでグラフトさせることができる。多孔性膜と反応する官能基としては、多孔性膜の官能基と反応し得るものであれば特に限定はないが、例えば、アルコキシシランのようなシランカップリング基、イソシアネート基、アミノ基、水酸基、カルボキシル基、カルボニル基、スルホン酸基、リン酸基、エポキシ基、アリル基、メタクリロイル基、アクリロイル基、アミド基、ヒドラジド基、アルデヒド基、チオール基、スクシイミド基等を挙げることができる。 First, in the method of attaching the porous membrane and the graft polymer chain by chemical bonding, a polymer having a functional group that reacts with the porous membrane is used at the terminal or side chain of the polymer, and this functional group and the porous It can be grafted by chemically reacting with a functional group of the membrane. The functional group that reacts with the porous membrane is not particularly limited as long as it can react with the functional group of the porous membrane. For example, a silane coupling group such as alkoxysilane, an isocyanate group, an amino group, and a hydroxyl group. Carboxyl group, carbonyl group, sulfonic acid group, phosphoric acid group, epoxy group, allyl group, methacryloyl group, acryloyl group, amide group, hydrazide group, aldehyde group, thiol group, succinimide group and the like.
ポリマーの末端、または側鎖に反応性官能基を有するポリマーとして特に有用な化合物は、トリアルコキシシリル基をポリマー末端に有するポリマー、アミノ基をポリマー末端に有するポリマー、カルボキシル基をポリマー末端に有するポリマー、エポキシ基をポリマー末端に有するポリマー、イソシアネート基をポリマー末端に有するポリマーが挙げられる。この時に使用されるポリマーとしては、核酸の吸着に関与する親水基を有するものであれば特に限定はないが、具体的には、ポリヒドロキシエチルアクリル酸、ポリヒドロキシエチルメタアクリル酸及びそれらの塩、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸及びそれらの塩、ポリオキシエチレン、ポリ乳酸、ポリケトン、ポリエーテルイミド、ポリアミドイミド、ポリフェニレンスルホン、ポリフェニレンスルフィドスルホン、ナイロン、N-メチル変性ナイロン、N-アルコキシメチル変性ナイロン、N-アルキルチオメチル変性ナイロン、ポリスルホン、ポリエーテルスルホン、ポリアリールスルホン、ポリアリルアミン、ポリウレタンなどを挙げることができる。 Particularly useful compounds as a polymer having a reactive functional group at the end of the polymer or in the side chain are a polymer having a trialkoxysilyl group at the polymer end, a polymer having an amino group at the polymer end, and a polymer having a carboxyl group at the polymer end. , A polymer having an epoxy group at the polymer end, and a polymer having an isocyanate group at the polymer end. The polymer used at this time is not particularly limited as long as it has a hydrophilic group involved in nucleic acid adsorption. Specifically, polyhydroxyethylacrylic acid, polyhydroxyethylmethacrylic acid and salts thereof , Polyvinyl alcohol, polyvinyl pyrrolidone, polyacrylic acid, polymethacrylic acid and their salts, polyoxyethylene, polylactic acid, polyketone, polyetherimide, polyamideimide, polyphenylenesulfone, polyphenylenesulfidesulfone, nylon, N-methyl modified nylon, Examples include N-alkoxymethyl-modified nylon, N-alkylthiomethyl-modified nylon, polysulfone, polyethersulfone, polyarylsulfone, polyallylamine, and polyurethane.
多孔性膜を基点として重合可能な二重結合を有する化合物を重合させ、グラフトポリマー鎖を形成させる方法は、一般的には表面グラフト重合と呼ばれる。表面グラフト重合法とは、プラズマ照射、光照射、加熱などの方法で基材表面上に活性種を与え、多孔性膜と接するように配置された重合可能な二重結合を有する化合物を重合によって多孔性膜と結合させる方法を指す。
基材に結合しているグラフトポリマー鎖を形成するのに有用な化合物は、重合可能な二重結合を有しており、核酸の吸着に関与する親水基を有するという、２つの特性を兼ね備えていることが必要である。これらの化合物としては、分子内に二重結合を有していれば、親水基を有するポリマー、オリゴマー、モノマーのいずれの化合物をも用いることができる。特に有用な化合物は親水基を有するモノマーである。
A method of polymerizing a compound having a polymerizable double bond based on a porous membrane to form a graft polymer chain is generally called surface graft polymerization. The surface graft polymerization method is a method of polymerizing a compound having a polymerizable double bond disposed so as to be in contact with the porous film by giving active species on the surface of the substrate by a method such as plasma irradiation, light irradiation, and heating. It refers to the method of bonding with a porous membrane.
A compound useful for forming a graft polymer chain bound to a substrate has a double bond that can be polymerized and has a hydrophilic group that participates in nucleic acid adsorption. It is necessary to be. As these compounds, any polymer, oligomer, or monomer compound having a hydrophilic group can be used as long as it has a double bond in the molecule. Particularly useful compounds are monomers having hydrophilic groups.
特に有用な親水基を有するモノマーの具体例としては、次のモノマーを挙げることができる。例えば、２−ヒドロキシエチルアクリレート、２−ヒドロキシエチルメタクリレート、グリセロールモノメタクリレート等の水酸性基含有モノマーを特に好ましく用いることができる。また、アクリル酸、メタアクリル酸等のカルボキシル基含有モノマー、もしくはそのアルカリ金属塩及びアミン塩、アクリルアミド等も好ましく用いることができる。 Specific examples of the particularly useful monomer having a hydrophilic group include the following monomers. For example, a hydroxyl group-containing monomer such as 2-hydroxyethyl acrylate, 2-hydroxyethyl methacrylate, and glycerol monomethacrylate can be particularly preferably used. In addition, carboxyl group-containing monomers such as acrylic acid and methacrylic acid, or alkali metal salts and amine salts thereof, acrylamide, and the like can also be preferably used.
親水基を持たない有機材料の多孔性膜に親水基を導入する別の方法として、親水基を有する材料をコーティングすることができる。コーティングに使用する材料は、核酸の吸着に関与する親水基を有するものであれば特に限定はないが、作業の容易さから有機材料のポリマーが好ましい。ポリマーとしては、ポリヒドロキシエチルアクリル酸、ポリヒドロキシエチルメタアクリル酸及びそれらの塩、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸及びそれらの塩、ポリオキシエチレン、アセチルセルロース、アセチル価の異なるアセチルセルロースの混合物などを挙げることができるが、多糖構造を有するポリマーが好ましい。 As another method for introducing a hydrophilic group into a porous film made of an organic material having no hydrophilic group, a material having a hydrophilic group can be coated. The material used for the coating is not particularly limited as long as it has a hydrophilic group involved in nucleic acid adsorption, but an organic material polymer is preferable from the viewpoint of easy work. Examples of polymers include polyhydroxyethyl acrylic acid, polyhydroxyethyl methacrylic acid and salts thereof, polyvinyl alcohol, polyvinyl pyrrolidone, polyacrylic acid, polymethacrylic acid and salts thereof, polyoxyethylene, acetylcellulose, and different acetyl values. Examples thereof include a mixture of acetylcellulose, and a polymer having a polysaccharide structure is preferable.
また、親水基を持たない有機材料の多孔性膜に、アセチルセルロースまたは、アセチル価の異なるアセチルセルロースの混合物をコーティングした後に、コーティングしたアセチルセルロースまたは、アセチル価の異なるアセチルセルロースの混合物を鹸化処理することもできる。この場合、鹸化率が約５％以上であることが好ましい。さらには、鹸化率が約１０％以上であることが好ましい。 In addition, after coating a porous film of an organic material having no hydrophilic group with acetyl cellulose or a mixture of acetyl celluloses having different acetyl values, the coated acetyl cellulose or a mixture of acetyl celluloses having different acetyl values is saponified. You can also In this case, the saponification rate is preferably about 5% or more. Furthermore, the saponification rate is preferably about 10% or more.
親水基を有する無機材料である多孔性膜としては、シリカ化合物を含有する多孔性膜を挙げることができる。シリカ化合物を含有する多孔性膜としては、ガラスフィルターを挙げることができる。また、特許公報第３０５８３４２号に記載されているような、多孔質のシリカ薄膜を挙げることができる。この多孔質のシリカ薄膜とは、二分子膜形成能を有するカチオン型の両親媒性物質の展開液を基板上に展開した後、基板上の液膜から溶媒を除去することによって両親媒性物質の多層二分子膜薄膜を調整し、シリカ化合物を含有する溶液に多層二分子膜薄膜を接触させ、次いで前記多層二分子膜薄膜を抽出除去することで作製することができる。 Examples of the porous film that is an inorganic material having a hydrophilic group include a porous film containing a silica compound. A glass filter can be mentioned as a porous film containing a silica compound. Further, a porous silica thin film as described in Japanese Patent Publication No. 3058342 can be given. This porous silica thin film is an amphiphilic substance by spreading a developing solution of a cationic type amphiphilic substance having a bilayer-forming ability on a substrate and then removing the solvent from the liquid film on the substrate. This multilayer bilayer thin film can be prepared by bringing the multilayer bilayer thin film into contact with a solution containing a silica compound, and then extracting and removing the multilayer bilayer thin film.
親水基を持たない無機材料の多孔性膜に親水基を導入する方法としては、多孔性膜とグラフトポリマー鎖とを化学結合させる方法と、分子内に二重結合を有している親水基を有するモノマーを使用して、多孔性膜を起点として、グラフトポリマー鎖を重合する２つの方法がある。
多孔性膜とグラフトポリマー鎖とを化学結合にて付着させる場合は、グラフトポリマー鎖の末端の官能基と反応する官能基を無機材料に導入し、そこにグラフトポリマーを化学結合させる。また、分子内に二重結合を有している親水基を有するモノマーを使用して、多孔性膜を起点として、グラフトポリマー鎖を重合する場合は、二重結合を有する化合物を重合する際の起点となる官能基を無機材料に導入する。
親水性基を持つグラフトポリマー、および分子内に二重結合を有している親水基を有するモノマーとしては、前記、親水基を持たない有機材料の多孔性膜とグラフトポリマー鎖とを化学結合させる方法において、記載した親水性基を持つグラフトポリマー、および分子内に二重結合を有している親水基を有するモノマーを好ましく使用することができる。
As a method for introducing a hydrophilic group into a porous membrane of an inorganic material having no hydrophilic group, a method of chemically bonding the porous membrane and a graft polymer chain, and a hydrophilic group having a double bond in the molecule are used. There are two methods for polymerizing a graft polymer chain using a monomer having a porous membrane as a starting point.
When the porous membrane and the graft polymer chain are attached by chemical bonding, a functional group that reacts with the functional group at the terminal of the graft polymer chain is introduced into the inorganic material, and the graft polymer is chemically bonded thereto. In addition, when a graft polymer chain is polymerized starting from a porous membrane using a monomer having a hydrophilic group having a double bond in the molecule, a compound having a double bond is polymerized. The starting functional group is introduced into the inorganic material.
As the graft polymer having a hydrophilic group and the monomer having a hydrophilic group having a double bond in the molecule, the porous film of the organic material having no hydrophilic group is chemically bonded to the graft polymer chain. In the method, the described graft polymers having hydrophilic groups and monomers having a hydrophilic group having a double bond in the molecule can be preferably used.
親水基を持たない無機材料の多孔性膜に親水基を導入する別の方法として、親水基を有する材料をコーティングすることができる。コーティングに使用する材料は、核酸の吸着に関与する親水基を有するものであれば特に限定はないが、作業の容易さから有機材料のポリマーが好ましい。ポリマーとしては、ポリヒドロキシエチルアクリル酸、ポリヒドロキシエチルメタアクリル酸及びそれらの塩、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸及びそれらの塩、ポリオキシエチレン、アセチルセルロース、アセチル価の異なるアセチルセルロースの混合物などを挙げることができる。 As another method for introducing a hydrophilic group into a porous film made of an inorganic material having no hydrophilic group, a material having a hydrophilic group can be coated. The material used for the coating is not particularly limited as long as it has a hydrophilic group involved in nucleic acid adsorption, but an organic material polymer is preferable from the viewpoint of easy work. Examples of polymers include polyhydroxyethyl acrylic acid, polyhydroxyethyl methacrylic acid and salts thereof, polyvinyl alcohol, polyvinyl pyrrolidone, polyacrylic acid, polymethacrylic acid and salts thereof, polyoxyethylene, acetylcellulose, and different acetyl values. Examples thereof include a mixture of acetylcellulose.
親水基を持たない無機材料の多孔性膜としては、アルミニウム等の金属、ガラス、セメント、陶磁器等のセラミックス、もしくはニューセラミックス、シリコン、活性炭、アルミノケイ酸塩等を加工して作製した多孔性膜を挙げることができる。 As a porous film made of an inorganic material having no hydrophilic group, a porous film produced by processing a metal such as aluminum, ceramics such as glass, cement, ceramics, or new ceramics, silicon, activated carbon, aluminosilicate, etc. Can be mentioned.
また、親水基を持たない無機材料の多孔性膜に、アセチルセルロースまたは、アセチル価の異なるアセチルセルロースの混合物をコーティングした後に、コーティングしたアセチルセルロースまたは、アセチル価の異なるアセチルセルロースの混合物を鹸化処理することもできる。この場合、鹸化率が約５％以上であることが好ましい。さらには、鹸化率が約１０％以上であることが好ましい。 In addition, after coating a porous film of an inorganic material having no hydrophilic group with acetyl cellulose or a mixture of acetyl celluloses having different acetyl values, the coated acetyl cellulose or a mixture of acetyl celluloses having different acetyl values is saponified. You can also In this case, the saponification rate is preferably about 5% or more. Furthermore, the saponification rate is preferably about 10% or more.
前記核酸吸着性固相担体調製工程において用途に応じた種々の添加剤（例えば、可塑剤、静電防止剤、劣化防止剤、紫外線防止剤、界面活性剤、剥離剤、着色剤、補強剤、架橋剤など）を加えることができる。またその添加する時期はドープ作製工程において何れでも添加しても良いが、ドープ調製工程の最後の調製工程に添加剤を添加し調製する工程を加えて行ってもよい。 Various additives (for example, plasticizer, antistatic agent, anti-degradation agent, ultraviolet ray inhibitor, surfactant, release agent, colorant, reinforcing agent, etc.) according to the use in the nucleic acid adsorbing solid phase carrier preparation step, Crosslinking agents, etc.) can be added. Further, the addition may be performed at any time in the dope preparation process, but may be performed by adding an additive to the final preparation process of the dope preparation process.
前記核酸吸着性固相担体には、必要に応じて可塑剤を含有することができ、特開２００２−２６５６３６に記載のリン酸エステル、カルボン酸エステル、また、特開平２−６８２６に記載の多価アルコール、また、特開平５−１９４７８８号、特開昭６０−２５００５３号、特開平４−２２７９４１号、特開平６−１６８６９号、特開平５−２７１４７１号、特開平７−２８６０６８号、特開平５−５０４７号、特開平１１−８０３８１号、特開平７−２０３１７号、特開平８−５７８７９号、特開平１０−１５２５６８号、特開平１０−１２０８２４号、特開平１１−１２４４４５号記載の（ジ）ペンタエリスリトールエステル類、特開平１１−２４６７０４号記載のグリセロールエステル類、特開２０００−６３５６０号記載のジグリセロールエステル類、特開平１１−９２５７４号記載のクエン酸エステル類、特開平１１−９０９４６号記載の置換フェニルリン酸エステル類、特開昭５６−１００６０４号の各公報などに記載されている可塑剤が好ましく用いることができる。これらの記載によると可塑剤だけでなくその利用方法あるいはその特性についての好ましい記載が多数あり、本発明の核酸吸着性固相担体においても好ましく用いられるものである。 The nucleic acid-adsorptive solid phase carrier can contain a plasticizer as necessary. The phosphate ester and the carboxylic acid ester described in JP-A No. 2002-265636 and the multi-agent described in JP-A No. 2-6826 can be used. JP, 5-194788, JP 60-250053, JP 4-227941, JP 6-16869, JP 5-271471, JP 7-286068, JP As described in JP-A-5-5047, JP-A-11-80381, JP-A-7-20317, JP-A-8-57879, JP-A-10-152568, JP-A-10-120824, and JP-A-11-124445. ) Pentaerythritol esters, glycerol esters described in JP-A No. 11-246704, diglyceres described in JP-A No. 2000-63560 And the plasticizers described in JP-A-11-92574, substituted phenylphosphates described in JP-A-11-90946, and JP-A-56-100604. It can be preferably used. According to these descriptions, there are many preferable descriptions not only about plasticizers but also their utilization methods or characteristics, and they are preferably used in the nucleic acid-adsorbing solid phase carrier of the present invention.
前記核酸吸着性固相担体には、取扱の際に膜が帯電するのを防ぐ目的で、静電防止剤を添加することができる。この静電防止剤については、イオン導電性物質や導電性微粒子が好ましく用いられる。ここでイオン導電性物質とは電気伝導性を示し、電気を運ぶ担体であるイオンを含有する物質のことであるが、例としてはイオン性高分子化合物を挙げることができる。イオン性高分子化合物としては、特公昭４９−２３８２８号、特公昭４９−２３８２７号、特公昭４７−２８９３７号の各公報に見られるようなアニオン性高分子化合物；特公昭５５−７３４号、特開昭５０−５４６７２号、特公昭５９−１４７３５号、特公昭５７−１８１７５号、特公昭５７−１８１７６号、特公昭５７−５６０５９号の各公報などに見られるような、主鎖中に解離基を持つアイオネン型ポリマー；特公昭５３−１３２２３号、特公昭５７−１５３７６号、特公昭５３−４５２３１号、特公昭５５−１４５７８３号、特公昭５５−６５９５０号、特公昭５５−６７７４６号、特公昭５７−１１３４２号、特公昭５７−１９７３５号、特公昭５８−５６８５８号、特開昭６１−２７８５３号、特公昭６２−９３４６号の各公報に見られるような、側鎖中にカチオン性解離基を持つカチオン性ペンダント型ポリマー；等を挙げることができる。これらのうち、好ましいのは導電性物質が微粒子状をしており、前記核酸吸着性固相担体中にこれらを微分散し添加したものであって、これらに用いられる好ましい導電性物質として、金属酸化物やこれらの複合酸化物からなる導電性微粒子及び特開平９−２０３８１０号公報に記載されているようなアイオネン導電性ポリマー或いは分子間架橋を有する第４級アンモニウムカチオン導電性ポリマー粒子などを含有することが望ましい。好ましい粒径としては５ｎｍ〜１０μｍの範囲であり、更に好ましい範囲は用いられる微粒子の種類に依存する。導電性微粒子である金属酸化物の例としては、ＺｎＯ、ＴｉＯ2 、ＳｎＯ2 、Ａｌ2 Ｏ3 、Ｉｎ2 Ｏ3 、ＳｉＯ2 、ＭｇＯ、ＢａＯ、ＭｏＯ2 、Ｖ2 Ｏ5 等、或いはこれらの複合酸化物が好ましく、特にＺｎＯ、ＴｉＯ2 及びＳｎＯ2 が好ましい。異種原子を含む例としては、例えばＺｎＯに対してはＡｌ、Ｉｎ等の添加、ＴｉＯ2 に対してはＮｂ、Ｔａ等の添加、又ＳｎＯ2 に対しては、Ｓｂ、Ｎｂ、ハロゲン元素等の添加が効果的である。これら異種原子の添加量は０．０１〜２５ｍｏｌ％の範囲が好ましいが、０．１〜１５ｍｏｌ％の範囲が特に好ましい。また、これらの導電性を有するこれら金属酸化物粉体の体積抵抗率は１０７Ωｃｍ以下、特に１０５Ωｃｍ以下であって、１次粒子径が１００Å以上０．２μｍ以下で、高次構造の長径が３０ｎｍ以上６μｍ以下である特定の構造を有する粉体を核酸吸着性固相担体に体積分率で０．０１％以上２０％以下含んでいることが好ましい。また、分散性粒状ポリマーとしての架橋型カチオン性導電性ポリマーの特徴は、粒子内のカチオン成分を高濃度、高密度に持たせることができるため、優れた導電性を有しているばかりでなく、低相対湿度下においても導電性の劣化は見られず、粒子同志も分散状態ではよく分散されているにもかかわらず、膜形状の場合、流延後造膜過程において粒子同志の接着性もよいため膜強度も強く、耐薬品性に優れている。また、架橋型のカチオン性導電性ポリマーである分散性粒状ポリマーは一般に約１０ｎｍ〜１０００ｎｍの粒子サイズ範囲にあり、好ましくは２０ｎｍ〜３００ｎｍの範囲の粒子サイズが用いられる。ここで用いる分散性粒状性ポリマーとは、視覚的観察によって透明又はわずかに濁った溶液に見えるが、電子顕微鏡の下では粒状分散物として見えるポリマーである。更にまた、有機電子導電性有機化合物も利用できる。例えば、ポリチオフェン、ポリピロール、ポリアニリン、ポリアセチレン、ポリフォスファゼンなどである。これらは、酸供与材としてポリスチレンスルフォン酸、過塩素酸などとのコンプレックスで好ましく用いられる。 An antistatic agent can be added to the nucleic acid-adsorbing solid phase carrier for the purpose of preventing the membrane from being charged during handling. As the antistatic agent, an ion conductive substance or conductive fine particles are preferably used. Here, the ion conductive substance is a substance that shows electric conductivity and contains ions that are carriers for carrying electricity, and examples include ionic polymer compounds. Examples of the ionic polymer compound include anionic polymer compounds such as those described in JP-B-49-23828, JP-B-49-23827, and JP-B-47-28937; A dissociation group in the main chain as shown in Japanese Patent Publication Nos. 50-54772, 59-14735, 57-18175, 57-18176, 57-56059, etc. Ionene type polymers having: JP-B 53-13223, JP-B 57-15376, JP-B 53-45231, JP-B 55-145783, JP-B 55-65950, JP-B 55-67746, JP-B Japanese Patent Nos. 57-11342, 57-19735, 58-56858, JP 61-27853, 62-9346 As seen in, cationic pendant polymer having a cationic dissociative group in the side chain; and the like can be given. Among these, the conductive material is preferably in the form of fine particles, and these are finely dispersed and added in the nucleic acid-adsorbing solid phase carrier. Contains conductive fine particles composed of oxides and composite oxides thereof, and ionene conductive polymers or quaternary ammonium cation conductive polymer particles having intermolecular crosslinking as described in JP-A-9-203810. It is desirable to do. The preferred particle size is in the range of 5 nm to 10 μm, and the more preferred range depends on the type of fine particles used. Examples of metal oxides that are conductive fine particles include ZnO, TiO 2 , SnO 2 , Al 2 O 3 , In 2 O 3 , SiO 2 , MgO, BaO, MoO 2 , V 2 O 5, etc. Complex oxides are preferred, and ZnO, TiO 2 and SnO 2 are particularly preferred. Examples of containing different atoms include, for example, addition of Al, In, etc. to ZnO, addition of Nb, Ta, etc. to TiO 2 , and addition of Sb, Nb, halogen elements, etc. to SnO 2 . Addition is effective. The amount of these different atoms added is preferably in the range of 0.01 to 25 mol%, particularly preferably in the range of 0.1 to 15 mol%. The volume resistivity of these metal oxide powders having conductivity is 107 Ωcm or less, particularly 105 Ωcm or less, the primary particle diameter is 100 μm or more and 0.2 μm or less, and the major structure has a major axis of 30 nm or more. The powder having a specific structure of 6 μm or less is preferably contained in the nucleic acid-adsorbing solid phase carrier in a volume fraction of 0.01% to 20%. In addition, the characteristics of the cross-linked cationic conductive polymer as a dispersible granular polymer are that it has a high concentration and high density of the cation component in the particles, so that it has not only excellent conductivity. However, even when the relative humidity is low, the conductivity is not deteriorated, and the particles are well dispersed in the dispersed state. Therefore, the film strength is strong and the chemical resistance is excellent. Moreover, the dispersible granular polymer which is a crosslinked cationic conductive polymer is generally in the particle size range of about 10 nm to 1000 nm, and preferably in the range of 20 nm to 300 nm. As used herein, a dispersible particulate polymer is a polymer that appears as a transparent or slightly turbid solution by visual observation, but appears as a particulate dispersion under an electron microscope. Furthermore, organic electronically conductive organic compounds can also be used. For example, polythiophene, polypyrrole, polyaniline, polyacetylene, polyphosphazene and the like. These are preferably used in a complex with polystyrene sulfonic acid, perchloric acid or the like as an acid donor.
前記核酸吸着性固相担体には、劣化防止剤（例、酸化防止剤、過酸化物分解剤、ラジカル禁止剤、金属不活性化剤、酸捕獲剤、アミン）や紫外線防止剤を添加することができる。これらの劣化防止剤や紫外線防止剤については、特開昭６０−２３５８５２号、特開平３−１９９２０１号、特開平５−１９０７０７号、特開平５−１９４７８９号、特開平５−２７１４７１号、特開平６−１０７８５４号、特開平６−１１８２３３号、特開平６−１４８４３０号、特開平７−１１０５６号、特開平７−１１０５５号、特開平７−１１０５６号、特開平８−２９６１９号、特開平８−２３９５０９号、特開平７−１１０５６号、特開２０００−２０４１７３号、特開平５−１９７０７３号、特開平５−１９４７８９号、特開平６−１０７８５４号、特開昭６０−２３５８５２号、特開平１２−１９３８２１号、特開平８−２９６１９号、特開平６−１１８２３３号、特開平６−１４８４３０号、特開２００２−２６５６３６号、特開平５−１９７０７３号の各公報などに記載されているものが好ましく用いることができる。特に好ましい劣化防止剤の例としては、ジブチルヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）を挙げることができる。 Degradation inhibitors (eg, antioxidants, peroxide decomposers, radical inhibitors, metal deactivators, acid scavengers, amines) and UV inhibitors are added to the nucleic acid-adsorbing solid phase carrier. Can do. With respect to these deterioration inhibitors and UV inhibitors, JP-A-60-235852, JP-A-3-199201, JP-A-5-190707, JP-A-5-194789, JP-A-5-271471, JP-A-5-271471, and JP-A-5-271471. JP-A-6-107854, JP-A-6-118233, JP-A-6-148430, JP-A-7-11056, JP-A-7-11055, JP-A-7-11056, JP-A-8-29619, JP-A-8 JP-A-239509, JP-A-7-11056, JP-A-2000-204173, JP-A-5-97073, JP-A-5-194789, JP-A-6-107854, JP-A-60-235852, JP-A-12. -193821, JP-A-8-29619, JP-A-6-118233, JP-A-6-148430, JP-A-2002-265636 , It can be preferably used those which are described, for example, in each publication of JP-A-5-197073. As a particularly preferable example of the deterioration preventing agent, dibutylhydroxytoluene (BHT) can be mentioned.
これらの添加量は、調製する溶液（ドープ）の０．０１〜１質量％であることが好ましく、０．０１〜０．０８質量％であることがさらに好ましい。添加量が０．０１質量％未満であると、劣化防止剤の効果がほとんど認められない。添加量が１質量％を越えると、固相担体表面への劣化防止剤のブリードアウト（滲み出し）が認められる場合がある。本発明で好ましい劣化防止剤は、沸点が２００℃以上、２５℃で液体であるか、または融点が２５〜２５０℃である固体であることが好ましい。更に好ましくは沸点が２５０℃以上、２５℃で液体であるか、融点が２５〜２００℃の固体である劣化防止剤が挙げられる。劣化防止剤が液体の場合は、その精製は通常減圧蒸留によって実施されるが高真空ほど好ましく、例えば１００Ｐａ以下が好ましい。また分子蒸留装置などを用いて精製することも特に好ましい。また可塑剤が固体の場合は、溶媒を用いて再結晶させてろ過、洗浄し乾燥することで実施されることが一般的である。 These addition amounts are preferably 0.01 to 1% by mass of the solution (dope) to be prepared, and more preferably 0.01 to 0.08% by mass. When the addition amount is less than 0.01% by mass, the effect of the deterioration preventing agent is hardly recognized. If the amount added exceeds 1% by mass, bleeding-out (bleeding) of the deterioration preventing agent to the surface of the solid phase carrier may be observed. The deterioration preventing agent preferable in the present invention is preferably a liquid having a boiling point of 200 ° C. or higher and 25 ° C., or a solid having a melting point of 25 to 250 ° C. More preferably, the deterioration inhibitor is a liquid having a boiling point of 250 ° C. or higher and 25 ° C., or a solid having a melting point of 25 to 200 ° C. When the deterioration inhibitor is a liquid, purification thereof is usually carried out by distillation under reduced pressure, but higher vacuum is preferable, for example, 100 Pa or less is preferable. It is also particularly preferable to purify using a molecular distillation apparatus or the like. When the plasticizer is a solid, it is generally carried out by recrystallization using a solvent, filtration, washing and drying.
前記核酸吸着性固相担体には、界面活性剤を添加することができる。界面活性剤については、特開２００２−２６５６３６号公報、特公昭５５−３１４１８号公報、界面活性剤等一覧表２００１年度版（日本界面活性剤工業会）、界面活性剤の応用（幸書房、刈米孝夫著、昭和５５年９月１日発行）等に記載されているものが好ましく用いられるが、これらに限定されるものではない。本発明においては、好ましい界面活性剤はその種類、使用量において特に限定されず、目的とする界面活性特性が得られる量であればよい。 A surfactant can be added to the nucleic acid-adsorbing solid phase carrier. As for surfactants, JP-A No. 2002-265636, Japanese Patent Publication No. 55-31418, List of surfactants, etc. 2001 edition (Japan Surfactant Industry Association), Application of surfactants (Shoshobo, Kori Those described in Takao Yone, published on September 1, 1980) are preferably used, but are not limited thereto. In the present invention, the preferred surfactant is not particularly limited in its kind and amount of use, and may be any amount that provides the desired surface active characteristics.
前記核酸吸着性固相担体には、必要であれば製造時の剥離の荷重を小さくするために剥離剤を含有することもできる。前記剥離剤については、界面活性剤が有効であり、リン酸系、スルフォン酸系、カルボン酸系、ノニオン系、カチオン系など特に限定されない。これらは、例えば特開昭６１−２４３８３７号、特開２０００−９９８４７号公報などに記載されている。また、特開平１０−３１６７０１号公報に記載の、酸解離指数ｐＫａ１．９３〜４．５０［好ましくは２．０〜４．４、さらに好ましくは２．２〜４．３（例えば、２．５〜４．０）、特に２．６〜４．３（例えば、２．６〜４．０）程度］の酸またはその塩が剥離剤として好ましい。これらは、無機酸または有機酸のいずれでもよい。酸のｐＫａについては「改訂３版化学便覧，基礎編II」（（財）日本化学会編，丸善（株）発行）を参照できる。また、特開２００２−２６５６３６号公報に記載の剥離剤についても好ましく用いることができる。これらの記載によると剥離剤だけでなくその利用方法あるいはその特性についての好ましい記載が多数あり、本発明の核酸吸着性固相担体においても好ましく用いられるものである。 If necessary, the nucleic acid-adsorbing solid phase carrier can contain a release agent in order to reduce the release load during production. As the release agent, a surfactant is effective, and there is no particular limitation such as phosphoric acid type, sulfonic acid type, carboxylic acid type, nonionic type, and cationic type. These are described in, for example, JP-A-61-243837 and JP-A-2000-99847. Moreover, the acid dissociation index pKa 1.93 to 4.50 [preferably 2.0 to 4.4, more preferably 2.2 to 4.3 (for example, 2.5) described in JP-A-10-316701. To 4.0), particularly 2.6 to 4.3 (for example, about 2.6 to 4.0)] or a salt thereof is preferable as the release agent. These may be either inorganic acids or organic acids. For the pKa of acid, “Revised 3rd edition Chemical Handbook, Fundamentals II” (edited by the Chemical Society of Japan, published by Maruzen Co., Ltd.) can be referred to. Moreover, it can use preferably also about the peeling agent as described in Unexamined-Japanese-Patent No. 2002-265636. According to these descriptions, there are many preferable descriptions not only on the release agent but also on the utilization method or its characteristics, and they are preferably used also in the nucleic acid-adsorbing solid phase carrier of the present invention.
前記核酸吸着性固相担体には、着色剤を添加することができる。着色剤については、これまでに公知の色素、染料、顔料、酸化発色色素、還元発色色素、pH指示薬、蛍光色素、カップリング色素、紫外線吸色素、赤外線吸色素、近赤外線吸収色素、感圧色素、フォトクロミック色素、サーモクロミック色素、エレクトロクロミック色素、有機発光色素、光電変換色素、増感色素、２色性色素、エレクトロルミネッセンス色素、食品用色素、有機非線形光学色素、化学発光用色素、医薬品用色素、医療診断用色素、化粧品用色素、半導体レーザー用色素、昇華転写用色素、溶融転写用色素、感熱色素、ロイコ色素、電磁波吸収色素、光導電性色素、帯電性色素等の有機、または無機、または有機無機複合の着色剤を単独または複数種類を所望の濃度で、また界面活性剤や保護ポリマー等の分散剤と併用して所望の濃度で使用することができるが、これらに限定されるものではない。 A colorant can be added to the nucleic acid-adsorbing solid phase carrier. As for the colorant, hitherto known dyes, dyes, pigments, oxidation coloring dyes, reduction coloring dyes, pH indicators, fluorescent dyes, coupling dyes, ultraviolet absorbing dyes, infrared absorbing dyes, near infrared absorbing dyes, pressure sensitive dyes , Photochromic dyes, thermochromic dyes, electrochromic dyes, organic luminescent dyes, photoelectric conversion dyes, sensitizing dyes, dichroic dyes, electroluminescent dyes, food dyes, organic nonlinear optical dyes, chemiluminescent dyes, pharmaceutical dyes , Dyes for medical diagnosis, dyes for cosmetics, dyes for semiconductor lasers, dyes for sublimation transfer, dyes for melt transfer, thermosensitive dyes, leuco dyes, electromagnetic wave absorbing dyes, photoconductive dyes, chargeable dyes, etc. Or, organic or inorganic composite colorants can be used alone or in combination at a desired concentration, and in combination with dispersants such as surfactants and protective polymers. It can be used in a concentration, but is not limited thereto.
前記核酸吸着性固相担体には、膜強度を向上させる目的で補強剤を添加することができる。補強剤としては、ガラス繊維、炭素繊維、ケイ素繊維、セルロース繊維、パルプ繊維、チタン酸カリウム繊維、炭化ケイ素ウィスカー、窒化ケイ素ウィスカー、酸化亜鉛ウィスカー、ホウ酸アルミニウムウィスカー、塩基性硫酸マグネシウムおよび繊維状ゾノトライト、チタン酸カリウムウィスカー、シリコンカーバイト(SiC)ウィスカー、ウィスカー状炭酸カルシウムなどが好ましく用いられるが、これらに限定されるものではなく、繊維状または針状結晶状のものであれば使用することができる。また、耐折性を向上させるために合成ポリマーを添加することもでき、特開昭５４−１１０８１に記載されているポリウレタン等を好ましく使用することができるが、これらに限定されるものではない。 A reinforcing agent can be added to the nucleic acid-adsorbing solid phase carrier for the purpose of improving the film strength. Reinforcing agents include glass fiber, carbon fiber, silicon fiber, cellulose fiber, pulp fiber, potassium titanate fiber, silicon carbide whisker, silicon nitride whisker, zinc oxide whisker, aluminum borate whisker, basic magnesium sulfate and fibrous zonotlite Potassium titanate whisker, silicon carbide (SiC) whisker, whisker-like calcium carbonate, and the like are preferably used, but are not limited thereto, and may be used as long as they are fibrous or needle-like crystals. it can. In addition, a synthetic polymer can be added to improve folding resistance, and polyurethanes described in JP-A No. 54-11081 can be preferably used, but are not limited thereto.
前記核酸吸着性固相担体には、架橋剤を添加することができる。架橋剤については、これまでに公知のものが使用できるが、固相担体素材の持つ官能基により適切な種類を選ぶことが好ましい。官能基が水酸基の場合、特開平７−２５６０６６号公報、特開平３−６８４３１号公報などに記載された架橋剤が好ましく使用できるが、これらに限定されるものではない。 A crosslinking agent can be added to the nucleic acid-adsorbing solid phase carrier. As the crosslinking agent, known ones can be used, but it is preferable to select an appropriate type depending on the functional group of the solid phase carrier material. When the functional group is a hydroxyl group, the crosslinking agents described in JP-A-7-256066, JP-A-3-68431 and the like can be preferably used, but are not limited thereto.
前記核酸吸着性固相担体には、湿潤剤を添加することができる。湿潤剤については、特開昭６３−２６２５５０号公報、特開昭６３−２６２５４９号公報、特公昭５５−３１４１８号公報に記載のものが好ましく使用できるが、これらに限定されるものではない。 A wetting agent can be added to the nucleic acid-adsorbing solid phase carrier. As the wetting agent, those described in JP-A-63-262550, JP-A-63-262549, and JP-B-55-31418 can be preferably used, but are not limited thereto.
前記の核酸吸着性多孔性膜は、溶液が内部を通過可能であり、厚さが１０μｍ〜５００μｍである。さらに好ましくは、厚さが５０μｍ〜２５０μｍである。洗浄がし易い点で、厚さが薄いほど好ましい。 The nucleic acid-adsorptive porous membrane allows the solution to pass through the inside and has a thickness of 10 μm to 500 μm. More preferably, the thickness is 50 μm to 250 μm. The thinner the thickness, the easier it is to clean.
前記の、溶液が内部を通過可能な核酸吸着性多孔性膜としては、最小孔径が０．２２μｍ以上である。さらに好ましくは、最小孔径が０．５μｍ以上である。また、溶液が内部を通過可能な核酸吸着性多孔性膜としては、最大孔径と最小孔径の比が２以上である多孔性膜を用いる事が好ましい。これにより、核酸が吸着するのに十分な表面積が得られるとともに、目詰まりし難い。さらに好ましくは、最大孔径と最小孔径の比が５以上である多孔性膜を用いる。 As the nucleic acid-adsorbing porous membrane through which the solution can pass, the minimum pore diameter is 0.22 μm or more. More preferably, the minimum pore diameter is 0.5 μm or more. Further, as the nucleic acid-adsorbing porous membrane through which the solution can pass, it is preferable to use a porous membrane having a ratio of the maximum pore diameter to the minimum pore diameter of 2 or more. As a result, a sufficient surface area for adsorbing nucleic acids is obtained and clogging is difficult. More preferably, a porous membrane having a ratio of the maximum pore diameter to the minimum pore diameter of 5 or more is used.
前記の、溶液が内部を通過可能な核酸吸着性多孔性膜としては、空隙率が５０〜９５％である。さらに好ましくは、空隙率が６５〜８０％である。また、溶液が内部を通過可能な核酸吸着性多孔性膜としては、バブルポイントが、０．１〜１０ｋｇｆ／ｃｍ2である。さらに好ましくは、バブルポイントが、０．２〜４ｋｇｆ／ｃｍ2である。 As a nucleic acid-adsorptive porous membrane through which the solution can pass, the porosity is 50 to 95%. More preferably, the porosity is 65 to 80%. Moreover, as a nucleic acid adsorptive porous membrane through which the solution can pass, the bubble point is 0.1 to 10 kgf / cm 2 . More preferably, a bubble point is 0.2-4 kgf / cm < 2 >.
前記の、溶液が内部を通過可能な核酸吸着性多孔性膜としては、圧力損失が、０．１〜１００ｋＰａである多孔性膜を用いる事が好ましい。これにより、過圧時に均一な圧力が得られる。さらに好ましくは、圧力損失が、０．５〜５０ｋＰａである多孔性膜を用いる事ができる。ここで、圧力損失とは、膜の厚さ１００μｍあたり、水を通過させるのに必要な最低圧力である。 As the nucleic acid-adsorptive porous membrane through which the solution can pass, a porous membrane having a pressure loss of 0.1 to 100 kPa is preferably used. Thereby, a uniform pressure is obtained at the time of overpressure. More preferably, a porous membrane having a pressure loss of 0.5 to 50 kPa can be used. Here, the pressure loss is the minimum pressure required to pass water per 100 μm thickness of the membrane.
前記の、溶液が内部を通過可能な核酸吸着性多孔性膜としては、また、２５℃で１ｋｇ／ｃｍ2の圧力で水を通過させたときの透水量が、膜１ｃｍ2あたり１分間で１〜５０００ｍＬである多孔性膜を用いることができる。さらに好ましくは、２５℃で１ｋｇ／ｃｍ2の圧力で水を通過させたときの透水量が、膜１ｃｍ2あたり１分間で５〜１０００ｍＬである多孔性膜を用いることができる。 As the nucleic acid-adsorbing porous membrane through which the solution can pass, the amount of water permeation when passing water at 25 ° C. and a pressure of 1 kg / cm 2 is 1 per 1 cm 2 of membrane. A porous membrane of ~ 5000 mL can be used. More preferably, a porous membrane having a water permeation amount of 5 to 1000 mL per 1 cm 2 of membrane when water is passed at 25 ° C. at a pressure of 1 kg / cm 2 can be used.
前記の、溶液が内部を通過可能な核酸吸着性多孔性膜としては、多孔性膜1ｍｇあたりの核酸の吸着量が０．１μｇ以上である多孔性膜を好ましく使用する事ができる。さらに好ましくは、多孔性膜1ｍｇあたりの核酸の吸着量が０．９μｇ以上である多孔性膜を用いることができる。 As the nucleic acid-adsorbing porous membrane through which the solution can pass, a porous membrane having a nucleic acid adsorption amount of 0.1 μg or more per 1 mg of the porous membrane can be preferably used. More preferably, a porous membrane having a nucleic acid adsorption amount of 0.9 μg or more per 1 mg of the porous membrane can be used.
前記の、溶液が内部を通過可能な核酸吸着性多孔性膜としては、一辺が５ｍｍの正方形の多孔性膜をトリフルオロ酢酸５ｍＬに浸漬したときに、１時間以内では溶解しないが４８時間以内に溶解するセルロース誘導体からなる多孔性膜を好ましく使用する事ができる。また、一辺が５ｍｍの正方形の多孔質膜をトリフルオロ酢酸５ｍＬに浸漬したときに１時間以内に溶解するが、ジクロロメタン５ｍＬに浸漬したときには２４時間以内に溶解しないセルロース誘導体からなる多孔性膜を好ましく使用する事ができる。 The nucleic acid-adsorbing porous membrane through which the solution can pass is not dissolved within 1 hour, but within 48 hours when a square porous membrane with a side of 5 mm is immersed in 5 mL of trifluoroacetic acid. A porous membrane made of a cellulose derivative that dissolves can be preferably used. Further, a porous membrane made of a cellulose derivative which dissolves within 1 hour when immersed in 5 mL of trifluoroacetic acid but is not dissolved within 24 hours when immersed in 5 mL of dichloromethane is preferable. Can be used.
核酸吸着性多孔性膜中を、核酸を含む試料溶液を通過させる場合、試料溶液を一方の面から他方の面へと通過させることが、液を多孔性膜へ均一に接触させることができる点で、好ましい。核酸吸着性多孔性膜中を、核酸を含む試料溶液を通過させる場合、試料溶液を核酸吸着性多孔性膜の孔径が大きい側から小さい側に通過させることが、目詰まりし難い点で、好ましい。 When passing a sample solution containing nucleic acid through a nucleic acid-adsorptive porous membrane, passing the sample solution from one surface to the other surface allows the solution to contact the porous membrane uniformly. It is preferable. When a sample solution containing nucleic acid is passed through the nucleic acid-adsorbing porous membrane, it is preferable that the sample solution is passed from the side having the larger pore size of the nucleic acid-adsorbing porous membrane to the smaller side because clogging is difficult. .
核酸を含む試料溶液を核酸吸着性多孔性膜に通過させる場合の流速は、液の多孔性膜への適切な接触時間を得るために、膜の面積ｃｍ2あたり、２〜１５００μＬ/secである事が好ましい。液の多孔性膜への接触時間が短すぎると十分な分離精製効果が得られず、長すぎると操作性の点から好ましくない。さらに、前記流速は、膜の面積ｃｍ2あたり、５〜７００μＬ/secである事が好ましい。 The flow rate when the sample solution containing nucleic acid is passed through the nucleic acid-adsorbing porous membrane is 2 to 1500 μL / sec per cm 2 of the membrane in order to obtain an appropriate contact time of the liquid with the porous membrane. Things are preferable. If the contact time of the liquid with the porous membrane is too short, a sufficient separation and purification effect cannot be obtained, and if it is too long, it is not preferable from the viewpoint of operability. Furthermore, the flow rate is preferably 5 to 700 μL / sec per cm 2 of the membrane area.
また、使用する溶液が内部を通過可能な核酸吸着性多孔性膜は、１枚であってもよいが、複数枚を使用することもできる。複数枚の核酸吸着性多孔性膜は、同一のものであっても、異なるものであって良い。 Further, the number of nucleic acid-adsorbing porous membranes through which the solution to be used can pass may be one, but a plurality of nucleic acid-adsorbing porous membranes can also be used. The plurality of nucleic acid-adsorbing porous membranes may be the same or different.
少なくとも二個の開口を有する容器内に、前記のような溶液が内部を通過可能な核酸吸着性多孔性膜を収容した核酸分離精製カートリッジを好ましく使用することができる。また、少なくとも二個の開口を有する容器内に、前記のような溶液が内部を通過可能な核酸吸着性多孔性膜を複数枚収容した核酸分離精製カートリッジを好ましく使用することができる。この場合、少なくとも二個の開口を有する容器内に収容される複数枚の核酸吸着性多孔性膜は、同一のものであっても、異なるものであって良い。 A cartridge for separating and purifying nucleic acid containing a nucleic acid-adsorbing porous membrane through which the above solution can pass in a container having at least two openings can be preferably used. Further, a nucleic acid separation / purification cartridge in which a plurality of nucleic acid-adsorbing porous membranes through which the solution can pass can be preferably used in a container having at least two openings. In this case, the plurality of nucleic acid-adsorbing porous membranes accommodated in a container having at least two openings may be the same or different.
複数枚の核酸吸着性多孔性膜は、無機材料の核酸吸着性多孔性膜と有機材料の核酸吸着性多孔性膜との組合せであっても良い。例えば、ガラスフィルターと再生セルロースの多孔性膜との組合せを挙げることができる。また、複数枚の核酸吸着性多孔性膜は、無機材料の核酸吸着性多孔性膜と有機材料の核酸非吸着性多孔性膜との組合せであってもよい、例えば、ガラスフィルターと、ナイロンまたはポリスルホンの多孔性膜との組合せを挙げることができる。
そして、以上に説明した核酸吸着性多孔性膜は、カートリッジの形状に応じて、膜状以外の形態にすることができる。例えば、チップ状やブロック状等とすることができる。
The plurality of nucleic acid-adsorptive porous membranes may be a combination of an inorganic material nucleic acid-adsorptive porous membrane and an organic material nucleic acid-adsorptive porous membrane. For example, a combination of a glass filter and a porous membrane of regenerated cellulose can be mentioned. The plurality of nucleic acid-adsorptive porous membranes may be a combination of an inorganic material nucleic acid-adsorptive porous membrane and an organic material non-nucleic acid-adsorptive porous membrane, for example, a glass filter and nylon or A combination with a porous membrane of polysulfone can be mentioned.
The nucleic acid-adsorptive porous membrane described above can be in a form other than the membrane shape according to the shape of the cartridge. For example, a chip shape or a block shape can be used.
核酸分離精製カートリッジは、少なくとも二個の開口を有する容器内に、前記のような溶液が内部を通過可能な核酸吸着性多孔性膜を収容する以外、その他の部材を収容していないことが好ましい。前記の容器の材料としては、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリカーボネート、ポリ塩化ビニルなどのプラスチックを使用することができる。また、生分解性の材料も好ましく使用することができる。また、前記の容器は透明であっても、着色してあっても良い。 It is preferable that the nucleic acid separation and purification cartridge does not contain other members in a container having at least two openings other than containing a nucleic acid-adsorbing porous membrane through which the above solution can pass. . As the material of the container, plastics such as polypropylene, polystyrene, polycarbonate, polyvinyl chloride and the like can be used. Biodegradable materials can also be preferably used. The container may be transparent or colored.
核酸分離精製カートリッジとして、個々の核酸分離精製カートリッジを識別する手段を備えている核酸分離精製カートリッジを使用する事ができる。個々の核酸分離精製カートリッジを識別する手段としては、バーコード、磁気テープなどが挙げられる。 As the nucleic acid separation / purification cartridge, a nucleic acid separation / purification cartridge provided with means for identifying individual nucleic acid separation / purification cartridges can be used. Examples of means for identifying individual nucleic acid separation and purification cartridges include bar codes and magnetic tapes.
また、少なくとも二個の開口を有する容器内から核酸吸着性多孔性膜を容易に取り出す事が可能になっている構造を有した核酸分離精製カートリッジを使用することもできる。 In addition, a nucleic acid separation and purification cartridge having a structure in which the nucleic acid-adsorbing porous membrane can be easily taken out from a container having at least two openings can also be used.
前記に記載した、各々の溶液が内部を通過可能な核酸吸着性多孔性膜を収容する核酸分離精製カートリッジを用いて、以下の工程で核酸を分離精製することができる。すなわち、(a)核酸を含む試料溶液を、少なくとも二個の開口を有する容器内に、溶液が内部を通過可能な、核酸吸着性多孔性膜を収容した核酸分離精製カートリッジの一の開口に注入する工程、(b)核酸分離精製カートリッジの前記一の開口に結合された圧力差発生装置を用いて核酸分離精製カートリッジト内を加圧状態にし、注入した核酸を含む試料溶液を、核酸吸着性多孔性膜を通過させ、核酸分離精製カートリッジの他の開口より排出することによって、核酸吸着性多孔性膜内に核酸を吸着させる工程、(c)核酸分離精製カートリッジの前記一の開口に洗浄液を注入する工程、(d)核酸分離精製カートリッジの前記一の開口に結合された圧力差発生装置を用いて核酸分離精製カートリッジ内を加圧状態にし、注入した洗浄液を、核酸吸着性多孔性膜を通過させ、他の開口より排出することによって、核酸吸着性多孔性膜を、核酸が吸着した状態で、洗浄する工程、(e)核酸分離精製カートリッジの前記一の開口に回収液を注入する工程、(f)核酸分離精製カートリッジの前記一の開口に結合された圧力差発生装置を用いて核酸分離精製カートリッジ内を加圧状態にし、注入した回収液を、核酸吸着性多孔性膜を通過させ、他の開口より排出することによって、核酸吸着性多孔性膜内から核酸を脱着させ、核酸分離精製カートリッジ容器外に排出する工程が挙げることができる。 Using the nucleic acid separation / purification cartridge containing the nucleic acid-adsorbing porous membrane through which each solution can pass, the nucleic acid can be separated and purified in the following steps. That is, (a) a sample solution containing nucleic acid is injected into one opening of a nucleic acid separation and purification cartridge containing a nucleic acid-adsorbing porous membrane that allows the solution to pass through a container having at least two openings. (B) The inside of the nucleic acid separation and purification cartridge is pressurized using a pressure difference generator coupled to the one opening of the nucleic acid separation and purification cartridge, and the sample solution containing the injected nucleic acid is adsorbed with nucleic acid. Allowing the nucleic acid to be adsorbed in the nucleic acid-adsorptive porous membrane by passing through the porous membrane and discharging from the other opening of the nucleic acid separation-purifying cartridge, and (c) washing liquid in the one opening of the nucleic acid separation-purification cartridge. (D) the inside of the nucleic acid separation and purification cartridge is pressurized using a pressure difference generator coupled to the one opening of the nucleic acid separation and purification cartridge, A step of washing the nucleic acid-adsorbing porous membrane in a state where the nucleic acid is adsorbed by passing through the functional membrane and discharging from the other opening, and (e) collecting the recovery liquid into the one opening of the nucleic acid separation and purification cartridge. A step of injecting, and (f) the inside of the nucleic acid separation / purification cartridge is pressurized using a pressure difference generator coupled to the one opening of the nucleic acid separation / purification cartridge, and the injected recovered liquid is converted into a nucleic acid-adsorbing porous membrane. The step of allowing the nucleic acid to be desorbed from the inside of the nucleic acid-adsorptive porous membrane and discharged out of the cartridge for separating and purifying nucleic acid can be exemplified by passing through and discharging through other openings.
前記(ｂ)、(ｄ)及び(ｆ)の各工程において、核酸を含む試料溶液、洗浄液又は回収液を、加圧状態で核酸吸着性多孔性膜に通過させるものであり、より好ましくは、前記(ｂ)、(ｄ)及び(ｆ)の各工程において、少なくとも二個の開口を有する容器内に該核酸吸着性多孔性膜を収容した核酸分離精製カートリッジの一の開口に、核酸を含む試料溶液、洗浄液又は回収液を注入し、カートリッジの前記一の開口に結合された圧力差発生装置を用いてカートリッジ内を加圧状態にして、該注入した各液を通過させ、他の開口より排出させるものである。核酸を含む試料溶液、洗浄液又は回収液を加圧状態で前記多孔性膜に通過させることにより、装置をコンパクトに自動化することができ、好ましい。加圧は、好ましくは１０〜２００ｋｐａ、より好ましくは４０〜１００ｋｐａの程度で行われる。 In each of the steps (b), (d) and (f), a sample solution containing a nucleic acid, a washing solution or a recovery solution is passed through a nucleic acid-adsorbing porous membrane under pressure, more preferably, In each of the steps (b), (d) and (f), the nucleic acid is contained in one opening of the nucleic acid separation / purification cartridge in which the nucleic acid-adsorbing porous membrane is accommodated in a container having at least two openings. A sample solution, a cleaning solution or a recovery solution is injected, and the inside of the cartridge is pressurized using a pressure difference generating device coupled to the one opening of the cartridge, and each of the injected solutions is passed through the other opening. It is what is discharged. By passing a sample solution, a washing solution or a recovery solution containing a nucleic acid through the porous membrane under pressure, the apparatus can be automated in a compact manner, which is preferable. The pressurization is preferably performed at a rate of 10 to 200 kpa, more preferably 40 to 100 kpa.
前記の核酸分離精製の工程では、最初の核酸を含む試料溶液を注入から核酸分離精製カートリッジ外に核酸を得るまでの工程を１０分以内、好適な状況では２分以内で終了することが可能である。また、前記の核酸分精製の工程では核酸を検体中に含まれる全量に対して５０質量％以上、好適な状況では９０質量％以上の収率で得る事が可能である。 In the nucleic acid separation and purification step, the steps from injection of the sample solution containing the first nucleic acid to obtaining the nucleic acid outside the nucleic acid separation and purification cartridge can be completed within 10 minutes, and in a suitable situation within 2 minutes. is there. In the nucleic acid fraction purification step, the nucleic acid can be obtained in a yield of 50% by mass or more with respect to the total amount contained in the sample, and in a suitable situation, the yield is 90% by mass or more.
前記の核酸分精製の工程では、１ｋｂｐから２００ｋｂｐ、特に２０ｋｂｐから１４０ｋｂｐと広範囲に及ぶ分子量の核酸を回収することができる。すなわち、従来行なわれているガラスフィルターを用いたスピンカラム法に比べて、長鎖の核酸を回収できる。 In the nucleic acid purification step, nucleic acids having a molecular weight ranging from 1 kbp to 200 kbp, particularly from 20 kbp to 140 kbp can be recovered. That is, long-chain nucleic acids can be recovered as compared with the conventional spin column method using a glass filter.
前記の核酸分精製の工程では、紫外可視分光光度計での測定値(２６０nm/２８０nm)が、ＤＮＡの場合は１．６〜２．０、ＲＮＡの場合は１．８〜２．２となる純度を持つ核酸を回収することができ、不純物混入量の少ない高純度の核酸を定常的に得ることができる。さらには、紫外可視分光光度計での測定値(２６０nm/２８０nm)がＤＮＡの場合は１．８付近、ＲＮＡの場合は２．０付近となる純度を持つ核酸を回収することができる。 In the nucleic acid fraction purification step, the UV-visible spectrophotometer measurement value (260 nm / 280 nm) is 1.6 to 2.0 for DNA and 1.8 to 2.2 for RNA. A nucleic acid having a high purity can be recovered, and a high purity nucleic acid with a small amount of impurities can be steadily obtained. Furthermore, a nucleic acid having a purity of about 1.8 when DNA (260 nm / 280 nm) measured with an ultraviolet-visible spectrophotometer is used and about 2.0 when RNA is used can be recovered.
本発明において使用できる検体に制限はないが、例えば診断分野においては、検体として採取された全血、血漿、血清、尿、便、***、唾液等の体液、あるいは植物（又はその一部）、動物（またはその一部）、細菌、ウイルスなど、あるいはそれらの溶解物およびホモジネートなどの生物材料から調製された溶液が対象となる。 There are no limitations on the specimens that can be used in the present invention. For example, in the diagnostic field, whole blood collected as specimens, plasma, serum, urine, feces, semen, saliva and other body fluids, or plants (or parts thereof), Of interest are solutions prepared from biological materials such as animals (or parts thereof), bacteria, viruses, etc., or lysates and homogenates thereof.
次にこれらの検体について細胞膜および核膜等を溶解して核酸を可溶化する試薬を含む水溶液（核酸可溶化試薬）で処理する。これにより細胞膜および核膜が溶解されて、核酸が水溶液内に分散し、核酸を含む試料溶液を得る。 Next, these specimens are treated with an aqueous solution (nucleic acid solubilizing reagent) containing a reagent that dissolves the cell membrane and the nuclear membrane to solubilize the nucleic acid. As a result, the cell membrane and the nuclear membrane are dissolved, and the nucleic acid is dispersed in the aqueous solution to obtain a sample solution containing the nucleic acid.
細胞膜および核膜を溶解して、核酸を可溶化するためには、例えば、対象となる試料が全血の場合、赤血球の除去、（2）各種タンパク質の除去、及び（3）白血球の溶解及び核膜の溶解が必要となる。赤血球の除去および（2）各種タンパク質の除去は、膜への非特異吸着および多孔性膜の目詰まりを防ぐために、（3）白血球の溶解及び核膜の溶解は、抽出の対象である核酸を可溶化させるためにそれぞれ必要となる。特に、（3）白血球の溶解及び核膜の溶解は重要な工程であり、本発明の方法では、この工程により核酸を可溶化することが必要である。 In order to solubilize cell membranes and nuclear membranes and solubilize nucleic acids, for example, when the sample of interest is whole blood, removal of red blood cells, (2) removal of various proteins, and (3) lysis of white blood cells and It is necessary to dissolve the nuclear membrane. Removal of red blood cells and (2) removal of various proteins prevent non-specific adsorption to the membrane and clogging of the porous membrane. (3) Lysis of leukocytes and lysis of the nuclear membrane are performed by removing the nucleic acid to be extracted. Each is required to solubilize. In particular, (3) lysis of leukocytes and lysis of the nuclear membrane are important steps. In the method of the present invention, it is necessary to solubilize nucleic acids by this step.
核酸を含む検体は、単一の核酸を含む検体でもよいし、異なる複数種類の核酸を含む検体でもよい。回収する核酸の種類は、ＤＮＡやＲＮＡ等、特に制限されない。検体の数は一つでも複数（複数の容器を用いて、複数検体の並列処理）であってもよい。回収する核酸の長さも特に限定されず、例えば、数ｂｐ〜数Ｍｂｐの任意の長さの核酸を使用することができる。取扱い上の観点からは、回収する核酸の長さは一般的には、数ｂｐ〜数百ｋｂｐ程度である。本発明の核酸分離精製方法は、従来の簡易的な核酸分離精製方法より比較的長い核酸を迅速に取り出すことができ、好ましくは５０ｋｂｐ以上、より好ましくは７０ｋｂｐ、更に好ましくは１００ｋｂｐ以上の核酸を回収することに用いることができる。撹拌及びピペッティングを穏やかにすることが、より長いＤＮＡを回収する点で好ましい。 The specimen containing the nucleic acid may be a specimen containing a single nucleic acid or a specimen containing a plurality of different types of nucleic acids. The type of nucleic acid to be collected is not particularly limited, such as DNA or RNA. The number of specimens may be one or plural (parallel processing of a plurality of specimens using a plurality of containers). The length of the nucleic acid to be recovered is not particularly limited, and for example, a nucleic acid having an arbitrary length of several bp to several Mbp can be used. From the viewpoint of handling, the length of the nucleic acid to be recovered is generally about several bp to several hundreds kbp. The nucleic acid separation and purification method of the present invention can quickly extract a relatively long nucleic acid as compared with the conventional simple nucleic acid separation and purification method, and preferably collects nucleic acid of 50 kbp or more, more preferably 70 kbp, and even more preferably 100 kbp or more. Can be used to Gently stirring and pipetting is preferred in terms of recovering longer DNA.
以下に、細胞膜および核膜を溶解し、核酸を可溶化して、検体から核酸を含む試料溶液を得る工程について説明する。本発明で、細胞膜および核膜を溶解して核酸を可溶化するには、核酸可溶化試薬を用いる。核酸可溶化試薬としては、カオトロピック塩、界面活性剤、消泡剤、タンパク質分解酵素および核酸安定化剤の中から選ばれる化合物を含む溶液が挙げられる。 Hereinafter, a process of dissolving a cell membrane and a nuclear membrane, solubilizing a nucleic acid, and obtaining a sample solution containing the nucleic acid from a specimen will be described. In the present invention, a nucleic acid solubilizing reagent is used to solubilize nucleic acid by dissolving the cell membrane and the nuclear membrane. Examples of the nucleic acid solubilizing reagent include a solution containing a compound selected from chaotropic salts, surfactants, antifoaming agents, proteolytic enzymes, and nucleic acid stabilizers.
細胞膜および核膜を溶解し、核酸を可溶化して、検体から核酸を含む試料溶液を得る方法としては、(Ｉ)細胞又はウイルスを含む検体を容器に注入する工程、(ＩＩ)前記容器に、核酸可溶化試薬溶液を添加し、検体と核酸可溶化試薬溶液を混合する工程、(ＩＩＩ)前記で得られた混合液をインキュベートする工程、(ＩＶ)インキュベートされた混合液に水溶性有機溶媒を添加する工程を含む方法を挙げることができる。 A method for obtaining a sample solution containing nucleic acid from a specimen by dissolving a cell membrane and a nuclear membrane and solubilizing a nucleic acid includes (I) a step of injecting a specimen containing cells or viruses into a container, and (II) A step of adding a nucleic acid solubilizing reagent solution and mixing the specimen and the nucleic acid solubilizing reagent solution, (III) a step of incubating the mixed solution obtained above, and (IV) a water-soluble organic solvent in the incubated mixed solution The method including the process of adding can be mentioned.
前記の細胞膜および核膜を溶解し、核酸を可溶化して、検体から核酸を含む試料溶液を得る工程において、検体をホモジナイズ処理することで、自動化処理適正が向上する。ホモジナイズ処理は、例えば、超音波処理、鋭利な突起物を用いる、高速攪拌処理を用いる、微細空隙から押し出す処理、ガラスビーズを用いる処理等で行うことができる。 In the step of dissolving the cell membrane and the nuclear membrane, solubilizing the nucleic acid, and obtaining a sample solution containing the nucleic acid from the specimen, homogenizing the specimen improves the appropriateness of the automated processing. The homogenizing treatment can be performed by, for example, ultrasonic treatment, using sharp protrusions, using high-speed stirring treatment, processing for extruding from fine voids, processing using glass beads, or the like.
また、前記の細胞膜および核膜を溶解し、核酸を可溶化して、検体から核酸を含む試料溶液を得る工程において、タンパク質分解酵素を含む核酸可溶化試薬を使用することにより、核酸の回収量及び回収効率が向上し、必要な核酸を含む検体の微量化及び迅速化が可能となる。 Further, in the step of dissolving the cell membrane and the nuclear membrane and solubilizing the nucleic acid to obtain a sample solution containing the nucleic acid from the specimen, the amount of nucleic acid recovered can be obtained by using a nucleic acid solubilizing reagent containing a proteolytic enzyme. In addition, the recovery efficiency is improved, and it is possible to reduce the amount and speed of the specimen containing the necessary nucleic acid.
タンパク質分解酵素は、セリンプロテアーゼ、システインプロテアーゼ、金属プロテアーゼなどから、少なくとも１つのタンパク質分解酵素を好ましく用いることができる。また、タンパク質分解酵素は、複数種以上のタンパク質分解酵素の混合物も好ましく用いることができる。セリンプロテアーゼとしては、特に限定されず、例えばプロテアーゼＫなどを好ましく用いることができる。システインプロテアーゼとしては、特に限定されず、例えばパパイン、カテプシン類などを好ましく用いることができる。金属プロテアーゼとしては、特に限定されず、例えばカルボキシペプチターゼ等を好ましく用いることができる。タンパク質分解酵素は、添加時の反応系全容積１ｍｌあたり好ましくは０．００１ＩＵ〜１０ＩＵ、より好ましくは０．０１ＩＵ〜１ＩＵの濃度で用いることができる。 As the proteolytic enzyme, at least one proteolytic enzyme can be preferably used from serine protease, cysteine protease, metalloprotease and the like. As the proteolytic enzyme, a mixture of a plurality of proteolytic enzymes can be preferably used. The serine protease is not particularly limited, and for example, protease K can be preferably used. The cysteine protease is not particularly limited, and for example, papain and cathepsins can be preferably used. The metal protease is not particularly limited, and for example, carboxypeptidase can be preferably used. The proteolytic enzyme can be used at a concentration of preferably 0.001 IU to 10 IU, more preferably 0.01 IU to 1 IU per 1 ml of the total volume of the reaction system at the time of addition.
タンパク質分解酵素は、核酸分解酵素を含まないタンパク質分解酵素を好ましく用いることができる。また、安定化剤を含んだタンパク質分解酵素を好ましく用いることができる。安定化剤としては、金属イオンを好ましく用いることができる。具体的には、マグネシウムイオンが好ましく、例えば塩化マグネシウムなどの形で添加することができる。タンパク質分解酵素の安定化剤を含ませることにより、核酸の回収に必要なタンパク質分解酵素の微量化が可能となり、核酸の回収に必要なコストを低減することができる。タンパク質分解酵素の安定化剤は、反応系全量に対して好ましくは１〜１０００ｍｍｏｌ／ｌ、より好ましくは１０〜１００ｍｍｏｌ／ｌの濃度で含有することが好ましい。 As the proteolytic enzyme, a proteolytic enzyme containing no nucleolytic enzyme can be preferably used. A proteolytic enzyme containing a stabilizer can be preferably used. As the stabilizer, metal ions can be preferably used. Specifically, magnesium ion is preferable, and it can be added in the form of, for example, magnesium chloride. By including a proteolytic enzyme stabilizer, the amount of proteolytic enzyme required for nucleic acid recovery can be reduced, and the cost required for nucleic acid recovery can be reduced. The stabilizer for the proteolytic enzyme is preferably contained at a concentration of 1 to 1000 mmol / l, more preferably 10 to 100 mmol / l, based on the total amount of the reaction system.
タンパク質分解酵素は、予めカオトロピック塩、界面活性剤等のその他の試薬とともに混合されて１つの試薬として核酸の回収に供されても良い。また、タンパク質分解酵素は、カオトロピック塩、界面活性剤等のその他の試薬とは個別の２つ以上の試薬として供されても良い。後者の場合、タンパク質分解酵素を含む試薬を先に検体と混合した後に、カオトロピック塩、界面活性剤を含む試薬と混合される。また、カオトロピック塩、界面活性剤を含む試薬を先に混合した後に、タンパク分解酵素を混合してもよい。また、タンパク質分解酵素を検体または、検体とカオトロピック塩、界面活性剤を含む試薬との混合液に、タンパク質分解酵素保存容器から直接目薬状に滴下させることもできる。この場合、操作を簡便にすることができる。 The proteolytic enzyme may be mixed with other reagents such as chaotropic salts and surfactants in advance and used for nucleic acid recovery as one reagent. The proteolytic enzyme may be provided as two or more reagents separate from other reagents such as chaotropic salts and surfactants. In the latter case, a reagent containing a proteolytic enzyme is first mixed with a sample, and then mixed with a reagent containing a chaotropic salt and a surfactant. Moreover, after mixing the reagent containing a chaotropic salt and a surfactant previously, you may mix a proteolytic enzyme. In addition, the proteolytic enzyme can be dropped directly into a specimen or a mixed solution of the specimen and a reagent containing a chaotropic salt and a surfactant directly from the proteolytic enzyme storage container. In this case, the operation can be simplified.
カオトロピック塩の核酸可溶化試薬溶液における濃度は、０．５ｍｏｌ／ｌ以上であることが好ましく、より好ましくは０．５ｍｏｌ／ｌ〜４ｍｏｌ／ｌ、さらに好ましくは、１ｍｏｌ／ｌ〜３ｍｏｌ／ｌである。前記カオトロピック塩としては、塩酸グアニジンが好ましいが、他のカオトロピック塩（イソチオシアン酸グアニジン、チオシアン酸グアニジン、尿素、グアニジン塩、イソチアン酸ナトリウム、ヨウ化ナトリウム、ヨウ化カリウム）を使用することもできる。また、これらの塩は単独または複数組み合わせて用いてもよい。 The concentration of the chaotropic salt in the nucleic acid solubilizing reagent solution is preferably 0.5 mol / l or more, more preferably 0.5 mol / l to 4 mol / l, still more preferably 1 mol / l to 3 mol / l. . As the chaotropic salt, guanidine hydrochloride is preferable, but other chaotropic salts (guanidine isothiocyanate, guanidine thiocyanate, urea, guanidine salt, sodium isothiocyanate, sodium iodide, potassium iodide) can also be used. These salts may be used alone or in combination.
界面活性剤は、例えば、ノニオン界面活性剤、カチオン界面活性剤、アニオン界面活性剤、両性界面活性剤を挙げることが出来る。本発明においてはノニオン界面活性剤をこのましく用いることができる。ノニオン界面活性剤は、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル系界面活性剤、ポリオキシエチレンアルキルエーテル系界面活性剤、脂肪酸アルカノールアミドを用いることができるが、好ましくは、ポリオキシエチレンアルキルエーテル系界面活性剤を用いることができる、さらに好ましくは、ポリオキシエチレンアルキルエーテル系界面活性剤は、ＰＯＥデシルエーテル、ＰＯＥラウリルエーテル、ＰＯＥトリデシルエーテル、ＰＯＥアルキレンデシルエーテル、ＰＯＥソルビタンモノラウレート、ＰＯＥソルビタンモノオレエート、ＰＯＥソルビタンモノステアレート、テトラオレイン酸ポリオキシエチレンソルビット、ＰＯＥアルキルアミン、ＰＯＥアセチレングリコールから選択されるポリオキシエチレンアルキルエーテル系界面活性剤である。 Examples of the surfactant include nonionic surfactants, cationic surfactants, anionic surfactants, and amphoteric surfactants. In the present invention, a nonionic surfactant can be preferably used. As the nonionic surfactant, a polyoxyethylene alkylphenyl ether surfactant, a polyoxyethylene alkyl ether surfactant, or a fatty acid alkanolamide can be used. Preferably, a polyoxyethylene alkyl ether surfactant is used. More preferably, the polyoxyethylene alkyl ether surfactant that can be used is POE decyl ether, POE lauryl ether, POE tridecyl ether, POE alkylene decyl ether, POE sorbitan monolaurate, POE sorbitan monooleate, Polyoxyethylene alkyl ether selected from POE sorbitan monostearate, polyoxyethylene sorbite tetraoleate, POE alkylamine, POE acetylene glycol A surfactant.
また、カチオン界面活性剤も好ましく用いることができる。さらに好ましくは、カチオン界面活性剤は、セチルトリメチルアンモニウムプロミド、ドデシルトリメチルアンモニウムクロリド、テトラデシルトリメチルアンモニウムクロリド、セチルピリジニウムクロリドから選択されるカチオン界面活性剤である。
これらの界面活性剤は、単独または複数組み合わせて用いてもよい。これら界面活性剤の核酸可溶化試薬溶液における濃度は０．１〜２０質量％であることが好ましい。
A cationic surfactant can also be preferably used. More preferably, the cationic surfactant is a cationic surfactant selected from cetyltrimethylammonium promide, dodecyltrimethylammonium chloride, tetradecyltrimethylammonium chloride, cetylpyridinium chloride.
These surfactants may be used alone or in combination. The concentration of these surfactants in the nucleic acid solubilizing reagent solution is preferably 0.1 to 20% by mass.
ＤＮＡなどＲＮＡ以外の核酸を回収する場合、前記の細胞膜および核膜を溶解し、核酸を可溶化して、検体から核酸を含む試料溶液を得る工程において、核酸可溶化試薬溶液にＲＮＡ分解酵素を加えることが好ましい。この場合、回収された核酸に共存するＲＮＡによる干渉を軽減することができる。また、ＤＮＡ分解酵素阻害剤を加えることも好ましい。一方、ＲＮＡなどＤＮＡ以外の核酸を回収する場合、核酸可溶化試薬溶液にＤＮＡ分解酵素を加えることが好ましい。この場合、回収された核酸に共存するＤＮＡによる干渉を軽減することができる。また、ＲＮＡ分解酵素阻害剤を加えることも好ましい。ＲＮＡ分解酵素阻害剤としては、ＲＮＡ分解酵素を特異的に阻害するものが好ましい。ＲＮＡ分解酵素は特に限定されず、例えば、リボヌクレアーゼ Ｈ（ＲＮａｓｅ Ｈ）等のＲＮＡ特異的分解酵素を好ましく用いることができる。ＤＮＡ分解酵素は特に限定されず、例えば、ＤＮａｓｅ Ｉ等のＤＮＡ特異的分解酵素を好ましく用いることができる。核酸分解酵素および核酸分解酵素阻害剤は、通常用いられる濃度で用いることが出来る。また、通常どおり加温処理することができる。加温処理は、タンパク質分解酵素による処理と同時におこなうことが好ましい。 When recovering nucleic acids other than RNA, such as DNA, in the step of dissolving the cell membrane and nuclear membrane, solubilizing the nucleic acid, and obtaining a sample solution containing the nucleic acid from the specimen, an RNase is added to the nucleic acid solubilizing reagent solution. It is preferable to add. In this case, interference by RNA coexisting with the recovered nucleic acid can be reduced. It is also preferable to add a DNA-degrading enzyme inhibitor. On the other hand, when recovering nucleic acids other than DNA such as RNA, it is preferable to add a DNA degrading enzyme to the nucleic acid solubilizing reagent solution. In this case, interference by DNA coexisting with the recovered nucleic acid can be reduced. It is also preferable to add an RNase inhibitor. As the RNase inhibitor, those that specifically inhibit RNase are preferable. The RNA degrading enzyme is not particularly limited, and for example, an RNA-specific degrading enzyme such as ribonuclease H (RNase H) can be preferably used. The DNA degrading enzyme is not particularly limited, and for example, a DNA-specific degrading enzyme such as DNase I can be preferably used. The nucleolytic enzyme and the nucleolytic enzyme inhibitor can be used at concentrations usually used. Moreover, it can be heated as usual. The heating treatment is preferably performed simultaneously with the treatment with the proteolytic enzyme.
核酸安定化剤としては、ヌクレアーゼの活性を不活性化させる作用を有するものが挙げられる。検体によっては、核酸を分解するヌクレアーゼ等が含まれていることがあり、核酸をホモジナイズするとこのヌクレアーゼが核酸に作用し、収量が激減することがある。前記核酸安定化剤は、検体中の核酸を安定に存在させることができ、これにより、核酸の回収量及び回収効率が向上し、検体の微量化及び迅速化が可能となり、好ましい。 Examples of the nucleic acid stabilizer include those having an action of inactivating nuclease activity. Depending on the sample, a nuclease or the like that degrades the nucleic acid may be contained. When the nucleic acid is homogenized, the nuclease acts on the nucleic acid, and the yield may be drastically reduced. The nucleic acid stabilizer is preferable because the nucleic acid in the sample can be stably present, thereby improving the recovery amount and recovery efficiency of the nucleic acid, enabling the sample to be reduced in volume and speeding up.
ヌクレアーゼの活性を不活性化させる作用を有する核酸安定化剤としては、一般的に還元剤として使用される化合物を用いることができる。還元剤としては、水素、ヨウ化水素、硫化水素、水素化アルミニウムリチウム、水素化ホウ素ナトリウム等の水素化化合物、アルカリ金属、マグネシウム、カルシウム、アルミニウム、亜鉛等の電気的陽性の大きい金属、またはそれのアマルガム、アルデヒド類、糖類、ギ酸、シュウ酸などの有機酸化物、メルカプト化合物等が挙げられる。中でもメルカプト化合物が好ましい。メルカプト化合物としては、Ｎ−アセチルシステイン、メルカプトエタノールや、アルキルメルカプタン等が挙げられる。特に、β−メルカプトエタノールが好ましい。メルカプト化合物は単独または複数組み合わせて用いてもよい。
核酸安定化剤は、前処理液における濃度は０．１〜２０質量％であることが好ましく、より好ましくは、０．３〜１５質量％で、用いることができる。メルカプト化合物は、前処理液における濃度は０．１〜１０質量％であることが好ましく、より好ましくは、０．５〜５質量％で、用いることができる。
As the nucleic acid stabilizer having an action of inactivating the nuclease activity, compounds generally used as a reducing agent can be used. Examples of the reducing agent include hydrogen, hydrogen iodide, hydrogen sulfide, lithium aluminum hydride, hydrogenated compounds such as sodium borohydride, alkali metals, metals with high electrical positiveity such as magnesium, calcium, aluminum, and zinc, or Amalgams, aldehydes, saccharides, organic acids such as formic acid and oxalic acid, mercapto compounds and the like. Of these, mercapto compounds are preferred. Examples of mercapto compounds include N-acetylcysteine, mercaptoethanol, alkyl mercaptan, and the like. In particular, β-mercaptoethanol is preferable. Mercapto compounds may be used alone or in combination.
The concentration of the nucleic acid stabilizer in the pretreatment solution is preferably 0.1 to 20% by mass, and more preferably 0.3 to 15% by mass. The concentration of the mercapto compound in the pretreatment liquid is preferably 0.1 to 10% by mass, and more preferably 0.5 to 5% by mass.
前記の細胞膜および核膜を溶解し、核酸を可溶化して、検体から核酸を含む試料溶液を得る工程において、核酸を含む試料溶液には、消泡剤を含有させることも好ましい。前記消泡剤としては、シリコン系消泡剤とアルコール系消泡剤の２つの成分が好ましく挙げられ、また、アルコール系消泡剤としては、アセチレングリコール系界面活性剤が好ましい。 In the step of dissolving the cell membrane and the nuclear membrane and solubilizing the nucleic acid to obtain the sample solution containing the nucleic acid from the specimen, the sample solution containing the nucleic acid preferably contains an antifoaming agent. The antifoaming agent preferably includes two components, a silicon-based antifoaming agent and an alcohol-based antifoaming agent, and the alcohol-based antifoaming agent is preferably an acetylene glycol surfactant.
消泡剤の具体例としては、シリコン系消泡剤（例えば、シリコーンオイル、ジメチルポリシロキサン、シリコーンエマルジョン、変性ポリシロキサン、シリコーンコンパウンドなど）、アルコール系消泡剤（例えば、アセチレングリコール、ヘプタノール、エチルエキサノール、高級アルコール、ポリオキシアルキレングリコールなど）、エーテル系消泡剤（例えば、ヘプチルセロソルブ、ノニルセロソルブ−３−ヘプチルコルビトールなど）、油脂系消泡剤（例えば、動植物油など）、脂肪酸系消泡剤（例えば、ステアリン酸、オレイン酸、パルミチン酸など）、金属セッケン系消泡剤（例えば、ステアリン酸アルミ、ステアリン酸カルシウムなど）、脂肪酸エステル系消泡剤（例えば、天然ワックス、トリブチルホスフェートなど）、リン燐酸エステル系消泡剤（例えば、オクチルリン酸ナトリウムなど）、アミン系消泡剤（例えば、ジアミルアミンなど）、アミド系消泡剤（例えば、ステアリン酸アミドなど）、その他の消泡剤（例えば、硫酸第二鉄、ボーキサイトなど）などが挙げられる。特に好ましくは、消泡剤として、シリコン系消泡剤とアルコール系消泡剤の２つの成分を組み合わせて使用することができる。また、アルコール系消泡剤としては、アセチレングリコール系界面活性剤を使用することも好ましい。 Specific examples of antifoaming agents include silicon-based antifoaming agents (eg, silicone oil, dimethylpolysiloxane, silicone emulsion, modified polysiloxane, silicone compound, etc.), alcohol-based antifoaming agents (eg, acetylene glycol, heptanol, ethyl). Exanol, higher alcohol, polyoxyalkylene glycol, etc.), ether type antifoaming agents (eg, heptylcellosolve, nonylcellosolv-3-heptylcorbitol, etc.), oils and fats type antifoaming agents (eg, animal and vegetable oils, etc.), fatty acid type Antifoaming agents (eg, stearic acid, oleic acid, palmitic acid, etc.), metal soap type antifoaming agents (eg, aluminum stearate, calcium stearate, etc.), fatty acid ester antifoaming agents (eg, natural wax, tributyl phosphate, etc.) ) Phosphate-based antifoaming agents (for example, sodium octyl phosphate), amine-based antifoaming agents (for example, diamylamine), amide-based antifoaming agents (for example, stearamide), and other antifoaming agents (for example, Ferric sulfate, bauxite, etc.). Particularly preferably, the antifoaming agent can be used in combination of two components, a silicon antifoaming agent and an alcohol antifoaming agent. Moreover, it is also preferable to use an acetylene glycol surfactant as the alcohol-based antifoaming agent.
核酸可溶化試薬は、乾燥された状態で供給されることも好ましい。また、凍結乾燥のように乾燥された状態のタンパク質分解酵素を予め含む容器を用いることができる。前記の、乾燥された状態で供給される核酸可溶化試薬、および乾燥された状態のタンパク質分解酵素を予め含む容器の両方を用いて、核酸を含む試料溶液を得ることもできる。前記の方法で核酸を含む試料溶液を得る場合、核酸可溶化試薬およびタンパク質分解酵素の保存安定性が良く、核酸収量を変えずに操作を簡便にすることができる。 It is also preferable that the nucleic acid solubilizing reagent is supplied in a dried state. Moreover, the container previously containing the proteolytic enzyme of the dried state like freeze-drying can be used. The sample solution containing the nucleic acid can also be obtained by using both the nucleic acid solubilizing reagent supplied in a dried state and the container previously containing the proteolytic enzyme in a dried state. When a sample solution containing nucleic acid is obtained by the above-described method, the storage stability of the nucleic acid solubilizing reagent and the proteolytic enzyme is good, and the operation can be simplified without changing the nucleic acid yield.
検体と核酸可溶化試薬溶液とを混合する方法は、特に限定されない。混合する際、攪拌装置により３０から３０００ｒｐｍで１秒から３分間混合することが好ましい。これにより、分離精製される核酸収量を増加させることができる。または、転倒混和を５から３０回行うことで混合することも好ましい。また、ピペッティング操作を、１０から５０回行うことによっても混合することができる、この場合、簡便な操作で分離精製される核酸収量を増加させることができる。
The method for mixing the specimen and the nucleic acid solubilizing reagent solution is not particularly limited. When mixing, it is preferable to mix at 30 to 3000 rpm for 1 second to 3 minutes with a stirrer. Thereby, the yield of nucleic acid to be separated and purified can be increased. Or it is also preferable to mix by inversion mixing 5 to 30 times. In addition, mixing can also be performed by performing
タンパク質分解酵素を含む核酸可溶化試薬溶液を用いる場合、検体と核酸可溶化試薬溶液との混合液を、タンパク質分解酵素の至適温度および反応時間でインキュベートすることにより、分離精製される核酸の収量を増加させることがきる。インキュベーション温度は、通常２０℃〜７０℃、好ましくはタンパク分解酵素の至適温度であり、インキュベーション時間は通常１分〜１８時間、好ましくはタンパク分解酵素の至適反応時間である。インキュベーション方法は特に限定されず、湯浴や加温器に入れることで行うことができる。 When using a nucleic acid solubilizing reagent solution containing a proteolytic enzyme, the yield of the nucleic acid to be separated and purified by incubating the mixture of the sample and the nucleic acid solubilizing reagent solution at the optimal temperature and reaction time of the proteolytic enzyme. Can be increased. The incubation temperature is usually 20 ° C. to 70 ° C., preferably the optimum temperature for the proteolytic enzyme, and the incubation time is usually 1 minute to 18 hours, preferably the optimum reaction time for the proteolytic enzyme. The incubation method is not particularly limited, and can be performed by putting it in a hot water bath or a warmer.
前記の細胞膜および核膜を溶解し、核酸を可溶化して、検体から核酸を含む試料溶液を得る工程において、インキュベートされた混合液に添加する水溶性有機溶媒は、アルコール類、アセトン、アセトニトリル、ジメチルホルムアミド等挙げられる。特にアルコールを好ましく用いることができる。
アルコールは、1級アルコール、２級アルコール、３級アルコールのいずれでも良い。アルコールがメチルアルコール、エチルアルコール、プロピルアルコール及びその異性体、ブチルアルコール及びその異性体を好ましく用いることができる。より好ましくはエタノールを用いることができる。これらの水溶性有機溶媒は単独または複数組み合わせて用いてもよい。これら水溶性有機溶媒の核酸可溶化試薬溶液における濃度は１〜２０質量％であることが好ましい。これら水溶性有機溶媒の核酸を含む試料溶液における最終濃度は、５〜９０質量％であることが好ましい。
In the step of dissolving the cell membrane and the nuclear membrane and solubilizing the nucleic acid to obtain a sample solution containing the nucleic acid from the specimen, the water-soluble organic solvent added to the incubated mixture is alcohols, acetone, acetonitrile, And dimethylformamide. In particular, alcohol can be preferably used.
The alcohol may be any of primary alcohol, secondary alcohol, and tertiary alcohol. As the alcohol, methyl alcohol, ethyl alcohol, propyl alcohol and its isomer, butyl alcohol and its isomer can be preferably used. More preferably, ethanol can be used. These water-soluble organic solvents may be used alone or in combination. The concentration of these water-soluble organic solvents in the nucleic acid solubilizing reagent solution is preferably 1 to 20% by mass. The final concentration of the sample solution containing nucleic acids of these water-soluble organic solvents is preferably 5 to 90% by mass.
前記の細胞膜および核膜を溶解し、核酸を可溶化して、検体から核酸を含む試料溶液を得る工程において、試料溶液は、好ましくはｐＨ５〜１０、より好ましくはｐＨ６〜９、さらに好ましくはｐＨ７〜８のものが用いられる。 In the step of dissolving the cell membrane and the nuclear membrane and solubilizing the nucleic acid to obtain a sample solution containing the nucleic acid from the specimen, the sample solution is preferably pH 5-10, more preferably pH 6-9, and even more preferably pH 7. ~ 8 are used.
また、前記の細胞膜および核膜を溶解し、核酸を可溶化して、検体から核酸を含む試料溶液を得る工程において、得られた核酸を含む試料溶液は、表面張力は０．０５Ｊ／ｍ２以下であることが好ましく、また、粘度は、１〜１００００ｍＰａであることが好ましく、比重は、０．８〜１．２であることが好ましい。 In the step of dissolving the cell membrane and the nuclear membrane and solubilizing the nucleic acid to obtain a sample solution containing the nucleic acid from the specimen, the sample solution containing the nucleic acid thus obtained has a surface tension of 0.05 J / m 2. The viscosity is preferably 1 to 10000 mPa, and the specific gravity is preferably 0.8 to 1.2.
以下、洗浄工程について説明する。洗浄を行うことにより、核酸の回収量及び純度が向上し、必要な核酸を含む検体の量を微量とすることができる。洗浄工程は、迅速化のためには１回の洗浄で済ませてもよく、また純度がより重要な場合には複数回洗浄を繰返すことが好ましい。 Hereinafter, the cleaning process will be described. By performing the washing, the amount and purity of the nucleic acid recovered can be improved, and the amount of the specimen containing the necessary nucleic acid can be made very small. The cleaning step may be completed only once for speeding up, and it is preferable to repeat the cleaning multiple times when purity is more important.
洗浄工程において、洗浄液は、自動注入装置もしくはこれらと同じ機能をもつ供給手段を使用して、核酸吸着性多孔性膜を収容した核酸分離精製カートリッジへ供給される。供給された洗浄液は、核酸分離精製カートリッジの一の開口（核酸を含む試料溶液を注入した開口）から供給され、該開口に結合された圧力差発生装置を用いて核酸分離精製カートリッジ内を加圧状態にして核酸吸着性多孔性膜を通過させ、一の開口と異なる開口より排出させることができる。また、洗浄液を一の開口から供給し、同じ一の開口より排出させることもできる。さらには、核酸分離精製カートリッジの核酸を含む試料溶液を供給した一の開口と異なる開口より洗浄液を供給し、排出させることも可能である。しかしながら、核酸分離精製カートリッジの一の開口から供給し、核酸吸着性多孔性膜を通過させ、一の開口と異なる開口より排出さる方法は洗浄効率が優れてより好ましい。洗浄工程における洗浄液の液量は、２μｌ/ｍｍ2以上が好ましい。洗浄液量が多量であれば洗浄効果は向上するが、操作性を保ち、試料の流出を抑止するためには、２００μｌ/ｍｍ2以下が好ましい。 In the washing step, the washing liquid is supplied to the nucleic acid separation / purification cartridge containing the nucleic acid-adsorbing porous membrane using an automatic injection apparatus or a supply means having the same function as these. The supplied cleaning solution is supplied from one opening of the nucleic acid separation and purification cartridge (opening into which the sample solution containing nucleic acid is injected), and the inside of the nucleic acid separation and purification cartridge is pressurized using a pressure difference generator coupled to the opening. It can be passed through the nucleic acid-adsorbing porous membrane in a state and discharged from an opening different from the one opening. Also, the cleaning liquid can be supplied from one opening and discharged from the same opening. Furthermore, it is also possible to supply and discharge the cleaning liquid from an opening different from the one opening to which the sample solution containing the nucleic acid in the cartridge for nucleic acid separation and purification is supplied. However, a method of supplying from one opening of the nucleic acid separation / purification cartridge, passing through the nucleic acid-adsorptive porous membrane, and discharging from a different opening from the one opening is more preferable because of excellent cleaning efficiency. The amount of the cleaning liquid in the cleaning process is preferably 2 μl / mm 2 or more. If the amount of the cleaning liquid is large, the cleaning effect is improved, but 200 μl / mm 2 or less is preferable in order to maintain the operability and suppress the outflow of the sample.
洗浄工程において、洗浄液を核酸吸着性多孔性膜に通過させる場合の流速は、膜の単位面積（ｃｍ2）あたり、２〜１５００μＬ/secであることが好ましく、５〜７００μＬ/secであることがより好ましい。通過速度を下げて時間を掛ければ洗浄がそれだけ十分に行なわれることになるが、核酸の分離精製操作の迅速化も重要であるので前記した範囲が選択される。 In the washing step, the flow rate when the washing solution is passed through the nucleic acid-adsorbing porous membrane is preferably 2 to 1500 μL / sec, preferably 5 to 700 μL / sec, per unit area (cm 2 ) of the membrane. More preferred. If the passage speed is lowered and time is taken, the washing is sufficiently performed. However, since the speed of the separation and purification operation of the nucleic acid is important, the above-mentioned range is selected.
洗浄工程において、洗浄液の液温は４〜７０℃であることが好ましい。さらには、洗浄液の液温を室温とすることがより好ましい。また洗浄工程において、その核酸分離精製カートリッジを器械的な振動や超音波による攪拌を与えながら、または遠心分離により洗浄することもできる。 In the washing step, the temperature of the washing solution is preferably 4 to 70 ° C. Furthermore, it is more preferable that the temperature of the cleaning liquid is room temperature. In the washing step, the cartridge for separating and purifying nucleic acid can be washed while being subjected to mechanical vibration, stirring by ultrasonic waves, or by centrifugation.
洗浄工程において、洗浄液には、一般的には核酸分解酵素のような酵素を含ませないが、タンパク質等の夾雑物質を分解する酵素を含ませることができる。また、場合によってはＤＮＡ分解酵素、ＲＮＡ分解酵素などを含ませることもできる。ＤＮＡ分解酵素を含む洗浄液を使用することにより、検体中のＲＮＡのみを選択的に回収することができる。逆に、ＲＮＡ分解酵素を含む洗浄液を使用することにより、検体中のＤＮＡのみを選択的に回収することができる。 In the washing step, the washing solution generally does not contain an enzyme such as a nucleolytic enzyme, but can contain an enzyme that degrades contaminants such as proteins. In some cases, a DNA degrading enzyme, an RNA degrading enzyme, or the like can be included. By using a washing solution containing a DNA degrading enzyme, only RNA in the sample can be selectively recovered. Conversely, by using a washing solution containing an RNase, only DNA in the sample can be selectively recovered.
洗浄工程において、洗浄液は、水溶性有機溶媒及び/または水溶性塩を含んでいる溶液であることが好ましい。洗浄液は、核酸吸着性多孔性膜に核酸と共に吸着した試料溶液中の不純物を洗い流す機能を有する必要がある。そのためには、核酸吸着性多孔性膜から核酸は脱着させないが不純物は脱着させる組成であることが必要である。この目的には、核酸がアルコール等の水溶性有機溶媒に難溶性であるので、核酸を保持したまま核酸以外の成分を脱着させるのに適している。また、水溶性塩を添加することにより、核酸の吸着効果が高まるので、不要成分の選択的除去作用が向上する。 In the washing step, the washing liquid is preferably a solution containing a water-soluble organic solvent and / or a water-soluble salt. The washing liquid needs to have a function of washing out impurities in the sample solution adsorbed together with the nucleic acid on the nucleic acid adsorbing porous membrane. For this purpose, it is necessary to have a composition in which nucleic acids are not desorbed from the nucleic acid-adsorbing porous membrane but impurities are desorbed. For this purpose, since the nucleic acid is hardly soluble in water-soluble organic solvents such as alcohol, it is suitable for desorbing components other than the nucleic acid while retaining the nucleic acid. In addition, by adding a water-soluble salt, the effect of adsorbing nucleic acids is enhanced, so that the selective removal of unnecessary components is improved.
洗浄液に含まれる水溶性有機溶媒としては、メタノール、エタノール、イソプロパノール、ｎ−イソプロパノール、ブタノール、アセトンなどを用いることができ、中でもエタノ―ルを用いることが好ましい。洗浄液中に含まれる水溶性有機溶媒の量は、２０〜１００重量％であることが好ましく、４０〜８０重量％であることがより好ましい。 As the water-soluble organic solvent contained in the cleaning liquid, methanol, ethanol, isopropanol, n-isopropanol, butanol, acetone and the like can be used, and ethanol is particularly preferable. The amount of the water-soluble organic solvent contained in the cleaning liquid is preferably 20 to 100% by weight, and more preferably 40 to 80% by weight.
一方、洗浄液に含まれる水溶性塩は、ハロゲン化物の塩であることが好ましく、中でも塩化物が好ましい。また、水溶性塩は、一価または二価のカチオンであることが好ましく、特にアルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩が好ましく、中でもナトリウム塩及びカリウム塩が好ましくナトリウム塩が最も好ましい。水溶性塩が洗浄液中に含まれる場合、その濃度は１０ｍｍｏｌ／ｌ以上であることが好ましく、その上限は不純物の溶解性を損なわない範囲であれば特に問わないが、１ｍｏｌ／ｌ以下であることが好ましく、０．１ｍｏｌ／ｌ以下であることがより好ましい。とりわけ、水溶性塩が塩化ナトリウムであり、さらには、塩化ナトリウムが２０ｍｍｏｌ／ｌ以上含まれていることが特に好ましい。 On the other hand, the water-soluble salt contained in the cleaning liquid is preferably a halide salt, and chloride is particularly preferable. The water-soluble salt is preferably a monovalent or divalent cation, particularly preferably an alkali metal salt or an alkaline earth metal salt. Among them, a sodium salt and a potassium salt are preferable, and a sodium salt is most preferable. When the water-soluble salt is contained in the cleaning liquid, the concentration is preferably 10 mmol / l or more, and the upper limit is not particularly limited as long as the solubility of impurities is not impaired, but it is 1 mol / l or less. Is preferable, and 0.1 mol / l or less is more preferable. In particular, the water-soluble salt is sodium chloride, and it is particularly preferable that sodium chloride is contained in an amount of 20 mmol / l or more.
洗浄液は、カオトロッピク物質を含んでいないことが好ましい。それによって、洗浄工程に引き続く回収工程にカオトロピック物質が混入する可能性を減らすことができる。回収工程時に、カオトロピック物質が混入すると、しばしばＰＣＲ反応等の酵素反応を阻害するので、後の酵素反応等を考慮すると洗浄液にカオトロッピク物質を含まないことが理想的である。また、カオトロピック物質は、腐食性で有害であるので、この点でもカオトロピック物質を用いないで済むことは、実験者にとっても試験操作の安全上極めて有利である。ここで、カオトロピック物質とは、前記したように尿素、グアニジン塩、イソチアン酸ナトリウム、ヨウ化ナトリウム、ヨウ化カリウムなどである。 It is preferable that the cleaning liquid does not contain a chaotropic substance. Thereby, the possibility that the chaotropic substance is mixed in the recovery process subsequent to the cleaning process can be reduced. When a chaotropic substance is mixed during the recovery step, an enzyme reaction such as a PCR reaction is often inhibited. Therefore, it is ideal that the washing liquid does not contain a chaotropic substance in consideration of the subsequent enzyme reaction or the like. In addition, since chaotropic substances are corrosive and harmful, it is extremely advantageous for the experimenter from the viewpoint of safety of the test operation that the chaotropic substances need not be used. Here, the chaotropic substance is urea, guanidine salt, sodium isothiocyanate, sodium iodide, potassium iodide or the like as described above.
従来、核酸分離精製工程における洗浄工程の際、洗浄液がカートリリッジなどの容器に対する濡れ性が高いため、しばしば洗浄液が容器中に残留することになり、洗浄工程に続く回収工程への洗浄液の混入して核酸の純度の低下や次工程における反応性の低下などの原因となっている。したがって、カートリッジなどの容器を用いて核酸の吸着及び脱着を行う場合、吸着、洗浄時に用いる液、特に洗浄液が、次の工程に影響を及ぼさないように、カートリッジ内に洗浄残液が残留しないことは重要である。 Conventionally, during the washing process in the nucleic acid separation and purification process, since the washing liquid has high wettability to containers such as cartridges, the washing liquid often remains in the container, and the washing liquid is mixed into the recovery process following the washing process. This causes a decrease in nucleic acid purity and a decrease in reactivity in the next step. Therefore, when nucleic acid is adsorbed and desorbed using a container such as a cartridge, the washing residual liquid should not remain in the cartridge so that the liquid used for adsorption and washing, particularly the washing liquid, does not affect the next step. Is important.
したがって、洗浄工程における洗浄液が次工程の回収液に混入することを防止して、洗浄液のカートリッジ内への残留を最小限に留めるため、洗浄液の表面張力を０．０３５Ｊ／ｍ２未満にすることが好ましい。表面張力を低くすれば洗浄液とカートリッジの濡れ性が向上し、残留する液量を抑えることができる。 Therefore, the surface tension of the cleaning liquid should be less than 0.035 J / m 2 in order to prevent the cleaning liquid in the cleaning process from being mixed into the recovered liquid in the next process and to keep the cleaning liquid remaining in the cartridge to a minimum. Is preferred. If the surface tension is lowered, the wettability between the cleaning liquid and the cartridge is improved, and the remaining liquid volume can be suppressed.
逆に、洗浄工程における洗浄液のカートリッジへの残留を減少させる目的で、洗浄液の表面張力を０．０３５Ｊ／ｍ２以上にして、カートリッジとの撥水性を高めて液滴を形成させ、その液滴が流れ落ちることによって残留する液量を抑えることもできる。核酸を吸着した多孔性膜、回収液、洗浄液の組合せなどによっていずれかの表面張力が選択される。 Conversely, for the purpose of reducing the remaining of the cleaning liquid in the cartridge in the cleaning process, the surface tension of the cleaning liquid is set to 0.035 J / m 2 or more to improve the water repellency with the cartridge to form droplets. The amount of remaining liquid can be suppressed by flowing down. Either surface tension is selected depending on the combination of the porous membrane adsorbing nucleic acid, the recovery liquid, the cleaning liquid, and the like.
本発明に係る核酸吸着性多孔性膜を利用して洗浄工程を簡素化することができる。（１）洗浄液が核酸吸着性多孔性膜を通過する回数を1回でよい、（２）洗浄工程を室温でできる。（３）洗浄後、直ちに回収液をカートリッジに注入することができる。（４）前記（１）、（２）、（３）のいずれか1つもしくは２つ以上のも可能である。従来法においては、洗浄液中に含まれる有機溶媒を迅速に取り除くため、しばしば乾燥工程を必要としたが、本発明に係る核酸吸着性多孔性膜は薄膜であるためにこれを省略できるからである。 The washing process can be simplified by using the nucleic acid-adsorbing porous membrane according to the present invention. (1) The number of times the washing solution passes through the nucleic acid-adsorbing porous membrane may be one, and (2) the washing step can be performed at room temperature. (3) The recovered liquid can be poured into the cartridge immediately after washing. (4) Any one or two or more of (1), (2), and (3) are also possible. In the conventional method, in order to quickly remove the organic solvent contained in the cleaning solution, a drying step is often required. However, since the nucleic acid-adsorptive porous membrane according to the present invention is a thin film, it can be omitted. .
従来、核酸分離精製工程において、洗浄工程の際、しばしば洗浄液が飛散し他に付着することによって、試料のコンタミネーション（汚染）が起きることが問題となっている。洗浄工程におけるこの種のコンタミネーションは、二個の開口を有する容器内に核酸吸着性多性孔膜を収容した核酸分離精製カートリッジと廃液容器の形状とを工夫することによって抑止することができる。 Conventionally, in the nucleic acid separation and purification process, there is a problem that contamination of the sample occurs due to the washing liquid often scattering and adhering to the other during the washing process. This kind of contamination in the washing process can be suppressed by devising the shape of the waste liquid container and the nucleic acid separation and purification cartridge in which the nucleic acid-adsorbing polyporous membrane is housed in a container having two openings.
以下に核酸吸着性多性孔膜から核酸を脱着させて回収する工程について示す。回収工程において、回収液は、自動注入装置、もしくはこれらと同じ機能をもつ供給手段を使用して、核酸吸着性多孔性膜を装着した核酸分離精製カートリッジへ供給される。回収液は、核酸分離精製カートリッジの一の開口（核酸を含む試料溶液を注入した開口）から供給され、該開口に結合された圧力差発生装置を用いて核酸分離精製カートリッジ内を加圧状態にして核酸吸着性多孔性膜を通過させ、一の開口と異なる開口より排出させることができる。また、回収液を一の開口から供給し、同じ一の開口より排出させることもできる。さらには、核酸分離精製カートリッジの核酸を含む試料溶液を供給した一の開口と異なる開口より回収液を供給し、排出させることも可能である。しかしながら、核酸分離精製カートリッジの一の開口から供給し、核酸吸着性多孔性膜を通過させ、一の開口と異なる開口より排出さる方法は回収効率が優れてより好ましい。 The process of desorbing and recovering nucleic acid from the nucleic acid adsorbing polyporous membrane is shown below. In the recovery step, the recovery solution is supplied to the nucleic acid separation / purification cartridge equipped with the nucleic acid-adsorbing porous membrane using an automatic injection device or a supply means having the same function. The recovery liquid is supplied from one opening of the nucleic acid separation and purification cartridge (opening into which the sample solution containing nucleic acid is injected), and the inside of the nucleic acid separation and purification cartridge is pressurized using a pressure difference generator coupled to the opening. Thus, the nucleic acid-adsorbing porous membrane can be passed through and discharged from an opening different from the one opening. Further, the recovery liquid can be supplied from one opening and discharged from the same opening. Furthermore, it is also possible to supply and discharge the recovery liquid from an opening different from the one opening to which the sample solution containing the nucleic acid in the nucleic acid separation and purification cartridge is supplied. However, a method of supplying from one opening of the nucleic acid separation and purification cartridge, passing through the nucleic acid-adsorptive porous membrane, and discharging from an opening different from the one opening is more preferable because of excellent recovery efficiency.
検体から調整した核酸を含む試料溶液の体積に対して、回収液の体積を調整して核酸の脱着を行うことができる。分離精製された核酸を含む回収液量は、そのとき使用する検体量による。一般的によく使われる回収液量は数１０から数１００μｌであるが、検体量が極微量である時や、逆に大量の核酸を分離精製したい場合には回収液量は１μｌから数１０ｍｌの範囲で変える事ができる。 Nucleic acid can be desorbed by adjusting the volume of the recovered liquid relative to the volume of the sample solution containing the nucleic acid prepared from the specimen. The amount of the recovered liquid containing the separated and purified nucleic acid depends on the amount of sample used at that time. In general, the amount of the recovered liquid is several tens to several hundreds of μl. However, when the amount of the sample is extremely small, or when it is desired to separate and purify a large amount of nucleic acid, the amount of the recovered liquid is 1 μl to several tens of ml. You can change the range.
回収液としては好ましくは精製蒸留水、Ｔｒｉｓ／ＥＤＴＡバッファ等が使用できる。また、回収した核酸をＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）に供する場合、ＰＣＲ反応において用いる緩衝溶液 (例えば、ＫＣｌ ５０ｍｍｏｌ／ｌ、Ｔｒｉｓ−Ｃｌ １０ｍｍｏｌ／ｌ、ＭｇＣｌ2 １．５ｍｍｏｌ／ｌを最終濃度とする水溶液)を用いることもできる。
The recovered liquid is preferably purified distilled water, Tris / EDTA buffer or the like. When the recovered nucleic acid is subjected to PCR (polymerase chain reaction), a buffer solution used in the PCR reaction (for example, KCl 50 mmol / l, Tris-
回収液のｐＨは、ｐＨ２〜１１であることが好ましい。さらには、ｐＨ５〜９であることが好ましい。また特にイオン強度と塩濃度は吸着核酸の溶出に効果を及ぼす。回収液は、２９０ｍｍｏｌ／Ｌ以下のイオン強度であることが好ましく、さらには、９０ｍｍｏｌ／Ｌ以下の塩濃度であることが好ましい。こうすることで、核酸の回収率が向上し、より多くの核酸を回収できることができる。回収される核酸は１本鎖でもよく、２本鎖でも良い。 The pH of the recovery liquid is preferably pH 2-11. Furthermore, it is preferable that it is pH 5-9. In particular, ionic strength and salt concentration have an effect on the elution of adsorbed nucleic acids. The recovered liquid preferably has an ionic strength of 290 mmol / L or less, and more preferably has a salt concentration of 90 mmol / L or less. By doing so, the recovery rate of nucleic acids can be improved, and more nucleic acids can be recovered. The recovered nucleic acid may be single-stranded or double-stranded.
回収液の体積を当初の核酸を含む試料溶液の体積と比較して少なくすることによって、濃縮された核酸を含む回収液を得ることができる。好ましくは、(回収液体積)：(試料溶液体積)＝１：１００〜９９：１００、更に好ましくは、(回収液体積)：(試料溶液体積)＝１：１０〜９：１０にすることができる。これにより核酸分離精製後工程において濃縮のための操作をすることなく、簡単に核酸を濃縮できる。これらの方法により検体よりも核酸が濃縮されている核酸溶液を得る方法を提供できる。 By reducing the volume of the recovery solution compared to the volume of the sample solution containing the original nucleic acid, a recovery solution containing concentrated nucleic acid can be obtained. Preferably, (collected liquid volume) :( sample solution volume) = 1: 100 to 99: 100, more preferably (collected liquid volume) :( sample solution volume) = 1: 10 to 9:10. it can. Thus, the nucleic acid can be easily concentrated without performing an operation for concentration in the step after the separation and purification of the nucleic acid. By these methods, it is possible to provide a method for obtaining a nucleic acid solution in which the nucleic acid is more concentrated than the specimen.
また別の方法としては、回収液の体積を当初の核酸を含む試料溶液よりも多い条件で核酸の脱着を行うことにより、希望の濃度の核酸を含む回収液を得ることができ、次工程（ＰＣＲなど）に適した濃度の核酸を含む回収液を得ることができる。好ましくは、(回収液体積)：(試料溶液体積)＝１：１〜５０：１、更に好ましくは、 (回収液体積)：(試料溶液体積)＝１：１〜５：１にすることができる。これにより核酸分離精製後に濃度調整をする煩雑さがなくなるというメリットを得られる。更に、十分量の回収液を使用することにより、多孔性膜からの核酸回収率の増加を図ることができる。 As another method, nucleic acid is desorbed under the condition that the volume of the recovery solution is larger than that of the sample solution containing the initial nucleic acid, thereby obtaining a recovery solution containing the nucleic acid of a desired concentration. A recovery solution containing nucleic acid at a concentration suitable for PCR and the like can be obtained. Preferably, (recovered liquid volume) :( sample solution volume) = 1: 1 to 50: 1, more preferably (recovered liquid volume) :( sample solution volume) = 1: 1 to 5: 1. it can. As a result, there is an advantage that there is no need to adjust the concentration after separation and purification of nucleic acid. Furthermore, by using a sufficient amount of the recovery liquid, it is possible to increase the nucleic acid recovery rate from the porous membrane.
回収液の注入回数は限定されるものではなく、１回でも複数回でもよい。通常、迅速、簡便に核酸を分離精製する場合は、１回の回収で実施するが、大量の核酸を回収する場合等複数回にわたり回収液を注入する事がある。 The number of injections of the recovery liquid is not limited and may be one time or multiple times. Usually, when the nucleic acid is separated and purified quickly and easily, it is carried out by one collection, but the collection liquid may be injected several times, such as when collecting a large amount of nucleic acid.
回収工程においては、核酸の回収液をその後の後工程に使用できる組成にしておくことが可能である。分離精製された核酸は、しばしばＰＣＲ(ポリメラーゼチェインリアクション)法により増幅される。この場合、分離精製された核酸溶液はＰＣＲ法に適したバッファー液で希釈する必要がある。本方法による回収工程において、回収液にＰＣＲ法に適したバッファー液を用いることで、その後のＰＣＲ工程へ簡便、迅速に移行することができる。 In the recovery step, the nucleic acid recovery solution can be made into a composition that can be used in the subsequent subsequent steps. The separated and purified nucleic acid is often amplified by a PCR (polymerase chain reaction) method. In this case, the separated and purified nucleic acid solution needs to be diluted with a buffer solution suitable for the PCR method. In the recovery step according to this method, a buffer solution suitable for the PCR method is used as the recovery solution, so that the subsequent PCR step can be easily and rapidly transferred.
また、回収工程において、核酸の回収液に回収した核酸の分解を防ぐための安定化剤を添加しておくことも可能である。安定化剤としては、抗菌剤、抗カヒ゛剤や核酸分解抑制剤などを添加することができる。核酸分解酵素の阻害剤としてはＥＤＴＡなどが上げられる。また別の実施態様として、回収容器にあらかじめ安定化剤を添加しておくこともできる。 In the recovery step, a stabilizer for preventing degradation of the recovered nucleic acid can be added to the nucleic acid recovery solution. As a stabilizer, an antibacterial agent, an anti-fouling agent, a nucleic acid degradation inhibitor and the like can be added. Examples of the nucleolytic enzyme inhibitor include EDTA. As another embodiment, a stabilizer may be added to the collection container in advance.
回収工程で用いられる回収容器には特に限定はないが、２６０ｎｍの吸収が無い素材で作製された回収容器を用いることができる。この場合、回収した核酸溶液の濃度を、他の容器に移し替えずに測定できる。２６０ｎｍに吸収のない素材は、例えば石英ガラス等が挙げられるがそれに限定されるものではない。 The collection container used in the collection step is not particularly limited, but a collection container made of a material that does not absorb 260 nm can be used. In this case, the concentration of the recovered nucleic acid solution can be measured without transferring to another container. Examples of the material that does not absorb at 260 nm include quartz glass, but are not limited thereto.
１０，２０ カートリッジ
１１，２１ カートリッジ本体
１２，２２ カートリッジキャップ
１２ｃ，２２ｃ リブ
１６ 加圧ノズル
Ｆ 核酸吸着性固相担体
Ｔ 溶液
10, 20
Claims (4)
有底円筒形状を有し、前記核酸を捕捉する核酸吸着性固相担体が底部に配置され、且つ、前記底部に漏斗状の排出部が形成されたカートリッジ本体と、
前記カートリッジ本体の開放側端部に固定されるカートリッジキャップとを備え、
前記カートリッジキャップに、前記カートリッジ本体より径が小さく、前記加圧ノズルが押圧される円孔状のノズル押圧口が形成されていることを特徴とする核酸抽出用のカートリッジ。 A cartridge for nucleic acid extraction that captures nucleic acid contained in a sample solution, discharges the dispensed solution with pressurized air supplied from a pressure nozzle, and extracts the nucleic acid,
A cartridge main body having a bottomed cylindrical shape, a nucleic acid-adsorbing solid phase carrier that captures the nucleic acid is disposed at the bottom, and a funnel-shaped discharge portion is formed at the bottom;
A cartridge cap fixed to the open side end of the cartridge body,
A cartridge for nucleic acid extraction, wherein the cartridge cap is formed with a circular nozzle pressing port that is smaller in diameter than the cartridge body and that presses the pressure nozzle.
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