JP2006117663A - ガン治療用の当帰抽出物 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】当帰(Angelicae sinensis)のアセトン抽出物、クロロホルム抽出物、ヘキサン抽出物、又はそれらから分離・純化された活性成分、例えば、n-ブチリデンフタリドを用いる。
【選択図】なし
Description
古くから当帰は、血の道や婦人病に用いられてきた。通常、これには繖形花科に属する当帰(Angelicae sinensis (Oliv.) Diels)の乾根が使用されている。当帰(Angelicae sinensis , 以下ASとも称す)は、この領域ではその熟練した技術が重視されている。ASの抽出、分離及び/又は各活性成分の純化には多くの技術が知られている。この領域において、当帰の有機溶剤抽出物は、如何なる標準的な方法により得ることが可能である。本発明によると、ASはアセトン、クロロホルム又はヘキサンより抽出される。本発明の形態の一つによると、ASの根茎の乾燥粉末をアセトン溶剤で抽出することで、アセトン抽出物(以下、AS−Aとも称す)を得る。このAS−Aを更にクロロホルムで抽出することでクロロホルム抽出物(以下、AS−Cとも称す)を得る、AS−Aをヘキサンで抽出することによりヘキサン抽出物(以下、AS−Hとも称す)を得ることができる。
ASの活性成分をASの有機溶剤抽出物から分離及び/又は純化する方法は、この領域における周知の任意な技術により行なうことができる。この活性成分は、ASの任意な形態、特に根茎から純化することが可能である。純化の際には、多くの異なる技法、例えば、濾過、選択的沈澱法、有機溶剤による抽出、水性溶剤による抽出、カラム クロマトグラフィ、高速液相クロマトグラフィ(HPLC)などが利用される。本発明によると、若干の活性成分をASの有機溶剤抽出物から純化することができ、例えば、リグスチリド(ligustilide)とn-ブチリデンフタリド(n-butylidenephthalide)が挙げられ、後者は腫瘍細胞のアポトーシスを誘発することができる。本発明の別の形態によると、BPのE-とZ-型幾何異性体は、カラム クロマトグラフィにより分離され、更にHPLCとNMRにより特徴づけることが可能となる。
真核性染色体のエクストレミチズ(extremities)であるテロメラーゼは、ゲノムの完全性を保持するのに重要な酵素であり、細胞のエージングと不死性の決め手と見なされている(N. W. Kim, M. A. Piatyszek, K. R. Prowse, C. B. Harley, M. D. West, P. L. C. Ho, G. M. Coviello, W. E. Wright, S. L. Weinrich, J. W. Shay, Science, 266, 2011-2015 (1994)参照)。テロメアの長さとその減少の比率は、器官と個体により異なる。ネズミと人において、テロメアの長さに大きな染色体内の変化が存在し、単一の染色体におけるテロメアの錯乱は、不正常な染色体の分離を引き起こすという(L. L. Sandell, V. A. Zakian, Cell, 75, 729-739 (1993)参照)。それ故、テロメアの長さの変化を調整と維持することは、ガンの生長上重要な役割を果すものと結論することができる。細胞は明らかにテロメアの危険な短縮と異常な延長の両者に対する保護系を有する。テロメアの長さの調整因子の一つとしてテロメラーゼが挙げられる(G. B. Morin, Cell, 59, 521-529 (1989)参照)。そこで、テロメラーゼ活性を選択的に抑制する成分又は物質があれば、腫瘍細胞の生長を抑制することが可能であり、更に腫瘍細胞のアポトーシスを誘発するものと考えられる。
本発明によると、当帰のアセトン抽出物、クロロホルム抽出物又はヘキサン抽出物、及びそれらから純化して得られた活性成分のn-ブチリデンフタリドを用いて、いくつかのガン細胞系の生長に対してその抗ガン性を調べたところ、ガン細胞に対する細胞障害性を有すること、ガン細胞のテロメラーゼ活性を抑制すること(実施例7)、ガン細胞の増殖を抑圧すること(実施例2)及びガン細胞のアポトーシスを誘発すること(実施例3と4)等が明らかにされた。この他、動物実験によってもガンの生長を有効に抑圧することが示された(実施例5と6)。これにより、本発明はガンの治療に有効であり、特にヒトの悪性多型神経膠芽腫瘍(グリオブラストーマ)、大腸・直腸癌、白血病、神経芽細胞腫瘍、肝臓癌、乳癌、卵巣癌と肺癌等のガンの治療に用いることができる。
本発明により当帰のアセトン抽出物、クロロホルム抽出物又はヘキサン抽出物、及びそれらから純化して得られた活性成分とその誘導体は、通常の経路、例えば、経口、腸管外、腹腔内(ip)、静脈内(iv)、筋肉内(im)、皮下(sc)、肺、真皮転移、口腔、鼻腔、舌下、目、直腸、膣又はその他の経路により投与することができるが、これらに限定されるものではない。用剤量又は投与頻度などは、有効な治療が期待できれば、特に限定されず、本発明の用途に使用することができる。好ましくは経口投与であり、通常、薬剤や食品に用いられる周知の経口方法が使用される。
当帰の抽出物と成分の調製
実験に使用される当帰(Angelicae sinensis (Oliv.) Diels )は、台湾台北市Chung-Yuan株式会社により提供され、Han-Ching Lin教授の鑑定を経たものである。この証拠物件の漢方試料は、***立国防医学センターの薬学部に保管されている。当帰の根茎の乾燥粉末(12 kg)をアセトン(24 L/回)で3回抽出してアセトン抽出物(以下、AS-Aとも称す)を得る。次に、AS-Aをクロロホルムで3回(24 L/回)抽出し、減圧下で濃縮してクロロホルム抽出物(31.67 g)を得る、以下、AS-Cとも称する(アセトン抽出物100gから得る) AS-A をヘキサンで抽出することによりヘキサン抽出物を得る(以下、AS-Hとも称する)。n-ブチリデンフタリド(BP)は、Lancaster Synthesis(株) (Newgate, Morecambe, UK)から購入し、そのまま直接に用いた。BPのE型とZ型異性体は、カラムクロマトグラフで分離し、HPLCとNMRを用いて確認した。これら物質をDMSOに溶解し、25℃で1時間振とうしながらインキュベーションした後、イン ビトロ実験に供する迄4℃で貯蔵した。
ヒト臍帯管内皮細胞(HUVECsと略称)をCascade Biologics, Inc.(株)(USA)から購入し、10%の牛胎児血清(FBS、Gibco BRL製品)と低血清生長補剤(LSGS、Cascade Biologics, Inc. USA提供)を追加した培地Medium 200(Cascade Biologics, Inc. USA提供)中に保持する。ヒト皮層繊維芽細胞(HDFsと略称)をCascade Biologics, Inc.(USA)から購入し、10%のFBSと低血清生長補剤(LSGS、Cascade Biologics, Inc. USA提供)を追加した培地のMedium 106(Cascade Biologics, Inc. USA)中に保持する。次に、ヒト大腸腺癌細胞系HT-29をATCC (Manassas, VA. USA)から購入し、10% FBSと100 ng/mlのペニシリンと100 ng/mlのストレプトマイシン(Life Technologies, Inc., Grand Island, NY, USA)を追加したDubecco'sの修正したイーグル培地(DMEM、Gibco)中に保持する。ロッグ生長(G1)中の細胞増殖を分析するために、細胞を60〜80%の密度まで培養する。100 mlの細胞懸濁物をFalcon 96穴プレートに分散し、その密度は培地のMedium 200 (HUVECsとして)中6 × 103細胞数/穴、又、培地のMedium 106 (HDFsとして)中9 × 103細胞数/穴、及び培地の10%FBSを追加したDMEM (HT-29として)中5 × 103細胞数/穴とする。該細胞をインキユベーター(加湿大気中、37℃, 5%CO2)中、24時間プレーインキュベーションする。10 mlの異なる濃度の毒物をプレートの培地中に加え、更に48時間インキュベーションを続け細胞を培養する。10 mlの細胞計量キット-8 (CCK-8、DOJINDO)溶液を加え、インキュベーター中更に1〜4時間インキュベーションを行なって、細胞を培養する。吸光度は波長450 nmで、マイクロプレート リーダーを用い、対照には600 nm又はそれ以上の波長を使用して測定する。
培養した基質細胞から修正したグアニジウム イソチオシアネート法(Trizol、 Invitrogen)を用いて総RNAを分離する。
該細胞に1 mlのトリゾール試薬を直径3.5 cmの6穴プレートに加え、直接溶胞し、次にピペットを用いて該細胞の溶胞産物数回通す。
上記の均質化した試料を15〜30℃で5分間インキュベーションし、核たん白質複合物を完全に解離させる。その後、1 mlのトリゾール試剤当り0.2 mlのクロロホルム (Riedel-de-haen)を加え、試料のチューブをしっかりと蓋する。上記のチューブを手で15秒はげしく振とうした後、15〜30℃で2〜3分間インキュベーションする。該試料を12,000x g過ぎない程度で15分間、2〜8℃下で遠心分離し、混合液を下層の赤色層、中間層のフェノールークロロホルム相と上層の無色水溶液相に分離した。RNAは水溶液相にのみ存在する。
新しいチューブに上記の水溶液相を移し、イソプロピル アルコールを混合することによりRNAを水溶液相から沈澱させる。1mlのトリゾール試薬当り0.5 mlのイソプロピル アルコールを均一化させるために冒頭に加える。試料は15〜30℃で10分間インキュベーションした後、12,000x g以下、2〜8℃で10分間遠心分離する。
上澄み液を除き、RNAペレットを75%のエタノールで1回洗う。1 mlのトリゾール試薬当り、少なくとも1 mlの75%エタノールを均一化させるために冒頭に加える、試料を旋回させながら混合した後、7,500 x g以下、2〜8℃で5分間遠心分離する。
上澄み液を除いた後、RNAペレットを乾燥する。このRNAをRNase-freeの水に溶解した後、55〜60℃下で10分間インキュベーションする。RNAは-70℃で貯蔵する。
イン ビトロで当帰の抽出物、リグスチリド、n-ブチリデンフタリドとその誘導体を用いて、ヒト腫瘍細胞系(MCF-7, CL1-5, HT-29, Caco-2)、ヒト臍帯管内皮細胞(HUVECs)、ヒト皮層繊維芽細胞(HDF)についての感応性を調べた。DBTRG-05MG、BCM、HL-60とJ5細胞系を、10%の牛胎児血清と100 ng/mlのペニシリン及び100 ng/mlのストレプトマイシンを含むRPMI-1640培地中、37℃、5%CO2の加湿大気下で培養した。G5T/VGH、RG2、N18、SVECとBalb/3T3細胞を、10%の牛胎児血清と100 ng/mlのペニシリン及び100 ng/mlのストレプトマイシンを含むDMEM培地中、5%CO2、37℃下で培養した。各試験の前にPCRスクリーン法を用いてマイコプラズマ感染した培養細胞を除去した。
異なる濃度の当帰の抽出物又はそれらから純化して得られた活性成分を用いて処理した細胞の生存能力に対する効果を修正したMTT分析法により3回重複して評価した。簡単に言えば、細胞(5×103)を100 mlの生長培地を含む96穴プレートでインキュベーションした。細胞を24時間付着させた後、100 mlの薬草抽出物又は活性成分を溶かした培地を用いて処理した。DMSO = 0.02% (v/v)を含んだものを対照とし、 24、 48及び72時間インキュベーションした後、50 mlの新鮮な培地で薬物を含む培地と取り替え、プレートの各穴にある細胞を50 mlの400 μg/ml MTTで6〜8時間インキュベーションした。その後、培地とMTTを除き、各穴と対照群に100 mlのDMSOを加え、可溶性成分を溶解する。550における溶液の吸光度をMRX Microtiter Plate Luminometer (DYNEX, USA)を用いて測定した。無処理の細胞の吸光度を100%と考え、GBM細胞の5×103指数の生長細胞を異なる濃度の抽出物又は活性成分で24、48又は72時間処理し、その生長率に対する効果を評価した。各試験物質の細胞毒性をIC50値で決定し、この値は50%の抑制率を示す薬物の濃度を示すものである。本研究における実験は、すべて3回重複し、その結果を示したものである。
(AT12とA549は タキソール耐性サブクローン)
J5:ヒト肝癌細胞系
HCT15:ヒト大腸腺癌細胞系
HT-29:ヒト大腸腺癌細胞系
CL1-5:ヒト肺腺癌
DBTRG-05MG:ヒト多形性神経膠芽細胞腫瘍細胞系
G5T/VGH:ヒト多形性神経膠芽細胞腫瘍細胞系
N18:神経芽細胞腫瘍
BCM:ヒト乳癌
HL-60:ヒト骨髄球白血病細胞
RG2:鼠悪性神経膠腫瘍
SVEC:SV40形質転換マウスリンパ節内皮細胞
Balb/3T3:マウス繊維芽細胞
脳腫瘍細胞系のDBTRG-05MGとG5T/VGHを稀釈剤と生長培地で培養した。各試験と対照群にDMSOを加え、濃度を0.02%(v/v)以下にした。AS-CとBP処理においては、それぞれ70 mg/mlのAS-Cと400 μMのBPを加えた。これらは、すべて48時間培養した。DNAをプロピジウム ヨーダイド(PI)を用い細胞周期の分布を分析した。簡単に言えば、2 × 106の付着細胞はトリプシンの作用により分離された。この分離細胞と浮動死細胞とを遠心分離し、10 mlの冷たい1 × PBS (Life Technologies(株)製品)で2回洗浄した。上層液をアスピレートで除き、細胞を0.8 mlの1 × PBSに再懸濁した後、200 μl の PI溶液(50 μg/ml PI + 0.05 mg/ml RNase A、シグマ ケミカル(株)製品)を加え、この細胞を4℃で一夜冷蔵した。この細胞を光腺から保護した状態で室温下少なくとも2時間、DNA分析する前にインキュベーションする。染色後、FACScan (Becton Dickinson Immunocytometry Systems, San Jose, CA, USA)とCell Quest分析ソフトを用いて測定・定量したところ、総細胞は20,000であった。G0/G1相はM1 (×2)にゲート イン、G2/M相はM2 (×2)にゲート イン、総細胞はM3にゲート イン、S相はM3 - (M1(×2)+ M2(×2))にゲート イン、Sub G1相(apoptosis細胞)はM4ゲート インする。
In Situ Cell Death Detection Kit, POD (Roche, ドイツ)を用いて細胞のアポトーシスの状態を分析した。DNAクロマチンの形態的性状の変化を利用して定量した。その工程は説明書の指示通りに行なった。簡単に言えば、細胞を培養皿で培養し、AS-C (70 μg/ml)とBP (5〜800 μg/ml)でそれぞれ処理した72時間後に分析した。AS-CとBP処理群の懸濁細胞を集めた。対照群においては、付着と浮動細胞を集めた。その後、その細胞を食塩水を塗布したスライド上、室温下で15分間、3.7%のホルムアルデヒドを用いて固定し、1× PBSで一回洗浄し、3%過酸化水素を用い内因性のペルオキシダーゼ活性を減少した後、冷たい透過性溶液(0.1% トリトンX-100 + 0.1% クエン酸ナトリウム)中でインキュベーションした。この細胞は、再度1× PBSで洗浄し、末端デオキシヌクレオチジル トランスフェラーゼ(TdT)-メジエートdUTPニック ラベル(TUNEL)反応混合物中、37℃下で60分間インキュベーションした。次に、細胞を1 × PBSで洗浄し、プロピジュウム ヨーダイド(PI)でカンター染色して、細胞を計算する。細胞のアポトーシスを定量するため、蛍光顕微鏡(ニコン、川崎、日本)で結果を観察した。
細胞のアポトーシス分子のウェスタンブロット分析
AS-C (70 μg/ml)を用いてDBTRG-05MG細胞(ヒトGBM細胞)を0, 6, 12, 24と48時間処理した。別の実験においてBP (400 μM)を使用し、DBTRG-05MG細胞を0, 1.5, 3, 6, 12, 24と48時間処理した。該細胞ペレットを溶菌緩衝液(10 nMトリス-塩酸, pH 7.5, 1 mM EGTA, 0.5% CHAPS, 10% (v/v)グリセロール, 5 mM b-2-メルカプトエタノールと0.1 mMフェニルメチルスルホニル フルオライド)に再懸濁し、アイス上で30分間保持した後、4℃下、13000x rpmで20分間遠心分離を行なった。細胞溶菌産物全体のタンパク質濃度について、BCAタンパク質分析キット(Pierce, Rockford, IL)を用い説明書の指示通り操作して測定した。該細胞溶菌産物(20 μg/レーン)は、10〜12% SDS-PAGE (Bio-Rad, Hercules, CA)を用いて電気泳動分析をした。タンパク質はボリビニリデンフルオライド(PVDF)膜(Amersham Lifesciences, Piscataway, NJ)に転移した。該膜を室温下5%のスキム ミルクをブロッキング剤として用い1時間マスクした後、Fas (FL-335)、Fas-L (C-178)、カスパーゼ3 (H-277)、カスパーゼ8 (H-134)、カスパーゼ9 (H-170)、Bax (B-9)、p16 (F-12)、p21 (F-5)、 p53 (DO-1、 1/100稀釈) (Santa Cruz Biotechnology Inc., CA, USA)、 ホスホ-p53 (Ser15、 1/2000稀釈)とホスホ-Rb (Ser795、 1/2000稀釈) (Cell signaling Technology, MA, USA)などの各抗体と共に室温下で2時間インキュベーションした。
又、BPがカスパーゼ8の活性を強め、48時間後に137.9倍増加し、同時にプロカスパーゼ8が減少することが観察された(図3dを参照)。
動物実験には、RG2細胞(鼠GBM)とDBTRG-05MG細胞(ヒトGBM)を用い、AS-CとBPの抗腫瘍活性をモニターした。雄鼠F344(230-260 g)と雄Foxn1 nu/nu鼠(10〜12週)をNational Laboratory Animal Center (台北、台湾)から分譲した。すべての実験過程は慈済大学(花蓮、台湾)の動物センター研究室の標準作業手順に従って行なった。実験動物は病原菌フリーの条件下で標準食餌を用いて飼育した。DBTRG-05MG細胞(ヒトGBM)とRG2細胞(鼠GBM)は、それぞれ裸鼠の異種移植と鼠の同種移植から準備した。
試験例1 皮下GBM腫瘍を生じた鼠の残存率と腫瘍サイズに与えるAS-Cの皮下注射投与の効果
同系のF344鼠を2群に分け(6匹/群)、その背中に1×106 RG2細胞を皮下に移植する。腫瘍細胞を移植後、3、6と9日目に、腫瘍を植え付けた場所からやや離れたところ(>2 cm)に皮下注射によりAS-C (500 mg/kg/day) (処理群)、又はベヒクル(50 mg/mlプロピレン グリコールと100 mg/mlトウィン80とを蒸留水に含ましたもの、Standard Chem. & Pharm社、台南、台湾) (参照群)を投与する。カリパーを用いて腫瘍のサイズを測定し、その容積をL × H × W × 0.52により算出した。腫瘍の容積が25 cm3以上になった日を試験動物の最後の日として、その生存日数を計算する。
2群の裸鼠(6匹/群)を準備し、ベヒクル(s.c.)と5 × 106個のDBTRG-05MG細胞を植入し、その5日後にAS-C (i.p. 500 mg/kg/day)、AS-C (s.c. 500 mg/kg/day)、又はベヒクル(s.c.)を投与した。腫瘍のサイズはカリパーを用いて測定し、そのL × H × W × 0.52により腫瘍の容積を算出した。腫瘍の容積が1000 mm3以上になった日を最後の日として、試験動物の最終生存日数を求めた。
RG2細胞を用い、in situ 腫瘍に対するAS-Cの細胞毒性効果を測定した。
同系の鼠を2群に分け(6匹/群)、i.c. (striatum)と5 × 104個のRG2細胞を植入し、腫瘍細胞を植え込み後、第4、5、6、7、8日目にAS-C (500 mg/kg/day)又はベヒクルs.c.処理を行なった。腫瘍の容量を測定し、3-TユニットMRI (General Electric, Wisconsin, USA)とエコープランナー イメージング カパビリテイ(Signa LX 3.8, General Electric, Wisconsin, USA) (慈済病院提供、花蓮、台湾)を用いて計量した。簡単に言えば、鼠を抱水クロラール(400 mg/ml, 1 ml/100g)で麻酔し、下記の条件下でMRIスキャンニングした:ファスト スピン エコー、重複時間6000 msecによるエコープランナー取得順序、エコー時間102 msec、マトリックス イメージは256×256、視野は5×5 cm、イン-プレーン解析80 mm。各鼠から19.5秒おきに6.5分間の間、1.5 mm厚さのスライスを20枚調製し試験に提供した。
本試験において、腫瘍は外科手術による除去は良くないという大きさになる迄放置し成長させた。
試験例1 F344雄鼠の頭蓋内における同種のGBM腫瘍に対するBPの効果
鼠を2群に分け(6匹/群)、i.c. (striatum)と5 × 104 RG2細胞を植入し、腫瘍細胞を植え付け後、第4、5、6、7と8日目に、ランダムにBP (300 mg/kg/day)とベヒクルs.c.を横腹の後方部分に5回投与した。腫瘍容積を測定し、MRIを用いて算出した。MRIは、3-Tユニット(General Electric, Wisconsin, USA)とエコープランナー イメージング カパビリテイ(Signa LX 3.8, General Electric, Wisconsin, USA)を用いて行なった。簡単に言えば、鼠は、抱水クロラール(400 mg/ml, 1 ml/100g)で麻酔し、下記の条件下でMRIスキャンニングを施した:ファスト スピン エコー、重複時間は6000 msecによるエコープランナー取得順序、エコー時間102 msec、マトリックス イメージは256×256、視野は5×5 cm、イン-プレーン解析は80 mm。各鼠から19.5秒おきに6.5分間の間、1.5 mm厚さのスライスを20枚調製した。最後に、全腫瘍サイズ(mm3)を測定し、各群について計算した。
6群の試験動物(Foxn1裸鼠、6匹/群)に1×106 DBTRG-05MG細胞を皮下注射で植え付み、腫瘍細胞植入して、インキュベーションした後、第4、5、6、7と8日目に、ランダムにBP s.c. (70, 150, 300, 500, 800 mg/kg/day)、又はベヒクルs.c.を遠く離れた場所(>2 cm)に5回投与した。腫瘍のサイズは2日置きに測量して腫瘍の容積を算出した。腫瘍が1000 mm3を過えた時点を最後の日とした。残存している試験動物は、3ヶ月にわたり腫瘍の成長をモニターした。生存期間は200日まで延長した。
文献に記載の修正したテロメア重複増大プロトコール(TRAP)分析法を用いて、テロメラーゼの活性を測定した。細胞ペレットを200 μlのアイスで冷却した溶菌緩衝液(10 mMトリス-塩酸、pH 7.5, 1 mM EGTA, 0.5% CHAPS, 10% [v/v]グリセロール, 5 mM b-2-メルカプトエタノールと0.1 mMフェニルメチルスルホニル フルオライド)に溶解し、アイス上で30分間インキュベーションした後、4℃、13,000 x gで20分間遠心分離を行なった。BCAタンパク質分析キット(Pierce, IL, USA)を用いて、上澄み抽出液のタンパク質を定量した。TRAP分析法は、TRAPezeテロメラーゼ検出キット(Intergen Co., Purchase, NY, USA)を用い、該社のプロトコル通りに実施した。簡単に述べると、0.5 μgのタンパク質を含んだ抽出物に、50 μlの下記組成分よりなる反応混合物(0.1 μgの基質オリゴヌクレオチド(TS)プライマ(5?-AATCCGTCGAGCAGAGTT-3?), 0.1 μgのTSK1 テンプレート(内部対照群)、0.1 μgのリバースオリゴヌクレオチド プライマ(RP)、2単位の宝Taq DNA ポリメラーゼ(宝酒造(株)、日本)、20 mMトリス-塩酸、pH 8.3、1.5 mM二塩化マグネシウム、63 mM 塩化ポタシウム、0.005% (v/v)トウィーン20、1 mM EGTA、各デオキシヌクレオチド 3燐酸塩(dNTPs) 50 μM、1.25 μCi (γ32P) ATP、3000 Ci/mmol (PerkinElmer Life Science, Boston, MA, USA))を加え、94℃で2.5分間インキュベーションした後、ポリメラーゼ 連鎖反応(PCR)をDNA熱サイクラー装置(GeneAmp PCR System 2400, PerkinElmer Co., Norwalk, CT, USA)を用いて、94℃で30秒間、59℃で30秒間、72℃で90秒間、30サイクルの複製を施こした。該TRAP生成物を54 mM トリス-塩酸、pH 8.0、54 mM 硼酸と1.2 mM EDTAを含む緩衝液中、12.5%(v/v)非変性ポリアクリルアミド ゲル電気泳動(PAGE)に付した。該ゲルを濾紙上1時間乾燥した後、X-フイルム(Bio-Max MR, コダック ロッチェスター, NY, USA)に80℃で6時間、増幅スクリーンと共に露出した。TRAP分析によるDNAラダーの生成物のシグナル強度をBio-Profil Biolight イメージング分析ソフトV2000.01 (Vulber Lourmat, フランス)により定量・比較した。
データは、平均値± SD又はSEで示される。スチューデントt-テスト(Student's t-test)によりその統計学的有意性(Statistical significance)分析を行なった。p <0.05で有意性ありと見なした。ロッグーランク(Mantel-Cox)テストを用いて生存率を比較した。Kaplan-Meier分析法により半数生存時間を推定した。
Claims (14)
- 腫瘍組織におけるガン細胞の増殖と移行を抑制する方法において、有効量の当帰(Angelicae sinensis)のアセトン抽出物、クロロホルム抽出物、ヘキサン抽出物、又はそれらの抽出物から分離・純化された活性成分を投与することを特徴とする腫瘍組織におけるガン細胞の増殖と移行を抑制する方法。
- ガン細胞のテロメラーゼ活性を抑制する方法において、有効量の当帰のアセトン抽出物、クロロホルム抽出物、ヘキサン抽出物、又はそれらの抽出物から分離・純化された活性成分を投与することを特徴とするガン細胞のテロメラーゼ活性を抑制する方法。
- ガン細胞のアポトーシスを誘発する方法において、有効量の当帰のアセトン抽出物、クロロホルム抽出物、ヘキサン抽出物、又はそれらの抽出物から分離・純化された活性成分を投与することを特徴とするガン細胞のアポトーシスを誘発する方法。
- ガンの予防及び/又は治療方法において、有効量の当帰のアセトン抽出物、クロロホルム抽出物、ヘキサン抽出物、又はそれらの抽出物より分離・純化された活性成分を用いて調製した薬剤を投与することを特徴とするガンの予防及び/又は治療方法。
- ガンの治療方法において、当帰のアセトン抽出物、クロロホルム抽出物、ヘキサン抽出物、又はそれらの抽出物から分離、純化された活性成分を佐薬として、他の一種又は一種以上の化学療法薬剤と共にその活性を利用し、細胞周期を調節し、テロメラーゼを抑制することを特徴とするガンの治療方法。
- 前記当帰の抽出物から分離・純化された活性成分は、n-ブチリデンフタリドを含有することを特徴とする請求項1〜5のいずれか1項に記載の方法。
- ガンの治療方法において、有効量のn-ブチリデンフタリドを投与することを特徴とするガンの治療方法。
- ガンの治療方法において、n-ブチリデンフタリドを佐薬として、更に他の一種又は一種以上の化学療法薬剤と共に、その活性を利用し、細胞周期を調節し、テロメラーゼを抑制することを特徴とするガンの治療方法。
- 前記ガンは、ヒトの悪性多形神経膠芽腫瘍、大腸・直腸ガン、白血病、神経芽細胞腫瘍、肝臓癌、乳癌、卵巣癌又は肺癌であることを特徴とする請求項1〜5のいずれか1項に記載の方法。
- 前記ガンは、ヒトの悪性多形神経膠芽腫瘍、大腸・直腸ガン、白血病、神経芽細胞腫瘍、肝臓癌、乳癌、卵巣癌又は肺癌であることを特徴とする請求項7又は8に記載の方法。
- 前記当帰の抽出物、又は当帰の抽出物から分離・純化された活性成分は、経口、腸管外、静脈内(iv)、腹腔内(ip)、筋肉内(im)、皮下(sc)、肺、真皮転移、口腔、鼻腔、舌下、目、直腸、膣又はその他の経路により投与することを特徴とする請求項1〜5のいずれか1項に記載の方法。
- 前記当帰の抽出物、又は当帰の抽出物から分離・純化された活性成分は、経口、腸管外、又は静脈内経路により投与することを特徴とする請求項11に記載の方法。
- n-ブチリデンフタリドは、経口、腸管外、静脈内(iv)、腹腔内(ip)、筋肉内(im)、皮下(sc)、肺、真皮転移、口腔、鼻腔、舌下、目、直腸、膣又はその他の経路により投与することを特徴とする請求項7又は8に記載の方法。
- n-ブチリデンフタリドは、経口、腸管外、又は静脈内経路により投与することを特徴とする請求項13に記載の方法。
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