JP4284250B2 - Nucleic acid separation and purification method - Google Patents

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本発明は、核酸を分離精製する方法に関する。より詳細には、本発明は、核酸を分離精製する方法において使用する固相および核酸を含む試料溶液、並びにこれらを使用して核酸を分離精製する方法に関する。   The present invention relates to a method for separating and purifying nucleic acid. More specifically, the present invention relates to a sample solution containing a solid phase and a nucleic acid used in a method for separating and purifying nucleic acids, and a method for separating and purifying nucleic acids using them.

核酸は様々な分野で種々の形態で使用されている。例えば、組換え核酸技術の領域においては、核酸をプローブ、ゲノム核酸、およびプラスミド核酸の形態で用いることが要求される。   Nucleic acids are used in various forms in various fields. For example, in the area of recombinant nucleic acid technology, it is required to use nucleic acids in the form of probes, genomic nucleic acids, and plasmid nucleic acids.

核酸は、診断分野においても、種々の形態で種々の目的に用いられている。例えば、核酸プローブは、ヒトの病原体の検出および診断に日常的に用いられている。また、核酸は遺伝障害の検出や食品汚染物質の検出にも用いられている。さらに、核酸は、遺伝地図の作製やクローニング、遺伝子組換えによる形質発現におよぶ種々の目的のために、所定の核酸に関する位置確認や同定、単離において日常的に用いられている。   Nucleic acids are also used for various purposes in various forms in the diagnostic field. For example, nucleic acid probes are routinely used for detection and diagnosis of human pathogens. Nucleic acids are also used to detect genetic disorders and food contaminants. Furthermore, nucleic acids are routinely used in position confirmation, identification, and isolation of a predetermined nucleic acid for various purposes related to genetic map creation, cloning, and gene expression by gene recombination.

しかし、多くの場合、核酸は極めて少量でしか入手できず、そしてその単離と精製との操作が、煩雑であり多くの時間を要する。この時間を要する煩雑な工程は、核酸の損失に結びつきやすいという問題があった。また、血清、尿およびバクテリアのカルチャーから得られた試料から核酸を精製する場合には、コンタミネーションが発生し、疑陽性の結果を招くという問題があった。   However, in many cases, the nucleic acid can be obtained only in a very small amount, and the operation of isolation and purification is complicated and requires a lot of time. This complicated process requiring time is likely to lead to loss of nucleic acid. In addition, when nucleic acids are purified from samples obtained from serum, urine, and bacterial cultures, there is a problem that contamination occurs and results in false positives.

上記問題を解決し、簡便かつ効率よく核酸を分離精製する方法の一つとして、固相に核酸を吸着させる溶液及び固相から核酸を脱着させる溶液をそれぞれ用いて、表面に水酸基を有する有機高分子から成る固相に核酸を吸着及び脱着させることによって、核酸を分離精製する方法が、特許文献１に開示されている。
特開２００３−１２８６９１号公報 As one of the methods for solving the above problems and separating and purifying nucleic acid simply and efficiently, an organic polymer having a hydroxyl group on the surface is prepared by using a solution for adsorbing nucleic acid on the solid phase and a solution for desorbing nucleic acid from the solid phase. Patent Document 1 discloses a method for separating and purifying nucleic acid by adsorbing and desorbing nucleic acid on a solid phase composed of molecules.
JP 2003-128691 A

しかしながら、これらのような核酸分離精製方法を実施する際、特に検体として、全血を使用した場合に、検体から得られる溶液は、粘度が高くなり泡が起こりやすく、さらに、界面活性剤を検体中の細胞の細胞膜を溶解するために添加した場合には、該界面活性剤の副次的効果によって、固相に核酸を吸着させる工程において、起泡が激しくなるという問題があった。この泡の飛散によるコンタミネーションや、核酸分離精製に要する時間にも影響を及ぼすため、泡の発生の抑制が望まれている。   However, when carrying out nucleic acid separation and purification methods such as these, especially when whole blood is used as a sample, the solution obtained from the sample has a high viscosity and is liable to foam. When added to dissolve the cell membrane of the cells inside, there is a problem that foaming becomes intense in the step of adsorbing nucleic acid to the solid phase due to a secondary effect of the surfactant. In order to affect the contamination due to the scattering of bubbles and the time required for nucleic acid separation and purification, suppression of the generation of bubbles is desired.

したがって、本発明の目的は、検体中の核酸を、固相に核酸を吸着させる工程、核酸が吸着した状態で該固相を洗浄する工程及び固相から核酸を脱着させる工程によって核酸を分離精製する方法において、核酸分離精製工程中における泡の発生を抑制でき、または工程中に発生する泡をなくすことができ、簡便かつ効率よく核酸の分離精製を行うことができる核酸分離精製方法を提供することである。また、該核酸分離精製方法を使用するための装置および該核酸分離精製方法に使用するための試薬キットを提供することである。   Accordingly, an object of the present invention is to separate and purify nucleic acids by a step of adsorbing nucleic acids in a sample to a solid phase, a step of washing the solid phases in a state where the nucleic acids are adsorbed, and a step of desorbing nucleic acids from the solid phase. A method for separating and purifying nucleic acid, which can suppress the generation of bubbles during the step of separating and purifying nucleic acid, or can eliminate bubbles generated during the step, and can perform the separation and purification of nucleic acid simply and efficiently. That is. Another object is to provide an apparatus for using the nucleic acid separation and purification method and a reagent kit for use in the nucleic acid separation and purification method.

本発明者らは、研究の結果、核酸を含む試料溶液が消泡剤を含有することによって、核酸分離精製方法を行う際の泡の発生および飛散を有意に抑制できることを見出した。さらには、本発明においては特に、核酸を含む試料溶液が消泡剤として少なくともアセチレングリコール系界面活性剤を含有することにより核酸分離精製方法を行う際の泡の発生および飛散が劇的に抑制されることを知見した。本発明はこれらの知見に基づいて完成したものである。 As a result of research, the present inventors have found that the generation and scattering of bubbles during the nucleic acid separation and purification method can be significantly suppressed by including a defoaming agent in a sample solution containing nucleic acid. Furthermore, in the present invention, particularly, the sample solution containing nucleic acid contains at least an acetylene glycol surfactant as an antifoaming agent , so that the generation and scattering of bubbles during the nucleic acid separation and purification method are dramatically suppressed. I found out. The present invention has been completed based on these findings.

すなわち、本発明は、以下の構成により前記目的を達成したものである。
１．
(ａ) 固相、
(ｂ) 前記固相を収容する少なくとも２個の開口を有する容器、及び
(ｃ) 前記容器の一の開口に結合された圧力差発生装置
を含む核酸分離精製ユニットを用いて核酸の吸着及び脱着を行う核酸分離精製方法であって、
（１）核酸を含む試料溶液を固相に接触させて、該固相に核酸を吸着させる工程、
（２）洗浄液を該固相に接触させて、核酸が吸着した状態で該固相を洗浄する工程、及び
（３）回収液を該固相に接触させて、該固相から核酸を脱着させる工程を含有し、
核酸を含む試料溶液が少なくとも一種の消泡剤を含み、該消泡剤として少なくともアセチレングリコール系界面活性剤を含むことを特徴とする核酸分離精製方法。
２． 核酸を含む試料溶液が、さらに核酸安定化剤、カオトロピック塩、界面活性剤、緩衝剤およびタンパク質分解酵素の中から選ばれる少なくとも一つを含む前処理液を添加、混合して得られる、前記第１項に記載の核酸分離精製方法。
３． 核酸を含む試料溶液が、さらに水溶性有機溶媒を添加して得られる、前記第１または２項に記載の核酸分離精製方法。
４． 消泡剤として更にシリコン系消泡剤を含む、前記第１〜３項の何れかに記載の核酸分離製精方法。
５． 前処理液中、核酸安定化剤が０.１〜２０質量％の濃度で使用される、前記第２項に記載の核酸分離精製方法。
６． 核酸安定化剤が、還元剤であることを特徴とする前記第２項に記載の核酸分離精製方法。
７． 還元剤がメルカプト化合物であることを特徴とする前記第６項に記載の核酸分離精製方法。
８． 核酸安定化剤が、キレート剤であることを特徴とする前記第２項に記載の核酸分離精製方法。
９． カオトロピック塩がグアニジウム塩である前記第２項に記載の核酸分離精製方法。
１０． 水溶性有機溶媒が、メタノール、エタノール、プロパノール、およびブタノールから選ばれる少なくとも１つを含むことを特徴とする前記第３項に記載の核酸分離精製方法。 That is, the present invention achieves the object by the following configuration.
1.
(a) solid phase,
(b) a container having at least two openings for containing the solid phase; and
(c) Pressure difference generator coupled to one opening of the container
A nucleic acid separation and purification method for adsorbing and desorbing nucleic acids using a nucleic acid separation and purification unit comprising:
(1) contacting a sample solution containing nucleic acid with a solid phase and adsorbing the nucleic acid to the solid phase;
(2) a step of bringing the washing solution into contact with the solid phase and washing the solid phase in a state where the nucleic acid is adsorbed; and (3) bringing the recovery solution into contact with the solid phase to desorb the nucleic acid from the solid phase. Contains the process ,
A nucleic acid separation and purification method, wherein a sample solution containing a nucleic acid contains at least one antifoaming agent, and at least an acetylene glycol surfactant as the antifoaming agent.
2. The sample solution containing nucleic acid is obtained by adding and mixing a pretreatment solution further containing at least one selected from nucleic acid stabilizers, chaotropic salts, surfactants, buffers and proteolytic enzymes. 2. The method for separating and purifying nucleic acid according to item 1.
3. 3. The method for separating and purifying nucleic acid according to item 1 or 2, wherein the sample solution containing nucleic acid is obtained by further adding a water-soluble organic solvent.
4). 4. The method for separating and purifying nucleic acid according to any one of Items 1 to 3, further comprising a silicon-based antifoaming agent as the antifoaming agent.
5. The method for separating and purifying nucleic acid according to the above item 2, wherein the nucleic acid stabilizer is used in the pretreatment solution at a concentration of 0.1 to 20% by mass.
6). 3. The method for separating and purifying nucleic acid according to the above item 2, wherein the nucleic acid stabilizer is a reducing agent.
7). 7. The method for separating and purifying nucleic acid according to item 6, wherein the reducing agent is a mercapto compound.
8). 3. The method for separating and purifying nucleic acid according to the above item 2, wherein the nucleic acid stabilizer is a chelating agent.
9. 3. The method for separating and purifying nucleic acid as described in the above item 2, wherein the chaotropic salt is a guanidinium salt.
10. 4. The method for separating and purifying nucleic acid according to item 3, wherein the water-soluble organic solvent contains at least one selected from methanol, ethanol, propanol, and butanol.

１１． 固相がシリカもしくはその誘導体、珪藻土、又はアルミナから成る固相である、前記第１〜１０項の何れかに記載の核酸分離精製方法。
１２． 固相が有機高分子から成る固相である、前記第１〜１０項の何れかに記載の核酸分離精製方法。
１３． 有機高分子から成る固相が、多糖構造を有する有機高分子から成る固相である、前記第１２項に記載の核酸分離精製方法。
１４． 有機高分子が、アセチルセルロースである、前記第１２又は１３項に記載の核酸分離精製方法。
１５． 有機高分子が、アセチルセルロースまたはアセチル価の異なるアセチルセルロースの混合物を鹸化処理した有機高分子である、前記第１２又は１３項に記載の核酸分離精製方法。
１６． アセチル価の異なるアセチルセルロースの混合物を鹸化処理した有機高分子の鹸化率が５％以上である、前記第１５項に記載の核酸分離精製方法
１７． アセチル価の異なるアセチルセルロースの混合物を鹸化処理した有機高分子の鹸化率が１０％以上である、前記第１５項に記載の核酸分離精製方法
１８． 有機高分子が、再生セルロースである、前記第１２項に記載の核酸分離精製方法。
１９． 固相が多孔性膜である、前記第１１〜１８項の何れかに記載の方法。
２０． 多孔性膜が表裏非対称性の多孔性膜である、前記第１９項に記載の方法。 11. The method for separating and purifying nucleic acid according to any one of Items 1 to 10, wherein the solid phase is a solid phase composed of silica or a derivative thereof, diatomaceous earth, or alumina.
12 The method for separating and purifying nucleic acid according to any one of Items 1 to 10, wherein the solid phase is a solid phase composed of an organic polymer.
13. 13. The method for separating and purifying nucleic acid according to the above item 12, wherein the solid phase composed of an organic polymer is a solid phase composed of an organic polymer having a polysaccharide structure.
14 14. The method for separating and purifying nucleic acid according to the above 12 or 13, wherein the organic polymer is acetyl cellulose.
15. 14. The method for separating and purifying nucleic acid according to the above 12 or 13, wherein the organic polymer is an organic polymer obtained by saponifying acetyl cellulose or a mixture of acetyl cellulose having different acetyl values.
16. 16. The method for separating and purifying nucleic acid according to the above item 15, wherein the saponification rate of an organic polymer obtained by saponifying a mixture of acetylcellulose having different acetyl values is 5% or more. 18. The method for separating and purifying nucleic acid according to the above item 15, wherein the saponification rate of an organic polymer obtained by saponifying a mixture of acetylcelluloses having different acetyl values is 10% or more. 13. The method for separating and purifying nucleic acid as described in 12 above, wherein the organic polymer is regenerated cellulose.
19. The method according to any one of the above items 11 to 18, wherein the solid phase is a porous membrane.
20. Item 20. The method according to Item 19, wherein the porous membrane is an asymmetric porous membrane.

２１． 多孔性膜が平均孔径０．１〜１０．０μｍの多孔性膜である、前記第１９又は２０項に記載の方法。
２２． 多孔性膜が厚さ1０〜５００μｍの多孔性膜である、前記第１９〜２１項の何れかに記載の方法。
２３． 固相が非孔性である、前記第１１〜１８項の何れかに記載の方法。
２４． 圧力差発生装置が加圧の装置である、前記第１〜２３項の何れかに記載の核酸分離精製方法。
２５． 圧力差発生装置が減圧の装置である、前記第１〜２３項の何れかに記載の核酸分離精製方法。
２６． 圧力差発生装置が、容器の一の開口に着脱可能に結合されている、前記第１〜２５項の何れかに記載の核酸分離精製方法。 21. 21. The method according to item 19 or 20, wherein the porous membrane is a porous membrane having an average pore diameter of 0.1 to 10.0 μm.
22. The method according to any one of Items 19 to 21, wherein the porous membrane is a porous membrane having a thickness of 10 to 500 μm.
23. The method according to any one of the above items 11 to 18, wherein the solid phase is non-porous.
2 4 . Pressure difference-generating apparatus is a device for pressurization, method for separating and purifying nucleic acid according to any one of the first 1 to 2 Item 3.
2 5 . 24. The method for separating and purifying nucleic acid according to any one of items 1 to 23 , wherein the pressure difference generator is an apparatus for reducing pressure.
2 6 . 26. The method for separating and purifying nucleic acid according to any one of 1 to 25 , wherein the pressure difference generator is detachably coupled to one opening of the container.

２７．
(２ａ) 検体を用いて核酸を含む試料溶液を調製し、固相を収容する少なくとも２個の開口を有する容器の一の開口に前記の核酸を含む試料溶液を注入する工程、
(２ｂ) 前記一の開口に結合された圧力差発生装置を用いて容器内を加圧状態にし、注入した核酸を含む試料溶液を、固相を収容する少なくとも２個の開口を有する容器の他の開口より排出することによって、固相に接触させることで、核酸を固相に吸着させる工程、
(２ｃ) 前記一の開口から圧力差発生装置を外し、前記一の開口に洗浄液を注入する工程、
(２ｄ) 前記一の開口に結合された圧力差発生装置を用いて容器内を加圧状態にし、注入した洗浄液を前記他の開口より排出することによって、固相に接触させることで、固相を洗浄する工程、
(２ｅ) 前記一の開口から圧力差発生装置を外し、前記一の開口に回収液を注入する工程、
(２ｆ) 前記一の開口に結合された圧力差発生装置を用いて容器内を加圧状態にし、注入した回収液を前記他の開口より排出させることによって、固相に吸着された核酸を脱着させ、容器外に排出する工程
を含む、第１〜２６項の何れかに記載の核酸分離精製方法。
２８． （２ｅ）の工程の前に、（２ｄ’）固相にＤＮＡ分解酵素溶液を接触させた後、洗浄液を用いて固相を洗浄する工程を行うことを含む、前記第２７項に記載の核酸分離精製方法。
２９． 洗浄液が、メタノール、エタノール、イソプロパノール又はｎ−プロパノールを２０〜１００質量％含む溶液である、前記第１〜２８に記載の核酸分離精製方法。
３０． 固相から核酸を脱着させる回収液が、塩濃度が０．５ｍｏｌ／Ｌ以下の溶液である、前記第１〜２９項の何れかに記載の核酸分離精製方法。
３１． 前記第１〜３０項の何れかに記載された方法を行うための試薬キット。
３２． 前記第１〜３０項の何れかに記載された方法を行うための装置。 2 7 .
(2a) preparing a sample solution containing a nucleic acid using a specimen and injecting the sample solution containing the nucleic acid into one opening of a container having at least two openings containing a solid phase;
(2b) In addition to a container having at least two openings for accommodating a sample solution containing the injected nucleic acid, the inside of the container is pressurized using the pressure difference generator coupled to the one opening. A step of adsorbing nucleic acid to the solid phase by contacting the solid phase by discharging from the opening of
(2c) removing the pressure difference generator from the one opening and injecting a cleaning liquid into the one opening;
(2d) By bringing the inside of the container into a pressurized state using the pressure difference generator coupled to the one opening, and discharging the injected cleaning liquid from the other opening to bring it into contact with the solid phase, Cleaning process,
(2e) removing the pressure difference generator from the one opening and injecting the recovered liquid into the one opening;
(2f) Decompressing the nucleic acid adsorbed on the solid phase by making the inside of the container pressurized using the pressure difference generator connected to the one opening and discharging the injected recovery liquid from the other opening. 27. The method for separating and purifying nucleic acid according to any one of items 1 to 26 , further comprising a step of discharging to the outside of the container.
28 . 28. The nucleic acid according to item 27 , comprising the step of (2d ′) contacting the DNA-degrading enzyme solution with the solid phase and then washing the solid phase with a washing solution before the step (2e). Separation and purification method.
29 . The method for separating and purifying nucleic acid according to the first to 28th aspects, wherein the washing liquid is a solution containing 20 to 100% by mass of methanol, ethanol, isopropanol, or n-propanol.
30 . 30. The method for separating and purifying nucleic acid according to any one of 1 to 29 above, wherein the recovery solution for desorbing nucleic acid from the solid phase is a solution having a salt concentration of 0.5 mol / L or less.
3 1 . Reagent kit for performing the method according to any of the first to third 0 Section.
3 2 . Apparatus for performing the method according to any of the first to third 0 Section.

本発明の方法により、泡の発生を抑制することができ、これにより核酸を含む試料溶液から純度の高い核酸を簡便かつ効率良く分離することができる。また、該核酸分離精製方法を行うための装置および該核酸分離精製方法に使用するための試薬キットにより、泡の発生を抑制し、より簡便迅速に核酸を回収できる。   By the method of the present invention, the generation of bubbles can be suppressed, whereby high-purity nucleic acid can be easily and efficiently separated from the sample solution containing the nucleic acid. In addition, by using an apparatus for performing the nucleic acid separation and purification method and a reagent kit for use in the nucleic acid separation and purification method, the generation of bubbles can be suppressed, and nucleic acids can be collected more easily and rapidly.

本発明の核酸分離精製方法は、
（１）核酸を含む試料溶液を固相に接触させて、該固相に核酸を吸着させる工程、（以下「吸着工程」とも称する）
（２）洗浄液を該固相に接触させて、核酸が吸着した状態で該固相を洗浄する工程、（以下「洗浄工程」とも称する）及び
（３）回収液を該固相に接触させて、該固相から核酸を脱着させる工程（以下「回収工程」とも称する）
を少なくとも含むものである。
すなわち、本発明では、核酸を含む試料溶液を固相に接触させることにより、核酸を含む試料溶液中の核酸を固相に吸着させ、洗浄し、固相に吸着させた核酸を、回収液を用いて固相から脱着させる。 The nucleic acid separation and purification method of the present invention comprises:
(1) A step of bringing a sample solution containing nucleic acid into contact with a solid phase and adsorbing the nucleic acid on the solid phase (hereinafter also referred to as “adsorption step”)
(2) A step of bringing the washing solution into contact with the solid phase and washing the solid phase in a state where the nucleic acid is adsorbed (hereinafter also referred to as “washing step”) and (3) bringing the recovered solution into contact with the solid phase. , A step of desorbing nucleic acid from the solid phase (hereinafter also referred to as “recovery step”)
Is included at least.
That is, in the present invention, the sample solution containing nucleic acid is brought into contact with the solid phase, thereby adsorbing the nucleic acid in the sample solution containing nucleic acid to the solid phase, washing, and removing the nucleic acid adsorbed on the solid phase from the recovered solution. To desorb from the solid phase.

＜核酸を含む試料溶液＞
核酸を含む試料溶液は、消泡剤を含む。好ましくは、さらに、核酸安定化剤、カオトロピック塩、界面活性剤、緩衝剤およびタンパク質分解酵素の中から選ばれる少なくとも一つを含む前処理液を核酸可溶化試薬として用いて処理することにより得られ、更に好ましくは水溶性有機溶媒を添加して得られた溶液である。 <Sample solution containing nucleic acid>
The sample solution containing the nucleic acid contains an antifoaming agent. Preferably, it is obtained by further using a pretreatment solution containing at least one selected from nucleic acid stabilizers, chaotropic salts, surfactants, buffers and proteolytic enzymes as a nucleic acid solubilizing reagent. More preferably, it is a solution obtained by adding a water-soluble organic solvent.

（消泡剤）
消泡剤としては、シリコン系消泡剤（例えば、シリコーンオイル、ジメチルポリシロキサン、シリコーンエマルジョン、変性ポリシロキサン、シリコーンコンパウンドなど）、アルコール系消泡剤（例えば、アセチレングリコール、ヘプタノール、エチルヘキサノール、高級アルコール、ポリオキシアルキレングリコールなど）、エーテル系消泡剤（例えば、ヘプチルセロソルブ、ノニルセロソルブ−３−ヘプチルコルビトールなど）、油脂系消泡剤（例えば、動植物油など）、脂肪酸系消泡剤（例えば、ステアリン酸、オレイン酸、パルミチン酸など）、金属セッケン系消泡剤（例えば、ステアリン酸アルミ、ステアリン酸カルシウムなど）、脂肪酸エステル系消泡剤（例えば、天然ワックス、トリブチルホスフェートなど）、燐酸エステル系消泡剤（例えば、オクチルリン酸ナトリウムなど）、アミン系消泡剤（例えば、ジアミルアミンなど）、アミド系消泡剤（例えば、ステアリン酸アミドなど）、その他の消泡剤（例えば、硫酸第二鉄、ボーキサイトなど）などが挙げられる。これらの消泡剤は、単独または組み合わせて用いてもよい。本発明においては、核酸を含む試料溶液が少なくとも一種の消泡剤を含み、該消泡剤として少なくともアセチレングリコール系界面活性剤を含む。特に好ましくは、消泡剤として、シリコン系消泡剤とアルコール系消泡剤の２つの成分を組み合わせて使用することである。
消泡剤は、検体に直接添加しても、核酸可溶化試薬として用いる前処理液に含有されていてもよい。消泡剤を前処理液に含有しない場合には、消泡剤を添加する時期は、前処理液を使用する前でも後でもよい。 消泡剤の、核酸を含む試料溶液中における濃度は０．１〜１０質量％であることが好ましい。 (Defoamer)
Antifoaming agents include silicone-based antifoaming agents (eg, silicone oil, dimethylpolysiloxane, silicone emulsion, modified polysiloxane, silicone compound, etc.), alcohol-based antifoaming agents (eg, acetylene glycol, heptanol, ethylhexanol, high grade Alcohol, polyoxyalkylene glycol, etc.), ether-based antifoaming agents (eg, heptyl cellosolve, nonyl cellosolv-3-heptylcorbitol, etc.), fat-based antifoaming agents (eg, animal and vegetable oils, etc.), For example, stearic acid, oleic acid, palmitic acid, etc.), metal soap antifoaming agents (eg, aluminum stearate, calcium stearate, etc.), fatty acid ester antifoaming agents (eg, natural wax, tributyl phosphate, etc.), phosphate ester Antifoaming agents (for example, sodium octyl phosphate), amine-based antifoaming agents (for example, diamylamine), amide-based antifoaming agents (for example, stearamide), and other antifoaming agents (for example, sulfuric acid Futetsu, bauxite, etc.) . These antifoaming agents may be used alone or in combination. In the present invention, a sample solution containing nucleic acid contains at least one antifoaming agent, and at least an acetylene glycol surfactant as the antifoaming agent. Particularly preferably, the antifoaming agent is a combination of two components, a silicon antifoaming agent and an alcohol antifoaming agent .
The antifoaming agent may be added directly to the specimen or may be contained in a pretreatment liquid used as a nucleic acid solubilizing reagent. When the antifoaming agent is not contained in the pretreatment liquid, the timing of adding the antifoaming agent may be before or after using the pretreatment liquid. The concentration of the antifoaming agent in the sample solution containing nucleic acid is preferably 0.1 to 10% by mass.

（検体）
本発明において使用できる検体は、核酸を含むものであれば特に制限はなく、例えば診断分野においては、採取された全血、血漿、血清、尿、便、***、唾液等の体液、又は植物（もしくはその一部）、動物（もしくはその一部）、細菌、ウイルスなどの生物材料が対象となり、これらをそのままあるいはこれらの溶解物もしくはホモジネートなどを試料として用いる。 (Sample)
The specimen that can be used in the present invention is not particularly limited as long as it contains a nucleic acid. For example, in the diagnostic field, collected whole blood, plasma, serum, urine, feces, semen, saliva and other body fluids, or plants ( Or a part thereof), an animal (or a part thereof), a biological material such as a bacterium or a virus, and these are used as they are or a lysate or a homogenate thereof as a sample.

「試料」とは、核酸を含む任意の試料を意味する。具体的には、上記検体において記載したものが挙げられる。試料溶液中の核酸の種類は１種類でも２種類以上であってもよい。前記核酸分離精製方法に供される個々の核酸の長さは特に限定されず、例えば、数ｂｐ〜数Ｍｂｐの任意の長さの核酸であってもよい。取り扱い上の観点からは、核酸の長さは一般的には、数ｂｐ〜数百ｋｂｐ程度であることが好ましい。   “Sample” means any sample containing nucleic acid. Specific examples include those described in the specimen. The type of nucleic acid in the sample solution may be one type or two or more types. The length of each nucleic acid subjected to the method for separating and purifying nucleic acid is not particularly limited, and may be a nucleic acid having an arbitrary length of several bp to several Mbp, for example. From the viewpoint of handling, it is preferable that the length of the nucleic acid is generally about several bp to several hundred kbp.

本発明において「核酸」は一本鎖または二本鎖の、ＤＮＡまたはＲＮＡのいずれでもよく、また、分子量の制限も無い。   In the present invention, the “nucleic acid” may be single-stranded or double-stranded DNA or RNA, and there is no molecular weight limitation.

検体は、細胞膜および核膜等を溶解して核酸を水溶液内に分散して、核酸を含む試料溶液を得ることが好ましい。   The specimen is preferably dissolved in the cell membrane and the nuclear membrane, and the nucleic acid is dispersed in an aqueous solution to obtain a sample solution containing the nucleic acid.

例えば、対象となる試料が全血の場合、Ａ．赤血球の除去、Ｂ．各種タンパク質の除去、及びＣ．白血球の溶解及び核膜の溶解を行うことが好ましい。Ａ．赤血球の除去およびＢ．各種タンパク質の除去は、固相への非特異吸着および固相として多孔性膜を用いる場合の目詰まりを防ぐために、Ｃ．白血球の溶解及び核膜の溶解は、抽出の対象である核酸を可溶化させるためにそれぞれ行うことが好ましい。特に、Ｃ．白血球の溶解及び核膜の溶解を行うことは好ましい。本発明の核酸分離精製方法は、試料が全血の場合には、これらの工程を行うことにより核酸を可溶化することが好ましい。
本発明で、細胞膜および核膜を溶解して核酸を可溶化するには、核酸可溶化試薬を用いることが好ましい。例えば、塩酸グアニジン、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、プロテアーゼＫ（ＳＩＧＭＡ社製）を添加して６０℃、１０分インキュベートすることによって前記のＡ，Ｂ及びＣを同時に達成することができる。 For example, when the target sample is whole blood, E. Removal of red blood cells Removal of various proteins, and C.I. It is preferable to lyse leukocytes and lysate the nuclear envelope. A. E. Removal of red blood cells and B. The removal of various proteins is performed in order to prevent non-specific adsorption to the solid phase and clogging when a porous membrane is used as the solid phase. Leukocyte lysis and nuclear membrane lysis are preferably performed to solubilize the nucleic acid to be extracted. In particular, C.I. It is preferable to lyse leukocytes and lysate the nuclear envelope. In the method for separating and purifying nucleic acid of the present invention, when the sample is whole blood, it is preferable to solubilize the nucleic acid by performing these steps.
In the present invention, it is preferable to use a nucleic acid solubilizing reagent in order to solubilize the nucleic acid by dissolving the cell membrane and the nuclear membrane. For example, guanidine hydrochloride, Triton X- 100, and protease K (manufactured by SIGMA) can be added and incubated at 60 ° C. for 10 minutes to achieve the above A, B and C simultaneously.

｛前処理液｝
前述の通り、本発明において用いられる核酸可溶化試薬としては、核酸安定化剤、カオトロピック塩、界面活性剤、緩衝剤およびタンパク質分解酵素の中から選ばれる少なくとも一つを含む前処理液を用いることが好ましい。以下、前処理液に含むことのできる化合物について説明する。
（核酸安定化剤）
核酸安定化剤としては、ヌクレアーゼの活性を不活性化させる作用を有するものが挙げられる。検体によっては、核酸を分解するヌクレアーゼ等が含まれていることがあり、核酸をホモジナイズするとこのヌクレアーゼが核酸に作用し、収量が激減することがある。前記核酸安定化剤は、検体中の核酸を安定に存在させることができ、好ましい。 {Pretreatment liquid}
As described above, the nucleic acid solubilizing reagent used in the present invention uses a pretreatment solution containing at least one selected from a nucleic acid stabilizer, a chaotropic salt, a surfactant, a buffer, and a proteolytic enzyme. Is preferred. Hereinafter, compounds that can be contained in the pretreatment liquid will be described.
(Nucleic acid stabilizer)
Examples of the nucleic acid stabilizer include those having an action of inactivating nuclease activity. Depending on the sample, a nuclease or the like that degrades the nucleic acid may be contained. When the nucleic acid is homogenized, the nuclease acts on the nucleic acid, and the yield may be drastically reduced. The nucleic acid stabilizer is preferable because it can cause the nucleic acid in the specimen to exist stably.

ヌクレアーゼの活性を不活性化させる作用を有する核酸安定化剤としては、一般的に還元剤として使用される化合物を用いることができる。還元剤としては、水素、ヨウ化水素、硫化水素、水素化アルミニウムリチウム、水素化ホウ素ナトリウム等の水素化化合物、アルカリ金属、マグネシウム、カルシウム、アルミニウム、亜鉛等の電気的陽性の大きい金属、またはそれのアマルガム、アルデヒド類、糖類、ギ酸、シュウ酸などの有機酸化物、メルカプト化合物等が挙げられる。中でもメルカプト化合物が好ましい。メルカプト化合物としては、Ｎ−アセチルシステイン、メルカプトエタノールや、アルキルメルカプタン等が挙げられる。特に、β−メルカプトエタノールが好ましい。メルカプト化合物は単独または複数組み合わせて用いてもよい。
前記核酸安定化剤は、前処理液における濃度は０．１〜２０質量％であることが好ましく、より好ましくは、０．３〜１５質量％で、用いることができる。メルカプト化合物は、前処理液における濃度は０．１〜１０質量％であることが好ましく、より好ましくは、０．５〜５質量％で、用いることができる。 As the nucleic acid stabilizer having an action of inactivating the nuclease activity, compounds generally used as a reducing agent can be used. Examples of the reducing agent include hydrogen, hydrogen iodide, hydrogen sulfide, lithium aluminum hydride, hydrogenated compounds such as sodium borohydride, alkali metals, metals with high electrical positiveity such as magnesium, calcium, aluminum, and zinc, or Amalgams, aldehydes, saccharides, organic acids such as formic acid and oxalic acid, mercapto compounds and the like. Of these, mercapto compounds are preferred. Examples of mercapto compounds include N-acetylcysteine, mercaptoethanol, alkyl mercaptan, and the like. In particular, β-mercaptoethanol is preferable. Mercapto compounds may be used alone or in combination.
The concentration of the nucleic acid stabilizer in the pretreatment liquid is preferably 0.1 to 20% by mass, and more preferably 0.3 to 15% by mass. The concentration of the mercapto compound in the pretreatment liquid is preferably 0.1 to 10% by mass, and more preferably 0.5 to 5% by mass.

また、ヌクレアーゼの活性を不活性化させる作用を有する核酸安定化剤として、キレート剤を用いることができる。キレート剤としては、例えば、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）、ＥＧＴＡ等を挙げることができる。キレート剤は単独または複数組み合わせて用いてもよい。キレート剤は、前処理液における濃度は１ｍｍｏｌ／Ｌ〜１ｍｏｌ／Ｌであることが好ましく、より好ましくは５ｍｍｏｌ／Ｌ〜１００ｍｍｏｌ／Ｌで、用いることができる。   Moreover, a chelating agent can be used as a nucleic acid stabilizer having an action of inactivating the nuclease activity. Examples of the chelating agent include ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), nitrilotriacetic acid (NTA), and EGTA. Chelating agents may be used alone or in combination. The concentration of the chelating agent in the pretreatment liquid is preferably 1 mmol / L to 1 mol / L, more preferably 5 mmol / L to 100 mmol / L.

（カオトロピック塩）
カオトロピック塩としては、グアニジン塩、イソチアン酸ナトリウム、ヨウ化ナト
リウム、ヨウ化カリウム等を使用することができる。中でもグアニジン塩が好ましい。グアニジン塩としては、塩酸グアニジン、イソチオシアン酸グアニジン、チオシアン酸グアニジンが挙げられ、中でも塩酸グアニジンが好ましい。これらの塩は単独でも、複数組み合わせて用いてもよい。前記前処理液中のカオトロピック塩濃度は、０．５ｍｏｌ／Ｌ以上であることが好ましく、より好ましくは０．５ｍｏｌ／Ｌ〜４ｍｏｌ／Ｌ、さらに好ましくは、１ｍｏｌ／Ｌ〜３ｍｏｌ／Ｌである。
カオトロピック塩の代わりに、カオトロピック物質として尿素を用いることもできる。 (Chaotropic salt)
As the chaotropic salt, a guanidine salt, sodium isothiocyanate, sodium iodide, potassium iodide or the like can be used. Of these, guanidine salts are preferred. Examples of the guanidine salt include guanidine hydrochloride, guanidine isothiocyanate, and guanidine thiocyanate. Of these, guanidine hydrochloride is preferable. These salts may be used alone or in combination. The chaotropic salt concentration in the pretreatment liquid is preferably 0.5 mol / L or more, more preferably 0.5 mol / L to 4 mol / L, and still more preferably 1 mol / L to 3 mol / L.
Instead of the chaotropic salt, urea can also be used as the chaotropic substance.

（界面活性剤）
界面活性剤としては、例えば、ノニオン界面活性剤、カチオン界面活性剤、アニオン界面活性剤、両性界面活性剤が挙げられる。
本発明においてはノニオン界面活性剤およびカチオン界面活性剤を好ましく用いることができる。
ノニオン界面活性剤としては、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル系界面活性剤、ポリオキシエチレンアルキルエーテル系界面活性剤、脂肪酸アルカノールアミドが挙げられ、好ましくは、ポリオキシエチレンアルキルエーテル系界面活性剤である。ポリオキシエチレンアルキルエーテル系界面活性剤のなかでも、ＰＯＥデシルエ−テル、ＰＯＥラウリルエ−テル、ＰＯＥトリデシルエ−テル、ＰＯＥアルキレンデシルエ−テル、ＰＯＥソルビタンモノラウレ−ト、ＰＯＥソルビタンモノオレエ−ト、ＰＯＥソルビタンモノステアレ−ト、テトラオレイン酸ポリオキシエチレンソルビット、ＰＯＥアルキルアミン、ＰＯＥアセチレングリコ−ルがさらに好ましい。 (Surfactant)
Examples of the surfactant include nonionic surfactants, cationic surfactants, anionic surfactants, and amphoteric surfactants.
In the present invention, nonionic surfactants and cationic surfactants can be preferably used.
Examples of nonionic surfactants include polyoxyethylene alkylphenyl ether surfactants, polyoxyethylene alkyl ether surfactants, and fatty acid alkanolamides, with polyoxyethylene alkyl ether surfactants being preferred. Among the polyoxyethylene alkyl ether surfactants, POE decyl ether, POE lauryl ether, POE tridecyl ether, POE alkylene decyl ether, POE sorbitan monolaurate, POE sorbitan monooleate POE sorbitan monostearate, polyoxyethylene sorbite tetraoleate, POE alkylamine, and POE acetylene glycol are more preferable.

カチオン界面活性剤としては、セチルトリメチルアンモニウムプロミド、ドデシルトリメチルアンモニウムクロリド、テトラデシルトリメチルアンモニウムクロリド、セチルピリジニウムクロリドが挙げられる。
これらの界面活性剤は、単独または複数組み合わせて用いてもよい。界面活性剤の前記前処理液における濃度は０．１〜２０質量％であることが好ましい。 Examples of the cationic surfactant include cetyltrimethylammonium promide, dodecyltrimethylammonium chloride, tetradecyltrimethylammonium chloride, and cetylpyridinium chloride.
These surfactants may be used alone or in combination. The concentration of the surfactant in the pretreatment liquid is preferably 0.1 to 20% by mass.

（緩衝剤）
緩衝剤としては、通常用いられるｐＨ緩衝剤（ｂｕｆｆｅｒ）を挙げることができる。好ましくは、生化学試験に通常用いられるｐＨ緩衝剤が挙げられる。このような緩衝剤としては、クエン酸塩、リン酸塩または酢酸塩からなる緩衝剤、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ＴＥ（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ／ＥＤＴＡ）、ＴＢＥ（Ｔｒｉｓ−Ｂｏｒａｔｅ／ＥＤＴＡ）、ＴＡＥ（Ｔｒｉｓ−Ａｃｅｔａｔｅ／ＥＤＴＡ）、グッド緩衝剤が挙げられる。グッド緩衝剤としては、ＭＥＳ(2-Morpholinoethanesulfonic acid)、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ(Bis(2-hydoroxyethyl)iminotris(hydroxymethyl)methane)、ＨＥＰＥＳ(2-[4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinyl]ethanesulfonic asid)、ＰＩＰＥＳ(Piperaxine-1,4-bis(2-ethanesulfonic acid))、ＡＣＥＳ(N-(2-Acetamino)-2-aminoethanesulfonic acid)、ＣＡＰＳ(N-Cyclohexyl-3-aminopropanesulfonic acid)、ＴＥＳ(N-Tris(hydroxymethyl)methyl-2-aminoethanesulfonic acid) が挙げられる。
これらの緩衝剤は、前記前処理液中の濃度は１〜３００ｍｍｏｌ／Ｌであることが好ましい。 (Buffering agent)
Examples of the buffer include a commonly used pH buffer. Preferably, the pH buffer agent normally used for a biochemical test is mentioned. Examples of such a buffer include a buffer composed of citrate, phosphate or acetate, Tris-HCl, TE (Tris-HCl / EDTA), TBE (Tris-Borate / EDTA), TAE (Tris-Acetate). / EDTA) and Good buffer. Good buffering agents include MES (2-Morpholinoethanesulfonic acid), Bis-Tris (Bis (2-hydoroxyethyl) iminotris (hydroxymethyl) methane), HEPES (2- [4- (2-Hydroxyethyl) -1-piperazinyl] ethanesulfonic asid ), PIPES (Piperaxine-1,4-bis (2-ethanesulfonic acid)), ACES (N- (2-Acetamino) -2-aminoethanesulfonic acid), CAPS (N-Cyclohexyl-3-aminopropanesulfonic acid), TES (N -Tris (hydroxymethyl) methyl-2-aminoethanesulfonic acid).
These buffering agents preferably have a concentration in the pretreatment liquid of 1 to 300 mmol / L.

（タンパク質分解酵素）
タンパク質分解酵素としては、セリンプロテアーゼ、システインプロテアーゼ、金属プロテアーゼが挙げられ、少なくとも１つのタンパク質分解酵素を好ましく用いることができる。また、タンパク質分解酵素は、複数種以上のタンパク質分解酵素の混合物も好ましく用いることができる。
前処理液は、核酸の回収量及び回収効率の向上、必要な核酸を含む検体の微量化及び迅速化の観点から、タンパク質分解酵素を含むことが好ましい。
セリンプロテアーゼとしては、特に限定されず、例えばプロテアーゼＫなどを好ましく用いることができる。システインプロテアーゼとしては、特に限定されず、例えばパパイン、カテプシン類などを好ましく用いることができる。金属プロテアーゼとしては、特に限定されず、例えばカルボキシペプチターゼ等を好ましく用いることができる。
タンパク質分解酵素の前記前処理液における濃度は、添加時の全容積１ｍｌあたり好ましくは０．００１ＩＵ〜１０ＩＵ、より好ましくは０．０１ＩＵ〜１ＩＵで用いることができる。 (Proteolytic enzyme)
Examples of the proteolytic enzyme include serine protease, cysteine protease, and metalloprotease, and at least one proteolytic enzyme can be preferably used. As the proteolytic enzyme, a mixture of a plurality of proteolytic enzymes can be preferably used.
The pretreatment liquid preferably contains a proteolytic enzyme from the viewpoint of improving the recovery amount and recovery efficiency of the nucleic acid and reducing the amount and speed of the sample containing the necessary nucleic acid.
The serine protease is not particularly limited, and for example, protease K can be preferably used. The cysteine protease is not particularly limited, and for example, papain and cathepsins can be preferably used. The metal protease is not particularly limited, and for example, carboxypeptidase can be preferably used.
The concentration of the proteolytic enzyme in the pretreatment solution is preferably 0.001 IU to 10 IU, more preferably 0.01 IU to 1 IU per 1 ml of the total volume at the time of addition.

また、タンパク質分解酵素は、核酸分解酵素を含まないタンパク質分解酵素を好ましく用いることができる。また、安定化剤を含んだタンパク質分解酵素を好ましく用いることができる。安定化剤としては、金属イオンを好ましく用いることができる。具体的には、マグネシウムイオンが好ましく、例えば塩化マグネシウムなどの形で添加することができる。タンパク質分解酵素の安定化剤を含ませることにより、核酸の回収に必要なタンパク質分解酵素の微量化が可能となり、核酸の回収に必要なコストを低減することができる。
タンパク質分解酵素の安定化剤の前記前処理液における濃度は、好ましくは１〜１０００ｍｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは１０〜１００ｍｍｏｌ／Ｌで含有することが好ましい。 As the proteolytic enzyme, a proteolytic enzyme that does not contain a nucleolytic enzyme can be preferably used. A proteolytic enzyme containing a stabilizer can be preferably used. As the stabilizer, metal ions can be preferably used. Specifically, magnesium ion is preferable, and it can be added in the form of, for example, magnesium chloride. By including a proteolytic enzyme stabilizer, the amount of proteolytic enzyme required for nucleic acid recovery can be reduced, and the cost required for nucleic acid recovery can be reduced.
The concentration of the protease stabilizer in the pretreatment solution is preferably 1 to 1000 mmol / L, more preferably 10 to 100 mmol / L.

タンパク質分解酵素は、予めカオトロピック塩、界面活性剤等、緩衝剤等のその他の試薬とともに混合されて前処理液（以下、前処理液Ａという。）として核酸の回収に供されても良い。
また、タンパク質分解酵素は、カオトロピック塩、界面活性剤等、緩衝剤等のその他の試薬を含む前処理液（以下、前処理液Ｂという。）とは個別の２つ以上の試薬として供されても良い。後者の場合、タンパク質分解酵素を含む試薬を先に検体と混合した後に、前処理液Ｂと混合される。また、前処理液Ｂを先に検体と混合した後に、タンパク分解酵素を混合してもよい。
また、タンパク質分解酵素を検体または、検体と前処理液Ｂとの混合液に、タンパク質分解酵素保存容器から直接目薬状に滴下させることもできる。この場合、操作を簡便にすることができる。 The proteolytic enzyme may be preliminarily mixed with other reagents such as a chaotropic salt, a surfactant, and a buffer, and used for the recovery of nucleic acid as a pretreatment liquid (hereinafter referred to as pretreatment liquid A).
In addition, the proteolytic enzyme is provided as two or more separate reagents from a pretreatment liquid (hereinafter referred to as pretreatment liquid B) containing other reagents such as chaotropic salts, surfactants, and buffering agents. Also good. In the latter case, the reagent containing the proteolytic enzyme is first mixed with the sample, and then mixed with the pretreatment liquid B. Alternatively, the pretreatment liquid B may be mixed with the specimen first, and then the proteolytic enzyme may be mixed.
Alternatively, the proteolytic enzyme can be dropped directly into the specimen or a mixed liquid of the specimen and the pretreatment liquid B in the form of eye drops directly from the proteolytic enzyme storage container. In this case, the operation can be simplified.

前処理液は、乾燥された状態、すなわち前処理剤として供給されることも好ましい。また、凍結乾燥のように乾燥された状態のタンパク質分解酵素を予め含む容器を用いることができる。前記の、前処理剤、および／または乾燥された状態のタンパク質分解酵素を予め含む容器を用いて、核酸を含む試料溶液を得ることもできる。
前記の方法で核酸を含む試料溶液を得る場合、前処理剤および乾燥された状態のタンパク質分解酵素の保存安定性が良く、核酸収量を変えずに操作を簡便にすることができる。 It is also preferable that the pretreatment liquid is supplied in a dried state, that is, as a pretreatment agent. Moreover, the container previously containing the proteolytic enzyme of the dried state like freeze-drying can be used. A sample solution containing a nucleic acid can also be obtained using the above-mentioned container containing a pretreatment agent and / or a dried proteolytic enzyme in advance.
When a sample solution containing nucleic acid is obtained by the above method, the storage stability of the pretreatment agent and the dried proteolytic enzyme is good, and the operation can be simplified without changing the nucleic acid yield.

また、試料溶液に含まれる前記化合物の溶解性の向上の観点から、前処理液に水溶性有機溶媒を添加してもよい。水溶性有機溶媒としては、アルコール類、アセトン、アセトニトリル、ジメチルホルムアミド等が挙げられる。これらの中でも、アルコール類が好ましい。アルコール類としては、１級アルコール、２級アルコール、３級アルコールのいずれでも良い。具体的にはメタノール、エタノール、プロパノール及びその異性体、ブタノール及びその異性体などが挙げられ、中でもエタノールが特に好ましい。これらの水溶性有機溶媒は、単独でも複数組み合わせて用いてもよい。上記の水溶性有機溶媒の濃度は、核酸を含む試料溶液中において、１〜２０質量％となるように調製することが好ましい。   Further, from the viewpoint of improving the solubility of the compound contained in the sample solution, a water-soluble organic solvent may be added to the pretreatment liquid. Examples of the water-soluble organic solvent include alcohols, acetone, acetonitrile, dimethylformamide and the like. Among these, alcohols are preferable. As alcohols, any of primary alcohol, secondary alcohol, and tertiary alcohol may be used. Specific examples include methanol, ethanol, propanol and its isomer, butanol and its isomer, and ethanol is particularly preferable. These water-soluble organic solvents may be used alone or in combination. The concentration of the water-soluble organic solvent is preferably adjusted to 1 to 20% by mass in the sample solution containing nucleic acid.

｛水溶性有機溶媒と吸着工程｝
核酸が可溶化し分散した溶液中に、水溶性有機溶媒を添加して、固相と接触させることにより、試料溶液中の核酸を効果的に固相に吸着させるために、核酸を含む試料溶液は、さらに、水溶性有機溶媒を添加して得られた溶液であることが好ましい。すなわち、前記の前処理液により処理されて得られた液に、さらに水溶性有機溶媒を添加して、核酸を含む試料溶液を得ることが好ましい。さらには、得られた核酸を含む試料溶液中に塩が存在することが、可溶化された核酸を、より効果的に、固相に吸着させることができ好ましい。 {Water-soluble organic solvent and adsorption process}
In order to effectively adsorb nucleic acid in the sample solution to the solid phase by adding a water-soluble organic solvent to the solution in which the nucleic acid is solubilized and dispersed, and bringing it into contact with the solid phase, the sample solution containing the nucleic acid Is preferably a solution obtained by adding a water-soluble organic solvent. That is, it is preferable to obtain a sample solution containing nucleic acid by further adding a water-soluble organic solvent to the liquid obtained by the treatment with the pretreatment liquid. Furthermore, the presence of a salt in the sample solution containing the obtained nucleic acid is preferable because the solubilized nucleic acid can be more effectively adsorbed to the solid phase.

水溶性有機溶媒と塩の存在により、核酸の周りに存在する水分子の水和構造を破壊され、核酸は不安定な状態で可溶化することになる。この状態の核酸を、固相と接触させると、核酸表面上の極性基と固相表面の極性基間で相互作用し、核酸は固相表面上に吸着するものと考えられる。特に固相として、表面に水酸基を有する有機高分子を用いた場合に顕著に吸着が起こり、好ましい。本発明の方法では、前記のとおり、可溶化した核酸混合液に水溶性有機溶媒を混合することと、得られた核酸混合液中に塩が存在することが、核酸を不安定な状態にさせることができ、好ましい。   The presence of the water-soluble organic solvent and the salt destroys the hydration structure of water molecules present around the nucleic acid, so that the nucleic acid is solubilized in an unstable state. When the nucleic acid in this state is brought into contact with the solid phase, it is considered that the polar group on the nucleic acid surface interacts with the polar group on the solid phase surface, and the nucleic acid is adsorbed on the solid surface. In particular, when an organic polymer having a hydroxyl group on the surface is used as the solid phase, adsorption is noticeably caused, which is preferable. In the method of the present invention, as described above, mixing a water-soluble organic solvent with a solubilized nucleic acid mixture and the presence of a salt in the obtained nucleic acid mixture makes the nucleic acid unstable. Can be preferred.

この水溶性有機溶媒としては、アルコール、アセトン、アセトニトリル、ジメチルホルムアミド等上げられる。これらの中でも、アルコールが好ましい。アルコールとしては、１級アルコール、２級アルコール、３級アルコールのいずれでも良い。中でもメタノール、エタノール、プロパノール及びその異性体、ブタノール及びその異性体を好ましく用いることができる。より好ましくは、エタノールを用いることができる。これらの水溶性有機溶媒は単独でも複数組み合わせて用いてもよい。   Examples of the water-soluble organic solvent include alcohol, acetone, acetonitrile, dimethylformamide and the like. Among these, alcohol is preferable. As the alcohol, any of primary alcohol, secondary alcohol, and tertiary alcohol may be used. Of these, methanol, ethanol, propanol and its isomer, butanol and its isomer can be preferably used. More preferably, ethanol can be used. These water-soluble organic solvents may be used alone or in combination.

これら水溶性有機溶媒の核酸を含む試料溶液における最終濃度は、５〜９０質量％であることが好ましい。エタノールの添加濃度は、この範囲内で、擬集物を生じないでできるだけ高くすることが特に好ましい。さらに好ましくは２０質量％〜６０質量％である。   The final concentration of the sample solution containing nucleic acids of these water-soluble organic solvents is preferably 5 to 90% by mass. It is particularly preferable that the concentration of ethanol added is as high as possible without producing pseudo-collections within this range. More preferably, it is 20 mass%-60 mass%.

得られる核酸混合液中に存在することが好ましい塩としては、各種カオトロピック物質（グアニジウム塩、ヨウ化ナトリウム、過塩素酸ナトリウム）や塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化アンモニウム、臭化ナトリウム、臭化カリウム、臭化カルシウム、臭化アンモニウム等が挙げられ、特にグアニジウム塩が、細胞膜の溶解と核酸の可溶化の効果を併有するので特に好ましい。   Salts preferably present in the resulting nucleic acid mixture include various chaotropic substances (guanidinium salts, sodium iodide, sodium perchlorate), sodium chloride, potassium chloride, ammonium chloride, sodium bromide, potassium bromide, Calcium bromide, ammonium bromide and the like can be mentioned, and guanidinium salt is particularly preferable because it has both the effect of lysing cell membranes and solubilizing nucleic acids.

得られる試料溶液のｐＨは、好ましくはｐＨ３〜１０、より好ましくはｐＨ４〜９、さらに好ましくはｐＨ５〜８のものが用いられる。   The pH of the obtained sample solution is preferably 3 to 10, more preferably 4 to 9, and still more preferably 5 to 8.

また、得られる核酸を含む試料溶液は、表面張力は０．０５Ｊ／ｍ2以下であることが好ましく、粘度は１〜１００００ｍＰａであることが好ましく、比重は０．８〜１．２の範囲であることが好ましい。この範囲の溶液にすることで、吸着工程において、核酸を含む試料溶液を前記固相に接触させて、核酸を吸着させた後に残った溶液を、洗浄工程において除去しやすくする。 Further, the sample solution containing the obtained nucleic acid preferably has a surface tension of 0.05 J / m 2 or less, a viscosity of preferably 1 to 10,000 mPa, and a specific gravity in the range of 0.8 to 1.2. Preferably there is. By making the solution in this range, the sample solution containing nucleic acid is brought into contact with the solid phase in the adsorption step, and the solution remaining after adsorbing the nucleic acid is easily removed in the washing step.

＜固相および吸着工程＞
固相は特に限定されず、核酸を吸着できれば、いずれの素材を用いることもできる。例えば、表面に水酸基を有する有機高分子から成る固相や、あるいは二酸化珪素、シリカポリマー又は珪酸マグネシウムから成る固相など、あるいはシリカもしくはその誘導体、珪藻土、又はアルミナから成る固相などを使用することができる。好ましくは、多糖構造を有する有機高分子から成る固相を使用することである。さらに好ましくは、イオン結合が実質的に関与しない相互作用で核酸が吸着する固相である。これは、固相側の使用条件で「イオン化」していないことを意味し、環境の極性を変化させることで、核酸と固相が引き合うようになると推定される。これにより分離性能に優れ、しかも洗浄効率よく、核酸を単離精製することができる。イオン結合が実質的に関与しない相互作用で核酸が吸着する固相としては、例えば、親水基を有する固相が挙げられ、環境の極性を変化させることで、核酸と固相の親水基同士が引きあうようになると推定される。 <Solid phase and adsorption process>
The solid phase is not particularly limited, and any material can be used as long as it can adsorb nucleic acids. For example, a solid phase composed of an organic polymer having a hydroxyl group on the surface, a solid phase composed of silicon dioxide, silica polymer or magnesium silicate, or a solid phase composed of silica or a derivative thereof, diatomaceous earth, or alumina. Can do. Preferably, a solid phase composed of an organic polymer having a polysaccharide structure is used. More preferably, it is a solid phase on which a nucleic acid is adsorbed by an interaction that does not substantially involve ionic bonds. This means that it is not “ionized” under the use conditions on the solid phase side, and it is presumed that the nucleic acid and the solid phase become attracted by changing the polarity of the environment. As a result, the nucleic acid can be isolated and purified with excellent separation performance and good washing efficiency. Examples of the solid phase on which the nucleic acid is adsorbed by an interaction in which ionic bonds are not substantially involved include, for example, a solid phase having a hydrophilic group. By changing the polarity of the environment, the hydrophilic group of the nucleic acid and the solid phase are bonded to each other. It is presumed that they will attract each other.

親水基とは、水との相互作用を持つことができる有極性の基（原子団）を指し、核酸の吸着に関与する全ての基（原子団）が当てはまる。親水基としては、水との相互作用の強さが中程度のもの（化学大事典、共立出版株式会社発行、「親水基」の項の「あまり親水性の強くない基」参照）が良く、例えば、水酸基、カルボキシ基、シアノ基、オキシエチレン基などを挙げることができる。好ましくは水酸基である。   The hydrophilic group refers to a polar group (atomic group) capable of interacting with water, and all groups (atomic groups) involved in nucleic acid adsorption are applicable. As the hydrophilic group, one having a moderate interaction with water is good (see Chemical Encyclopedia, Kyoritsu Shuppan Co., Ltd., “Hydrophilic group”, “Group that is not very hydrophilic”), Examples thereof include a hydroxyl group, a carboxy group, a cyano group, and an oxyethylene group. Preferably it is a hydroxyl group.

親水基を有する固相とは、固相を形成する材料自体が親水基を有すること、または固相を形成する材料を処理またはコーティングすることによって親水基を導入した固相を意味する。固相を形成する材料は、有機物、無機物のいずれでも良い。例えば、固相を形成する材料自体が親水基を有する有機材料である固相、親水基を持たない有機材料の固相を処理して親水基を導入した固相、親水基を持たない有機材料の固相に対し親水基を有する材料でコーティングして親水基を導入した固相、固相を形成する材料自体が親水基を有する無機材料である固相、親水基を持たない無機材料の固相を処理して親水基を導入した固相、親水基を持たない無機材料の固相に対し親水基を有する材料でコーティングして親水基を導入した固相などを使用することができる。中でも、加工の容易性から、固相を形成する材料として有機高分子などの有機材料を用いることが好ましい。   The solid phase having a hydrophilic group means that the material itself forming the solid phase has a hydrophilic group, or a solid phase into which a hydrophilic group has been introduced by treating or coating the material forming the solid phase. The material forming the solid phase may be either organic or inorganic. For example, a solid phase in which the material forming the solid phase itself is an organic material having a hydrophilic group, a solid phase in which a solid phase of an organic material having no hydrophilic group is processed to introduce a hydrophilic group, or an organic material having no hydrophilic group A solid phase in which a hydrophilic group is introduced by coating with a material having a hydrophilic group on the solid phase, a solid phase in which the solid phase forming material itself is an inorganic material having a hydrophilic group, and a solid phase of an inorganic material having no hydrophilic group. A solid phase in which a hydrophilic group is introduced by treating a phase, a solid phase in which a hydrophilic group is introduced by coating with a material having a hydrophilic group on a solid phase of an inorganic material having no hydrophilic group can be used. Among them, it is preferable to use an organic material such as an organic polymer as a material for forming a solid phase because of ease of processing.

｛親水基を有する有機材料｝
親水基を有する有機材料としては、水酸基を有する有機材料が挙げられる。水酸基を有する有機材料としては、ポリヒドロキシエチルアクリル酸、ポリヒドロキシエチルメタアクリル酸、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、ポリオキシエチレン、多糖構造を有する有機材料（多糖構造を有する有機高分子と称することもある。）などを挙げることができる。 {Organic material having hydrophilic group}
Examples of the organic material having a hydrophilic group include organic materials having a hydroxyl group. Examples of the organic material having a hydroxyl group include polyhydroxyethyl acrylic acid, polyhydroxyethyl methacrylic acid, polyvinyl alcohol, polyvinyl pyrrolidone, polyacrylic acid, polymethacrylic acid, polyoxyethylene, and organic materials having a polysaccharide structure (having a polysaccharide structure) And may be referred to as an organic polymer).

多糖構造を有する有機材料としては、セルロース、ヘミセルロース、デキストラン、アガロース、デキストリン、アミロース、アミロペクチン、デンプン、グリコーゲン、プルラン、マンナン、グルコマンナン、リケナン、イソリケナン、ラミナラン、カラギーナン、キシラン、フルクタン、アルギン酸、ヒアルロン酸、コンドロイチン、キチン、キトサン等を挙げることができる。これらの多糖構造の誘導体を用いてもよい。例えば、多糖構造の水酸基が任意の置換度で、エステル化したもの、エーテル化したもの、ハロゲン化したものが挙げられる。多糖構造およびその誘導体の少なくともいずれかであれば前記に挙げた材料に限定されることなく用いることができる。これらの誘導体は、従来公知の方法で製造することができる。
特にエステル誘導体を好ましく用いることができる。また、エステル誘導体の鹸化物も好適なものとして挙げられる。 Organic materials having a polysaccharide structure include cellulose, hemicellulose, dextran, agarose, dextrin, amylose, amylopectin, starch, glycogen, pullulan, mannan, glucomannan, lichenan, isolikenan, laminaran, carrageenan, xylan, fructan, alginic acid, hyaluronic acid , Chondroitin, chitin, chitosan and the like. These polysaccharide structure derivatives may be used. For example, those in which the hydroxyl group of the polysaccharide structure is esterified, etherified, or halogenated with an arbitrary degree of substitution. Any of the polysaccharide structures and derivatives thereof can be used without being limited to the materials listed above. These derivatives can be produced by a conventionally known method.
In particular, ester derivatives can be preferably used. Further, a saponified product of an ester derivative is also preferable.

前記多糖構造のエステル誘導体におけるエステルとしては、カルボン酸エステル、硝酸エステル、硫酸エステル、スルホン酸エステル、リン酸エステル、ホスホン酸エステル、ピロリン酸エステルが挙げられ、エステル誘導体がこれらのエステルから選ばれる少なくとも１つであることが好ましい。また、これらエステル誘導体の鹸化物も好適なものとして挙げられる。   Examples of the ester in the ester derivative having a polysaccharide structure include a carboxylic acid ester, a nitrate ester, a sulfate ester, a sulfonate ester, a phosphate ester, a phosphonate ester, and a pyrophosphate ester, and the ester derivative is at least selected from these esters. One is preferred. Further, saponified products of these ester derivatives are also suitable.

前記カルボン酸エステルとしては、アルキルカルボニルエステル、アルケニルカルボニルエステル、芳香族カルボニルエステル、芳香族アルキルカルボニルエステルが挙げられ、エステルとしてカルボン酸エステルを用いる場合には、これらのカルボン酸エステルから選ばれる少なくとも１つであることが好ましい。また、これらカルボン酸エステルの鹸化物も好適なものとして挙げられる。   Examples of the carboxylic acid ester include alkyl carbonyl esters, alkenyl carbonyl esters, aromatic carbonyl esters, and aromatic alkyl carbonyl esters. When a carboxylic acid ester is used as the ester, at least one selected from these carboxylic acid esters. It is preferable that In addition, saponified products of these carboxylic acid esters are also preferred.

前記アルキルカルボニルエステルのアルキルカルボニル基としては、アセチル基、プロピオニル基、ブチロイル基、バレル基、ペプタノイル基、オクタノイル基、デカノイル基、ドデカノイル基、トリデカノイル基、ヘキサデカノイル基、オクタデカノイル基が挙げられ、カルボン酸エステルとしてアルキルカルボニルエステルを用いる場合には、これらのアルキルカルボニル基から選ばれる少なくとも１つを有することが好ましい。また、これらアルキルカルボニルエステルの鹸化物も好適なものとして挙げられる。   Examples of the alkylcarbonyl group of the alkylcarbonyl ester include an acetyl group, a propionyl group, a butyroyl group, a barrel group, a peptanoyl group, an octanoyl group, a decanoyl group, a dodecanoyl group, a tridecanoyl group, a hexadecanoyl group, and an octadecanoyl group. When an alkylcarbonyl ester is used as the carboxylic acid ester, it preferably has at least one selected from these alkylcarbonyl groups. Further, saponified products of these alkyl carbonyl esters are also suitable.

前記アルケニルカルボニルエステルのアルケニルカルボニル基としては、アクリル基、メタクリル基が挙げられ、カルボン酸エステルとしてアルケニルカルボニルエステルを用いる場合には、これらのアルケニルカルボニル基から選ばれる少なくとも１つを有することが好ましい。また、これらアルケニルカルボニルエステルの鹸化物も好適なものとして挙げられる。   Examples of the alkenylcarbonyl group of the alkenylcarbonyl ester include an acryl group and a methacryl group. When an alkenylcarbonyl ester is used as the carboxylic acid ester, it preferably has at least one selected from these alkenylcarbonyl groups. Further, saponified products of these alkenyl carbonyl esters are also preferred.

前記芳香族カルボニルエステルの芳香族カルボニル基としては、ベンゾイル基、ナフタロイル基が挙げられ、カルボン酸エステルとして芳香族カルボニルエステルを用いる場合には、これらの芳香族カルボニルエステルから選ばれる少なくとも１つを有することが好ましい。また、これら芳香族カルボニルエステルの鹸化物も好適なものとして挙げられる。   Examples of the aromatic carbonyl group of the aromatic carbonyl ester include a benzoyl group and a naphthaloyl group. When an aromatic carbonyl ester is used as the carboxylic acid ester, the aromatic carbonyl ester has at least one selected from these aromatic carbonyl esters. It is preferable. Further, saponified products of these aromatic carbonyl esters are also preferred.

前記硝酸エステルとしては、ニトロセルロース、ニトロヘミセルロース、ニトロデキストラン、ニトロアガロース、ニトロデキストリン、ニトロアミロース、ニトロアミロペクチン、ニトログリコーゲン、ニトロプルラン、ニトロマンナン、ニトログルコマンナン、ニトロリケナン、ニトロイソリケナン、ニトロラミナラン、ニトロカラギーナン、ニトロキシラン、ニトロフルクタン、ニトロアルギン酸、ニトロヒアルロン酸、ニトロコンドロイチン、ニトロキチン、ニトロキトサンなどが挙げられる。また、これら硝酸エステルの鹸化物も好適なものとして挙げられる。   Examples of the nitrate ester include nitrocellulose, nitrohemicellulose, nitrodextran, nitroagarose, nitrodextrin, nitroamylose, nitroamylopectin, nitroglycogen, nitropullulan, nitromannan, nitroglucomannan, nitrolikenan, nitroisoliquenan, nitrolaminaran, Examples thereof include nitrocarrageenan, nitroxylan, nitrofructan, nitroalginic acid, nitrohyaluronic acid, nitrochondroitin, nitrochitin, and nitrochitosan. Further, saponified products of these nitrates are also suitable.

前記硫酸エステルとしては、セルロース硫酸、ヘミセルロース硫酸、デキストラン硫酸、アガロース硫酸、デキストリン硫酸、アミロース硫酸、アミロペクチン硫酸、グリコーゲン硫酸、プルラン硫酸、マンナン硫酸、グルコマンナン硫酸、リケナン硫酸、イソリケナン硫酸、ラミナラン硫酸、カラギーナン硫酸、キシラン硫酸、フルクタン硫酸、アルギン酸硫酸、ヒアルロン酸硫酸、コンドロイチン硫酸、キチン硫酸、キトサン硫酸などが挙げられる。また、これら硫酸エステルの鹸化物も好適なものとして挙げられる。   Examples of the sulfate ester include cellulose sulfate, hemicellulose sulfate, dextran sulfate, agarose sulfate, dextrin sulfate, amylose sulfate, amylopectin sulfate, glycogen sulfate, pullulan sulfate, mannan sulfate, glucomannan sulfate, lichenan sulfate, isolikenane sulfate, laminaran sulfate, carrageenan Examples include sulfuric acid, xylan sulfate, fructan sulfate, alginic acid sulfate, hyaluronic acid sulfuric acid, chondroitin sulfate, chitin sulfate, and chitosan sulfate. In addition, a saponified product of these sulfates is also preferable.

前記スルホン酸エステルとしては、アルキルスルホン酸エステル、アルケニルスルホン酸エステル、芳香族スルホン酸エステル、芳香族アルキルスルホン酸エステルが挙げられ、エステルとしてスルホン酸エステルを用いる場合には、これらのスルホン酸エステルから選ばれる少なくとも１つであることが好ましい。また、これらスルホン酸エステルの鹸化物も好適なものとして挙げられる。   Examples of the sulfonic acid ester include alkyl sulfonic acid esters, alkenyl sulfonic acid esters, aromatic sulfonic acid esters, and aromatic alkyl sulfonic acid esters. When sulfonic acid esters are used as the esters, from these sulfonic acid esters, It is preferable that at least one selected. In addition, saponified products of these sulfonic acid esters are also preferable.

前記リン酸エステルとしては、セルロースリン酸、ヘミセルロースリン酸、デキストランリン酸、アガロースリン酸、デキストリンリン酸、アミロースリン酸、アミロペクチンリン酸、グリコーゲンリン酸、プルランリン酸、マンナンリン酸、グルコマンナンリン酸、リケナンリン酸、イソリケナンリン酸、ラミナランリン酸、カラギーナンリン酸、キシランリン酸、フルクタンリン酸、アルギン酸リン酸、ヒアルロン酸リン酸、コンドロイチンリン酸、キチンリン酸、キトサンリン酸などが挙げられる。また、これらリン酸エステルの鹸化物も好適なものとして挙げられる。   Examples of the phosphate ester include cellulose phosphate, hemicellulose phosphate, dextran phosphate, agarose phosphate, dextrin phosphate, amylose phosphate, amylopectin phosphate, glycogen phosphate, pullulan phosphate, mannan phosphate, glucomannan phosphate , Lichenan phosphoric acid, isoricenan phosphoric acid, laminaran phosphoric acid, carrageenan phosphoric acid, xylan phosphoric acid, fructan phosphoric acid, alginic acid phosphoric acid, hyaluronic acid phosphoric acid, chondroitin phosphoric acid, chitin phosphoric acid, chitosan phosphoric acid and the like. In addition, saponified products of these phosphate esters are also preferable.

前記ホスホン酸エステルとしては、セルロースホスホン酸、ヘミセルロースホスホン酸、デキストランホスホン酸、アガロースホスホン酸、デキストリンホスホン酸、アミロースホスホン酸、アミロペクチンホスホン酸、グリコーゲンホスホン酸、プルランホスホン酸、マンナンホスホン酸、グルコマンナンホスホン酸、リケナンホスホン酸、イソリケナンホスホン酸、ラミナランホスホン酸、カラギーナンホスホン酸、キシランホスホン酸、フルクタンホスホン酸、アルギン酸ホスホン酸、ヒアルロン酸ホスホン酸、コンドロイチンホスホン酸、キチンホスホン酸、キトサンホスホン酸などが挙げられる。また、これらホスホン酸エステルの鹸化物も好適なものとして挙げられる。   Examples of the phosphonic acid ester include cellulose phosphonic acid, hemicellulose phosphonic acid, dextran phosphonic acid, agarose phosphonic acid, dextrin phosphonic acid, amylose phosphonic acid, amylopectin phosphonic acid, glycogen phosphonic acid, pullulan phosphonic acid, mannan phosphonic acid, and glucomannan phosphonic acid. Examples include acids, lichenan phosphonic acid, isolichenane phosphonic acid, laminaran phosphonic acid, carrageenan phosphonic acid, xylan phosphonic acid, fructan phosphonic acid, alginic acid phosphonic acid, hyaluronic acid phosphonic acid, chondroitin phosphonic acid, chitin phosphonic acid, chitosan phosphonic acid, etc. It is done. In addition, saponified products of these phosphonic acid esters are also preferable.

前記ピロリン酸エステルとしては、セルロースピロリン酸、ヘミセルロースピロリン酸、デキストランピロリン酸、アガロースピロリン酸、デキストリンピロリン酸、アミロースピロリン酸、アミロペクチンピロリン酸、グリコーゲンピロリン酸、プルランピロリン酸、マンナンピロリン酸、グルコマンナンピロリン酸、リケナンピロリン酸、イソリケナンピロリン酸、ラミナランピロリン酸、カラギーナンピロリン酸、キシランピロリン酸、フルクタンピロリン酸、アルギン酸ピロリン酸、ヒアルロン酸ピロリン酸、コンドロイチンピロリン酸、キチンピロリン酸、キトサンピロリン酸などが挙げられる。また、これらピロリン酸エステルの鹸化物も好適なものとして挙げられる。   Examples of the pyrophosphate ester include cellulose pyrophosphate, hemicellulose pyrophosphate, dextran pyrophosphate, agarose pyrophosphate, dextrin pyrophosphate, amylose pyrophosphate, amylopectin pyrophosphate, glycogen pyrophosphate, pullulan pyrophosphate, mannan pyrophosphate, glucomannan pyrophosphate. Acid, lichenane pyrophosphate, isolichenane pyrophosphate, laminaran pyrophosphate, carrageenan pyrophosphate, xylan pyrophosphate, fructan pyrophosphate, alginate pyrophosphate, hyaluronic acid pyrophosphate, chondroitin pyrophosphate, chitin pyrophosphate, chitosan pyrophosphate, etc. Is mentioned. Further, saponified products of these pyrophosphate esters are also suitable.

前記多糖構造のエーテル誘導体におけるエーテルとして、多糖構造がセルロースの場合のエーテルの例を以下に挙げるが、多糖構造の種類、エーテルの種類を含めてこれらに限定されない。
例えば、メチルセルロース、エチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、カルボキシエチルセルロース、カルボキシエチル−カルバモイルエチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシエチルメチルセルロース、シアノエチルセルロース、カルバモイルエチルセルロース等が挙げられる。好ましくは、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロースである。 Examples of the ether in the ether derivative having a polysaccharide structure include ethers in the case where the polysaccharide structure is cellulose, but are not limited to these including the type of polysaccharide structure and the type of ether.
Examples thereof include methyl cellulose, ethyl cellulose, carboxymethyl cellulose, carboxyethyl cellulose, carboxyethyl-carbamoylethyl cellulose, hydroxymethyl cellulose, hydroxyethyl cellulose, hydroxypropyl cellulose, hydroxypropyl methyl cellulose, hydroxyethyl methyl cellulose, cyanoethyl cellulose, carbamoyl ethyl cellulose and the like. Preferred are hydroxymethyl cellulose and hydroxyethyl cellulose.

多糖構造を有する有機材料として好ましくは、アセチルセルロースが挙げられ、更にアセチル価の異なるアセチルセルロース混合物が挙げられる。アセチル価の異なるアセチルセルロース混合物として、トリアセチルセルロースとジアセチルセルロース混合物、トリアセチルセルロースとモノアセチルセルロース混合物、トリアセチルセルロースとジアセチルセルロースとモノアセチルセルロース混合物、ジアセチルセルロースとモノアセチルセルロース混合物を好ましく使用する事ができる。
特にトリアセチルセルロースとジアセチルセルロース混合物が好ましい。トリアセチルセルロースとジアセチルセルロースの混合比（質量比）は、９９：１〜１：９９である事が好ましく、９０：１０〜５０：５０である事がより好ましい。 The organic material having a polysaccharide structure is preferably acetyl cellulose, and further an acetyl cellulose mixture having different acetyl values. As acetylcellulose mixtures having different acetyl values, triacetylcellulose and diacetylcellulose mixtures, triacetylcellulose and monoacetylcellulose mixtures, triacetylcellulose and diacetylcellulose and monoacetylcellulose mixtures, diacetylcellulose and monoacetylcellulose mixtures are preferably used. Can do.
Particularly preferred is a mixture of triacetyl cellulose and diacetyl cellulose. The mixing ratio (mass ratio) of triacetyl cellulose and diacetyl cellulose is preferably 99: 1 to 1:99, and more preferably 90:10 to 50:50.

多糖構造を有する有機材料として好ましく用いられるアセチルセルロースの中でも、特開２００３−１２８６９１号公報に記載の、アセチルセルロースの表面鹸化物が特に好ましい。アセチルセルロースの表面鹸化物（以下、単に「鹸化物」ということもある。）としては、アセチル価の異なるアセチルセルロース混合物を鹸化処理したものが挙げられ、トリアセチルセルロースとジアセチルセルロース混合物の鹸化物、トリアセチルセルロースとモノアセチルセルロース混合物の鹸化物、トリアセチルセルロースとジアセチルセルロースとモノアセチルセルロース混合物の鹸化物、ジアセチルセルロースとモノアセチルセルロース混合物の鹸化物を好ましく使用することができる。より好ましくは、トリアセチルセルロースとジアセチルセルロース混合物の鹸化物を使用することであり、その混合比（質量比）もアセチル価の異なるアセチルセルロースの混合物に前記したと同じ範囲である。鹸化処理の程度（鹸化率）で固相表面の水酸基の量（密度）をコントロールすることができ、好ましい。核酸の分離効率向上の観点から、水酸基の量（密度）が多い方が好ましい。鹸化処理により得られる固相の鹸化率（表面鹸化率）が５％以上１００％以下であることが好ましく、１０％以上１００％以下であることが更に好ましい。また、固相における水酸基を有する表面積を大きくするという観点から、アセチルセルロースを鹸化処理して固相とすることが好ましい。   Among the acetylcelluloses preferably used as the organic material having a polysaccharide structure, the surface saponified product of acetylcellulose described in JP-A No. 2003-128691 is particularly preferable. Examples of the surface saponified product of acetyl cellulose (hereinafter sometimes simply referred to as “saponified product”) include those obtained by saponifying an acetyl cellulose mixture having a different acetyl value, a saponified product of a mixture of triacetyl cellulose and diacetyl cellulose, A saponified product of a mixture of triacetyl cellulose and monoacetyl cellulose, a saponified product of a mixture of triacetyl cellulose, diacetyl cellulose and monoacetyl cellulose, or a saponified product of a mixture of diacetyl cellulose and monoacetyl cellulose can be preferably used. More preferably, a saponified product of a mixture of triacetyl cellulose and diacetyl cellulose is used, and the mixing ratio (mass ratio) is also in the same range as described above for the mixture of acetyl cellulose having different acetyl values. The amount (density) of the hydroxyl group on the surface of the solid phase can be controlled by the degree of saponification treatment (saponification rate), which is preferable. From the viewpoint of improving nucleic acid separation efficiency, it is preferable that the amount (density) of hydroxyl groups is large. The saponification rate (surface saponification rate) of the solid phase obtained by the saponification treatment is preferably 5% or more and 100% or less, and more preferably 10% or more and 100% or less. Further, from the viewpoint of increasing the surface area having hydroxyl groups in the solid phase, it is preferable to saponify acetyl cellulose to obtain a solid phase.

前記した鹸化物を得るには、鹸化処理を行う。ここで、鹸化処理とは、エステル基を有する有機材料を鹸化処理液(例えば水酸化ナトリウム水溶液)に接触させることを言う。これにより、鹸化処理液に接触した部分、すなわち、有機材料の表面が鹸化される。アセチルセルロースの場合には、鹸化処理液に接触した部分は、再生セルロースとなり水酸基が導入される。こうして作製された再生セルロースは、本来のセルロースとは、結晶状態等の点で異なっている。本発明において固相として、再生セルロースを含む固相を用いることが特に好ましい。
又、鹸化率を変えるには、水酸化ナトリウムの濃度を変えて鹸化処理を行えば良い。鹸化率は、ＮＭＲにより、容易に測定することができる（例えば、カルボニル基のピーク減少の程度で定めることができる）。 In order to obtain the saponified product, a saponification treatment is performed. Here, the saponification treatment refers to bringing an organic material having an ester group into contact with a saponification treatment solution (for example, a sodium hydroxide aqueous solution). Thereby, the part which contacted the saponification process liquid, ie, the surface of an organic material, is saponified. In the case of acetylcellulose, the portion in contact with the saponification solution becomes regenerated cellulose and hydroxyl groups are introduced. The regenerated cellulose thus produced is different from the original cellulose in terms of crystal state and the like. In the present invention, it is particularly preferable to use a solid phase containing regenerated cellulose as the solid phase.
In order to change the saponification rate, the saponification treatment may be performed by changing the concentration of sodium hydroxide. The saponification rate can be easily measured by NMR (for example, it can be determined by the degree of peak reduction of the carbonyl group).

｛親水基を持たない有機材料｝
親水基を持たない有機材料を固相として用いる場合に、有機材料に親水基を導入する方法として、ポリマー鎖内または側鎖に親水基を有すグラフトポリマー鎖を有機材料に結合することができる。
有機材料にグラフトポリマー鎖を結合させる方法としては、有機材料とグラフトポリマー鎖とを化学結合させる方法と、有機材料を起点として重合可能な二重結合を有する化合物を重合させグラフトポリマー鎖とする２つの方法がある。 {Organic materials without hydrophilic groups}
When an organic material having no hydrophilic group is used as the solid phase, a graft polymer chain having a hydrophilic group in the polymer chain or in the side chain can be bonded to the organic material as a method for introducing the hydrophilic group into the organic material. .
As a method of bonding the graft polymer chain to the organic material, a method of chemically bonding the organic material and the graft polymer chain, and a compound having a polymerizable double bond starting from the organic material are polymerized to form a graft polymer chain 2 There are two ways.

まず、有機材料とグラフトポリマー鎖とを化学結合させる方法においては、ポリマーの末端または側鎖に有機材料と反応する官能基を有するポリマーを使用し、この官能基と有機材料の官能基とを化学反応させることでグラフトさせることができる。有機材料と反応する官能基としては、有機材料の官能基と反応し得るものであれば特に限定はないが、例えば、アルコキシシランのようなシランカップリング基、イソシアネート基、アミノ基、水酸基、カルボキシ基、スルホン酸基、リン酸基、エポキシ基、アリル基、メタクリロイル基、アクリロイル基等を挙げることができる。
ポリマーの末端、または側鎖に反応性官能基を有するポリマーとして特に有用な化合物は、トリアルコキシシリル基をポリマー末端に有するポリマー、アミノ基をポリマー末端に有するポリマー、カルボキシ基をポリマー末端に有するポリマー、エポキシ基をポリマー末端に有するポリマー、イソシアネート基をポリマー末端に有するポリマーが挙げられる。この時に使用されるポリマーとしては、核酸の吸着に関与する親水基を有するものであれば特に限定はないが、具体的には、ポリヒドロキシエチルアクリル酸、ポリヒドロキシエチルメタアクリル酸及びそれらの塩、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸及びそれらの塩、ポリオキシエチレンなどを挙げることができる。 First, in the method of chemically bonding an organic material and a graft polymer chain, a polymer having a functional group that reacts with the organic material at the terminal or side chain of the polymer is used, and this functional group and the functional group of the organic material are chemically treated. It can be grafted by reacting. The functional group that reacts with the organic material is not particularly limited as long as it can react with the functional group of the organic material. For example, a silane coupling group such as alkoxysilane, an isocyanate group, an amino group, a hydroxyl group, and a carboxy group. Groups, sulfonic acid groups, phosphoric acid groups, epoxy groups, allyl groups, methacryloyl groups, acryloyl groups, and the like.
Compounds particularly useful as polymers having reactive functional groups at the polymer ends or side chains are polymers having trialkoxysilyl groups at the polymer ends, polymers having amino groups at the polymer ends, polymers having carboxy groups at the polymer ends. , A polymer having an epoxy group at the polymer end, and a polymer having an isocyanate group at the polymer end. The polymer used at this time is not particularly limited as long as it has a hydrophilic group involved in nucleic acid adsorption. Specifically, polyhydroxyethylacrylic acid, polyhydroxyethylmethacrylic acid and salts thereof , Polyvinyl alcohol, polyvinyl pyrrolidone, polyacrylic acid, polymethacrylic acid and salts thereof, and polyoxyethylene.

有機材料を起点として重合可能な二重結合を有する化合物を重合させ、グラフトポリマー鎖とする方法は、一般的には表面グラフト重合と呼ばれる。表面グラフト重合法とは、プラズマ照射、光照射、加熱などの方法で有機材料表面上に活性種を与え、有機材料と接するように配置された重合可能な二重結合を有する化合物を重合によって有機材料と結合させる方法を指す。
有機材料に結合しているグラフトポリマー鎖を形成するのに有用な化合物は、重合可能な二重結合を有しており、核酸の吸着に関与する親水基を有するという、２つの特性を兼ね備えていることが必要である。これらの化合物としては、分子内に二重結合を有していれば親水基を有するポリマー、オリゴマー、モノマーのいずれの化合物をも用いることができる。特に有用な化合物は親水基を有するモノマーである。
特に有用な親水基を有するモノマーの具体例としては、例えば、２−ヒドロキシエチルアクリレート、２−ヒドロキシエチルメタクリレート、グリセロールモノメタクリレート等の水酸性基含有モノマーである。また、アクリル酸、メタアクリル酸等のカルボキシ基含有モノマー、もしくはそのアルカリ金属塩及びアミン塩も好ましく用いることができる。 A method of polymerizing a compound having a polymerizable double bond starting from an organic material to form a graft polymer chain is generally called surface graft polymerization. The surface graft polymerization method is a method in which an active species is provided on the surface of an organic material by a method such as plasma irradiation, light irradiation, or heating, and a compound having a polymerizable double bond disposed so as to be in contact with the organic material is polymerized by polymerization. Refers to the method of bonding with the material.
A compound useful for forming a graft polymer chain bonded to an organic material has a double bond that can be polymerized and has a hydrophilic group that participates in nucleic acid adsorption. It is necessary to be. As these compounds, any of polymers, oligomers, and monomers having a hydrophilic group can be used as long as they have a double bond in the molecule. Particularly useful compounds are monomers having hydrophilic groups.
Specific examples of the particularly useful monomer having a hydrophilic group include monomers having a hydroxyl group, such as 2-hydroxyethyl acrylate, 2-hydroxyethyl methacrylate, and glycerol monomethacrylate. In addition, carboxy group-containing monomers such as acrylic acid and methacrylic acid, or alkali metal salts and amine salts thereof can also be preferably used.

親水基を持たない有機材料に親水基を導入する別の方法として、親水基を有する材料をコーティングする方法を用いることができる。コーティングに使用する材料は、核酸の吸着に関与する親水基を有するものであれば特に限定はないが、作業の容易さから有機材料のポリマーが好ましい。ポリマーとしては、ポリヒドロキシエチルアクリル酸、ポリヒドロキシエチルメタアクリル酸及びそれらの塩、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸及びそれらの塩、ポリオキシエチレン、アセチルセルロース、アセチル価の異なるアセチルセルロース混合物などを挙げることができ、多糖構造を有するポリマーが好ましい。   As another method for introducing a hydrophilic group into an organic material having no hydrophilic group, a method of coating a material having a hydrophilic group can be used. The material used for the coating is not particularly limited as long as it has a hydrophilic group involved in nucleic acid adsorption, but an organic material polymer is preferable from the viewpoint of easy work. Examples of polymers include polyhydroxyethyl acrylic acid, polyhydroxyethyl methacrylic acid and salts thereof, polyvinyl alcohol, polyvinyl pyrrolidone, polyacrylic acid, polymethacrylic acid and salts thereof, polyoxyethylene, acetylcellulose, and different acetyl values. An acetylcellulose mixture can be mentioned, and a polymer having a polysaccharide structure is preferred.

また、親水基を持たない有機材料に、アセチルセルロースまたはアセチル価の異なるアセチルセルロース混合物をコーティングした後に、コーティングしたアセチルセルロースまたはアセチル価の異なるアセチルセルロース混合物を鹸化処理することもできる。この場合、鹸化率が５％以上１００％以下であることが好ましい。さらには、鹸化率が１０％以上１００％以下であることが好ましい。   Further, after coating an organic material having no hydrophilic group with acetyl cellulose or an acetyl cellulose mixture having a different acetyl value, the coated acetyl cellulose or an acetyl cellulose mixture having a different acetyl value can be saponified. In this case, the saponification rate is preferably 5% or more and 100% or less. Furthermore, the saponification rate is preferably 10% or more and 100% or less.

｛親水基を有する無機材料｝
親水基を有する無機材料としては、シリカ化合物が挙げられる。シリカ化合物を含有する固相としては、ガラスフィルターを挙げることができる。また、特許公報第３０５８３４２号に記載されているような、多孔質のシリカ薄膜を挙げることができる。この多孔質のシリカ薄膜とは、二分子膜形成能を有するカチオン型の両親媒性物質の展開液を基板上に展開した後、基板上の液膜から溶媒を除去することによって両親媒性物質の多層二分子膜薄膜を調整し、シリカ化合物を含有する溶液に多層二分子膜薄膜を接触させ、次いで前記多層二分子膜薄膜を抽出除去することで作製することができる。 {Inorganic material having hydrophilic groups}
A silica compound is mentioned as an inorganic material which has a hydrophilic group. A glass filter can be mentioned as a solid phase containing a silica compound. Further, a porous silica thin film as described in Japanese Patent Publication No. 3058342 can be given. This porous silica thin film is an amphiphilic substance by spreading a developing solution of a cationic type amphiphilic substance having a bilayer-forming ability on a substrate and then removing the solvent from the liquid film on the substrate. This multilayer bilayer thin film can be prepared by bringing the multilayer bilayer thin film into contact with a solution containing a silica compound, and then extracting and removing the multilayer bilayer thin film.

｛親水基を持たない無機材料｝
固相として使用できる親水基を持たない無機材料としては、アルミニウム等の金属、ガラス、セメント、陶磁器等のセラミックス、もしくはニューセラミックス、シリコン、活性炭等を挙げることができる。 {Inorganic material without hydrophilic groups}
Examples of the inorganic material having no hydrophilic group that can be used as a solid phase include metals such as aluminum, ceramics such as glass, cement, and ceramics, or new ceramics, silicon, and activated carbon.

親水基を持たない無機材料に親水基を導入する方法としては、無機材料と親水基を持つグラフトポリマー鎖とを化学結合させる方法と、分子内に二重結合を有している親水基を有するモノマーを使用して、無機材料を起点として、グラフトポリマー鎖を重合する２つの方法がある。
無機材料と親水基を持つグラフトポリマー鎖とを化学結合させる場合は、グラフトポリマー鎖の末端の官能基と反応する官能基を無機材料に導入し、そこにグラフトポリマーを化学結合させる。また、分子内に二重結合を有している親水基を有するモノマーを使用し、無機材料を起点として、グラフトポリマー鎖を重合する場合は、二重結合を有する化合物を重合する際の起点となる官能基を無機材料に導入する。 As a method of introducing a hydrophilic group into an inorganic material having no hydrophilic group, there are a method of chemically bonding an inorganic material and a graft polymer chain having a hydrophilic group, and a method having a hydrophilic group having a double bond in the molecule. There are two ways to polymerize graft polymer chains using monomers and starting from inorganic materials.
In the case of chemically bonding an inorganic material and a graft polymer chain having a hydrophilic group, a functional group that reacts with a functional group at the terminal of the graft polymer chain is introduced into the inorganic material, and the graft polymer is chemically bonded thereto. In addition, when using a monomer having a hydrophilic group having a double bond in the molecule and polymerizing a graft polymer chain starting from an inorganic material, the starting point for polymerizing a compound having a double bond Is introduced into the inorganic material.

親水基を持つグラフトポリマー、および分子内に二重結合を有している親水基を有するモノマーとしては、前記、親水基を持たない有機材料に親水基を導入する方法において、記載した親水基を有するグラフトポリマー、および分子内に二重結合を有している親水基を有するモノマーを好ましく使用することができる。   As the graft polymer having a hydrophilic group and the monomer having a hydrophilic group having a double bond in the molecule, the hydrophilic group described in the method for introducing a hydrophilic group into an organic material having no hydrophilic group is used. A graft polymer having a monomer and a hydrophilic group having a double bond in the molecule can be preferably used.

親水基を持たない無機材料に親水基を導入する別の方法として、親水基を有する材料をコーティングすることができる。コーティングに使用する材料は、核酸の吸着に関与する親水基を有するものであれば特に限定はないが、作業の容易さから有機材料のポリマーが好ましい。該ポリマーとしては、ポリヒドロキシエチルアクリル酸、ポリヒドロキシエチルメタアクリル酸及びそれらの塩、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸及びそれらの塩、ポリオキシエチレン、アセチルセルロース、アセチル価の異なるアセチルセルロース混合物などを挙げることができる。   As another method for introducing a hydrophilic group into an inorganic material having no hydrophilic group, a material having a hydrophilic group can be coated. The material used for the coating is not particularly limited as long as it has a hydrophilic group involved in nucleic acid adsorption, but an organic material polymer is preferable from the viewpoint of easy work. Examples of the polymer include polyhydroxyethyl acrylic acid, polyhydroxyethyl methacrylic acid and salts thereof, polyvinyl alcohol, polyvinyl pyrrolidone, polyacrylic acid, polymethacrylic acid and salts thereof, polyoxyethylene, acetylcellulose, and acetyl value. Mention may be made of different acetylcellulose mixtures.

また、親水基を持たない無機材料に、アセチルセルロースまたはアセチル価の異なるアセチルセルロース混合物をコーティングした後に、コーティングしたアセチルセルロースまたはアセチル価の異なるアセチルセルロース混合物を鹸化処理することもできる。この場合、鹸化率が５％以上１００％以下であることが好ましい。さらには、鹸化率が１０％以上１００％以下であることが好ましい。   In addition, after coating an inorganic material having no hydrophilic group with acetyl cellulose or an acetyl cellulose mixture having a different acetyl value, the coated acetyl cellulose or an acetyl cellulose mixture having a different acetyl value can be saponified. In this case, the saponification rate is preferably 5% or more and 100% or less. Furthermore, the saponification rate is preferably 10% or more and 100% or less.

｛性状｝
前記の固相は、溶液が接触することができれば、何れの形状でもよい。例えば、固相がファイバーなど、表面に溶液が接触する形状、また、後記のように溶液が内部を通過可能な形状でもよい。
また、ビーズが前記の材料でコーティングされることにより、固相とされていてもよい。ビーズには、アセチル価の異なるアセチルセルロースの混合物がコーティングされていることが好ましい。この場合、ビーズは磁性ビーズを用いてもよい。例えばポリエチレン製のビーズの表面にトリアセチルセルロースの膜を形成してもよい。すなわち、トリアセチルセルロースはビーズにコーティングされることになる。ビーズの素材は、核酸を汚染等しなければよく、ポリエチレンには限定されない。
固相は、溶液が内部を通過可能なフィルター又は膜状の形状（以下、溶液が内部を通過可能な固相とも称する。）で使用することが好ましい。この場合、厚さが１０μｍ〜５００μｍであることが好ましい。さらに好ましくは、厚さが５０μｍ〜２５０μｍである。この範囲内にあることが、洗浄の観点から好ましい。 {Properties}
The solid phase may have any shape as long as the solution can be contacted. For example, the solid phase may have a shape such as a fiber where the solution is in contact with the surface, or a shape where the solution can pass through the interior as described later.
Further, the solid phase may be obtained by coating the beads with the above-mentioned material. The beads are preferably coated with a mixture of acetylcelluloses having different acetyl values. In this case, magnetic beads may be used as the beads. For example, a triacetyl cellulose film may be formed on the surface of polyethylene beads. That is, the triacetyl cellulose is coated on the beads. The material of the beads is not limited to polyethylene as long as it does not contaminate the nucleic acid.
The solid phase is preferably used in the form of a filter or a membrane that allows the solution to pass through the interior (hereinafter also referred to as a solid phase that allows the solution to pass through the interior). In this case, the thickness is preferably 10 μm to 500 μm. More preferably, the thickness is 50 μm to 250 μm. It is preferable that it exists in this range from a viewpoint of washing | cleaning.

前記の溶液が内部を通過可能な固相は、多孔性膜であることが好ましく、孔の平均孔径が０．１μｍ〜１０μｍであることが好ましい。さらに好ましくは、平均孔径が１μｍ〜５μｍである。この範囲内にあれば、核酸が吸着するのに十分な表面積が得られるとともに、目詰まりし難く、好ましい。この溶液が内部を通過可能な固相の平均孔径は、バブルポイント法（ＡＳＴＭ Ｆ３１６−８６、ＪＩＳ Ｋ−３８３２に準拠）を用いて決定することができる。   The solid phase through which the solution can pass is preferably a porous membrane, and the average pore diameter is preferably 0.1 μm to 10 μm. More preferably, the average pore diameter is 1 μm to 5 μm. If it exists in this range, while sufficient surface area for a nucleic acid to adsorb | suck will be obtained, it is hard to clog and it is preferable. The average pore diameter of the solid phase through which this solution can pass can be determined using the bubble point method (according to ASTM F316-86, JIS K-3832).

前期の溶液が内部を通過可能な固相は、表裏対称性の多孔性膜であってもよい。また表裏非対称性の多孔性膜であってもよい。ここで、表裏非対称性とは、多孔性膜の一方の面から他方の面へと膜の物理的性質または化学的性質が変化している性質を示す。
膜の物理的性質の例としては、平均孔径が挙げられる。また膜の化学的性質としては鹸化度が挙げられる。
平均孔径が表裏非対称性の多孔性膜を本発明で使用する場合は、液の通過する方向に平均孔径が、大から小に変化するように使用するのが好ましい。ここで、最大孔径と最小孔径の比が２以上である多孔性膜を用いる事が好ましい。さらに好ましくは、最大孔径と最小孔径の比が５以上である。この範囲内にあれば、核酸が吸着するのに十分な表面積が得られるとともに、目詰まりし難く、好ましい。 The solid phase through which the previous solution can pass may be a porous film with symmetrical front and back surfaces. Moreover, the front and back asymmetric porous membrane may be sufficient. Here, the front and back asymmetry indicates a property in which the physical property or chemical property of the membrane changes from one surface of the porous membrane to the other surface.
An example of the physical properties of the membrane is the average pore size. The chemical properties of the membrane include the degree of saponification.
When a porous membrane having an average pore size that is asymmetrical is used in the present invention, it is preferably used so that the average pore size changes from large to small in the direction in which the liquid passes. Here, it is preferable to use a porous membrane having a ratio of the maximum pore diameter to the minimum pore diameter of 2 or more. More preferably, the ratio of the maximum pore diameter to the minimum pore diameter is 5 or more. If it exists in this range, while sufficient surface area for a nucleic acid to adsorb | suck will be obtained, it is hard to clog and it is preferable.

前記の、溶液が内部を通過可能な固相は、空隙率が５０〜９５％であることが好ましい。さらに好ましくは、空隙率が６５〜８０％である。また、バブルポイントが、０．１〜１０ｋｇｆ／ｃｍ2である事が好ましい。さらに好ましくは、バブルポイントが、０．２〜４ｋｇｆ／ｃｍ2である。 The solid phase through which the solution can pass is preferably 50 to 95% in porosity. More preferably, the porosity is 65 to 80%. Moreover, it is preferable that a bubble point is 0.1-10 kgf / cm < 2 >. More preferably, a bubble point is 0.2-4 kgf / cm < 2 >.

前記の、溶液が内部を通過可能な固相は、圧力損失が、０．１〜１００ｋＰａである事が好ましい。この範囲内にあることで、過圧時に均一な圧力が得られ、好ましい。さらに好ましくは、圧力損失が、０．５〜５０ｋＰａである。ここで、圧力損失とは、膜の厚さ１００μｍあたり、水を通過させるのに必要な最低圧力である。   The solid phase through which the solution can pass is preferably 0.1 to 100 kPa in pressure loss. By being in this range, a uniform pressure can be obtained during overpressure, which is preferable. More preferably, the pressure loss is 0.5 to 50 kPa. Here, the pressure loss is the minimum pressure required to pass water per 100 μm thickness of the membrane.

前記の、溶液が内部を通過可能な固相は、２５℃で１ｋｇ／ｃｍ2の圧力で水を通過させたときの透水量が、膜１ｃｍ2あたり１分間で１〜５０００ｍＬであることが好ましい。さらに好ましくは、２５℃で１ｋｇ／ｃｍ2の圧力で水を通過させたときの透水量が、膜１ｃｍ2あたり１分間で５〜１０００ｍＬである。 The solid phase through which the solution can pass is preferably 1 to 5000 mL per minute per 1 cm 2 of membrane when water is passed at 25 ° C. and 1 kg / cm 2 of pressure. . More preferably, the water permeation amount when water is passed at 25 ° C. and a pressure of 1 kg / cm 2 is 5 to 1000 mL per minute per 1 cm 2 of membrane.

前記の、溶液が内部を通過可能な固相は、多孔性膜１ｍｇあたりの核酸の吸着量が０．１μｇ以上である事が好ましい。さらに好ましくは、多孔性膜１ｍｇあたりの核酸の吸着量が０．９μｇ以上である。   The solid phase through which the solution can pass is preferably 0.1 μg or more of nucleic acid adsorbed per 1 mg of the porous membrane. More preferably, the amount of nucleic acid adsorbed per 1 mg of the porous membrane is 0.9 μg or more.

核酸を含む試料溶液を前記固相に接触させる場合の流速は、液の固相への適切な接触時間を得るために、固相の面積１ｃｍ2あたり、２〜１５００μＬ／secである事が好ましい。液の固相への接触時間が短すぎると十分な分離精製効果が得られず、長すぎると操作性の点から好ましくない。さらに、前記流速は、固相の面積１ｃｍ2あたり、５〜７００μＬ／secである事が好ましい。 The flow rate when the sample solution containing nucleic acid is brought into contact with the solid phase is preferably 2 to 1500 μL / sec per 1 cm 2 of the solid phase area in order to obtain an appropriate contact time of the liquid with the solid phase. . If the contact time of the liquid with the solid phase is too short, a sufficient separation and purification effect cannot be obtained, and if it is too long, it is not preferable from the viewpoint of operability. Further, the flow rate is preferably 5 to 700 μL / sec per 1 cm 2 of the solid phase area.

また、溶液が内部を通過可能な固相は、１つのみ用いても複数を使用してもよい。複数の固相は、同一の素材であっても、異なるものであって良い。   Further, only one or a plurality of solid phases through which the solution can pass may be used. The plurality of solid phases may be the same material or different.

＜洗浄工程＞
以下、洗浄工程について説明する。核酸を固相に吸着させた後、固相の洗浄を行うことにより、核酸の回収量及び純度が向上し、必要な核酸を含む検体の量を微量とすることができる。また、洗浄工程や後述する回収工程を自動化することによって、操作が簡便かつ迅速に行うことが可能になり、好ましい。洗浄工程は、迅速化のためには1回の洗浄で済ませてもよく、また純度がより重要な場合には複数回洗浄を繰返すことが好ましい。 <Washing process>
Hereinafter, the cleaning process will be described. By washing the solid phase after adsorbing the nucleic acid to the solid phase, the recovery amount and purity of the nucleic acid can be improved, and the amount of the specimen containing the necessary nucleic acid can be made very small. Further, it is preferable to automate the washing process and the recovery process described later, because the operation can be performed easily and quickly. The cleaning step may be completed only once for speeding up, and it is preferable to repeat the cleaning multiple times when purity is more important.

洗浄液は、水溶性有機溶媒及び/または水溶性塩を含んでいる溶液であることが好ましい。又、必要に応じて緩衝剤、界面活性剤を含んでも良い。洗浄液は、固相に核酸と共に吸着した試料溶液中の不純物を洗い流す機能を有する必要がある。そのためには、固相から核酸は脱着させないが不純物は脱着させる組成であることが必要である。この目的には、核酸がアルコール等の水溶性有機溶媒に難溶性であるので、核酸を保持したまま核酸以外の成分を脱着させるのに適している。また、水溶性塩を添加することにより、核酸の吸着効果が高まるので、不純物および不要成分の選択的除去作用が向上するので、好ましい。   The cleaning liquid is preferably a solution containing a water-soluble organic solvent and / or a water-soluble salt. Moreover, you may contain a buffering agent and surfactant as needed. The washing liquid needs to have a function of washing out impurities in the sample solution adsorbed on the solid phase together with the nucleic acid. For that purpose, it is necessary to have a composition that does not desorb nucleic acids from the solid phase but desorbs impurities. For this purpose, since the nucleic acid is hardly soluble in water-soluble organic solvents such as alcohol, it is suitable for desorbing components other than the nucleic acid while retaining the nucleic acid. Further, the addition of a water-soluble salt is preferable because the effect of adsorbing nucleic acids is enhanced, and the selective removal action of impurities and unnecessary components is improved.

洗浄液に含まれる水溶性有機溶媒としては、アルコール、アセトンなどを用いることができ、アルコールが好ましい。アルコールとしては、メタノール、エタノール、プロパノール、およびブタノールが挙げられる。プロパノールとしては、イソプロパノール、ｎ−プロパノールのいずれでもよく、ブタノールも直鎖状でも分岐状でもよい。これらアルコールは、複数種類を使用することもできる。この中でも、エタノールを用いることが好ましい。洗浄液中に含まれる水溶性有機溶媒の量は、２０〜１００質量％であることが好ましく、４０〜８０質量％であることがより好ましい。   As the water-soluble organic solvent contained in the cleaning liquid, alcohol, acetone or the like can be used, and alcohol is preferable. Alcohols include methanol, ethanol, propanol, and butanol. The propanol may be either isopropanol or n-propanol, and butanol may be linear or branched. A plurality of these alcohols can be used. Among these, it is preferable to use ethanol. The amount of the water-soluble organic solvent contained in the cleaning liquid is preferably 20 to 100% by mass, and more preferably 40 to 80% by mass.

一方、洗浄液に含まれる水溶性塩は、ハロゲン化物の塩であることが好ましく、中でも塩化物がより好ましい。また、水溶性塩は、一価または二価のカチオンであることが好ましく、特にアルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩が好ましく、中でもナトリウム塩及びカリウム塩が好ましく、ナトリウム塩が最も好ましい。
水溶性塩が洗浄液中に含まれる場合、その濃度は１０ｍｍｏｌ／Ｌ以上であることが好ましく、その上限は不純物の溶解性を損なわない範囲であれば特に問わないが、１ｍｏｌ／Ｌ以下であることが好ましく、０．１ｍｏｌ／Ｌ以下であることがより好ましい。よりさらに好ましくは、水溶性塩が塩化ナトリウムであり、とりわけ、塩化ナトリウムが２０ｍｍｏｌ／Ｌ以上含まれていることが好ましい。 On the other hand, the water-soluble salt contained in the cleaning liquid is preferably a halide salt, and more preferably chloride. The water-soluble salt is preferably a monovalent or divalent cation, particularly preferably an alkali metal salt or an alkaline earth metal salt, particularly preferably a sodium salt or potassium salt, and most preferably a sodium salt.
When the water-soluble salt is contained in the cleaning liquid, the concentration is preferably 10 mmol / L or more, and the upper limit is not particularly limited as long as it does not impair the solubility of impurities, but it is 1 mol / L or less. Is preferable, and 0.1 mol / L or less is more preferable. More preferably, the water-soluble salt is sodium chloride, and it is particularly preferable that sodium chloride is contained in an amount of 20 mmol / L or more.

緩衝剤、界面活性剤としては、｛前処理液｝において既述の緩衝剤、界面活性剤が挙げられる。これらの内、洗浄液には、エタノール、Ｔｒｉｓ及びＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含むことが好ましい。Ｔｒｉｓ及びＴｒｉｔｏｎＸ−１００の好ましい濃度は、それぞれ１０〜１００ｍｍｏｌ／Ｌ、及び０．１〜１０質量％である。 Examples of the buffering agent and the surfactant include the buffering agent and the surfactant described above in {Pretreatment liquid}. Of these, the cleaning solution preferably contains ethanol, Tris and Triton X- 100. The preferable concentrations of Tris and Triton X- 100 are 10 to 100 mmol / L and 0.1 to 10% by mass, respectively.

洗浄液は、カオトロッピック物質を含んでいないことが好ましい。それによって、洗浄工程に引き続く回収工程にカオトロピック物質が混入する可能性を減らすことができる。回収工程時に、カオトロピック物質が混入すると、しばしばＰＣＲ反応（ポリメラーゼ連鎖反応）等の酵素反応を阻害するので、後の酵素反応等を考慮すると洗浄液にカオトロッピク物質を含まないことが理想的である。また、カオトロピック物質は、腐食性で有害であるので、この点でもカオトロピック物質を用いないで済むことは、実験者にとっても試験操作の安全上極めて有利である。ここでカオトロピック物質とは、前記した尿素、グアニジン塩、イソチアン酸ナトリウム、ヨウ化ナトリウム、ヨウ化カリウムなどである。   It is preferable that the cleaning liquid does not contain a chaotropic substance. Thereby, the possibility that the chaotropic substance is mixed in the recovery process subsequent to the cleaning process can be reduced. When a chaotropic substance is mixed during the recovery step, an enzyme reaction such as a PCR reaction (polymerase chain reaction) is often inhibited. Therefore, it is ideal that the washing solution does not contain a chaotropic substance in consideration of the subsequent enzyme reaction or the like. In addition, since chaotropic substances are corrosive and harmful, it is extremely advantageous for the experimenter from the viewpoint of safety of the test operation that the chaotropic substances need not be used. Here, the chaotropic substance is urea, guanidine salt, sodium isothiocyanate, sodium iodide, potassium iodide or the like.

従来、核酸分離精製方法における洗浄工程の際、洗浄液が核酸分離精製方法に使用する容器に対する濡れ性が高いため、しばしば洗浄液が容器中に残留することになり、洗浄工程に続く回収工程の際、洗浄液が混入して分離する核酸の純度の低下や回収工程後に次の工程（例えば、ＰＣＲ反応等）を行う場合における反応性の低下などの原因となっている。したがって、容器を用いて核酸の吸着及び脱着を行う場合、吸着、洗浄時に用いる液、特に洗浄液が、回収工程や回収工程後の工程に影響を及ぼさないように、容器内に洗浄残液が残留しないことが望ましい。   Conventionally, at the time of the washing step in the nucleic acid separation and purification method, since the washing liquid has high wettability with respect to the container used in the nucleic acid separation and purification method, the washing liquid often remains in the container, and during the recovery step following the washing step, This is a cause of a decrease in the purity of the nucleic acid separated by mixing with the washing solution or a decrease in reactivity when the next step (for example, PCR reaction) is performed after the recovery step. Therefore, when nucleic acid is adsorbed and desorbed using a container, residual washing liquid remains in the container so that the liquid used for adsorption and washing, particularly the washing liquid, does not affect the recovery process or the process after the recovery process. It is desirable not to.

したがって、洗浄工程における洗浄液が回収工程の回収液に混入することを防止して、洗浄液の容器内への残留を最小限に留めるため、洗浄液の表面張力を０．０３５Ｊ／ｍ2未満にすることが好ましい。表面張力が低いと、洗浄液と容器の濡れ性が向上し、残留する液量を抑えることができ、好ましい。 Therefore, the surface tension of the cleaning liquid should be less than 0.035 J / m 2 in order to prevent the cleaning liquid in the cleaning process from being mixed into the recovery liquid in the recovery process and to keep the cleaning liquid remaining in the container to a minimum. Is preferred. When the surface tension is low, the wettability between the cleaning liquid and the container is improved, and the remaining liquid amount can be suppressed, which is preferable.

洗浄液において水の割合を増やして、洗浄効率を上げることができるが、洗浄液の表面張力が上昇し、これによって残留する液量が増えてしまう。洗浄液の表面張力が０．０３５Ｊ／ｍ2以上の場合は、容器の撥水性を高めることで、残留する液量を抑えることができる。容器の撥水性を高めることで、液滴を形成させ、その液滴が流れ落ちることによって残留する液量が抑制できる。撥水性を高める方法としては、容器表面にシリコン等の撥水剤をコートするか、容器成型時にシリコン等の撥水剤を練り込む等の手段があるが、これに限らない。 Although the cleaning efficiency can be increased by increasing the proportion of water in the cleaning liquid, the surface tension of the cleaning liquid increases, which increases the amount of remaining liquid. When the surface tension of the cleaning liquid is 0.035 J / m 2 or more, the remaining liquid amount can be suppressed by increasing the water repellency of the container. By increasing the water repellency of the container, droplets can be formed, and the amount of liquid remaining by the droplets flowing down can be suppressed. As a method for enhancing water repellency, there are means such as coating the surface of the container with a water repellent such as silicon, or kneading a water repellent such as silicon when molding the container, but is not limited thereto.

洗浄工程における洗浄液の液量は、２μｌ／ｍｍ2以上が好ましい。洗浄液量が多量であれば洗浄効果は向上する。しかし、２００μｌ／ｍｍ2以下とすることで、操作性を保ち、試料の流出を抑止することができ好ましい。 The amount of the cleaning liquid in the cleaning process is preferably 2 μl / mm 2 or more. If the amount of the cleaning liquid is large, the cleaning effect is improved. However, it is preferable that the amount be 200 μl / mm 2 or less because operability can be maintained and sample outflow can be suppressed.

洗浄工程において、洗浄液を固相に接触させる場合の流速は、固相の単位面積１ｃｍ2あたり、２〜１５００μＬ／ｓｅｃであることが好ましく、５〜７００μＬ／ｓｅｃであることがより好ましい。通過速度を下げて時間を掛ければ洗浄がそれだけ十分に行なわれることになる。しかし、前記の範囲とすることで、洗浄効率を落とすことなく、核酸の分離精製操作を迅速化でき、好ましい。 In the washing step, the flow rate when the washing liquid is brought into contact with the solid phase is preferably 2 to 1500 μL / sec, more preferably 5 to 700 μL / sec per 1 cm 2 of the solid phase unit area. If the passage speed is lowered and time is taken, the washing is sufficiently performed. However, the above range is preferable because the operation of separating and purifying nucleic acid can be speeded up without reducing the washing efficiency.

洗浄工程において、洗浄液の液温は４〜７０℃であることが好ましい。さらには、洗浄液の液温を室温とすることがより好ましい。また、洗浄工程において、洗浄工程と同時に核酸分離精製方法に使用する容器に器械的な振動や超音波による攪拌を与えることもできる。または遠心分離を行うことにより洗浄することもできる。   In the washing step, the temperature of the washing solution is preferably 4 to 70 ° C. Furthermore, it is more preferable that the temperature of the cleaning liquid is room temperature. In the washing step, mechanical vibration and ultrasonic stirring can be applied to the container used for the nucleic acid separation and purification method simultaneously with the washing step. Alternatively, it can be washed by centrifugation.

＜回収工程（脱着工程）＞
洗浄工程の次に、固相に吸着した核酸を脱着せしめうる溶液である回収液に、洗浄後の固相を接触させる。固相と接触した後の溶液（以下、精製後溶液とも称する。）には目的とする核酸が含まれているので、これを後に続く工程、例えばＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）による核酸の増幅に提供する。 <Recovery process (desorption process)>
Following the washing step, the washed solid phase is brought into contact with a recovery solution, which is a solution capable of desorbing the nucleic acid adsorbed on the solid phase. Since the target nucleic acid is contained in the solution after contact with the solid phase (hereinafter also referred to as the solution after purification), this is provided for subsequent steps, for example, amplification of the nucleic acid by PCR (polymerase chain reaction). To do.

核酸を含む試料溶液の体積に対して、回収液の体積を調整して核酸の脱着を行うことができる。使用する回収液量は、そのとき核酸分離精製に供せられる検体量による。一般的によく使われる回収液量は数１０から数１００μｌであるが、検体量が極微量である時や、逆に大量の核酸を分離精製したい場合には回収液量は１μｌから数１０ｍｌの範囲で変える事ができる。   Nucleic acid can be desorbed by adjusting the volume of the recovered solution with respect to the volume of the sample solution containing the nucleic acid. The amount of the recovered liquid to be used depends on the amount of specimen that is then subjected to nucleic acid separation and purification. In general, the amount of the recovered liquid is several tens to several hundreds of μl. However, when the amount of the sample is extremely small, or when it is desired to separate and purify a large amount of nucleic acid, the amount of the recovered liquid is 1 μl to several tens of ml. You can change the range.

回収液としては好ましくは精製蒸留水、Ｔｒｉｓ／ＥＤＴＡバッファ等が使用できる。回収液のｐＨは、ｐＨ２〜１１であることが好ましい。さらには、ｐＨ５〜９であることが好ましい。また特にイオン強度と塩濃度は吸着核酸の溶出に効果を及ぼす。回収液は、塩濃度が０．５ｍｏｌ／Ｌ以下の溶液であることが好ましい。回収液は、５００ｍｏｌ／Ｌ以下のイオン強度であることが好ましく、より好ましくは２９０ｍｍｏｌ／Ｌ以下のイオン強度であることが好ましく、さらに好ましくは９０ｍｍｏｌ／Ｌ以下のイオン強度であることが好ましい。こうすることで、核酸の回収率が向上し、より多くの核酸を回収できることができる。   The recovered liquid is preferably purified distilled water, Tris / EDTA buffer or the like. The pH of the recovery liquid is preferably pH 2-11. Furthermore, it is preferable that it is pH 5-9. In particular, ionic strength and salt concentration have an effect on the elution of adsorbed nucleic acids. The recovered liquid is preferably a solution having a salt concentration of 0.5 mol / L or less. The recovered liquid preferably has an ionic strength of 500 mol / L or less, more preferably 290 mmol / L or less, and even more preferably 90 mmol / L or less. By doing so, the recovery rate of nucleic acids can be improved, and more nucleic acids can be recovered.

回収液の体積を当初の核酸を含む試料溶液の体積と比較して少なくすることによって、濃縮された核酸を含む回収液を得ることができる。好ましくは、（回収液体積）：（試料溶液体積）＝１：１００〜９９：１００であり、更に好ましくは、(回収液体積)：(試料溶液体積)＝１：１０〜９：１０である。これにより核酸分離精製後の工程において濃縮のための操作をすることなく、簡単に核酸を濃縮できる。これらの方法により検体よりも核酸が濃縮されている核酸溶液を得る方法を提供でき、好ましい。   By reducing the volume of the recovery solution compared to the volume of the sample solution containing the original nucleic acid, a recovery solution containing concentrated nucleic acid can be obtained. Preferably, (recovered liquid volume) :( sample solution volume) = 1: 100 to 99: 100, more preferably (recovered liquid volume) :( sample solution volume) = 1: 10 to 9:10. . As a result, the nucleic acid can be easily concentrated without performing an operation for concentration in the step after the separation and purification of the nucleic acid. By these methods, a method for obtaining a nucleic acid solution in which the nucleic acid is more concentrated than the sample can be provided, which is preferable.

回収液の注入回数は限定されるものではなく、１回でも複数回でもよい。通常、迅速、簡便に核酸を分離精製する場合は、１回の回収で実施するが、大量の核酸を回収する場合等複数回にわたり回収液を注入してもよい。   The number of injections of the recovery liquid is not limited and may be one time or multiple times. Usually, when the nucleic acid is separated and purified quickly and easily, it is carried out by one collection, but the collection solution may be injected several times, such as when collecting a large amount of nucleic acid.

また、回収工程において、核酸の回収液に回収した核酸の分解を防ぐための安定化剤を添加しておくことも可能である。安定化剤としては、抗菌剤、抗カビ剤や核酸分解抑制剤などを添加することができる。核酸分解抑制剤としては、核酸分解酵素の阻害剤が挙げられ、具体的にはＥＤＴＡなどが挙げられる。また別の実施態様として、回収容器にあらかじめ安定化剤を添加しておくこともできる。   In the recovery step, a stabilizer for preventing degradation of the recovered nucleic acid can be added to the nucleic acid recovery solution. As the stabilizer, antibacterial agents, antifungal agents, nucleic acid degradation inhibitors and the like can be added. Examples of the nucleic acid degradation inhibitor include nucleolytic enzyme inhibitors, and specific examples include EDTA. As another embodiment, a stabilizer may be added to the collection container in advance.

＜核酸分離精製カートリッジ＞
本発明の核酸分離精製方法では、好ましくは、少なくとも２個の開口を有する容器内に前記固相を収容した核酸分離精製カートリッジを用いて核酸の吸着及び脱着を行うことができる。 <Nucleic acid separation and purification cartridge>
In the method for separating and purifying nucleic acid of the present invention, preferably, nucleic acid can be adsorbed and desorbed using a cartridge for separating and purifying nucleic acid in which the solid phase is accommodated in a container having at least two openings.

容器の材料に特別な限定はなく、固相が収容でき、かつ少なくとも２個の開口を設けることができればよい。製造の容易性からプラスチックが好ましい。例えば、ポリスチレン、ポリメタアクリル酸エステル、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリエステル、ナイロン、ポリカーボネート等の透明あるいは不透明のプラスチックを用いるのが好ましい。   There is no particular limitation on the material of the container, as long as the solid phase can be accommodated and at least two openings can be provided. Plastics are preferred because of their ease of manufacture. For example, it is preferable to use a transparent or opaque plastic such as polystyrene, polymethacrylate, polyethylene, polypropylene, polyester, nylon, polycarbonate or the like.

前記容器に収容される固相の形状にも特別な限定は無く、円形、正方形、長方形、楕円、膜の場合には筒状、巻物状、あるいは表面に水酸基を有する有機高分子をコーティングしたビーズ等、任意の形状で良いが、製造適性の点からは、円、正方形、円筒状、巻物状等の対称性の高い形状又はビーズが好ましい。   There is no particular limitation on the shape of the solid phase contained in the container, and in the case of a circle, square, rectangle, ellipse, membrane, a cylinder, a scroll, or a bead coated with an organic polymer having a hydroxyl group on the surface However, from the viewpoint of suitability for manufacture, a highly symmetrical shape such as a circle, a square, a cylinder, or a scroll, or a bead is preferable.

容器の内容積は処理すべき試料溶液の量によって決めることが好ましく、通常、収容される固相の体積で表す。即ち、厚さが約１ｍｍ以下（例えば、５０〜５００μｍ程度）で、直径が約２ｍｍ〜２０ｍｍの固相を１枚〜６枚程度収容する大きさとすることが好ましい。   The internal volume of the container is preferably determined by the amount of the sample solution to be processed, and is usually represented by the volume of the solid phase accommodated. That is, it is preferable that the thickness is about 1 mm or less (for example, about 50 to 500 μm) and the size is such that about 1 to 6 solid phases having a diameter of about 2 mm to 20 mm can be accommodated.

固相の容器に接する側の端面は、試料溶液等が通過しない程度に、容器の内壁面に密着させることが好ましい。   It is preferable that the end surface of the solid phase in contact with the container is in close contact with the inner wall surface of the container so that the sample solution or the like does not pass through.

少なくとも２個の開口を有する容器の、固相から見て、試料溶液等の入り口に使用される開口に対する側（容器内の固相から開口側）は、容器の内壁に密着させずに空間を設け、試料溶液等が固相の全面にできるだけ均等に拡散する構造にすることが好ましい。   When viewed from the solid phase of the container having at least two openings, the side (open side from the solid phase in the container) used for the inlet of the sample solution or the like is not in close contact with the inner wall of the container. It is preferable to provide a structure in which the sample solution or the like diffuses as evenly as possible over the entire surface of the solid phase.

＜核酸分離精製ユニット＞
さらに好ましくは、本発明の核酸分離精製方法は、
(ａ) 固相、
(ｂ) 前記固相を収容する、少なくとも２個の開口を有する容器、及び
(ｃ) 前記容器の一の開口に結合された圧力差発生装置、
を含む核酸分離精製ユニットを使用することが好ましい。
核酸分離精製ユニットのうち、（ａ）と（ｂ）については、前記の核酸分離精製カートリッジと同様であるので、以下、核酸分離精製ユニットにおける当該個所についても、核酸分離精製カートリッジということがある。以下、この核酸分離精製ユニットについて説明する。 <Nucleic acid separation and purification unit>
More preferably, the nucleic acid separation and purification method of the present invention comprises:
(a) solid phase,
(b) a container having at least two openings for containing the solid phase; and
(c) a pressure difference generator coupled to one opening of the container;
It is preferable to use a nucleic acid separation and purification unit comprising
Among the nucleic acid separation and purification units, (a) and (b) are the same as the above-described nucleic acid separation and purification cartridge. Hereinafter, the nucleic acid separation and purification unit will be described.

容器は、固相の収容部を持ち、収容部に固相を収容でき、固相が試料液等の吸引及び排出時に収容部の外へは出ることがなく、開口に圧力差発生装置を接合できればよい。このためには、容器が当初は二つの部分に分かれており、固相を収容した後で一体化できることが好ましい。また、固相の上下に核酸を汚染しない材料で作成されたメッシュを置くことができ、これにより固相が収容部から外へ出ることを避けることができ、好ましい。   The container has a solid phase container, and the container can store the solid phase, and the solid phase does not go out of the container when the sample liquid or the like is sucked or discharged, and the pressure difference generator is joined to the opening. I can do it. For this purpose, it is preferred that the container is initially divided into two parts and can be integrated after the solid phase is accommodated. In addition, a mesh made of a material that does not contaminate nucleic acid can be placed above and below the solid phase, which can prevent the solid phase from going out of the housing portion, which is preferable.

容器は、通常、固相を収容する本体と、蓋体に分かれた態様で作製され、いずれにも少なくとも１個の開口が設けられている。開口は核酸を含む試料溶液、洗浄液及び回収液（以下、「試料溶液等」と記す。）の入口及び出口として使用され、又、容器内を減圧又は加圧状態にせしめうる圧力差発生装置に接続される。本体の形状に特に限定はないが、製造が容易で、試料溶液等が固相の全面に拡散し易くするには、断面を円形にすることが好ましい。断面を四角形にすることも、固相の裁断屑を発生させないために好ましい。   The container is usually produced in a form divided into a main body for storing the solid phase and a lid, and each is provided with at least one opening. The openings are used as inlets and outlets for sample solutions containing nucleic acids, washing solutions and recovery solutions (hereinafter referred to as “sample solutions, etc.”). Connected. The shape of the main body is not particularly limited, but it is preferable to make the cross section circular in order to facilitate the manufacture and to facilitate the diffusion of the sample solution and the like over the entire surface of the solid phase. It is also preferable to make the cross section square in order not to generate solid-state cutting waste.

前記蓋は、圧力差発生装置によって容器内部を減圧及び加圧状態にできるように本体に接合されている必要があるが、この状態が達成できれば、接合方法は任意に選択できる。例えば、接着剤の使用、ねじ込み、はめ込み、ネジ止め、超音波加熱による融着等が挙げられる。   The lid needs to be joined to the main body so that the inside of the container can be depressurized and pressurized by a pressure difference generator, but if this state can be achieved, the joining method can be arbitrarily selected. For example, use of an adhesive, screwing, fitting, screwing, fusion by ultrasonic heating and the like can be mentioned.

圧力差発生装置としては、注射器、ピペッタ、あるいはペリスタポンプのような吸引及び加圧が可能なポンプ等が挙げられる。これらの内、手動操作には注射器が、自動操作にはポンプが適している。また、ピペッタは片手操作が容易にできるという利点を有する。好ましくは、圧力差発生装置は、前記容器の一の開口に着脱可能に結合されている。   Examples of the pressure difference generating device include a pump capable of suction and pressurization such as a syringe, a pipetter, or a peristaltic pump. Of these, a syringe is suitable for manual operation, and a pump is suitable for automatic operation. Also, the pipetter has the advantage that it can be easily operated by one hand. Preferably, the pressure difference generator is detachably coupled to one opening of the container.

なお、容器に３以上の開口を設けた場合には、減圧及び加圧操作に伴う液の吸引及び排出を可能にすべく、余分の開口を一時的に封鎖する必要があることはいうまでもない。   Needless to say, if the container is provided with three or more openings, it is necessary to temporarily block the extra openings in order to allow suction and discharge of the liquid accompanying decompression and pressurization operations. Absent.

本発明の核酸分離精製方法の第一実施態様は、以下の工程を含むことができる。
(１ａ) 検体を用いて核酸を含む試料溶液を調製し、固相を収容する少なくとも２個の開口を有する容器の一の開口を該試料溶液中に挿入する工程、
(１ｂ) 固相を収容する少なくとも２個の開口を有する容器の他の開口に結合された圧力差発生装置を用いて容器内を減圧状態にして核酸を含む試料溶液を吸引し、固相に接触させる工程、
(１ｃ) 前記他の開口に結合された圧力差発生装置を用いて容器内を加圧状態にし、吸引された核酸を含む試料溶液を容器外に排出する工程、
(１ｄ) 前記一の開口を洗浄液に挿入する工程、
(１ｅ) 前記他の開口に結合された圧力差発生装置を用いて容器内を減圧状態にして洗浄液を吸引し、固相に接触させる工程、
(１ｆ) 前記他の開口に結合された圧力差発生装置を用いて容器内を加圧状態にし、吸引された洗浄液を容器外に排出する工程、
(１ｇ) 前記一の開口を、回収液中に挿入する工程、
(１ｈ) 前記他の開口に結合された圧力差発生装置を用いて容器内を減圧状態にして、回収液を吸引し、固相に接触させる工程、及び
(１ｉ) 前記他の開口に結合された圧力差発生装置を用いて容器内を加圧状態にし、回収液を容器外に排出する工程。
（１ｂ）、（１ｅ）、（１ｈ）の際に、固相のほぼ全体と接触する量の溶液を吸引することが好ましいが、圧力差発生装置内に吸引すると装置を汚染するので、適量に調整する。適量の溶液を吸引後、圧力差発生装置を用いて容器内を加圧して、吸引した液を排出する。この操作までに間隔を開ける必要はなく、吸引後直ちに排出してもよい。
上記の第一実施態様を行うための核酸分離精製ユニットの好ましい態様の一つとして、例えば、特開２００４−１８０６３７号公報に記載されている核酸の分離精製装置が挙げられる。 The first embodiment of the method for separating and purifying nucleic acid of the present invention can include the following steps.
(1a) preparing a sample solution containing nucleic acid using a specimen, and inserting one opening of a container having at least two openings containing a solid phase into the sample solution;
(1b) Using a pressure difference generator connected to another opening of a container having at least two openings for containing a solid phase, the container is depressurized and a sample solution containing nucleic acid is sucked into the solid phase. Contacting,
(1c) A step of bringing the inside of the container into a pressurized state using a pressure difference generator coupled to the other opening and discharging the sample solution containing the aspirated nucleic acid out of the container;
(1d) inserting the one opening into a cleaning liquid;
(1e) A step of bringing the container into a depressurized state using the pressure difference generator coupled to the other opening and sucking the cleaning liquid into contact with the solid phase;
(1f) A step of bringing the inside of the container into a pressurized state using a pressure difference generator coupled to the other opening and discharging the sucked cleaning liquid out of the container;
(1g) a step of inserting the one opening into the recovered liquid;
(1h) a step of reducing the pressure in the container using the pressure difference generator coupled to the other opening, sucking the recovered liquid and bringing it into contact with the solid phase; and
(1i) A step of bringing the container into a pressurized state using a pressure difference generator coupled to the other opening and discharging the recovered liquid to the outside of the container.
In (1b), (1e), and (1h), it is preferable to suck the amount of solution that comes into contact with almost the entire solid phase, but if sucked into the pressure difference generator, the device is contaminated. adjust. After sucking an appropriate amount of solution, the inside of the container is pressurized using a pressure difference generator, and the sucked liquid is discharged. It is not necessary to leave an interval before this operation, and it may be discharged immediately after suction.
One preferred embodiment of the nucleic acid separation and purification unit for carrying out the first embodiment is, for example, a nucleic acid separation and purification apparatus described in JP-A No. 2004-180637.

第一実施態様を行うための核酸分離精製ユニットにおいては、圧力差発生装置に結合される開口に対向する固相の上には、ほぼ中央に穴を穿った部材を設けることが好ましい。この部材は、固相を押さえると共に、試料溶液等を効率よく排出する効果を有するものであり、液が中央の穴に集まる様に、漏斗状あるいはお椀状等の斜面を有する形状にすることが好ましい。この穴の大きさ、斜面の角度、部材の厚さは、処理する試料溶液等の量や固相を収容する容器の大きさ等を考慮して、当業者が適宜定めることができる。この部材と当該開口の間には、オーバーフローした試料溶液等を溜めて、圧力差発生装置内に吸引されることを防ぐための空間を設けることが好ましい。この空間の大きさも当業者が適宜選択することができる。なお、核酸を効率良く集めるためには、固相の全体が浸る以上の量の核酸を含む試料溶液を吸引することが好ましい。   In the nucleic acid separation / purification unit for carrying out the first embodiment, it is preferable to provide a member having a hole in the substantially center on the solid phase facing the opening coupled to the pressure difference generator. This member suppresses the solid phase and has the effect of efficiently discharging the sample solution and the like, and has a funnel-shaped or bowl-shaped inclined surface so that the liquid collects in the central hole. preferable. The size of the hole, the angle of the inclined surface, and the thickness of the member can be appropriately determined by those skilled in the art in consideration of the amount of the sample solution to be processed, the size of the container for storing the solid phase, and the like. It is preferable to provide a space between the member and the opening for storing the overflowed sample solution or the like and preventing the sample solution from being sucked into the pressure difference generator. The size of this space can also be appropriately selected by those skilled in the art. In order to efficiently collect nucleic acids, it is preferable to aspirate a sample solution containing an amount of nucleic acid larger than the entire solid phase.

また、吸引している開口の真下の部分にのみ試料溶液等が集中することを防いで、試料溶液等が固相内を比較的均一に通過できるようにするため、固相とこの部材の間にも空間を設けることが好ましい。このためには、当該部材から固相に向けて複数の突起物を設けることが好ましい。突起物の大きさや数は当業者が適宜選択することができるが、空間を保持しながら固相の開口面積をできる限り大きく保つことが好ましい。   In addition, in order to prevent the sample solution and the like from concentrating only in the portion directly under the opening being sucked and to allow the sample solution and the like to pass through the solid phase relatively uniformly, the space between the solid phase and this member It is preferable to provide a space. For this purpose, it is preferable to provide a plurality of protrusions from the member toward the solid phase. The size and number of the protrusions can be appropriately selected by those skilled in the art, but it is preferable to keep the solid phase opening area as large as possible while maintaining the space.

本発明の核酸分離精製方法の第二実施態様は、以下の工程を含むことができる。
(２ａ) 検体を用いて核酸を含む試料溶液を調製し、固相を収容する少なくとも２個の開口を有する容器の一の開口に前記の核酸を含む試料溶液を注入する工程、
(２ｂ) 前記一の開口に圧力差発生装置を結合し、容器内を加圧状態にし、注入した核酸を含む試料溶液を、固相を収容する少なくとも２個の開口を有する容器の他の開口より排出することによって、固相に接触させる工程、
(２ｃ) 前記一の開口から圧力差発生装置を外し、核酸分離精製カートリッジの前記一の開口に洗浄液を注入する工程、
(２ｄ) 前記一の開口に圧力差発生装置を結合し、容器内を加圧状態にし、注入した洗浄液を前記他の開口より排出することによって、固相に接触させる工程、
(２ｅ) 前記一の開口から圧力差発生装置を外し、核酸分離精製カートリッジの前記一の開口に回収液を注入する工程、
(２ｆ) 前記一の開口に圧力差発生装置を結合し、容器内を加圧状態にし、注入した回収液を前記他の開口より排出させることによって、固相に吸着された核酸を脱着させ、容器外に排出する工程。 The second embodiment of the method for separating and purifying nucleic acid of the present invention can include the following steps.
(2a) preparing a sample solution containing a nucleic acid using a specimen and injecting the sample solution containing the nucleic acid into one opening of a container having at least two openings containing a solid phase;
(2b) The other opening of the container having at least two openings for accommodating the solid solution containing the sample solution containing the injected nucleic acid by connecting the pressure difference generating device to the one opening to make the inside of the container pressurized. A step of contacting the solid phase by discharging more,
(2c) removing the pressure difference generating device from the one opening and injecting a washing solution into the one opening of the nucleic acid separation and purification cartridge;
(2d) connecting a pressure difference generator to the one opening, bringing the inside of the container into a pressurized state, and discharging the injected cleaning liquid from the other opening, thereby contacting the solid phase;
(2e) removing the pressure difference generator from the one opening and injecting the recovery solution into the one opening of the nucleic acid separation and purification cartridge;
(2f) A pressure difference generator is coupled to the one opening, the inside of the container is pressurized, and the injected recovery liquid is discharged from the other opening, thereby desorbing the nucleic acid adsorbed on the solid phase, The process of discharging out of the container.

前記の工程において、試料溶液を容器に添加する方法は、限定はされないが、ピペットやスポイトなどの実験用器具を使用するのが好ましい。これらの器具が、ヌクレアーゼフリーかつパイロジェンフリーであれば、より好ましい。
検体を混合する方法は、特に限定されない。例えば、混合する際、攪拌装置を使用する場合には３０から３０００ｒｐｍで１秒から３分間混合することが好ましい。これにより、分離精製される核酸収量を増加させることができ、好ましい。または、転倒混和の場合には５から３０回行うことで混合することが好ましい。また、ピペッティング操作の場合には、１０から５０回行うことによって混合することが好ましい。 In the above step, the method of adding the sample solution to the container is not limited, but it is preferable to use a laboratory instrument such as a pipette or a dropper. More preferably, these instruments are nuclease-free and pyrogen-free.
The method for mixing the specimen is not particularly limited. For example, when mixing, when using a stirrer, it is preferable to mix at 30 to 3000 rpm for 1 second to 3 minutes. Thereby, the yield of nucleic acid to be separated and purified can be increased, which is preferable. Alternatively, in the case of inversion mixing, mixing is preferably performed by performing 5 to 30 times. Moreover, in the case of pipetting operation, it is preferable to mix by performing 10 to 50 times.

前記（２ｅ）の工程の前に、（２ｄ’）固相にＤＮＡ分解酵素溶液を接触させた後、洗浄液を用いて固相を洗浄する工程を行うことで、ＤＮＡとＲＮＡを含む核酸混合物溶液からＲＮＡのみを選択的に分離精製することもできる。ＤＮＡ分解酵素溶液としては、特に限定無く、公知のいずれのＤＮａｓｅも用いることが出来る。   Before the step (2e), (2d ′) a step of contacting the DNA-degrading enzyme solution with the solid phase and then washing the solid phase with a washing solution, whereby a nucleic acid mixture solution containing DNA and RNA Alternatively, RNA alone can be selectively separated and purified. The DNA degrading enzyme solution is not particularly limited, and any known DNase can be used.

前記の核酸分離精製方法に使用するための試薬を試薬キットとすることができる。試薬キットには、前記消泡剤、前処理液、洗浄液及び、回収液を含む。   A reagent for use in the nucleic acid separation and purification method can be used as a reagent kit. The reagent kit includes the antifoaming agent, pretreatment liquid, cleaning liquid, and recovery liquid.

本発明の核酸分離精製方法を行う態様の一例として、自動装置を用いて行うことも可能である。
以下に、固相、該固相を収容した少なくとも２個の開口を有する容器および圧力差発生装置を用いて、核酸を含む検体から核酸を分離精製する工程を自動で行う装置の例を示すが、自動装置はこれに限定されるものではない。 As an example of an embodiment for carrying out the method for separating and purifying nucleic acid of the present invention, it can also be carried out using an automatic apparatus.
The following shows an example of an apparatus that automatically performs a step of separating and purifying nucleic acid from a sample containing nucleic acid using a solid phase, a container having at least two openings containing the solid phase, and a pressure difference generator. However, the automatic device is not limited to this.

自動装置は、溶液が内部を通過可能な、核酸を吸着する固相を収容した少なくとも２個の開口を有する容器（核酸分離精製カートリッジ）を用い、該核酸分離精製カートリッジに核酸を含む試料液を注入し加圧して該試料液中の核酸を前記固相に吸着させた後、前記核酸分離精製カートリッジに洗浄液を分注し加圧して不純物を除去した後、前記核酸分離精製カートリッジに、回収液を分注し固相に吸着した核酸を脱着して回収液とともに回収する、分離精製動作を自動的に行う核酸分離精製装置であって、前記の核酸分離精製カートリッジ、前記試料液および洗浄液の排出液を収容する廃液容器および前記核酸を含む回収液を収容する回収容器を保持する搭載機構と、前記の核酸分離精製カートリッジに加圧エアを導入する加圧エア供給機構と、前記の核酸分離精製カートリッジに洗浄液および回収液を分注する分注機構とを備えてなることを特徴とするものである。   The automatic apparatus uses a container (nucleic acid separation / purification cartridge) having at least two openings containing a solid phase that adsorbs nucleic acid through which the solution can pass, and a nucleic acid separation / purification cartridge containing a sample solution containing nucleic acid. After injecting and pressurizing to adsorb the nucleic acid in the sample solution to the solid phase, the washing solution is dispensed to the nucleic acid separation and purification cartridge and pressurized to remove impurities, and then the recovery solution is added to the nucleic acid separation and purification cartridge. Is a nucleic acid separation and purification device that automatically performs a separation and purification operation in which the nucleic acid adsorbed on the solid phase is desorbed and collected together with the collected liquid, and the nucleic acid separation and purification cartridge, the sample liquid and the washing liquid are discharged. A waste liquid container for storing a liquid, a mounting mechanism for holding a recovery container for storing a recovery liquid containing the nucleic acid, and a pressurized air feeder for introducing pressurized air into the nucleic acid separation and purification cartridge When and it is characterized by comprising a dispensing mechanism for dispensing the washing solution and a recovering solution to the cartridge for separation and purification of nucleic acid.

前記搭載機構は、装置本体に搭載されるスタンドと、該スタンドに上下移動可能に支持され前記の核酸分離精製カートリッジを保持するカートリッジホルダーと、該ホルダーの下方で前記の核酸分離精製カートリッジに対する位置を交換可能に前記廃液容器および前記回収容器を保持する容器ホルダーとを備えてなるものが好適である。   The mounting mechanism includes a stand mounted on the apparatus main body, a cartridge holder supported on the stand so as to be movable up and down, and holding the nucleic acid separation and purification cartridge, and a position below the holder with respect to the nucleic acid separation and purification cartridge. What comprises the container holder which hold | maintains the said waste liquid container and the said collection | recovery container so that replacement | exchange is possible is suitable.

また、前記加圧エア供給機構は、下端部より加圧エアを噴出するエアノズルと、該エアノズルを支持して前記ホルダーに保持された前記の核酸分離精製カートリッジに対し前記エアノズルを昇降移動させる加圧ヘッドと、該加圧ヘッドに設置され前記搭載機構のラックにおける核酸分離精製カートリッジの位置決めをする位置決め手段とを備えてなるものが好適である。   Further, the pressurized air supply mechanism includes an air nozzle that ejects pressurized air from a lower end portion, and a pressure that moves the air nozzle up and down relative to the nucleic acid separation and purification cartridge supported by the air nozzle and held by the holder. A head provided with a head and positioning means for positioning the nucleic acid separation / purification cartridge in the rack of the mounting mechanism is suitable.

また、前記分注機構は、前記洗浄液を分注する洗浄液分注ノズルと、前記回収液を分注する回収液分注ノズルと、前記洗浄液分注ノズルおよび前記回収液分注ノズルを保持し前記搭載機構においてカートリッジホルダーにより保持された前記の核酸分離精製カートリッジ上を順に移動可能なノズル移動台と、洗浄液を収容した洗浄液ボトルより洗浄液を吸引し前記洗浄液分注ノズルに供給する洗浄液供給ポンプと、回収液を収容した回収液ボトルより回収液を吸引し前記回収液分注ノズルに供給する回収液供給ポンプとを備えてなるものが好適である。   The dispensing mechanism holds a cleaning liquid dispensing nozzle that dispenses the cleaning liquid, a recovered liquid dispensing nozzle that dispenses the recovered liquid, the cleaning liquid dispensing nozzle, and the recovered liquid dispensing nozzle. A nozzle moving table capable of sequentially moving on the nucleic acid separation and purification cartridge held by the cartridge holder in the mounting mechanism, a cleaning liquid supply pump for sucking the cleaning liquid from the cleaning liquid bottle containing the cleaning liquid and supplying the cleaning liquid to the cleaning liquid dispensing nozzle; It is preferable to include a recovery liquid supply pump that sucks the recovery liquid from a recovery liquid bottle containing the recovery liquid and supplies the recovered liquid to the recovery liquid dispensing nozzle.

前記のような自動装置によれば、核酸分離精製カートリッジ、廃液容器および回収容器を保持する搭載機構と、核酸分離精製カートリッジに加圧エアを導入する加圧エア供給機構と、核酸分離精製カートリッジに洗浄液および回収液を分注する分注機構とを備え、前記固相部材を備えた核酸分離精製カートリッジに核酸を含む試料液を注入加圧し核酸を該固相部材に吸着させた後、洗浄液を分注して不純物を洗浄排出した後、回収液を分注して該固相膜部材に吸着した核酸を分離して回収する核酸分離精製工程を自動的に行って短時間で効率よく試料液の核酸を自動的に分離精製できる機構をコンパクトに構成することとができる。   According to the automatic apparatus as described above, the mounting mechanism for holding the nucleic acid separation and purification cartridge, the waste liquid container and the recovery container, the pressurized air supply mechanism for introducing pressurized air into the nucleic acid separation and purification cartridge, and the nucleic acid separation and purification cartridge A dispensing mechanism for dispensing the washing solution and the recovery solution, and injecting and pressurizing the sample solution containing the nucleic acid into the nucleic acid separation / purification cartridge equipped with the solid phase member to adsorb the nucleic acid to the solid phase member, After dispensing and washing out impurities, the sample solution is efficiently dispensed in a short time by automatically performing a nucleic acid separation and purification step of dispensing the collected solution and separating and collecting the nucleic acid adsorbed on the solid phase membrane member. The mechanism capable of automatically separating and purifying the nucleic acid can be made compact.

また、前記搭載機構を、スタンドと、核酸分離精製カートリッジを保持する上下移動可能なホルダーと、廃液容器および回収容器を交換可能に保持する容器ホルダーとを備えて構成すると、核酸分離精製カートリッジおよび両容器のセット並びに廃液容器と回収容器の交換が簡易に行える。   Further, when the mounting mechanism includes a stand, a vertically movable holder for holding the nucleic acid separation and purification cartridge, and a container holder for holding the waste liquid container and the recovery container in an exchangeable manner, the nucleic acid separation and purification cartridge and both It is possible to easily set the container and exchange the waste liquid container and the collection container.

また、前記加圧エア供給機構を、エアノズルと、該エアノズルを昇降移動させる加圧ヘッドと、核酸分離精製カートリッジの位置決めをする位置決め手段とを備えて構成すると、簡易な機構で確実な加圧エアの供給が行える。   In addition, when the pressurized air supply mechanism includes an air nozzle, a pressure head for moving the air nozzle up and down, and a positioning means for positioning the nucleic acid separation / purification cartridge, the pressurized air can be reliably secured with a simple mechanism. Can be supplied.

また、前記分注機構を、洗浄液分注ノズルと、回収液分注ノズルと、核酸分離精製カートリッジ上を順に移動可能なノズル移動台と、洗浄液ボトルより洗浄液を吸引し洗浄液分注ノズルに供給する洗浄液供給ポンプと、回収液ボトルより回収液を吸引し回収液分注ノズルに供給する回収液供給ポンプとを備えて構成すると、簡易な機構で順次洗浄液および回収液の分注が行える。   In addition, the dispensing mechanism includes a washing liquid dispensing nozzle, a recovery liquid dispensing nozzle, a nozzle moving table that can move in sequence on the nucleic acid separation and purification cartridge, and a washing liquid drawn from the washing liquid bottle and supplied to the washing liquid dispensing nozzle. If the cleaning liquid supply pump and the recovery liquid supply pump that sucks the recovery liquid from the recovery liquid bottle and supplies it to the recovery liquid dispensing nozzle are provided, the cleaning liquid and the recovery liquid can be sequentially dispensed by a simple mechanism.

以下、実施例により本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。   EXAMPLES Hereinafter, although an Example demonstrates this invention further in detail, this invention is not limited to these.

（１）材料及び試薬
特開２００４−１８０６３７号公報の図１〜図６に構造を示す核酸分離精製用ユニットを使用し、第２開口部側より試料、洗浄液、蒸留水を順次注入し、そのたびにピストン部材（ブランジャ）を挿入し、押した。また、核酸吸着固相としては、富士ミクロフィルターＦＲ２５０（富士写真フイルム製）を使用した。前処理液（比較例および本発明）及び洗浄液は以下の通り調製した。 (1) Materials and Reagents Using the nucleic acid separation and purification unit having the structure shown in FIGS. 1 to 6 of JP-A No. 2004-180637, a sample, a washing solution, and distilled water are sequentially injected from the second opening side. Each time a piston member (blanger) was inserted and pushed. Further, Fuji Microfilter FR250 (manufactured by Fuji Photo Film) was used as the nucleic acid adsorption solid phase. The pretreatment liquid (comparative example and the present invention) and the cleaning liquid were prepared as follows.

｛前処理液（比較例）｝
塩酸グアニジン（ライフテクノロジー製） ３８２ｇ
Ｔｒｉｓ（ライフテクノロジー製） １２．１ｇ
ＴｒｉｔｏｎＸ−１００（ＩＣＮ製） １０ｇ
蒸留水 １０００ｍｌ {Pretreatment liquid (comparative example)}
Guanidine hydrochloride (Life Technology) 382g
Tris (Life Technology) 12.1g
Triton X- 100 (ICN) 10g
1000ml distilled water

｛前処理液（本発明）｝
塩酸グアニジン（ライフテクノロジー製） ３８２ｇ
Ｔｒｉｓ（ライフテクノロジー製） １２．１ｇ
ＴｒｉｔｏｎＸ−１００（ＩＣＮ製） １０ｇ
アセチレングリコール（エアープロダクツ製）１０ｇ
シリコーンオイル（ＧＥ東芝シリコーン製） ２ｇ
蒸留水 １０００ｍｌ {Pretreatment liquid (present invention)}
Guanidine hydrochloride (Life Technology) 382g
Tris (Life Technology) 12.1g
Triton X- 100 (ICN) 10g
10 g of acetylene glycol (Air Products)
Silicone oil (made by GE Toshiba Silicone) 2g
1000ml distilled water

｛洗浄液｝
１０ｍｍｏｌ／ＬＴｒｉｓ−ＨＣｌ ６５％エタノール {Cleaning liquid}
10 mmol / LTris-HCl 65% ethanol

（２）核酸分離精製操作
人全血試料２００μｌに、本発明の前処理液２００μｌとプロテアーゼＫ２００μｌを添加して、６０℃で１０分間インキュベートした。インキュベート後、エタノール２００μｌを加え、攪拌した。攪拌後、特開２００４−１８０６３７号公報の図１〜図６に構造を示す核酸分離精製用ユニットにこの液を注入した。注入後、ピストンにて液を押し出した。 (2) Nucleic acid separation and purification operation To 200 μl of human whole blood sample, 200 μl of the pretreatment solution of the present invention and 200 μl of protease K were added and incubated at 60 ° C. for 10 minutes. After incubation, 200 μl of ethanol was added and stirred. After stirring, this solution was injected into the nucleic acid separation and purification unit having the structure shown in FIGS. 1 to 6 of JP-A No. 2004-180637. After the injection, the liquid was pushed out by the piston.

続いて、洗浄液５００μｌを注入し、ピストンにて液を押し出すことにより、ユニットおよび吸着固相上の不純物を洗浄した。最後に、蒸留水２００μｌを注入し、ピストンにて液を押し出して、この液をＤＮＡ溶液として回収した。
前処理液を比較例用の前処理液を使用した以外は、本発明と同様にして、核酸分離精製操作を行った。 Subsequently, 500 μl of the cleaning liquid was injected, and the liquid on the unit and the adsorbed solid phase was cleaned by extruding the liquid with a piston. Finally, 200 μl of distilled water was injected, the liquid was pushed out with a piston, and this liquid was recovered as a DNA solution.
A nucleic acid separation and purification operation was performed in the same manner as in the present invention except that the pretreatment liquid for the comparative example was used as the pretreatment liquid.

（３）核酸の回収量の定量
（２）の操作により精製されたＤＮＡの収量および泡沫高さ（試料溶液の排出際、開口部から発生する泡沫の長さを測定した数値）を以下の表１に示す。上記核酸分離精製ユニットにより、簡便に核酸分離精製操作ができ、また表１の結果から、得られるＤＮＡの量は維持し、かつ本発明においては泡の発生量を抑制できることが分かった。 (3) Quantification of the amount of nucleic acid recovered The yield and foam height of the DNA purified by the operation of (2) (numerical values obtained by measuring the length of foam generated from the opening when the sample solution is discharged) are shown in the table below. It is shown in 1. The nucleic acid separation and purification unit can be used for simple nucleic acid separation and purification, and the results shown in Table 1 indicate that the amount of DNA obtained can be maintained and that the amount of bubbles generated can be suppressed in the present invention.

（１）核酸分離精製カートリッジの作成
内径７ｍｍ、固相として核酸吸着性の多孔性膜を収容する部分を持つ少なくとも２個の開口を有する容器をハイインパクトポリスチレンで作成した。 (1) Preparation of Nucleic Acid Separation / Purification Cartridge A container having at least two openings having an inner diameter of 7 mm and containing a nucleic acid-adsorbing porous membrane as a solid phase was made of high impact polystyrene.

（２）核酸吸着性の多孔性膜として、トリアセチルセルロースの多孔性膜を鹸化処理した多孔性膜（孔径２．５μｍ、直径７ｍｍ、厚さ１００μｍ、鹸化率９５％）を使用し、前記（１）で作成した少なくとも２個の開口を有する容器の多孔性膜収容部に収容した。 (2) A porous membrane obtained by saponifying a porous membrane of triacetyl cellulose (pore size 2.5 μm, diameter 7 mm, thickness 100 μm, saponification rate 95%) is used as the nucleic acid-adsorbing porous membrane, It was accommodated in the porous membrane accommodating part of the container having at least two openings prepared in 1).

（３）前処理液及び洗浄液の調製
以下に示す処方の前処理液及び洗浄液を調製した。 (3) Preparation of pretreatment liquid and cleaning liquid A pretreatment liquid and a cleaning liquid having the following formulation were prepared.

（前処理液）
β−メルカプトエタノール ９ｇ
塩酸グアニジン（ライフテクノロジー社製） ３８２ｇ
Ｔｒｉｓ（ライフテクノロジー社製） １２．１ｇ
ＴｒｉｔｏｎＸ−１００（ＩＣＮ製） １０ｇ
アセチレングリコール（エアープロダクツ製） １０ｇ
シリコーンオイル（ＧＥ東芝シリコーン製） ２ｇ
蒸留水 １０００ｍｌになるよう添加
(Pretreatment liquid)
β-mercaptoethanol 9g
Guanidine hydrochloride (Life Technology) 382g
Tris (Life Technology) 12.1g
Triton X- 100 (ICN) 10g
10 g of acetylene glycol (Air Products)
Silicone oil (made by GE Toshiba Silicone) 2g
Add distilled water to 1000ml

（洗浄液）
１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣＬ ３０％エタノール (Cleaning solution)
10 mM Tris-HCL 30% ethanol

（４）核酸分離精製操作
ガン化ヒト骨髄細胞（ＨＬ６０）培養液を用意した。この培養液２００μｌ（細胞数５×１０5個）をヌクレアーゼフリーかつパイロジェンフリーのチップ（プラチナチップＢＭ機器社製）を装着した分注用ピペット（ＰＩＰＥＴＭＡＮ ギルソン社製）を用いて、ヌクレアーゼフリーかつパイロジェンフリーの１．５ｍＬマイクロチューブ（プラチナチューブ ＢＭ機器社製）の容器に注入し、前記前処理液２００μlとタンパク質分解酵素のプロテアーゼＫ（ＳＩＧＭＡ製）溶液２０μｌを添加してＶＯＲＴＥＸを１５秒かけることによって混合し、６０℃で１０分間インキュベートした。インキュベート後、エタノール２００μｌを加え、攪拌した。攪拌後、前記（２）で作成した核酸分離精製カートリッジの一の開口に注入し、続いて前記一の開口に圧力差発生装置（チュウビングポンプ）を結合し、核酸分離精製カートリッジ内を加圧状態（８０ｋｐａ）にし、注入した核酸を含む試料溶液を、核酸吸着性の多孔性膜に通過させることで、核酸吸着性の多孔性膜に接触させ、核酸分離精製カートリッジの他の開口より排出した。続いて、前記核酸分離精製カートリッジの前記一の開口に洗浄液を注入し、前記一の開口にチュウビングポンプを結合し、核酸分離精製カートリッジ内を加圧状態（８０ｋｐａ）にし、注入した洗浄液を、核酸吸着性の多孔性膜に通過させ、他の開口より排出した。続いて、前記核酸分離精製カートリッジの前記一の開口に回収液を注入し、核酸分離精製カートリッジの前記一の開口にチュウビングポンプを結合して核酸分離精製カートリッジ内を加圧状態（８０ｋｐａ）にし、注入した回収液を、核酸吸着性の多孔性膜に通過させ、他の開口より排出し、この液を回収した。核酸分離精製操作（核酸を含む試料溶液を前記の核酸分離精製カートリッジに注入してから回収するまで）に要した時間は２分であった。 (4) Nucleic acid separation and purification operation A cancerous human bone marrow cell (HL60) culture solution was prepared. 200 μl of this culture solution (5 × 10 5 cells) was nuclease-free and pyrogen using a pipetting pipette (PIPETMAN Gilson) equipped with a nuclease-free and pyrogen-free tip (platinum chip BM Instruments). By injecting into a free 1.5 mL microtube (platinum tube manufactured by BM Instruments), adding 200 μl of the pretreatment solution and 20 μl of protease K protease (manufactured by SIGMA) and applying VORTEX for 15 seconds. Mix and incubate at 60 ° C. for 10 minutes. After incubation, 200 μl of ethanol was added and stirred. After stirring, the mixture is injected into one opening of the nucleic acid separation / purification cartridge prepared in (2), and then a pressure difference generator (tubing pump) is connected to the one opening to pressurize the inside of the nucleic acid separation / purification cartridge. The sample solution containing the injected nucleic acid was passed through the nucleic acid-adsorbing porous membrane in a state (80 kpa), brought into contact with the nucleic acid-adsorbing porous membrane, and discharged from the other opening of the nucleic acid separation and purification cartridge. . Subsequently, a washing liquid is injected into the one opening of the nucleic acid separation and purification cartridge, a tubing pump is coupled to the one opening, the inside of the nucleic acid separation and purification cartridge is pressurized (80 kpa), and the injected washing liquid is The sample was passed through a porous membrane capable of adsorbing nucleic acid and discharged from other openings. Subsequently, the recovery liquid is injected into the one opening of the nucleic acid separation and purification cartridge, and a tubing pump is connected to the one opening of the nucleic acid separation and purification cartridge to bring the inside of the nucleic acid separation and purification cartridge into a pressurized state (80 kpa). The injected recovery liquid was passed through a porous membrane capable of adsorbing nucleic acid, discharged from another opening, and this liquid was recovered. The time required for the nucleic acid separation and purification operation (from when the sample solution containing nucleic acid was injected into the nucleic acid separation and purification cartridge until it was collected) was 2 minutes.

（５）核酸の回収量の定量
実施例１の実験を行った。図１に、本発明の方法に従って核酸を含む試料溶液から精製した核酸の電気泳動の結果を示す。 (5) Quantification of recovery amount of nucleic acid The experiment of Example 1 was conducted. FIG. 1 shows the result of electrophoresis of nucleic acid purified from a sample solution containing nucleic acid according to the method of the present invention.

図１の結果から明らかなように、本発明の方法を用いることにより、核酸を極めて効率よく、分離精製できることが分かる。すなわち、本発明の方法は、分離性能に優れ、洗浄効率がよいために、前記した時間で、迅速に収量高く、核酸を得ることができた。   As is apparent from the results of FIG. 1, it can be seen that nucleic acids can be separated and purified very efficiently by using the method of the present invention. That is, since the method of the present invention has excellent separation performance and good washing efficiency, it was possible to obtain nucleic acids quickly and with high yield in the time described above.

本発明の方法に従って分離精製した核酸および分子量マーカーを電気泳動して得られた図である。It is the figure obtained by electrophoresis of the nucleic acid and molecular weight marker which were separated and purified according to the method of the present invention.

Claims (32)

(ａ) 固相、
(ｂ) 前記固相を収容する少なくとも２個の開口を有する容器、及び
(ｃ) 前記容器の一の開口に結合された圧力差発生装置
を含む核酸分離精製ユニットを用いて核酸の吸着及び脱着を行う核酸分離精製方法であって、
（１）核酸を含む試料溶液を固相に接触させて、該固相に核酸を吸着させる工程、
（２）洗浄液を該固相に接触させて、核酸が吸着した状態で該固相を洗浄する工程、及び
（３）回収液を該固相に接触させて、該固相から核酸を脱着させる工程を含有し、
核酸を含む試料溶液が少なくとも一種の消泡剤を含み、該消泡剤として少なくともアセチレングリコール系界面活性剤を含むことを特徴とする核酸分離精製方法。 (a) solid phase,
(b) a container having at least two openings for containing the solid phase; and
(c) Pressure difference generator coupled to one opening of the container
A nucleic acid separation and purification method for adsorbing and desorbing nucleic acids using a nucleic acid separation and purification unit comprising:
(1) contacting a sample solution containing nucleic acid with a solid phase and adsorbing the nucleic acid to the solid phase;
(2) a step of bringing the washing solution into contact with the solid phase and washing the solid phase in a state where the nucleic acid is adsorbed; and (3) bringing the recovery solution into contact with the solid phase to desorb the nucleic acid from the solid phase. Contains the process ,
A nucleic acid separation and purification method, wherein a sample solution containing a nucleic acid contains at least one antifoaming agent, and at least an acetylene glycol surfactant as the antifoaming agent. 核酸を含む試料溶液が、さらに核酸安定化剤、カオトロピック塩、界面活性剤、緩衝剤およびタンパク質分解酵素の中から選ばれる少なくとも一つを含む前処理液を添加、混合して得られる、請求項１に記載の核酸分離精製方法。   The sample solution containing nucleic acid is obtained by adding and mixing a pretreatment solution further containing at least one selected from nucleic acid stabilizers, chaotropic salts, surfactants, buffers and proteolytic enzymes. 2. The method for separating and purifying nucleic acid according to 1. 核酸を含む試料溶液が、さらに水溶性有機溶媒を添加して得られる、請求項１または２に記載の核酸分離精製方法。   The method for separating and purifying nucleic acid according to claim 1 or 2, wherein the sample solution containing the nucleic acid is obtained by further adding a water-soluble organic solvent. 消泡剤として更にシリコン系消泡剤を含む、請求項１〜３の何れかに記載の核酸分離製精方法。   The method for separating and purifying nucleic acid according to claim 1, further comprising a silicon-based antifoaming agent as the antifoaming agent. 前処理液中、核酸安定化剤が０.１〜２０質量％の濃度で使用される、請求項２に記載の核酸分離精製方法。   The method for separating and purifying nucleic acid according to claim 2, wherein the nucleic acid stabilizer is used in the pretreatment solution at a concentration of 0.1 to 20% by mass. 核酸安定化剤が、還元剤であることを特徴とする請求項２に記載の核酸分離精製方法。   The method for separating and purifying nucleic acid according to claim 2, wherein the nucleic acid stabilizer is a reducing agent. 還元剤がメルカプト化合物であることを特徴とする請求項６に記載の核酸分離精製方法。   The method for separating and purifying nucleic acid according to claim 6, wherein the reducing agent is a mercapto compound. 核酸安定化剤が、キレート剤であることを特徴とする請求項２に記載の核酸分離精製方法。   The method for separating and purifying nucleic acid according to claim 2, wherein the nucleic acid stabilizer is a chelating agent. カオトロピック塩がグアニジウム塩である請求項２に記載の核酸分離精製方法。   The method for separating and purifying nucleic acid according to claim 2, wherein the chaotropic salt is a guanidinium salt. 水溶性有機溶媒が、メタノール、エタノール、プロパノール、およびブタノールから選ばれる少なくとも１つを含むことを特徴とする請求項３に記載の核酸分離精製方法。   The method for separating and purifying nucleic acid according to claim 3, wherein the water-soluble organic solvent contains at least one selected from methanol, ethanol, propanol, and butanol. 固相がシリカもしくはその誘導体、珪藻土、又はアルミナを含有する固相である、請求項１〜１０の何れかに記載の核酸分離精製方法。   The method for separating and purifying nucleic acid according to any one of claims 1 to 10, wherein the solid phase is a solid phase containing silica or a derivative thereof, diatomaceous earth, or alumina. 固相が有機高分子を含有する固相である、請求項１〜１０の何れかに記載の核酸分離精製方法。   The method for separating and purifying nucleic acid according to any one of claims 1 to 10, wherein the solid phase is a solid phase containing an organic polymer. 有機高分子が、多糖構造を有する有機高分子である、請求項１２に記載の核酸分離精製方法。   The method for separating and purifying nucleic acid according to claim 12, wherein the organic polymer is an organic polymer having a polysaccharide structure. 有機高分子が、アセチルセルロースである、請求項１２又は１３に記載の核酸分離精製方法。   The method for separating and purifying nucleic acid according to claim 12 or 13, wherein the organic polymer is acetylcellulose. 有機高分子が、アセチルセルロースまたはアセチル価の異なるアセチルセルロースの混合物を鹸化処理した有機高分子である、請求項１２又は１３に記載の核酸分離精製方法。   The method for separating and purifying nucleic acid according to claim 12 or 13, wherein the organic polymer is an organic polymer obtained by saponifying acetylcellulose or a mixture of acetylcellulose having different acetyl values. アセチル価の異なるアセチルセルロースの混合物を鹸化処理した有機高分子の鹸化率が５％以上である、請求項１５に記載の核酸分離精製方法   The method for separating and purifying nucleic acid according to claim 15, wherein the saponification rate of an organic polymer obtained by saponifying a mixture of acetylcelluloses having different acetyl values is 5% or more. アセチル価の異なるアセチルセルロースの混合物を鹸化処理した有機高分子の鹸化率が１０％以上である、請求項１５に記載の核酸分離精製方法   The method for separating and purifying nucleic acid according to claim 15, wherein the saponification rate of an organic polymer obtained by saponifying a mixture of acetylcelluloses having different acetyl values is 10% or more. 有機高分子が、再生セルロースである、請求項１２に記載の核酸分離精製方法。   The method for separating and purifying nucleic acid according to claim 12, wherein the organic polymer is regenerated cellulose. 固相が多孔性膜である、請求項１１〜１８の何れかに記載の方法。   The method according to claim 11, wherein the solid phase is a porous membrane. 多孔性膜が表裏非対称性の多孔性膜である、請求項１９に記載の方法。   The method according to claim 19, wherein the porous membrane is a front and back asymmetric porous membrane. 多孔性膜が平均孔径０．１〜１０．０μｍの多孔性膜である、請求項１９又は２０に記載の方法。   The method according to claim 19 or 20, wherein the porous membrane is a porous membrane having an average pore diameter of 0.1 to 10.0 µm. 多孔性膜が厚さ1０〜５００μｍの多孔性膜である、請求項１９〜２１の何れかに記載の方法。   The method according to any one of claims 19 to 21, wherein the porous membrane is a porous membrane having a thickness of 10 to 500 µm. 固相が非孔性である、請求項１１〜１８の何れかに記載の方法。   The method according to any of claims 11 to 18, wherein the solid phase is non-porous. 圧力差発生装置が加圧の装置である、請求項１〜２３のいずれかに記載の核酸分離精製方法。 The method for separating and purifying nucleic acid according to any one of claims 1 to 23 , wherein the pressure difference generator is a pressurizing apparatus. 圧力差発生装置が減圧の装置である、請求項１〜２３のいずれかに記載の核酸分離精製方法。 The method for separating and purifying nucleic acid according to any one of claims 1 to 23 , wherein the pressure difference generator is an apparatus for reducing pressure. 圧力差発生装置が、容器の一の開口に着脱可能に結合されている、請求項１〜２５のいずれかの何れかに記載の核酸分離精製方法。 The method for separating and purifying nucleic acid according to any one of claims 1 to 25, wherein the pressure difference generator is detachably coupled to one opening of the container. (２ａ) 検体を用いて核酸を含む試料溶液を調製し、固相を収容する少なくとも２個の開口を有する容器の一の開口に前記の核酸を含む試料溶液を注入する工程、
(２ｂ) 前記一の開口に結合された圧力差発生装置を用いて容器内を加圧状態にし、注入した核酸を含む試料溶液を、固相を収容する少なくとも２個の開口を有する容器の他の開口より排出することによって、固相に接触させることで、核酸を固相に吸着させる工程、
(２ｃ) 前記一の開口から圧力差発生装置を外し、前記一の開口に洗浄液を注入する工程、
(２ｄ) 前記一の開口に結合された圧力差発生装置を用いて容器内を加圧状態にし、注入した洗浄液を前記他の開口より排出することによって、固相に接触させることで、固相を洗浄する工程、
(２ｅ) 前記一の開口から圧力差発生装置を外し、前記一の開口に回収液を注入する工程、
(２ｆ) 前記一の開口に結合された圧力差発生装置を用いて容器内を加圧状態にし、注入した回収液を前記他の開口より排出させることによって、固相に吸着された核酸を脱着させ、容器外に排出する工程
を含む、請求項１〜２４のいずれかに記載の核酸分離精製方法。 (2a) preparing a sample solution containing a nucleic acid using a specimen and injecting the sample solution containing the nucleic acid into one opening of a container having at least two openings containing a solid phase;
(2b) In addition to a container having at least two openings for accommodating a sample solution containing the injected nucleic acid, the inside of the container is pressurized using the pressure difference generator coupled to the one opening. A step of adsorbing nucleic acid to the solid phase by contacting the solid phase by discharging from the opening of
(2c) removing the pressure difference generator from the one opening and injecting a cleaning liquid into the one opening;
(2d) By bringing the inside of the container into a pressurized state using the pressure difference generator coupled to the one opening, and discharging the injected cleaning liquid from the other opening to bring it into contact with the solid phase, Cleaning process,
(2e) removing the pressure difference generator from the one opening and injecting the recovered liquid into the one opening;
(2f) Decompressing the nucleic acid adsorbed on the solid phase by making the inside of the container pressurized using the pressure difference generator connected to the one opening and discharging the injected recovery liquid from the other opening. The method for separating and purifying nucleic acid according to any one of claims 1 to 24, further comprising a step of discharging to the outside of the container. （２ｅ）の工程の前に、（２ｄ’）固相にＤＮＡ分解酵素溶液を接触させた後、洗浄液を用いて固相を洗浄する工程を行うことを含む、請求項２７に記載の核酸分離精製方法。 28. The nucleic acid separation according to claim 27 , comprising the step of (2d ′) contacting the DNA-degrading enzyme solution with the solid phase and then washing the solid phase with a washing solution before the step (2e). Purification method. 洗浄液が、メタノール、エタノール、イソプロパノール又はｎ−プロパノールを２０〜１００質量％含む溶液である、請求項１〜２８のいずれかに記載の核酸分離精製方法。 The method for separating and purifying nucleic acid according to any one of claims 1 to 28, wherein the washing solution is a solution containing 20 to 100% by mass of methanol, ethanol, isopropanol or n-propanol. 固相から核酸を脱着させる回収液が、塩濃度が０．５ｍｏｌ／Ｌ以下の溶液である、請求項１〜２９の何れかに記載の核酸分離精製方法。 Recovering solution to desorb the nucleic acid from the solid phase, the salt concentration is a solution below 0.5 mol / L, method for separating and purifying nucleic acid according to any of claims 1 to 29. 請求項１〜３０の何れかに記載された方法を行うための試薬キット。 A reagent kit for performing the method according to any one of claims 1 to 30 . 請求項１〜３０の何れかに記載された方法を行うための装置。 Apparatus for performing the method according to any of claims 1 to 30.
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