JP4207467B2

JP4207467B2 - 顕微鏡照明装置

Info

Publication number: JP4207467B2
Application number: JP2002170558A
Authority: JP
Inventors: 久奥川
Original assignee: Nikon Corp
Current assignee: Nikon Corp
Priority date: 2002-06-11
Filing date: 2002-06-11
Publication date: 2009-01-14
Anticipated expiration: 2022-06-11
Also published as: JP2004013117A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、顕微鏡照明装置に関し、特に、対物レンズの入射瞳面上に集光させた集光スポット位置を自在に制御可能な顕微鏡照明装置に関する。
【０００２】
【従来技術】
従来、蛍光顕微鏡において、対物レンズの入射瞳面上に集光させた光束を励起光としてエバネセント波発生させ、蛍光を観察する全反射蛍光顕微鏡がある。この方法は試料を保持しているガラス基板と試料との境界面で励起光が全反射し、試料にエバネセント波が照射されるもので、試料の境界面近傍のみが励起されるため、コントラストよくその部分の蛍光像を観察することができる。
【０００３】
このような全反射顕微鏡に用いられる照明光の例が、特開平９−１５９９２２号公報や特開２００１−２７２６０６号公報に開示されている。これらの開示例では、レーザ光源または光ファイバーから射出したレーザ光は、対物レンズの入射瞳面上に集光スポットを形成するためのリレーレンズと、照明光の光路を変えるビームスプリッタを介して対物レンズの入射瞳の外周付近に集光される。そしてレーザ光がカバーガラス（またはスライドガラス）と標本の境界面で全反射する臨界角度以上で標本に照射されるように、光源または光ファイバの光射出端面を光軸と垂直方向に移動させる、またはビームスプリッタの位置を上下に移動させて全反射条件を達成している。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、上記の開示例では、対物レンズの入射瞳面上における集光スポットは、全反射条件を満たすある１点にのみに設定されているため、一方向からのみの照明となり、集光スポットが設定された位置によって得られる画像が異方性を持つという問題があった。
【０００５】
また、集光スポットの位置を変えながら画像を観察する場合には、集光スポットの位置を変更する都度、画像を見ながら全反射条件が満たされるように集光スポット位置を調整する必要があり、煩雑であり所望の画像を得るために時間がかかっていた。
【０００６】
このため、対物レンズの入射瞳面上に集光された集光スポット位置を自在に制御可能な顕微鏡照明装置が求められている。
【０００７】
本発明は、上記問題に鑑みて行われたものであり、集光レンズの入射瞳面上に形成する集光スポット位置を入射瞳面上の任意の位置に自在に設定できる顕微鏡照明装置を提供することを目的としている。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
上記目的を達成するために、本発明では、レーザ光源と、前記レーザ光源からのレーザ光を走査する少なくとも１つのスキャナと、前記走査されたレーザ光を物体面に集光する集光レンズと、前記スキャナと前記集光レンズの物体側焦点面を概略光学的共役にする位置に配置され、前記集光レンズの入射瞳面上に前記走査されたレーザ光を集光するリレーレンズと、前記スキャナを駆動する駆動回路と、前記集光レンズを介して前記物体面に前記レーザ光が全反射角度で入射するよう、前記リレーレンズの集光する前記レーザ光の集光スポットが前記集光レンズの入射瞳面上の定められたリング状領域内に位置するように、前記駆動回路に前記スキャナの走査状態を制御する制御信号を与える制御回路とを具備し、前記制御回路は、前記制御信号に基づき、前記集光スポットを前記リング状領域内の任意の位置に位置決めできることを特徴とする顕微鏡照明装置を提供する。
【００１０】
また、本発明の顕微鏡照明装置では、前記制御回路の制御条件を記憶する制御条件記憶回路と、前記光源の光強度を変調する光変調回路と、前記光変調回路の変調条件を記憶する変調条件記憶回路と、を有することが望ましい。
【００１１】
また、本発明の顕微鏡照明装置では、前記光源と前記スキャナとの間の光路に配置された光変調部材と、前記光変調部材を制御する第２の変調回路と、前記第２の変調回路の変調条件を記憶する第２の変調条件記憶回路と、を有することが望ましい。
【００１３】
また、本発明は、前記顕微鏡照明装置を具備することを特徴とする顕微鏡を提供する。
【００１４】
【発明の実施形態】
本発明の実施の形態を図面を参照しつつ説明する。
【００１５】
図１は、本発明にかかる第1実施の形態の顕微鏡照明装置を有する顕微鏡の概略構成図を示し、図２は、第１実施の形態における集光スポットの走査パターンの一例を示す。図３は、本発明にかかる第２実施の形態の顕微鏡照明装置を有する顕微鏡の概略構成図を示し、図４は、第２実施の形態における集光スポットの走査パターンと光強度分布の一例を示す。図５は本発明にかかる顕微鏡照明装置を全反射顕微鏡に用いた場合の概略構成図を示す。
（第１実施の形態）
図１、図２において、第１実施の形態の顕微鏡照明装置は、レーザ光源１から射出されたレーザ光２が、二次元ガルバノスキャナ３に入射され、二次元ガルバノスキャナ３で走査されたレーザ光２はリレーレンズ４に入射し、コンデンサレンズ５の入射瞳面I近傍に集光され、この集光スポット２１は、コンデンサレンズ５で標本６に照射されて標本６を照明する。リレーレンズ４は二次元ガルバノスキャナ３とコンデンサレンズ５の物体側焦点面を概略光学的共役にする位置に配置されている。また、二次元ガルバノスキャナ３を駆動する駆動回路１０と、駆動回路１０を制御する制御回路１１と、プログラムされた制御信号を記憶する制御条件記憶回路を有する記憶装置１２を備えた制御装置Ａを有し、二次元ガルバノスキャナ３は、制御装置Ａからの制御信号に基づきレーザ光２を入射瞳面I上で所望の領域を走査する。そして、標本６からの射出光７は対物レンズ８により集光され、カメラ９に結像し不図示のモニタ等で標本像として観察される。
【００１６】
制御装置Ａにパーソナルコンピュータ等を用いることによって、コンデンサレンズ５の入射瞳面Ｉ上における集光スポット２１の位置を正確に決めたり、集光スポット２１の走査スピードや走査領域を自由に変えたりすることが可能となる。
【００１７】
図２は、第１実施の形態の顕微鏡照明装置で形成される集光スポット２１の走査パターンの一例を示す。この例では、集光スポット２１がコンデンサレンズ５の入射瞳面Ｉ上の外周近傍で、リング２２の形状に走査されるように制御された場合を示している。
【００１８】
このような照明光において、集光スポット２１を図２中の矢印で示す方向または矢印で示す方向とは反対方向に、高速にリング２２の形状に走査する場合、カメラ９の露出時間が集光スポット２１がリング２２を一周する時間より長い場合には、カメラ９に結像する像は、標本６をリング２２の形状を有する照明光で照明した画像と見なすことができる。
【００１９】
また、本第１実施の形態の顕微鏡照明装置を全反射顕微鏡の照明装置に用いることが可能である。全反射顕微鏡では、標本６をエバネッセント波で照明する。よって照明光を臨界角度（全反射角度）で入射させるために、照明光を厳密にコンデンサレンズ５の入射瞳面上の外周部の定められた位置に集光する必要がある。全反射を実現する場合に使用できる開口部分は、開口数に換算して略１．３５以上の部分であり、例えば、開口数１．４５のコンデンサレンズ５を使用した場合、全反射照明できる領域は開口数の約７％以下である。実際には３００ミクロン程度の幅を有するリング２２の領域に集光スポット２１を形成することが必要である。このときの集光スポット２１の大きさは約２５ミクロンである。このように、エバネッセント波を利用する全反射顕微鏡では、小さく絞られた集光スポット２１を３００ミクロン程度の幅を有するリング２２の領域に、精度良く位置合わせすることが必須であるが、本実施の形態の顕微鏡照明装置では、集光スポット２１の位置を制御装置からの信号に基づき二次元ガルバノスキャナ３を制御することができるため、従来の光源やミラーを移動させて位置合せをおこなう方式に比べ、高精度に且つ簡便に集光スポット２１の位置決めを行うことが可能である。
【００２０】
また、図２のリング２２に示す領域に集光スポット２１を容易に形成できるため、異方性の無い画像を得ることも可能となる。
【００２１】
上述のようなリング２２形状に集光スポット２１を走査する走査条件を決める手順の一例を説明する。
【００２２】
入射瞳面Ｉの中心Ｏを通る直交座標軸をＸ−Ｙとする。制御装置Ａから二次元ガルバノスキャナ３に集光スポット２１をＸ軸上を入射瞳面Ｉの直径にわたって走査するように制御信号を入力し、このときの射出光７をカメラ９によって観測する。このとき、標本６の代わりに生体特性に略等しい水滴を使っても良い。集光スポット２１が中心ＯからＸ軸上を走査するとき、中心Ｏでの射出光７の光強度は最大となり、中心Ｏから＋Ｘ右方向に走査するに従って光強度がわずかに減少し、全反射条件となる境界付近で射出する光強度は急激に減少し略ゼロとなる。この略ゼロとなった時の座標（または略ゼロに変化する時の変曲点）をＸ１として記憶装置１２に記憶する。同様にして、−Ｘ方向に走査して、光強度が略ゼロとなる座標（または略ゼロに変化する時の変曲点）Ｘ２を記憶装置１２に記憶する。Ｙ軸方向も同様の手順で、座標Ｙ１および座標Ｙ２を記憶装置１２に記憶する。
【００２３】
これら、記憶された４つの座標を通る円の座標を計算によって求め、集光スポット２１のリング２２形状の走査座標データを作成し、記憶装置１２の制御条件記憶回路に記憶する。この制御条件記憶回路に記憶されたデータを制御条件として二次元ガルバノスキャナ３を制御することにより、リング２２の形状のような走査パターンを形成することができる。また、リング２２の形状に限られず任意の走査データを作成することも可能である。また、射出光の光強度の検出は、カメラ９以外の手段、例えば目視などでも可能である。また、上述の説明では４つの座標を用いて円の座標を求めたが、最低３つの座標があれば円の座標を求めることが可能である。
【００２４】
なお、レーザ光源１からのレーザ光２を走査する部材として二次元ガルバノスキャナ３を示しているが、二次元スキャナであればこれ以外のものでも使用可能である。また、１次元スキャナを組み合わせて二次元スキャナを構成しても良いし、音響光学素子等も使用可能である。
（第２実施の形態）
次に、本発明の第２実施の形態について図面を参照して説明する。
【００２５】
図３は、本発明にかかる第２実施の形態の顕微鏡照明装置を有する顕微鏡の概略構成図を示し、図４は、第２実施の形態における集光スポットの走査パターンと光強度分布の一例を示す。
【００２６】
本第２実施の形態が第１実施の形態と異なる点は、レーザ光源１のレーザ光強度を変調する光変調回路を有していることにある。第１実施の形態と同等の部材には同じ符号を付し説明を省略する。
【００２７】
図３に示すように、第２実施の形態の顕微鏡照明装置は、第１実施の形態と略同一の形態を有する顕微鏡照明装置のレーザ光源１（例えば、半導体レーザ等）にレーザ光２の光強度を変調するレーザ光変調回路３１が設けられている。レーザ光変調回路３１は、制御装置Ａの記憶装置１２に設けられた変調条件記憶回路からのレーザ光変調条件に基づきレーザ光源１を変調し、変調されたレーザ光２を射出させる。
【００２８】
このようにして、第２実施の形態の顕微鏡照明装置は、二次元ガルバノスキャナ３による集光スポット２１の走査と共に、レーザ光２の光強度も変調することが可能となる。
【００２９】
図４（ａ）は、集光スポット２１の走査パターンの一例であり、図４（ｂ）は、図４（ａ）の走査パターンに対応した光強度分布を示す図である。集光スポット２１をコンデンサレンズ５の入射瞳面Ｉ上の全域を走査すると共に、入射瞳面Ｉの外周近傍で、レーザ光２の光強度を入射瞳面Ｉの中央部分に比べ強くした場合を示している。このように、入射瞳面Ｉ上の場所によって明るさの異なる照明が行え、超解像照明光学系が実現でき、観察象の解像力や焦点深度の改善が容易に行える。
【００３０】
また、入射瞳面Ｉ上の外周部でレーザ光２をＯＮとし、それ以外の部分ではレーザ光をＯＦＦとする制御を行うことによって、第１実施の形態と同様の全反射照明を実現することができる。
【００３１】
また、図４（ｃ）に示すように、入射瞳面I上をほぼ均一な明るさとなるように走査することもでき、走査の仕方を自由に制御することができる。
（第３実施の形態）
次に、本発明の第３実施の形態について図面を参照して説明する。
【００３２】
図５は、本発明にかかる第３実施の形態の顕微鏡照明装置を有する顕微鏡の概略構成図を示す。
【００３３】
本第３実施の形態が第２実施の形態と異なる点は、レーザ光源１と二次元ガルバノスキャナ３の間の光路に第２の変調回路４１を有する光変調部材４２（例えば、音響光学素子（ＡＯＭ）等）を配置し、記憶装置１２に第２の変調条件記憶回路を設けて変調条件を記憶しておき、この記憶された変調条件に基づきレーザ光２の光強度変調するように構成したことである。このような構成とすることによって第２実施の形態と同様の作用、効果が得られるので詳細な説明は省略する。
（第４実施の形態）
次に、本発明の第４実施の形態の顕微鏡照明装置に関し図面を参照して説明する。図６は、第４実施の形態の顕微鏡照明装置を示す。第４実施の形態では、倒立方顕微鏡に顕微鏡照明装置を適用した場合について示している。第１、第２および第３実施の形態と同等の部材には、同一の符号を付し説明を省略する。
【００３４】
レーザ光源１からのレーザ光２は、二次元ガルバノスキャナ３で走査され、リレーレンズ４を通過したレーザ光は、ビームスプリッタ５１で反射され、対物レンズ８の入射瞳面Ｉ上に集光されて、対物レンズ８を介して標本６に照射される。標本６からの光（蛍光）は、対物レンズ８で集光され、ビームスプリッタ５１、レーザカットフィルタ５２を通過した後、結像レンズ５３でカメラ９上に結像されて標本６の光像（蛍光像）が観察される。
【００３５】
標本６を照射する照明光は、制御装置Ａからの制御信号に基づき対物レンズ８の入射瞳面上Ｉで図２に示すようなリング２２の形状の走査が行われるように、二次元ガルバノミラ３が制御され、標本６への全反射照明が可能となる。この結果、標本６は、スライドガラスと標本との界面近傍が、エバネッセント波を受けて蛍光を発するため、界面近傍の蛍光像を観察することが可能となる。
【００３６】
その他の作用、効果は第１、第２および第３実施の形態と同様であるので説明を省略する。
【００３７】
このように、本発明によれば、容易に全反射条件を設定できると共に、入射瞳面上の任意の位置に任意の速度で集光スポットを移動でき、また光強度も変調することが可能となる。
【００３８】
なお、上述の実施の形態は例に過ぎず、上述の構成や形状に限定されるものではなく、本発明の範囲内において適宜修正、変更が可能である。
【００３９】
【発明の効果】
上述のように、本発明では、集光レンズの入射瞳面上に形成する集光スポット位置を入射瞳面上の任意の位置に自在に設定でき、顕微鏡照明方法の多様化が可能である。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明にかかる第1実施の形態の顕微鏡照明装置を有する顕微鏡の概略構成図を示す。
【図２】第１実施の形態における集光スポットの走査パターンの一例を示す。
【図３】本発明にかかる第２実施の形態の顕微鏡照明装置を有する顕微鏡の概略構成図を示す。
【図４】（ａ）は、第２実施の形態における集光スポットの走査パターンを示し、（ｂ）、（ｃ）は光強度分布の例を示す。
【図５】本発明にかかる第３実施の形態の顕微鏡照明装置を有する顕微鏡の概略構成図を示す。
【図６】本発明にかかる第４実施の形態の顕微鏡照明装置を有する全反射顕微鏡の概略構成図を示す。
【符号の説明】
１レーザ光源
２レーザ光
３二次元ガルバノスキャナ
４リレーレンズ
５コンデンサレンズ
６標本
７射出光
８対物レンズ
９カメラ
１０駆動回路
１１制御回路
１２記憶装置
２１集光スポット
２２リング
３１レーザ光変調回路
４１第２の変調回路
４２光変調部材
５１ビームスプリッタ
５２レーザカットフィルタ
５３結像レンズ
Ａ制御装置
Ｉ入射瞳面

Claims

レーザ光源と、
前記レーザ光源からのレーザ光を走査する少なくとも１つのスキャナと、
前記走査されたレーザ光を物体面に集光する集光レンズと、
前記スキャナと前記集光レンズの物体側焦点面を概略光学的共役にする位置に配置され、前記集光レンズの入射瞳面上に前記走査されたレーザ光を集光するリレーレンズと、
前記スキャナを駆動する駆動回路と、
前記集光レンズを介して前記物体面に前記レーザ光が全反射角度で入射するよう、前記リレーレンズの集光する前記レーザ光の集光スポットが前記集光レンズの入射瞳面上の定められたリング状領域内に位置するように、前記駆動回路に前記スキャナの走査状態を制御する制御信号を与える制御回路とを具備し、
前記制御回路は、前記制御信号に基づき、前記集光スポットを前記リング状領域内の任意の位置に位置決めできることを特徴とする顕微鏡照明装置。
請求項１に記載の顕微鏡照明装置において、
前記制御回路の制御条件を記憶する制御条件記憶回路と、
前記光源の光強度を変調する光変調回路と、
前記光変調回路の変調条件を記憶する変調条件記憶回路と、
を有することを特徴とする顕微鏡照明装置。
請求項１に記載の顕微鏡照明装置において、
前記光源と前記スキャナとの間の光路に配置された光変調部材と、
前記光変調部材を制御する第２の変調回路と、
前記第２の変調回路の変調条件を記憶する第２の変調条件記憶回路と、
を有することを特徴とする顕微鏡照明装置。
請求項１から３のいずれか１項に記載の顕微鏡照明装置を具備することを特徴とする顕微鏡。