JP2006143605A - Method for producing percutaneously administrative agent and orally administrative agent each promoting fibroblast proliferation - Google Patents
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Description
本発明は、コラーゲンペプチド等を有効成分とした繊維芽細胞の増殖を促進させる経皮投与剤および経口投与剤の製造方法に関する。 The present invention relates to a method for producing a transdermal administration agent and an oral administration agent, which promotes the proliferation of fibroblasts using collagen peptide or the like as an active ingredient.
肌荒れやしわ等を改善するために、美容効果を有する化粧品を皮膚上に塗布することが一般的である。このような化粧品には、有効成分として、保湿剤、保水性の高い物質等が配合されている。中でも、コラーゲンは肌のハリや弾力を与え、かつ、スキンケアで重要な保湿効果を有することから大変注目されている物質である。 In order to improve rough skin, wrinkles, etc., it is common to apply cosmetics having a cosmetic effect on the skin. In such cosmetics, moisturizers, substances with high water retention, and the like are blended as active ingredients. Among them, collagen is a substance that has received much attention because it gives skin elasticity and elasticity and has an important moisturizing effect in skin care.
コラーゲンは、人間も含めて様々な動物の体を構成しているタンパク質の一種であり、肌や骨、内臓、血管、目の角膜等あらゆるところに存在している。しかし、コラーゲンは加齢に伴い減少する。コラーゲンの減少が皮膚のシワやたるみの原因となることから、コラーゲンを配合させた化粧品が多くの人に使用されている。 Collagen is a kind of protein that constitutes the body of various animals including humans, and is present in various places such as skin, bones, internal organs, blood vessels, and corneas of eyes. However, collagen decreases with age. Since a decrease in collagen causes skin wrinkles and sagging, cosmetics containing collagen are used by many people.
このようなコラーゲンを配合させた化粧品として、例えば特許文献１では、コラーゲン産生促進作用をもつ植物エキスと魚由来コラーゲンを含有させた化粧品を提案している。また、特許文献２では、コラーゲンにニンジン抽出物を含有させた化粧品を提案している。近年の研究で、コラーゲンは真皮で作用して初めて肌のハリや弾力を与えることが知られるようになった。しかし、上述したようなコラーゲンを配合させた化粧品を皮膚上に塗布しても、コラーゲンは皮膚の顆粒層までしか到達しない。また、コラーゲンをそのまま経口摂取しても、酵素によってアミノ酸に分解され、真皮までコラーゲンが届かず、皮膚のシワやたるみに対する効果を期待できないといった問題が生じていた。
本発明は上述したような実情に鑑みてなされたものであり、本発明は繊維芽細胞（コラーゲン産生細胞）の増殖を促進させる経皮投与剤および経口投与剤の製造方法を提供することを目的とする。 This invention is made | formed in view of the above situations, and this invention aims at providing the manufacturing method of the transdermal administration agent and oral administration agent which promote the proliferation of a fibroblast (collagen production cell). And
本発明の経皮投与剤の製造方法に関する上記目的は、動物由来コラーゲンペプチドと、オリゴ糖と、グルコサミン類と、コンドロイチン類と、ヒアルロン酸と、糖セラミドと、ビタミンＣとを構成物質とする混合物が配合されている繊維芽細胞の増殖を促進させる経皮投与剤の製造方法において、容器に前記動物由来コラーゲンペプチドを入れて室温・常圧下で攪拌しながら、前記オリゴ糖、前記グルコサミン類、前記コンドロイチン類、前記ヒアルロン酸、前記糖セラミドそして前記ビタミンＣの順に添加することによって効果的に達成される。 The above object relating to the method for producing a transdermal administration agent of the present invention is to provide a mixture comprising animal-derived collagen peptides, oligosaccharides, glucosamines, chondroitins, hyaluronic acid, sugar ceramide, and vitamin C as constituents. In the method for producing a transdermal agent for promoting the proliferation of fibroblasts, the oligosaccharide, the glucosamines, the above, while stirring the animal-derived collagen peptide in a container at room temperature and normal pressure, It is effectively achieved by adding chondroitins, the hyaluronic acid, the sugar ceramide and the vitamin C in this order.
また、本発明の経皮投与剤の製造方法に関する上記目的は、有効成分は、前記グルコサミン類と、前記コンドロイチン類と、前記ヒアルロン酸と、前記ビタミンＣとであることによって、或は前記混合物の配合量は、前記動物由来コラーゲンペプチド１００重量部に対して、前記前記オリゴ糖は４０〜５０重量部、前記グルコサミン類は１〜２重量部、前記コンドロイチン類は１〜２重量部、前記ヒアルロン酸は０．１〜１重量部、前記糖セラミドは０．１〜１重量部と、前記ビタミンＣは０．１〜１重量部であることによって、或は更に前記動物由来コラーゲンペプチド１００重量部に対して、０．１〜１重量部のビタミンＥを添加させることによって、或は前記動物由来コラーゲンペプチドは、サメまたは白身魚類由来のコラーゲンペプチドであることによって、或は前記オリゴ糖は、デンプン由来イソマルトオリゴ糖であることによって、或は前記糖セラミドは、小麦または米由来糖セラミドであることによって、より効果的に達成される。 The object of the method for producing a transdermal administration agent of the present invention is that the active ingredient is the glucosamines, the chondroitins, the hyaluronic acid, and the vitamin C, or the mixture. The blending amount is 40 to 50 parts by weight for the oligosaccharide, 1 to 2 parts by weight for the glucosamines, 1 to 2 parts by weight for the chondroitins, and 100% by weight for the hyaluronic acid. Is 0.1 to 1 part by weight, the sugar ceramide is 0.1 to 1 part by weight, and the vitamin C is 0.1 to 1 part by weight, or further 100 parts by weight of the animal-derived collagen peptide. On the other hand, by adding 0.1 to 1 part by weight of vitamin E, or the animal-derived collagen peptide is a collagen peptide derived from shark or white fish. By a de or the oligosaccharide by a starch-derived isomalto-oligosaccharides, or the sugar ceramide by wheat or rice derived sugar ceramides, it is more effectively achieved.
本発明の経口投与剤の製造方法に関する上記目的は、オリゴ糖と、動物由来コラーゲンペプチドと、グルコサミン類と、コンドロイチン類と、ヒアルロン酸と、ビタミンＣと、糖セラミドとを構成物質とする混合物が配合されている繊維芽細胞の増殖を促進させる経口投与剤の製造方法において、容器に前記オリゴ糖を入れて室温・常圧下で攪拌しながら、前記動物由来コラーゲンペプチド、前記グルコサミン類、前記コンドロイチン類、前記ヒアルロン酸、前記糖ビタミンＣそして前記糖セラミドの順に添加することによって、効果的に達成される。 The above object relating to the method for producing an orally administered agent of the present invention is to provide a mixture comprising oligosaccharides, animal-derived collagen peptides, glucosamines, chondroitins, hyaluronic acid, vitamin C, and sugar ceramide. In the method for producing an orally administered agent that promotes the proliferation of blended fibroblasts, the animal-derived collagen peptide, the glucosamines, and the chondroitins are prepared by placing the oligosaccharide in a container and stirring at room temperature and normal pressure. It is effectively achieved by adding the hyaluronic acid, the sugar vitamin C and the sugar ceramide in this order.
また、本発明の経口投与剤の製造方法に関する上記目的は、有効成分は、前記グルコサミン類と、前記コンドロイチン類と、前記ヒアルロン酸と、前記ビタミンＣとであることによって、或は前記混合物の配合量は、前記オリゴ糖１００重量部に対して、前記動物由来コラーゲンペプチドは４０〜５０重量部、前記グルコサミン類は１〜５重量部、前記コンドロイチン類は１〜５重量部、前記ヒアルロン酸は０．１〜１重量部、前記糖セラミドは０．１〜１重量部と、前記ビタミンＣは０．１〜１重量部であることによって、或は更に前記オリゴ糖１００重量部に対して、０．１〜１重量部のビタミンＥを添加させることによって、或は前記動物由来コラーゲンペプチドは、サメまたは白身魚類由来のコラーゲンペプチドであることによって、或は前記オリゴ糖は、デンプン由来イソマルトオリゴ糖であることによって、或は前記糖セラミドは、小麦または米由来糖セラミドであることによって、より効果的に達成される。 In addition, the object of the method for producing an orally administered agent of the present invention is that the active ingredient is the glucosamines, the chondroitins, the hyaluronic acid, and the vitamin C, or the mixture of the mixture. The amount is 40 to 50 parts by weight for the animal-derived collagen peptide, 1 to 5 parts by weight for the glucosamines, 1 to 5 parts by weight for the chondroitins, and 0 for the hyaluronic acid with respect to 100 parts by weight of the oligosaccharide. 0.1 to 1 part by weight, 0.1 to 1 part by weight of the sugar ceramide, 0.1 to 1 part by weight of the vitamin C, or 0 to 100 parts by weight of the oligosaccharide By adding 1-1 part by weight of vitamin E, or the animal-derived collagen peptide is a collagen peptide derived from shark or white fish Alternatively the oligosaccharide by a starch-derived isomalto-oligosaccharides, or the sugar ceramide by wheat or rice derived sugar ceramides, are more effectively achieved.
本発明の繊維芽細胞の増殖を促進させる経皮投与剤および経口投与剤の製造方法によれば、グルコサミン類、コンドロイチン類、ヒアルロン酸、およびビタミンＣを有効成分とし、添加する順序を適宜変更させることによって経皮投与剤および経口投与剤と用途を分けることができるようになった。また、さらに動物由来コラーゲンペプチド、オリゴ糖および糖セラミドを配合させることにより、より効率よく繊維芽細胞の増殖を促進させることがわかった。 According to the method for producing a transdermal administration agent and oral administration agent that promotes the proliferation of fibroblasts of the present invention, glucosamines, chondroitins, hyaluronic acid, and vitamin C are used as active ingredients, and the order of addition is appropriately changed. As a result, it has become possible to separate the use from that for transdermal administration and oral administration. It was also found that the addition of animal-derived collagen peptides, oligosaccharides and sugar ceramides promotes the proliferation of fibroblasts more efficiently.
また、本発明の製造方法によって得られた経皮投与剤および経口投与剤を摂取することにより、繊維芽細胞が増殖し、美肌保持および皮膚の再生をもたらす効果があることが、細胞学、形態学の面からわかり、併せてヒアルロン酸、グルコサミンおよびコンドロイチンにより、膝等の関節軟骨の再生が促進され、関節痛等の症状を緩和させる効果があることもわかった。 In addition, it is known that the ingestion of the transdermal preparation and the oral preparation obtained by the production method of the present invention has the effect of proliferating fibroblasts and maintaining beautiful skin and regenerating skin. From the scientific point of view, it was also found that hyaluronic acid, glucosamine and chondroitin promote the regeneration of articular cartilage such as knees and relieve symptoms such as joint pain.
本発明は、コラーゲンペプチドと、オリゴ糖と、グルコサミン類と、コンドロイチン類と、ヒアルロン酸と、糖セラミドと、ビタミンＣとを構成物質とする混合物であって、グルコサミン類と、コンドロイチン類と、ヒアルロン酸と、ビタミンＣとを有効成分としたことを特徴とした繊維芽細胞の増殖を促進させる経皮投与剤および経口投与剤の製造方法に関する。 The present invention relates to a mixture comprising a collagen peptide, an oligosaccharide, a glucosamine, a chondroitin, a hyaluronic acid, a sugar ceramide, and vitamin C, the glucosamine, a chondroitin, and a hyaluron. The present invention relates to a method for producing a transdermal administration agent and an oral administration agent which promotes the proliferation of fibroblasts, characterized by comprising an acid and vitamin C as active ingredients.
まず、本発明の繊維芽細胞の増殖を促進させ得る経皮投与剤の製造方法について詳細に説明する。 First, the manufacturing method of the transdermal administration agent which can accelerate | stimulate the proliferation of the fibroblast of this invention is demonstrated in detail.
本発明の繊維芽細胞の増殖を促進させ得る経皮投与剤は、まず、減菌した容器内に動物由来コラーゲンペプチドを入れて攪拌させる。予め動物由来コラーゲンペプチドが攪拌されている容器内に常温・常圧下でオリゴ糖を動物由来コラーゲンペプチド１００重量部に対して、４０〜５０重量部添加する。攪拌速度は、経皮投与剤の製造量等に応じて適宜変更することができるが、１００〜１０００ｒｐｍの間で調節することが好ましい。また、全ての構成物質を入れ終わるまで攪拌をしつづける。ここで、常温とは室温のことをいい、１５〜２５℃の範囲をいう。また、常圧とは、大気圧（１気圧）のことをいう。 In the transdermal administration agent capable of promoting the growth of fibroblasts of the present invention, first, an animal-derived collagen peptide is placed in a sterilized container and stirred. 40 to 50 parts by weight of the oligosaccharide is added to 100 parts by weight of the animal-derived collagen peptide in a container in which the animal-derived collagen peptide is previously stirred at room temperature and normal pressure. The stirring speed can be appropriately changed according to the production amount of the transdermal administration agent, but is preferably adjusted between 100 and 1000 rpm. Moreover, stirring is continued until all the constituent substances are added. Here, normal temperature refers to room temperature and refers to a range of 15 to 25 ° C. The normal pressure means atmospheric pressure (1 atm).
次に、オリゴ糖を添加した後も攪拌を続け、グルコサミン類を常温・常圧下で動物由来コラーゲンペプチド１００重量部に対して１〜２重量部を添加する。ここで、グルコサミン類とは、グルコサミン塩酸塩、Ｎ−アセチルグルコサミンもしくはＮ−アセチルグルコサミン塩酸塩のことをいう。 Next, stirring is continued even after the oligosaccharide is added, and 1 to 2 parts by weight of glucosamines are added to 100 parts by weight of the animal-derived collagen peptide at room temperature and normal pressure. Here, glucosamine means glucosamine hydrochloride, N-acetylglucosamine or N-acetylglucosamine hydrochloride.
グルコサミン類を添加した後、コンドロイチン類を常温・常圧下で動物由来コラーゲンペプチド１００重量部に対して１〜２重量部を攪拌しながら添加する。ここで、コンドロイチン類とは、コンドロイチン硫酸塩またはマトリキシルのことをいう。 After adding glucosamines, chondroitins are added with stirring at 1 to 2 parts by weight with respect to 100 parts by weight of animal-derived collagen peptide at room temperature and normal pressure. Here, chondroitin means chondroitin sulfate or matrixyl.
コンドロイチン類を添加した後、ヒアルロン酸を常温・常圧下で動物由来コラーゲンペプチド１００重量部に対して０．１〜１重量部を攪拌しながら添加する。 After the chondroitin is added, hyaluronic acid is added with stirring at 0.1 to 1 part by weight with respect to 100 parts by weight of the animal-derived collagen peptide at room temperature and normal pressure.
ヒアルロン酸を添加した後、糖セラミドを常温・常圧下で動物由来コラーゲンペプチド１００重量部に対して０．１〜１重量部を攪拌しながら添加する。 After adding hyaluronic acid, 0.1-1 part by weight of sugar ceramide is added with stirring to 100 parts by weight of animal-derived collagen peptide at room temperature and normal pressure.
糖セラミドを添加した後、ビタミンＣを常温・常圧下で動物由来コラーゲンペプチド１００重量部に対して０．１〜１重量部を攪拌しながら添加して、混合物（経皮投与剤）を形成する。 After addition of sugar ceramide, 0.1 to 1 part by weight of vitamin C is added with stirring to 100 parts by weight of animal-derived collagen peptide at room temperature and normal pressure to form a mixture (transdermal administration agent). .
必要に応じて、ビタミンＣを添加した後に、ビタミンＥを常温・常圧下で動物由来コラーゲンペプチド１００重量部に対して０．１〜１重量部を攪拌しながら添加してもよい。ビタミンＥをさらに添加することにより、より効率よくコラーゲンを体内へ吸収させることができる。 If necessary, after adding vitamin C, vitamin E may be added while stirring at 0.1 to 1 part by weight with respect to 100 parts by weight of the animal-derived collagen peptide at room temperature and normal pressure. By further adding vitamin E, collagen can be absorbed into the body more efficiently.
それぞれの構成物質の添加する順番を変更しても経皮投与剤を製造することができる。しかし、理由は定かでないが、構成物質の添加する順番を変更すると、繊維芽細胞の増殖を促進させる効果がなくなってしまう。したがって、上述したように、動物由来コラーゲンペプチド、オリゴ糖、グルコサミン類、コンドロイチン類、ヒアルロン酸、糖セラミド、ビタミンＣの順に構成物質を添加することが好ましい。 A transdermal administration agent can be produced even if the order of adding each constituent substance is changed. However, although the reason is not clear, if the order in which the constituent substances are added is changed, the effect of promoting the proliferation of fibroblasts is lost. Therefore, as described above, it is preferable to add constituent substances in the order of animal-derived collagen peptide, oligosaccharide, glucosamines, chondroitins, hyaluronic acid, sugar ceramide, and vitamin C.
混合物の構成物質の一つである動物由来コラーゲンペプチドとは、コラーゲンを安定化させるために低分子化させたものである。コラーゲンを低分子化させたことにより、コラーゲンを真皮まで遊走させることができ、肌や弾力を回復させることができる。本発明で添加するコラーゲンペプチドは、動物由来のコラーゲンペプチドであればいずれを添加してもよいが、サメ由来コラーゲンペプチド或は白身魚類コラーゲンペプチドを添加することが好ましい。なお、本発明の製造方法では、コラーゲンペプチドの代わりに、コラーゲンをアルカリ、酸、加圧により、或は酵素により加水分解することで得られるコラーゲンの加水分解物およびコラーゲンの熱変性物であるゼラチン等を用いることもでき、これらを単独で添加してもよく複数組合せて添加してもよい。 Animal-derived collagen peptides, which are one of the constituents of the mixture, are those whose molecular weight has been reduced in order to stabilize collagen. By reducing the molecular weight of collagen, collagen can migrate to the dermis, and the skin and elasticity can be recovered. Any collagen peptide may be added as long as it is an animal-derived collagen peptide, but it is preferable to add a shark-derived collagen peptide or a white fish collagen peptide. In the production method of the present invention, instead of collagen peptide, collagen hydrolyzate obtained by hydrolyzing collagen by alkali, acid, pressurization, or enzyme, and gelatin that is heat-denatured collagen Etc. can also be used, and these may be added singly or in combination.
混合物の構成物質の一つであるオリゴ糖は、コラーゲンを肌に送る役割を果たす。コラーゲンは、真皮に到達して初めて肌に作用する（肌のハリや弾力を与える）が、コラーゲンを塗布しただけでは皮膚の顆粒層までしか到達せず、コラーゲンを肌に作用させることができない。本発明において、オリゴ糖は、糖セラミドと共にコラーゲンを真皮まで遊走させることができ、コラーゲンを肌で作用させることができる。また、上述したように本発明ではコラーゲンを低分子化した動物由来コラーゲンペプチドを添加しているため、より効率よくコラーゲンを真皮まで遊走させることができる。本発明で添加するオリゴ糖は、例えば植物由来オリゴ糖、乳由来オリゴ糖等種々の公知のオリゴ糖を添加することができるが、本発明ではデンプン由来のイソマルトオリゴ糖を添加することが好ましい。デンプン由来のイソマルトオリゴ糖を添加することで、より繊維芽細胞に活性を与えることができる。なお、デンプン由来イソマルトオリゴ糖はデンプン由来であれば種類は特に限定されず、例えば芋、米、麦芽等のデンプン由来イソマルトオリゴ糖を添加することができ、これらを単独で添加してもよいが複数組合せて添加してもよい。 Oligosaccharide, which is one of the constituents of the mixture, plays a role in sending collagen to the skin. Collagen does not act on the skin until it reaches the dermis (gives skin elasticity and elasticity), but it only reaches the granular layer of the skin by applying collagen, and collagen cannot act on the skin. In the present invention, the oligosaccharide can cause collagen to migrate to the dermis together with sugar ceramide, and can cause collagen to act on the skin. Moreover, since the animal origin collagen peptide which reduced the molecular weight of collagen is added in this invention as mentioned above, collagen can be migrated more efficiently to the dermis. Various known oligosaccharides such as plant-derived oligosaccharides and milk-derived oligosaccharides can be added to the oligosaccharides added in the present invention. In the present invention, it is preferable to add starch-derived isomalt oligosaccharides. By adding starch-derived isomaltoligosaccharides, it is possible to impart more activity to fibroblasts. The type of starch-derived isomaltoligosaccharide is not particularly limited as long as it is derived from starch. For example, starch-derived isomaltoligosaccharides such as rice bran, rice, and malt can be added, and these may be added alone. Multiple combinations may be added.
本発明で添加するオリゴ糖の配合量は動物由来コラーゲンペプチド１００重量部に対して４０〜５０重量部とすることが好ましい。オリゴ糖の配合量が４０重量部より少ないと、コラーゲンペプチドを効率よく肌へ送ることができなくなる。一方、オリゴ糖の配合量が５０重量部を超えると、混合物の構成バランスが崩れ、繊維芽細胞の増殖を促進させることができなくなる。 It is preferable that the compounding quantity of the oligosaccharide added by this invention shall be 40-50 weight part with respect to 100 weight part of animal origin collagen peptides. When the amount of the oligosaccharide is less than 40 parts by weight, the collagen peptide cannot be efficiently delivered to the skin. On the other hand, when the compounding amount of the oligosaccharide exceeds 50 parts by weight, the composition balance of the mixture is lost, and the proliferation of fibroblasts cannot be promoted.
混合物の構成物質の一つであって経皮投与剤の有効成分であるグルコサミン類は、蟹や海老等の甲殻類の殻からつくられるアミノ酸の一種であり、体内では軟骨細胞、皮下組織細胞や角膜細胞の主要成分として存在していることが知られている。本発明者の鋭意研究の成果により、グルコサミン類を摂取すると、コラーゲンの生合成を促進させ、肌の保水性が高まることをわかった。本発明では、グルコサミンを添加してもよいが、コストの面でグルコサミン類を添加することが好ましい。また、本発明ではグルコサミン塩酸塩、Ｎ−アセチルグルコサミンもしくはＮ−アセチルグルコサミン塩酸塩を混合させてもよい。 Glucosamines, one of the components of the mixture and the active ingredient of transdermal agents, are a kind of amino acids made from shells of shellfish such as salmon and shrimp. In the body, chondrocytes, subcutaneous tissue cells and It is known to exist as a major component of corneal cells. As a result of earnest research by the present inventors, it has been found that ingestion of glucosamines promotes biosynthesis of collagen and increases the water retention of the skin. In the present invention, glucosamine may be added, but it is preferable to add glucosamines in terms of cost. In the present invention, glucosamine hydrochloride, N-acetylglucosamine or N-acetylglucosamine hydrochloride may be mixed.
本発明で添加するグルコサミン類の配合量は動物由来コラーゲンペプチド１００重量部に対して１〜２重量部とすることが好ましい。グルコサミン類の配合量が１重量部より少ないと、コラーゲンの生合成を促進させることができなくなる。一方、グルコサミン類の配合量が２重量部を超えると、混合物の構成バランスが崩れ、繊維芽細胞の増殖を促進させることができなくなる。 It is preferable that the compounding quantity of the glucosamine added by this invention shall be 1-2 weight part with respect to 100 weight part of animal origin collagen peptides. If the blending amount of glucosamines is less than 1 part by weight, collagen biosynthesis cannot be promoted. On the other hand, when the blending amount of glucosamines exceeds 2 parts by weight, the composition balance of the mixture is lost, and the proliferation of fibroblasts cannot be promoted.
混合物の構成物質の一つであって経皮投与剤の有効成分であるコンドロイチン類は、ムコ多糖類の一つであって、皮膚組織内や軟骨内の水分調節機能を有し、軟骨成分分解酵素の阻害剤として知られている。コンドロイチン類は、グルコサミンとの相乗効果でコラーゲンやエラスチン等の膠質蛋白の生合成を促進させ、肌のシワ等を改善させる。コンドロイチン類は、例えば、牛、クジラ等の哺乳動物やサメ等の魚類の軟骨等により得られる。なお、本発明ではコンドロイチンを添加してもよいが、コスト等の面からコンドロイチン類を添加することが好ましい。また、本発明ではコンドロイチン硫酸塩またはマトリキシルを混合させて添加してもよい。 Chondroitin, which is one of the components of the mixture and is an active ingredient for transdermal administration, is a mucopolysaccharide, has a function of regulating water in skin tissue and cartilage, and decomposes cartilage components. Known as an enzyme inhibitor. Chondroitins promote biosynthesis of collagen proteins such as collagen and elastin through synergistic effects with glucosamine, and improve skin wrinkles and the like. Chondroitins can be obtained, for example, from the cartilage of mammals such as cattle and whales and fish such as sharks. In the present invention, chondroitin may be added, but it is preferable to add chondroitins from the viewpoint of cost and the like. In the present invention, chondroitin sulfate or matrixyl may be mixed and added.
本発明で添加するコンドロイチン類の配合量は動物由来コラーゲンペプチド１００重量部に対して１〜２重量部とすることが好ましい。コンドロイチン類の配合量が１重量部より少ないと、体内でコラーゲンの生成を働きかけることができなくなる。一方、コンドロイチン類の配合量が２重量部を超えると、混合物の構成バランスが崩れ、繊維芽細胞の増殖を促進させることができなくなる。 It is preferable that the compounding quantity of chondroitin added by this invention shall be 1-2 weight part with respect to 100 weight part of animal-derived collagen peptides. If the amount of chondroitin is less than 1 part by weight, collagen cannot be produced in the body. On the other hand, when the compounding amount of chondroitins exceeds 2 parts by weight, the composition balance of the mixture is lost, and the proliferation of fibroblasts cannot be promoted.
混合物の構成物質の一つであって経皮投与剤の有効成分であるヒアルロン酸は、グルコサミン類およびコンドロイチン類と同様にムコ多糖類の一つであって、皮膚組織内や軟骨内の保水力を亢進させることが知られている。また、ヒアルロン酸は、皮膚の弾力性や皮膚表面のハリを促進させることも知られている。ヒアルロン酸は、体積の約６０００倍の水分を吸収する保湿力が特徴で、肌のシワの改善、乾燥肌の形成予防等の重要な役割を果たす。 Hyaluronic acid, which is one of the components of the mixture and is an active ingredient in transdermal agents, is one of mucopolysaccharides as well as glucosamines and chondroitins, and has a water retention capacity in skin tissue and cartilage. It is known to enhance. Hyaluronic acid is also known to promote skin elasticity and skin surface tension. Hyaluronic acid is characterized by its moisturizing ability to absorb approximately 6000 times its volume of water, and plays an important role in improving skin wrinkles and preventing the formation of dry skin.
本発明で添加するヒアルロン酸の配合量は動物由来コラーゲンペプチド１００重量部に対して０．１〜１重量部とすることが好ましい。ヒアルロン酸の配合量が０．１重量部より少ないと、繊維芽細胞の保水保湿力を高めることができず、肌のハリ等を保つことができなくなる。一方、ヒアルロン酸の配合量が１重量部を超えると、混合物の構成バランスが崩れ、繊維芽細胞の増殖を促進させることができなくなる。 It is preferable that the compounding quantity of the hyaluronic acid added by this invention shall be 0.1-1 weight part with respect to 100 weight part of animal origin collagen peptides. When the blending amount of hyaluronic acid is less than 0.1 parts by weight, the water retention and moisturizing power of fibroblasts cannot be increased, and the skin firmness and the like cannot be maintained. On the other hand, when the blending amount of hyaluronic acid exceeds 1 part by weight, the composition balance of the mixture is lost, and the proliferation of fibroblasts cannot be promoted.
混合物の構成物質の一つである糖セラミドは、ガラクトース、グルコース、マンノース等の糖部分がセラミド類に付加した糖脂質であり、ガラクトシルセラミド、グルコシルセラミド等がある。糖セラミドはコラーゲンを分解する酵素を抑え、真皮までコラーゲンを遊走させる役割を果たす。コラーゲンは、真皮に到達して初めて肌に作用する（肌のハリや弾力を与える）が、コラーゲンを塗布しただけでは皮膚の顆粒層までしか到達せず、コラーゲンを肌に作用させることができない。本発明では、糖セラミドを構成物質の一つとすることで、オリゴ糖と共にコラーゲンを真皮まで遊走させることができ、コラーゲンを肌で作用させることができるようになった。糖セラミドは、例えば、牛、馬等の哺乳動物の脳、脊髄等の組織や、小麦、麹や米ぬか等の植物の細胞膜、微生物の細胞膜に存在するもの、または化学合成等により得られるもの等公知の種々の糖セラミドを添加してもよいが、コスト等の面から小麦または米由来糖セラミドを添加することが好ましい。 Sugar ceramide, which is one of the components of the mixture, is a glycolipid obtained by adding a sugar moiety such as galactose, glucose, mannose to ceramides, and includes galactosyl ceramide, glucosyl ceramide, and the like. Glyceramide suppresses enzymes that break down collagen and plays a role in causing collagen to migrate to the dermis. Collagen does not act on the skin until it reaches the dermis (gives skin elasticity and elasticity), but it only reaches the granular layer of the skin by applying collagen, and collagen cannot act on the skin. In the present invention, by making sugar ceramide one of the constituent substances, collagen can migrate to the dermis together with oligosaccharide, and collagen can act on the skin. Sugar ceramides, for example, are present in tissues of the brain, spinal cord, etc. of mammals such as cattle and horses, plant cell membranes such as wheat, rice bran and rice bran, and those obtained by chemical synthesis, etc. Various known sugar ceramides may be added, but it is preferable to add wheat or rice-derived sugar ceramide from the viewpoint of cost and the like.
本発明で添加する糖セラミドの配合量は動物由来コラーゲンペプチド１００重量部に対して０．１〜１重量部とすることが好ましい。糖セラミドの配合量が０．１重量部より少ないと、表皮の深部までコラーゲンを遊走させることができなくなる。一方、糖セラミドの配合量が１重量部を超えると、混合物の構成バランスが崩れ、繊維芽細胞の増殖を促進させることができなくなる。 It is preferable that the compounding quantity of the sugar ceramide added by this invention shall be 0.1-1 weight part with respect to 100 weight part of animal origin collagen peptides. If the amount of sugar ceramide is less than 0.1 parts by weight, collagen cannot migrate to the deep part of the epidermis. On the other hand, when the compounding quantity of sugar ceramide exceeds 1 weight part, the structural balance of a mixture will collapse | crumble and it will become impossible to promote the proliferation of a fibroblast.
混合物の構成物質の一つであって経皮投与剤の有効成分であるビタミンＣは、体内組織の酸化を防止する働きを有すると共に、コラーゲンの生合成のために必須なビタミンであることが知られている。また、肌の組織を修復する際に発生する活性酸素を除去する役割を果たす。 Vitamin C, which is one of the components of the mixture and is an active ingredient in transdermally administered agents, has the function of preventing oxidation of body tissues and is known to be an essential vitamin for the biosynthesis of collagen. It has been. It also serves to remove active oxygen generated when repairing skin tissue.
本発明で添加するビタミンＣの配合量は動物由来コラーゲンペプチド１００重量部に対して０．１〜１重量部とすることが好ましい。ビタミンＣの配合量が０．１重量部より少ないと、コラーゲンの吸収を増加させることができなくなる。一方、ビタミンＣの配合量が１重量部を超えると、混合物の構成バランスが崩れ、繊維芽細胞の増殖を促進させることができなくなる。 It is preferable that the compounding quantity of the vitamin C added by this invention shall be 0.1-1 weight part with respect to 100 weight part of animal origin collagen peptides. If the amount of vitamin C is less than 0.1 parts by weight, the absorption of collagen cannot be increased. On the other hand, if the blending amount of vitamin C exceeds 1 part by weight, the composition balance of the mixture is lost, and the proliferation of fibroblasts cannot be promoted.
経皮投与剤の使用体系は特に限定されず、例えば化粧品、湿布類、軟膏類等として使用することができる。 The use system of the transdermal administration agent is not particularly limited, and can be used as, for example, cosmetics, poultices, ointments and the like.
次に、本発明の繊維芽細胞の増殖を促進させる経口投与剤の製造方法について詳細に説明する。なお、本発明の繊維が細胞の増殖を促進させる経皮投与剤の製造方法と重複している個所については説明を省略する。 Next, the manufacturing method of the oral administration agent which accelerates | stimulates the proliferation of the fibroblast of this invention is demonstrated in detail. In addition, description is abbreviate | omitted about the location which the fiber of this invention overlaps with the manufacturing method of the transdermal administration agent which promotes the proliferation of a cell.
本発明の繊維芽細胞の増殖を促進させ得る経口投与剤は、まず、減菌した容器内にオリゴ糖を入れて攪拌させる。予めオリゴ糖が攪拌されている容器内に常温・常圧下で動物由来コラーゲンペプチドをオリゴ糖１００重量部に対して、４０〜５０重量部添加する。攪拌速度は、経口投与剤の製造量等に応じて適宜変更することができるが、１００〜１０００ｒｐｍの間で調節することが好ましい。また、全ての構成物質を入れ終わるまで攪拌をしつづける。 In the oral administration agent capable of promoting the proliferation of the fibroblasts of the present invention, the oligosaccharide is first placed in a sterilized container and stirred. 40 to 50 parts by weight of animal-derived collagen peptide is added to 100 parts by weight of oligosaccharide at room temperature and normal pressure in a container in which the oligosaccharide is previously stirred. The stirring speed can be appropriately changed according to the production amount of the orally administered agent, but is preferably adjusted between 100 and 1000 rpm. Moreover, stirring is continued until all the constituent substances are added.
次に、動物由来コラーゲンペプチドを添加した後も攪拌を続け、グルコサミン類を常温・常圧下でオリゴ糖１００重量部に対して１〜２重量部を添加する。 Next, stirring is continued even after the animal-derived collagen peptide is added, and 1-2 parts by weight of glucosamines are added to 100 parts by weight of the oligosaccharide at normal temperature and normal pressure.
グルコサミン類を添加した後、コンドロイチン類を常温・常圧下でオリゴ糖１００重量部に対して１〜５重量部を攪拌しながら添加する。 After adding glucosamines, 1-5 parts by weight of chondroitin is added to 100 parts by weight of oligosaccharide with stirring at room temperature and normal pressure.
コンドロイチン類を添加した後、ヒアルロン酸を常温・常圧下でオリゴ糖１００重量部に対して１〜５重量部を攪拌しながら添加する。 After adding chondroitin, hyaluronic acid is added with stirring at 1 to 5 parts by weight with respect to 100 parts by weight of oligosaccharide at room temperature and normal pressure.
ヒアルロン酸を添加した後、ビタミンＣを常温・常圧下でオリゴ糖１００重量部に対して０．１〜１重量部を攪拌しながら添加する。 After adding hyaluronic acid, 0.1 to 1 part by weight of vitamin C is added to 100 parts by weight of oligosaccharide with stirring at room temperature and normal pressure.
ビタミンＣを添加した後、糖セラミドを常温・常圧下でオリゴ糖１００重量部に対して０．１〜１重量部を攪拌しながら添加して、混合物を形成する。 After adding vitamin C, sugar ceramide is added with stirring at 0.1-1 part by weight with respect to 100 parts by weight of oligosaccharide at room temperature and normal pressure to form a mixture.
必要に応じて、糖セラミドを添加した後に、ビタミンＥを常温・常圧下でオリゴ糖１００重量部に対して０．１〜１重量部を攪拌しながら添加してもよい。ビタミンＥをさらに添加することにより、より効率よくコラーゲンを体内へ吸収させることができる。 If necessary, after adding sugar ceramide, vitamin E may be added with stirring at 0.1 to 1 part by weight with respect to 100 parts by weight of oligosaccharide at room temperature and normal pressure. By further adding vitamin E, collagen can be absorbed into the body more efficiently.
それぞれの構成物質の添加する順番を変更しても経口投与剤を製造することができる。しかし、理由は定かでないが、構成物質の添加する順番を変更すると、繊維芽細胞の増殖を促進させる効果がなくなってしまう。したがって、上述したように、オリゴ糖、動物由来コラーゲンペプチド、グルコサミン類、コンドロイチン類、ヒアルロン酸、ビタミンＣ、糖セラミドの順に構成物質を添加することが好ましい。 Even if the order in which each constituent substance is added is changed, the oral administration agent can be produced. However, although the reason is not clear, if the order in which the constituent substances are added is changed, the effect of promoting the proliferation of fibroblasts is lost. Therefore, as described above, it is preferable to add the constituent substances in the order of oligosaccharide, animal-derived collagen peptide, glucosamines, chondroitins, hyaluronic acid, vitamin C, and sugar ceramide.
混合物の構成物質の一つであるオリゴ糖は、経皮投与剤と同様にデンプン由来のイソマルトオリゴ糖を添加することが好ましい。デンプン由来のイソマルトオリゴ糖を添加することで、より繊維芽細胞に活性を与えることができる。なお、デンプン由来イソマルトオリゴ糖はデンプン由来であれば種類は特に限定されず、例えば芋、米、麦芽等のデンプン由来イソマルトオリゴ糖を添加することができ、これらを単独で添加してもよいが複数組合せて添加してもよい。 It is preferable to add starch-derived isomaltoligosaccharide to the oligosaccharide that is one of the constituents of the mixture, as in the case of the transdermal administration agent. By adding starch-derived isomaltoligosaccharides, it is possible to impart more activity to fibroblasts. The type of starch-derived isomaltoligosaccharide is not particularly limited as long as it is derived from starch. For example, starch-derived isomaltoligosaccharides such as rice bran, rice, and malt can be added, and these may be added alone. Multiple combinations may be added.
本発明で添加する動物由来コラーゲンペプチドの配合量はオリゴ糖１００重量部に対して４０〜５０重量部とすることが好ましい。動物由来コラーゲンペプチドの配合量が４０重量部より少ないと、混合物の構成バランスが崩れ、繊維芽細胞の増殖を促進させることができなくなる。一方、動物由来コラーゲンペプチドの配合量が５０重量部を超えた場合、コラーゲンは必須アミノ酸のトリプトファンをほとんど含んでいないため、必須アミノ酸のバランスを崩すおそれが生じる。 The amount of the animal-derived collagen peptide added in the present invention is preferably 40 to 50 parts by weight with respect to 100 parts by weight of the oligosaccharide. When the blending amount of the animal-derived collagen peptide is less than 40 parts by weight, the composition balance of the mixture is lost, and the proliferation of fibroblasts cannot be promoted. On the other hand, when the blending amount of the animal-derived collagen peptide exceeds 50 parts by weight, since collagen contains almost no essential amino acid tryptophan, the balance of essential amino acids may be lost.
本発明で添加するグルコサミン類の配合量はオリゴ糖１００重量部に対して１〜５重量部とすることが好ましい。グルコサミン類の配合量が１重量部より少ないと、コラーゲンの生合成を促進させることができなくなる。一方、グルコサミン類の配合量が２重量部を超えると、混合物の構成バランスが崩れ、繊維芽細胞の増殖を促進させることができなくなる。 It is preferable that the compounding quantity of glucosamine added by this invention shall be 1-5 weight part with respect to 100 weight part of oligosaccharides. If the blending amount of glucosamines is less than 1 part by weight, collagen biosynthesis cannot be promoted. On the other hand, when the blending amount of glucosamines exceeds 2 parts by weight, the composition balance of the mixture is lost, and the proliferation of fibroblasts cannot be promoted.
本発明で添加するコンドロイチン類の配合量はオリゴ糖１００重量部に対して１〜５重量部とすることが好ましい。コンドロイチン類の配合量が１重量部より少ないと、体内でコラーゲンの生成を働きかけることができなくなる。一方、コンドロイチン類の配合量が２重量部を超えると、混合物の構成バランスが崩れ、繊維芽細胞の増殖を促進させることができなくなる。 It is preferable that the compounding quantity of chondroitin added by this invention shall be 1-5 weight part with respect to 100 weight part of oligosaccharides. If the amount of chondroitin is less than 1 part by weight, collagen cannot be produced in the body. On the other hand, when the compounding amount of chondroitins exceeds 2 parts by weight, the composition balance of the mixture is lost, and the proliferation of fibroblasts cannot be promoted.
本発明で添加するヒアルロン酸の配合量はオリゴ糖１００重量部に対して０．１〜１重量部とすることが好ましい。ヒアルロン酸の配合量が０．１重量部より少ないと、繊維芽細胞の保水保湿力を高めることができず、肌のハリ等を保つことができなくなる。一方、ヒアルロン酸の配合量が１重量部を超えると、混合物の構成バランスが崩れ、繊維芽細胞の増殖を促進させることができなくなる。 The amount of hyaluronic acid added in the present invention is preferably 0.1 to 1 part by weight per 100 parts by weight of the oligosaccharide. When the blending amount of hyaluronic acid is less than 0.1 parts by weight, the water retention and moisturizing power of fibroblasts cannot be increased, and the skin firmness and the like cannot be maintained. On the other hand, when the blending amount of hyaluronic acid exceeds 1 part by weight, the composition balance of the mixture is lost, and the proliferation of fibroblasts cannot be promoted.
本発明で添加するビタミンＣの配合量はオリゴ糖１００重量部に対して０．１〜１重量部とすることが好ましい。ビタミンＣの配合量が０．１重量部より少ないと、コラーゲンの吸収を増加させることができなくなる。一方、ビタミンＣの配合量が１重量部を超えると、混合物の構成バランスが崩れ、繊維芽細胞の増殖を促進させることができなくなる。 It is preferable that the compounding quantity of the vitamin C added by this invention shall be 0.1-1 weight part with respect to 100 weight part of oligosaccharides. If the amount of vitamin C is less than 0.1 parts by weight, the absorption of collagen cannot be increased. On the other hand, if the blending amount of vitamin C exceeds 1 part by weight, the composition balance of the mixture is lost, and the proliferation of fibroblasts cannot be promoted.
混合物の構成物質の一つである糖セラミドは、ガラクトース、グルコース、マンノース等の糖部分がセラミド類に付加した糖脂質であり、ガラクトシルセラミド、グルコシルセラミド等がある。糖セラミドは、例えば、牛、馬等の哺乳動物の脳、脊髄等の組織や、小麦、麹や米ぬか等の植物の細胞膜、微生物の細胞膜に存在するもの、または化学合成等により得られるもの等公知の種々の糖セラミドを添加してもよいが、コスト等の面から小麦または米由来糖セラミドを添加することが好ましい。 Sugar ceramide, which is one of the components of the mixture, is a glycolipid obtained by adding a sugar moiety such as galactose, glucose, mannose to ceramides, and includes galactosyl ceramide, glucosyl ceramide, and the like. Sugar ceramides, for example, are present in tissues of the brain, spinal cord, etc. of mammals such as cattle and horses, plant cell membranes such as wheat, rice bran and rice bran, and those obtained by chemical synthesis, etc. Various known sugar ceramides may be added, but it is preferable to add wheat or rice-derived sugar ceramide from the viewpoint of cost and the like.
通常、コラーゲンを摂取すると、コラーゲンはコラーゲン分解酵素コラゲナーゼにより分解されて骨芽細胞に取り込まれてしまい、皮膚の真皮にはコラーゲンがほとんど遊走されない。 Normally, when collagen is ingested, collagen is degraded by collagenase collagenase and taken up by osteoblasts, and collagen hardly migrates to the dermis of the skin.
しかし、糖セラミドはコラーゲン分解酵素コラゲナーゼの発生を抑制する役割を果たす。したがって、コラーゲンを糖セラミドと共に摂取すると、コラーゲンはコラゲナーゼによって分解されずに直接皮膚の真皮や、関節の軟骨等、コラーゲンが不足している部分に遊走される。このように、本発明の製造方法によって得られる経皮投与剤および経口投与剤は、膝等の関節軟骨の再生が促進され、関節痛等の症状を緩和させる効果もある。 However, sugar ceramide plays a role in suppressing the generation of collagenase collagenase. Therefore, when collagen is ingested with sugar ceramide, the collagen is not decomposed by collagenase, but is directly migrated to a portion lacking collagen, such as the dermis of the skin or the cartilage of the joint. As described above, the transdermal administration agent and the oral administration agent obtained by the production method of the present invention have the effect of promoting the regeneration of articular cartilage such as knees and alleviating symptoms such as joint pain.
本発明で添加する糖セラミドの配合量はオリゴ糖１００重量部に対して０．１〜１重量部とすることが好ましい。糖セラミドの配合量が０．１重量部より少ないと、表皮の深部までコラーゲンを遊走させることができなくなる。一方、糖セラミドの配合量が１重量部を超えると、混合物の構成バランスが崩れ、繊維芽細胞の増殖を促進させることができなくなる。 It is preferable that the compounding quantity of the sugar ceramide added by this invention shall be 0.1-1 weight part with respect to 100 weight part of oligosaccharides. If the amount of sugar ceramide is less than 0.1 parts by weight, collagen cannot migrate to the deep part of the epidermis. On the other hand, when the compounding quantity of sugar ceramide exceeds 1 weight part, the structural balance of a mixture will collapse | crumble and it will become impossible to promote the proliferation of a fibroblast.
経口投与剤の使用体系は特に限定されず、例えば顆粒、タブレット類、散剤、カプセル剤、座剤等として使用することができる。 The use system of the oral administration agent is not particularly limited, and for example, it can be used as granules, tablets, powders, capsules, suppositories and the like.
以上、本発明の繊維芽細胞の増殖を促進させる経皮投与剤および経口投与剤の製造方法について詳細に説明したが、本発明はこれらに限定されるものではない。 As mentioned above, although the manufacturing method of the transdermal administration agent and oral administration agent which accelerates | stimulates the proliferation of the fibroblast of this invention was demonstrated in detail, this invention is not limited to these.
本発明では、上述した構成物質以外に必要に応じて、例えば香料類、アルコール類、保留剤、香料以外の油分、保湿剤、湿潤剤、油脂、炭化水素、脂肪酸、水溶性高分子、紫外線吸収剤、酸化防止剤、防腐剤、色剤、増粘剤、ビタミンＣ・ビタミンＥ以外のビタミン類等目的に応じて適宜選択して配合させてもよい。これらは単独で配合させてもよいが複数配合させてもよい。なお、これらを配合させる場合は、構成物質を全て添加した後に配合させることが好ましい。 In the present invention, if necessary, in addition to the above-described constituent materials, for example, fragrances, alcohols, retention agents, oils other than fragrances, humectants, wetting agents, fats and oils, hydrocarbons, fatty acids, water-soluble polymers, ultraviolet absorption Agents, antioxidants, preservatives, colorants, thickeners, vitamins other than vitamin C / vitamin E, etc. may be appropriately selected and blended depending on the purpose. These may be blended alone or in combination. In addition, when mix | blending these, it is preferable to mix | blend after adding all the structural substances.
一方、いわゆるＭＣＭ（マリーン・クリスタル・ミネラル）製剤を本発明の製造方法によって得られた経皮投与剤および経口投与剤に添加すれば、更なる新陳代謝を促進することができる。ＭＣＭとは、海水抽出物のことをいい、カルシウム、マグネシウム、カリウム、鉄、亜鉛、ニッケル等の６０種類以上のミネラルを含んだ製剤のことをいう。 On the other hand, if a so-called MCM (Marine Crystal Mineral) preparation is added to the transdermal administration agent and oral administration agent obtained by the production method of the present invention, further metabolism can be promoted. MCM refers to a seawater extract, and refers to a preparation containing 60 or more minerals such as calcium, magnesium, potassium, iron, zinc, nickel and the like.
経皮投与剤の塗布量および経口投与剤の摂取量は、各構成物質の配合量が上述した範囲内であれば特に限定されないが、美肌保持或は皮膚の再生をより効率よく行うには、１日あたり３０ｍｇ以上経皮投与剤を塗布もしくは経口投与剤を摂取することが好ましい。なお、３０ｍｇ以上塗布もしくは摂取しても人体に有害とはならない。 The application amount of the transdermal administration agent and the intake amount of the oral administration agent are not particularly limited as long as the blending amount of each constituent is within the above-mentioned range, but in order to more efficiently maintain the skin or regenerate the skin, It is preferable to apply 30 mg or more of a transdermal administration agent or ingest an oral administration agent per day. In addition, even if 30 mg or more is applied or ingested, it is not harmful to the human body.
以下、実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。 Hereinafter, although an example is given and the present invention is explained still in detail, the present invention is not limited to these.
本発明の有効成分であるグルコサミン類、コンドロイチン類、ヒアルロン酸およびビタミンＣの繊維芽細胞に対する増殖促進作用について試験した。 The growth promoting action of the glucosamines, chondroitins, hyaluronic acid and vitamin C, which are the active ingredients of the present invention, on fibroblasts was tested.
試料である実験群、実験対照群および対照群を以下のように調整した。 The sample experimental group, experimental control group, and control group were adjusted as follows.
通常の細胞培養に用いられる１０％胎児牛血清（ＦＢＳ）添加イーグルＭＥＭ培養液（１０％ＦＢＳ−ＭＥＭ培養液）に、予め培養した仔ハムスター腎臓由来繊維芽細胞（ＢＨＫ−２１細胞、大日本製薬工業会社）を浮遊させた。このＢＨＫ−２１細胞浮遊液を６ウエル付きプラスチックトレイ（１ウエル＝１穴直径：３５ｍｍ）に２ｍｌずつ添加し（２×１０４個／ウエル）、ＣＯ２インキュベーターを用いて３７℃で３時間培養した。その後培養液を除去し、さらにウエル内をリン酸・生理食塩緩衝液（ＰＢＳ）で３回洗浄した。ＰＢＳで洗浄したウエル内の細胞に、グルコサミン塩酸塩５０ｍｇ／ｍｌ、コンドロイチン硫酸塩５０ｍｇ／ｍｌ、ヒアルロン酸１０ｍｇ／ｍｌ、ビタミンＣ５ｍｇ／ｍｌの配合液（ＧＣＨＡ）を１０％ＦＢＳ−ＭＥＭ培養液に添加した。
Hamster kidney-derived fibroblasts (BHK-21 cells, Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd.) previously cultured in 10% fetal bovine serum (FBS) -added Eagle MEM culture solution (10% FBS-MEM culture solution) used for normal cell culture Industrial company). Add 2 ml of this BHK-21 cell suspension to a plastic tray with 6 wells (1 well = 1 hole diameter: 35 mm) (2 × 10 4 cells / well) and incubate at 37 ° C. for 3 hours using a CO 2 incubator. did. Thereafter, the culture solution was removed, and the well was further washed three times with a phosphate / saline buffer (PBS). Glucosamine hydrochloride 50 mg / ml, chondroitin sulfate 50 mg / ml,
実験群の比較対照として実験対照群および対照群を調整した。実験群では、ＧＣＨＡを１０％ＦＢＳ−ＭＥＭ培養液に添加したが、実験対照群はＧＣＨＡをＭＥＭ培養液（１０％ＦＢＳが無添加）に添加した。ＧＣＨＡを添加せず１０％ＦＢＳ−ＭＥＭ培養液のみを対照群とした。 The experimental control group and the control group were prepared as comparative controls for the experimental group. In the experimental group, GCHA was added to the 10% FBS-MEM culture medium, whereas in the experimental control group, GCHA was added to the MEM culture medium (no 10% FBS added). Only 10% FBS-MEM culture solution without adding GCHA was used as a control group.
次に、調整した実験群、実験対照群および対照群を、３７℃で１０日間培養させて細胞増殖の有無と細胞数の推移を調べた。 Next, the adjusted experimental group, experimental control group, and control group were cultured at 37 ° C. for 10 days to examine the presence or absence of cell proliferation and the transition of the number of cells.
実験群、実験対照群および対照群の０日目、３日目、７日目および１０日目のＢＨＫ−２１細胞をトリプシン液で消化・剥離した後ＰＢＳを添加してＢＨＫ−２１細胞を浮遊させて、浮遊液中の細胞数を算定した。
BHK-21 cells on
図１に示すように、実験群および対照群のＢＨＫ−２１細胞数は、３日目から急速に増加し始め、７日目にはプラトーに達した。特に実験群では、実験対照群よりも細胞増殖が極めて顕著であることがわかる。一方、実験対照群では、細胞の増殖は認められず、培養日数の経過と共に急速に減少していることがわかる。 As shown in FIG. 1, the number of BHK-21 cells in the experimental group and the control group began to increase rapidly from the 3rd day and reached a plateau on the 7th day. In particular, it can be seen that in the experimental group, cell proliferation is significantly more significant than in the experimental control group. On the other hand, in the experimental control group, no cell proliferation was observed, and it was found that the number rapidly decreased with the passage of the culture days.
図２は、実験群、実験対照群および対照群のＢＨＫ−２１細胞の増殖状態と細胞形態を顕微鏡下で観察した写真である。図２に示すように、実験群での７日目における細胞数（実験群：図上段、７日目参照）は、対照群の細胞数（対照群：図下段、７日目参照）に比べて多く、細胞形態も極めて良好であった。また、繊維芽細胞の第１の特色である細胞体からの偽足が繊維状に長く伸延し、細胞質全体が典型的な紡錘形態を保持していた（図上段、下段：３日目参照）。 FIG. 2 is a photograph of the experimental state, experimental control group and control group of BHK-21 cells grown and observed under a microscope. As shown in FIG. 2, the number of cells on the seventh day in the experimental group (experimental group: see the upper part of the figure, the seventh day) is compared with the number of cells in the control group (the control group: lower part of the figure, see the seventh day) The cell morphology was also very good. In addition, the pseudopod from the cell body, which is the first feature of fibroblasts, was elongated in a fiber shape, and the entire cytoplasm maintained a typical spindle shape (see the upper and lower stages of the figure). .
他方、実験対照群での培養細胞の形態（図中段）は、培養１日目から細胞質の膨化・崩壊と偽足部位の損傷・破壊が著しく、３日目以降では、細胞質の崩壊に伴う裸核細胞像が顕著であった。 On the other hand, the morphology of cultured cells in the experimental control group (middle in the figure) is markedly expanded and collapsed from the first day of culture and damage / destruction of the pseudopod site. The nuclear cell image was remarkable.
以上の結果をまとめると、通常の細胞培養液（ＦＢＳ−ＭＥＭ）に上記４種類の成分（グルコサミン塩酸塩：コンドロイチン硫酸塩：ヒアルロン酸：ビタミンＣ＝１０：１０：２：１）を添加すると、コラーゲン産生細胞である繊維芽細胞の増殖機能をより増強させることがわかる。言いかえると、加齢と共に低下する自己のコラーゲン蛋白質の産生機能を効果的に亢進させると共に、皮膚組織の再生機能をも再活性化させることがわかる。すなわち、自己の繊維芽細胞の増殖に伴うコラーゲン蛋白質産生能が、回復・改善することが本実施例で確認された。 Summarizing the above results, when the above four components (glucosamine hydrochloride: chondroitin sulfate: hyaluronic acid: vitamin C = 10: 10: 2: 1) are added to a normal cell culture solution (FBS-MEM), It can be seen that the proliferation function of fibroblasts, which are collagen-producing cells, is further enhanced. In other words, it is found that the production function of the own collagen protein that decreases with aging is effectively enhanced and the regeneration function of the skin tissue is also reactivated. That is, it was confirmed in this example that the ability to produce collagen protein accompanying the proliferation of autologous fibroblasts was recovered / improved.
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