JP2006068006A - Secreted and transmembrane polypeptide and nucleic acid encoding the same - Google Patents

Secreted and transmembrane polypeptide and nucleic acid encoding the same Download PDF

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Dan L Eaton
イートン，ダン，エル．
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フェララ，ナポレオン
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Mary E Gerritsen
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Timothy A Stewart
スチュアート，ティモシー，エー．
Daniel Tumas
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Abstract

<P>PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a new polypeptide derived from a human tissue and to provide a nucleic acid molecule encoding the polypeptide. <P>SOLUTION: The polypeptide having a specific amino acid sequence and a polynucleotide having a specified nucleic acid sequence encoding the polypeptide are provided. Furthermore, a vector and a host cell comprising the nucleic acid sequence, a chimera polypeptide molecule comprising a polypeptide fused to a heterogenous polypeptide sequence and an antibody binding to the polypeptide are provided. Furthermore, a method for producing the polypeptide is provided. <P>COPYRIGHT: (C)2006,JPO&NCIPI

Description

(発明の分野)
本発明は一般に新規なＤＮＡの同定と単離及び新規なポリペプチドの組換え生産に関する。 (Field of Invention)
The present invention relates generally to the identification and isolation of novel DNA and the recombinant production of novel polypeptides.

(発明の背景)
細胞外タンパク質は、特に、多細胞生物の形成、分化及び維持において重要な役割を担っている。多くの個々の細胞の運命、例えば増殖、移動、分化又は他の細胞との相互作用は、典型的には、他の細胞及び／又は直近の環境から受け取る情報に支配される。この情報は、しばしば分泌ポリペプチド(例えば、***促進因子、生存因子、細胞障害性因子、分化因子、神経ペプチド、及びホルモン)により伝達され、これが今度は多様な細胞レセプター又は膜結合タンパク質により受け取られ解釈される。これらの分泌ポリペプチド又はシグナル分子は、通常は細胞分泌経路を通過し、細胞外環境のその作用部位に到達する。
分泌タンパク質は、製薬、診断、バイオセンサー及びバイオリアクターを含む、様々な産業上の利用性を有している。血栓溶解剤、インターフェロン、インターロイキン、エリスロポエチン、コロニー刺激因子、及び種々の他のサイトカインのような、現在入手可能な大抵のタンパク質薬物は分泌タンパク質である。膜タンパク質であるそのレセプターもまた治療又は診断用薬剤としての可能性を有している。新規な未変性の分泌タンパク質を同定する努力が産業界と学術界の両方によってなされている。多くの努力が新規な分泌タンパク質のコード配列を同定するために哺乳動物組換えＤＮＡライブラリーのスクリーニングに注がれている。スクリーニング方法及び技術の例は文献に記載されている[例えば、Klein等, Proc. Natl. Acad. Sci. 93;7108-7113(1996);米国特許第5,536,637号を参照されたい]。 (Background of the invention)
Extracellular proteins play a particularly important role in the formation, differentiation and maintenance of multicellular organisms. The fate of many individual cells, such as proliferation, migration, differentiation or interaction with other cells, is typically governed by information received from other cells and / or the immediate environment. This information is often transmitted by secreted polypeptides (e.g., mitogens, survival factors, cytotoxic factors, differentiation factors, neuropeptides, and hormones), which in turn are received by various cell receptors or membrane-bound proteins. Interpreted. These secreted polypeptides or signal molecules usually pass through the cell secretory pathway and reach their site of action in the extracellular environment.
Secreted proteins have a variety of industrial applications, including pharmaceutical, diagnostic, biosensor and bioreactors. Most protein drugs currently available, such as thrombolytic agents, interferons, interleukins, erythropoietin, colony stimulating factor, and various other cytokines are secreted proteins. Its receptor, which is a membrane protein, also has potential as a therapeutic or diagnostic agent. Efforts have been made by both industry and academia to identify new native secreted proteins. Much effort has been devoted to screening mammalian recombinant DNA libraries to identify novel secretory protein coding sequences. Examples of screening methods and techniques are described in the literature [see, eg, Klein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 93; 7108-7113 (1996); US Pat. No. 5,536,637].

膜結合タンパク質とレセプターは、とりわけ、多細胞生物の形成、分化及び維持において重要な役割を担っている。多くの個々の細胞の運命、例えば増殖、移動、分化又は他の細胞との相互作用は、典型的には他の細胞及び／又は直近の環境から受け取る情報に支配される。この情報は、しばしば分泌ポリペプチド(例えば、***促進因子、生存因子、細胞障害性因子、分化因子、神経ペプチド、及びホルモン)により伝達され、これが次に多様な細胞レセプター又は膜結合タンパク質により受け取られ解釈される。このような膜結合タンパク質と細胞レセプターは、これらに限定されるものではないが、サイトカインレセプター、レセプターキナーゼ、レセプターホスファターゼ、細胞-細胞間相互作用に関与するレセプター、及びセレクチン及びインテグリンのような細胞接着分子を含む。例えば、細胞の増殖及び分化を調節するシグナルの伝達は、様々な細胞タンパク質のリン酸化により部分的に調節される。そのプロセスを触媒する酵素であるプロテインチロシンキナーゼはまた成長因子レセプターとしても作用しうる。具体例には、線維芽細胞成長因子及び神経成長因子レセプターが含まれる。
膜結合タンパク質とレセプター分子は、製薬及び診断薬を含む、様々な産業上の利用性を有している。例えば、レセプターイムノアドヘシンはレセプター-リガンド間相互作用を阻止する治療薬として使用することができる。膜結合タンパク質はまた、関連するレセプター／リガンド間相互作用の可能性のあるペプチド又は小分子インヒビターをスクリーニングするために使用することもできる。
新規な未変性のレセプター又は膜結合タンパク質を同定するための努力が産業界と学術界の双方によってなされている。多くの努力が、新規なレセプター又は膜結合タンパク質のコード配列を同定するために、哺乳動物組換えＤＮＡライブラリーのスクリーニングに注がれている。 Membrane-bound proteins and receptors play an important role in the formation, differentiation and maintenance of multicellular organisms, among others. The fate of many individual cells, such as proliferation, migration, differentiation or interaction with other cells, is typically governed by information received from other cells and / or the immediate environment. This information is often transmitted by secreted polypeptides (e.g., mitogens, survival factors, cytotoxic factors, differentiation factors, neuropeptides, and hormones) that are then received by various cell receptors or membrane-bound proteins. Interpreted. Such membrane-bound proteins and cell receptors include, but are not limited to, cytokine receptors, receptor kinases, receptor phosphatases, receptors involved in cell-cell interactions, and cell adhesions such as selectins and integrins. Contains molecules. For example, the transmission of signals that regulate cell growth and differentiation is regulated in part by phosphorylation of various cellular proteins. Protein tyrosine kinases, enzymes that catalyze the process, can also act as growth factor receptors. Specific examples include fibroblast growth factor and nerve growth factor receptor.
Membrane-bound proteins and receptor molecules have a variety of industrial applications, including pharmaceutical and diagnostic agents. For example, receptor immunoadhesins can be used as therapeutic agents that block receptor-ligand interactions. Membrane-bound proteins can also be used to screen for peptide or small molecule inhibitors with potential for related receptor / ligand interactions.
Efforts have been made by both industry and academia to identify new native receptors or membrane-bound proteins. Much effort has been devoted to screening mammalian recombinant DNA libraries to identify novel receptor or membrane-bound protein coding sequences.

１． ＰＲＯ１９６
「ＴＩＥ」又は「ｔｉｅ」という略語は頭文字であり、「チロシンキナーゼ含有Ｉｇ及びＥＧＦ相同ドメイン」を意味し、血管内皮細胞及び初期造血細胞でほぼ排他的に発現され、ＥＧＦ様ドメイン、及び一般に「免疫グロブリン(ＩＧ)様」折り畳みと呼ばれる鎖内ジスルフィド結合で安定化された細胞外折り畳み単位の存在を特徴とするレセプターチロシンキナーゼの新規なファミリーを表すのに作られた。ヒト白血病細胞(ｔｉｅ)からのチロシンキナーゼ相同体ｃＤＮＡ断片は、Partanen等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 8913-8917 (1990)に記載されている。このヒト「ｔｉｅ」レセプターのｍＲＮＡは、全てのヒト胎児及びマウス胚組織で検出され、心臓及び血管内皮細胞に局在化していると報告されている。Korhonen等, Blood 80, 2548-2555 (1992); ＰＣＴ出願公報WO 93/14124(1993年7月22日公開)。ヒトｔｉｅのラット相同体は「ｔｉｅ-１」と呼ばれ、Maisonpierre等, Oncogene 8, 1631-1637 (1993)によって同定された。「ｔｉｅ-２」と呼ばれる他のｔｉｅレセプターは、最初にラットで同定され(Dumont等, Oncogene 8, 1293-1301 (1993))、「ｏｒｋ」と呼ばれるｔｉｅ-２のヒト相同体は米国特許第5,447,860号(Ziegler)に記載されている。ｔｉｅ-２のマウス相同体は最初「ｔｅｋ」と命名された。脳毛細管ｃＤＮＡライブラリーからのマウスｔｉｅ-２レセプターのクローニングはＰＣＴ出願公報WO 95/13387(1995年5月18日公開)に記載されている。ＴＩＥレセプターは、血管形成に活動的に含まれ、造血でも役割を果たすと考えられる。
ヒトＴＩＥ-２リガンドの発現クローニングはＰＣＴ出願公報WO 96/11269(1996年4月18日公開)及び米国特許第5,521,073号(1996年5月28日発行)に記載されている。「ｈｔｉｅ-２リガンド１」又は「ｈＴＬ１」と呼称されるＴＩＥ-２リガンドをコードするλｇｔ１０と命名されたベクターはＡＴＣＣ登録番号７５９２８で寄託された。「ｈｔｉｅ-２ ２」又は「ｈＴＬ２」と命名された他のＴＩＥ-２リガンドをコードするプラスミドは、ＡＴＣＣ登録番号７５９２８で入手できる。この第２のリガンドは、ＴＡＩ-２レセプターのアンタゴニストとして記載されている。ＴＩＥ-２レセプターの分泌されたヒト及びマウスリガンドの同定は、Davis等, Cell 87, 1161-1169 (1996)に報告されている。血管形成における役割及び造血中の潜在的作用を反映して「アンギオポエチン-１(Angiopoietin-1)」と命名されたヒトリガンドは、WO 96/11269において「ｈｔｉｅ-２１」又は「ｈＴＬ-１」のように様々に呼ばれているリガンドと同じリガンドである。アンギオポエチン-１は、後に血管形成の役割を果たし、ＶＥＧＦとは区別されることが記載されている(Suri等, Cell 87, 1171-1180 (1996))。腫瘍成長に必要な病理的血管形成の間にＴＩＥ-２は明らかにアップレギュレートされるので(Kaipainen等, Cancer Res. 54, 6571-6577 (1994))、アンギオポエチン-１は腫瘍血管を特異的に標的化するのに更に有用であることが示唆された(Davis等, 上掲)。 1. PRO196
The abbreviations “TIE” or “tie” stand for “tyrosine kinase-containing Ig and EGF homology domains” and are expressed almost exclusively in vascular endothelial cells and early hematopoietic cells, EGF-like domains, and generally It was created to represent a novel family of receptor tyrosine kinases characterized by the presence of extracellular folding units stabilized by intrachain disulfide bonds called “immunoglobulin (IG) -like” folding. Tyrosine kinase homologue cDNA fragments from human leukemia cells (tie) are described in Partanen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 8913-8917 (1990). This human “tie” receptor mRNA has been detected in all human fetal and mouse embryonic tissues and is reported to be localized in the heart and vascular endothelial cells. Korhonen et al., Blood 80, 2548-2555 (1992); PCT application publication WO 93/14124 (published July 22, 1993). The rat homologue of human tie is called “tie-1” and was identified by Maisonpierre et al., Oncogene 8, 1631-1637 (1993). Another tie receptor termed “tie-2” was first identified in the rat (Dumont et al., Oncogene 8, 1293-1301 (1993)) and the human homologue of tie-2 termed “ork” is US Pat. No. 5,447,860 (Ziegler). The mouse homologue of tie-2 was initially named “tek”. Cloning of mouse tie-2 receptor from a brain capillary cDNA library is described in PCT application publication WO 95/13387 (published May 18, 1995). TIE receptors are actively involved in angiogenesis and are thought to play a role in hematopoiesis.
Expression cloning of human TIE-2 ligand is described in PCT application publication WO 96/11269 (published 18 April 1996) and US Pat. No. 5,521,073 (issued 28 May 1996). A vector designated λgt10 encoding a TIE-2 ligand designated “htie-2 ligand 1” or “hTL1” was deposited under ATCC accession number 75928. Plasmids encoding other TIE-2 ligands designated “htie-2 2” or “hTL2” are available under ATCC accession number 75928. This second ligand has been described as an antagonist of the TAI-2 receptor. The identification of secreted human and mouse ligands for the TIE-2 receptor is reported in Davis et al., Cell 87, 1161-1169 (1996). The human ligand named “Angiopoietin-1” reflecting its role in angiogenesis and potential effects during hematopoiesis is referred to as “htie-21” or “hTL-1” in WO 96/11269. It is the same ligand as variously called ligands. Angiopoietin-1 has been described to later play a role in angiogenesis and is distinct from VEGF (Suri et al., Cell 87, 1171-1180 (1996)). Since TIE-2 is clearly up-regulated during the pathological angiogenesis necessary for tumor growth (Kaipainen et al., Cancer Res. 54, 6571-6577 (1994)), angiopoietin-1 is associated with tumor blood vessels. It was suggested to be more useful for specific targeting (Davis et al., Supra).

２． ＰＲＯ４４４
新規で未変性の分泌タンパク質を同定するための努力が、産業界と学術界の両方でなされている。多くの努力は、新規な分泌タンパク質のコード配列を同定するための哺乳動物組換えＤＮＡライブラリーのスクリーニングに注がれている。我々は、ここでＰＲＯ４４４ポリペプチドと命名する新規な分泌ポリペプチドをコードするｃＤＮＡ分子の同定と単離をここに記載する。 2. PRO444
Efforts have been made in both industry and academia to identify new, native secreted proteins. Much effort is devoted to the screening of mammalian recombinant DNA libraries to identify novel secretory protein coding sequences. We describe here the identification and isolation of a cDNA molecule encoding a novel secreted polypeptide, designated herein as the PRO444 polypeptide.

３． ＰＲＯ１８３
新規で未変性の分泌タンパク質を同定するための努力が、産業界と学術界の両方でなされている。多くの努力は、新規な分泌タンパク質のコード配列を同定するための哺乳動物組換えＤＮＡライブラリーのスクリーニングに注がれている。我々は、ここでＰＲＯ１８３ポリペプチドと命名する新規な分泌ポリペプチドをコードするｃＤＮＡ分子の同定と単離をここに記載する。 3. PRO183
Efforts have been made in both industry and academia to identify new, native secreted proteins. Much effort is devoted to the screening of mammalian recombinant DNA libraries to identify novel secretory protein coding sequences. We describe here the identification and isolation of a cDNA molecule encoding a novel secreted polypeptide, designated herein as PRO183 polypeptide.

４． ＰＲＯ１８５
新規で未変性の分泌タンパク質を同定するための努力が、産業界と学術界の両方でなされている。多くの努力は、新規な分泌タンパク質のコード配列を同定するための哺乳動物組換えＤＮＡライブラリーのスクリーニングに注がれている。我々は、ここでＰＲＯ１８５ポリペプチドと命名する新規な分泌ポリペプチドをコードするｃＤＮＡ分子の同定と単離をここに記載する。 4). PRO185
Efforts have been made in both industry and academia to identify new, native secreted proteins. Much effort is devoted to the screening of mammalian recombinant DNA libraries to identify novel secretory protein coding sequences. We describe here the identification and isolation of a cDNA molecule encoding a novel secreted polypeptide, designated herein as PRO185 polypeptide.

５． ＰＲＯ２１０及びＰＲＯ２１７
上皮成長因子(ＥＧＦ)は上皮細胞及び線維芽細胞を含む様々なタイプの細胞の増殖を刺激する一般的な***促進因子である。ＥＧＦはＥＧＦレセプター(ＥＧＦＲ)に結合してそれを活性化させ、それが細胞内シグナル伝達及びそれに引き続く効果を開始させる。ＥＧＦＲは中枢神経系(ＣＮＳ)の他の領域に加えて、大脳皮質、小脳、及び海馬のニューロン中で発現される。また、ＥＧＦはＣＮＳの様々な領域において発現される。従って、ＥＧＦは有糸***細胞に対してばかりでなく***終了ニューロンに対しても作用する。実際、多くの研究において、ＥＧＦがＣＮＳ中の様々なタイプのニューロンに神経栄養性及び神経調節性効果を有していることが示されている。例えば、ＥＧＦは培養された大脳皮質及び小脳ニューロンに直接作用し、神経突起成長と生存を亢進する。他方、ＥＧＦはまた中隔コリン作用性及び中脳ドーパミン作用性ニューロンを含む他の細胞型にもグリア細胞を通して間接的に作用する。ＣＮＳ中のニューロンに対するＥＧＦの効果の証拠は蓄積されつつあるが、作用の機構は本質的に知られていないままである。有糸***細胞におけるＥＧＦ-誘発シグナル伝達は細胞***終了ニューロンにおいてよりもよりよく理解されている。クローン化されたクロム親和細胞腫ＰＣ１２細胞と培養された大脳皮質ニューロンの研究により、ＥＧＦ誘発神経栄養性作用がＥＧＦに応答してのＥＧＦＲとマイトジェン活性化プロテインキナーゼ(MAPK)の持続性活性化により媒介されることが示唆されている。持続性細胞内シグナル伝達はＥＧＦＲ下方制御の減少速度と相関し、これはＥＧＦに対するニューロン細胞の応答を決定するかもしれない。ＥＧＦは有糸細胞***細胞及び細胞***終了ニューロンを含む細胞の様々なタイプに作用する多分化能成長因子である可能性が高い。
ＥＧＦは、腎臓、膵臓、甲状腺、脳下垂体、神経系及び胃腸系の唾液腺及びブルンアー腺によりつくられ、体液、例えば唾液、血液、脳脊髄液(ＣＳＦ)、尿、羊水、前立腺液、膵液、及び母乳に見いだされる。Plata-Salaman, Peptides 12: 653-663 (1991)。
ＥＧＦは、内因性チロシンキナーゼを含むその膜特異的レセプターにより媒介される。Stoscheck CM等, J. Cell Biochem. 31: 135-152 (1986)。ＥＧＦは内因性チロシンキナーゼを活性化する膜貫通シグナルを誘発するそのレセプターの細胞外部分に結合することにより機能すると信じられている。
ＥＧＦ様ドメインの精製と配列分析により、交差結合して３つのペプチドループをつくりだす６個の保存システイン残基の存在が明らかになった。Savage CR等, J. Biol. Chem. 248: 7669-7672 (1979)。幾つかの他のペプチドは、Ｘは任意の非システインアミノ酸を表し、ｎは可変の繰り返し数である、同じ一般化されたモチーフＸｎＣＸ7ＣＸ4/5ＣＸ10ＣＸＣＸ5ＧＸ2ＣＸnを共有するＥＧＦレセプターと反応しうることが今は一般的に知られている。このモチーフを有する非単離ペプチドは、ＴＧＦ-α、アンフィレギュリン、シュワン細胞腫由来成長因子(ＳＤＧＦ)、ヘパリン結合ＥＧＦ様成長因子及びある種のウィルス性コード化ペプチド(例えばワクシニアウィルス、Reisner, AH, Nature 313: 801-803 (1985), ショープ線維腫ウィルス、Chang W.等, Mol Cell Biol. 7: 535-540 (1987), 伝染性軟属腫、Porter CD及びArchard, LC, J. Gen. Virol. 68: 673-682 (1987)、及び粘液腫ウィルス、Upton C等, J. Virol. 61: 1271-1275 (1987)、Prigent SA及びLemoine, N.R., Prog. Growth Factor Res.. 4: 1-24 (1992)を含む。
ＥＧＦ様ドメインは成長因子に制限されず、細胞接着、タンパク質−タンパク質相互作用と発達において興味有る性質を有している様々な細胞表面及び細胞外タンパク質において観察されている。Laurence DJR及びGusterson BA, Tumor Biol. 11: 229-261 (1990)。これらのタンパク質は血液凝固因子(因子ＶＩ、ＩＸ、Ｘ、ＸＩＩ、プロテインＣ、プロテインＳ、プロテインＺ、組織プラスミノゲンアクチベーター、ウロキナーゼ)、細胞外マトリックス成分(ラミニン、サイトタクチン、エンタクチン)、細胞表面レセプター(ＬＤＬレセプター、トロンボモジュリンレセプター)及び免疫関連タンパク質(補体Ｃ１ｒ、ウロモジュリン)を含む。
更により興味深いことには、ＥＧＦ様前駆体の一般的構造パターンは下等生物並びに哺乳動物細胞を通して保存されている。発達上の優位性を持つ多くの遺伝子はＥＧＦ様反復を持つ無脊椎動物において同定されている。例えば、ショウジョウバエのnotch遺伝子は、ＥＧＦとの相同性を示す３６の直列に配置された４０のアミノ酸反復をコードしている。Wharton W等, Cell 43: 557-581 (1985)。ヒドロパシープロットは推定膜貫通スパニングドメインを示し、そのＥＤＦ関連配列は膜の細胞外側に位置している。ＥＧＦ様反復を持つ他のホメオティック遺伝子は、Notchに基づくプローブを使用して同定されたデルタ、９５F及び５ＺＤ、及び２つの特定された細胞の間に伝達される発生的シグナルに対する推定レセプターをコードする線虫遺伝子Ｌｉｎ-１２を含む。
特に、ＥＧＦは胃腸粘膜の保存と維持及び急性及び慢性粘膜病状の修復、Konturek, PC等, Eur. J. Gastroenterol Hepatol. 7 (10), 933-37 (1995)で、壊死性腸炎、ゾリンジャー・エリソン症候群、胃腸潰瘍形成及び先天性微絨毛萎縮症、A. Guglietta及び PB Sullivan, Eur. J. Gastroenterol Hepatol, 7(10), 945-50 (1995)の治療における可能性を有していることが示された。また、ＥＧＦは、毛包分化；C.L. du Cros, J. Invest. Dermatol. 101 (1 Suppl.), 106S-113S (1993), SG Hillier, Clin. Endocrinol. 33(4), 427-28 (1990); 腎機能、L.L. Hamm等, Semin. Nephrol. 13(1): 109-15 (1993), RC Harris, Am. J. Kidney Dis. 17(6): 627-30 (1991); 涙液、GB van Settenｔ等, Int. Ophthalmol 15(6); 359-62 (1991);ビタミンＫ媒介血液凝固、J. Stenflo等, Blood 78(7): 1637-51 (1991)に関与していた。ＥＧＦはまた異常なケラチノサイト分化により特徴づけられる様々な皮膚疾患、例えば乾癬、上皮ガン、例えば肺の扁平上皮ガン、外陰部の表皮ガン及び神経膠腫に関連している。King, LE等, Am. J. Med. Sci. 296: 154-158 (1998)。
非常に興味深いのは、成長因子シグナル伝達経路における遺伝的変更が発育異常とガンを含む慢性疾患に密接に関連しているという証拠である。Aaronson SA, Science 254: 1146-1153 (1991)。例えば、ＥＧＦレセプタータンパク質と密接な構造類似性を持つプロトガン遺伝子ｃ-ｅｒｂ-２(またＨＥＲ-２としても知られている)がヒト乳ガンにおいて過剰発現されている。King等, Science 229: 974-976 (1985); Gullick, WJ, Hormones and their actions, Cooke BA等, eds, Amsterdam, Elsevier, pp349-360 (1986)。 5. PRO210 and PRO217
Epidermal growth factor (EGF) is a common mitogen that stimulates the proliferation of various types of cells, including epithelial cells and fibroblasts. EGF binds to and activates the EGF receptor (EGFR), which initiates intracellular signaling and subsequent effects. EGFR is expressed in neurons of the cerebral cortex, cerebellum, and hippocampus, in addition to other areas of the central nervous system (CNS). EGF is also expressed in various regions of the CNS. Thus, EGF acts not only on mitotic cells but also on mitotic neurons. In fact, many studies have shown that EGF has neurotrophic and neuromodulatory effects on various types of neurons in the CNS. For example, EGF acts directly on cultured cerebral cortex and cerebellar neurons to enhance neurite growth and survival. On the other hand, EGF also acts indirectly through glial cells on other cell types, including septal cholinergic and midbrain dopaminergic neurons. Evidence for the effects of EGF on neurons in the CNS is accumulating, but the mechanism of action remains essentially unknown. EGF-induced signaling in mitotic cells is better understood than in mitotic neurons. Studies of cloned pheochromocytoma PC12 cells and cultured cerebral cortical neurons show that EGF-induced neurotrophic effects are due to sustained activation of EGFR and mitogen-activated protein kinase (MAPK) in response to EGF It has been suggested to be mediated. Sustained intracellular signaling correlates with the rate of decrease of EGFR downregulation, which may determine the response of neuronal cells to EGF. EGF is likely a pluripotent growth factor that acts on various types of cells, including mitotic cells and mitotic neurons.
EGF is made by the kidney, pancreas, thyroid, pituitary gland, nervous and gastrointestinal salivary gland and Bruner's gland, and body fluids such as saliva, blood, cerebrospinal fluid (CSF), urine, amniotic fluid, prostate fluid, pancreatic juice, And found in breast milk. Plata-Salaman, Peptides 12: 653-663 (1991).
EGF is mediated by its membrane-specific receptors including endogenous tyrosine kinases. Stoscheck CM et al., J. Cell Biochem. 31: 135-152 (1986). EGF is believed to function by binding to the extracellular portion of its receptor that triggers a transmembrane signal that activates endogenous tyrosine kinases.
Purification and sequence analysis of the EGF-like domain revealed the presence of six conserved cysteine residues that cross-linked to create three peptide loops. Savage CR et al., J. Biol. Chem. 248: 7669-7672 (1979). It is now common that some other peptides can react with EGF receptors that share the same generalized motif XnCX7CX4 / 5CX10CXCX5GX2CXn, where X represents any non-cysteine amino acid and n is a variable repeat number Known. Non-isolated peptides having this motif include TGF-α, amphiregulin, Schwannoma-derived growth factor (SDGF), heparin-binding EGF-like growth factor and certain virally encoded peptides (eg, vaccinia virus, Reisner, AH, Nature 313: 801-803 (1985), Schoop Fibroma virus, Chang W. et al., Mol Cell Biol. 7: 535-540 (1987), Infectious molluscum, Porter CD and Archard, LC, J. Gen. Virol. 68: 673-682 (1987), and myxoma virus, Upton C et al., J. Virol. 61: 1271-1275 (1987), Prigent SA and Lemoine, NR, Prog. Growth Factor Res .. 4 : Including 1-24 (1992).
EGF-like domains are not restricted to growth factors and have been observed on a variety of cell surface and extracellular proteins with properties of interest in cell adhesion, protein-protein interactions and development. Laurence DJR and Gusterson BA, Tumor Biol. 11: 229-261 (1990). These proteins are blood coagulation factors (factors VI, IX, X, XII, protein C, protein S, protein Z, tissue plasminogen activator, urokinase), extracellular matrix components (laminin, cytotactin, entactin), cell surface Receptors (LDL receptor, thrombomodulin receptor) and immune related proteins (complement C1r, uromodulin).
Even more interesting, the general structural pattern of EGF-like precursors is conserved throughout lower organisms as well as mammalian cells. Many genes with developmental dominance have been identified in invertebrates with EGF-like repeats. For example, the Drosophila notch gene encodes 36 amino acid repeats arranged in tandem that show homology to EGF. Wharton W et al., Cell 43: 557-581 (1985). The hydropathy plot shows a putative transmembrane spanning domain whose EDF-related sequence is located outside the membrane. Other homeotic genes with EGF-like repeats encode delta, 95F and 5ZD identified using Notch-based probes, and putative receptors for developmental signals transmitted between the two identified cells. The nematode gene Lin-12.
In particular, EGF is the preservation and maintenance of gastrointestinal mucosa and the repair of acute and chronic mucosal pathology, Konturek, PC, etc., Eur. J. Gastroenterol Hepatol. 7 (10), 933-37 (1995). Potential in the treatment of Ellison syndrome, gastrointestinal ulceration and congenital microvillous atrophy, A. Guglietta and PB Sullivan, Eur. J. Gastroenterol Hepatol, 7 (10), 945-50 (1995) It has been shown. EGF is also known as hair follicle differentiation; CL du Cros, J. Invest. Dermatol. 101 (1 Suppl.), 106S-113S (1993), SG Hillier, Clin. Endocrinol. 33 (4), 427-28 (1990). ); Renal function, LL Hamm et al., Semin. Nephrol. 13 (1): 109-15 (1993), RC Harris, Am. J. Kidney Dis. 17 (6): 627-30 (1991); lacrimal fluid, GB van Settent et al., Int. Ophthalmol 15 (6); 359-62 (1991); Vitamin K mediated blood coagulation, J. Stenflo et al., Blood 78 (7): 1637-51 (1991). EGF is also associated with various skin diseases characterized by abnormal keratinocyte differentiation, such as psoriasis, epithelial cancers such as squamous cell carcinoma of the lung, epidermis cancer of the vulva and glioma. King, LE et al., Am. J. Med. Sci. 296: 154-158 (1998).
Of great interest is evidence that genetic alterations in growth factor signaling pathways are closely related to developmental disorders and chronic diseases including cancer. Aaronson SA, Science 254: 1146-1153 (1991). For example, the protocancer gene c-erb-2 (also known as HER-2), which has close structural similarity to the EGF receptor protein, is overexpressed in human breast cancer. King et al., Science 229: 974-976 (1985); Gullick, WJ, Hormones and their actions, Cooke BA et al., Eds, Amsterdam, Elsevier, pp349-360 (1986).

６． ＰＲＯ２１５
タンパク質-タンパク質相互作用はレセプター及び抗原複合体及びシグナル伝達機構を含む。タンパク質-タンパク質相互作用の基となる構造的及び機能的機構についてよく知られているように、タンパク質-タンパク質相互作用は、タンパク質-タンパク質相互作用の特定の結果を調節するように更に容易に操作することができる。従って、タンパク質-タンパク質相互作用の基となる機構は科学及び医学界にとって興味深い。
ロイシンリッチ反復を含む全てのタンパク質はタンパク質-タンパク質相互作用に関与していると考えられている。ロイシンリッチ反復は多様な機能と細胞位置を持つ多くのタンパク質に存在する短い配列モチーフである。リボヌクレアーゼインヒビタータンパク質の結晶構造から、ロイシンリッチ反復はβ-α構造単位に対応することが明らかになった。これらの単位は、一面が溶媒に暴露された平行なβシートを形成するように配置され、タンパク質は珍しい非球状の形状を獲得している。これらの二つの特徴はロイシンリッチ反復を含むタンパク質のタンパク質結合機能が原因であることが示されている。Kobe及びDeisenhofer, Trends Biochem.Sci., 19(10):415-421 (Oct.1994)を参照されたい。
個体発生の間にコラーゲン原線維を配向させ指令する組織オーガナイザーとなり、創傷治癒、組織修復、及び腫瘍ストローマ形成のような病理プロセスに関与するロイシンリッチプロテオグリカンについての研究が報告されている。Iozzo,R.V., Crit.Rev.Biochem.Mol.Biol., 32(2):141-174 (1997)。創傷治癒及び組織修復におけるロイシンリッチタンパク質の関与を示す他の研究は、De La Salle, C.等, Vouv.Rev.Fr.Hematol. (Germany),37(4):215-222 (1995)であり、出血疾患ベルナール-スーリエ症候群に伴う複合体におけるロイシンリッチモチーフの突然変異を報告しており、Chlemetson,K.J., Thromb.Haemost. (Germany),74(1):111-116 (July 1995)は、血小板がロイシンリッチ反復を有していることを報告している。ロイシンリッチ反復を有することが報告されている他のタンパク質は、アルツハイマー病のような神経変性疾患、パーキンソン病のような神経損傷の治療において、及びガンの診断に対して有用であることが報告されているＳＬＩＴタンパク質であり、エール大学のArtavanistsakonas,S.及びRothberg,J.M.のWO9210518-A1を参照されたい。ロイシンリッチ反復を有するタンパク質の生物学的機能を報告している他の研究には：Tayar,N.等, Mol.Cell Endocrinol., (Ireland), 125(1-2):65-70 (Dec.1996)(ゴナドトロピンレセプター関連)；Miura,Y.等,Nippon Rinsho (Japan), 54(7):1784-1789 (July 1996)(アポトーシス関連)；Harris,P.C.等, J.Am.Soc.Nephrol., 6(4):1125-1133 (Oct.1995)(腎疾患関連)；及びLa Jolla Cancer Research FoundationのRuoslahti, E.I.等のWO9110727-A(トランスフォーミング成長因子βに結合しているデコリンがガンの治療、創傷治癒及び瘢痕化に関与)が含まれる。 6). PRO215
Protein-protein interactions include receptor and antigen complexes and signal transduction mechanisms. As is well known for the structural and functional mechanisms underlying protein-protein interactions, protein-protein interactions are more easily manipulated to modulate specific outcomes of protein-protein interactions. be able to. Thus, the mechanisms underlying protein-protein interactions are of interest to the scientific and medical communities.
All proteins containing leucine-rich repeats are thought to be involved in protein-protein interactions. Leucine-rich repeats are short sequence motifs present in many proteins with diverse functions and cellular locations. The crystal structure of the ribonuclease inhibitor protein revealed that leucine-rich repeats correspond to β-α structural units. These units are arranged to form parallel β-sheets with one side exposed to solvent, and the protein has acquired an unusual non-spherical shape. These two features have been shown to be due to the protein binding function of proteins containing leucine-rich repeats. See Kobe and Deisenhofer, Trends Biochem. Sci., 19 (10): 415-421 (Oct. 1994).
Studies have been reported on leucine-rich proteoglycans that become tissue organizers that direct and direct collagen fibrils during ontogeny and are involved in pathological processes such as wound healing, tissue repair, and tumor stromal formation. Iozzo, RV, Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol., 32 (2): 141-174 (1997). Other studies showing the involvement of leucine-rich proteins in wound healing and tissue repair are described in De La Salle, C. et al., Vouv. Rev. Fr. Hematol. (Germany), 37 (4): 215-222 (1995). And reported mutations in the leucine-rich motif in the complex associated with the bleeding disorder Bernard-Soulier syndrome, Chlemetson, KJ, Thromb. Haemost. (Germany), 74 (1): 111-116 (July 1995) Report that platelets have leucine-rich repeats. Other proteins reported to have leucine-rich repeats have been reported to be useful in the treatment of neurodegenerative diseases such as Alzheimer's disease, nerve damage such as Parkinson's disease, and for cancer diagnosis. See SLIT protein, Artavanistsakonas, S. of Yale University and WO9210518-A1 of Rothberg, JM. Other studies reporting biological functions of proteins with leucine-rich repeats include: Tayar, N. et al., Mol. Cell Endocrinol., (Ireland), 125 (1-2): 65-70 (Dec 1996) (gonadotropin receptor related); Miura, Y. et al., Nippon Rinsho (Japan), 54 (7): 1784-1789 (July 1996) (apoptosis related); Harris, PC et al., J. Am. Soc. Nephrol ., 6 (4): 1125-1133 (Oct. 1995) (renal disease-related); and WO9110727-A (Ruoslahti, EI et al. Of La Jolla Cancer Research Foundation) Treatment, wound healing and scarring).

７． ＰＲＯ２４２、ＰＲＯ１３１８及びＰＲＯ１６００
白血球は単球、マクロファージ、好塩基球、及び好酸球を含み、免疫応答に重要な役割を果たしている。これら細胞はＴ及び／又はＢリンパ球により開始される機構において重要であり、他の炎症性細胞を補充し活性化させ組織破壊に寄与するある範囲のサイトカインを分泌する。
従って、白血球がその適切な目的地まで移動し他の細胞と相互作用する調節プロセスの研究は重要である。現在、白血球は血管壁の内皮細胞に沿って転がることにより損傷を受けたあるいは炎症を起こした組織まで移動すると考えられている。この移動は、セレクチンとそのリガンドの間の一過性の相互作用により媒介される。次に、白血球は血管壁に沿って組織内部まで移動しなければならない。この血液から漏出と管外遊出工程は、またインテグリンとそのリガンドにより媒介される、より安定した白血球−内皮細胞相互作用を促進する細胞活性化を含む。
ケモカインは構造的に関連したポリペプチドサイトカインの大きなファミリーである。これらの分子は白血球の動きを刺激し、異なった炎症状況における白血球の情報交換を説明する。ケモカインは内皮細胞上で特定の接着分子の発現を媒介し、それらが特定の細胞型を活性化する化学誘因物質をつくりだす。また、ケモカインは特定の細胞型の増殖を刺激し活性化を調節する。これらの活動の双方において、ケモカインは高度の標的細胞特異性を示す。
ケモカインファミリーは、二つのアミノ末端システイン残基が直ぐに隣接しているか(Ｃ-Ｃ)、一つのアミノ酸によって分離しているか(Ｃ-Ｘ-Ｃ)に基づいて二つのサブファミリーに分割される。Ｃ-Ｘ-Ｃファミリーのケモカインは一般に好中球と線維芽細胞を活性化させる一方、Ｃ-Ｃケモカインは単球／マクロファージ、好塩基球、好酸球及びＴリンパ球を含むより広範なグループ標的細胞に作用する。両方のサブファミリーの既知のケモカインは、Thomson A. (1994) The Cytokine Handbook, 2nd Ed. Academic Press, N.Y.において概説されているように、多くの多様な細胞型により合成される。
既知のケモカインには、マクロファージ炎症タンパク質アルファ及びベータ(ＭＩＰ-１アルファ及びベータ)、Ｉ-３０９、RANTES、及び単球化学走化性タンパク質(ＭＣＰ-１)が含まれる。
ＭＩＰ-１アルファ及びＭＩＰ-１ベータは、最初は刺激したマウスマクロファージ細胞系から精製され、正常な組織に注射した場合に炎症反応を誘発した。ＭＩＰ-１アルファ及びＭＩＰ-１ベータは６８−６９アミノ酸からなり、それらの成熟した分泌形態では約７０％の同一性を共有する。両方ともマイトジェン、抗-ＣＤ３及びエンドトキシンにより刺激される単球及びＴ細胞、Ｂ細胞で発現し、両方のポリペプチドとも、ヘパリンと結合して単球を刺激する。ＭＩＰ-１アルファは、Ｔリンパ球及び好酸球のＣＤ-８サブセットの化学誘引物質として作用する一方、ＭＩＰ-１ベータはＴリンパ球のＣＤ-４サブセットを化学誘引する。また、これらのタンパク質はマウスの骨髄造血を刺激することが知られている。
RANTESはインターロイキン-１及び-４、形質転換神経因子及びインターフェロン-ガンマにより調節され、Ｔ細胞、血小板、刺激性リウマチ様滑液線維芽細胞、及びいくつかの腫瘍細胞系に発現する。RANTESはリンパ球、単球、好塩基球及び好酸球に影響を及ぼす。RANTESの発現はＴ細胞の刺激時に大幅に低減する。
単球化学走化性タンパク質(ＭＣＰ-１)は７６のアミノ酸のタンパク質であり、多様な薬剤による刺激の際にはほとんど全ての細胞及び組織で発現するようである。しかし、ＭＣＰ-１の標的は単球及び好塩基球に限定されている。これらの細胞では、ＭＣＰ-１はＭＣＰ-１レセプターを誘発する。２つの関連したタンパク質であるＭＣＰ-２とＭＣＰ-３は、それぞれＭＣＰ-１と６２％及び７３％の同一性を有しており、その化学誘引物質特異性及び単球を共有している。
炎症を生じた又は羅患した組織における異常の診断に対する現在の技術は、臨床的徴候の観察又はホルモン、ポリペプチド又は様々な代謝物に対する体の組織又は流体の血清学的な検査に主に依存している。問題はこれらの診断法にある。第１に、患者は疾患の初期段階では臨床的徴候を表さないであろう。第２に、血清学的試験は浸潤性疾患と遺伝的シンドローム間を必ずしも区別しない。従って、発現されたケモカインの同定は、新規な診断法、効果的な治療法の開発、及び分子病原性の理解の助けとして重要である。
ケモカイン分子はSchall TJ(1994)Chemotactic Cytokines：Targets for Therapeutic Development．International Business Communications, Southborough Mass. pp180-270；及びPaul WE(1993)Fundamental Immunology, 3rd Ed. Raven Press, N.Y. pp822-826に概説されている。 7). PRO242, PRO1318 and PRO1600
Leukocytes include monocytes, macrophages, basophils, and eosinophils and play an important role in the immune response. These cells are important in the mechanism initiated by T and / or B lymphocytes and secrete a range of cytokines that recruit and activate other inflammatory cells and contribute to tissue destruction.
Therefore, the study of regulatory processes in which leukocytes move to their proper destination and interact with other cells is important. Currently, white blood cells are thought to travel to damaged or inflamed tissues by rolling along endothelial cells in the vessel wall. This migration is mediated by a transient interaction between selectin and its ligand. Next, the leukocytes must travel along the vessel wall into the tissue. This blood leakage and extravasation process also involves cell activation that promotes more stable leukocyte-endothelial cell interactions mediated by integrins and their ligands.
Chemokines are a large family of structurally related polypeptide cytokines. These molecules stimulate leukocyte movement and explain leukocyte information exchange in different inflammatory situations. Chemokines mediate the expression of specific adhesion molecules on endothelial cells, which create chemoattractants that activate specific cell types. Chemokines also stimulate the proliferation of specific cell types and regulate activation. In both of these activities, chemokines exhibit a high degree of target cell specificity.
The chemokine family is divided into two subfamilies based on whether two amino-terminal cysteine residues are immediately adjacent (CC) or separated by one amino acid (CCX). The C—X—C family chemokines generally activate neutrophils and fibroblasts, while C—C chemokines are a broader group that includes monocytes / macrophages, basophils, eosinophils, and T lymphocytes. Acts on target cells. Known chemokines from both subfamilies are synthesized by many diverse cell types, as outlined in Thomson A. (1994) The Cytokine Handbook, 2nd Ed. Academic Press, NY.
Known chemokines include macrophage inflammatory proteins alpha and beta (MIP-1 alpha and beta), I-309, RANTES, and monocyte chemotactic protein (MCP-1).
MIP-1 alpha and MIP-1 beta were initially purified from stimulated mouse macrophage cell lines and elicited an inflammatory response when injected into normal tissues. MIP-1 alpha and MIP-1 beta consist of 68-69 amino acids and share about 70% identity in their mature secreted form. Both are expressed on monocytes and T cells, B cells stimulated by mitogen, anti-CD3 and endotoxin, both polypeptides bind to heparin and stimulate monocytes. MIP-1 alpha acts as a chemoattractant for the CD-8 subset of T lymphocytes and eosinophils, while MIP-1 beta chemoattracts the CD-4 subset of T lymphocytes. These proteins are also known to stimulate mouse bone marrow hematopoiesis.
RANTES is regulated by interleukin-1 and -4, transforming nerve factor and interferon-gamma and is expressed on T cells, platelets, stimulating rheumatoid synovial fibroblasts, and several tumor cell lines. RANTES affects lymphocytes, monocytes, basophils and eosinophils. RANTES expression is greatly reduced upon stimulation of T cells.
Monocyte chemotactic protein (MCP-1) is a 76 amino acid protein that appears to be expressed in almost all cells and tissues upon stimulation with various drugs. However, MCP-1 targets are limited to monocytes and basophils. In these cells, MCP-1 induces the MCP-1 receptor. Two related proteins, MCP-2 and MCP-3, share 62% and 73% identity with MCP-1, respectively, and share their chemoattractant specificity and monocytes.
Current techniques for diagnosing abnormalities in inflamed or affected tissues rely primarily on observation of clinical signs or serological examination of body tissues or fluids for hormones, polypeptides or various metabolites is doing. The problem lies in these diagnostic methods. First, patients will not present clinical signs in the early stages of the disease. Second, serological tests do not necessarily distinguish between invasive disease and genetic syndromes. Thus, the identification of expressed chemokines is important as an aid in the development of new diagnostic methods, effective treatments, and understanding molecular pathogenicity.
Chemokine molecules are described in Schall TJ (1994) Chemotactic Cytokines: Targets for Therapeutic Development. International Business Communications, Southborough Mass. Pp 180-270; and Paul WE (1993) Fundamental Immunology, 3rd Ed. Raven Press, NY pp 822-826.

８． ＰＲＯ２８８
哺乳動物における細胞数のコントロールは、細胞増殖と細胞死の間のバランスにより部分的に決定されると考えられている。しばしば壊死性細胞死と称される細胞死の一形態は、典型的には、ある種の外傷又は細胞傷害の結果生じる細胞死の病理的形態として特徴づけられる。これに対して、通常は規則的又はコントロールされた状態で進行する細胞死の他の「生理的」形態がある。細胞死のこの規則的又はコントロールされた形態は、しばしば「アポトーシス」と称される［例えば、Barr等, Bio/Technology, 12：487-493(1994)；Steller等, Science, 267：1445-1449(1995)を参照］。アポトーシス性細胞死は、免疫系におけるクローン選択と胚の発達を含む多くの生理的プロセスにおいて自然に生じる［Itoh等, Cell, 66：233-243(1991)］。アポトーシス性細胞死のレベルの減少は、ガン、狼瘡、及び疱疹ウイスル感染を含む種々の病理的条件に関連している［Thompson, Science, 267：1456-1462(1995)］。アポトーシス性細胞死のレベルの増加は、エイズ、アルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、多発性硬化症、色素性網膜炎、小脳変性、無形成性貧血、心筋梗塞、脳卒中、再灌流傷害、及び毒素誘発性肝疾患を含む様々な他の病理状態に関連している［上掲のThompsonを参照されたい］。
典型的には、アポトーシス性細胞死には、細胞内における一又は複数の特徴的な形態学的及び生化学的変化、例えば細胞質の凝結、原形質膜の微絨毛の喪失、核の分節化、染色体ＤＮＡの分解又はミトコンドリア機能の喪失が伴う。様々な外因的及び内因的シグナルが、このような形態学的及び生化学的な細胞変化を惹起又は誘発すると考えられている［Raff, Nature, 356：397-400(1992)；Steller, 上掲；Sachsら, Blood, 82：15(1993)］。例えば、ホルモンの刺激、例えば未成熟胸腺細胞に対する糖質コルチコイドホルモン、並びにある種の成長因子の退薬により惹起され得る［Watanabe-Fukunaga等, Nature, 356：314-317(1992)］。また、幾つかの同定された発ガン遺伝子、例えばｍｙｃ、ｒｅｌ、及びＥ１Ａ、及び腫瘍サプレッサー、例えばｐ５３が、アポトーシスを誘発する際にある役割を有していることも報告されている。ある種の化学療法薬及びある種の放射線も同様にアポトーシス誘発活性を有していることも知見されている［Thompson, 上掲］。 8). PRO288
Control of cell number in mammals is thought to be determined in part by the balance between cell proliferation and cell death. One form of cell death, often referred to as necrotic cell death, is typically characterized as a pathological form of cell death resulting from some type of trauma or cell injury. In contrast, there are other “physiological” forms of cell death that normally proceed in a regular or controlled manner. This regular or controlled form of cell death is often referred to as “apoptosis” [eg, Barr et al., Bio / Technology, 12: 487-493 (1994); Steller et al., Science, 267: 1445-1449. (1995)]. Apoptotic cell death occurs naturally in many physiological processes, including clonal selection in the immune system and embryo development [Itoh et al., Cell, 66: 233-243 (1991)]. Reduced levels of apoptotic cell death are associated with a variety of pathological conditions including cancer, lupus, and herpes virus infection [Thompson, Science, 267: 1456-1462 (1995)]. Increased levels of apoptotic cell death are seen in AIDS, Alzheimer's disease, Parkinson's disease, amyotrophic lateral sclerosis, multiple sclerosis, retinitis pigmentosa, cerebellar degeneration, aplastic anemia, myocardial infarction, stroke, relapse It is associated with various other pathological conditions including perfusion injury and toxin-induced liver disease [see Thompson, supra].
Apoptotic cell death typically involves one or more characteristic morphological and biochemical changes within the cell, such as cytoplasmic coagulation, loss of plasma membrane microvilli, nuclear segmentation, chromosomes It involves DNA degradation or loss of mitochondrial function. A variety of exogenous and intrinsic signals are believed to cause or induce such morphological and biochemical cellular changes [Raff, Nature, 356: 397-400 (1992); Steller, supra. Sachs et al., Blood, 82:15 (1993)]. For example, it can be triggered by hormone stimulation, such as glucocorticoid hormones on immature thymocytes, as well as withdrawal of certain growth factors [Watanabe-Fukunaga et al., Nature, 356: 314-317 (1992)]. It has also been reported that several identified oncogenes, such as myc, rel, and E1A, and tumor suppressors, such as p53, have a role in inducing apoptosis. It has also been found that certain chemotherapeutic drugs and certain radiations have apoptosis-inducing activity as well [Thompson, supra].

様々な分子、例えば腫瘍壊死因子-α(「ＴＮＦ-α」)、腫瘍壊死因子-β(「ＴＮＦ-β」又は「リンホトキシン」)、ＣＤ３０リガンド、ＣＤ２７リガンド、ＣＤ４０リガンド、ＯＸ-４０リガンド、４-１ＢＢリガンド、Ａｐｏ-１リガンド(Ｆａｓリガンド又はＣＤ９５リガンドとも称される)、及びＡｐｏ-２リガンド(トレイル(TRAIL)とも称される)が、サイトカインの腫瘍壊死因子(「ＴＮＦ」)ファミリーのメンバーとして同定されている［例えば、Gruss及びDower, Blood, 85：3378-3404(1995)；Wiley等, Immunity, 3：673-682(1995)；Pitti等, J. Biol. Chem., 271：12687-12690(1996)を参照されたい］。これらの分子のなかでも、ＴＮＦ-α、ＴＮＦ-β、ＣＤ３０リガンド、４-１ＢＢリガンド、Ａｐｏ-１リガンド、及びＡｐｏ-２リガンド(TRAIL)が、アポトーシス性細胞死に関与していることが報告されている。ＴＮＦ-αとＴＮＦ-βの両方とも、感受性腫瘍細胞におけるアポトーシス性死を誘発することが報告されている［Schmid等, Proc. Natl. Acad. Sci., 83：1881(1986)；Dealtry等, Eur. J. Immunol., 17：689(1987)］。Zheng等は、ＴＮＦ-αがＣＤ８陽性Ｔ細胞の刺激後アポトーシスに関与していることを報告している［Zheng等, Nature, 377：348-351(1995)］。他の研究者は、ＣＤ３０リガンドが胸腺における自己反応性Ｔ細胞の欠失に関与していることを報告している［Amakawa等, プログラム細胞死に関するコールドスプリングハーバー研究所のシンポジウム、要約集、第10巻、(1995)］。
マウスのＦａｓ／Ａｐｏ-１レセプター又はリガンド遺伝子(それぞれｌｐｒ及びｇｌｄと呼ばれる)における突然変異は幾つかの自己免疫疾患に関連しており、Ａｐｏ-１リガンドが末梢の自己反応性リンパ球のクローン欠失を調節する役割を担っていることを示している［Krammer等, Curr. Op. Immunol., 6：279-289(1994)；Nagata等, Science, 267：1449-1456(1995)］。また、Ａｐｏ-１リガンドは、ＣＤ４陽性Ｔリンパ球及びＢリンパ球において刺激後アポトーシスを誘発することが報告されており、それらの機能がもはや必要でなくなった際の活性化リンパ球の除去に関与している［Krammer等, 上掲；Nagata等, 上掲］。Ａｐｏ-１レセプターと特異的に結合するアゴニストマウスモノクローナル抗体は、ＴＮＦ-αに匹敵するか類似する細胞死滅活性を示すことが報告されている［Yonehara等, J. Exp. Med., 169：1747-1756(1989)］。 Various molecules such as tumor necrosis factor-α (“TNF-α”), tumor necrosis factor-β (“TNF-β” or “lymphotoxin”), CD30 ligand, CD27 ligand, CD40 ligand, OX-40 ligand, 4 -1BB ligand, Apo-1 ligand (also referred to as Fas ligand or CD95 ligand), and Apo-2 ligand (also referred to as TRAIL) are members of the cytokine tumor necrosis factor ("TNF") family [For example, Gruss and Dower, Blood, 85: 3378-3404 (1995); Wiley et al., Immunity, 3: 673-682 (1995); Pitti et al., J. Biol. Chem., 271: 12687. -12690 (1996)]. Among these molecules, TNF-α, TNF-β, CD30 ligand, 4-1BB ligand, Apo-1 ligand, and Apo-2 ligand (TRAIL) have been reported to be involved in apoptotic cell death. ing. Both TNF-α and TNF-β have been reported to induce apoptotic death in susceptible tumor cells [Schmid et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 83: 1881 (1986); Eur. J. Immunol., 17: 689 (1987)]. Zheng et al. Report that TNF-α is involved in apoptosis after stimulation of CD8 positive T cells [Zheng et al., Nature, 377: 348-351 (1995)]. Other researchers have reported that CD30 ligand is involved in the deletion of autoreactive T cells in the thymus [Amakawa et al., Cold Spring Harbor Laboratory Symposium, Summary, 10 (1995)].
Mutations in the mouse Fas / Apo-1 receptor or ligand genes (referred to as lpr and gld, respectively) are associated with several autoimmune diseases, and Apo-1 ligand is a clonal deficiency of peripheral autoreactive lymphocytes. It has been shown to play a role in regulating loss [Krammer et al., Curr. Op. Immunol., 6: 279-289 (1994); Nagata et al., Science, 267: 1449-1456 (1995)]. Apo-1 ligand has also been reported to induce post-stimulation apoptosis in CD4-positive T lymphocytes and B lymphocytes and is involved in the removal of activated lymphocytes when their function is no longer required [Krammer et al., Supra; Nagata et al., Supra]. Agonist mouse monoclonal antibodies that specifically bind to the Apo-1 receptor have been reported to show cell killing activity comparable or similar to TNF-α [Yonehara et al., J. Exp. Med., 169: 1747 -1756 (1989)].

このようなＴＮＦファミリーのサイトカインが介在する種々の細胞反応誘導は、特異的な細胞レセプターに結合することにより開始されると考えられている。約５５-ｋＤａ(ＴＮＦＲ１)と７５-ｋＤａ(ＴＮＦＲ２)の２つの異なるＴＮＦレセプターが同定されており［Hohman等, J. Biol. Chem., 264：14927-14934(1989)；Brockhaus等, Proc. Natl. Acad. Sci., 87：3127-3131(1990)；1991年3月20日に公開されたEP417,563］、双方のレセプター型に対応するヒト及びマウスｃＤＮＡが単離され、特徴づけされている［Loetscher等, Cell, 61：351(1990)；Schall等, Cell, 61：361(1990)；Smith等, Science, 248：1019-1023(1990)；Lewis等, Proc. Natl. Acad. Sci., 88：2830-2834(1991)；Goodwin等, Mol. Cell. Biol., 11：3020-3026(1991)］。広範な多型性が、双方のＴＮＦレセプター遺伝子に関連している［例えば、Takao等, Immunogenetics, 37：199-203(1993)を参照］。双方のＴＮＦＲは細胞外、膜貫通及び細胞内領域を含む細胞表面のレセプターの典型的な構造を共有する。双方のレセプターの細胞外部分はまた可溶性ＴＮＦ結合タンパク質として天然に見出される［Nophar, Y等, EMBO J., 9：3269(1990)；及びKohno, T等, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 87：8331(1990)］。更に最近になって、組換え体可溶性ＴＮＦレセプターのクローニングがHale等［J. Cell. Biochem. 増補15F, 1991, p.113(P424)］により報告されている。
１型又は２型のＴＮＦＲ(ＴＮＦＲ１及びＴＮＦＲ２)の細胞外部分は、ＮＨ２末端から出発して、１〜４とされる４つのシステインに富んだドメイン(ＣＲＤ)の反復アミノ酸配列パターンを含む。各ＣＲＤは約４０のアミノ酸長のものであり、良好に保存された位置に４〜６のシステイン残基を含んでいる［Schall等, 上掲；Loetscher等, 上掲；Smith等, 上掲；Nophar等, 上掲；Kohno等, 上掲］。ＴＮＦＲ１において、４つのＣＲＤのおおよその境界は次の通りである：ＣＲＤ１-１４から約５３までのアミノ酸；ＣＲＤ２-約５４から約９７までのアミノ酸；ＣＲＤ３-約９８から約１３８までのアミノ酸；ＣＲＤ４-約１３９から約１６７までのアミノ酸。ＴＮＦＲ２において、ＣＲＤ１は、１７〜約５４までのアミノ酸を、ＣＲＤ２は約５５から約９７までのアミノ酸を；ＣＲＤ３は約９８から約１４０までのアミノ酸を；ＣＲＤ４は約１４１から約１７９までのアミノ酸を含む［Banner等, Cell, 73：431-435(1993)］。また、リガンド結合におけるＣＲＤの可能な役割は前掲のBanner等により記載されている。 Induction of various cellular responses mediated by such TNF family cytokines is thought to be initiated by binding to specific cell receptors. Two different TNF receptors of approximately 55-kDa (TNFR1) and 75-kDa (TNFR2) have been identified [Hohman et al., J. Biol. Chem., 264: 14927-14934 (1989); Brockhaus et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 87: 3127-3131 (1990); EP417,563 published March 20, 1991], human and mouse cDNAs corresponding to both receptor types have been isolated and characterized. [Loetscher et al., Cell, 61: 351 (1990); Schall et al., Cell, 61: 361 (1990); Smith et al., Science, 248: 1019-1023 (1990); Lewis et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 88: 2830-2834 (1991); Goodwin et al., Mol. Cell. Biol., 11: 3020-3026 (1991)]. A wide range of polymorphisms are associated with both TNF receptor genes [see, eg, Takao et al., Immunogenetics, 37: 199-203 (1993)]. Both TNFRs share the typical structure of cell surface receptors including extracellular, transmembrane and intracellular regions. The extracellular portions of both receptors are also found naturally as soluble TNF binding proteins [Nophar, Y et al., EMBO J., 9: 3269 (1990); and Kohno, T et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA , 87: 8331 (1990)]. More recently, cloning of recombinant soluble TNF receptors has been reported by Hale et al. [J. Cell. Biochem. Augmented 15F, 1991, p.113 (P424)].
The extracellular portion of type 1 or type 2 TNFR (TNFR1 and TNFR2) contains a repetitive amino acid sequence pattern of four cysteine-rich domains (CRDs) starting from the NH 2 terminus and taken as 1-4. Each CRD is about 40 amino acids long and contains 4-6 cysteine residues in well-conserved positions [Schall et al., Supra; Loetscher et al., Supra; Smith et al., Supra; Nophar et al., Supra; Kohno et al., Supra]. In TNFR1, the approximate boundaries of the four CRDs are as follows: CRD1-14 to about 53 amino acids; CRD2 to about 54 to about 97 amino acids; CRD3 to about 98 to about 138 amino acids; CRD4 -About 139 to about 167 amino acids. In TNFR2, CRD1 contains from 17 to about 54 amino acids, CRD2 contains from about 55 to about 97 amino acids; CRD3 contains from about 98 to about 140 amino acids; CRD4 contains from about 141 to about 179 amino acids. [Banner et al., Cell, 73: 431-435 (1993)]. The possible role of CRD in ligand binding is described by Banner et al.

ＣＲＤの類似の反復パターンが、ｐ７５神経成長因子レセプター(ＮＧＦＲ)［Johnson等, Cell, 47：545(1986)；Radeke等, Nature, 325：593(1987)］、Ｂ細胞抗原ＣＤ４０［Stamenkovic等, EMBO J., 8：1403(1989)］、Ｔ細胞抗原ＯＸ４０［Mallet等, EMBO J., 9：1063(1990)］及びＦａｓ抗原［Yonehara等, 上掲、及びItoh等, Cell, 66:233-243(1991)］を含むいくつかの他の細胞表面タンパク質に存在している。また、ＣＲＤはショープ(Shope)及び粘液腫ポックスウィルスの可溶型ＴＮＦＲ(ｓＴＮＦＲ)様のＴ２タンパク質にも見出されている［Upton等, Virology, 160：20-29(1987)；Smith等, Biochem. Biophys. Res. Commun., 176：335(1991)；Upton等, Virology, 184：370(1991)］。これらの配列の最適なアラインメントは、システイン残基の位置が良好に保存されていることを示している。これらレセプターは、しばしば集合的に、ＴＮＦ／ＮＧＦレセプタースーパーファミリーのメンバーと称される。ｐ７５ＮＧＦＲに関する最近の研究では、このドメインにおけるＣＲＤ１の欠失［Welcher, A.A.等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88：159-163(1991)］又は5-アミノ酸の挿入［Yan. H及びChao, M.V., J. Biol. Chem., 266：12099-12104(1991)］は、ＮＧＦ結合には殆ど又は全く影響を持たないことが示されている［Yan. H及びChao, M.V., 上掲］。ｐ７５ＮＧＦＲはＮＧＦ結合に関与せず、そのＣＲＤ４と膜貫通領域の間に約６０のアミノ酸のプロリンに富んだ伸展を含む［Peetre, C等, Eur. J. Hematol.、41：414-419(1988)；Seckinger, P等, J. Biol. Chem., 264：11966-11973(1989)；Yan. H及びChao, M.V., 上掲］。同様のプロリンに富んだ領域はＴＮＦＲ２に見出されているが、ＴＮＦＲ１にはない。
Itoh等は、Ａｐｏ-１レセプターが、５５-ｋＤａのＴＮＦＲ１によりシグナル化されるものと同様のアポトーシス性細胞死をシグナル化し得ることを開示している［Itoh等, 上掲］。また、Ａｐｏ-１抗原の発現は、細胞をＴＮＦ-α又は抗Ａｐｏ-１のマウスモノクローナル抗体で処理した場合に、ＴＮＦＲ１のものと共にダウンレギュレーションされることが報告されている［Krammer等, 上掲；Nagata等, 上掲］。従って、Ａｐｏ-１及びＴＮＦ-Ｒ１レセプターの双方を同時発現する細胞系が、共通のシグナル伝達経路を通して細胞死を媒介しているとの仮説を唱える研究者もいた［同］。
今日までに同定されているＴＮＦファミリーのリガンドは、リンホトキシン-αを除き、ＩＩ型の膜貫通タンパク質であり、そのＣ末端は細胞外にある。これに対して、今日までに同定されているＴＮＦレセプター(ＴＮＦＲ)ファミリーのレセプターはＩ型の膜貫通タンパク質である。しかしながら、ＴＮＦリガンド及びレセプターファミリーの双方において、ファミリーメンバー間で同定された相同性は、主として細胞外ドメイン(「ＥＣＤ」)において見出されている。ＴＮＦ-α、Ａｐｏ-１リガンド及びＣＤ４０リガンドを含むＴＮＦファミリーサイトカインのいくつかは、細胞表面においてタンパク分解的に切断され；各場合に得られたタンパク質は、典型的には、可溶性サイトカインとして機能するホモ三量体分子を形成する。また、ＴＮＦレセプターファミリーのタンパク質は、通常、タンパク分解的に切断され、同族のサイトカインの阻害剤として機能し得る可溶性レセプターのＥＣＤを放出する。 A similar repetitive pattern of CRD is the p75 nerve growth factor receptor (NGFR) [Johnson et al., Cell, 47: 545 (1986); Radeke et al., Nature, 325: 593 (1987)], B cell antigen CD40 [Stamenkovic et al., EMBO J., 8: 1403 (1989)], T cell antigen OX40 [Mallet et al., EMBO J., 9: 1063 (1990)] and Fas antigen [Yonehara et al., Supra, and Itoh et al., Cell, 66: 233 -243 (1991)] is present in several other cell surface proteins. CRD has also been found in soluble TNFR (sTNFR) -like T2 proteins of Shope and myxoma poxvirus [Upton et al., Virology, 160: 20-29 (1987); Smith et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 176: 335 (1991); Upton et al., Virology, 184: 370 (1991)]. The optimal alignment of these sequences shows that the positions of cysteine residues are well conserved. These receptors are often collectively referred to as members of the TNF / NGF receptor superfamily. Recent studies on p75NGFR have shown that deletion of CRD1 in this domain [Welcher, AA et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88: 159-163 (1991)] or 5-amino acid insertion [Yan. Chao, MV, J. Biol. Chem., 266: 12099-12104 (1991)] has been shown to have little or no effect on NGF binding [Yan. H and Chao, MV, supra. ]. p75NGFR is not involved in NGF binding and contains a proline-rich extension of about 60 amino acids between its CRD4 and transmembrane region [Peetre, C et al., Eur. J. Hematol., 41: 414-419 (1988). Seckinger, P et al., J. Biol. Chem., 264: 11966-11973 (1989); Yan. H and Chao, MV, supra]. A similar proline-rich region is found in TNFR2, but not in TNFR1.
Itoh et al. Disclose that the Apo-1 receptor can signal apoptotic cell death similar to that signaled by 55-kDa TNFR1 [Itoh et al., Supra]. It has also been reported that the expression of Apo-1 antigen is down-regulated with that of TNFR1 when cells are treated with TNF-α or anti-Apo-1 mouse monoclonal antibody [Krammer et al., Supra. ; Nagata et al, supra]. Thus, some researchers hypothesized that cell lines that co-express both Apo-1 and TNF-R1 receptors mediate cell death through a common signaling pathway [ibid].
The TNF family ligands identified to date are type II transmembrane proteins, with the exception of lymphotoxin-α, whose C-terminus is extracellular. In contrast, the TNF receptor (TNFR) family of receptors identified to date are type I transmembrane proteins. However, homology identified between family members in both the TNF ligand and receptor families has been found primarily in the extracellular domain ("ECD"). Some of the TNF family cytokines, including TNF-α, Apo-1 ligand and CD40 ligand, are proteolytically cleaved at the cell surface; the resulting protein in each case typically functions as a soluble cytokine Forms homotrimeric molecules. TNF receptor family proteins are also usually proteolytically cleaved to release soluble receptor ECDs that can function as inhibitors of cognate cytokines.

最近になって、ＴＮＦＲファミリーの他のメンバーが同定された。Marsters等、Curr. Biol., 6：750(1996)において、研究者は、細胞外のシステインに富んだ反復においてＴＮＦＲファミリーに対して類似性を示し、細胞質死亡ドメイン配列を含む点でＴＮＦＲ１及びＣＤ９５に似ており、Ａｐｏ-３と称される、ヒトのポリペプチド天然配列の全長を記載している［Marsters等,Curr. Biol., 6：1669(1996)もまた参照されたい］。他の研究者によれば、Ａｐｏ-３は、ＤＲ３、ｗｓｌ-１及びＴＲＡＭＰとも称されている［Chinnaiyan等, Science, 274：990(1996)；Kitson等, Nature, 384：372(1996)；Bodmer等, Immunity, 6：79(1997)］。
Pan等は、「ＤＲ４」と称される他のＴＮＦレセプターファミリーのメンバーを開示している［Pan等, Science, 276：111-113(1997)］。ＤＲ４は細胞自殺器を活動させる細胞質死亡ドメインを含むと報告されている。Pan等は、ＤＲ４がＡｐｏ-２リガンド又はＴＲＡＩＬとして知られているリガンドに対するレセプターであると考えられることを開示している。
Sheridan等, Science, 277:818-821(1997)及びPan等, Science, 277:815-818(1997)には、Ａｐｏ-２リガンド(TRAIL)に対するレセプターであると考えられている他の分子が記載されている。その分子はＤＲ５と称されている(またApo-2とも称されている)。同様に、ＤＲ４、ＤＲ５は細胞質死亡ドメインを含み、アポトーシスをシグナル伝達しうることが報告されている。
Sheridan等, 上掲,において、ＤｃＲ１(又はApo-2DcR)と呼ばれるレセプターは、Ａｐｏ-２リガンド(TRAIL)に対する可能なデコイレセプター(decoy receptor)であるとして開示されている。Sheridan等は、ＤｃＲ１がＡｐｏ-２リガンドの機能をインビトロで阻害可能であると報告している。また、ＴＲＩＤと称されるデコイレセプターの開示については、Pan等, 上掲,が参照される。
現在理解されているように、細胞死プログラムは、少なくとも３つの重要な要素-活性化因子、インヒビター及びエフェクターを含む；線虫(C. elegans)において、これらの成分はそれぞれ３つの遺伝子、Ｃｅｄ-４、Ｃｅｄ-９及びＣｅｄ-３によりコード化されている［Steller, Science, 267:1445(1995)；Chinnaiyan等, Science, 275:1122-1126(1997)；Wang等, Cell, 90:1-20(1997)］。ＴＮＦＲファミリーのメンバーの２つ、ＴＮＦＲ１及びＦａｓ／Ａｐｏｌ(CD95)は、アポトーシス性細胞死を活性化しうる［Chinnaiyan及びDixit, Current Biology, 6：555-562(1996)；Fraser及びEvan, Cell, 85：781-784(1996)］。また、ＴＮＦＲ１は、転写因子、ＮＦ-κＢの活性化を媒介することも知られている［Tartaglia等, Cell, 74：845-853(1993)；Hsu等, Cell, 84：299-308(1996)］。ある程度のＥＣＤ相同性に加えて、これら２つのレセプターは、死亡ドメインとして知られているオリゴマー形成界面の細胞内ドメイン(ICD)での相同性を共有する［Tartaglia, 上掲；Nagata, Cell, 88：355(1997)］。また、死亡ドメインはアポトーシスを調節する幾つかの後生動物タンパク質、すなわちショウジョウバエタンパク質、リーパー(Reaper)、及びＦＡＤＤ／ＭＯＲＴ１、ＴＲＡＤＤ及びＲＩＰと称される哺乳動物タンパク質中においても見出されている［Cleaveland及びIhle, Cell, 81：479-482(1995)］。Ravenらは、酵母-二重ハイブリッド系を使用して、ＴＮＦＲ１死亡ドメインに結合するタンパク質ｗｓｌ-１の同定を報告している［Ravenら, Programmed Cell Death Meeting, 9月20-24日,1995年,127頁の要約；Ravenら, European Cytokine Network, 7：210頁の要約82(1996年4-6月); また、Kitsonら, Nature, 384: 372-375(1996)］。ｗｓｌ-１タンパク質はＴＮＦＲ１に相同で(４８％の同一性)、制限された組織分布を有すると記載されている。Ravenらに依れば、ｗｓｌ-１の組織分布は、ＴＮＦＲ１結合タンパク質、ＴＲＡＤＤとは顕著に異なる。 Recently, other members of the TNFR family have been identified. In Marsters et al., Curr. Biol., 6: 750 (1996), researchers have shown similarity to the TNFR family in extracellular cysteine-rich repeats and include TNFR1 and CD95 in that they contain cytoplasmic death domain sequences. And describes the full-length human polypeptide native sequence, termed Apo-3 [see also Marsters et al., Curr. Biol., 6: 1669 (1996)]. According to other researchers, Apo-3 has also been referred to as DR3, wsl-1 and TRAMP [Chinnaiyan et al., Science, 274: 990 (1996); Kitson et al., Nature, 384: 372 (1996); Bodmer et al., Immunity, 6:79 (1997)].
Pan et al. Discloses another member of the TNF receptor family termed “DR4” [Pan et al., Science, 276: 111-113 (1997)]. DR4 has been reported to contain a cytoplasmic death domain that activates cell suicides. Pan et al. Disclose that DR4 is thought to be a receptor for a ligand known as Apo-2 ligand or TRAIL.
Sheridan et al., Science, 277: 818-821 (1997) and Pan et al., Science, 277: 815-818 (1997) include other molecules that are thought to be receptors for Apo-2 ligand (TRAIL). Are listed. The molecule is called DR5 (also called Apo-2). Similarly, it has been reported that DR4 and DR5 contain a cytoplasmic death domain and can signal apoptosis.
In Sheridan et al., Supra, a receptor called DcR1 (or Apo-2DcR) is disclosed as being a possible decoy receptor for Apo-2 ligand (TRAIL). Sheridan et al. Report that DcR1 can inhibit the function of Apo-2 ligand in vitro. For disclosure of a decoy receptor called TRID, see Pan et al., Supra.
As currently understood, the cell death program includes at least three important elements—activators, inhibitors and effectors; in C. elegans, each of these components comprises three genes, Ced- 4, encoded by Ced-9 and Ced-3 [Steller, Science, 267: 1445 (1995); Chinnaiyan et al., Science, 275: 1122-1126 (1997); Wang et al., Cell, 90: 1- 20 (1997)]. Two members of the TNFR family, TNFR1 and Fas / Apol (CD95), can activate apoptotic cell death [Chinnaiyan and Dixit, Current Biology, 6: 555-562 (1996); Fraser and Evan, Cell, 85 : 781-784 (1996)]. TNFR1 is also known to mediate activation of a transcription factor, NF-κB [Tartaglia et al., Cell, 74: 845-853 (1993); Hsu et al., Cell, 84: 299-308 (1996). )]. In addition to some degree of ECD homology, these two receptors share homology in the intracellular domain (ICD) of the oligomerization interface known as the death domain [Tartaglia, supra; Nagata, Cell, 88 : 355 (1997)]. Death domains have also been found in several metazoan proteins that regulate apoptosis: Drosophila protein, Reaper, and mammalian proteins called FADD / MORT1, TRADD and RIP [Cleaveland] And Ihle, Cell, 81: 479-482 (1995)]. Have reported the identification of the protein wsl-1 that binds to the TNFR1 death domain using a yeast-double hybrid system [Raven et al., Programmed Cell Death Meeting, September 20-24, 1995. 127, summary; Raven et al., European Cytokine Network, 7: 210 summary 82 (April-June 1996); Kitson et al., Nature, 384: 372-375 (1996)]. The wsl-1 protein is described as being homologous to TNFR1 (48% identity) and having a restricted tissue distribution. According to Raven et al., The tissue distribution of wsl-1 is significantly different from the TNFR1 binding protein, TRADD.

リガンド結合及びレセプターのクラスター形成の際に、ＴＮＦＲ１とＣＤ９５は死亡誘発性シグナル伝達複合体にＦＡＤＤを補充するものと考えられている。言われるところによれば、ＣＤ９５はＦＡＤＤに直接結合する一方、ＴＮＦＲ１はＴＲＡＤＤを介して間接的にＦＡＤＤに結合する［Chinnaiyan等, Cell, 81：505-512(1995)；Boldin等, J. Biol. Chem., 270：387-391(1995)；Hsu等, 上掲；Chinnaiyan等, J. Biol. Chem., 271：4961-4965(1996)］。ＦＡＤＤは、Ｃｅｄ-３-関連プロテアーゼ、ＭＡＣＨα／ＦＬＩＣＥ(カスパーゼ８)を、死亡シグナル伝達複合体に補充するアダプタータンパク質として供給されることが報告されている［Boldin等, Cell, 85：803-815(1996)；Muzio等, Cell, 85：817-827(1996)］。ＭＡＣＨα／ＦＬＩＣＥは、細胞死プログラムの幾つかの重要な側面を実施し得る、インターロイキン-１β変換酵素(ＩＣＥ)及びＣＰＰ３２／Ｙａｍａを含むアポトーシス性プロテアーゼのカスケードを引き起こすトリガーであることは明らかである［Fraser及びEvan, 上掲］。
プログラム細胞死が、線虫の細胞死遺伝子、ｃｅｄ-３、及び哺乳動物のＩＬ-１-変換酵素、ＩＣＥに関連したシステインプロテアーゼファミリーのメンバーの活性に関与していることが最近開示された。ＩＣＥ及びＣＰＰ３２／Ｙａｍａプロテアーゼの活性は、牛痘ウイルス遺伝子、ｃｒｍＡの産物により阻害されうる［Ray等, Cell, 69：597-604(1992)；Tewari等, Cell, 81：801-809(1995)］。最近の研究では、ＣｒｍＡがＴＮＦＲ１-及びＣＤ９５-誘発細胞死を阻害しうることが示されている［Enari等, Nature, 375：78-81(1995)；Tewari等, J. Biol. Chem., 270：3255-3260(1995)］。
Tewari等により最近レビューされているように、ＴＮＦＲ１、ＴＮＦＲ２及びＣＤ４０は、転写因子、ＮＦ-κＢの活性化により、炎症誘発性及び同時刺激性サイトカイン、サイトカインレセプター、及び細胞接着分子の発現を変調する［Tewari等, Curr. Op. Genet. Develop., 6：39-44(1996)］。ＮＦ-κＢは、そのサブユニットが保存Ｒｅｌ領域を含む二量体転写因子のファミリーの原型である［Verma等, Genes Develop., 9：2723-2735(1996)；Baldwin, Ann. Rev. Immunol., 14：649-681(1996)］。その潜伏形態において、ＮＦ-κＢはＩκＢーインヒビターファミリーのメンバーと複合化しており；所定の刺激に反応してＩκＢの不活性化の際に、放出されたＮＦ-κＢが、特異的ＤＮＡ配列と結合する核に転座して遺伝子転写を活性化する。
サイトカインのＴＮＦファミリーとそれらのレセプターについてのレビューとしては、Gruss及びDower, 上掲を参照のこと。 Upon ligand binding and receptor clustering, TNFR1 and CD95 are thought to recruit FADD to the mortality-inducing signaling complex. It is said that CD95 binds directly to FADD while TNFR1 binds indirectly to FADD via TRADD [Chinnaiyan et al., Cell, 81: 505-512 (1995); Boldin et al., J. Biol Chem., 270: 387-391 (1995); Hsu et al., Supra; Chinnaiyan et al., J. Biol. Chem., 271: 4961-4965 (1996)]. FADD has been reported to be supplied as an adapter protein that recruits the Ced-3-related protease, MACHα / FLICE (caspase 8) to the death signaling complex [Boldin et al., Cell, 85: 803-815. (1996); Muzio et al., Cell, 85: 817-827 (1996)]. It is clear that MACHα / FLICE is a trigger that triggers a cascade of apoptotic proteases, including interleukin-1β converting enzyme (ICE) and CPP32 / Yama, that can implement several important aspects of the cell death program [Fraser and Evan, supra].
It has recently been disclosed that programmed cell death is involved in the activity of the nematode cell death gene, ced-3, and a member of the cysteine protease family related to mammalian IL-1-converting enzyme, ICE. The activity of ICE and CPP32 / Yama protease can be inhibited by the product of cowpox virus gene, crmA [Ray et al., Cell, 69: 597-604 (1992); Tewari et al., Cell, 81: 801-809 (1995)] . Recent studies have shown that CrmA can inhibit TNFR1- and CD95-induced cell death [Enari et al., Nature, 375: 78-81 (1995); Tewari et al., J. Biol. Chem., 270: 3255-3260 (1995)].
As recently reviewed by Tewari et al., TNFR1, TNFR2, and CD40 modulate the expression of pro- and co-stimulatory cytokines, cytokine receptors, and cell adhesion molecules by activating transcription factors, NF-κB [Tewari et al., Curr. Op. Genet. Develop., 6: 39-44 (1996)]. NF-κB is the prototype of a family of dimeric transcription factors whose subunits contain a conserved Rel region [Verma et al., Genes Develop., 9: 2723-2735 (1996); Baldwin, Ann. Rev. Immunol. , 14: 649-681 (1996)]. In its latent form, NF-κB is complexed with members of the IκB-inhibitor family; upon inactivation of IκB in response to a given stimulus, the released NF-κB becomes a specific DNA sequence. Translocates to the binding nucleus and activates gene transcription.
For a review of the TNF family of cytokines and their receptors, see Gruss and Dower, supra.

９． ＰＲＯ３６５
ヒト２-１９プロテイン等のポリペプチドはサイトカインとして機能する。サイトカインは免疫細胞の分化、増殖又は機能を刺激又は阻害するように機能する低分子量のタンパク質である。サイトカインはしばしば細胞間メッセンジャーとして作用し、複数の生理学的効果を有する。インビボにおける免疫機構の生理学的重要性が分かっているため、現在、免疫系に影響を与える新規で未変性のタンパク質を同定するための努力がなされている。我々は、ここでヒト２-１９プロテインに対して相同性を有する新規なポリペプチドの同定を記載する。 9. PRO365
A polypeptide such as human 2-19 protein functions as a cytokine. Cytokines are low molecular weight proteins that function to stimulate or inhibit immune cell differentiation, proliferation or function. Cytokines often act as intercellular messengers and have multiple physiological effects. Given the physiological importance of the immune mechanism in vivo, efforts are currently being made to identify new and native proteins that affect the immune system. We now describe the identification of a novel polypeptide having homology to the human 2-19 protein.

１０． ＰＲＯ１３６１
新規で未変性の膜貫通レセプタータンパク質を同定するための努力が、産業界と学術界の両方でなされている。多くの努力は、新規なレセプタータンパク質のコード配列を同定するための哺乳動物組換えＤＮＡライブラリーのスクリーニングに注がれている。我々は、ここでＰＲＯ１３６１ポリペプチドと命名する新規な膜貫通ポリペプチドの同定と特徴付けをここに記載する。 10. PRO 1361
Efforts have been made in both industry and academia to identify new and native transmembrane receptor proteins. Much effort is devoted to screening mammalian recombinant DNA libraries to identify novel receptor protein coding sequences. We describe here the identification and characterization of a novel transmembrane polypeptide, designated herein as the PRO1361 polypeptide.

１１． ＰＲＯ１３０８
フォリスタチンは、下垂体濾胞刺激ホルモン(ＦＳＨ)の分泌を調節する分泌タンパク質である。それは、下垂体前葉からのＦＳＨの生成と分泌を刺激するアクチビン及びトランスフォーミング成長因子ベータ(ＴＧＦβ)ファミリーの他のメンバーのようなタンパク質と結合し、それによってそれらを阻害することにより機能する。フォリスタチンは、神経発育の誘発を含む、基礎的発育を制御する機構にもまた関与している。またフォリスタチンは、特に塩基性線維芽成長因子(ｂＦＧＦ)と組み合わされて、血管形成特性を示す。このように、フォリスタチンファミリーのタンパク質の新規なメンバーを同定することには強い関心がある。フォリスタチンの同定及び特徴付けは、出典明示によりここに取り込まれる以下の文献の論題である：Suginoら, J. Med Invest(1997)44：(1-2)：1-14；Matherら, Proc. Soc. Exp. biol. Med.(1997)215(3)：209-222；Thomsen, G.H., Trends Genet(1997)13(6)：209-211；DePaolo, L.V., Proc. Soc. Exp. biol. Med.(1997)214(4)：328-339；Pengら, Biol. Signals(1996)5(2)：81-89、及びHalvorsonら, Fertil Steril(1996)65(3)：459-469。 11. PRO1308
Follistatin is a secreted protein that regulates the secretion of pituitary follicle stimulating hormone (FSH). It functions by binding to and thereby inhibiting proteins such as activin and other members of the transforming growth factor beta (TGFβ) family that stimulate the production and secretion of FSH from the anterior pituitary gland. Follistatin is also involved in mechanisms that control basal development, including induction of neuronal development. Follistatin also exhibits angiogenic properties, particularly in combination with basic fibroblast growth factor (bFGF). Thus, there is a strong interest in identifying novel members of the follistatin family of proteins. The identification and characterization of follistatin is the topic of the following literature, incorporated herein by reference: Sugino et al., J. Med Invest (1997) 44: (1-2): 1-14; Mather et al., Proc Soc. Exp. Biol. Med. (1997) 215 (3): 209-222; Thomsen, GH, Trends Genet (1997) 13 (6): 209-211; DePaolo, LV, Proc. Soc. Exp. Biol Med. (1997) 214 (4): 328-339; Peng et al., Biol. Signals (1996) 5 (2): 81-89, and Halvorson et al., Fertil Steril (1996) 65 (3): 459-469. .

１２． ＰＲＯ１１８３
プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼはヘム生合成経路における最後から２番目の工程を触媒する。この酵素の活性が欠如するとヒト遺伝病多彩性ポルフィリン症になる。よって、プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ及びこれらのオキシダーゼに関連するか又はこれを調節する分子には関心が持たれている。さらに、オキシダーゼと関連分子は、一般に関心あるものである。またオキシダーゼは、少なくともBirchfieldら, Biochemistry, 37(19)：6905-6910(1998)；Fingarら, Cancer Res., 57(20)：4551-4556(1997)；Arnouldら, Biochemistry, 36(33)：10178-10184(1997)；及びDailey及びDailey, Cell Mol. Biol., 43(1)：67-73(1997)に記載されている。 12 PRO1183
Protoporphyrinogen oxidase catalyzes the penultimate step in the heme biosynthetic pathway. Lack of activity of this enzyme results in the human genetic disease multiplicity of porphyria. Thus, there is interest in protoporphyrinogen oxidase and molecules related to or regulating these oxidases. In addition, oxidases and related molecules are of general interest. Oxidase is also at least Birchfield et al., Biochemistry, 37 (19): 6905-6910 (1998); Fingar et al., Cancer Res., 57 (20): 4551-4556 (1997); Arnould et al., Biochemistry, 36 (33) : 10178-10184 (1997); and Dailey and Dailey, Cell Mol. Biol., 43 (1): 67-73 (1997).

１３． ＰＲＯ１２７２
セメント腺はカエル胎仔の頭部にある外胚葉器官であり、あらゆる神経組織の前側に位置している。神経組織と同様に、セメント腺は背側中胚葉により誘発されることが分かっている。ＸＡＧ-１は、発育中のセメント腺誘発のマーカーとして有用であるセメント腺特異的タンパク質である。Siveら, Cell, 58(1)：171-180(1989)；Itohら, Development, 121(12)：3979-3988(1995)を参照されたい。ＸＡＧ-２とＸＡＧファミリーに関与している他のタンパク質はさらにAbergerら, Mech. Dev., 72(1-2)：115-130(1998)及びGammill及びSive, Development, 124(2)：471-481(1997)に記載されている。よって、ＸＡＧタンパク質と配列同一性を有する新規なポリペプチドには関心が持たれる。 13. PRO1272
The cement gland is the ectoderm organ in the frog fetal head and is located in front of all neural tissues. Like neural tissue, cement glands have been found to be induced by the dorsal mesoderm. XAG-1 is a cement gland-specific protein that is useful as a marker for the induction of cement gland during development. See Sive et al., Cell, 58 (1): 171-180 (1989); Itoh et al., Development, 121 (12): 3979-3988 (1995). XAG-2 and other proteins involved in the XAG family are further described in Aberger et al., Mech. Dev., 72 (1-2): 115-130 (1998) and Gammill and Sive, Development, 124 (2): 471 -481 (1997). Thus, new polypeptides having sequence identity with the XAG protein are of interest.

１４． ＰＲＯ１４１９
新規で未変性の分泌タンパク質を同定するための努力が、産業界と学術界の両方でなされている。多くの努力は、新規な分泌タンパク質のコード配列を同定するための哺乳動物組換えＤＮＡライブラリーのスクリーニングに注がれている。我々は、ここでＰＲＯ１４１９ポリペプチドと命名する新規な分泌ポリペプチドの同定と特徴付けをここに記載する。 14 PRO1419
Efforts have been made in both industry and academia to identify new, native secreted proteins. Much effort is devoted to the screening of mammalian recombinant DNA libraries to identify novel secretory protein coding sequences. We describe here the identification and characterization of a novel secreted polypeptide, designated herein as PRO1419 polypeptide.

１５． ＰＲＯ４９９９
ウロモジュリンは腎臓で合成され、正常なヒトの尿における最も豊富なタンパク質である。ウロモジュリン遺伝子のエクソンの一つによりコードされるアミノ酸配列は低密度リポタンパク質レセプター及び表皮成長因子前駆体と相同性を有している。Pennicaら, Science 236：83-88(1987)。ウロモジュリンの機能は知られていない；しかし、ＩＬ-１、ＩＬ-２及びＴＮＦと高親和性で結合するので、多くの強力なサイトカインに特異的に結合し、その循環活性を調節する独特の腎臓調節糖タンパク質として機能しうる。Hessionら, Science 237：1479-1484(1987)を参照されたい。Suらは、ウロモジュリンが泌尿器系に生得的な免疫性において重要な役割を担っており、ウロモジュリンの免疫刺激活性が免疫治療に潜在的に有用であることを示唆している。Suら, J. Immunology, 158：3449-3456(1997)。
我々は、ここでＰＲＯ４９９９ポリペプチドと命名する、ウロモジュリンに類似した配列を有する新規なポリペプチドの同定及び特徴付けを記載する。 15. PRO4999
Uromodulin is synthesized in the kidney and is the most abundant protein in normal human urine. The amino acid sequence encoded by one exon of the uromodulin gene is homologous to the low density lipoprotein receptor and epidermal growth factor precursor. Pennica et al., Science 236: 83-88 (1987). The function of uromodulin is unknown; however, it binds with high affinity to IL-1, IL-2 and TNF, so it has a unique kidney that specifically binds to many powerful cytokines and regulates its circulating activity Can function as a regulatory glycoprotein. See Hession et al., Science 237: 1479-1484 (1987). Su et al. Suggest that uromodulin plays an important role in innate immunity to the urinary system, suggesting that the immunostimulatory activity of uromodulin is potentially useful for immunotherapy. Su et al., J. Immunology, 158: 3449-3456 (1997).
We describe the identification and characterization of a novel polypeptide having a sequence similar to uromodulin, designated herein as PRO4999 polypeptide.

１６． ＰＲＯ７１７０
新規で未変性の分泌タンパク質を同定するための努力が、産業界と学術界の両方でなされている。多くの努力は、新規な分泌タンパク質のコード配列を同定するための哺乳動物組換えＤＮＡライブラリーのスクリーニングに注がれている。我々は、ここでＰＲＯ７１７０ポリペプチドと命名する新規な分泌ポリペプチドの同定と特徴付けをここに記載する。 16. PRO7170
Efforts have been made in both industry and academia to identify new, native secreted proteins. Much effort is devoted to the screening of mammalian recombinant DNA libraries to identify novel secretory protein coding sequences. We describe here the identification and characterization of a novel secreted polypeptide, designated herein as the PRO7170 polypeptide.

１７． ＰＲＯ２４８
サイトカインは、神経学的機能不全がアミノ酸神経伝達物質の代謝の変化に起因する多くの脳疾患の病因に関与している。特に、トランスフォーミング成長因子β(ＴＧＦβ)のメンバーが関与している。トランスフォーミング成長ペプチドは、最初は培養中の非癌細胞の増殖と形質転換を誘発する能力によって同定された小さなポリペプチドである。成長因子として最初は定義されたが、ＴＧＦβはまた上皮、内皮、リンパ球及び造血細胞の増殖を阻害する。このサイトカインは炎症反応の持続時間の調節において重要な役割を担っており、治癒プロセスを促進させることができる。また強力な免疫調節物質でもあり、多くの他のサイトカインの調節を含む多くの多面発現効果を有する。
ＴＧＦβファミリーには塩基性ミエリンタンパク質(ＢＭＰ-２、ＢＭＰ-４、ＢＭＰ-５、ＢＭＰ-６、ＢＭＰ-７)、アクチビンＡ及びＢ、デカペンタプレジック(decapentaplegic)(dpp)、６０Ａ、ＯＰ-２、ドルサリン(dorsalin)、成長分化因子(ＧＤＦｓ)１、３及び９、ノーダル(nodal)、ＭＩＳ、インヒビンα、トランスフォーミング成長因子ベータ(ＴＧＦ-β１、ＴＧＦ-β２、ＴＧＦ-β３、ＴＧＦ-β５)及び神経膠細胞誘導神経栄養因子(ＧＤＮＦ)が含まれる。Atrisanoら, J. Biochemica et Biophysica Acta. 1222：71-80(1994)。特に関心があるものは成長分化因子であるが、これはその名称が意味するように、これらの因子は細胞の分化に関与しているためである。
よって、ＴＧＦβファミリーのメンバー、特に成長分化因子(ＧＤＦ)３と相同性を有するタンパク質の同定は、医学界及び産業界にとって重要である。一般に、互いに相同性を有するタンパク質は類似した機能を有する。相同性を有するタンパク質が類似した機能を持たない場合、ある種の構造的モチーフが、例えば機能の局部性などの、機能以外の情報を同定することを示すこともまた興味深いことである。 17. PRO248
Cytokines are involved in the pathogenesis of many brain diseases where neurological dysfunction results from alterations in amino acid neurotransmitter metabolism. In particular, members of transforming growth factor β (TGFβ) are involved. Transforming growth peptides are small polypeptides that were initially identified by their ability to induce proliferation and transformation of non-cancerous cells in culture. Although originally defined as a growth factor, TGFβ also inhibits proliferation of epithelium, endothelium, lymphocytes and hematopoietic cells. This cytokine plays an important role in regulating the duration of the inflammatory response and can accelerate the healing process. It is also a potent immunomodulator and has many pleiotropic effects including the regulation of many other cytokines.
The TGFβ family includes basic myelin proteins (BMP-2, BMP-4, BMP-5, BMP-6, BMP-7), activins A and B, decapentaplegic (dpp), 60A, OP- 2, Dorsalin, growth differentiation factors (GDFs) 1, 3 and 9, nodal, MIS, inhibin α, transforming growth factor beta (TGF-β1, TGF-β2, TGF-β3, TGF-β5) ) And glial cell-derived neurotrophic factor (GDNF). Atrisano et al., J. Biochemica et Biophysica Acta. 1222: 71-80 (1994). Of particular interest are growth differentiation factors, as the name implies, because these factors are involved in cell differentiation.
Thus, identification of members of the TGFβ family, particularly proteins with homology to growth differentiation factor (GDF) 3, is important for the medical community and industry. In general, proteins that are homologous to each other have similar functions. It is also interesting to show that certain structural motifs identify information other than function, such as locality of function, when homologous proteins do not have similar functions.

１８． ＰＲＯ３５３
補体タンパク質は、炎症に関連したエフェクター分子を生成する、酵素的カスケードに作用するいくつかの血清タンパク質の大きなグループを含む。補体タンパク質は炎症に関与する細胞の機能及び動きの調節において、特に重要性を有する。インビボにおける炎症及び関連したメカニズムの生理学的な重要性が分かっているため、炎症に関与している新規な未変性タンパク質を同定するための努力がなされている。我々は、ここでＰＲＯ３５３ポリペプチドと命名する、補体タンパク質に対して相同性を有する新規なポリペプチドの同定と特徴付けをここに記載する。 18. PRO353
Complement proteins comprise a large group of several serum proteins that act on enzymatic cascades to produce effector molecules associated with inflammation. Complement proteins are particularly important in the regulation of cellular functions and movements involved in inflammation. As the physiological importance of inflammation and related mechanisms in vivo is known, efforts are being made to identify novel native proteins involved in inflammation. We describe here the identification and characterization of a novel polypeptide having homology to complement proteins, designated herein as PRO353 polypeptide.

１９． ＰＲＯ５３３
成長因子は、特定の細胞表面レセプターと結合することにより、単独で又は協力して細胞成長又は増殖を亢進する分子シグナル又はメディエータであるが、成長因子への発現時には成長のみ以外の細胞性反応がある。その結果、成長因子は多機能性で強力な細胞レギュレーターとしてよりよく特徴付けられる。その生物学的効果は増殖、走化性及び細胞外マトリックス生産の刺激を含む。成長因子は刺激性及び阻害効果の双方を有しうる。例えば、トランスフォーミング成長因子(ＴＧＦ-β)は高度に多面的で、ある細胞、特に結合組織では増殖を刺激する一方、他のもの、例えばリンパ球及び上皮細胞では増殖の強力な阻害剤である。
成長因子による成長刺激又は阻害の生理学的効果は標的組織の発達と分化の状態に依存する。古典的な内分泌分子による局所的細胞調節はオートクライン(同じ細胞)、ジャクスタクリン(近くの細胞)、及びパラクリン(隣接細胞)経路の理解を含む。ペプチド成長因子は複雑な生物学的言語の要素であり、細胞間情報交換の基礎を提供する。それらは細胞が互いに情報を運ぶことを可能にし、細胞間の相互作用を媒介し、遺伝子発現を変化させる。これらの多機能及び多面的因子の効果は他のペプチドの有無に依存している。
線維芽細胞成長因子(ＦＧＦｓ)は正常な二倍体線維芽細胞と樹立株化細胞の双方に対するヘパリン結合性の強力なマイトジェンのファミリーである。Godpodarowicz, D等, (1984), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6963。ＦＧＦファミリーはとりわけ、酸性ＦＧＦ(ＦＧＦ-１)、塩基性ＦＧＦ(ＦＧＦ-２)、ＩＮＴ-２(ＦＧＦ-３)、Ｋ-ＦＧＦ／ＨＳＴ(ＦＧＦ-４)、ＦＧＦ-５、ＦＧＦ-６、ＫＧＦ(ＦＧＦ-７)、ＡＩＧＦ(ＦＧＦ-８)を含む。全てのＦＧＦｓは２つの保存されたシステイン残基を持ち、アミノ酸レベルで３０−５０％の配列相同性を共有する。これらの因子は、顆粒膜細胞、副腎皮質細胞、軟骨細胞、筋芽細胞、角膜及び血管内皮細胞(ウシ又はヒト)、血管平滑筋細胞、水晶体、網膜及び前立腺上皮細胞、オリゴデンドロサイト、アストロサイト、クロンドサイト(chrondocytes)、筋芽細胞及び骨芽細胞を含む多様で正常な二倍体中胚葉由来及び神経冠由来細胞に対して***促進的である。
線維芽細胞成長因子はまた非***促進的な形で多数の細胞型を刺激することができる。これらの活動は、線維芽細胞成長因子はまた創傷領域への細胞移動の促進(走化作用)、新しい血管形成の開始(血管新生)、神経再生と生存の変調(ニューロトロフィズム(neurotrophism))、内分泌機能の変調、及び特異的細胞性タンパク質発現、細胞外マトリックス生産及び細胞生存の刺激又は抑制を含む。Baird, A. & Bohlen, P., Handbook of Exp. Pharmacol. 95(1): 369-418,(1990)。これらの性質は、創傷治癒、神経修復、側枝血管形成等々を加速させる治療的アプローチにおいて線維芽細胞成長因子を使用するための基礎を提供する。例えば、線維芽細胞成長因子が心臓疾患及び手術において心筋損傷を最小にすることが示唆されている(U.S.P. 4,378,437)。
ここで我々は、ＰＲＯ５３３ポリペプチドと命名する、ＦＧＦと相同性を有する新規なポリペプチドの同定及び特徴付けをを記載する。 19. PRO533
A growth factor is a molecular signal or mediator that enhances cell growth or proliferation alone or in cooperation by binding to a specific cell surface receptor, but when expressed to a growth factor, a cellular response other than growth alone is present. is there. As a result, growth factors are better characterized as multifunctional and powerful cell regulators. Its biological effects include stimulation of proliferation, chemotaxis and extracellular matrix production. Growth factors can have both stimulatory and inhibitory effects. For example, transforming growth factor (TGF-β) is highly pleiotropic and stimulates proliferation in some cells, particularly connective tissue, while it is a potent inhibitor of proliferation in others, such as lymphocytes and epithelial cells. .
The physiological effects of growth stimulation or inhibition by growth factors depend on the state of target tissue development and differentiation. Local cellular regulation by classical endocrine molecules involves an understanding of the autocrine (same cell), jaxtaclin (near cell), and paracrine (adjacent cell) pathways. Peptide growth factors are complex biological language elements that provide the basis for the exchange of information between cells. They allow cells to carry information from each other, mediate cell-cell interactions, and change gene expression. The effects of these multifunctional and multifaceted factors depend on the presence or absence of other peptides.
Fibroblast growth factors (FGFs) are a family of powerful heparin-binding mitogens for both normal diploid fibroblasts and established cell lines. Godpodarowicz, D et al. (1984), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 6963. The FGF family includes, among others, acidic FGF (FGF-1), basic FGF (FGF-2), INT-2 (FGF-3), K-FGF / HST (FGF-4), FGF-5, FGF-6, KGF (FGF-7) and AIGF (FGF-8) are included. All FGFs have two conserved cysteine residues and share 30-50% sequence homology at the amino acid level. These factors include granulosa cells, adrenocortical cells, chondrocytes, myoblasts, corneas and vascular endothelial cells (bovine or human), vascular smooth muscle cells, lens, retina and prostate epithelial cells, oligodendrocytes, astrocytes It is mitogenic for a variety of normal diploid mesoderm and neural crest-derived cells, including chrondocytes, myoblasts and osteoblasts.
Fibroblast growth factor can also stimulate many cell types in a non-mitogenic manner. These activities include: fibroblast growth factor also promotes cell migration to the wound area (chemotaxis), initiation of new blood vessel formation (angiogenesis), modulation of nerve regeneration and survival (neurotrophism) , Modulation of endocrine function, and stimulation or suppression of specific cellular protein expression, extracellular matrix production and cell survival. Baird, A. & Bohlen, P., Handbook of Exp. Pharmacol. 95 (1): 369-418, (1990). These properties provide the basis for using fibroblast growth factor in therapeutic approaches that accelerate wound healing, nerve repair, side branch angiogenesis, and the like. For example, it has been suggested that fibroblast growth factor minimizes myocardial damage in heart disease and surgery (USP 4,378,437).
Here we describe the identification and characterization of a novel polypeptide with homology to FGF, termed PRO533 polypeptide.

２０． ＰＲＯ３０１
ガンの広範な発生はかなりの資源と新しい治療法を発見することに捧げることを促した。特定の一方法は腫瘍抗原に特異的である腫瘍又はガン特異的モノクローナル抗体(ｍＡｂｓ)の創造を含む。正常細胞とガン細胞を区別できるそのようなｍＡｂｓは疾患の診断、予防及び治療に有用である。特定の抗原は、結腸直腸ガンのような新生物疾患に関連していることが知られている。
一つの特定の抗原であるＡ３３抗原は原発性又は転移性大腸ガン並びに正常な大腸上皮の９０％以上において発現される。大腸ガンは広範性疾患であるので、早期の診断と治療が重要な医療目標である。大腸ガンの診断と治療は蛍光、核磁気又は放射性タグを持つそれに特異的なモノクローナル抗体(ｍＡｂｓ)を使用して実施することができる。放射性遺伝子、毒素及び／又は薬物タグｍＡＢｓを最小の患者の処方でインサイツでの治療に対して使用できる。ｍＡｂｓはまた大腸ガンの診断と治療における診断に使用することができる。例えば、Ａ３３抗原の血清レベルがある患者において上昇している場合、手術後のレベルの降下は腫瘍切除が成功したことを示している。他方、手術後の血清Ａ３３抗原レベルの引き続く上昇は元の腫瘍の転移が生じたかあるいは新しい原発性腫瘍が現れたことを示している。そのようなモノクローナル抗体は手術及び／又は化学療法の代わりに又はこれと同時に使用することができる。例えばU.S.P.4,579,827とU.S.S.N.424,991(E.P.199,141)はモノクローナル抗体の治療的投与に関しており、その後者は抗Ａ３３ｍＡｂの適用に関している。
上皮由来の多くのガンはアデノウィルスレセプターを有している。実際、アデノウィルス由来ベクターが腫瘍中にアンチセンス核酸を挿入する手段として提案されている(U.S.P.5,518,885)。よって、新生物腫瘍とのウィルスレセプターの結合は期待できないものではない。
我々は、ここでＰＲＯ３０１ポリペプチドと命名した、ある種のガン関連抗原に対して相同性を有する新規なポリペプチドの同定及び特徴づけをここに記載する。 20. PRO301
The widespread outbreaks of cancer prompted dedicated resources to discover new treatments. One particular method involves the creation of tumor or cancer specific monoclonal antibodies (mAbs) that are specific for tumor antigens. Such mAbs capable of distinguishing between normal cells and cancer cells are useful for disease diagnosis, prevention and treatment. Certain antigens are known to be associated with neoplastic diseases such as colorectal cancer.
One specific antigen, the A33 antigen, is expressed in more than 90% of primary or metastatic colon cancer as well as normal colon epithelium. Since colorectal cancer is a widespread disease, early diagnosis and treatment are important medical goals. Diagnosis and treatment of colorectal cancer can be performed using monoclonal antibodies (mAbs) specific for it with fluorescent, nuclear magnetic or radioactive tags. Radioactive genes, toxins and / or drug tagged mAbs can be used for in situ treatment with minimal patient prescription. mAbs can also be used for diagnosis in the diagnosis and treatment of colorectal cancer. For example, if the serum level of A33 antigen is elevated in a patient, a decrease in post-operative level indicates successful tumor resection. On the other hand, a subsequent increase in serum A33 antigen level after surgery indicates that the original tumor has metastasized or a new primary tumor has appeared. Such monoclonal antibodies can be used instead of or simultaneously with surgery and / or chemotherapy. For example, USP 4,579,827 and USSN 424,991 (EP199,141) relate to the therapeutic administration of monoclonal antibodies and the latter relates to the application of anti-A33 mAbs.
Many cancers of epithelial origin have adenovirus receptors. Indeed, adenovirus-derived vectors have been proposed as a means of inserting antisense nucleic acids into tumors (USP 5,518,885). Therefore, the binding of viral receptors to neoplastic tumors cannot be expected.
We describe here the identification and characterization of a novel polypeptide having homology to certain cancer-associated antigens, designated herein as PRO301 polypeptide.

２１．ＰＲＯ１８７
成長因子は、特定の細胞表面レセプターに結合することにより、単独で又は協力して細胞成長又は増殖を亢進する分子シグナル又はメディエータである。しかし、成長因子への発現時には成長のみ以外の細胞性反応がある。その結果、成長因子は多機能性で強力な細胞レギュレーターとしてよりよく特徴付けられる。その生物学的効果は増殖、走化性及び細胞外マトリックス生産の刺激を含む。成長因子は刺激性及び阻害効果の双方を有しうる。例えば、トランスフォーミング成長因子(ＴＧＦ-β)は高度に多面的で、ある細胞、特に結合組織では増殖を刺激する一方、他のもの、例えばリンパ球及び上皮細胞では増殖の強力な阻害剤である。
成長因子による成長刺激又は阻害の生理学的効果は標的組織の発達と分化の状態に依存する。古典的な内分泌分子による局所的細胞調節のメカニズムはオートクライン(同じ細胞)、ジャクスタクリン(近くの細胞)、及びパラクリン(隣接細胞)経路の理解を含む。ペプチド成長因子は複雑な生物学的言語の要素であり、細胞間情報交換の基礎を提供する。それらは細胞が互いに情報を運ぶことを可能にし、細胞間の相互作用を媒介し、遺伝子発現を変化させる。これらの多機能及び多面的因子の効果は他のペプチドの有無に依存している。
ＦＧＦ-８は、正常な二倍体線維芽細胞と樹立株化細胞の双方に対するヘパリン結合性の強力なマイトジェンのファミリーである線維芽細胞成長因子(ＦＧＦｓ)のメンバーである。Gospodarowicz等, (1984), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6963。ＦＧＦファミリーは、酸性ＦＧＦ(ＦＧＦ-１)、塩基性ＦＧＦ(ＦＧＦ-２)、ＩＮＴ-２(ＦＧＦ-３)、Ｋ-ＦＧＦ／ＨＳＴ(ＦＧＦ-４)、ＦＧＦ-５、ＦＧＦ-６、ＫＧＦ(ＦＧＦ-７)、ＡＩＧＦ(ＦＧＦ-８)を含む。全てのＦＧＦｓは２つの保存されたシステイン残基を持ち、アミノ酸レベルで３０-５０％の配列相同性を共有する。これらの因子は、顆粒膜細胞、副腎皮質細胞、軟骨細胞、筋芽細胞、角膜及び血管内皮細胞(ウシ又はヒト)、血管平滑筋細胞、水晶体、網膜及び前立腺上皮細胞、オリゴデンドロサイト、アストロサイト、クロンドサイト(chrondocytes)、筋芽細胞及び骨芽細胞を含む広範囲の正常な二倍体中胚葉由来及び神経冠由来細胞に対して***促進的である。
線維芽細胞成長因子はまた非***促進的な形で多数の細胞型を刺激することができる。これらの活動は、創傷領域への細胞移動の促進(走化作用)、新しい血管形成の開始(血管形成)、神経再生と生存の変調(ニューロトロフィズム(neurotrophism))、内分泌機能の変調、及び特異的細胞性タンパク質発現、細胞外マトリックス生産及び細胞生存の刺激又は抑制を含む。Baird & Bohlen, Handbook of Exp. Pharmacol. 95(1): 369-418, Springer, (1990)。これらの性質は、創傷治癒、神経修復、側枝血管形成等々を加速させる治療的アプローチにおいて線維芽細胞成長因子を使用するための基礎を提供する。例えば、線維芽細胞成長因子が心臓疾患及び手術において心筋損傷を最小にすることが示唆されている(U.S.P. 4,378,347)。
アンドロゲン誘発成長因子(ＡＩＧＦ)としても知られているＥＧＦ-８はＦＧＦファミリーの他のメンバーと３０-４０％の配列相同性を共有する２１５のアミノ酸タンパク質である。ＦＧＦ-８はマウス乳ガン株化細胞ＳＣ３においてアンドロゲン調節及び誘導下にあることが提案されている。Tanaka等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 8928-8932 (1992); Sato等, J. Steroid Biochem. Molec. Biol. 47: 91-98 (1993)。その結果、ＦＧＦ-８は、アンドロゲン応答性器官であることが知られている前立腺において局所的な役割を有しうる。ＦＧＦ-８がまたＮＩＨ-３Ｔ３線維芽細胞内に形質移入されるとトランスフォーミング活性を示すので発ガン性でありうる。Kouhara等, Oncogene 9 455-462 (1994)。ＦＧＦ-８は心臓、脳、肺、腎臓、精巣、前立腺及び卵巣において検出されている一方、発現はまた外因性アンドロゲンのない場合にもまた検出された。Schmitt等, J. Steroid Biochem. Mol. Biol. 57 (3-4): 173-78 (1996)。
ＦＧＦ-８は、マウス胚形成の様々な段階で発現されるという性質を幾つかの他のＦＧＦｓと共有し、これが、様々なＥＧＦｓが分化と胚形成において多重的でおそらくは協調的な役割を有するという理論を裏付けている。更に、ＦＧＦ-８はまた***腫瘍形成の過程においてＷｎｔ-１と共同するプロトオンコジーンとして同定されている(Shackleford等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 740-744 (1993)；Heikinheimo等, Mech. Dev. 48: 129-138 (1994))。
他のＦＧＦｓとは対照的に、ＦＧＦ-８は一次転写物の選択的スプライシングの結果として、３種のタンパク質アイソフォームとして存在している、上掲のTanaka等。ＦＧＦ-８の正常な成人の発現は弱く生殖腺組織に限られているが、ノーザンブロット分析は、ＦＧＦ-８ｍＲＮＡがマウス妊娠期間の１０日から１２日存在していることを示しており、ＦＧＦ-８が正常な発育に重要であることを示唆している。Heikinheimo等, Mech Dev. 48(2): 129-38 (1994)。妊娠の８から１６日の間の更なるインサイツハイブリッド形成アッセイは、第一気管支アーチの表面外胚葉、前線鼻突起、前脳及び中脳-後脳移行部において初期の発現を示した。１０-１２日で、ＦＧＦ-８は前肢及び後肢芽の表面外胚葉、鼻及び上咽頭、漏斗及び終脳、間脳及び後脳に発現された。発現は妊娠の１３日で発育中の後肢において継続するがその後は検出できない。この結果は、ＦＧＦ-８が胚形成において独特な時間的かつ空間的パターンを有していることを示唆しており、嚢胚形成後の胚における外胚葉分化の多重領域におけるこの成長因子の役割を示唆している。
ここで我々は、ＦＧＦ-８と相同性を有する新規なポリペプチドの同定を記載し、これらポリペプチドをここでＰＲＯ１８７ポリペプチドと命名した。 21. PRO187
Growth factors are molecular signals or mediators that, by binding to specific cell surface receptors, alone or in concert, enhance cell growth or proliferation. However, there are cellular responses other than growth alone when expressed to growth factors. As a result, growth factors are better characterized as multifunctional and powerful cell regulators. Its biological effects include stimulation of proliferation, chemotaxis and extracellular matrix production. Growth factors can have both stimulatory and inhibitory effects. For example, transforming growth factor (TGF-β) is highly pleiotropic and stimulates proliferation in some cells, particularly connective tissue, while it is a potent inhibitor of proliferation in others, such as lymphocytes and epithelial cells. .
The physiological effects of growth stimulation or inhibition by growth factors depend on the state of target tissue development and differentiation. The mechanism of local cellular regulation by classical endocrine molecules involves understanding the autocrine (same cell), jakstaclin (near cell), and paracrine (adjacent cell) pathways. Peptide growth factors are complex biological language elements that provide the basis for the exchange of information between cells. They allow cells to carry information from each other, mediate cell-cell interactions, and change gene expression. The effects of these multifunctional and multifaceted factors depend on the presence or absence of other peptides.
FGF-8 is a member of fibroblast growth factors (FGFs), a family of potent heparin-binding mitogens for both normal diploid fibroblasts and established cell lines. Gospodarowicz et al. (1984), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 6963. The FGF family includes acidic FGF (FGF-1), basic FGF (FGF-2), INT-2 (FGF-3), K-FGF / HST (FGF-4), FGF-5, FGF-6, and KGF. (FGF-7) and AIGF (FGF-8). All FGFs have two conserved cysteine residues and share 30-50% sequence homology at the amino acid level. These factors include granulosa cells, adrenocortical cells, chondrocytes, myoblasts, corneas and vascular endothelial cells (bovine or human), vascular smooth muscle cells, lens, retina and prostate epithelial cells, oligodendrocytes, astrocytes It is mitogenic for a wide range of normal diploid mesoderm and neural crest-derived cells, including chrondocytes, myoblasts and osteoblasts.
Fibroblast growth factor can also stimulate many cell types in a non-mitogenic manner. These activities promote cell migration to the wound area (chemotactic action), initiate new blood vessel formation (angiogenesis), modulate nerve regeneration and survival (neurotrophism), modulate endocrine function, and Includes stimulation or suppression of specific cellular protein expression, extracellular matrix production and cell survival. Baird & Bohlen, Handbook of Exp. Pharmacol. 95 (1): 369-418, Springer, (1990). These properties provide the basis for using fibroblast growth factor in therapeutic approaches that accelerate wound healing, nerve repair, side branch angiogenesis, and the like. For example, fibroblast growth factor has been suggested to minimize myocardial damage in heart disease and surgery (USP 4,378,347).
EGF-8, also known as androgen-induced growth factor (AIGF), is a 215 amino acid protein that shares 30-40% sequence homology with other members of the FGF family. FGF-8 has been proposed to be under androgen regulation and induction in the mouse breast cancer cell line SC3. Tanaka et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 8928-8932 (1992); Sato et al., J. Steroid Biochem. Molec. Biol. 47: 91-98 (1993). As a result, FGF-8 may have a local role in the prostate that is known to be an androgen-responsive organ. FGF-8 can also be carcinogenic because it exhibits transforming activity when transfected into NIH-3T3 fibroblasts. Kouhara et al., Oncogene 9 455-462 (1994). While FGF-8 has been detected in heart, brain, lung, kidney, testis, prostate and ovary, expression was also detected in the absence of exogenous androgen. Schmitt et al., J. Steroid Biochem. Mol. Biol. 57 (3-4): 173-78 (1996).
FGF-8 shares the property of being expressed at various stages of mouse embryogenesis with several other FGFs, which have multiple and possibly coordinated roles for various EGFs in differentiation and embryogenesis. It supports the theory. Furthermore, FGF-8 has also been identified as a proto-oncogene that cooperates with Wnt-1 in the process of breast tumor formation (Shackleford et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 740-744 (1993); Heikinheimo et al. , Mech. Dev. 48: 129-138 (1994)).
In contrast to other FGFs, FGF-8 exists as three protein isoforms as a result of alternative splicing of the primary transcript, Tanaka et al., Supra. Although normal adult expression of FGF-8 is weak and restricted to gonad tissues, Northern blot analysis indicates that FGF-8 mRNA is present from 10 to 12 days of mouse gestation, and FGF- 8 suggests that it is important for normal development. Heikinheimo et al., Mech Dev. 48 (2): 129-38 (1994). Further in situ hybridization assays between 8 and 16 days of gestation showed early expression in the superficial ectoderm, frontal nasal processes, forebrain and midbrain-hindbrain transition of the first bronchial arch. At 10-12 days, FGF-8 was expressed in the surface ectoderm, nose and nasopharynx, funnel and telencephalon, diencephalon and hindbrain of forelimb and hindlimb buds. Expression continues in the developing hind limb on day 13 of pregnancy but is not detectable thereafter. This result suggests that FGF-8 has a unique temporal and spatial pattern in embryogenesis and the role of this growth factor in multiple regions of ectoderm differentiation in postembryonic embryos It suggests.
Here we described the identification of novel polypeptides having homology to FGF-8, and these polypeptides were herein designated PRO187 polypeptides.

２２． ＰＲＯ３３７
高等脊椎動物におけるニューロンの発達は、途中の別個の細胞環境を成功裡にそのシナプス標的まで航路決定しなければならないプロセスにより特徴づけられる。結果は神経回路の機能的に正確な形成である。精度は、成長円錐経路の発見と標的認識を調節し、後者の洗練とニューロン活性を必要とする現象によるそのような突出の再構築が続く機構から得られるものと信じられている。Goodman及びShatz, Cell/Neuron [Suppl.] 72(10):77-98 (1993)。更に、異なったニューロンが生化学的に区別される神経線維を伸長し、細胞-細胞、細胞-マトリックス、及び走化性相互作用によって提供される特異的案内キューに依存して、その適切なシナプス標的に到達することが明らかである。Goodman等、上掲。
ニューロン細胞表面の多様性がつくり出される一つの特定の手段は、細胞接着分子(ＣＡＭｓ)と称される細胞表面タンパク質の差次的な発現を通してである。ニューロン的に発現されたＣＡＭｓは、放射状グリア細胞に沿ったニューロンの移動を含む、広範な発達プロセスに関与し、神経突起伸長に対して許容できる又は反発性の基質を提供し、また突出経路における軸索の選択的束状化を促進することに関与している。Jessel, Neuron 1:3-13 (1998); Edelman及びCrossin, Annu.Rev.Biochem. 60:155-190 (1991)。成長円錐膜上に存在するＣＡＭｓと対向する細胞膜上又は細胞外マトリックス中の分子との間の相互作用は、適切な突出経路に沿って神経線維の成長を方向付ける特異的案内キューを提供すると考えられている。そのような相互作用の結果、神経突起成長を調節する成長円錐内において様々な第２のメッセンジャー系の活性化が生じると思われる。Doherty及びWalsh, Curr.Opin.Neurobiol. 2:595-601 (1992)。
高等脊椎動物において、大抵の神経ＣＡＭｓはタンパク質の３つの主要な構造ファミリー：インテグリン、カドヘリン、及び免疫グロブリン遺伝子スーパーファミリー(ＩｇＳＦ)のメンバーであることが見出されている。Jessel,上掲；Takeichi, Annu.Rev.Biochem. 59:237-252 (1990); Reichardt及びTomaselli, Annu.Rev.Neurosci. 14:531-570 (1991)。ＩｇＳＦ(又はＩｇ-ＣＡＭｓ)の細胞接着分子は特に、発達の間の神経細胞相互作用及び神経線維成長にしばしば関与しているタンパク質の大きなファミリーを構成している。Salzer及びColman, Dev.Neurosci. 11:377-390 (1989); Bruemmendorf及びRathjen, J.Neurochem. 61:1207-1219 (1993)。しかし、哺乳動物Ｉｇ-ＣＡＭｓの大半はあまりに広範に発現されているので航路決定又はシナプス標的を特定できないように思われ、まだ同定されていない他のＣＡＭｓがニューロンのこれらの更に選択的な相互作用において役割を果たしていることが示唆される。 22. PRO337
Neuronal development in higher vertebrates is characterized by a process that must successfully route a distinct cellular environment along its way to its synaptic target. The result is a functionally accurate formation of the neural circuit. The accuracy is believed to come from a mechanism that coordinates the discovery of growth cone pathways and target recognition, followed by the reconstruction of such protrusions by phenomena that require the latter refinement and neuronal activity. Goodman and Shatz, Cell / Neuron [Suppl.] 72 (10): 77-98 (1993). In addition, different neurons extend biochemically distinct nerve fibers and depend on specific guidance cues provided by cell-cell, cell-matrix, and chemotaxis interactions, depending on their proper synapses. It is clear that the target is reached. Goodman et al., Supra.
One particular means by which neuronal cell surface diversity is created is through differential expression of cell surface proteins called cell adhesion molecules (CAMs). Neuronally expressed CAMs are involved in a wide range of developmental processes, including neuronal movement along radial glia, provide an acceptable or repulsive substrate for neurite outgrowth, and in the protruding pathway Involved in promoting selective bundles of axons. Jessel, Neuron 1: 3-13 (1998); Edelman and Crossin, Annu. Rev. Biochem. 60: 155-190 (1991). Interactions between CAMs present on the growth cone and molecules on the opposing cell membrane or in the extracellular matrix are thought to provide specific guidance cues that direct nerve fiber growth along the appropriate protruding pathway. It has been. Such interactions may result in the activation of various second messenger systems within the growth cone that regulates neurite growth. Doherty and Walsh, Curr. Opin. Neurobiol. 2: 595-601 (1992).
In higher vertebrates, most neuronal CAMs have been found to be members of three major structural families of proteins: integrins, cadherins, and the immunoglobulin gene superfamily (IgSF). Jessel, supra; Takeichi, Annu. Rev. Biochem. 59: 237-252 (1990); Reichardt and Tomaselli, Annu. Rev. Neurosci. 14: 531-570 (1991). IgSF (or Ig-CAMs) cell adhesion molecules constitute, among other things, a large family of proteins that are often involved in neural cell interactions and nerve fiber growth during development. Salzer and Colman, Dev. Neurosci. 11: 377-390 (1989); Bruemmendorf and Rathjen, J. Neurochem. 61: 1207-1219 (1993). However, it seems that most of the mammalian Ig-CAMs are so widely expressed that they cannot identify navigation or synaptic targets, and other CAMs that have not yet been identified are those more selective interactions of neurons. It is suggested that it plays a role.

既知の神経Ｉｇ-ＣＡＭｓの多くはグリコシルホスファチジルイノシトール(ＧＰＩ)アンカーを介して原形質膜に結合していることが見出されている。また、多くの研究によれば、ＧＰＩアンカータンパク質が特異的経路におけるニューロンの成長の間、特異的案内キューの提供に関与している。バッタの神経系の研究では、細胞の表面からＧＰＩ-アンカータンパク質を選択的に除去するホスファチジルイノシトール特異的ホスホリパーゼＣ(ＰＩＰＬＣ)での胎仔の治療の結果、開拓している成長円錐のサブセットの間での誤案内及び偽りの航路決定、並びに初期ニューロンのサブセットの阻害移動パターンが生じる。Chang等, Devel. 114:507-519 (1992)。網膜線維の視蓋への突出は、部分的に３３ｋＤａのＧＰＩアンカータンパク質に依存しているように思われるが、このタンパク質の正確な性質は未知である。Stahl等, Neuron 5:735-743 (1990)。
様々なＧＰＩアンカータンパク質の発現は、後根神経節の一次ラットニューロン、頸部神経節の交感ニューロン、上頸神経節の交感ニューロン、及び小脳顆粒ニューロンの異なった集団のなかで特徴づけられている。Rosen等, J.Cell Biol. 117:617-627 (1992)。これらの異なったタイプのニューロンによる全膜タンパク質の発現の類似パターンとは対照に、顕著な差異がこれらのニューロン間でＧＰＩアンカータンパク質の発現において観察された。最近、ニューロトリミン(neurotrimin)として知られている６５ｋＤａのタンパク質バンドが発見され、一次ニューロンにより差次的に発現され(Rosen等,上掲)、神経系に制限され、ＣＮＳにおいて最も豊富で最も初期に発現されたＧＰＩアンカー種であることが分かった。Struyk等, J.Neuroscience 15(3):2141-2156 (1995)。ニューロトリミンの発見は更に、現在ＩｇＬＯＮと名付けられ、それぞれが有意なアミノ酸同一性を共有するＩｇ様ドメインを含んでいるＩｇＳＦメンバーのファミリーの同定に至った。Struyk等,上掲；Pimenta等,Gene 170(2):189-95 (1996)。
ＩｇＬＯＮサブファミリーの更なるメンバーは、オピエート結合細胞接着分子(ＯＢＣＡＭ)、Schofield等, EMBO J. 8:489-495 (1989)；辺縁随伴膜タンパク質(ＬＡＭＰ)、Pimenta等,上掲；ＣＥＰＵ−１；ＧＰ５５、Wilson等, J.Cell Sci. 109:3129-3138 (1996); Eur.J.Neurosci. 9(2):334-41 (1997)；及びＡｖＧｐ５０、Hancox等,Brain Res.Mol.Brain Res. 44(2):273-85 (1997)を含む。 Many of the known neuronal Ig-CAMs have been found to be bound to the plasma membrane via glycosyl phosphatidylinositol (GPI) anchors. Also, according to many studies, GPI anchor proteins are involved in providing specific guidance cues during neuronal growth in specific pathways. Grasshopper's nervous system studies show that treatment of fetuses with phosphatidylinositol-specific phospholipase C (PIPLC), which selectively removes GPI-anchor proteins from the surface of cells, results in the development of a subset of growth cones Misguided and false navigation decisions, and an inhibitory movement pattern of a subset of early neurons. Chang et al., Devel. 114: 507-519 (1992). Protrusion of the retinal fibers into the optic lid appears to depend in part on the 33 kDa GPI anchor protein, but the exact nature of this protein is unknown. Stahl et al., Neuron 5: 735-743 (1990).
Expression of various GPI anchor proteins has been characterized in different populations of primary rat neurons of the dorsal root ganglion, sympathetic neurons of the cervical ganglion, sympathetic neurons of the superior cervical ganglion, and cerebellar granule neurons . Rosen et al., J. Cell Biol. 117: 617-627 (1992). In contrast to the similar pattern of total membrane protein expression by these different types of neurons, significant differences were observed in the expression of GPI anchor proteins between these neurons. Recently, a 65 kDa protein band known as neurotrimin was discovered, differentially expressed by primary neurons (Rosen et al., Supra), restricted to the nervous system, and most abundant and earliest in the CNS It was found to be a GPI anchor species expressed in Struyk et al., J. Neuroscience 15 (3): 2141-2156 (1995). The discovery of neurotrimins has further led to the identification of a family of IgSF members now named IgLON, each containing an Ig-like domain that shares significant amino acid identity. Struyk et al., Supra; Pimenta et al., Gene 170 (2): 189-95 (1996).
Additional members of the IgLON subfamily include opiate-binding cell adhesion molecules (OBCAM), Schofield et al., EMBO J. 8: 489-495 (1989); margin associated membrane protein (LAMP), Pimenta et al., Supra; CEPU- 1; GP55, Wilson et al., J. Cell Sci. 109: 3129-3138 (1996); Eur. J. Neurosci. 9 (2): 334-41 (1997); and AvGp50, Hancox et al., Brain Res. Mol. Including Brain Res. 44 (2): 273-85 (1997).

ニューロトリミンの発現は広範であると思われる一方、幾つかの神経回路の発達に相関していると思われる。例えば、Ｅ１８とＰ１０の間で、前脳内でのニューロチミンｍＲＮＡの発現が、発達中の視床、皮質サブプレート、及び皮質のニューロン、特にラミナＶ及びＶＩ(ＩＩ、ＩＩ及びＩＶでのあまり強くない発現とラミナＩでの最小の発現を伴って)において高レベルに維持される。皮質サブプレートニューロンは、皮質内のその最終のシナプス標的までの途中の内に伸びる視床求心性神経に対する初期の一時的な足場を提供する。Allendoerfer及びShatz, Annu.Rev.Neurosci. 17:185-218 (1994)。逆に、サブプレートニューロンは、層Ｖからの皮質ニューロンがＶＩを選択して視床内に成長し、層Ｖからのニューロンが小丘、脳橋、及び脊髄においてその標的を選択するのに必要とされることが示唆されている(McConnell等, J.Neurosci. 14:1892-1907 (1994))。これらの突出の多くにおけるニューロトリミンの高レベルの発現はそれがその発達に関与していることを示唆している。
後脳において、ニューロトリミンメッセージ発現の高レベルはニューロトリミンはまた脳橋核内に及び小脳のプルキニエ細胞及び内部顆粒細胞によって観察された。脳橋核はＶ層の皮質脳橋線維を含む様々なソースから求心性線維の入力を受け取り、顆粒細胞への苔状線維を介しての求心性線維の入力の主要ソースであり、該顆粒細胞は次にプルキニエ細胞への平行線維を介しての求心性線維の入力の主たるソースである。[Palay及びChan-Palay, The cerebellar cortex: cytology and organization. New York: Springer (1974)]。これらニューロトリミンニューロンの高レベルの発現はこれらの回路の確率における強力な関与を示唆している。
ニューロトリミンはまた初期の出生後線条体において段階的な発現パターンを示す。ニューロトリミンの発現の増加はラットの背外側線条体上に横たわって見出される一方、より低いハイブリダイゼーション強さが腹側正中線条体上に横たわって見られる。Struyk等,上掲。より高いニューロトリミンハイブリダイゼーション強さのこの領域は細胞構造的に区別しうる領域に対応せず、むしろ、対側性感覚運動皮質のＶＩ層からの求心性入力の一次領域に対応する(Gerfen, Nature 311:461-464 (1984); Donoghue及びHerkenham, Brain Res. 365:397-403 (1986))。対照的に、腹側正中線条体は鼻周囲及び連合野からその大部分の求心性入力を受け取る。ＬＡＭＰ発現の相補的段階的パターンは線条体において、腹側正中領域において最も高い発現と背外側的に最も低い発現を伴って観察されている。Levitt, Science 223:299-301 (1985); Chesselet等, Neuroscience 40:725-733 (1991)。 While neurotrimin expression appears to be extensive, it appears to correlate with the development of several neural circuits. For example, between E18 and P10, neurothymine mRNA expression in the forebrain is less intense in developing thalamus, cortical subplates, and cortical neurons, particularly lamina V and VI (II, II and IV). Maintained at high levels (with no expression and minimal expression at Lamina I). Cortical subplate neurons provide an initial temporary scaffold for thalamic afferent nerves that extend in the middle of the cortex to its final synaptic target. Allendoerfer and Shatz, Annu. Rev. Neurosci. 17: 185-218 (1994). Conversely, subplate neurons are required for cortical neurons from layer V to select VI to grow into the thalamus, and for neurons from layer V to select their targets in the hills, pons, and spinal cord. (McConnell et al., J. Neurosci. 14: 1892-1907 (1994)). High levels of neurotrimin expression in many of these protrusions suggests that it is involved in its development.
In the hindbrain, high levels of neurotrimin message expression were also observed in the pontine nucleus and by cerebellar Purkinje cells and internal granule cells. The pontine nucleus receives afferent fiber input from various sources, including layer V cortical pontine pontine fiber, and is the primary source of afferent fiber input through the mossy fibers to the granule cells. Is then the main source of input of afferent fibers via parallel fibers to Purkinje cells. [Palay and Chan-Palay, The cerebellar cortex: cytology and organization. New York: Springer (1974)]. The high level expression of these neurotrimin neurons suggests a strong involvement in the probability of these circuits.
Neurotrimin also exhibits a graded expression pattern in the early postnatal striatum. Increased expression of neurotrimin is found lying on the rat dorsolateral striatum, while lower hybridization strength is seen lying on the ventral midstriatum. Struyk et al., Supra. This region of higher neurotrimin hybridization strength does not correspond to a region that can be distinguished from the cytostructure, but rather to the primary region of afferent input from the VI layer of the contralateral sensorimotor cortex (Gerfen, Nature 311: 461-464 (1984); Donoghue and Herkenham, Brain Res. 365: 397-403 (1986)). In contrast, the ventral midstriatum receives most of its afferent input from the peri-nasal and associated areas. Complementary stepwise patterns of LAMP expression have been observed in the striatum with the highest expression in the ventral midline region and the lowest dorsolateral expression. Levitt, Science 223: 299-301 (1985); Chesselet et al., Neuroscience 40: 725-733 (1991).

２３． ＰＲＯ１４１１
新規で未変性の分泌タンパク質を同定するための努力が、産業界と学術界の両方でなされている。多くの努力は、新規な分泌タンパク質のコード配列を同定するための哺乳動物組換えＤＮＡライブラリーのスクリーニングに注がれている。我々は、ここでＰＲＯ１４１１と命名する新規な分泌タンパク質の同定と特徴付けをここに記載する。 23. PRO1411
Efforts have been made in both industry and academia to identify new, native secreted proteins. Much effort is devoted to the screening of mammalian recombinant DNA libraries to identify novel secretory protein coding sequences. We describe here the identification and characterization of a novel secreted protein, designated herein as PRO1411.

２４． ＰＲＯ４３５６
グリコシルホスファチジルイノシトール(ＧＰＩ)固着プロテオグリカンは一般的に細胞表面に局在化し、よって多くの成長因子、細胞接着分子及び細胞外マトリクス成分に対する細胞の反応の調節に関与することが知られている。転移関連ＧＰＩ固着タンパク質(ＭＡＧＰＩＡＰ)は、これらの細胞表面タンパク質の一つであり転移に関与することがわかっている。転移は、形質転換された又は悪性の細胞が移動し、癌を一方の部位から他方へ拡げる癌の形態である。従って、転移及びＭＡＧＰＩＡＰに関連するポリペプチドの同定は興味の対象である。 24. PRO4356
Glycosylphosphatidylinositol (GPI) -anchored proteoglycans are generally known to be localized on the cell surface and thus involved in the regulation of cellular responses to many growth factors, cell adhesion molecules and extracellular matrix components. Metastasis-related GPI anchor protein (MAGPIAP) is one of these cell surface proteins and has been shown to be involved in metastasis. Metastasis is a form of cancer in which transformed or malignant cells migrate and spread the cancer from one site to another. Therefore, the identification of polypeptides related to metastasis and MAGPIAP is of interest.

２５． ＰＲＯ２４６
細胞表面タンパク質ＨＣＡＲは、アデノウイルスのサブグループＣ及びコクサッキーウイルスのサクグループＢに対するレセプターとして作用する膜結合タンパク質である。よって、ＨＣＡＲは細胞へのウイルス感染を媒介する手段を提供するものであり、細胞表面上にＨＣＡＲレセプターが存在すると、ウイルス粒子に対する結合部位が提供され、それによってウイルス感染が促進される。
膜結合タンパク質、特にウイルスに対する細胞表面レセプターを提供するものの生理学的重要性に鑑みて、新規で未変性の膜結合レセプタータンパク質を同定するための努力が、産業界及び学術界の双方により現在なされている。これらの多くの努力は、新規なレセプタータンパク質のコード配列を同定するために哺乳動物組換えＤＮＡライブラリーのスクリーニングに注がれている。我々は、ここでＡ３３及びガン胎児抗原を含む様々な腫瘍抗原及び細胞表面タンパク質ＨＣＡＲに対して相同性を有する新規な膜結合ポリペプチドポリペプチド(ここでＰＲＯ２４６と命名)をここに記載するもので、このポリペプチドは新規な細胞表面ウイルスレセプター又は腫瘍抗原でありうる。 25. PRO246
The cell surface protein HCAR is a membrane-bound protein that acts as a receptor for adenovirus subgroup C and coxsackievirus sacgroup B. Thus, HCAR provides a means of mediating viral infection of cells, and the presence of HCAR receptors on the cell surface provides a binding site for viral particles, thereby promoting viral infection.
In view of the physiological importance of membrane-bound proteins, particularly those that provide cell surface receptors for viruses, efforts are currently being made by both industry and academia to identify new and native membrane-bound receptor proteins. Yes. Many of these efforts are devoted to screening mammalian recombinant DNA libraries to identify novel receptor protein coding sequences. We herein describe a novel membrane-bound polypeptide polypeptide (herein designated PRO246) having homology to various tumor antigens, including A33 and carcinoembryonic antigen, and the cell surface protein HCAR. The polypeptide can be a novel cell surface viral receptor or tumor antigen.

２６． ＰＲＯ２６５
タンパク質-タンパク質相互作用はレセプター及び抗原複合体及びシグナル伝達機構を含む。タンパク質-タンパク質相互作用の基となる構造的及び機能的機構についてよく知られているように、タンパク質-タンパク質相互作用は、タンパク質-タンパク質相互作用の特定の結果を調節するように更に容易に操作することができる。従って、タンパク質-タンパク質相互作用の基となる機構は科学及び医学界にとって興味深い。
ロイシンリッチ反復を含む全てのタンパク質はタンパク質-タンパク質相互作用に関与していると考えられている。ロイシンリッチ反復は多様な機能を持つ多くのタンパク質と細胞位置に存在する短い配列モチーフである。リボヌクレアーゼインヒビタータンパク質の結晶構造から、ロイシンリッチ反復はβ-α構造単位に対応することが明らかになった。これらの単位は、一面が溶媒に暴露された平行なβシートを形成するように配置され、タンパク質は珍しい非球状の形状を獲得する。これらの二つの特徴はロイシンリッチ反復を含むタンパク質のタンパク質結合機能の原因であることが示されている。Kobe及びDeisenhofer, Trends Biochem.Sci., 19(10):415-421 (Oct.1994)を参照されたい。
個体発生の間にコラーゲン原線維を配向し指令する組織オーガナイザーとなり、創傷治癒、組織修復、及び腫瘍ストローマ形成のような病理プロセスに関与するロイシンリッチプロテオグリカンについて研究が報告されている。Iozzo, R.V., Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol., 32(2):141-174 (1997)。創傷治癒、組織修復におけるロイシンリッチタンパク質の関与を示す他の研究は、De La Salle, C.等, Vouv. Rev. Fr. Hematol. (Germany), 37(4):215-222 (1995)であり、出血疾患ベルナール-スーリエ症候群に伴う複合体におけるロイシンリッチモチーフの突然変異を報告しており、Chlemetson,K.J., Thromb. Haemost. (Germany),74(1):111-116 (July 1995)は、血小板がロイシンリッチ反復を有していることを報告している。ロイシンリッチ反復を有することが報告されている特に興味深い他のタンパク質は、アルツハイマー病のような神経変性疾患、パーキンソン病のような神経損傷の治療において、及びガンの診断に対して有用であることが報告されているＳＬＩＴタンパク質である。エール大学のArtavanistsakonas,S.及びRothberg,J.M.のWO9210518-A1を参照されたい。ロイシンリッチ反復を有するタンパク質の生物学的機能を報告している他の研究には：Tayar, N.等, Mol.Cell Endocrinol., (Ireland), 125(1-2):65-70 (Dec.1996)(ゴナドトロピンレセプター関連)；Miura,Y.等, Nippon Rinsho (Japan), 54(7):1784-1789 (July 1996)(アポトーシス関連)；Harris, P.C.等, J. Am. Soc. Nephrol., 6(4):1125-1133 (Oct.1995)(腎疾患関連)；及びLa Jolla Cancer Research FoundationのRuoslahti, E.I.等のWO9110727-A(トランスフォーミング成長因子βに結合するデコリンの、ガンの治療、創傷治癒及び瘢痕化への関与)が含まれる。また興味深いのはフィブロモジュリンと皮膚瘢痕化を防止又は低減するためのその使用である。フィブロモジュリンの研究はRouslahti等の米国特許第5,654,270に見いだされる。
よって、タンパク質-タンパク質相互作用をよりよく理解するためにロイシンリッチ反復を有する新規なタンパク質を同定するための努力が産業界と学術界の両方によってなされている。特に興味があるものはロイシンリッチ反復とフィブロモジュリン、SLITタンパク質及び血小板糖タンパク質Vのようなロイシンリッチ反復を有する既知のタンパク質と相同性を有するタンパク質である。多くの努力は、ロイシンリッチ反復を有する新規な分泌及び膜貫通タンパク質についてのコード化配列を同定するための哺乳動物組換えＤＮＡライブラリーのスクリーニングに集中している。ここで我々は、ここでＰＲＯ２６５ポリペプチドと命名する、フィブロモジュリンと相同性を有する新規なポリペプチドの同定及び特徴づけについて記載する。 26. PRO265
Protein-protein interactions include receptor and antigen complexes and signal transduction mechanisms. As is well known for the structural and functional mechanisms underlying protein-protein interactions, protein-protein interactions are more easily manipulated to modulate specific outcomes of protein-protein interactions. be able to. Thus, the mechanisms underlying protein-protein interactions are of interest to the scientific and medical communities.
All proteins containing leucine-rich repeats are thought to be involved in protein-protein interactions. Leucine rich repeats are short sequence motifs present in many proteins and cell locations with diverse functions. The crystal structure of the ribonuclease inhibitor protein revealed that leucine-rich repeats correspond to β-α structural units. These units are arranged to form parallel β-sheets with one side exposed to the solvent, and the protein acquires an unusual non-spherical shape. These two features have been shown to be responsible for the protein binding function of proteins containing leucine-rich repeats. See Kobe and Deisenhofer, Trends Biochem. Sci., 19 (10): 415-421 (Oct. 1994).
Studies have been reported on leucine-rich proteoglycans that become tissue organizers that direct and direct collagen fibrils during ontogeny and are involved in pathological processes such as wound healing, tissue repair, and tumor stromal formation. Iozzo, RV, Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol., 32 (2): 141-174 (1997). Other studies showing the involvement of leucine-rich proteins in wound healing and tissue repair are in De La Salle, C. et al., Vouv. Rev. Fr. Hematol. (Germany), 37 (4): 215-222 (1995) And reported mutations in the leucine-rich motif in the complex associated with the bleeding disorder Bernard-Soulier syndrome, Chlemetson, KJ, Thromb. Haemost. (Germany), 74 (1): 111-116 (July 1995) Report that platelets have leucine-rich repeats. Other particularly interesting proteins reported to have leucine-rich repeats may be useful in the treatment of neurodegenerative diseases such as Alzheimer's disease, nerve damage such as Parkinson's disease, and for the diagnosis of cancer. It is a reported SLIT protein. See Artavanistsakonas, S. and Yoth University, Yale University, WO9210518-A1. Other studies reporting biological functions of proteins with leucine-rich repeats include: Tayar, N. et al., Mol. Cell Endocrinol., (Ireland), 125 (1-2): 65-70 (Dec 1996) (gonadotropin receptor related); Miura, Y. et al., Nippon Rinsho (Japan), 54 (7): 1784-1789 (July 1996) (apoptosis related); Harris, PC et al., J. Am. Soc. Nephrol ., 6 (4): 1125-1133 (Oct. 1995) (renal disease related); and WO9110727-A (Ruoslahti, EI et al., La Jolla Cancer Research Foundation, of decorin binding to transforming growth factor β, cancer Treatment, involvement in wound healing and scarring). Also of interest is fibromodulin and its use to prevent or reduce skin scarring. A study of fibrojuline is found in US Pat. No. 5,654,270 to Rouslahti et al.
Thus, efforts have been made by both industry and academia to identify new proteins with leucine-rich repeats to better understand protein-protein interactions. Of particular interest are proteins that have homology to known proteins having leucine-rich repeats and leucine-rich repeats such as fibromodulin, SLIT protein and platelet glycoprotein V. Much effort has focused on screening mammalian recombinant DNA libraries to identify coding sequences for novel secreted and transmembrane proteins with leucine-rich repeats. Here we describe the identification and characterization of a novel polypeptide having homology to fibromodulin, designated herein as PRO265 polypeptide.

２７． ＰＲＯ９４１
カドヘリンは大きなファミリーの膜貫通タンパク質である。カドヘリンには、事実上、多細胞生物の全ての固体組織において細胞-細胞接着を媒介するように機能するカルシウム依存性糖タンパク質のファミリーが含まれる。少なくともカドヘリン１-１３並びにＢ、Ｅ、ＥＰ、Ｍ、Ｎ、Ｐ及びＲ型が同定され、特徴づけられている。幾つかの例外はあるが、カドヘリンの機能の中でも、カドヘリンが細胞凝集に関与しており、細胞-細胞接着部位に付随していることが知られている。最近、全てのカドヘリンが、細胞外ドメインの折り畳みに対応すると考えられているカドヘリン特異的モチーフの多重反復を分かち持つが、カドヘリンスーパーファミリーのメンバーは多様な構造、及びおそらくは機能を有していることが報告されている。特に、カドヘリンスーパーファミリーのメンバーはシグナル伝達に関連していることが報告されている。Suzuki, J. Cell. Biochem., 61(4):531-542(1996)。カドヘリンはさらに、Tanihara等, J. Cell Sci., 107(6):1697-1704(1994)、Aberle等, J. Cell. Biochem., 61(4):514-523(1996)及びTanihara等, Cell Adhes. Commun., 2(1):15-26(1994)にも記載されている。我々は、ここでＰＲＯ９４１と命名した、カドヘリンタンパク質に対して相同性を有する他の新規なポリペプチドの同定及び特徴づけについてここに記載する。 27. PRO941
Cadherins are a large family of transmembrane proteins. Cadherins include a family of calcium-dependent glycoproteins that function to mediate cell-cell adhesion in virtually all solid tissues of multicellular organisms. At least cadherins 1-13 and B, E, EP, M, N, P and R types have been identified and characterized. With some exceptions, cadherin is known to be involved in cell aggregation and associated with cell-cell adhesion sites among cadherin functions. Recently, all cadherins share multiple repeats of cadherin-specific motifs that are thought to correspond to extracellular domain folding, but members of the cadherin superfamily have diverse structures and possibly functions Has been reported. In particular, members of the cadherin superfamily have been reported to be associated with signal transduction. Suzuki, J. Cell. Biochem., 61 (4): 531-542 (1996). Cadherins are further described in Tanihara et al., J. Cell Sci., 107 (6): 1697-1704 (1994), Aberle et al., J. Cell. Biochem., 61 (4): 514-523 (1996) and Tanihara et al., Cell Adhes. Commun., 2 (1): 15-26 (1994). We describe here the identification and characterization of another novel polypeptide, designated herein as PRO941, that has homology to the cadherin protein.

２８． ＰＲＯ１００９６
インターロイキン-１０(ＩＬ-１０)は多面的な免疫抑制サイトカインであり、骨髄及びリンパ細胞の機能の重要なレギュレータとして関連している。ＩＬ-１０が、例えばＩＬ-１、ＩＬ-６、ＩＦＮ-γ及びＴＮＦ-αを含む種々の炎症性サイトカインの合成活性化の強力なインヒビターとして機能することが示されている(Gesser等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 14620-14625 (1997))。さらに、ＩＬ-１０はマクロファージの付属的活性の幾つかを強く阻害し、それによりマクロファージ、Ｔ細胞及びＮＫ細胞のエフェクター機能の強力なサプレッサとして機能することが示されている(Kuhn等, Cell 75: 263-274 (1993))。さらに、ＩＬ-１０はＢ細胞、肥満細胞及び胸腺細胞分化の調節と強く関係している。
ＩＬ-１０は２つの別の実験系から独立に同定された。第１に、マウスＩＬ-１０をコードするｃＤＮＡクローンが、サイトカイン合成阻害因子の発現に基づいて同定され(Moore等, Science 248: 1230-1234 (1990))、ヒトＩＬ-１０対応ｃＤＮＡが続いてマウスＩＬ-１０ｃＤＮＡでの交差ハイブリッド形成によって同定された(Viera等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 1172-1176 (1991))。さらにＩＬ-１０は、活性胸腺を同時刺激するように機能するＢ細胞由来のメディエータとして独立に同定された(Suda等, Cell Immunol., 129: 228 (1990))。
ここで我々は、ここでＰＲＯ１００９６ポリペプチドと命名する、ＩＬ-１０と配列類似性を持つ新規なポリペプチドの同定及び特徴づけについて記載する。 28. PRO10096
Interleukin-10 (IL-10) is a pleiotropic immunosuppressive cytokine and has been implicated as an important regulator of bone marrow and lymphocyte function. IL-10 has been shown to function as a potent inhibitor of synthetic activation of various inflammatory cytokines including, for example, IL-1, IL-6, IFN-γ and TNF-α (Gesser et al., Proc Natl. Acad. Sci. USA 94: 14620-14625 (1997)). Furthermore, IL-10 has been shown to strongly inhibit some of the macrophage accessory activities, thereby acting as a potent suppressor of macrophage, T cell and NK cell effector functions (Kuhn et al., Cell 75). : 263-274 (1993)). Furthermore, IL-10 is strongly associated with the regulation of B cell, mast cell and thymocyte differentiation.
IL-10 was identified independently from two separate experimental systems. First, a cDNA clone encoding mouse IL-10 was identified based on the expression of cytokine synthesis inhibitors (Moore et al., Science 248: 1230-1234 (1990)), followed by human IL-10 corresponding cDNA. Identified by cross-hybridization with mouse IL-10 cDNA (Viera et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 1172-1176 (1991)). In addition, IL-10 was independently identified as a B cell-derived mediator that functions to costimulate the active thymus (Suda et al., Cell Immunol., 129: 228 (1990)).
Here we describe the identification and characterization of a novel polypeptide having sequence similarity to IL-10, designated herein as PRO10096 polypeptide.

２９． ＰＲＯ６００３
新規で未変性のレセプター又は膜結合タンパク質を同定するための努力が、産業界と学術界の両方でなされている。多くの努力は、新規なレセプター又は膜結合タンパク質のコード配列を同定するための哺乳動物組換えＤＮＡライブラリーのスクリーニングに注がれている。我々は、ここでＰＲＯ６００３ポリペプチドと命名する新規なポリペプチドの同定と特徴付けをここに記載する。 29. PRO6003
Efforts have been made in both industry and academia to identify new, native receptors or membrane-bound proteins. Much effort is devoted to screening mammalian recombinant DNA libraries to identify novel receptor or membrane-bound protein coding sequences. We describe here the identification and characterization of a novel polypeptide, designated herein as the PRO6003 polypeptide.

(発明の概要)
本発明の一実施態様では、本発明はここに記載したポリペプチドの任意のものをコードするＤＮＡを含んでなるベクターを提供する。そのようなベクターを含んでなる宿主細胞もまた提供される。例を挙げると、宿主細胞はＣＨＯ細胞、大腸菌、又は酵母でありうる。ここに記載のポリペプチドの任意のものを生産するための方法が更に提供され、これは、所望のポリペプチドの発現に適した条件下で宿主細胞を培養し、細胞培養物から所望のポリペプチドを回収することを含んでなる。
他の実施態様では、本発明は、異種性ポリぺプチド又はアミノ酸配列に融合したここに記載のポリペプチドの任意のものを含んでなるキメラ分子を提供する。そのようなキメラ分子の例は、免疫グロブリンのＦｃ領域又はエピトープタグ配列に融合したここに記載のポリペプチドの任意のものが含まれる。
他の実施態様では、本発明は上述の又は下記のポリペプチドの任意のものに特異的に結合する抗体を提供する。場合によっては、抗体はモノクローナル抗体、ヒト化抗体、抗体断片又は一本鎖抗体である。
さらに他の実施態様では、本発明は、アンチセンスプローブとして又はゲノム及びｃＤＮＡヌクレオチド配列を単離するために有用なオリゴヌクレオチドプローブを提供し、ここでこれらプローブは上述の又は下記のヌクレオチド配列の任意のものから誘導されうる。
他の実施態様では、本発明はＰＲＯポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含んでなる単離された核酸分子を提供する。
一態様では、単離された核酸分子は、(ａ)ここに開示された全長アミノ酸配列、ここに開示されたシグナルペプチドを欠くアミノ酸配列、シグナルペプチドを伴うか伴わないここに開示した膜貫通タンパク質の細胞外ドメイン、又はここに開示された全長アミノ酸配列の任意の他の特に定められた断片を有するＰＲＯポリペプチドをコードするＤＮＡ分子、又は(ｂ)(ａ)のＤＮＡ分子の補体に対して、少なくとも約８０％の核酸配列同一性、又は少なくとも約８１％の核酸配列同一性、又は少なくとも約８２％の核酸配列同一性、又は少なくとも約８３％の核酸配列同一性、又は少なくとも約８４％の核酸配列同一性、又は少なくとも約８５％の核酸配列同一性、又は少なくとも約８６％の核酸配列同一性、又は少なくとも約８７％の核酸配列同一性、又は少なくとも約８８％の核酸配列同一性、又は少なくとも約８９％の核酸配列同一性、又は少なくとも約９０％の核酸配列同一性、又は少なくとも約９１％の核酸配列同一性、又は少なくとも約９２％の核酸配列同一性、又は少なくとも約９３％の核酸配列同一性、又は少なくとも約９４％の核酸配列同一性、又は少なくとも約９５％の核酸配列同一性、又は少なくとも約９６％の核酸配列同一性、又は少なくとも約９７％の核酸配列同一性、又は少なくとも約９８％の核酸配列同一性、そして又は少なくとも約９９％の核酸配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。 (Summary of Invention)
In one embodiment of the invention, the invention provides a vector comprising DNA encoding any of the polypeptides described herein. Host cells comprising such vectors are also provided. By way of example, the host cell can be a CHO cell, E. coli, or yeast. Further provided is a method for producing any of the polypeptides described herein, wherein the host cells are cultured under conditions suitable for expression of the desired polypeptide, and the desired polypeptide is derived from the cell culture. Recovering.
In other embodiments, the invention provides chimeric molecules comprising any of the herein described polypeptides fused to a heterologous polypeptide or amino acid sequence. Examples of such chimeric molecules include any of the polypeptides described herein fused to an immunoglobulin Fc region or epitope tag sequence.
In other embodiments, the invention provides antibodies that specifically bind to any of the above or below described polypeptides. In some cases, the antibody is a monoclonal antibody, a humanized antibody, an antibody fragment or a single chain antibody.
In yet another embodiment, the present invention provides oligonucleotide probes useful as antisense probes or for isolating genomic and cDNA nucleotide sequences, wherein these probes are any of the nucleotide sequences described above or below. Can be derived from
In another embodiment, the present invention provides an isolated nucleic acid molecule comprising a nucleotide sequence encoding a PRO polypeptide.
In one aspect, an isolated nucleic acid molecule comprises (a) a full-length amino acid sequence disclosed herein, an amino acid sequence that lacks a signal peptide disclosed herein, a transmembrane protein disclosed herein with or without a signal peptide Or a DNA molecule encoding a PRO polypeptide having any other specifically defined fragment of the full-length amino acid sequence disclosed herein, or (b) the complement of the DNA molecule of (a) At least about 80% nucleic acid sequence identity, or at least about 81% nucleic acid sequence identity, or at least about 82% nucleic acid sequence identity, or at least about 83% nucleic acid sequence identity, or at least about 84%. Nucleic acid sequence identity, or at least about 85% nucleic acid sequence identity, or at least about 86% nucleic acid sequence identity, or at least about 87% nucleic acid sequence Identity, or at least about 88% nucleic acid sequence identity, or at least about 89% nucleic acid sequence identity, or at least about 90% nucleic acid sequence identity, or at least about 91% nucleic acid sequence identity, or at least about 92% nucleic acid sequence identity, or at least about 93% nucleic acid sequence identity, or at least about 94% nucleic acid sequence identity, or at least about 95% nucleic acid sequence identity, or at least about 96% nucleic acid sequence identity Or a nucleotide sequence having at least about 97% nucleic acid sequence identity, or at least about 98% nucleic acid sequence identity, and / or at least about 99% nucleic acid sequence identity.

他の態様では、単離された核酸分子は、(ａ)ここに開示された全長ＰＲＯポリペプチドｃＤＮＡのコード配列、ここに開示されたシグナルペプチドを欠くＰＲＯポリペプチドｃＤＮＡのコード配列、シグナルペプチドを伴うか伴わないここに開示した膜貫通ＰＲＯポリペプチドの細胞外ドメインのコード配列、又はここに開示された全長アミノ酸配列の任意の他の特に定められた断片のコード配列を含むＤＮＡ分子、又は(ｂ)(ａ)のＤＮＡ分子の補体に対して、少なくとも約８０％の核酸配列同一性、又は少なくとも約８１％の核酸配列同一性、又は少なくとも約８２％の核酸配列同一性、又は少なくとも約８３％の核酸配列同一性、又は少なくとも約８４％の核酸配列同一性、又は少なくとも約８５％の核酸配列同一性、又は少なくとも約８６％の核酸配列同一性、又は少なくとも約８７％の核酸配列同一性、又は少なくとも約８８％の核酸配列同一性、又は少なくとも約８９％の核酸配列同一性、又は少なくとも約９０％の核酸配列同一性、又は少なくとも約９１％の核酸配列同一性、又は少なくとも約９２％の核酸配列同一性、又は少なくとも約９３％の核酸配列同一性、又は少なくとも約９４％の核酸配列同一性、又は少なくとも約９５％の核酸配列同一性、又は少なくとも約９６％の核酸配列同一性、又は少なくとも約９７％の核酸配列同一性、又は少なくとも約９８％の核酸配列同一性、そして又は少なくとも約９９％の核酸配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。
さらなる態様では、本発明は、(ａ)ここに開示されたＡＴＴＣに寄託されたヒトタンパク質ｃＤＮＡの任意のものによりコードされる同じ成熟ポリペプチドをコードするＤＮＡ分子、又は(ｂ)(ａ)のＤＮＡ分子の補体に対して、少なくとも約８０％の核酸配列同一性、又は少なくとも約８１％の核酸配列同一性、又は少なくとも約８２％の核酸配列同一性、又は少なくとも約８３％の核酸配列同一性、又は少なくとも約８４％の核酸配列同一性、又は少なくとも約８５％の核酸配列同一性、又は少なくとも約８６％の核酸配列同一性、又は少なくとも約８７％の核酸配列同一性、又は少なくとも約８８％の核酸配列同一性、又は少なくとも約８９％の核酸配列同一性、又は少なくとも約９０％の核酸配列同一性、又は少なくとも約９１％の核酸配列同一性、又は少なくとも約９２％の核酸配列同一性、又は少なくとも約９３％の核酸配列同一性、又は少なくとも約９４％の核酸配列同一性、又は少なくとも約９５％の核酸配列同一性、又は少なくとも約９６％の核酸配列同一性、又は少なくとも約９７％の核酸配列同一性、又は少なくとも約９８％の核酸配列同一性、そして又は少なくとも約９９％の核酸配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。
本発明の他の態様は、膜貫通ドメインが欠失されているか膜貫通ドメインが不活性化されているＰＲＯポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含んでなる単離された核酸分子を提供し、またはそのようなコード化ヌクレオチド配列に相補的であり、ここでそのようなポリペプチドの膜貫通ドメインがここに開示される。従って、ここに記載されたＰＲＯポリペプチドの可溶性細胞外ドメインが考慮される。 In other embodiments, the isolated nucleic acid molecule comprises (a) a coding sequence of a full-length PRO polypeptide cDNA disclosed herein, a coding sequence of a PRO polypeptide cDNA lacking a signal peptide disclosed herein, a signal peptide A DNA molecule comprising the coding sequence of the extracellular domain of a transmembrane PRO polypeptide disclosed herein with or without, or the coding sequence of any other specifically defined fragment of the full-length amino acid sequence disclosed herein, or ( b) at least about 80% nucleic acid sequence identity, or at least about 81% nucleic acid sequence identity, or at least about 82% nucleic acid sequence identity, or at least about the complement of the DNA molecule of (a) 83% nucleic acid sequence identity, or at least about 84% nucleic acid sequence identity, or at least about 85% nucleic acid sequence identity, or at least about 8 % Nucleic acid sequence identity, or at least about 87% nucleic acid sequence identity, or at least about 88% nucleic acid sequence identity, or at least about 89% nucleic acid sequence identity, or at least about 90% nucleic acid sequence identity Or at least about 91% nucleic acid sequence identity, or at least about 92% nucleic acid sequence identity, or at least about 93% nucleic acid sequence identity, or at least about 94% nucleic acid sequence identity, or at least about 95%. Nucleic acid sequence identity, or at least about 96% nucleic acid sequence identity, or at least about 97% nucleic acid sequence identity, or at least about 98% nucleic acid sequence identity, and / or at least about 99% nucleic acid sequence identity A nucleotide sequence having
In a further aspect, the invention provides (a) a DNA molecule encoding the same mature polypeptide encoded by any of the human protein cDNAs deposited with the ATTC disclosed herein, or (b) of (a) At least about 80% nucleic acid sequence identity, or at least about 81% nucleic acid sequence identity, or at least about 82% nucleic acid sequence identity, or at least about 83% nucleic acid sequence identity to the complement of the DNA molecule Or at least about 84% nucleic acid sequence identity, or at least about 85% nucleic acid sequence identity, or at least about 86% nucleic acid sequence identity, or at least about 87% nucleic acid sequence identity, or at least about 88 % Nucleic acid sequence identity, or at least about 89% nucleic acid sequence identity, or at least about 90% nucleic acid sequence identity, or at least about 91% nucleic acid Column identity, or at least about 92% nucleic acid sequence identity, or at least about 93% nucleic acid sequence identity, or at least about 94% nucleic acid sequence identity, or at least about 95% nucleic acid sequence identity, or at least Nucleotide sequences having about 96% nucleic acid sequence identity, or at least about 97% nucleic acid sequence identity, or at least about 98% nucleic acid sequence identity, and / or at least about 99% nucleic acid sequence identity.
Another aspect of the present invention provides an isolated nucleic acid molecule comprising a nucleotide sequence encoding a PRO polypeptide in which the transmembrane domain is deleted or the transmembrane domain is inactivated, or Complementary to such an encoded nucleotide sequence, where the transmembrane domain of such a polypeptide is disclosed herein. Accordingly, the soluble extracellular domains of the PRO polypeptides described herein are contemplated.

他の実施態様はＰＲＯポリペプチドコード化配列の断片、又はその補体に向けられ、それらは、例えば、場合によっては抗-ＰＲＯ抗体に対する結合部位を含むポリペプチドをコードするＰＲＯポリペプチドのコード化断片のハイブリッド形成プローブとして、又はアンチセンスオリゴヌクレオチドプローブとしての用途が見いだされる。このような核酸断片は、通常は少なくとも約２０ヌクレオチド長、又は少なくとも約３０ヌクレオチド長、又は少なくとも約４０ヌクレオチド長、又は少なくとも約５０ヌクレオチド長、又は少なくとも約６０ヌクレオチド長、又は少なくとも約７０ヌクレオチド長、又は少なくとも約８０ヌクレオチド長、又は少なくとも約９０ヌクレオチド長、又は少なくとも約１００ヌクレオチド長、又は少なくとも約１１０ヌクレオチド長、又は少なくとも約１２０ヌクレオチド長、又は少なくとも約１３０ヌクレオチド長、又は少なくとも約１４０ヌクレオチド長、又は少なくとも約１５０ヌクレオチド長、又は少なくとも約１６０ヌクレオチド長、又は少なくとも約１７０ヌクレオチド長、又は少なくとも約１８０ヌクレオチド長、又は少なくとも約１９０ヌクレオチド長、又は少なくとも約２００ヌクレオチド長、又は少なくとも約２５０ヌクレオチド長、又は少なくとも約３００ヌクレオチド長、又は少なくとも約３５０ヌクレオチド長、又は少なくとも約４００ヌクレオチド長、又は少なくとも約４５０ヌクレオチド長、又は少なくとも約５００ヌクレオチド長、又は少なくとも約６００ヌクレオチド長、又は少なくとも約７００ヌクレオチド長、又は少なくとも約８００ヌクレオチド長、又は少なくとも約９００ヌクレオチド長、及び又は少なくとも約１０００ヌクレオチド長であり、ここで「約」という語の内容は参照する長さのプラス又はマイナス１０％のヌクレオチド配列長を指すことを意味する。ＰＲＯポリペプチドコード化ヌクレオチド配列の新規な断片は、多くの良く知られた配列アラインメントプログラムの任意のものを用いてＰＲＯポリペプチドコード化ヌクレオチド配列と他の公知のヌクレオチド配列とを整列させ、いずれのＰＲＯポリペプチドコード化ヌクレオチド配列断片が新規であるかを決定することにより、日常的な手法で同定してもよい。このようなＰＲＯポリペプチドコード化ヌクレオチド配列は全てここで考慮される。また、これらのヌクレオチド分子断片、好ましくは抗-ＰＲＯ抗体に対する結合部位を含むＰＲＯポリペプチド断片によってコードされるＰＲＯポリペプチド断片も考慮される。
他の実施態様では、本発明は上記において同定した単離核酸配列の任意のものによりコードされる単離されたＰＲＯポリペプチドを提供する。 Other embodiments are directed to fragments of the PRO polypeptide coding sequence, or complements thereof, which encode, for example, a PRO polypeptide that encodes a polypeptide that optionally includes a binding site for an anti-PRO antibody. Applications are found as fragment hybridization probes or as antisense oligonucleotide probes. Such nucleic acid fragments are typically at least about 20 nucleotides in length, or at least about 30 nucleotides in length, or at least about 40 nucleotides in length, or at least about 50 nucleotides in length, or at least about 60 nucleotides in length, or at least about 70 nucleotides in length, Or at least about 80 nucleotides, or at least about 90 nucleotides, or at least about 100 nucleotides, or at least about 110 nucleotides, or at least about 120 nucleotides, or at least about 130 nucleotides, or at least about 140 nucleotides, or At least about 150 nucleotides in length, or at least about 160 nucleotides in length, or at least about 170 nucleotides in length, or at least about 180 nucleotides in length, or at least About 190 nucleotides, or at least about 200 nucleotides, or at least about 250 nucleotides, or at least about 300 nucleotides, or at least about 350 nucleotides, or at least about 400 nucleotides, or at least about 450 nucleotides, or at least about 500 nucleotides long, or at least about 600 nucleotides long, or at least about 700 nucleotides long, or at least about 800 nucleotides long, or at least about 900 nucleotides long, and / or at least about 1000 nucleotides long, where the term “about” Content is meant to refer to a nucleotide sequence length that is plus or minus 10% of the referenced length. A novel fragment of a PRO polypeptide-encoding nucleotide sequence aligns the PRO polypeptide-encoding nucleotide sequence with other known nucleotide sequences using any of a number of well-known sequence alignment programs, By determining whether a PRO polypeptide-encoding nucleotide sequence fragment is novel, it may be identified by routine techniques. All such PRO polypeptide-encoding nucleotide sequences are contemplated herein. Also contemplated are PRO polypeptide fragments encoded by these nucleotide molecule fragments, preferably PRO polypeptide fragments comprising a binding site for an anti-PRO antibody.
In another embodiment, the present invention provides an isolated PRO polypeptide encoded by any of the isolated nucleic acid sequences identified above.

ある態様では、本発明は、ここに開示された全長アミノ酸配列、ここに開示されたシグナルペプチドを欠く全長アミノ酸配列、シグナルペプチドを伴うか伴わないここに開示した膜貫通タンパク質の細胞外ドメイン、又はここに開示された全長アミノ酸配列の任意の他の特に定められた断片を有するＰＲＯポリペプチドに対して、少なくとも約８０％のアミノ酸配列同一性、又は少なくとも約８１％のアミノ酸配列同一性、又は少なくとも約８２％のアミノ酸配列同一性、又は少なくとも約８３％のアミノ酸配列同一性、又は少なくとも約８４％のアミノ酸配列同一性、又は少なくとも約８５％のアミノ酸配列同一性、又は少なくとも約８６％のアミノ酸配列同一性、又は少なくとも約８７％のアミノ酸配列同一性、又は少なくとも約８８％のアミノ酸配列同一性、又は少なくとも約８９％のアミノ酸配列同一性、又は少なくとも約９０％のアミノ酸配列同一性、又は少なくとも約９１％のアミノ酸配列同一性、又は少なくとも約９２％のアミノ酸配列同一性、又は少なくとも約９３％のアミノ酸配列同一性、又は少なくとも約９４％のアミノ酸配列同一性、又は少なくとも約９５％のアミノ酸配列同一性、又は少なくとも約９６％のアミノ酸配列同一性、又は少なくとも約９７％のアミノ酸配列同一性、又は少なくとも約９８％のアミノ酸配列同一性、そして又は少なくとも約９９％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む単離されたＰＲＯポリペプチドに関する。
さらなる態様では、本発明は、ここに開示するＡＴＣＣに寄託されたヒトタンパク質ｃＤＮＡの任意のものにコードされるアミノ酸配列に対して少なくとも約８０％のアミノ酸配列同一性、又は少なくとも約８１％のアミノ酸配列同一性、又は少なくとも約８２％のアミノ酸配列同一性、又は少なくとも約８３％のアミノ酸配列同一性、又は少なくとも約８４％のアミノ酸配列同一性、又は少なくとも約８５％のアミノ酸配列同一性、又は少なくとも約８６％のアミノ酸配列同一性、又は少なくとも約８７％のアミノ酸配列同一性、又は少なくとも約８８％のアミノ酸配列同一性、又は少なくとも約８９％のアミノ酸配列同一性、又は少なくとも約９０％のアミノ酸配列同一性、又は少なくとも約９１％のアミノ酸配列同一性、又は少なくとも約９２％のアミノ酸配列同一性、又は少なくとも約９３％のアミノ酸配列同一性、又は少なくとも約９４％のアミノ酸配列同一性、又は少なくとも約９５％のアミノ酸配列同一性、又は少なくとも約９６％のアミノ酸配列同一性、又は少なくとも約９７％のアミノ酸配列同一性、又は少なくとも約９８％のアミノ酸配列同一性、そして又は少なくとも約９９％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む単離されたＰＲＯポリペプチドに関する。
さらなる態様では、本発明は、ここに開示する全長アミノ酸配列、ここに開示するシグナルペプチドを欠くアミノ酸配列、シグナルペプチド伴うか伴わないここに開示された膜貫通タンパク質の細胞外ドメイン、又はここに開示する全長アミノ酸配列の任意の他の特に定められた断片を有するＰＲＯポリペプチドのアミノ酸配列と比較したときに、少なくとも約８０％ポジティブ、又は少なくとも約８１％ポジティブ、又は少なくとも約８２％ポジティブ、又は少なくとも約８３％ポジティブ、又は少なくとも約８４％ポジティブ、又は少なくとも約８５％ポジティブ、又は少なくとも約８６％ポジティブ、又は少なくとも約８７％ポジティブ、又は少なくとも約８８％ポジティブ、又は少なくとも約８９％ポジティブ、又は少なくとも約９０％ポジティブ、又は少なくとも約９１％ポジティブ、又は少なくとも約９２％ポジティブ、又は少なくとも約９３％ポジティブ、又は少なくとも約９４％ポジティブ、又は少なくとも約９５％ポジティブ、又は少なくとも約９６％ポジティブ、又は少なくとも約９７％ポジティブ、又は少なくとも約９８％ポジティブ、そして又は少なくとも約９９％ポジティブのスコアとされるアミノ酸配列を含む単離されたＰＲＯポリペプチドに関する。 In certain aspects, the invention provides a full-length amino acid sequence disclosed herein, a full-length amino acid sequence that lacks a signal peptide disclosed herein, an extracellular domain of a transmembrane protein disclosed herein with or without a signal peptide, or At least about 80% amino acid sequence identity, or at least about 81% amino acid sequence identity to a PRO polypeptide having any other specifically defined fragment of the full-length amino acid sequence disclosed herein, or at least About 82% amino acid sequence identity, or at least about 83% amino acid sequence identity, or at least about 84% amino acid sequence identity, or at least about 85% amino acid sequence identity, or at least about 86% amino acid sequence Identity, or at least about 87% amino acid sequence identity, or at least about 88% Amino acid sequence identity, or at least about 89% amino acid sequence identity, or at least about 90% amino acid sequence identity, or at least about 91% amino acid sequence identity, or at least about 92% amino acid sequence identity; or At least about 93% amino acid sequence identity, or at least about 94% amino acid sequence identity, or at least about 95% amino acid sequence identity, or at least about 96% amino acid sequence identity, or at least about 97% amino acid It relates to an isolated PRO polypeptide comprising an amino acid sequence having sequence identity, or at least about 98% amino acid sequence identity, and / or at least about 99% amino acid sequence identity.
In a further aspect, the invention provides at least about 80% amino acid sequence identity to the amino acid sequence encoded by any of the human protein cDNAs deposited with the ATCC disclosed herein, or at least about 81% amino acids. Sequence identity, or at least about 82% amino acid sequence identity, or at least about 83% amino acid sequence identity, or at least about 84% amino acid sequence identity, or at least about 85% amino acid sequence identity, or at least About 86% amino acid sequence identity, or at least about 87% amino acid sequence identity, or at least about 88% amino acid sequence identity, or at least about 89% amino acid sequence identity, or at least about 90% amino acid sequence Identity, or at least about 91% amino acid sequence identity, or at least About 92% amino acid sequence identity, or at least about 93% amino acid sequence identity, or at least about 94% amino acid sequence identity, or at least about 95% amino acid sequence identity, or at least about 96% amino acid sequence An isolated PRO polypeptide comprising an amino acid sequence having identity, or at least about 97% amino acid sequence identity, or at least about 98% amino acid sequence identity, and / or at least about 99% amino acid sequence identity .
In a further aspect, the invention provides a full-length amino acid sequence disclosed herein, an amino acid sequence lacking a signal peptide disclosed herein, an extracellular domain of a transmembrane protein disclosed herein with or without a signal peptide, or disclosed herein At least about 80% positive, or at least about 81% positive, or at least about 82% positive, or at least when compared to the amino acid sequence of a PRO polypeptide having any other specifically defined fragment of the full-length amino acid sequence About 83% positive, or at least about 84% positive, or at least about 85% positive, or at least about 86% positive, or at least about 87% positive, or at least about 88% positive, or at least about 89% positive, or at least about 9 % Positive, or at least about 91% positive, or at least about 92% positive, or at least about 93% positive, or at least about 94% positive, or at least about 95% positive, or at least about 96% positive, or at least about 97% It relates to an isolated PRO polypeptide comprising an amino acid sequence that is scored positive, or at least about 98% positive, and / or at least about 99% positive.

特定の態様では、本発明は、Ｎ末端シグナル配列及び／又は開始メチオニンを持たない単離されたＰＲＯポリペプチドを提供し、それは上述したそのようなアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列によりコードされる。これを生産する方法もまたここに記載され、ここで、これらの方法はＰＲＯポリペプチドの発現に適した条件下で適当なコード化核酸分子を含むベクターを含んでなる宿主細胞を培養し、細胞培養物からＰＲＯポリペプチドを回収することを含んでなる。
本発明の他の態様は、膜貫通ドメインが欠失されたか膜貫通ドメインが不活性化された単離されたＰＲＯポリペプチドを提供する。これを生産する方法もまたここに記載され、ここで、これらの方法はＰＲＯポリペプチドの発現に適した条件下で適当なコード化核酸分子を含むベクターを含んでなる宿主細胞を培養し、細胞培養物からＰＲＯポリペプチドを回収することを含んでなる。
さらに他の実施態様では、本発明は、ここで特定した天然ＰＲＯポリペプチドのアゴニスト及びアンタゴニストに関する。特定の実施態様では、アゴニスト又はアンタゴニストは抗-ＰＲＯ抗体又は小分子である。
さらなる実施態様では、本発明は、ＰＲＯポリペプチドを候補分子と接触させ、前記ＰＲＯポリペプチドによって媒介される生物活性を監視することを含んでなる、ＰＲＯポリペプチドに対するアゴニスト又はアンタゴニストの同定方法に関する。好ましくは、ＰＲＯポリペプチドは天然ＰＲＯポリペプチドである。
またさらなる実施態様では、本発明は、ＰＲＯポリペプチド、又はここに記載されたＰＲＯポリペプチドのアゴニスト又はアンタゴニスト、又は抗-ＰＲＯ抗体を担体とともに含んでなる物質の組成物に関する。場合によっては、担体は製薬的に許容される担体である。
本発明の他の実施態様は、ＰＲＯポリペプチド、又は上記したようなそのアゴニスト又はアンタゴニスト、又は抗-ＰＲＯ抗体の、ＰＲＯポリペプチド、そのアゴニスト又はアンタゴニスト又は抗-ＰＲＯ抗体に応答性である症状の治療に有用な医薬の調製のための使用に向けられる。 In a particular aspect, the invention provides an isolated PRO polypeptide that does not have an N-terminal signal sequence and / or an initiation methionine, which is encoded by a nucleotide sequence that encodes such an amino acid sequence described above. Methods for producing it are also described herein, wherein these methods are used to cultivate a host cell comprising a vector containing a suitable encoding nucleic acid molecule under conditions suitable for expression of the PRO polypeptide. Recovering the PRO polypeptide from the culture.
Other aspects of the invention provide isolated PRO polypeptides in which the transmembrane domain is deleted or the transmembrane domain is inactivated. Methods for producing it are also described herein, wherein these methods are used to cultivate a host cell comprising a vector containing a suitable encoding nucleic acid molecule under conditions suitable for expression of the PRO polypeptide. Recovering the PRO polypeptide from the culture.
In yet another embodiment, the present invention relates to agonists and antagonists of the native PRO polypeptides identified herein. In certain embodiments, the agonist or antagonist is an anti-PRO antibody or small molecule.
In a further embodiment, the invention relates to a method for identifying an agonist or antagonist for a PRO polypeptide comprising contacting the PRO polypeptide with a candidate molecule and monitoring biological activity mediated by said PRO polypeptide. Preferably, the PRO polypeptide is a native PRO polypeptide.
In yet a further embodiment, the invention relates to a composition of matter comprising a PRO polypeptide, or an agonist or antagonist of a PRO polypeptide described herein, or an anti-PRO antibody, together with a carrier. In some cases, the carrier is a pharmaceutically acceptable carrier.
Another embodiment of the invention is for a PRO polypeptide, or an agonist or antagonist thereof, as described above, or an anti-PRO antibody, of a condition that is responsive to the PRO polypeptide, its agonist or antagonist, or anti-PRO antibody. It is directed to use for the preparation of a medicament useful for therapy.

(好適な実施態様の詳細な説明)
Ｉ．定義
ここで使用される際の「ＰＲＯポリペプチド」及び「ＰＲＯ」という用語は、直後に数値符号がある場合に種々のポリペプチドを指し、完全な符号(例えば、ＰＲＯ／数字)は、ここに記載する特定のポリペプチド配列を称する。ここで使用される「ＰＲＯ／数字ポリペプチド」及び「ＰＲＯ／数字」であって、「数字」がここで使用される実際の数値符号として与えられる用語は、天然配列ポリペプチド及びポリペプチド変異体(ここで更に詳細に定義する)を含む。ここに記載されるＰＲＯポリペプチドは、ヒト組織型又は他の供給源といった種々の供給源から単離してもよく、組換え又は合成方法によって調製してもよい。「ＰＲＯポリペプチド」なる用語は、ここで記載する個々のＰＲＯ／数字ポリペプチドを意味する。「ＰＲＯポリペプチド」に言及するこの明細書中の全ての開示は、ポリペプチドのそれぞれを個々に又は併せて意味する。例えば、調製、精製、誘導、抗体生成、投与、それを含有する組成物、それによる病気の治療などが、本発明の各ポリペプチドにそれぞれ関与している。また「ＰＲＯポリペプチド」なる用語には、ここに開示されるＰＲＯ／数字ポリペプチドの変異体も含まれる。
「天然配列ＰＲＯポリペプチド」は、天然由来の対応するＰＲＯポリペプチドと同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含んでいる。このような天然配列ＰＲＯポリペプチドは、自然から単離することもできるし、組換え又は合成手段により生産することもできる。「天然配列ＰＲＯポリペプチド」という用語には、特に、特定のＰＲＯポリペプチドの自然に生じる切断又は分泌形態(例えば、細胞外ドメイン配列)、自然に生じる変異形態(例えば、選択的にスプライシングされた形態)及びそのポリペプチドの自然に生じる対立遺伝子変異体が含まれる。本発明の種々の実施態様において、天然配列ＰＲＯポリペプチドは、添付の図面に示される全長アミノ酸配列を含む成熟又は全長天然配列ポリペプチドである。開始及び停止コドンは、図において太字及び下線で示した。しかし、添付の図面に開示したＰＲＯポリペプチドは、図面におけるアミノ酸１としてここに命名されるメチオニン残基で始まるように示されているが、図面におけるアミノ酸位置１の上流又は下流に位置する他のメチオニン残基をＰＲＯポリペプチドの開始アミノ酸残基として用いることも考えられるし可能でもある。
ＰＲＯポリペプチド「細胞外ドメイン」又は「ＥＣＤ」は、膜貫通及び細胞質ドメインを実質的に有しないＰＲＯポリペプチドの形態を称する。通常、ＰＲＯポリペプチドＥＣＤは、それらの膜貫通及び／又は細胞質ドメインを１％未満、好ましくはそのようなドメインを０．５％未満しか持たない。本発明のＰＲＯポリペプチドについて同定された任意の膜貫通ドメインは、疎水性ドメインのその型を同定するために当該分野において日常的に使用される基準に従い同定されることが理解されるであろう。膜貫通ドメインの厳密な境界は変わり得るが、最初に同定されたドメインのいずれかの末端から約５アミノ酸を越えない可能性が高い。従って、ＰＲＯポリペプチドの細胞外ドメインは、場合によっては、実施例又は明細書で同定されるように膜貫通ドメイン及び／又は細胞外ドメインの境界のいずれかの側から約５を越えないアミノ酸を含んでもよく、シグナルペプチドを伴う又は伴わない、それらのポリペプチド及びそれらをコードする核酸が、本発明で考慮される。 (Detailed description of preferred embodiments)
I. Definitions As used herein, the terms “PRO polypeptide” and “PRO” refer to various polypeptides immediately followed by a numerical sign, where the full sign (eg, PRO / number) Refers to the specific polypeptide sequence described. The terms “PRO / number polypeptide” and “PRO / number” as used herein, where “number” is given as the actual numerical code used herein, are native sequence polypeptides and polypeptide variants (Defined in more detail here). The PRO polypeptides described herein may be isolated from a variety of sources, such as human tissue types or other sources, and may be prepared by recombinant or synthetic methods. The term “PRO polypeptide” refers to the individual PRO / number polypeptides described herein. All disclosures in this specification that refer to "PRO polypeptides" mean each of the polypeptides individually or in combination. For example, preparation, purification, induction, antibody production, administration, compositions containing the same, treatment of illnesses thereby, and the like are involved in each polypeptide of the present invention. The term “PRO polypeptide” also includes variants of the PRO / number polypeptides disclosed herein.
A “native sequence PRO polypeptide” includes a polypeptide having the same amino acid sequence as the corresponding PRO polypeptide from nature. Such native sequence PRO polypeptides can be isolated from nature or can be produced by recombinant or synthetic means. The term “native sequence PRO polypeptide” specifically includes naturally occurring truncated or secreted forms (eg, extracellular domain sequences), naturally occurring mutated forms (eg, alternatively spliced) of a particular PRO polypeptide. Form) and naturally occurring allelic variants of the polypeptide. In various embodiments of the invention, the native sequence PRO polypeptide is a mature or full length native sequence polypeptide comprising the full length amino acid sequence shown in the accompanying drawings. Start and stop codons are shown in bold and underlined in the figure. However, the PRO polypeptide disclosed in the accompanying drawings is shown to begin with a methionine residue designated herein as amino acid 1 in the drawings, but other polypeptides located upstream or downstream of amino acid position 1 in the drawings. It is conceivable or possible to use a methionine residue as the starting amino acid residue of the PRO polypeptide.
The PRO polypeptide “extracellular domain” or “ECD” refers to a form of a PRO polypeptide that is substantially free of transmembrane and cytoplasmic domains. Typically, PRO polypeptide ECD has less than 1% of their transmembrane and / or cytoplasmic domains, preferably less than 0.5% of such domains. It will be understood that any transmembrane domain identified for a PRO polypeptide of the invention is identified according to criteria routinely used in the art to identify that type of hydrophobic domain. . Although the exact boundaries of the transmembrane domain can vary, it is likely not to exceed about 5 amino acids from either end of the originally identified domain. Thus, the extracellular domain of a PRO polypeptide optionally comprises no more than about 5 amino acids from either side of the transmembrane domain and / or extracellular domain boundary, as identified in the Examples or specification. Those polypeptides and nucleic acids encoding them, which may be included, with or without signal peptides, are contemplated by the present invention.

ここに開示する種々のＰＲＯポリペプチドの「シグナルペプチド」の適切な位置は、本明細書及び／又は添付図面に示す。しかし、注記するように、シグナルペプチドのＣ-末端境界は変化しうるが、ここで最初に定義したようにシグナルペプチドＣ-末端境界のいずれかの側で約５アミノ酸未満である可能性が最も高く、シグナルペプチドのＣ-末端境界は、そのような型のアミノ酸配列成分を同定するのに日常的に使用される基準に従って同定しうる(例えば、Nielsen等, Prot. Eng. 10: 1-6 (1997)及びvon Heinje等, Nucl. Acids. Res. 14: 4683-4690 (1986))。さらに、幾つかの場合には、分泌ポリペプチドからのシグナルペプチドの切断は完全に均一ではなく、結果として一以上の分泌種をもたらすことも認められる。シグナルペプチドがここで同定されるシグナルペプチドのＣ-末端境界の何れかの側の約５アミノ酸未満内で切断されるこれらの成熟ポリペプチド、及びそれらをコードするポリヌクレオチドが、本発明で考慮される。
「ＰＲＯポリペプチド変異体」とは、上記又は下記に定義されるように、ここに開示される全長天然配列ＰＲＯポリペプチド配列、ここに開示されたシグナルペプチドを欠く全長天然配列ＰＲＯポリペプチド配列、シグナルペプチドを伴うか伴わないここに開示されたＰＲＯの細胞外ドメイン、又はここに開示された全長ＰＲＯポリペプチドの任意の他の断片と、少なくとも約８０％のアミノ酸配列同一性を有する活性ＰＲＯポリペプチドを意味する。このようなＰＲＯポリペプチド変異体には、例えば、全長天然アミノ酸配列のＮ-又はＣ-末端において一又は複数のアミノ酸残基が付加、もしくは欠失されたＰＲＯポリペプチドが含まれる。通常、ＰＲＯポリペプチド変異体は、ここに開示される全長天然配列ポリペプチド配列、ここに開示されたシグナルペプチドを欠くＰＲＯポリペプチド配列、シグナルペプチドを伴うか伴わないここに開示されたＰＲＯポリペプチドの細胞外ドメイン、又はここに開示された全長ＰＲＯポリペプチド配列の他の任意の特に定められた断片と、少なくとも約８０％のアミノ酸配列同一性、又は少なくとも約８１％のアミノ酸配列同一性、又は少なくとも約８２％のアミノ酸配列同一性、又は少なくとも約８３％のアミノ酸配列同一性、又は少なくとも約８４％のアミノ酸配列同一性、又は少なくとも約８５％のアミノ酸配列同一性、又は少なくとも約８６％のアミノ酸配列同一性、又は少なくとも約８７％のアミノ酸配列同一性、又は少なくとも約８８％のアミノ酸配列同一性、又は少なくとも約８９％のアミノ酸配列同一性、又は少なくとも約９０％のアミノ酸配列同一性、又は少なくとも約９１％のアミノ酸配列同一性、又は少なくとも約９２％のアミノ酸配列同一性、又は少なくとも約９３％のアミノ酸配列同一性、又は少なくとも約９４％のアミノ酸配列同一性、又は少なくとも約９５％のアミノ酸配列同一性、又は少なくとも約９６％のアミノ酸配列同一性、又は少なくとも約９７％のアミノ酸配列同一性、又は少なくとも約９８％のアミノ酸配列同一性、そして又は少なくとも約９９％のアミノ酸配列同一性を有している。通常は、ＰＲＯ変異体ポリペプチドは、少なくとも約１０アミノ酸長、又は少なくとも約２０アミノ酸長、又は少なくとも約３０アミノ酸長、又は少なくとも約４０アミノ酸長、又は少なくとも約５０アミノ酸長、又は少なくとも約６０アミノ酸長、又は少なくとも約７０アミノ酸長、又は少なくとも約８０アミノ酸長、又は少なくとも約９０アミノ酸長、又は少なくとも約１００アミノ酸長、又は少なくとも約１５０アミノ酸長、又は少なくとも約２００アミノ酸長、又は少なくとも約３００アミノ酸長、又はそれ以上である。 Appropriate positions for the “signal peptides” of the various PRO polypeptides disclosed herein are indicated herein and / or in the accompanying drawings. However, as noted, the C-terminal boundary of the signal peptide can vary, but is most likely less than about 5 amino acids on either side of the signal peptide C-terminal boundary as defined herein. High, the C-terminal boundary of the signal peptide can be identified according to criteria routinely used to identify such types of amino acid sequence components (eg, Nielsen et al., Prot. Eng. 10: 1-6). (1997) and von Heinje et al., Nucl. Acids. Res. 14: 4683-4690 (1986)). Furthermore, in some cases, it is also observed that cleavage of the signal peptide from the secreted polypeptide is not completely uniform, resulting in one or more secreted species. These mature polypeptides, and polynucleotides encoding them, which are cleaved within less than about 5 amino acids on either side of the C-terminal boundary of the signal peptide identified here, are contemplated in the present invention. The
A “PRO polypeptide variant”, as defined above or below, is a full-length native sequence PRO polypeptide sequence disclosed herein, a full-length native sequence PRO polypeptide sequence that lacks a signal peptide disclosed herein, An active PRO poly having at least about 80% amino acid sequence identity with the extracellular domain of the PRO disclosed herein with or without a signal peptide, or any other fragment of the full-length PRO polypeptide disclosed herein Means peptide. Such PRO polypeptide variants include, for example, PRO polypeptides in which one or more amino acid residues have been added or deleted at the N- or C-terminus of the full-length natural amino acid sequence. Typically, a PRO polypeptide variant is a full-length native sequence polypeptide sequence disclosed herein, a PRO polypeptide sequence that lacks a signal peptide disclosed herein, a PRO polypeptide disclosed herein with or without a signal peptide At least about 80% amino acid sequence identity, or at least about 81% amino acid sequence identity, or any other defined fragment of the full-length PRO polypeptide sequence disclosed herein, or At least about 82% amino acid sequence identity, or at least about 83% amino acid sequence identity, or at least about 84% amino acid sequence identity, or at least about 85% amino acid sequence identity, or at least about 86% amino acid Sequence identity, or at least about 87% amino acid sequence identity, or at least About 88% amino acid sequence identity, or at least about 89% amino acid sequence identity, or at least about 90% amino acid sequence identity, or at least about 91% amino acid sequence identity, or at least about 92% amino acid sequence Identity, or at least about 93% amino acid sequence identity, or at least about 94% amino acid sequence identity, or at least about 95% amino acid sequence identity, or at least about 96% amino acid sequence identity, or at least about It has 97% amino acid sequence identity, or at least about 98% amino acid sequence identity, and / or at least about 99% amino acid sequence identity. Typically, the PRO variant polypeptide is at least about 10 amino acids long, or at least about 20 amino acids long, or at least about 30 amino acids long, or at least about 40 amino acids long, or at least about 50 amino acids long, or at least about 60 amino acids long. Or at least about 70 amino acids long, or at least about 80 amino acids long, or at least about 90 amino acids long, or at least about 100 amino acids long, or at least about 150 amino acids long, or at least about 200 amino acids long, or at least about 300 amino acids long, Or more.

ここに同定されるＰＲＯポリペプチド配列に対する「パーセント(％)アミノ酸配列同一性」は、配列を整列させ、最大のパーセント配列同一性を得るために必要ならば間隙を導入し、如何なる保存的置換も配列同一性の一部と考えないとした、特定のＰＲＯポリペプチド配列のアミノ酸残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基のパーセントとして定義される。パーセントアミノ酸配列同一性を決定する目的のためのアラインメントは、当業者の技量の範囲にある種々の方法、例えばBLAST、BLAST-2、ALIGN又はMegalign(DNASTAR)ソフトウエアのような公に入手可能なコンピュータソフトウエアを使用することにより達成可能である。当業者であれば、比較される配列の全長に対して最大のアラインメントを達成するために必要な任意のアルゴリズムを含む、アラインメントを測定するための適切なパラメータを決定することができる。しかし、ここでの目的のためには、％アミノ酸配列同一性値は、以下に記載するように、ALIGN-2プログラム用の完全なソースコードが表１に与えられている配列比較コンピュータプログラムALIGN-2を用いて得られる。ALIGN-2配列比較コンピュータプログラムはジェネンテク社によって作成され、表１に示したソースコードは米国著作権庁, Washington D.C., 20559に使用者用書類とともに提出され、米国著作権登録番号TXU510087の下で登録されている。ALIGN-2プログラムはジェネンテク社、South San Francisco, Californiaを通して公的に入手可能であり、また表１に与えたソースコードからコンパイルしてもよい。ALIGN-2プログラムは、UNIXオペレーティングシステム、好ましくはデジタルUNIX V4.0Dでの使用のためにコンパイルされる。全ての配列比較パラメータは、ALIGN-2プログラムによって設定され変動しない。   “Percent (%) amino acid sequence identity” relative to the PRO polypeptide sequence identified herein introduces gaps if necessary to align the sequences and obtain maximum percent sequence identity, and any conservative substitutions. Defined as the percentage of amino acid residues in a candidate sequence that are identical to the amino acid residues of a particular PRO polypeptide sequence, not considered part of the sequence identity. Alignments for the purpose of determining percent amino acid sequence identity are publicly available such as various methods within the skill of the art, such as BLAST, BLAST-2, ALIGN or Megalign (DNASTAR) software This can be achieved by using computer software. One skilled in the art can determine appropriate parameters for measuring alignment, including any algorithms necessary to achieve maximal alignment over the full length of the sequences being compared. However, for purposes herein, the% amino acid sequence identity values are calculated as shown below in the sequence comparison computer program ALIGN-, whose complete source code for the ALIGN-2 program is given in Table 1. Obtained using 2. The ALIGN-2 sequence comparison computer program was created by Genentech, and the source code shown in Table 1 was submitted to the US Copyright Office, Washington DC, 20559 with user documentation and registered under US copyright registration number TXU510087 Has been. The ALIGN-2 program is publicly available through Genentech, South San Francisco, California, and may be compiled from the source code given in Table 1. The ALIGN-2 program is compiled for use on a UNIX operating system, preferably digital UNIX V4.0D. All sequence comparison parameters are set by the ALIGN-2 program and do not vary.

アミノ酸配列比較にALIGN-2が用いれれる状況では、与えられたアミノ酸配列Ａの、与えられたアミノ酸配列Ｂとの、又はそれに対する％アミノ酸配列同一性(あるいは、与えられたアミノ酸配列Ｂと、又はそれに対して或る程度の％アミノ酸配列同一性を持つ又は含む与えられたアミノ酸配列Ａと言うこともできる)は次のように計算される：
分率Ｘ／Ｙの１００倍
ここで、Ｘは配列アラインメントプログラムALIGN-2のＡ及びＢのプログラムアラインメントによって同一であると一致したスコアのアミノ酸残基の数であり、ＹはＢの全アミノ酸残基数である。アミノ酸配列Ａの長さがアミノ酸配列Ｂの長さと異なる場合、ＡのＢに対する％アミノ酸配列同一性は、ＢのＡに対する％アミノ酸配列同一性とは異なると認識されるであろう。％アミノ酸配列同一性の計算の例として、表２及び３は、「比較タンパク質」と称されるアミノ酸配列の「ＰＲＯ」と称されるアミノ酸配列に対する％アミノ酸配列同一性の計算方法を示し、ここで「ＰＲＯ」は関心ある仮定ＰＲＯポリペプチドのアミノ酸配列を表し、「比較タンパク質」は関心ある「ＰＲＯ」ポリペプチドと比較され、これに対するポリペプチドのアミノ酸配列を表し、「Ｘ」、「Ｙ」及び「Ｚ」は、それぞれ異なる仮定アミノ酸残基を表す。
特に断らない限りは、ここで使用されるの全ての％アミノ酸配列同一性値は上記のようにALIGN-2コンピュータプログラムを用いて得られる。しかしながら、％アミノ酸配列同一性は、WU-BLAST-2コンピュータプログラム(Altschul等, Methods in Enzymology 266: 460-480 (1996))を用い、以下に記載するようにしても得られる。殆どのWU-BLAST-2検索パラメータはデフォルト値に設定される。デフォルト値に設定されない、即ち調節可能なパラメータは以下の値に設定する：オーバーラップスパン＝１、オーバーラップフラクション＝０．１２５、ワード閾値(Ｔ)＝１１、及びスコアリングマトリクス＝BLOSUM62。WU-BLAST-2を使用する場合、％アミノ酸配列同一性値は、(ａ)天然ＰＲＯポリペプチドから誘導された配列を有する関心あるＰＲＯポリペプチドのアミノ酸配列と、関心ある比較アミノ酸配列(即ち、関心あるＰＲＯポリペプチドが比較されるＰＲＯポリペプチド変異体であってもよい配列)との間の、WU-BLAST-2によって決定した一致する同一アミノ酸残基の数を、(ｂ)関心あるＰＲＯポリペプチドの残基の総数で除した商によって決定される。例えば、「アミノ酸配列Ｂに対して少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を持つ又は持っているアミノ酸配列Ａを含んでなるポリペプチド」という表現では、アミノ酸配列Ａが関心ある比較アミノ酸配列であり、アミノ酸配列Ｂが関心あるＰＲＯポリペプチドのアミノ酸配列である。 In situations where ALIGN-2 is used for amino acid sequence comparison,% amino acid sequence identity of a given amino acid sequence A with or against a given amino acid sequence B (or with a given amino acid sequence B, or In contrast, a given amino acid sequence A (which may have or contain some degree of amino acid sequence identity) is calculated as follows:
100 times the fraction X / Y, where X is the number of amino acid residues with a score matched by the A and B program alignments of the sequence alignment program ALIGN-2, and Y is the total amino acid residue of B Radix. If the length of amino acid sequence A is different from the length of amino acid sequence B, it will be recognized that the% amino acid sequence identity of A to B is different from the% amino acid sequence identity of B to A. As an example of calculating% amino acid sequence identity, Tables 2 and 3 show how to calculate% amino acid sequence identity for an amino acid sequence called “PRO” of an amino acid sequence called “Comparative Protein” Where “PRO” represents the amino acid sequence of the hypothetical PRO polypeptide of interest, and “comparison protein” represents the amino acid sequence of the polypeptide compared to and compared to the “PRO” polypeptide of interest, “X”, “Y”. And “Z” each represent a different hypothetical amino acid residue.
Unless otherwise noted, all% amino acid sequence identity values used herein are obtained using the ALIGN-2 computer program as described above. However,% amino acid sequence identity can also be obtained as described below using the WU-BLAST-2 computer program (Altschul et al., Methods in Enzymology 266: 460-480 (1996)). Most WU-BLAST-2 search parameters are set to default values. Parameters that are not set to default values, ie adjustable parameters, are set to the following values: overlap span = 1, overlap fraction = 0.125, word threshold (T) = 11, and scoring matrix = BLOSUM62. When using WU-BLAST-2, the% amino acid sequence identity value is: (a) the amino acid sequence of the PRO polypeptide of interest having a sequence derived from a native PRO polypeptide and the comparative amino acid sequence of interest (ie, The number of matching identical amino acid residues determined by WU-BLAST-2 between (the sequence that may be the PRO polypeptide variant to which the PRO polypeptide of interest is compared) is (b) the PRO of interest Determined by the quotient divided by the total number of residues in the polypeptide. For example, in the expression “polypeptide comprising amino acid sequence A having or having at least 80% amino acid sequence identity to amino acid sequence B”, amino acid sequence A is a comparative amino acid sequence of interest, Sequence B is the amino acid sequence of the PRO polypeptide of interest.

また、パーセントアミノ酸配列同一性は配列比較プログラムNCBI-BLAST2(Altschul等, Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402 (1997))を用いて決定してもよい。NCBI-BLAST2配列比較プログラムは、http://ww.ncbi.nlm.nih.govからダウンロードするか、又は国立衛生研究所, Bethesda, MD.から得ることができる。NCBI-BLAST2は幾つかの検索パラメータを使用し、それら検索パラメータの全てはデフォルト値に設定され、例えば、unmask＝可、鎖＝全て、予測される発生＝１０、最小低複合長＝１５／５、マルチパスｅ-値＝０．０１、マルチパスの定数＝２５、最終ギャップアラインメントのドロップオフ＝２５、及びスコアリングマトリクス＝BLOSUM62を含む。
アミノ酸配列比較にNCBI-BLAST2が用いられる状況では、与えられたアミノ酸配列Ａの、与えられたアミノ酸配列Ｂとの、又はそれに対する％アミノ酸配列同一性(あるいは、与えられたアミノ酸配列Ｂと、又はそれに対して或る程度の％アミノ酸配列同一性を持つ又は含む与えられたアミノ酸配列Ａと言うこともできる)は次のように計算される：
分率Ｘ／Ｙの１００倍
ここで、Ｘは配列アラインメントプログラムNCBI-BLAST2のＡ及びＢのプログラムアラインメントによって同一であると一致したスコアのアミノ酸残基の数であり、ＹはＢの全アミノ酸残基数である。アミノ酸配列Ａの長さがアミノ酸配列Ｂの長さと異なる場合、ＡのＢに対する％アミノ酸配列同一性は、ＢのＡに対する％アミノ酸配列同一性とは異なると評価されるであろう。 Percent amino acid sequence identity may also be determined using the sequence comparison program NCBI-BLAST2 (Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402 (1997)). The NCBI-BLAST2 sequence comparison program can be downloaded from http://ww.ncbi.nlm.nih.gov or obtained from National Institutes of Health, Bethesda, MD. NCBI-BLAST2 uses several search parameters, all of which are set to default values, eg unmask = allowable, chain = all, predicted occurrence = 10, minimum low composite length = 15/5 Multipath e-value = 0.01, multipath constant = 25, final gap alignment dropoff = 25, and scoring matrix = BLOSUM62.
In situations where NCBI-BLAST2 is used for amino acid sequence comparison, the% amino acid sequence identity of a given amino acid sequence A with or against a given amino acid sequence B (or with a given amino acid sequence B, or In contrast, a given amino acid sequence A (which can also be referred to as having or containing some degree of amino acid sequence identity) is calculated as follows:
100 times the fraction X / Y, where X is the number of amino acid residues with a score consistent with the A and B program alignments of the sequence alignment program NCBI-BLAST2 and Y is the total amino acid residue of B Radix. If the length of amino acid sequence A is different from the length of amino acid sequence B, the percent amino acid sequence identity of A to B will be evaluated as different from the percent amino acid sequence identity of B to A.

「ＰＲＯ変異体ポリヌクレオチド」又は「ＰＲＯ変異体核酸配列」は、以下に定義するような活性なＰＲＯポリペプチドをコードする核酸分子を意味し、ここに開示する全長天然配列ＰＲＯポリペプチド配列、ここに開示するシグナルペプチドを欠く全長天然配列ＰＲＯポリペプチド配列、ここに開示するシグナルペプチド有又は無のＰＲＯポリペプチド細胞外ドメイン、又はここに開示する全長ＰＲＯポリペプチド配列の任意の他の断片をコードする核酸配列に対して少なくとも約８０％の核酸配列同一性を有する。通常は、ＰＲＯ変異体ポリヌクレオチドは、ここに開示する全長天然配列ＰＲＯポリペプチド配列、ここに開示するシグナルペプチドを欠く全長天然配列ＰＲＯポリペプチド配列、ここに開示するシグナルペプチド有又は無のＰＲＯポリペプチド細胞外ドメイン、又はここに開示する全長ＰＲＯポリペプチド配列の任意の他の断片をコードする核酸配列と少なくとも約８０％の核酸配列同一性、又は少なくとも約８１％の核酸配列同一性、又は少なくとも約８２％の核酸配列同一性、又は少なくとも約８３％の核酸配列同一性、又は少なくとも約８４％の核酸配列同一性、又は少なくとも約８５％の核酸配列同一性、又は少なくとも約８６％の核酸配列同一性、又は少なくとも約８７％の核酸配列同一性、又は少なくとも約８８％の核酸配列同一性、又は少なくとも約８９％の核酸配列同一性、又は少なくとも約９０％の核酸配列同一性、又は少なくとも約９１％の核酸配列同一性、又は少なくとも約９２％の核酸配列同一性、又は少なくとも約９３％の核酸配列同一性、又は少なくとも約９４％の核酸配列同一性、又は少なくとも約９５％の核酸配列同一性、又は少なくとも約９６％の核酸配列同一性、又は少なくとも約９７％の核酸配列同一性、又は少なくとも約９８％の核酸配列同一性、そして又は少なくとも約９９％の核酸配列同一性を有している。変異体は、天然のヌクレオチド配列を含まない。
通常は、ＰＲＯ変異体ポリヌクレオチドは、少なくとも約３０ヌクレオチド長、又は少なくとも約６０ヌクレオチド長、又は少なくとも約９０ヌクレオチド長、又は少なくとも約１２０ヌクレオチド長、又は少なくとも約１５０ヌクレオチド長、又は少なくとも約１８０ヌクレオチド長、又は少なくとも約２１０ヌクレオチド長、又は少なくとも約２４０ヌクレオチド長、又は少なくとも約２７０ヌクレオチド長、又は少なくとも約３００ヌクレオチド長、又は少なくとも約４５０ヌクレオチド長、又は少なくとも約６００ヌクレオチド長、又は少なくとも約９００ヌクレオチド長、又はそれ以上である。 By “PRO variant polynucleotide” or “PRO variant nucleic acid sequence” is meant a nucleic acid molecule that encodes an active PRO polypeptide as defined below, and is a full-length native sequence PRO polypeptide sequence disclosed herein, wherein Encoding a full-length native sequence PRO polypeptide sequence lacking the signal peptide disclosed in <RTIgt;, </ RTI> a PRO polypeptide extracellular domain with or without a signal peptide disclosed herein, or any other fragment of the full-length PRO polypeptide sequence disclosed herein Have at least about 80% nucleic acid sequence identity to the nucleic acid sequence Typically, a PRO variant polynucleotide is a full-length native sequence PRO polypeptide sequence disclosed herein, a full-length native sequence PRO polypeptide sequence that lacks a signal peptide disclosed herein, a PRO poly with or without a signal peptide disclosed herein. At least about 80% nucleic acid sequence identity, or at least about 81% nucleic acid sequence identity with a nucleic acid sequence encoding a peptide extracellular domain, or any other fragment of a full-length PRO polypeptide sequence disclosed herein, or at least About 82% nucleic acid sequence identity, or at least about 83% nucleic acid sequence identity, or at least about 84% nucleic acid sequence identity, or at least about 85% nucleic acid sequence identity, or at least about 86% nucleic acid sequence Identity, or at least about 87% nucleic acid sequence identity, or at least about 88% nucleic acid sequence Identity, or at least about 89% nucleic acid sequence identity, or at least about 90% nucleic acid sequence identity, or at least about 91% nucleic acid sequence identity, or at least about 92% nucleic acid sequence identity, or at least about 93% nucleic acid sequence identity, or at least about 94% nucleic acid sequence identity, or at least about 95% nucleic acid sequence identity, or at least about 96% nucleic acid sequence identity, or at least about 97% nucleic acid sequence identity Or at least about 98% nucleic acid sequence identity and / or at least about 99% nucleic acid sequence identity. Variants do not contain the native nucleotide sequence.
Typically, the PRO variant polynucleotide is at least about 30 nucleotides in length, or at least about 60 nucleotides in length, or at least about 90 nucleotides in length, or at least about 120 nucleotides in length, or at least about 150 nucleotides in length, or at least about 180 nucleotides in length. Or at least about 210 nucleotides, or at least about 240 nucleotides, or at least about 270 nucleotides, or at least about 300 nucleotides, or at least about 450 nucleotides, or at least about 600 nucleotides, or at least about 900 nucleotides, Or more.

ここに同定されるＰＲＯポリペプチドコード化核酸配列に対するる「パーセント(％)核酸配列同一性」は、配列を整列させ、最大のパーセント配列同一性を得るために必要ならば間隙を導入し、関心あるＰＲＯ核酸配列のヌクレオチドと同一である候補配列中のヌクレオチドのパーセントとして定義される。パーセント核酸配列同一性を決定する目的のためのアラインメントは、当業者の技量の範囲にある種々の方法、例えばBLAST、BLAST-2、ALIGN又はMegalign(DNASTAR)ソフトウエアのような公に入手可能なコンピュータソフトウエアを使用することにより達成可能である。しかし、ここでの目的のためには、％核酸配列同一性値は、以下に記載するように、ALIGN-2プログラム用の完全なソースコードが表１に与えられている配列比較コンピュータプログラムALIGN-2を用いて得られる。ALIGN-2配列比較コンピュータプログラムはジェネンテク社によって作成され、表１に示したソースコードは米国著作権庁, Washington D.C., 20559に使用者用書類とともに提出され、米国著作権登録番号TXU510087の下で登録されている。ALIGN-2プログラムはジェネンテク社、South San Francisco, Californiaを通して公的に入手可能であり、また表１に与えたソースコードからコンパイルしてもよい。ALIGN-2プログラムは、UNIXオペレーティングシステム、好ましくはデジタルUNIX V4.0Dでの使用のためにコンパイルされる。全ての配列比較パラメータは、ALIGN-2プログラムによって設定され変動しない。   "Percent (%) nucleic acid sequence identity" relative to the PRO polypeptide-encoding nucleic acid sequence identified herein introduces a gap if necessary to align the sequences and obtain maximum percent sequence identity, Defined as the percentage of nucleotides in a candidate sequence that are identical to the nucleotides of a given PRO nucleic acid sequence. Alignments for the purpose of determining percent nucleic acid sequence identity are publicly available such as various methods within the skill of the art, such as BLAST, BLAST-2, ALIGN or Megalign (DNASTAR) software This can be achieved by using computer software. However, for purposes herein, the% nucleic acid sequence identity values are calculated as shown below in the sequence comparison computer program ALIGN-, whose complete source code for the ALIGN-2 program is given in Table 1. Obtained using 2. The ALIGN-2 sequence comparison computer program was created by Genentech, and the source code shown in Table 1 was submitted to the US Copyright Office, Washington DC, 20559 with user documentation and registered under US copyright registration number TXU510087 Has been. The ALIGN-2 program is publicly available through Genentech, South San Francisco, California, and may be compiled from the source code given in Table 1. The ALIGN-2 program is compiled for use on a UNIX operating system, preferably digital UNIX V4.0D. All sequence comparison parameters are set by the ALIGN-2 program and do not vary.

核酸配列比較にALIGN-2が用いれれる状況では、与えられた核酸配列Ｃの、与えられた核酸配列Ｄとの、又はそれに対する％核酸配列同一性(あるいは、与えられた核酸配列Ｄと、又はそれに対して或る程度の％核酸配列同一性を持つ又は含む与えられたアミノ酸配列Ｃと言うこともできる)は次のように計算される：
分率Ｗ／Ｚの１００倍
ここで、Ｗは配列アラインメントプログラムALIGN-2のＣ及びＤのプログラムアラインメントによって同一であると一致したスコアのヌクレオチドの数であり、ＺはＤの全ヌクレオチド数である。核酸配列Ｃの長さが核酸配列Ｄの長さと異なる場合、ＣのＤに対する％核酸配列同一性は、ＤのＣに対する％核酸配列同一性とは異なると評価されるであろう。％核酸配列同一性の計算の例として、表４及び５は、「比較ＤＮＡ」と称される核酸配列の「ＰＲＯ-ＤＮＡ」と称される核酸配列に対する％核酸配列同一性の計算方法を示しており、ここで「ＰＲＯ-ＤＮＡ」は関心ある仮定ＰＲＯコード化核酸配列を表し、「比較ＤＮＡ」は関心ある「ＰＲＯ-ＤＮＡ」核酸分子と比較され、これに対する核酸分子のヌクレオチド配列を表し、「Ｎ」、「Ｌ」及び「Ｖ」は、それぞれ異なる仮定ヌクレオチドを表す。
特に断らない限りは、ここでの全ての％核酸配列同一性値は上記のようにALIGN-2配列比較コンピュータプログラムを用いて得られる。しかしながら、％核酸配列同一性は、WU-BLAST-2コンピュータプログラム(Altschul等, Methods in Enzymology 266: 460-480 (1996))を用い、以下に記載するようにしても得られる。殆どのWU-BLAST-2検索パラメータはデフォルト値に設定される。デフォルト値に設定されない、即ち調節可能なパラメータは以下の値に設定する：オーバーラップスパン＝１、オーバーラップフラクション＝０．１２５、ワード閾値(Ｔ)＝１１、及びスコアリングマトリクス＝BLOSUM62。WU-BLAST-2を使用する場合、％核酸配列同一性値は、(ａ)天然配列ＰＲＯポリペプチドコード化核酸から誘導された配列を有する関心あるＰＲＯポリペプチドコード化核酸分子の核酸配列と、関心ある比較核酸配列(即ち、関心あるＰＲＯポリペプチドコード化核酸配列が比較される変異体ＰＲＯポリペプチドであってもよい配列)との間の、WU-BLAST-2によって決定した一致する同一ヌクレオチドの数を、(ｂ)関心あるＰＲＯポリペプチドコード化核酸分子のヌクレオチドの総数で除した商によって決定される。例えば、「核酸配列Ｂに対して少なくとも８０％の核酸配列同一性を持つ又は持っている核酸配列Ａを含んでなる単離された核酸分子」という表現では、核酸配列Ａが関心ある比較核酸配列であり、核酸配列Ｂが関心あるＰＲＯポリペプチドコード化核酸分子の核酸配列である。 In situations where ALIGN-2 is used for nucleic acid sequence comparison, the% nucleic acid sequence identity of, or relative to, a given nucleic acid sequence C (or a given nucleic acid sequence D, or A given amino acid sequence C (which can also be referred to as having or containing a certain percentage of nucleic acid sequence identity) is calculated as follows:
100 times the fraction W / Z, where W is the number of nucleotides with a score matched by C and D program alignments of the sequence alignment program ALIGN-2, and Z is the total number of nucleotides in D . If the length of nucleic acid sequence C is different from the length of nucleic acid sequence D, the percent nucleic acid sequence identity of C to D will be evaluated as different from the percent nucleic acid sequence identity of D to C. As an example of calculating% nucleic acid sequence identity, Tables 4 and 5 show how to calculate% nucleic acid sequence identity for a nucleic acid sequence called “PRO-DNA” for a nucleic acid sequence called “Comparative DNA”. Where “PRO-DNA” represents the hypothetical PRO-encoding nucleic acid sequence of interest, “comparison DNA” represents the nucleotide sequence of the nucleic acid molecule relative to and compared to the “PRO-DNA” nucleic acid molecule of interest, “N”, “L” and “V” each represent a different hypothetical nucleotide.
Unless otherwise indicated, all% nucleic acid sequence identity values herein are obtained using the ALIGN-2 sequence comparison computer program as described above. However,% nucleic acid sequence identity can also be obtained as described below using the WU-BLAST-2 computer program (Altschul et al., Methods in Enzymology 266: 460-480 (1996)). Most WU-BLAST-2 search parameters are set to default values. Parameters that are not set to default values, ie adjustable parameters, are set to the following values: overlap span = 1, overlap fraction = 0.125, word threshold (T) = 11, and scoring matrix = BLOSUM62. When using WU-BLAST-2, the% nucleic acid sequence identity value is: (a) the nucleic acid sequence of the PRO polypeptide-encoding nucleic acid molecule of interest having a sequence derived from a native sequence PRO polypeptide-encoding nucleic acid; The identical identical nucleotide determined by WU-BLAST-2 between the comparison nucleic acid sequence of interest (ie, the sequence that may be a mutant PRO polypeptide to which the PRO polypeptide-encoding nucleic acid sequence of interest is compared) Of (b) divided by the total number of nucleotides of the PRO polypeptide-encoding nucleic acid molecule of interest. For example, in the expression “an isolated nucleic acid molecule comprising nucleic acid sequence A having or having at least 80% nucleic acid sequence identity to nucleic acid sequence B”, the nucleic acid sequence A of interest is a comparative nucleic acid sequence of interest. And nucleic acid sequence B is the nucleic acid sequence of the PRO polypeptide-encoding nucleic acid molecule of interest.

また、パーセント核酸配列同一性を配列比較プログラムNCBI-BLAST2(Altschul等, Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402 (1997))を用いて決定してもよい。NCBI-BLAST2配列比較プログラムは、http://ww.ncbi.nlm.nih.govからダウンロードするか、又は国立衛生研究所, Bethesda, MD.から得ることができる。NCBI-BLAST2は幾つかの検索パラメータを使用し、それら検索パラメータの全てはデフォルト値に設定され、例えば、unmask＝可、鎖＝全て、予測される発生＝１０、最小低複合長＝１５／５、マルチパスｅ-値＝０．０１、マルチパスの定数＝２５、最終ギャップアラインメントのドロップオフ＝２５、及びスコアリングマトリクス＝BLOSUM62を含む。
配列比較にNCBI-BLAST2が用いれる状況では、与えられた核酸配列Ｃの、与えられた核酸配列Ｄとの、又はそれに対する％核酸配列同一性(与えられた核酸配列Ｄと、又はそれに対して或る程度の％核酸配列同一性を持つ又は含む与えられた核酸配列Ｃと言うこともできる)は次のように計算される：
分率Ｗ／Ｚの１００倍
ここで、Ｗは配列アラインメントプログラムNCBI-BLAST2のＣ及びＤのプログラムアラインメントによって同一であると一致したスコアのヌクレオチドの数であり、ＺはＤの全ヌクレオチド数である。核酸配列Ｃの長さが核酸配列Ｄの長さと異なる場合、ＣのＤに対する％核酸配列同一性は、ＤのＣに対する％核酸配列同一性とは異なると評価されるであろう。 Percent nucleic acid sequence identity may also be determined using the sequence comparison program NCBI-BLAST2 (Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402 (1997)). The NCBI-BLAST2 sequence comparison program can be downloaded from http://ww.ncbi.nlm.nih.gov or obtained from National Institutes of Health, Bethesda, MD. NCBI-BLAST2 uses several search parameters, all of which are set to default values, eg unmask = allowable, chain = all, predicted occurrence = 10, minimum low composite length = 15/5 Multipath e-value = 0.01, multipath constant = 25, final gap alignment dropoff = 25, and scoring matrix = BLOSUM62.
In situations where NCBI-BLAST2 is used for sequence comparison, the% nucleic acid sequence identity of, or relative to, a given nucleic acid sequence C (to or against a given nucleic acid sequence D) A given nucleic acid sequence C (which may have or contain some% nucleic acid sequence identity) is calculated as follows:
100 times the fraction W / Z, where W is the number of nucleotides with a score matched by the C and D program alignments of the sequence alignment program NCBI-BLAST2, and Z is the total number of nucleotides in D . If the length of nucleic acid sequence C is different from the length of nucleic acid sequence D, the percent nucleic acid sequence identity of C to D will be evaluated as different from the percent nucleic acid sequence identity of D to C.

他の実施態様では、ＰＲＯ変異体ポリペプチドヌクレオチドは、活性ＰＲＯポリペプチドをコードし、好ましくは緊縮性ハイブリッド形成及び洗浄条件下で、ここに開示する全長ＰＲＯポリペプチドをコードするヌクレオチド配列にハイブリッド形成する核酸分子である。ＰＲＯ変異体ポリペプチドは、ＰＲＯ変異体ポリヌクレオチドにコードされるものであってもよい。   In other embodiments, the PRO variant polypeptide nucleotide encodes an active PRO polypeptide and preferably hybridizes to the nucleotide sequence encoding the full-length PRO polypeptide disclosed herein under stringent hybridization and wash conditions. Nucleic acid molecule. The PRO variant polypeptide may be one encoded by a PRO variant polynucleotide.

「陽性(ポジティブ)」という用語は、上記のように実施された配列比較の中で、比較された配列において同一ではないが類似の特性を有している残基(例えば、保存的置換の結果として、下記の表６参照)を含む。ここでの目的のために、陽性の％値は、(ａ)天然ＰＲＯポリペプチドから誘導された配列を有する関心あるＰＲＯポリペプチドアミノ酸配列と、関心ある比較アミノ酸配列(即ち、ＰＲＯポリペプチド配列が比較されるアミノ酸配列)との間の、WU-BLAST-2のBLOSUM62マトリクス内でポジティブな値が付けられたアミノ酸残基の数を、(ｂ)関心あるＰＲＯポリペプチドのアミノ酸残基の総数で除した商によって決定される。
特に断らない限り、陽性の％値は、直上のパラグラフに記載したようにして計算される。しかしながら、ALIGN-2及びNCBI-BLAST2について上記したように実施されるアミノ酸配列同一性には、配列比較において同一のみならず類似した特性をもつ配列におけるアミノ酸残基を含む。関心あるアミノ酸残基に対して陽性とされたアミノ酸残基は、関心あるアミノ酸残基と同一であるか、又は関心あるアミノ酸残基の好ましい置換(下記の表６に定義)であるものである。
ALIGN-2又はNCBI-BLAST2を用いたアミノ酸配列比較では、与えられたアミノ酸配列Ａの、与えられたアミノ酸配列Ｂとの、又はそれに対する陽性の％値(あるいは、与えられたアミノ酸配列Ｂと、又はそれに対して或る程度の％アミノ酸配列同一性を持つ又は含む与えられたアミノ酸配列Ａと言うこともできる)は次のように計算される：
分率Ｘ／Ｙの１００倍
ここで、Ｘは配列アラインメントプログラムALIGN-2又はNCBI-BLAST2のＡ及びＢのアラインメントによって陽性であるとされたスコアのアミノ酸残基の数であり、ＹはＢの全アミノ酸残基数である。アミノ酸配列Ａの長さがアミノ酸配列Ｂの長さと等しくない場合、ＡのＢに対する％陽性は、ＢのＡに対する％陽性とは異なると評価されるであろう。 The term `` positive '' refers to residues that are not identical but have similar characteristics in the compared sequences in sequence comparisons performed as described above (e.g., conservative substitution results). As shown in Table 6 below. For purposes herein, a positive% value is: (a) a PRO polypeptide amino acid sequence of interest having a sequence derived from a native PRO polypeptide and a comparative amino acid sequence of interest (ie, the PRO polypeptide sequence is The number of amino acid residues positively valued in the BLOSUM62 matrix of WU-BLAST-2 (b) the total number of amino acid residues of the PRO polypeptide of interest Determined by the quotient divided.
Unless otherwise noted,% positive values are calculated as described in the immediately preceding paragraph. However, amino acid sequence identity performed as described above for ALIGN-2 and NCBI-BLAST2 includes amino acid residues in sequences that have similar characteristics as well as identity in sequence comparisons. Amino acid residues that are positive for an amino acid residue of interest are those that are identical to the amino acid residue of interest or that are preferred substitutions of amino acid residues of interest (defined in Table 6 below). .
In amino acid sequence comparison using ALIGN-2 or NCBI-BLAST2, a given amino acid sequence A is% positive with or against a given amino acid sequence B (or a given amino acid sequence B and Or a given amino acid sequence A having or containing some% amino acid sequence identity) may be calculated as follows:
100 times the fraction X / Y, where X is the number of amino acid residues scored positive by the alignment of A and B of the sequence alignment program ALIGN-2 or NCBI-BLAST2, and Y is the number of B The total number of amino acid residues. If the length of amino acid sequence A is not equal to the length of amino acid sequence B, then A's% positive for B would be evaluated as different from B's% positive for A.

「単離された」とは、ここで開示された種々のポリペプチドを記述するために使用するときは、その自然環境の成分から同定され分離され及び／又は回収されたポリペプチドを意味する。その自然環境の汚染成分とは、そのポリペプチドの診断又は治療への使用を典型的には妨害する物質であり、酵素、ホルモン、及び他のタンパク質様又は非タンパク質様溶質が含まれる。好ましい実施態様において、ポリペプチドは、(１)スピニングカップシークエネーターを使用することにより、少なくとも１５残基のＮ末端あるいは内部アミノ酸配列を得るのに充分なほど、あるいは、(２)クーマシーブルーあるいは好ましくは銀染色を用いた非還元あるいは還元条件下でのＳＤＳ-ＰＡＧＥによる均一性まで精製される。単離されたポリペプチドには、ＰＲＯポリペプチドの自然環境の少なくとも一つの成分が存在しないため、組換え細胞内のインサイツのポリペプチドが含まれる。しかしながら、通常は、単離されたポリペプチドは少なくとも一つの精製工程により調製される。
「単離された」ＰＲＯポリペプチドコード化核酸又は他のポリペプチドコード化核酸は、同定され、ＰＲＯポリペプチドコード化核酸の天然源に通常付随している少なくとも一つの汚染核酸分子から分離された核酸分子である。単離されたＰＲＯポリペプチドコード化核酸分子は、天然に見出される形態あるいは設定以外のものである。ゆえに、単離されたＰＲＯポリペプチドコード化核酸分子は、天然の細胞中に存在する特定のＰＲＯポリペプチドコード化核酸分子とは区別される。しかし、単離されたＰＲＯポリペプチドコード化核酸分子は、例えば、核酸分子が天然細胞のものとは異なった染色***置にあるポリペプチドを通常発現する細胞に含まれるポリペプチドコード核酸分子を含む。
「コントロール配列」なる用語は、特定の宿主生物において作用可能に結合したコード配列を発現するために必要なＤＮＡ配列を指す。例えば原核生物に好適なコントロール配列は、プロモーター、場合によってはオペレータ配列、及びリボソーム結合部位を含む。真核生物の細胞は、プロモーター、ポリアデニル化シグナル及びエンハンサーを利用することが知られている。
核酸は、他の核酸配列と機能的な関係にあるときに「作用可能に結合し」ている。例えば、プレ配列あるいは分泌リーダーのＤＮＡは、ポリペプチドの分泌に参画するプレタンパク質として発現されているなら、そのポリペプチドのＤＮＡに作用可能に結合している；プロモーター又はエンハンサーは、配列の転写に影響を及ぼすならば、コード配列に作用可能に結合している；又はリボソーム結合部位は、もしそれが翻訳を容易にするような位置にあるなら、コード配列と作用可能に結合している。一般的に、「作用可能に結合している」とは、結合したＤＮＡ配列が近接しており、分泌リーダーの場合には近接していて読みフェーズにあることを意味する。しかし、エンハンサーは必ずしも近接している必要はない。結合は簡便な制限部位でのライゲーションにより達成される。そのような部位が存在しない場合は、従来の手法に従って、合成オリゴヌクレオチドアダプターあるいはリンカーが使用される。 “Isolated”, when used to describe the various polypeptides disclosed herein, means a polypeptide that has been identified and separated and / or recovered from a component of its natural environment. Contaminant components of the natural environment are substances that typically interfere with the diagnostic or therapeutic use of the polypeptide, including enzymes, hormones, and other proteinaceous or non-proteinaceous solutes. In a preferred embodiment, the polypeptide is (1) sufficient to obtain an N-terminal or internal amino acid sequence of at least 15 residues by using a spinning cup sequenator, or (2) Coomassie blue or It is preferably purified to homogeneity by SDS-PAGE under non-reducing or reducing conditions using silver staining. Isolated polypeptide includes polypeptide in situ within recombinant cells, since at least one component of the PRO polypeptide natural environment will not be present. Ordinarily, however, isolated polypeptide will be prepared by at least one purification step.
An “isolated” PRO polypeptide-encoding nucleic acid or other polypeptide-encoding nucleic acid has been identified and separated from at least one contaminating nucleic acid molecule normally associated with the natural source of the PRO polypeptide-encoding nucleic acid A nucleic acid molecule. An isolated PRO polypeptide-encoding nucleic acid molecule is other than in the form or setting in which it is found in nature. Thus, an isolated PRO polypeptide-encoding nucleic acid molecule is distinguished from a specific PRO polypeptide-encoding nucleic acid molecule that is present in natural cells. However, an isolated PRO polypeptide-encoding nucleic acid molecule includes, for example, a polypeptide-encoding nucleic acid molecule contained in a cell that normally expresses the polypeptide where the nucleic acid molecule is in a chromosomal location different from that of natural cells.
The term “control sequence” refers to a DNA sequence necessary to express an operably linked coding sequence in a particular host organism. For example, suitable control sequences for prokaryotes include a promoter, optionally an operator sequence, and a ribosome binding site. Eukaryotic cells are known to utilize promoters, polyadenylation signals and enhancers.
A nucleic acid is “operably linked” when it is in a functional relationship with another nucleic acid sequence. For example, a presequence or secretory leader DNA is operably linked to the polypeptide DNA if expressed as a preprotein that participates in the secretion of the polypeptide; a promoter or enhancer is responsible for the transcription of the sequence. If it does, it is operably linked to the coding sequence; or the ribosome binding site is operably linked to the coding sequence if it is in a position that facilitates translation. In general, “operably linked” means that the bound DNA sequences are in close proximity and, in the case of a secretory leader, in close proximity and in the reading phase. However, enhancers do not necessarily have to be close together. Binding is achieved by ligation at convenient restriction sites. If such sites do not exist, synthetic oligonucleotide adapters or linkers are used according to conventional techniques.

「抗体」という用語は最も広い意味において使用され、例えば、単一の抗-ＰＲＯモノクローナル抗体(アゴニスト、アンタゴニスト、及び中和抗体を含む)、多エピトープ特異性を持つ抗-ＰＲＯ抗体組成物、一本鎖抗-ＰＲＯ抗体、及び抗-ＰＲＯ抗体の断片(下記参照)を包含している。ここで使用される「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に均一な抗体の集団、すなわち、集団を構成する個々の抗体が、少量存在しうる自然に生じる可能性のある突然変異を除いて同一である集団から得られる抗体を称する。
ハイブリッド形成反応の「緊縮性」は、当業者によって容易に決定され、一般的にプローブ長、洗浄温度、及び塩濃度に依存する経験的な計算である。一般に、プローブが長くなると適切なアニーリングのための温度が高くなり、プローブが短くなると温度は低くなる。ハイブリッド形成は、一般的に、相補的鎖がその融点に近いがそれより低い環境に存在する場合における変性ＤＮＡの再アニールする能力に依存する。プローブとハイブリッド形成可能な配列との間の所望の相同性の程度が高くなると、使用できる相対温度が高くなる。その結果、より高い相対温度は、反応条件をより緊縮性にするが、低い温度は緊縮性を低下させる。ハイブリッド形成反応の緊縮性の更なる詳細及び説明は、Ausubel等, Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience Publishers, (1995)を参照のこと。
ここで定義される「緊縮性条件」又は「高度の緊縮性条件」は、(１)洗浄のために低イオン強度及び高温度、例えば、５０℃において０．０１５Ｍの塩化ナトリウム／０．００１５Ｍのクエン酸ナトリウム／０．１％のドデシル硫酸ナトリウムを用いるもの；(２)ハイブリッド形成中にホルムアミド等の変性剤、例えば、４２℃において５０％(v/v)ホルムアミドと０．１％ウシ血清アルブミン／０．１％フィコール／０．１％のポリビニルピロリドン／５０ｍＭのｐＨ６．５のリン酸ナトリウムバッファー、及び７５０ｍＭの塩化ナトリウム、７５ｍＭクエン酸ナトリウムを用いるもの；又は(３)４２℃における５０％ホルムアミド、５ｘＳＳＣ(０．７５ＭのＮａＣｌ、０．０７５Ｍのクエン酸ナトリウム)、５０ｍＭのリン酸ナトリウム(ｐＨ６．８)、０．１％のピロリン酸ナトリウム、５ｘデンハート液、超音波処理サケ***ＤＮＡ(５０μｇ／ｍｌ)、０．１％ＳＤＳ、及び１０％のデキストラン硫酸と、４２℃における０．２ｘＳＳＣ(塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム)中の洗浄及び５５℃での５０％ホルムアミド、次いで５５℃におけるＥＤＴＡを含む０．１ｘＳＳＣからなる高緊縮性洗浄を用いるものによって特定される。
「中程度の緊縮性条件」は、Sambrook等, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989に記載されているように特定され、上記の緊縮性より低い洗浄溶液及びハイブリッド形成条件(例えば、温度、イオン強度及び％ＳＤＳ)の使用を含む。中程度の緊縮性条件の例は、２０％ホルムアミド、５ｘＳＳＣ(１５０ｍＭのＮａＣｌ、１５ｍＭのクエン酸三ナトリウム)、５０ｍＭリン酸ナトリウム(ｐＨ７．６)、５ｘデンハート液、１０％デキストラン硫酸、及び２０ｍｇ／ｍＬの変性剪断サケ***ＤＮＡを含む溶液中の３７℃での終夜インキュベーション、次いで１ｘＳＳＣ中３７−５０℃でのフィルターの洗浄といった条件である。当業者であれば、プローブ長などの因子に適合させる必要に応じて、どのようにして温度、イオン強度等を調節するかを認識するであろう。 The term “antibody” is used in the broadest sense and includes, for example, a single anti-PRO monoclonal antibody (including agonists, antagonists, and neutralizing antibodies), anti-PRO antibody compositions with multiple epitope specificity, one Including single chain anti-PRO antibodies and fragments of anti-PRO antibodies (see below). The term “monoclonal antibody” as used herein is the same except for naturally occurring mutations in which a substantially homogeneous population of antibodies, ie, the individual antibodies comprising the population may be present in small amounts. Refers to an antibody obtained from a population.
The “stringency” of a hybridization reaction is readily determined by those skilled in the art and is generally an empirical calculation that depends on probe length, wash temperature, and salt concentration. In general, the longer the probe, the higher the temperature for proper annealing, and the shorter the probe, the lower the temperature. Hybridization generally depends on the ability of denatured DNA to reanneal when the complementary strand is present in an environment close to but below its melting point. The higher the degree of desired homology between the probe and hybridizable sequence, the higher the relative temperature that can be used. As a result, higher relative temperatures make the reaction conditions more stringent, while lower temperatures reduce the stringency. For further details and explanation of the stringency of hybridization reactions, see Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience Publishers, (1995).
As defined herein, “stringent conditions” or “highly stringent conditions” are: (1) 0.015 M sodium chloride / 0.0015 M at low ionic strength and high temperature, eg, 50 ° C., for washing. Using sodium citrate / 0.1% sodium dodecyl sulfate; (2) denaturing agents such as formamide during hybridization, eg 50% (v / v) formamide and 0.1% bovine serum albumin at 42 ° C. /0.1% Ficoll / 0.1% polyvinylpyrrolidone / 50 mM sodium phosphate buffer pH 6.5 and 750 mM sodium chloride, 75 mM sodium citrate; or (3) 50% formamide at 42 ° C. 5 × SSC (0.75 M NaCl, 0.075 M sodium citrate), 50 mM sodium phosphate (pH 8), 0.1% sodium pyrophosphate, 5 × Denhart's solution, sonicated salmon sperm DNA (50 μg / ml), 0.1% SDS, and 10% dextran sulfate, and 0.2 × SSC at 42 ° C. ( Specified by washing with sodium chloride / sodium citrate) and 50% formamide at 55 ° C. followed by high stringency washing consisting of 0.1 × SSC with EDTA at 55 ° C.
“Moderate stringency conditions” are specified as described in Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989, and include washing solutions and hybrids less than the above stringency. Including the use of forming conditions (eg, temperature, ionic strength and% SDS). Examples of moderate stringency conditions are: 20% formamide, 5 × SSC (150 mM NaCl, 15 mM trisodium citrate), 50 mM sodium phosphate (pH 7.6), 5 × Denhardt's solution, 10% dextran sulfate, and 20 mg / Conditions include overnight incubation at 37 ° C. in a solution containing mL of denatured sheared salmon sperm DNA, followed by washing the filter at 37-50 ° C. in 1 × SSC. One skilled in the art will recognize how to adjust temperature, ionic strength, etc. as needed to accommodate factors such as probe length.

「エピトープタグ」なる用語は、ここで用いられるときは、「タグポリペプチド」に融合したＰＲＯポリペプチドを含んでなるキメラポリペプチドを指す。タグポリペプチドは、その抗体が産生され得るエピトープを提供するに十分な残基を有しているが、その長さはそれが融合するポリペプチドの活性を阻害しないよう充分に短い。また、タグポリペプチドは、好ましくは、抗体が他のエピトープと実質的に交差反応をしないようにかなり独特である。適切なタグポリペプチドは、一般に、少なくとも６のアミノ酸残基、通常は約８〜約５０のアミノ酸残基(好ましくは約１０〜約２０のアミノ酸残基)を有する。
ここで用いられる「イムノアドヘシン」なる用語は、異種タンパク質(「アドヘシン」)の結合特異性と免疫グロブリン定常ドメインのエフェクター機能とを結合した抗体様分子を指す。構造的には、イムノアドヘシンは、所望の結合特異性を持ち、抗体の抗原認識及び結合部位以外である(即ち「異種の」)アミノ酸配列と、免疫グロブリン定常ドメイン配列との融合物を含む。イムノアドヘシン分子のアドへシン部分は、典型的には少なくともレセプター又はリガンドの結合部位を含む隣接アミノ酸配列である。イムノアドヘシンの免疫グロブリン定常ドメイン配列は、ＩｇＧ-１、ＩｇＧ-２、ＩｇＧ-３又はＩｇＧ-４サブタイプ、ＩｇＡ(ＩｇＡ-１及びＩｇＡ-２を含む)、ＩｇＥ、ＩｇＤ又はＩｇＭなどの任意の免疫グロブリンから得ることができる。
ここで目的としている「活性な」及び「活性」とは、天然又は天然に生じるＰＲＯの生物学的及び／又は免疫学的活性を保持するＰＲＯポリペプチドの形態を称し、「生物学的」活性とは、天然又は天然に生じるＰＲＯによって生ずる(阻害性又は刺激性の)生物学的機能であって、天然又は天然に生じるＰＲＯが有する抗原性エピトープに対して抗体を生成する能力を除くものを意味し、「免疫学的」活性とは、天然又は天然に生じるＰＲＯが有する抗原性エピトープに対して抗体を生成する能力を称する。
「アンタゴニスト」なる用語は最も広い意味で用いられ、ここに開示した天然ＰＲＯポリペプチドの生物学的活性を部分的もしくは完全に阻止、阻害、又は中和する任意の分子を含む。同様に「アゴニスト」なる用語も最も広い意味で用いられ、ここに開示した天然ＰＲＯポリペプチドの生物学的活性を模倣する任意の分子を含む。好適なアゴニスト又はアンタゴニスト分子は特に、アゴニスト又はアンタゴニスト抗体又は抗体断片、天然ＰＲＯポリペプチドの断片又はアミノ酸配列変異体、ペプチド、アンチセンスオリゴヌクレオチド、有機小分子等を含む。ＰＲＯポリペプチドのアゴニスト又はアンタゴニストの同定方法は、ＰＲＯポリペプチドを候補アンタゴニスト又はアゴニストと接触させ、ＰＲＯポリペプチドに通常付随する一又は複数の生物学的活性の検出可能な変化を測定することを含みうる。 The term “epitope tag” as used herein refers to a chimeric polypeptide comprising a PRO polypeptide fused to a “tag polypeptide”. A tag polypeptide has sufficient residues to provide an epitope from which the antibody can be produced, but its length is short enough so that it does not inhibit the activity of the polypeptide to which it is fused. Also, the tag polypeptide is preferably fairly unique so that the antibody does not substantially cross-react with other epitopes. Suitable tag polypeptides generally have at least 6 amino acid residues, usually about 8 to about 50 amino acid residues (preferably about 10 to about 20 amino acid residues).
The term “immunoadhesin” as used herein refers to an antibody-like molecule that combines the binding specificity of a heterologous protein (“adhesin”) with the effector function of an immunoglobulin constant domain. Structurally, an immunoadhesin comprises a fusion of an immunoglobulin constant domain sequence with the desired binding specificity and other than the antigen recognition and binding site of an antibody (ie, a “heterologous”) and an immunoglobulin constant domain sequence. . The adhesin portion of an immunoadhesin molecule is typically a contiguous amino acid sequence that includes at least a receptor or ligand binding site. The immunoglobulin constant domain sequence of the immunoadhesin can be any of IgG-1, IgG-2, IgG-3 or IgG-4 subtype, IgA (including IgA-1 and IgA-2), IgE, IgD or IgM It can be obtained from the immunoglobulins.
As used herein, “active” and “activity” refer to a form of a PRO polypeptide that retains the biological and / or immunological activity of a naturally occurring or naturally occurring PRO, and refers to a “biological” activity. Is a biological function (inhibitory or stimulatory) caused by a naturally occurring or naturally occurring PRO, excluding the ability to generate antibodies against the antigenic epitope of the naturally occurring or naturally occurring PRO By “immunological” activity is meant the ability to generate antibodies against an antigenic epitope possessed by a naturally occurring or naturally occurring PRO.
The term “antagonist” is used in the broadest sense and includes any molecule that partially or fully prevents, inhibits, or neutralizes the biological activity of a native PRO polypeptide disclosed herein. Similarly, the term “agonist” is also used in the broadest sense and includes any molecule that mimics the biological activity of a native PRO polypeptide disclosed herein. Suitable agonist or antagonist molecules include in particular agonist or antagonist antibodies or antibody fragments, fragments of native PRO polypeptides or amino acid sequence variants, peptides, antisense oligonucleotides, small organic molecules, and the like. A method for identifying a PRO polypeptide agonist or antagonist comprises contacting the PRO polypeptide with a candidate antagonist or agonist and measuring a detectable change in one or more biological activities normally associated with the PRO polypeptide. sell.

ここで使用される「治療」とは、治癒的処置、予防的療法及び防止的療法の両方を意味し、目的は標的とする病理学的状態又は疾患を防止又は低下(減少)させることにある。治療が必要なものとは、既に疾患に罹っているもの、並びに疾患に罹りやすいもの又は疾患が防止されるべきものを含む。
「慢性」投与とは、急性様式とは異なり連続的な様式での薬剤を投与し、初期の治療効果(活性)を長時間に渡って維持することを意味する。「間欠」投与とは、中断無く連続的になされるのではなく、むしろ周期的になされる性質の治療である。
治療の目的のための「哺乳動物」は、ヒト、家庭及び農業用動物、動物園、スポーツ、又はペット動物、例えばイヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ウサギなどを含む哺乳類に分類される任意の動物を意味する。好ましくは、哺乳動物はヒトである。
一又は複数の治療薬と「組み合わせた」投与とは、同時(同時期)及び任意の順序での連続した投与を含む。
ここで用いられる「担体」は、製薬的に許容されうる担体、賦形剤、又は安定化剤を含み、用いられる用量及び濃度でそれらに暴露される細胞又は哺乳動物に対して非毒性である。生理学的に許容されうる担体は、水性ｐＨ緩衝溶液であることが多い。生理学的に許容されうる担体の例は、リン酸塩、クエン酸塩、及び他の有機酸塩のバッファー；アスコルビン酸を含む酸化防止剤；低分子量(約１０残基未満)ポリペプチド；タンパク質、例えば血清アルブミン、ゼラチン、又は免疫グロブリン；親水性ポリマー、例えばポリビニルピロリドン；アミノ酸、例えばグリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン又はリシン；グルコース、マンノース又はデキストリンを含む単糖類、二糖類、及び他の炭水化物；ＥＤＴＡ等のキレート剤；マンニトール又はソルビトール等の糖アルコール；ナトリウム等の塩形成対イオン；及び／又は非イオン性界面活性剤、例えばTWEENＴＭ、ポリエチレングリコール(ＰＥＧ)、及びPLURONICSＴＭを含む。 As used herein, "treatment" means both curative treatment, preventive therapy and preventive therapy, the purpose being to prevent or reduce (reduce) the targeted pathological condition or disease . Those in need of treatment include those already suffering from the disease as well as those susceptible to the disease or those in which the disease is to be prevented.
“Chronic” administration means that the drug is administered in a continuous manner as opposed to an acute manner, and the initial therapeutic effect (activity) is maintained over a long period of time. “Intermittent” administration is a treatment of the nature of being done periodically rather than continuously without interruption.
“Mammals” for therapeutic purposes are classified as mammals, including humans, household and agricultural animals, zoos, sports, or pet animals such as dogs, cats, cows, horses, sheep, pigs, goats, rabbits, etc. Means any animal. Preferably the mammal is a human.
Administration “in combination with” one or more further therapeutic agents includes simultaneous (concurrent) and consecutive administration in any order.
As used herein, a “carrier” includes a pharmaceutically acceptable carrier, excipient, or stabilizer and is non-toxic to cells or mammals exposed to them at the dosages and concentrations used. . Often the physiologically acceptable carrier is an aqueous pH buffered solution. Examples of physiologically acceptable carriers include phosphate, citrate, and other organic acid salt buffers; antioxidants including ascorbic acid; low molecular weight (less than about 10 residues) polypeptides; For example, serum albumin, gelatin, or immunoglobulin; hydrophilic polymers such as polyvinylpyrrolidone; amino acids such as glycine, glutamine, asparagine, arginine or lysine; monosaccharides, disaccharides and other carbohydrates including glucose, mannose or dextrin; EDTA Chelating agents such as; sugar alcohols such as mannitol or sorbitol; salt-forming counterions such as sodium; and / or nonionic surfactants such as TWEEN ™ , polyethylene glycol (PEG), and PLURONICS ™ .

「抗体断片」は、無傷の抗体の一部、好ましくは無傷の抗体の抗原結合又は可変領域を含む。抗体断片の例は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ(ａｂ')２、及びＦｖ断片；ダイアボディ(diabodies)；直鎖状抗体(Zapata等, Protein Eng. 8(10): 1057-1062 [1995])；一本鎖抗体分子；及び抗体断片から形成された多重特異性抗体を含む。
抗体のパパイン消化は、「Ｆａｂ」断片と呼ばれる２つの同一の抗体結合断片を生成し、その各々は単一の抗原結合部位を持ち、残りは容易に結晶化する能力を反映して「Ｆｃ」断片と命名される。ペプシン処理はＦ(ａｂ')２断片を生じ、それは２つの抗原結合部位を持ち、抗原を交差結合することができる。
「Ｆｖ」は、完全な抗原認識及び結合部位を含む最小の抗体断片である。この領域は、密接に非共有結合した１本の重鎖と１本の軽鎖の可変領域の二量体からなる。この配置において各可変ドメインの３つのＣＤＲが相互作用してＶＨ−ＶＬ二量体の表面に抗原結合部位を決定する。集合的には、６つのＣＤＲｓは抗体に対して抗原結合特異性をもたらす。しかしながら、単一の可変ドメイン(又は抗原に特異的な３つのＣＤＲのみを含んでなるＦｖの半分)でさえ、結合部位全体よりは低い親和性であるが、抗原を認識し結合する能力を持つ。
またＦａｂ断片は、軽鎖の定常ドメイン及び重鎖の第１の定常ドメイン(ＣＨ１)も含む。Ｆａｂ断片は、抗体ヒンジ領域からの一又は複数のシステインを含む重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシ末端に幾つかの残基が付加されていることによりＦａｂ断片と相違する。ここで、Ｆａｂ'-ＳＨは、定常ドメインのシステイン残基が遊離のチオール基を持つＦａｂ’を表す。Ｆ(ａｂ')２抗体断片は、最初はＦａｂ’断片の対として生成され、それらの間にヒンジシステインを有する。抗体断片の他の化学的結合も知られている。
任意の脊椎動物種からの抗体(免疫グロブリン)の「軽鎖」は、それらの定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ及びラムダと呼ばれる二つの明らかに異なる型の一方に分類される。
それらの重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に依存して、免疫グロブリンは異なるクラスに分類できる。免疫グロブリンには五つの主要なクラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭがあり、それらの幾つかは更にサブクラス(アイソタイプ)、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３，ＩｇＧ４、ＩｇＡ及びＩｇＡ２に分類される。 “Antibody fragments” comprise a portion of an intact antibody, preferably the antigen binding or variable region of the intact antibody. Examples of antibody fragments are Fab, Fab ′, F (ab ′) 2 , and Fv fragments; diabodies; linear antibodies (Zapata et al., Protein Eng. 8 (10): 1057-1062 [1995]. ); Single chain antibody molecules; and multispecific antibodies formed from antibody fragments.
Papain digestion of antibodies produces two identical antibody-binding fragments called “Fab” fragments, each of which has a single antigen-binding site, the rest reflecting the ability to crystallize easily. It is named a fragment. Pepsin treatment yields an F (ab ′) 2 fragment that has two antigen binding sites and can cross-link antigen.
“Fv” is the minimum antibody fragment which contains a complete antigen recognition and binding site. This region consists of a dimer of one heavy chain and one light chain variable region in tight, non-covalent association. In this arrangement, the three CDRs of each variable domain interact to determine the antigen binding site on the surface of the V H -V L dimer. Collectively, the six CDRs provide antigen binding specificity for the antibody. However, even a single variable domain (or half of an Fv comprising only three CDRs specific for the antigen) has a lower affinity than the entire binding site, but has the ability to recognize and bind to the antigen. .
The Fab fragment also contains the constant domain of the light chain and the first constant domain (CH1) of the heavy chain. Fab fragments differ from Fab fragments by the addition of a few residues at the carboxy terminus of the heavy chain CH1 domain including one or more cysteines from the antibody hinge region. Here, Fab′-SH represents Fab ′ in which the cysteine residue of the constant domain has a free thiol group. F (ab ′) 2 antibody fragments are initially produced as pairs of Fab ′ fragments, with a hinge cysteine between them. Other chemical couplings of antibody fragments are also known.
“Light chains” of antibodies (immunoglobulins) from any vertebrate species are classified into one of two distinctly different types called kappa and lambda, based on the amino acid sequence of their constant domains.
Depending on the amino acid sequence of the constant domain of their heavy chains, immunoglobulins can be classified into different classes. There are five major classes of immunoglobulins: IgA, IgD, IgE, IgG and IgM, some of which are further classified into subclasses (isotypes) such as IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA and IgA2.

「一本鎖Ｆｖ」又は「ｓＦｖ」抗体断片は、抗体のＶＨ及びＶＬドメインを含み、これらのドメインは単一のポリペプチド鎖に存在する。好ましくは、ＦｖポリペプチドはＶＨ及びＶＬドメイン間にポリペプチドリンカーを更に含み、それはｓＦｖが抗原結合に望まれる構造を形成するのを可能にする。ｓＦｖの概説については、The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg及びMoore編, Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994)のPluckthunを参照のこと。
用語「ダイアボディ(diabodies)」は、二つの抗原結合部位を持つ小型の抗体断片を指し、その断片は同じポリペプチド鎖(ＶＨ−ＶＬ)内で軽鎖可変ドメイン(ＶＬ)に結合した重鎖可変ドメイン(ＶＨ)を含む。同じ鎖の二つのドメイン間に対形成するには短すぎるリンカーを用いることにより、ドメインは強制的に他の鎖の相補的ドメインと対形成して二つの抗原結合部位を生成する。ダイアボディは、例えば、EP 404,097; WO 93/11161; 及びHollinger等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 6444-6448 (1993)に十分に記載されている。
「単離された」抗体は、その自然環境の成分から同定され分離及び／又は回収されたものである。その自然環境の汚染成分とは、その抗体の診断又は治療への使用を妨害する物質であり、酵素、ホルモン、及び他のタンパク質様又は非タンパク質様溶質が含まれる。好ましい実施態様において、抗体は、(１)ローリ法(Lowry method)で測定した場合９５重量％を越える抗体、最も好ましくは９９重量％を越えるまで、(２)スピニングカップシークエネーターを使用することにより、少なくとも１５残基のＮ末端あるいは内部アミノ酸配列を得るのに充分なほど、あるいは、(３)クーマシーブルーあるいは好ましくは銀染色を用いた非還元あるいは還元条件下でのＳＤＳ-ＰＡＧＥによる均一になるまで精製される。単離された抗体には、抗体の自然環境の少なくとも一つの成分が存在しないため、組換え細胞内のインサイツの抗体が含まれる。しかしながら、通常は、単離された抗体は少なくとも一つの精製工程により調製される。
「標識」なる語は、ここで用いられる場合、抗体に直接又は間接的に抱合して「標識」抗体を生成する検出可能な化合物又は組成物を称する。標識は、それ自身検出可能でもよく(例えば、放射性標識又は蛍光標識)、又は酵素標識の場合、検出可能な基質化合物又は組成物の化学変化を触媒してもよい。
「固相」とは、本発明の抗体がそれに付着することのできる非水性マトリクスを意味する。ここに包含する固相の例は、部分的又は全体的に、ガラス(例えば、孔調整ガラス)、多糖類(例えばアガロース)、ポリアクリルアミド、ポリスチレン、ポリビニルアルコール及びシリコーンから形成されたものを含む。或る種の実施態様では、内容に応じて、固相はアッセイプレートのウェルを構成することができ；その他では精製カラム(例えばアフィニティクロマトグラフィーカラム)とすることもできる。また、この用語は、米国特許第4,275,149号に記載されたような、別個の粒子の不連続な固相も包含する。
「リポソーム」は、種々の型の脂質、リン脂質及び／又は界面活性剤からなる小型の小胞であり、哺乳動物への薬物(ＰＲＯポリペプチド又はその抗体など)の送達に有用である。リポソームの成分は、通常は生体膜の脂質配置に類似する二層構造に配置される。
「小分子」とは、ここでは約５００ダルトン未満の分子量を持つと定義される。
「ＦＧＦＲ-１」、「ＦＧＦＲ-２」、「ＦＧＦＲ-３」及び「ＦＧＦＲ-４」は、Isacchiら, Nuc. Acids Res. 18(7)：1906(1990), Dionneら, EMBO J.9(9)：2685-2692(1990), Keeganら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88：1095-1099(1991)及びPartanenら, EMBO J. 10(6)：1347-1354(1991)にそれぞれ開示されているように、線維芽細胞成長因子レセプター１、２、３及び４を意味する。 “Single-chain Fv” or “sFv” antibody fragments comprise the V H and V L domains of antibody, wherein these domains are present in a single polypeptide chain. Preferably, the Fv polypeptide further comprises a polypeptide linker between the VH and VL domains that allows the sFv to form the desired structure for antigen binding. For a review of sFv, see Pluckthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore, Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994).
The term “diabodies” refers to a small antibody fragment with two antigen binding sites that binds to the light chain variable domain (V L ) within the same polypeptide chain (V H -V L ). Heavy chain variable domain (V H ). By using a linker that is too short to pair between two domains of the same chain, the domain is forced to pair with the complementary domains of the other chain to produce two antigen binding sites. Diabodies are well described, for example, in EP 404,097; WO 93/11161; and Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 6444-6448 (1993).
An “isolated” antibody is one that has been identified and separated and / or recovered from a component of its natural environment. Contaminating components of the natural environment are substances that interfere with the use of the antibody in diagnosis or therapy, including enzymes, hormones, and other proteinaceous or non-proteinaceous solutes. In a preferred embodiment, the antibody is (1) more than 95% by weight antibody, most preferably greater than 99% by weight as measured by the Lowry method, (2) by using a spinning cup seeker. Sufficient to obtain an N-terminal or internal amino acid sequence of at least 15 residues, or (3) uniform by SDS-PAGE under non-reducing or reducing conditions using Coomassie blue or preferably silver staining Purify until Isolated antibody includes the antibody in situ within recombinant cells since at least one component of the antibody's natural environment will not be present. Ordinarily, however, isolated antibody will be prepared by at least one purification step.
The term “label” as used herein refers to a detectable compound or composition that is conjugated directly or indirectly to the antibody to produce a “labeled” antibody. The label may itself be detectable (eg, a radioactive label or a fluorescent label) or, in the case of an enzyme label, may catalyze a chemical change in the detectable substrate compound or composition.
“Solid phase” means a non-aqueous matrix to which an antibody of the invention can be attached. Examples of solid phases encompassed herein include those formed, in part or in whole, from glass (eg, pore modifying glass), polysaccharides (eg, agarose), polyacrylamide, polystyrene, polyvinyl alcohol and silicone. In certain embodiments, depending on the content, the solid phase can constitute the well of an assay plate; in others it can be a purification column (eg, an affinity chromatography column). The term also encompasses a discontinuous solid phase of discrete particles, such as those described in US Pat. No. 4,275,149.
“Liposomes” are small vesicles composed of various types of lipids, phospholipids and / or surfactants, and are useful for delivery of drugs (such as PRO polypeptides or antibodies thereof) to mammals. The components of the liposome are usually arranged in a bilayer structure similar to the lipid arrangement of biological membranes.
“Small molecule” is defined herein as having a molecular weight of less than about 500 Daltons.
“FGFR-1,” “FGFR-2,” “FGFR-3,” and “FGFR-4” are described in Isacchi et al., Nuc. Acids Res. 18 (7): 1906 (1990), Dionne et al., EMBO J.9. (9): 2685-2692 (1990), Keegan et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 1095-1099 (1991) and Partanen et al., EMBO J. 10 (6): 1347-1354 (1991). As disclosed respectively, it means fibroblast growth factor receptors 1, 2, 3 and 4.

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ＩＩ. 本発明の組成物と方法
Ａ．全長ＰＲＯポリペプチド
本発明は、本出願でＰＲＯポリペプチドと命名されるポリペプチドをコードする新規に同定され単離されたヌクレオチド配列を提供する。特に下記の実施例でさらに詳細に説明するように、種々のＰＲＯポリペプチドをコードするｃＤＮＡが同定され単離された。別々の発現ラウンドで生成されたタンパク質には異なるＰＲＯ番号が与えられるが、ＵＮＱ番号は全ての与えられたＤＮＡ及びコード化タンパク質に独特であり、変わることはないことを記しておく。しかしながら、単純化のために、本明細書において、ここに開示した全長天然核酸分子にコードされるタンパク質並びに上記のＰＲＯの定義に含まれるさらなる天然相同体及び変異体は、それらの起源又は調製形式に関わらず、「ＰＲＯ／番号」で呼称する。
下記の実施例に開示するように、種々のｃＤＮＡクローンがＡＴＣＣに寄託されている。これらのクローンの正確なヌクレオチド配列は、この分野で日常的な方法を用いて寄託されたクローンを配列決定することにより容易に決定することができる。予測されるアミノ酸配列は、ヌクレオチド配列から常套的技量を用いて決定できる。ここに記載したＰＲＯポリペプチド及びコード化核酸について、本出願人は、現時点で入手可能な配列情報と最も良く一致するリーディングフレームであると考えられるものを同定した。 II. Compositions and Methods of the Invention Full-Length PRO Polypeptides The present invention provides newly identified and isolated nucleotide sequences that encode a polypeptide designated herein as a PRO polypeptide. In particular, cDNAs encoding various PRO polypeptides have been identified and isolated, as described in further detail in the Examples below. Note that proteins produced in separate rounds of expression are given different PRO numbers, but the UNQ numbers are unique to all given DNA and encoded proteins and do not change. However, for simplicity, the proteins encoded by the full-length natural nucleic acid molecules disclosed herein, as well as additional natural homologues and variants included in the PRO definition above, are herein referred to as their origin or form of preparation. Regardless, it is referred to as “PRO / number”.
As disclosed in the examples below, various cDNA clones have been deposited with the ATCC. The exact nucleotide sequence of these clones can be readily determined by sequencing the deposited clones using routine methods in the art. The predicted amino acid sequence can be determined from the nucleotide sequence using routine skill. For the PRO polypeptides and encoding nucleic acids described herein, Applicants have identified what is believed to be the reading frame that best matches the currently available sequence information.

１．全長ＰＲＯ１９６ポリペプチド
本発明は、本出願においてＰＲＯ１９６と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離されたヌクレオチド配列を提供する。特に、本出願人は以下の実施例で更に詳細に開示するように、ＰＲＯ１９６ポリペプチドをコードするｃＤＮＡを同定し単離した。BLAST及びFastA配列アラインメントコンピュータプログラムを用いて、本出願人は、全長天然配列ＰＲＯ１９６をコードするｃＤＮＡ配列が、種々のＴＩＥリガンドポリペプチドのアミノ酸配列と同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードしていることを見出した。 1. Full-Length PRO196 Polypeptide The present invention provides a newly identified and isolated nucleotide sequence encoding a polypeptide referred to in this application as PRO196. In particular, Applicants have identified and isolated cDNA encoding a PRO196 polypeptide, as disclosed in further detail in the Examples below. Using the BLAST and FastA sequence alignment computer programs, Applicants have encoded polypeptides whose cDNA sequences encoding the full-length native sequence PRO196 have amino acid sequences that are identical to the amino acid sequences of various TIE ligand polypeptides. I found out.

２．全長ＰＲＯ４４４ポリペプチド
ＤＮＡ２６８４６-１３９７クローンは、分泌タンパク質をコードするヌクレオチドを選択する捕捉技術を用いてヒト胎児肺ライブラリーから単離した。よってＤＮＡ２６８４６-１３９７クローンは分泌因子をコードする。知りうる限り、ＤＮＡ２６８４６-１３９７配列はＰＲＯ４４４とここで称される新規な因子をコードする。WU-BLAST2配列アラインメントコンピュータプログラムを用いて、公知のタンパク質とある程度の配列同一性があることが明らかになった。 2. The full-length PRO444 polypeptide DNA26846-1397 clone was isolated from a human fetal lung library using a capture technique that selects for nucleotides encoding secreted proteins. The DNA26846-1397 clone thus encodes a secreted factor. As far as is known, the DNA26846-1397 sequence encodes a novel factor designated herein as PRO444. Using the WU-BLAST2 sequence alignment computer program, it was revealed that there is some sequence identity with known proteins.

３．全長ＰＲＯ１８３ポリペプチド
ＤＮＡ２８４９８クローンはヒト組織ライブラリーから単離した。知りうる限り、ＤＮＡ２８４９８配列はＰＲＯ１８３とここで称される新規な因子をコードする。WU-BLAST2配列アラインメントコンピュータプログラムを用いて、公知のタンパク質とある程度の配列同一性があることが明らかになった。 3. The full-length PRO183 polypeptide DNA28498 clone was isolated from a human tissue library. To the best of our knowledge, the DNA28498 sequence encodes a novel factor designated herein as PRO183. Using the WU-BLAST2 sequence alignment computer program, it was revealed that there is some sequence identity with known proteins.

４．全長ＰＲＯ１８５ポリペプチド
ＤＮＡ２８５０３クローンはヒト組織ライブラリーから単離した。知りうる限り、ＤＮＡ２８５０３配列はＰＲＯ１８５とここで称される新規な因子をコードする。WU-BLAST2配列アラインメントコンピュータプログラムを用いて、公知のタンパク質とある程度の配列同一性があることが明らかになった。 4). The full-length PRO185 polypeptide DNA28503 clone was isolated from a human tissue library. To the best of our knowledge, the DNA28503 sequence encodes a novel factor designated herein as PRO185. Using the WU-BLAST2 sequence alignment computer program, it was revealed that there is some sequence identity with known proteins.

５．全長ＰＲＯ２１０及びＰＲＯ２１７ポリペプチド
本発明は、本出願においてＰＲＯ２１０及びＰＲＯ２１７と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離されたヌクレオチド配列を提供する。特に、本出願人は以下の実施例で更に詳細に開示するような、ＰＲＯ２１０及びＰＲＯ２１７ポリペプチドをコードするｃＤＮＡを同定し単離した。BLAST(FastAフォーマット)配列アラインメントコンピュータプログラムを用いて、本出願人は全長天然配列ＰＲＯ２１０及びＰＲＯ２１７ポリペプチドをコードするｃＤＮＡ配列が、ＥＧＦ様ドメインを有する公知のタンパク質に対して相同性を有していることを見出した。従って、今では、本出願で開示されたＰＲＯ２１０及びＰＲＯ２１７がＥＧＦ様ファミリーの新規に同定されたメンバーであり、ＥＧＦ様タンパク質ファミリーに典型的な性質を有すると信じられる。 5. Full length PRO210 and PRO217 polypeptides The present invention provides newly identified and isolated nucleotide sequences encoding polypeptides referred to in the present application as PRO210 and PRO217. In particular, Applicants have identified and isolated cDNAs encoding PRO210 and PRO217 polypeptides, as disclosed in further detail in the Examples below. Using the BLAST (FastA format) sequence alignment computer program, Applicants have found that the cDNA sequences encoding the full-length native sequence PRO210 and PRO217 polypeptides are homologous to known proteins with EGF-like domains. I found out. Thus, it is now believed that PRO210 and PRO217 disclosed in this application are newly identified members of the EGF-like family and have properties typical of the EGF-like protein family.

６．全長ＰＲＯ２１５ポリペプチド
本発明は、本出願においてＰＲＯ２１５と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離されたヌクレオチド配列を提供する。特に、本出願人は以下の実施例で更に詳細に開示するような、ＰＲＯ２１５ポリペプチドをコードするｃＤＮＡを同定し単離した。BLAST及びFastA配列アラインメントコンピュータプログラムを用いて、本出願人は全長天然配列ＰＲＯ２１５(図１１及び配列番号：１６に示す)をコードするｃＤＮＡ配列が、ＳＬＩＴタンパク質前駆物質のアミノ酸配列と同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードすることを見出した。またＰＲＯ２１５は、ロイシンリッチ反復タンパク質との同一性も有する。 6). Full Length PRO215 Polypeptides The present invention provides newly identified and isolated nucleotide sequences that encode a polypeptide referred to in this application as PRO215. In particular, Applicants have identified and isolated cDNA encoding a PRO215 polypeptide, as disclosed in further detail in the Examples below. Using the BLAST and FastA sequence alignment computer programs, Applicants have determined that the amino acid sequence in which the cDNA sequence encoding the full-length native sequence PRO215 (shown in FIG. 11 and SEQ ID NO: 16) is identical to the amino acid sequence of the SLIT protein precursor. It was found to encode a polypeptide having a sequence. PRO215 also has identity with leucine-rich repeat proteins.

７．全長ＰＲＯ２４２ポリペプチド
本発明は、本出願においてＰＲＯ２４２と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離されたヌクレオチド配列を提供する。特に、本出願人は以下の実施例で更に詳細に開示するような、ＰＲＯ２４２ポリペプチドをコードするｃＤＮＡを同定し単離した。BLAST及びFastA配列アラインメントコンピュータプログラムを用いて、本出願人は全長天然配列ＰＲＯ２４２(図１５及び配列番号：２３に示す)をコードするｃＤＮＡ配列が、ヒトマクロファージ炎症性タンパク質１-アルファ、ウサギマクロファージ炎症性タンパク質１-ベータ、ヒトＬＤ７８及びウサギ免疫活性化遺伝子２とアミノ酸配列同一性を有することを見出した。従って、今では、本出願で開示されたＰＲＯ２４２ポリペプチドがケモカインファミリーの新規に同定されたメンバーであり、ケモカインファミリーに典型的な性質を有すると信じられる。 7). Full Length PRO242 Polypeptides The present invention provides newly identified and isolated nucleotide sequences that encode a polypeptide referred to in this application as PRO242. In particular, Applicants have identified and isolated cDNA encoding a PRO242 polypeptide, as disclosed in further detail in the Examples below. Using the BLAST and FastA sequence alignment computer programs, Applicants have determined that the cDNA sequence encoding the full-length native sequence PRO242 (shown in FIG. 15 and SEQ ID NO: 23) is human macrophage inflammatory protein 1-alpha, rabbit macrophage inflammatory It was found to have amino acid sequence identity with protein 1-beta, human LD78 and rabbit immunostimulatory gene 2. Thus, it is now believed that the PRO242 polypeptide disclosed in this application is a newly identified member of the chemokine family and has properties typical of the chemokine family.

８．全長ＰＲＯ２８８ポリペプチド
本発明は、新規に同定され単離されたＰＲＯ２８８ポリペプチドを提供する。特に、本出願人は種々のヒトＰＲＯ２８８ポリペプチドを同定し単離した。これらＰＲＯ２８８ポリペプチドのいくつかの性質と特徴を以下の実施例で更に詳細に記載する。ここで開示されるＰＲＯ２８８ポリペプチドの性質と特徴に基づき、本出願人は、ＰＲＯ２８８がＴＮＦＲのメンバーであり、特にＡｐｏ-２リガンドのレセプターであると信じる。 8). Full Length PRO288 Polypeptides The present invention provides newly identified and isolated PRO288 polypeptides. In particular, Applicants have identified and isolated various human PRO288 polypeptides. Some properties and characteristics of these PRO288 polypeptides are described in more detail in the following examples. Based on the nature and characteristics of the PRO288 polypeptide disclosed herein, Applicants believe that PRO288 is a member of TNFR, and in particular a receptor for the Apo-2 ligand.

９．全長ＰＲＯ３６５ポリペプチド
本発明は、本出願においてＰＲＯ３６５と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離されたヌクレオチド配列を提供する。特に、本出願人は以下の実施例で更に詳細に開示するような、ＰＲＯ３６５ポリペプチドをコードするｃＤＮＡを同定し単離した。BLAST及びFastA配列アラインメントコンピュータプログラムを用いて、本出願人はＰＲＯ３６５ポリペプチドの種々の部分がヒト２−１９プロテインと有意な相同性を有していることを見出した。従って、今では、本出願で開示されたＰＲＯ３６５ポリペプチドがヒト２−１９プロテインファミリーの新規に同定されたメンバーであると信じられる。 9. Full-Length PRO365 Polypeptides The present invention provides newly identified and isolated nucleotide sequences that encode a polypeptide referred to in this application as PRO365. In particular, Applicants have identified and isolated cDNA encoding a PRO365 polypeptide, as disclosed in further detail in the Examples below. Using BLAST and FastA sequence alignment computer programs, Applicants have found that various portions of the PRO365 polypeptide have significant homology with human 2-19 protein. Thus, it is now believed that the PRO365 polypeptide disclosed in this application is a newly identified member of the human 2-19 protein family.

１０．全長ＰＲＯ１３６１ポリペプチド
ＤＮＡ６０７８３-１６１１クローンはヒトＢ細胞ライブラリーから単離した。知りうる限り、ＤＮＡ６０７８３-１６１１配列はＰＲＯ１３６１とここで称される新規な因子をコードし；WU-BLAST2配列アラインメントコンピュータプログラムを用いて、任意の公知のタンパク質と配列同一性がないことが明らかになった。 10. Full-length PRO1361 polypeptide DNA60783-1611 clone was isolated from a human B cell library. To the best of our knowledge, the DNA60783-1611 sequence encodes a novel factor, referred to herein as PRO1361 ,; using the WU-BLAST2 sequence alignment computer program, it becomes clear that there is no sequence identity with any known protein. It was.

１１．全長ＰＲＯ１３０８ポリペプチド
WU-BLAST2配列アラインメントコンピュータプログラムを用いて、ＰＲＯ１３０８が、Dayhoffデータベースにおいて「Ｓ５５３６９」と命名されたフォリスタチンタンパク質のアミノ酸配列とある程度のアミノ酸配列同一性を共有することを見出した。従って、今では、本出願で開示されたＰＲＯ１３０８がフォリスタチンタンパク質ファミリーの新規に同定されたメンバーであり、該タンパク質ファミリーの典型的な活性又は性質を有していると信じられる。 11. Full-length PRO1308 polypeptide
Using the WU-BLAST2 sequence alignment computer program, it was found that PRO1308 shares some amino acid sequence identity with the amino acid sequence of the follistatin protein named “S55369” in the Dayhoff database. Thus, it is now believed that PRO1308 disclosed in this application is a newly identified member of the follistatin protein family and has the typical activity or properties of the protein family.

１２．全長ＰＲＯ１１８３ポリペプチド
WU-BLAST2配列アラインメントコンピュータプログラムを用いて、全長天然配列ＰＲＯ１１８３(図２６及び配列番号：５２に示す)が、プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼとある程度のアミノ酸配列同一性を有していることを見出した。従って、今では、本出願で開示されたＰＲＯ１１８３がオキシダーゼファミリーの新規に同定されたメンバーであり、オキシダーゼに典型的な酵素活性を有していると信じられる。 12 Full length PRO1183 polypeptide
Using the WU-BLAST2 sequence alignment computer program, it was found that the full-length native sequence PRO1183 (shown in FIG. 26 and SEQ ID NO: 52) has some amino acid sequence identity with protoporphyrinogen oxidase. Thus, it is now believed that PRO1183 disclosed in this application is a newly identified member of the oxidase family and possesses enzyme activity typical of oxidases.

１３．全長ＰＲＯ１２７２ポリペプチド
WU-BLAST2配列アラインメントコンピュータプログラムを用いて、全長天然配列ＰＲＯ１２７２(図２８及び配列番号：５４に示す)が、アフリカツメガエル（Xenopus laevis）からのセメント腺特異的タンパク質とある程度のアミノ酸配列同一性を有していることを見出した。従って、今では、本出願で開示されたＰＲＯ１２７２がＸＡＧファミリーの新規に同定されたメンバーであり、ＸＡＧタンパク質と少なくとも一つの機構を共有すると信じられる。 13. Full-length PRO1272 polypeptide
Using the WU-BLAST2 sequence alignment computer program, the full-length native sequence PRO1272 (shown in FIG. 28 and SEQ ID NO: 54) has some amino acid sequence identity with a cement gland specific protein from Xenopus laevis. I found out. Thus, it is now believed that PRO1272 disclosed in this application is a newly identified member of the XAG family and shares at least one mechanism with the XAG protein.

１４．全長ＰＲＯ１４１９ポリペプチド
知りうる限り、ＤＮＡ７１２９０-１６３０配列はＰＲＯ１４１９とここで称される新規な因子をコードする。WU-BLAST2配列アラインメントコンピュータプログラムを用いて、公知のタンパク質との最小の配列同一性が明らかになった。 14 Full-length PRO1419 polypeptide To the best of our knowledge, the DNA71290-1630 sequence encodes a novel factor referred to herein as PRO1419. The WU-BLAST2 sequence alignment computer program was used to reveal minimal sequence identity with known proteins.

１５．全長ＰＲＯ４９９９ポリペプチド
上に引用したALIGN-2配列アラインメントコンピュータプログラムを用いて、全長天然配列ＰＲＯ４９９９(図３２及び配列番号：５５に示す)が、UROM_HUMANとある程度のアミノ酸配列同一性を有していることを見出した。従って、今では、本出願で開示されたＰＲＯ４９９９ポリペプチドがウロモジュリンタンパク質ファミリーの新規に同定されたメンバーであり、該タンパク質ファミリーに典型的な一又は複数の生物学的及び／又は免疫学的活性又は性質を有すると信じられる。 15. Full-length PRO4999 polypeptide Using the ALIGN-2 sequence alignment computer program cited above, the full-length native sequence PRO4999 (shown in FIG. 32 and SEQ ID NO: 55) has some amino acid sequence identity with UROM_HUMAN. I found. Accordingly, the PRO4999 polypeptide disclosed in the present application is now a newly identified member of the uromodulin protein family and one or more biological and / or immunological aspects typical of that protein family. It is believed to have activity or properties.

１６．全長ＰＲＯ７１７０ポリペプチド
ＤＮＡ１０８７２２-２７４３クローンは、以下の実施例に記載したようにしてヒトライブラリーから単離した。知りうる限り、ＤＮＡ１０８７２２-２７４３ヌクレオチド配列はＰＲＯ７１７０とここで称される新規な因子をコードし；ALIGN-2配列アラインメントコンピュータプログラムを用いて、如何なる既知のタンパク質とも有意な配列同一性がないことが明らかになった。 16. The full-length PRO7170 polypeptide DNA108722-2743 clone was isolated from a human library as described in the Examples below. To the best of our knowledge, the DNA108722-2743 nucleotide sequence encodes a novel factor referred to herein as PRO7170; using the ALIGN-2 sequence alignment computer program, it is clear that there is no significant sequence identity with any known protein Became.

１７．全長ＰＲＯ２４８ポリペプチド
本発明は、本出願においてＰＲＯ２４８と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離されたヌクレオチド配列を提供する。特に、本出願人は以下の実施例で更に詳細に開示するような、ＰＲＯ２４８ポリペプチドをコードするｃＤＮＡを同定し単離した。BLAST及びFastA配列アラインメントコンピュータプログラム等の公知のプログラムを用いて、本出願人は、全長天然配列ＰＲＯ２４８(図３６及び配列番号：６５に示すアミノ酸配列)をコードするｃＤＮＡ配列が、マウス及びホモサピエンスからの成長分化因子３とある程度のアミノ酸配列同一性を有していることを見出した。従って、今では、本出願で開示されたＰＲＯ２４８ポリペプチドが、トランスフォーミング成長因子βファミリーの新規に同定されたメンバーであり、このファミリーに典型的な成長及び分化能力を有すると信じられる。 17. Full-Length PRO248 Polypeptide The present invention provides a newly identified and isolated nucleotide sequence encoding a polypeptide referred to in this application as PRO248. In particular, Applicants have identified and isolated cDNA encoding a PRO248 polypeptide, as disclosed in further detail in the Examples below. Using known programs such as the BLAST and FastA sequence alignment computer programs, Applicants have obtained that the cDNA sequence encoding the full-length native sequence PRO248 (amino acid sequence shown in FIG. 36 and SEQ ID NO: 65) from mouse and homo sapiens. It was found that it has a certain degree of amino acid sequence identity with the growth differentiation factor 3. Thus, it is now believed that the PRO248 polypeptide disclosed in this application is a newly identified member of the transforming growth factor beta family and has the growth and differentiation capabilities typical of this family.

１８．全長ＰＲＯ３５３ポリペプチド
本発明は、本出願においてＰＲＯ３５３と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離されたヌクレオチド配列を提供する。特に、本出願人は以下の実施例で更に詳細に開示するような、ＰＲＯ３５３ポリペプチドをコードするｃＤＮＡを同定し単離した。BLAST及びFastA配列アラインメントコンピュータプログラムを用いて、本出願人はＰＲＯ３５３ポリペプチドの種々の部分が、ヒト及びマウス補体タンパク質とある程度の相同性を有していることを見出した。従って、今では、本出願で開示されたＰＲＯ３５３ポリペプチドが補体タンパク質ファミリーの新規に同定されたメンバーであり、補体ファミリーのタンパク質に典型的なように炎症プロセスに影響を及ぼす能力を有していると信じられる。 18. Full-Length PRO353 Polypeptide The present invention provides a newly identified and isolated nucleotide sequence encoding a polypeptide referred to in this application as PRO353. In particular, Applicants have identified and isolated cDNA encoding a PRO353 polypeptide, as disclosed in further detail in the Examples below. Using the BLAST and FastA sequence alignment computer programs, Applicants have found that various portions of the PRO353 polypeptide have some degree of homology with human and mouse complement proteins. Thus, the PRO353 polypeptide disclosed in this application is now a newly identified member of the complement protein family and has the ability to affect inflammatory processes, as is typical of complement family proteins. It is believed that

１９．全長ＰＲＯ１３１８及びＰＲＯ１６００ポリペプチド
本発明は、本出願においてＰＲＯ１３１８及びＰＲＯ１６００と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離されたヌクレオチド配列を提供する。特に、本出願人は以下の実施例で更に詳細に開示するような、ＰＲＯ１３１８及びＰＲＯ１６００ポリペプチドをコードするｃＤＮＡを同定し単離した。BLAST及びFastA配列アラインメントコンピュータプログラム等の公知のプログラムを用いて、本出願人は、全長天然配列ＰＲＯ１３１８及びＰＲＯ１６００(それぞれ、図４０及び配列番号：７８、及び図４２及び配列番号：８０に示す)をコードするｃＤＮＡ配列が、一又は複数のケモカインとアミノ酸配列同一性を有していることを見出した。従って、今では、本出願で開示されたＰＲＯ１３１８及びＰＲＯ１６００ポリペプチドが、ケモカインファミリーの新規に同定されたメンバーであり、ケモカインファミリーに典型的な活性を有すると信じられる。 19. Full-length PRO1318 and PRO1600 polypeptides The present invention provides newly identified and isolated nucleotide sequences encoding polypeptides referred to in this application as PRO1318 and PRO1600. In particular, Applicants have identified and isolated cDNA encoding PRO1318 and PRO1600 polypeptides, as disclosed in further detail in the Examples below. Using known programs, such as the BLAST and FastA sequence alignment computer programs, Applicants have used the full-length native sequences PRO1318 and PRO1600 (shown in FIG. 40 and SEQ ID NO: 78, and FIG. 42 and SEQ ID NO: 80, respectively). It was found that the coding cDNA sequence has amino acid sequence identity with one or more chemokines. Thus, it is now believed that the PRO1318 and PRO1600 polypeptides disclosed in this application are newly identified members of the chemokine family and have activity typical of the chemokine family.

２０．全長ＰＲＯ５３３ポリペプチド
本発明は、本出願においてＰＲＯ５３３と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離されたヌクレオチド配列を提供する。特に、本出願人は以下の実施例で更に詳細に開示するような、ＰＲＯ５３３ポリペプチドをコードするｃＤＮＡを同定し単離した。BLAST及びFastA配列アラインメントコンピュータプログラムを用いて、本出願人は全長天然配列ＰＲＯ５３３(図４６及び配列番号：８６に示す)が、線維芽細胞成長因子(ＦＧＦ)と５０９のBlastスコア及び５３％のアミノ酸配列同一性を有していることを見いだした。従って、今では、本出願で開示されるＰＲＯ５３３は線維芽細胞成長因子ファミリーの新規に同定されたメンバーであり、そのようなポリペプチドに典型的な活性を有していると信じられる。 20. Full-Length PRO533 Polypeptide The present invention provides a newly identified and isolated nucleotide sequence encoding a polypeptide referred to in this application as PRO533. In particular, Applicants have identified and isolated cDNA encoding a PRO533 polypeptide, as disclosed in further detail in the Examples below. Using the BLAST and FastA sequence alignment computer program, Applicants have identified the full-length native sequence PRO533 (shown in FIG. 46 and SEQ ID NO: 86) as fibroblast growth factor (FGF) and a Blast score of 509 and 53% amino acid. It was found to have sequence identity. Therefore, PRO533 disclosed in this application is now a newly identified member of the fibroblast growth factor family and is believed to have activity typical of such polypeptides.

２１．全長ＰＲＯ３０１ポリペプチド
本発明は、本出願においてＰＲＯ３０１と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離されたヌクレオチド配列を提供する。特に、本出願人は、以下の実施例で更に詳細に開示するような、ＰＲＯ３０１ポリペプチドをコードするｃＤＮＡを同定し単離した。BLAST及びFastA配列アラインメントコンピュータプログラムを用いて、本出願人は、全長天然配列ＰＲＯ３０１(図４８と配列番号：９１に示される)がヒトＡ３３抗原前駆体と３０％のアミノ酸配列同一性に対応する２４６のBlastスコアを有していることを見いだした。従って、今では、本出願で開示されるＰＲＯ３０１はＡ３３抗原タンパク質ファミリーの新規に同定されたメンバーであり、結腸直腸ガンのようなヒト新生物性疾患に発現されうると信じられる。 21. Full-length PRO301 polypeptide The present invention provides a newly identified and isolated nucleotide sequence encoding a polypeptide referred to in this application as PRO301. In particular, Applicants have identified and isolated cDNA encoding a PRO301 polypeptide, as disclosed in further detail in the Examples below. Using BLAST and FastA sequence alignment computer programs, Applicants have determined that the full-length native sequence PRO301 (shown in FIG. 48 and SEQ ID NO: 91) corresponds to 30% amino acid sequence identity with the human A33 antigen precursor. Found to have a Blast score of. Thus, it is now believed that PRO301 disclosed in this application is a newly identified member of the A33 antigen protein family and can be expressed in human neoplastic diseases such as colorectal cancer.

２２．全長ＰＲＯ１８７ポリペプチド
本発明は、本出願においてＰＲＯ１８７と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離されたヌクレオチド配列を提供する。特に、本出願人は、以下の実施例で更に詳細に開示するような、ＰＲＯ１８７ポリペプチドをコードするｃＤＮＡを同定し単離した。BLAST及びFastA配列アラインメントコンピュータプログラムを用いて、本出願人は、全長天然配列ＰＲＯ１８７(図５０に示す)が様々なアンドロゲン誘導成長因子及びＦＧＦ-８と７４％のアミノ酸同一性及び３１０のBLASTスコアを有していることを見出した。従って、今では、本出願で開示されるＰＲＯ１８７ポリペプチドはＦＧＦ-８タンパク質ファミリーの新規に同定されたメンバーであり、ＦＧＦ-８様タンパク質ファミリーに典型的な活性又は性質を有すると信じられる。 22. Full-Length PRO187 Polypeptide The present invention provides a newly identified and isolated nucleotide sequence encoding a polypeptide referred to in this application as PRO187. In particular, Applicants have identified and isolated cDNA encoding a PRO187 polypeptide, as disclosed in further detail in the Examples below. Using the BLAST and FastA sequence alignment computer program, Applicants have determined that the full-length native sequence PRO187 (shown in FIG. 50) has 74% amino acid identity with various androgen-induced growth factors and FGF-8 and a BLAST score of 310. I found that I have. Accordingly, it is now believed that the PRO187 polypeptide disclosed in this application is a newly identified member of the FGF-8 protein family and has activities or properties typical of the FGF-8-like protein family.

２３．全長ＰＲＯ３３７ポリペプチド
本発明は、本出願においてＰＲＯ３３７と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離されたヌクレオチド配列を提供する。特に本出願人は、以下の実施例で更に詳細に開示するような、ＰＲＯ３３７ポリペプチドをコードするｃＤＮＡを同定し単離した。BLAST、BLAST-2及びFastA配列アラインメントプログラムを用いて、本出願人は、全長天然配列ＰＲＯ３３７が、ラットニューロトリミンと９７％の配列同一性、チキンＣＥＰＵと８５％の配列同一性、チキンＧ５５と７３％の配列同一性、ヒトＬＡＭＰと５９％の相同性、及びヒトＯＰＣＡＭと８４％の相同性を有することを見出した。従って、今では、本出願で開示されるＰＲＯ３３７が免疫グロブリンスーパーファミリーのＩｇＬＯＮサブファミリーの新規に同定されたメンバーであり、神経突起成長及び分化可能特性を有すると信じられる。 23. Full-Length PRO337 Polypeptide The present invention provides a newly identified and isolated nucleotide sequence encoding a polypeptide referred to in this application as PRO337. In particular, Applicants have identified and isolated cDNA encoding a PRO337 polypeptide, as disclosed in further detail in the Examples below. Using the BLAST, BLAST-2 and FastA sequence alignment programs, Applicants have found that the full-length native sequence PRO337 is 97% sequence identical to rat neurotrimin, 85% sequence identity to chicken CEPU, chicken G55 and 73. % Sequence identity, 59% homology with human LAMP, and 84% homology with human OPCAM. Thus, it is now believed that PRO337 disclosed in this application is a newly identified member of the IgLON subfamily of the immunoglobulin superfamily and has neurite outgrowth and differentiable properties.

２４．全長ＰＲＯ１４１１ポリペプチド
知りうる限り、ＤＮＡ５９２１２-１６２７配列はＰＲＯ１４１１とここで称される新規な因子をコードする。しかし、WU-BLAST2配列アラインメントコンピュータプログラムを用いて、公知のタンパク質とのある程度の配列同一性が明らかになった。 24. Full-length PRO1411 polypeptide To the best of our knowledge, the DNA59212-1627 sequence encodes a novel factor referred to herein as PRO1411. However, using the WU-BLAST2 sequence alignment computer program, some sequence identity with known proteins was revealed.

２５．全長ＰＲＯ４３５６ポリペプチド
WU-BLAST2配列アラインメントコンピュータプログラムを用いて、全長天然配列ＰＲＯ４３５６(図５６及び配列番号：１０８に示す)が、転移関連ＧＰＩアンカータンパク質とある程度のアミノ酸配列同一性を有していることを見出した。従って、今では、本出願で開示されたＰＲＯ４３５６が該ファミリーの新規に同定されたメンバーであり、同様の機構を共有すると信じられる。 25. Full length PRO4356 polypeptide
Using the WU-BLAST2 sequence alignment computer program, it was found that the full-length native sequence PRO4356 (shown in FIG. 56 and SEQ ID NO: 108) has some amino acid sequence identity with the metastasis-related GPI anchor protein. Thus, it is now believed that PRO4356 disclosed in this application is a newly identified member of the family and shares a similar mechanism.

２６．全長ＰＲＯ２４６ポリペプチド
本発明は、本出願においてＰＲＯ２４６と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離されたヌクレオチド配列を提供する。特に、本出願人は、以下の実施例で更に詳細に開示するような、ＰＲＯ２４６ポリペプチドをコードするｃＤＮＡを同定し単離した。BLAST及びFastA配列アラインメントコンピュータプログラムを用いて、本出願人は、ＰＲＯ２４６ポリペプチドの一部がヒト細胞表面タンパク質ＨＣＡＲと有意な相同性を有していることを見いだした。従って、今では、本出願で開示されるＰＲＯ２４６ポリペプチドは新規に同定された膜結合ウィルスレセプター又は腫瘍細胞特異的抗原であると信じられる。 26. Full-Length PRO246 Polypeptide The present invention provides a newly identified and isolated nucleotide sequence encoding a polypeptide referred to in this application as PRO246. In particular, Applicants have identified and isolated cDNA encoding a PRO246 polypeptide, as disclosed in further detail in the Examples below. Using BLAST and FastA sequence alignment computer programs, Applicants have found that a portion of the PRO246 polypeptide has significant homology to the human cell surface protein HCAR. Thus, it is now believed that the PRO246 polypeptide disclosed in this application is a newly identified membrane-bound viral receptor or tumor cell specific antigen.

２７．全長ＰＲＯ２６５ポリペプチド
本発明は、本出願においてＰＲＯ２６５と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離されたヌクレオチド配列を提供する。特に、本出願人は、以下の実施例で更に詳細に開示するような、ＰＲＯ２６５ポリペプチドをコードするｃＤＮＡを同定し単離した。BLAST及びFastA配列アラインメントコンピュータプログラム等のプログラムを用いて、本出願人は、ＰＲＯ２６５ポリペプチドの種々の部分がフィブロモジュリンタンパク質及びフィブロモジュリン前駆体タンパク質と有意な相同性を有していることを見いだした。本出願人はまたＰＲＯ２６５ポリペプチドをコードしているＤＮＡが皮膚と創傷修復に関与するロイシンリッチ反復タンパク質ファミリーのメンバーである血小板糖タンパク質Ｖと有意な相同性を有していることを見いだした。従って、今では、本出願で開示されるＰＲＯ２６５ポリペプチドはロイシンリッチ反復タンパク質ファミリーの新規に同定されたメンバーであり、このファミリーに典型的なタンパク質間結合能を有し並びに皮膚と創傷修復への関与していると信じられる。 27. Full-Length PRO265 Polypeptides The present invention provides newly identified and isolated nucleotide sequences that encode a polypeptide referred to in this application as PRO265. In particular, Applicants have identified and isolated cDNA encoding a PRO265 polypeptide, as disclosed in further detail in the Examples below. Using programs such as the BLAST and FastA sequence alignment computer programs, Applicants have determined that various portions of the PRO265 polypeptide have significant homology to fibrojuulin protein and fibrojuline precursor protein. I found it. Applicants have also found that the DNA encoding the PRO265 polypeptide has significant homology with platelet glycoprotein V, a member of the leucine-rich repeat protein family involved in skin and wound repair. Thus, the PRO265 polypeptide disclosed in the present application is now a newly identified member of the leucine-rich repeat protein family, having the protein-protein binding ability typical of this family, as well as for skin and wound repair. Believed to be involved.

２８．全長ＰＲＯ９４１ポリペプチド
本発明は、本出願においてＰＲＯ９４１と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離されたヌクレオチド配列を提供する。特に本出願人は、以下の実施例で更に詳細に開示するような、ＰＲＯ９４１ポリペプチドをコードするｃＤＮＡを同定し単離した。BLAST及びFastA配列アラインメントコンピュータプログラムを用いて、本出願人は、ＰＲＯ９４１ポリペプチドが一又は複数のカドヘリンタンパク質と有意な類似性を有していることを見出した。従って、今では、本出願で開示されるＰＲＯ９４１ポリペプチドが新規に同定されたカドヘリン相同体であると信じられる。 28. Full-Length PRO941 Polypeptide The present invention provides a newly identified and isolated nucleotide sequence encoding a polypeptide referred to in this application as PRO941. In particular, Applicants have identified and isolated cDNA encoding a PRO941 polypeptide, as disclosed in further detail in the Examples below. Using BLAST and FastA sequence alignment computer programs, Applicants have found that the PRO941 polypeptide has significant similarity to one or more cadherin proteins. Thus, it is now believed that the PRO941 polypeptide disclosed in this application is a newly identified cadherin homolog.

２９．全長ＰＲＯ１００９６ポリペプチド
上に引用されたALIGN-2配列アラインメントコンピュータプログラムを用いて、全長天然配列ＰＲＯ１００９６(図６４及び配列番号：１２６に示す)が、種々のインターロイキン-１０関連分子とある程度のアミノ酸配列同一性を有していることを見出した。従って、今では、本出願で開示されたＰＲＯ１００９６ポリペプチドが新規に同定されたＩＬ-１０相同体であり、該タンパク質に典型的な一又は複数の生物学的及び／又は免疫学的活性又は性質を有すると信じられる。 29. Full-length PRO10096 polypeptide Using the ALIGN-2 sequence alignment computer program cited above, the full-length native sequence PRO10096 (shown in FIG. 64 and SEQ ID NO: 126) is converted to various interleukin-10-related molecules and some amino acid sequences. It was found to have identity. Accordingly, the PRO10096 polypeptide disclosed in the present application is now a newly identified IL-10 homologue, and one or more biological and / or immunological activities or properties typical of the protein It is believed to have

３０．全長ＰＲＯ６００３ポリペプチド
ＤＮＡ８３５６８-２６９２クローンは、以下の実施例に記載したようにしてヒト胎児腎臓ライブラリーから単離した。知りうる限り、ＤＮＡ８３５６８-２６９２ヌクレオチド配列はＰＲＯ６００３とここで称される新規な因子をコードし；ALIGN-2配列アラインメントコンピュータプログラムを用いて、如何なる既知のタンパク質とも有意な配列同一性がないことが明らかになった。 30. The full-length PRO6003 polypeptide DNA83568-2692 clone was isolated from a human fetal kidney library as described in the Examples below. To the best of our knowledge, the DNA83568-2692 nucleotide sequence encodes a novel factor referred to herein as PRO6003; using the ALIGN-2 sequence alignment computer program, it is clear that there is no significant sequence identity with any known protein Became.

Ｂ．ＰＲＯポリペプチド変異体
ここに記載した全長天然配列ＰＲＯポリペプチドに加えて、ＰＲＯ変異体も調製できると考えられる。ＰＲＯ変異体は、ＰＲＯ ＤＮＡに適当なヌクレオチド変化を導入することにより、あるいは所望のＰＲＯポリペプチドを合成することにより調製できる。当業者であれば、グリコシル化部位の数又は位置の変化あるいは膜固着特性の変化などのアミノ酸変化がＰＲＯの翻訳後プロセスを変えうることを理解するであろう。
天然全長配列ＰＲＯ又はここに記載したＰＲＯの種々のドメインにおける変異は、例えば、米国特許第5,364,934号に記載されている保存的及び非保存的変異についての任意の技術及び指針を用いてなすことができる。変異は、天然配列ＰＲＯと比較してＰＲＯのアミノ酸配列が変化することになるＰＲＯをコードする一又は複数のコドンの置換、欠失又は挿入であってよい。場合によっては、変異は少なくとも一つのアミノ酸のＰＲＯの一又は複数のドメインの任意の他のアミノ酸による置換である。どのアミノ酸残基が所望の活性に悪影響を与えることなく挿入、置換又は欠失されるかの指針は、ＰＲＯの配列を、相同性な既知のタンパク質分子のものと比較し、相同性の高い領域になされるアミノ酸配列変化の数を最小にすることによって見出される。アミノ酸置換は、一のアミノ酸の類似した構造及び／又は化学特性を持つ他のアミノ酸での置換、例えばロイシンのセリンでの置換、即ち保存的アミノ酸置換の結果とすることができる。挿入及び欠失は、場合によっては約１から５のアミノ酸の範囲内とすることができる。許容される変異は、配列においてアミノ酸の挿入、欠失又は置換を系統的に作成し、得られた変異体について全長又は成熟天然配列が示す活性を試験することにより決定される。 B. PRO polypeptide variants In addition to the full-length native sequence PRO polypeptides described herein, it is contemplated that PRO variants can also be prepared. PRO variants can be prepared by introducing appropriate nucleotide changes into the PRO DNA or by synthesizing the desired PRO polypeptide. One skilled in the art will appreciate that amino acid changes such as changes in the number or position of glycosylation sites or changes in membrane anchoring properties can alter the post-translational process of PRO.
Mutations in the native full-length sequence PRO or various domains of the PRO described herein may be made using any technique and guidance for conservative and non-conservative mutations described, for example, in US Pat. No. 5,364,934. it can. A mutation may be a substitution, deletion or insertion of one or more codons encoding PRO that will alter the amino acid sequence of the PRO compared to the native sequence PRO. In some cases, the mutation is a substitution of at least one amino acid PRO by one or more domains of any other amino acid. Guidance on which amino acid residues are inserted, substituted or deleted without adversely affecting the desired activity can be obtained by comparing the sequence of PRO with that of a known homologous protein molecule. Is found by minimizing the number of amino acid sequence changes made. Amino acid substitutions can be the result of substitution of one amino acid with another amino acid having similar structural and / or chemical properties, eg, substitution of leucine with serine, ie, a conservative amino acid substitution. Insertions and deletions can optionally be in the range of about 1 to 5 amino acids. Permissible mutations are determined by systematically making amino acid insertions, deletions or substitutions in the sequence and testing the activity of the resulting mutant for the full-length or mature native sequence.

ＰＲＯポリペプチド断片がここに提供される。このような断片は、例えば、全長天然タンパク質と比較した際に、Ｎ-末端又はＣ-末端で切断されてもよく、又は内部残基を欠いていてもよい。或る種の断片は、ＰＲＯポリペプチドの所望の生物学的活性に必須ではないアミノ酸残基を欠いている。
ＰＲＯ断片は、多くの一般的な技術の任意のものによって調製されうる。所望のペプチド断片は化学合成されてもよい。代替方法は、酵素的消化、例えば特定のアミノ酸残基によって定められる部位のタンパク質を切断することが知られた酵素でタンパク質を処理することにより、あるいは適当な制限酵素でＤＮＡを消化して所望の断片を単離することによるＰＲＯ断片の生成を含む。さらに他の好適な技術は、ポリメラーゼ連鎖反応(ＰＣＲ)により、所望のポリペプチド断片をコードするＤＮＡ断片を単離し増幅することを含む。ＤＮＡ断片の所望の末端を定めるオリゴヌクレオチドは、ＰＣＲの５’及び３’プライマーで用いられる。好ましくは、ＰＲＯポリペプチド断片は、ここに開示した天然ＰＲＯポリペプチドと少なくとも一つの生物学的及び／又は免疫学的活性を共有する。
特別の実施態様では、関心ある保存的置換を、好ましい置換との表題で表６に示す。このような置換が生物学的活性の変化をもたらす場合、表６に置換例と命名され、又は以下にアミノ酸分類に関してさらに記載されるような、より実質的な変化が導入され、生成物がスクリーニングされる。

Figure 2006068006
PRO polypeptide fragments are provided herein. Such fragments may be cleaved at the N-terminus or C-terminus, for example, or lack internal residues when compared to a full-length native protein. Certain fragments lack amino acid residues that are not essential for a desired biological activity of the PRO polypeptide.
PRO fragments can be prepared by any of a number of common techniques. Desired peptide fragments may be chemically synthesized. Alternative methods include enzymatic digestion, for example by treating the protein with an enzyme known to cleave the protein at a site defined by a particular amino acid residue, or by digesting the DNA with an appropriate restriction enzyme Includes the generation of PRO fragments by isolating the fragments. Yet another suitable technique involves isolating and amplifying a DNA fragment encoding the desired polypeptide fragment by polymerase chain reaction (PCR). Oligonucleotides that define the desired ends of the DNA fragments are used in PCR 5 ′ and 3 ′ primers. Preferably, the PRO polypeptide fragment shares at least one biological and / or immunological activity with a native PRO polypeptide disclosed herein.
In a particular embodiment, the conservative substitutions of interest are shown in Table 6 under the heading Preferred substitutions. If such a substitution results in a change in biological activity, a more substantial change, such as a substitution example in Table 6 or described further below with respect to amino acid classification, is introduced and the product is screened. Is done.
Figure 2006068006

ＰＲＯポリペプチドの機能又は免疫学的同一性の実質的修飾は、(ａ)置換領域のポリペプチド骨格の構造、例えばシート又は螺旋配置、(ｂ)標的部位の分子の電荷又は疎水性、又は(ｃ)側鎖の嵩を維持しながら、それらの効果において実質的に異なる置換基を選択することにより達成される。天然に生じる残基は共通の側鎖特性に基づいてグループ分けすることができる：
(１)疎水性：ノルロイシン, met, ala, val, leu, ile;
(２)中性の親水性：cys, ser, thr;
(３)酸性：asp, glu;
(４)塩基性：asn, gln, his, lys, arg;
(５)鎖配向に影響する残基：gly, pro; 及び
(６)芳香族：trp, tyr, phe。
非保存的置換は、これらの分類の一つのメンバーを他の分類に交換することを必要とするであろう。また、そのように置換された残基は、保存的置換部位、好ましくは残された(非保存)部位に導入されうる。
変異は、オリゴヌクレオチド媒介(部位特異的)突然変異誘発、アラニンスキャンニング、及びＰＣＲ突然変異誘発等の当該分野において公知の技術を使用して作成することができる。部位特異的突然変異誘発［Carter等, Nucl. Acids Res., 13: 4331 (1986); Zoller等, Nucl. Acids Res., 10: 6487 (1987)］、カセット突然変異誘発［Wells等, Gene, 34: 315 (1985)］、制限選択突然変異誘発［Wells等, Philos. Trans. R. Soc. London SerA, 317: 415 (1986)］又は他の周知の技術が、ＰＲＯ変異体ＤＮＡを製造するために、クローン化されたＤＮＡに実施できる。
また、隣接配列に沿って一又は複数のアミノ酸を同定するのにスキャンニングアミノ酸分析を用いることができる。好ましいスキャンニングアミノ酸は比較的小さく、中性のアミノ酸である。そのようなアミノ酸は、アラニン、グリシン、セリン、及びシステインを含む。アラニンは、ベータ炭素を越える側鎖を排除し変異体の主鎖構造を変化させにくいので、この群の中で典型的に好ましいスキャンニングアミノ酸である［Cuningham及びWells, Science, 244: 1081-1085 (1989)］。また、アラニンは最もありふれたアミノ酸であるため典型的には好ましい。さらに、それは埋もれた及び露出した位置の両方に見られることが多い［Creighton, The Proteins, (W.H. Freeman & Co., N.Y.); Chothia, J. Mol. Biol., 150: 1 (1976)］。アラニン置換が十分な量の変異体を生じない場合は、アイソテリック(isoteric)アミノ酸を用いることができる。 Substantial modification of the PRO polypeptide function or immunological identity can be achieved by: c) achieved by selecting substituents that differ substantially in their effect while maintaining the bulk of the side chains. Naturally occurring residues can be grouped based on common side chain properties:
(1) Hydrophobicity: norleucine, met, ala, val, leu, ile;
(2) Neutral hydrophilicity: cys, ser, thr;
(3) Acidity: asp, glu;
(4) Basicity: asn, gln, his, lys, arg;
(5) Residues affecting chain orientation: gly, pro;
(6) Aromatic: trp, tyr, phe.
Non-conservative substitutions will require exchanging one member of these classes for another. Residues so substituted can also be introduced at conservative substitution sites, preferably left (non-conserved) sites.
Mutations can be made using techniques known in the art such as oligonucleotide-mediated (site-specific) mutagenesis, alanine scanning, and PCR mutagenesis. Site-directed mutagenesis [Carter et al., Nucl. Acids Res., 13: 4331 (1986); Zoller et al., Nucl. Acids Res., 10: 6487 (1987)], cassette mutagenesis [Wells et al., Gene, 34: 315 (1985)], restriction selective mutagenesis [Wells et al., Philos. Trans. R. Soc. London SerA, 317: 415 (1986)] or other well-known techniques produce PRO mutant DNA. Can be performed on cloned DNA.
Scanning amino acid analysis can also be used to identify one or more amino acids along adjacent sequences. Preferred scanning amino acids are relatively small and neutral amino acids. Such amino acids include alanine, glycine, serine, and cysteine. Alanine is a typically preferred scanning amino acid in this group because it eliminates side chains beyond the beta carbon and is unlikely to change the backbone structure of the mutant [Cuningham and Wells, Science, 244: 1081-1085 (1989)]. Alanine is also typically preferred because it is the most common amino acid. Furthermore, it is often found in both buried and exposed positions [Creighton, The Proteins, (WH Freeman & Co., NY); Chothia, J. Mol. Biol., 150: 1 (1976)]. If alanine substitution does not result in a sufficient amount of mutants, isoteric amino acids can be used.

Ｃ．ＰＲＯの修飾
ＰＲＯの共有結合的修飾は本発明の範囲内に含まれる。共有結合的修飾の一型は、ＰＲＯポリペプチドの標的とするアミノ酸残基を、ＰＲＯの選択された側鎖又はＮ又はＣ末端残基と反応できる有機誘導体化試薬と反応させることを含む。二官能性試薬での誘導体化が、例えばＰＲＯを水不溶性支持体マトリクスあるいは抗-ＰＲＯ抗体の精製方法又はその逆で用いるための表面に架橋させるのに有用である。通常用いられる架橋剤は、例えば、１，１-ビス(ジアゾアセチル)-２-フェニルエタン、グルタルアルデヒド、Ｎ-ヒドロキシスクシンイミドエステル、例えば４-アジドサリチル酸、３，３’-ジチオビス(スクシンイミジルプロピオネート)等のジスクシンイミジルエステルを含むホモ二官能性イミドエステル、ビス-Ｎ-マレイミド-１，８-オクタン等の二官能性マレイミド、及びメチル-３-[(ｐ-アジドフェニル)-ジチオ］プロピオイミダート等の試薬を含む。
他の修飾は、グルタミニル及びアスパラギニル残基の各々対応するグルタミル及びアスパルチル残基への脱アミノ化、プロリン及びリシンのヒドロキシル化、セリル又はトレオニル残基のヒドロキシル基のリン酸化、リシン、アルギニン、及びヒスチジン側鎖のα-アミノ基のメチル化[T.E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W.H. Freeman & Co., San Francisco, pp.79-86 (1983)]、Ｎ末端アミンのアセチル化、及び任意のＣ末端カルボキシル基のアミド化を含む。 C. Modification of PRO Covalent modifications of PRO are included within the scope of the present invention. One type of covalent modification involves reacting the amino acid residue targeted by the PRO polypeptide with an organic derivatization reagent capable of reacting with a selected side chain or N or C terminal residue of PRO. Derivatization with bifunctional reagents is useful, for example, to cross-link PRO to a surface for use in a water-insoluble support matrix or anti-PRO antibody purification method or vice versa. Commonly used crosslinking agents include, for example, 1,1-bis (diazoacetyl) -2-phenylethane, glutaraldehyde, N-hydroxysuccinimide ester, such as 4-azidosalicylic acid, 3,3′-dithiobis (succinimidyl) Homobifunctional imide esters including disuccinimidyl esters such as propionate), bifunctional maleimides such as bis-N-maleimide-1,8-octane, and methyl-3-[(p-azidophenyl)- Reagents such as dithio] propioimidate.
Other modifications include deamination of glutaminyl and asparaginyl residues to the corresponding glutamyl and aspartyl residues, hydroxylation of proline and lysine, phosphorylation of the hydroxyl group of seryl or threonyl residues, lysine, arginine, and histidine, respectively. Methylation of α-amino group of side chain [TE Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, WH Freeman & Co., San Francisco, pp. 79-86 (1983)], acetylation of N-terminal amine, and optional Includes amidation of the C-terminal carboxyl group.

本発明の範囲内に含まれるＰＲＯポリペプチドの共有結合的修飾の他の型は、ポリペプチドの天然グリコシル化パターンの変更を含む。「天然グリコシル化パターンの変更」とは、この目的で意図されるのは、天然配列ＰＲＯに見られる一又は複数の炭水化物部分の欠失(存在するグリコシル化部位の除去又は化学的及び／又は酵素的手段によるグリコシル化の削除のいずれかによる)、及び／又は天然配列ＰＲＯに存在しない一又は複数のグリコシル化部位の付加を意味する。さらに、この文節は、存在する種々の炭水化物部分の性質及び特性の変化を含む、天然タンパク質のグリコシル化における定性的変化を含む。
ＰＲＯポリペプチドへのグリコシル化部位の付加はアミノ酸配列の変更を伴ってもよい。この変更は、例えば、一又は複数のセリン又はトレオニン残基の天然配列ＰＲＯ(Ｏ-結合グリコシル化部位)への付加、又は置換によってなされてもよい。ＰＲＯアミノ酸配列は、場合によっては、ＤＮＡレベルでの変化、特に、ＰＲＯポリペプチドをコードするＤＮＡを予め選択された塩基において変異させ、所望のアミノ酸に翻訳されるコドンを生成させることを通して変更されてもよい。 Another type of covalent modification of a PRO polypeptide included within the scope of the present invention involves altering the native glycosylation pattern of the polypeptide. By “altering the native glycosylation pattern” is intended for this purpose the deletion of one or more carbohydrate moieties found in the native sequence PRO (removal of existing glycosylation sites or chemical and / or enzyme). Or by the addition of one or more glycosylation sites that are not present in the native sequence PRO. In addition, this clause includes qualitative changes in glycosylation of natural proteins, including changes in the nature and properties of the various carbohydrate moieties present.
Addition of glycosylation sites to the PRO polypeptide may involve amino acid sequence alterations. This alteration may be made, for example, by addition or substitution of one or more serine or threonine residues to the native sequence PRO (O-linked glycosylation site). The PRO amino acid sequence is optionally altered through changes at the DNA level, particularly by mutating the DNA encoding the PRO polypeptide at a preselected base to produce a codon that is translated into the desired amino acid. Also good.

ＰＲＯポリペプチド上に炭水化物部分の数を増加させる他の手段は、グリコシドのポリペプチドへの化学的又は酵素的結合による。このような方法は、この技術分野において、例えば、1987年9月11日に公開されたWO 87/05330、及びAplin及びWriston, CRC Crit. Rev. Biochem., pp. 259-306 (1981)に記載されている。
ＰＲＯポリペプチド上に存在する炭水化物部分の除去は、化学的又は酵素的に、あるいはグルコシル化の標的として提示されたアミノ酸残基をコードするコドンの変異的置換によってなすことができる。化学的脱グリコシル化技術は、この分野で知られており、例えば、Hakimuddin等, Arch. Biochem. Biophys., 259:52 (1987)により、及びEdge等, Anal. Biochem., 118: 131 (1981)により記載されている。ポリペプチド上の炭水化物部分の酵素的切断は、Thotakura等, Meth. Enzymol. 138:350 (1987)に記載されているように、種々のエンド及びエキソグリコシダーゼを用いることにより達成される。
ＰＲＯの共有結合的修飾の他の型は、ＰＲＯポリぺプチドの、種々の非タンパク質様ポリマー、例えばポリエチレングリコール(PEG)、ポリプロピレングリコール、又はポリオキシアルキレンの一つへの、米国特許第4,640,835号；第4,496,689号；第4,301,144号；第4,670,417号；第4,791,192号又は第4,179,337号に記載された方法での結合を含む。 Another means of increasing the number of carbohydrate moieties on the PRO polypeptide is by chemical or enzymatic coupling of glycosides to the polypeptide. Such methods are described in the art, for example in WO 87/05330 published September 11, 1987, and in Aplin and Wriston, CRC Crit. Rev. Biochem., Pp. 259-306 (1981). Are listed.
Removal of carbohydrate moieties present on the PRO polypeptide can be accomplished chemically or enzymatically, or by mutational substitution of codons encoding amino acid residues presented as targets for glucosylation. Chemical deglycosylation techniques are known in the art, for example, by Hakimuddin et al., Arch. Biochem. Biophys., 259: 52 (1987), and Edge et al., Anal. Biochem., 118: 131 (1981 ). Enzymatic cleavage of the carbohydrate moiety on the polypeptide is accomplished by using various endo and exoglycosidases as described in Thotakura et al., Meth. Enzymol. 138: 350 (1987).
Another type of covalent modification of PRO is U.S. Pat. No. 4,640,835 to one of various non-proteinaceous polymers of PRO polypeptide, such as polyethylene glycol (PEG), polypropylene glycol, or polyoxyalkylene. 4,496,689; 4,301,144; 4,670,417; 4,791,192 or 4,179,337.

また、本発明のＰＲＯは、他の異種ポリペプチド又はアミノ酸配列に融合したＰＲＯを含むキメラ分子を形成する方法で修飾してもよい。
一実施態様では、このようなキメラ分子は、抗タグ抗体が選択的に結合できるエピトープを提供するタグポリペプチドとＰＲＯとの融合を含む。エピトープタグは、一般的にはＰＲＯのアミノ又はカルボキシル末端に位置する。このようなＰＲＯのエピトープタグ形態の存在は、タグポリペプチドに対する抗体を用いて検出することができる。また、エピトープタグの提供は、抗-タグ抗体又はエピトープタグに結合する他の型の親和性マトリクスを用いたアフィニティ精製によってＰＲＯを容易に精製できるようにする。種々のタグポリペプチド及びそれら各々の抗体はこの分野で良く知られている。例としては、ポリ-ヒスチジン(poly-his)又はポリ-ヒスチジン-グリシン(poly-his-gly)タグ；flu HAタグポリペプチド及びその抗体１２ＣＡ５［Field等, Mol. Cell. Biol., 8:2159-2165 (1988)］；c-mycタグ及びそれに対する８Ｆ９、３Ｃ７、６Ｅ１０、Ｇ４、Ｂ７及び９Ｅ１０抗体［Evan等, Molecular and Cellular Biology, 5:3610-3616 (1985)］；及び単純ヘルペスウイルス糖タンパク質Ｄ(gD)タグ及びその抗体［Paborsky等, Protein Engineering, 3(6):547-553 (1990)］を含む。他のタグポリペプチドは、フラッグペプチド［Hopp等, BioTechnology, 6:1204-1210 (1988)］；ＫＴ３エピトープペプチド［Martin等, Science, 255:192-194 (1992)］；α-チューブリンエピトープペプチド［Skinner等, J. Biol. Chem., 266:15163-15166 (1991)］；及びＴ７遺伝子１０タンパク質ペプチドタグ［Lutz-Freyermuth等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:6393-6397 (1990)］を含む。
それに換わる実施態様では、キメラ分子はＰＲＯの免疫グロブリン又は免疫グロブリンの特定領域との融合体を含んでもよい。キメラ分子の二価形態(「イムノアドヘシン」とも呼ばれる)については、そのような融合体はＩｇＧ分子のＦｃ領域であり得る。Ｉｇ融合体は、好ましくはＩｇ分子内の少なくとも一つの可変領域に換えてＰＲＯポリペプチドの可溶化(膜貫通ドメイン欠失又は不活性化)形態を含む。特に好ましい実施態様では、免疫グロブリン融合体は、ＩｇＧ１分子のヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ３、又はヒンジ、ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３領域を含む。免疫グロブリン融合体の製造については、1995年6月27日発行の米国特許第5,428,130号を参照のこと。 The PRO of the present invention may also be modified by a method of forming a chimeric molecule comprising PRO fused to another heterologous polypeptide or amino acid sequence.
In one embodiment, such chimeric molecules comprise a fusion of a PRO with a tag polypeptide that provides an epitope to which an anti-tag antibody can selectively bind. The epitope tag is generally located at the amino or carboxyl terminus of PRO. The presence of such an epitope tag form of PRO can be detected using an antibody against the tag polypeptide. Providing the epitope tag also allows the PRO to be easily purified by affinity purification using an anti-tag antibody or other type of affinity matrix that binds to the epitope tag. Various tag polypeptides and their respective antibodies are well known in the art. Examples include poly-histidine (poly-his) or poly-histidine-glycine (poly-his-gly) tag; flu HA tag polypeptide and its antibody 12CA5 [Field et al., Mol. Cell. Biol., 8: 2159 -2165 (1988)]; c-myc tag and 8F9, 3C7, 6E10, G4, B7 and 9E10 antibodies thereto [Evan et al., Molecular and Cellular Biology, 5: 3610-3616 (1985)]; and herpes simplex virus sugars A protein D (gD) tag and its antibody [Paborsky et al., Protein Engineering, 3 (6): 547-553 (1990)]. Other tag polypeptides include flag peptides [Hopp et al., BioTechnology, 6: 1204-1210 (1988)]; KT3 epitope peptides [Martin et al., Science, 255: 192-194 (1992)]; α-tubulin epitope peptides [Skinner et al., J. Biol. Chem., 266: 15163-15166 (1991)]; and T7 gene 10 protein peptide tag [Lutz-Freyermuth et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87: 6393-6397 ( 1990)].
In an alternative embodiment, the chimeric molecule may comprise a PRO immunoglobulin or a fusion with a specific region of an immunoglobulin. For a bivalent form of a chimeric molecule (also called “immunoadhesin”), such a fusion may be the Fc region of an IgG molecule. An Ig fusion preferably comprises a solubilized (transmembrane domain deleted or inactivated) form of the PRO polypeptide in place of at least one variable region within the Ig molecule. In a particularly preferred embodiment, the immunoglobulin fusion comprises the hinge, CH2 and CH3, or hinge, CH1, CH2 and CH3 regions of the IgG1 molecule. For the production of immunoglobulin fusions, see US Pat. No. 5,428,130 issued June 27, 1995.

Ｄ．ＰＲＯの調製
以下の説明は、主として、ＰＲＯ核酸を含むベクターで形質転換又は形質移入された細胞を培養することによりＰＲＯを生産する方法に関する。もちろん、当該分野においてよく知られている他の方法を用いてＰＲＯを調製することができると考えられる。例えば、ＰＲＯ配列、又はその一部は、固相技術を用いた直接ペプチド合成によって生産してもよい［例えば、Stewart等, Solid-Phase Peptide Synthesis, W.H. Freeman Co., San Francisco, CA (1969)；Merrifield, J. Am. Chem. Soc., 85:2149-2154 (1963)参照］。手動技術又は自動によるインビトロタンパク質合成を行ってもよい。自動合成は、例えば、アプライド・バイオシステムズ・ペプチド合成機(Foster City, CA)を用いて、製造者の指示により実施してもよい。ＰＲＯの種々の部分は、別々に化学的に合成され、化学的又は酵素的方法を用いて結合させて全長ＰＲＯを生産してもよい。 D. PRO Preparation The following description relates primarily to a method for producing PRO by culturing cells transformed or transfected with a vector containing PRO nucleic acid. Of course, it is believed that the PRO can be prepared using other methods well known in the art. For example, PRO sequences, or portions thereof, may be produced by direct peptide synthesis using solid phase techniques [eg, Stewart et al., Solid-Phase Peptide Synthesis, WH Freeman Co., San Francisco, CA (1969). Merrifield, J. Am. Chem. Soc., 85: 2149-2154 (1963)]. In vitro protein synthesis may be performed by manual techniques or by automation. Automated synthesis may be performed, for example, using an Applied Biosystems Peptide Synthesizer (Foster City, CA) according to the manufacturer's instructions. The various portions of the PRO may be chemically synthesized separately and combined using chemical or enzymatic methods to produce the full-length PRO.

１．ＰＲＯをコードするＤＮＡの単離
ＰＲＯをコードするＤＮＡは、ＰＲＯｍＲＮＡを保有していてそれを検出可能なレベルで発現すると考えられる組織から調製されたｃＤＮＡライブラリーから得ることができる。従って、ヒトＰＲＯ ＤＮＡは、実施例に記載されるように、ヒトの組織から調製されたｃＤＮＡライブラリーから簡便に得ることができる。またＰＲＯ-コード化遺伝子は、ゲノムライブラリーから又は公知の合成方法(例えば、自動化核酸合成)により得ることもできる。
ライブラリーは、関心ある遺伝子あるいはその遺伝子によりコードされるタンパク質を同定するために設計されたプローブ(ＰＲＯに対する抗体又は少なくとも約２０−８０塩基のオリゴヌクレオチド等)によってスクリーニングできる。選択されたプローブによるｃＤＮＡ又はゲノムライブラリーのスクリーニングは、例えばSambrook等, Molecular Cloning: A Laboratory Manual(New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)に記載されている標準的な手順を使用して実施することができる。ＰＲＯポリペプチドをコードする遺伝子を単離する他の方法はＰＣＲ法を使用するものである［Sambrook等,上掲；Dieffenbach等, PCR Primer：A Laboratory Manual(Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1995)］。 1. Isolation of DNA encoding PRO PRODNA encoding PRO can be obtained from a cDNA library prepared from tissues that carry PRO mRNA and are believed to express it at detectable levels. Accordingly, human PRO DNA can be conveniently obtained from a cDNA library prepared from human tissue, as described in the Examples. The PRO-encoding gene can also be obtained from a genomic library or by a known synthesis method (for example, automated nucleic acid synthesis).
Libraries can be screened with probes designed to identify the gene of interest or the protein encoded by the gene (such as an antibody to PRO or an oligonucleotide of at least about 20-80 bases). Screening of cDNA or genomic libraries with selected probes is performed using standard procedures described, for example, in Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989). can do. Another method for isolating the gene encoding the PRO polypeptide is to use the PCR method [Sambrook et al., Supra; Dieffenbach et al., PCR Primer: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1995)].

下記の実施例には、ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニング技術を記載している。プローブとして選択されたオリゴヌクレオチド配列は、充分な長さで、疑陽性が最小化されるよう充分に明瞭でなければならない。オリゴヌクレオチドは、スクリーニングされるライブラリー内のＤＮＡとのハイブリッド形成時に検出可能であるように標識されていることが好ましい。標識化の方法は当該分野において良く知られており、３２Ｐ標識されたＡＴＰのような放射線標識、ビオチン化あるいは酵素標識の使用が含まれる。中程度の厳密性及び高度の厳密性を含むハイブリッド形成条件は、上掲のSambrook等に与えられている。
このようなライブラリースクリーニング法において同定された配列は、Genbank等の公共データベース又は個人の配列データベースに寄託され公衆に利用可能とされている周知の配列と比較及びアラインメントすることができる。分子の決定された領域内又は全長に渡っての(アミノ酸又はヌクレオチドレベルのいずれかでの)配列同一性は、この分野で知られた、そしてここに記載した方法を用いて決定することができる。
タンパク質コード配列を有する核酸は、初めてここで開示された推定アミノ酸配列を使用し、また必要ならば、ｃＤＮＡに逆転写されなかったｍＲＮＡの生成中間体及び先駆物質を検出する上掲のSambrook等に記述されているような従来のプライマー伸展法を使用し、選択されたｃＤＮＡ又はゲノムライブラリーをスクリーニングすることにより得られる。 The following examples describe screening techniques for cDNA libraries. The oligonucleotide sequence selected as the probe must be long enough and clear enough to minimize false positives. The oligonucleotide is preferably labeled such that it can be detected upon hybridization to DNA in the library being screened. Labeling methods are well known in the art and include the use of radiolabels such as 32P labeled ATP, biotinylation or enzyme labeling. Hybridization conditions including moderate stringency and high stringency are given by Sambrook et al., Supra.
Sequences identified in such library screening methods can be compared and aligned with well-known sequences deposited in public databases such as Genbank or personal sequence databases and made available to the public. Sequence identity (either at the amino acid or nucleotide level) within a determined region or over the entire length of the molecule can be determined using methods known in the art and described herein. .
Nucleic acids having protein coding sequences use the deduced amino acid sequences disclosed herein for the first time, and if necessary, Sambrook et al., Supra, which detects intermediates and precursors of mRNA that was not reverse transcribed into cDNA. Obtained by screening selected cDNA or genomic libraries using conventional primer extension methods as described.

２．宿主細胞の選択及び形質転換
宿主細胞を、ここに記載したＰＲＯ生産のための発現又はクローニングベクターで形質移入又は形質転換し、プロモーターを誘導し、形質転換体を選択し、又は所望の配列をコードする遺伝子を増幅するために適当に変性された常套的栄養培地で培養する。培養条件、例えば培地、温度、ｐＨ等々は、過度の実験をすることなく当業者が選ぶことができる。一般に、細胞培養の生産性を最大にするための原理、プロトコール、及び実用技術は、Mammalian Cell Biotechnology: a Practical Approach, M.Butler編 (IRL Press, 1991)及びSambrook等, 上掲に見出すことができる。
原核生物細胞形質移入及び真核生物細胞形質転換の方法、例えば、ＣａＣｌ２、ＣａＰＯ４、リポソーム媒介及びエレクトロポレーションは当業者に知られている。用いられる宿主細胞に応じて、その細胞に対して適した標準的な方法を用いて形質転換はなされる。前掲のSambrook等に記載された塩化カルシウムを用いるカルシウム処理又はエレクトロポレーションが、一般的に原核生物に対して用いられる。アグロバクテリウム・トゥメファシエンスによる感染が、Shaw等, Gene, 23:315 (1983)及び1989年6月29日公開のWO 89/05859に記載されているように、或る種の植物細胞の形質転換に用いられる。このような細胞壁のない哺乳動物の細胞に対しては、Graham及びvan der Eb, Virology, 52:456-457 (1978)のリン酸カルシウム沈降法を使用することができる。哺乳動物細胞の宿主系形質転換の一般的な態様は米国特許第4,399,216号に記載されている。酵母菌中への形質転換は、典型的には、Van Solingen等, J. Bact., 130:946 (1977)及びHsiao等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76:3829 (1979)の方法に従って実施される。しかしながら、ＤＮＡを細胞中に導入する他の方法、例えば、核マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、無傷の細胞、又はポリカチオン、例えばポリブレン、ポリオルニチン等を用いる細菌プロトプラスト融合もまた用いることもできる。哺乳動物細胞を形質転換するための種々の技術については、Keown等, Methods in Enzymology, 185:527-537 (1990)及び Mansour等, Nature, 336:348-352 (1988)を参照のこと。 2. Host Cell Selection and Transformation Host cells are transfected or transformed with the expression or cloning vectors for PRO production described herein to induce promoters, select transformants, or encode the desired sequence. In order to amplify the gene to be cultured, it is cultured in a conventional nutrient medium appropriately modified. Culture conditions such as medium, temperature, pH, etc. can be selected by those skilled in the art without undue experimentation. In general, principles, protocols, and practical techniques for maximizing cell culture productivity can be found in Mammalian Cell Biotechnology: a Practical Approach, edited by M. Butler (IRL Press, 1991) and Sambrook et al., Supra. it can.
Methods of prokaryotic cell transfection and eukaryotic cell transformation, such as CaCl2, CaPO4, liposome-mediated and electroporation are known to those skilled in the art. Depending on the host cell used, transformation is done using standard methods appropriate to that cell. Calcium treatment or electroporation with calcium chloride described in Sambrook et al., Supra, is generally used for prokaryotes. Infection with Agrobacterium tumefaciens has been reported in certain plant cells as described in Shaw et al., Gene, 23: 315 (1983) and WO 89/05859 published 29 June 1989. Used for transformation. For mammalian cells without such cell walls, the calcium phosphate precipitation method of Graham and van der Eb, Virology, 52: 456-457 (1978) can be used. General aspects of mammalian cell host system transformations are described in US Pat. No. 4,399,216. Transformation into yeast is typically performed by Van Solingen et al., J. Bact., 130: 946 (1977) and Hsiao et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76: 3829 (1979). Implemented according to the method. However, other methods of introducing DNA into cells, such as nuclear microinjection, electroporation, intact cells, or bacterial protoplast fusion using polycations such as polybrene, polyornithine, etc. can also be used. For various techniques for transforming mammalian cells, see Keown et al., Methods in Enzymology, 185: 527-537 (1990) and Mansour et al., Nature, 336: 348-352 (1988).

ここに記載のベクターにＤＮＡをクローニングあるいは発現するために適切な宿主細胞は、原核生物、酵母菌、又は高等真核生物細胞である。適切な原核生物は、限定するものではないが、真正細菌、例えばグラム陰性又はグラム陽性生物体、例えば大腸菌のような腸内細菌科を含む。種々の大腸菌株が公衆に利用可能であり、例えば、大腸菌Ｋ１２株ＭＭ２９４(ATCC31,446)；大腸菌Ｘ１７７６(ATCC31,537)；大腸菌株Ｗ３１１０(ATCC27,325)及びＫ５７７２(ATCC53,635)である。他の好ましい原核動物宿主細胞は、大腸菌、例えば、E. coli、エンテロバクター、エルビニア(Erwinia)、クレブシエラ(Klebsiella)、プロテウス(Proteus)、サルモネラ、例えば、ネズミチフス菌、セラチア、例えば、セラチアマルセサンス(Serratia marcescans) 、及び赤痢菌、並びに桿菌、例えばバシリスブチリス(B. subtilis)及びバシリリチェニフォルミス(B. licheniformis)(例えば、1989年4月12日発行のDD 266,710に記載されたバシリリチェニフォルミス４１Ｐ)、シュードモナス、例えば緑膿筋及びストレプトマイセスなどの腸内細菌科を含む。これらの例は限定ではなく例示である。株Ｗ３１１０は、組換えＤＮＡ生産発行のための共通の宿主株であるので一つの特に好ましい宿主又は親宿主である。好ましくは、宿主細胞は最小量のタンパク質分解酵素を分泌する。例えば、株Ｗ３１１０は、細胞に外来のタンパク質をコードする遺伝子における遺伝子変異をするように修飾してもよく、そのような宿主の例としては、完全な遺伝子型ｔｏｎＡを有する大腸菌Ｗ３１１０株１Ａ２；完全な遺伝子型ｔｏｎＡ ｐｔｒ３を有する大腸菌Ｗ３１１０株９Ｅ４；完全な遺伝子型ｔｏｎＡ ｐｒｔ３ ｐｈｏＡ Ｅ１５ (ａｒｇＦ-ｌａｃ)１６９ ｄｅｇＰ ｏｍｐＴ ｋａｎrを有する大腸菌Ｗ３１１０株２７Ｃ７(ATCC 55,244)；完全な遺伝子型ｔｏｎＡ ｐｔｒ３ ｐｈｏＡ Ｅ１５ (ａｌｇＦ-ｌａｃ)１６９ ｄｅｇＰ ｏｍｐＴ ｒｂｓ７ｉｌｖＧｋａｎｒを有する大腸菌Ｗ３１１０株３７Ｄ６；非カナマイシン耐性ｄｅｇＰ欠失変異を持つ３７Ｄ６株である大腸菌Ｗ３１１０株４０Ｂ４；及び1990年8月7日発行の米国特許第4,946,783号に開示された変異周辺質プロテアーゼを有する大腸菌株を含む。あるいは、クローニングのインビトロ法、例えばＰＣＲ又は他の核酸ポリメラーゼ反応が好ましい。   Suitable host cells for cloning or expressing the DNA in the vectors described herein are prokaryotic, yeast, or higher eukaryotic cells. Suitable prokaryotes include, but are not limited to, eubacteria such as Gram negative or Gram positive organisms such as Enterobacteriaceae such as E. coli. Various E. coli strains are available to the public, such as E. coli K12 strain MM294 (ATCC 31,446); E. coli X1776 (ATCC 31,537); E. coli strains W3110 (ATCC 27,325) and K5772 (ATCC 53,635). Other preferred prokaryotic host cells are E. coli, such as E. coli, Enterobacter, Erwinia, Klebsiella, Proteus, Salmonella, such as Salmonella typhimurium, Serratia, eg Serratia marcesans ( Serratia marcescans), and Shigella, and Neisseria gonorrhoeae, such as B. subtilis and B. licheniformis (e.g., Bacillicenifol as described in DD 266,710 issued April 12, 1989). Miss 41P), Pseudomonas, including Enterobacteriaceae such as Pseudomonas aeruginosa and Streptomyces. These examples are illustrative rather than limiting. Strain W3110 is one particularly preferred host or parent host because it is a common host strain for the issuance of recombinant DNA production. Preferably, the host cell secretes a minimal amount of proteolytic enzyme. For example, strain W3110 may be modified to have a genetic mutation in a gene encoding a foreign protein in the cell, examples of such hosts include E. coli W3110 strain 1A2 with the complete genotype tonA; E. coli W3110 strain 9E4 with the complete genotype tonA ptr3; E. coli W3110 strain 27C7 (ATCC 55,244) with the complete genotype tonA prt3 phoA E15 (argF-lac) 169 degP openM -lac) E. coli W3110 strain 37D6 with 169 degP ompT rbs7ilvGkanr; E. coli W3110 strain 40B4 which is 37D6 strain with non-kanamycin resistant degP deletion mutation; and U.S. Pat. E. coli strains having the mutant periplasmic protease disclosed in US Pat. No. 4,946,783 are included. Alternatively, in vitro methods of cloning such as PCR or other nucleic acid polymerase reactions are preferred.

原核生物に加えて、糸状菌又は酵母菌のような真核微生物は、ＰＲＯポリペプチドコード化ベクターのための適切なクローニング又は発現宿主である。サッカロミセス・セレヴィシアは、通常用いられる下等真核生物宿主微生物である。他に、シゾサッカロミセスプロンブ(Schizosaccharomyces prombe)(Beach及びNurse, Nature, 290: 140 [1981]; 1985年5月2日公開のEP 139,383)；クルベロミセスホスツ(Kluveromyces hosts)(米国特許第4,943,529号; Fleer等, Bio/Technology, 9: 968-975 (1991))、例えばケー・ラクチス(K. lactis)(MW98-8C, CBS683, CBS4574; Louvencourt等, J. Bacteriol. 154(2): 737-742 [1983])、ケー・フラギリス(K. fragilis)(ATCC 12,424)、ケー・ブルガリクス(K. bulgaricus)(ATCC 16,045)、ケー・ウィケラミイ(K. wickeramii)(ATCC 24,178)、ケー・ワルチイ(K. waltii)(ATCC 56,500)、ケー・ドロソフィラルム(K. drosophilarum)(ATCC 36,906; Van den Berg等, Bio/Technology, 8: 135 (1990))、ケー・テモトレランス(K. themotolerans)及びケー・マルキシアナス(K. marxianus)；ヤロウィア(yarrowia)(EP 402,226)；ピッチャパストリス(Pichia pastoris)(EP 183,070; Sheekrishna等, J. Basic Microbiol, 28: 265-278 [1988])；カンジダ；トリコデルマレーシア(reesia)(EP 244,234)；アカパンカビ(Case等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76: 5259-5263 [1979])；シュワニオマイセス(schwanniomyces)、例えばシュワニオマイセスオクシデンタリス(occidentalis)(1990年10月31日公開のEP 394,538)；及び糸状真菌、例えば、ニューロスポラ、ペニシリウム、トリポクラジウム(Tolypocladium)(1991年1月10日公開のWO 91/00357)；及びコウジ菌、例えば偽巣性コウジ菌(Ballance等, Biochem. Biophys. Res. Commun., 112: 284-289 [1983]; Tilburn等, Gene, 26: 205-221 [1983]; Yelton等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 1470-1474 [1984])及びクロカビ(Kelly及びHynes, EMBO J., 4: 475-479 [1985])が含まれる。ここで好ましいメチロトロピック(methylotropic)酵母は、これらに限られないが、ハンセヌラ(Hansenula)、カンジダ、クロエケラ(Kloeckera)、ピチア(Pichia)、サッカロミセス、トルロプシス(Torulopsis)、及びロドトルラ(Rhodotorula)からなる属から選択されるメタノールで成長可能な酵母を含む。この酵母の分類の例示である特定の種のリストは、C. Anthony, The Biochemistry of Methylotrophs, 269 (1982)に記載されている。   In addition to prokaryotes, eukaryotic microbes such as filamentous fungi or yeast are suitable cloning or expression hosts for PRO polypeptide-encoding vectors. Saccharomyces cerevisia is a commonly used lower eukaryotic host microorganism. Others include Schizosaccharomyces prombe (Beach and Nurse, Nature, 290: 140 [1981]; EP 139,383 published May 2, 1985); Kluveromyces hosts (US patent) No. 4,943,529; Fleer et al., Bio / Technology, 9: 968-975 (1991)), e.g. K. lactis (MW98-8C, CBS683, CBS4574; Louvencourt et al., J. Bacteriol. 154 (2) : 737-742 [1983]), K. fragilis (ATCC 12,424), K. bulgaricus (ATCC 16,045), K. wickeramii (ATCC 24,178), K.・ K. waltii (ATCC 56,500), K. drosophilarum (ATCC 36,906; Van den Berg et al., Bio / Technology, 8: 135 (1990)), K. themotolerans And K. marxianus; yarrowia (EP 402,226); Pichia pastoris (EP 183,070; Sheekrishna et al., J. Basic Microbiol, 28: 265-278 [1988]); Nicida; Trichodel malaysia (EP 244,234); Akapan mold (Case et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76: 5259-5263 [1979]); Schwanniomyces, eg, Schwanniomyces Occidentalis (EP 394,538 published October 31, 1990); and filamentous fungi such as Neurospora, Penicillium, Tolypocladium (WO 91/00357 published January 10, 1991) And Koji fungi, such as pseudonogenic Koji fungi (Ballance et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 112: 284-289 [1983]; Tilburn et al., Gene, 26: 205-221 [1983]; Yelton et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 1470-1474 [1984]) and black mold (Kelly and Hynes, EMBO J., 4: 475-479 [1985]). Preferred methylotropic yeasts here include, but are not limited to, Hansenula, Candida, Kloeckera, Pichia, Saccharomyces, Torulopsis, and Rhodotorula. Includes yeast that can grow on methanol selected from the genus. A list of specific species, illustrative of this yeast classification, is described in C. Anthony, The Biochemistry of Methylotrophs, 269 (1982).

グリコシル化ＰＲＯの発現に適切な宿主細胞は、多細胞生物から誘導される。無脊椎動物細胞の例としては、ショウジョウバエＳ２及びスポドスペラＳｆ９等の昆虫細胞並びに植物細胞が含まれる。有用な哺乳動物宿主株化細胞の例は、チャイニーズハムスター卵巣(ＣＨＯ)及びＣＯＳ細胞を含む。多くの特異的な例は、ＳＶ４０によって形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株 (COS-7, ATCC CRL 1651);ヒト胚腎臓株(293又は懸濁培養での増殖のためにサブクローン化された293細胞、Graham等, J. Gen Virol., 36:59 (1977));チャイニーズハムスター卵巣細胞／-ＤＨＦＲ(CHO, Urlaub及びChasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216 (1980));マウスのセルトリ細胞(TM4, Mather, Biol. Reprod., 23:243-251 (1980))ヒト肺細胞 (W138, ATCC CCL 75); ヒト肝細胞 (Hep G2, HB 8065); 及びマウス***腫瘍細胞 (MMT 060562, ATTC CCL51)を含む。適切な宿主細胞の選択は、この分野の技術常識内にある。   Suitable host cells for the expression of glycosylated PRO are derived from multicellular organisms. Examples of invertebrate cells include insect cells such as Drosophila S2 and Spodospera Sf9, and plant cells. Examples of useful mammalian host cell lines include Chinese hamster ovary (CHO) and COS cells. Many specific examples are the monkey kidney CV1 strain transformed with SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); the human embryonic kidney strain (293 or 293 subcloned for growth in suspension culture). Cell, Graham et al., J. Gen Virol., 36:59 (1977)); Chinese hamster ovary cells / -DHFR (CHO, Urlaub and Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77: 4216 (1980)) Mouse Sertoli cells (TM4, Mather, Biol. Reprod., 23: 243-251 (1980)) human lung cells (W138, ATCC CCL 75); human hepatocytes (Hep G2, HB 8065); and mouse breast tumors Contains cells (MMT 060562, ATTC CCL51). The selection of an appropriate host cell is within the common general knowledge of this field.

３．複製可能なベクターの選択及び使用
ＰＲＯをコードする核酸(例えば、ｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡ)は、クローニング(ＤＮＡの増幅)又は発現のために複製可能なベクター内に挿入される。様々なベクターが公的に入手可能である。ベクターは、例えば、プラスミド、コスミド、ウイルス粒子、又はファージの形態とすることができる。適切な核酸配列が、種々の手法によってベクターに挿入される。一般に、ＤＮＡはこの分野で周知の技術を用いて適当な制限エンドヌクレアーゼ部位に挿入される。ベクター成分としては、一般に、これらに制限されるものではないが、一又は複数のシグナル配列、複製開始点、一又は複数のマーカー遺伝子、エンハンサーエレメント、プロモーター、及び転写終結配列を含む。これらの成分の一又は複数を含む適当なベクターの作成には、当業者に知られた標準的なライゲーション技術を用いる。
ＰＲＯは直接的に組換え手法によって生産されるだけではなく、シグナル配列あるいは成熟タンパク質あるいはポリペプチドのＮ-末端に特異的切断部位を有する他のポリペプチドである異種性ポリペプチドとの融合ペプチドとしても生産される。一般に、シグナル配列はベクターの成分であるか、ベクターに挿入されるＰＲＯ-コード化ＤＮＡの一部である。シグナル配列は、例えばアルカリホスファターゼ、ペニシリナーゼ、ｌｐｐあるいは熱安定性エンテロトキシンIIリーダーの群から選択される原核生物シグナル配列であってよい。酵母の分泌に関しては、シグナル配列は、酵母インベルターゼリーダー、α因子リーダー(酵母菌属(Saccharomyces)及びクルイベロマイシス(Kluyveromyces)α因子リーダーを含み、後者は米国特許第5,010,182号に記載されている)、又は酸ホスフォターゼリーダー、白体(C.albicans)グルコアミラーゼリーダー(1990年4月4日公開のEP362179)、又は1990年11月15日に公開されたWO 90/13646に記載されているシグナルであり得る。哺乳動物細胞の発現においては、哺乳動物シグナル配列は、同一あるいは関連ある種の分泌ポリペプチド由来のシグナル配列並びにウイルス分泌リーダーのようなタンパク質の直接分泌に使用してもよい。 3. Selection and use of replicable vectors Nucleic acids encoding PRO (eg, cDNA or genomic DNA) are inserted into replicable vectors for cloning (amplification of DNA) or expression. Various vectors are publicly available. The vector can be, for example, in the form of a plasmid, cosmid, virus particle, or phage. The appropriate nucleic acid sequence is inserted into the vector by a variety of techniques. In general, DNA is inserted into an appropriate restriction endonuclease site using techniques well known in the art. Vector components generally include, but are not limited to, one or more signal sequences, an origin of replication, one or more marker genes, an enhancer element, a promoter, and a transcription termination sequence. Standard ligation techniques known to those skilled in the art are used to generate suitable vectors containing one or more of these components.
PRO is not only produced directly by recombinant techniques, but also as a fusion peptide with a heterologous polypeptide that is a signal sequence or a mature protein or other polypeptide having a specific cleavage site at the N-terminus of the polypeptide. Is also produced. In general, the signal sequence is a component of the vector, or a part of the PRO-encoding DNA that is inserted into the vector. The signal sequence may be, for example, a prokaryotic signal sequence selected from the group of alkaline phosphatase, penicillinase, lpp or a thermostable enterotoxin II leader. For yeast secretion, signal sequences include yeast invertase leader, alpha factor leader (including Saccharomyces and Kluyveromyces alpha factor leaders, the latter described in US Pat. No. 5,010,182). Or an acid phosphatase leader, a C. albicans glucoamylase leader (EP362179 published 4 April 1990), or WO 90/13646 published 15 November 1990 It can be a signal. In mammalian cell expression, mammalian signal sequences may be used for direct secretion of proteins such as signal sequences from the same or related species of secreted polypeptides as well as viral secretory leaders.

発現及びクローニングベクターは共に一又は複数の選択された宿主細胞においてベクターの複製を可能にする核酸配列を含む。そのような配列は多くの細菌、酵母及びウイルスに対してよく知られている。プラスミドｐＢＲ３２２に由来する複製開始点は大部分のグラム陰性細菌に好適であり、２μプラスミド開始点は酵母に適しており、様々なウイルス開始点(ＳＶ４０、ポリオーマ、アデノウイルス、ＶＳＶ又はＢＰＶ)は哺乳動物細胞におけるクローニングベクターに有用である。
発現及びクローニングベクターは、典型的には、選択性マーカーとも称される選択遺伝子を含む。典型的な選択遺伝子は、(a)アンピシリン、ネオマイシン、メトトレキセートあるいはテトラサイクリンのような抗生物質あるいは他の毒素に耐性を与え、(b)栄養要求性欠陥を補い、又は(c)例えばバシリに対する遺伝子コードＤ-アラニンラセマーゼのような、複合培地から得られない重要な栄養素を供給するタンパク質をコードする。
哺乳動物細胞に適切な選べるマーカーの例は、ＤＨＦＲあるいはチミジンキナーゼのように、ＰＲＯ-コード化核酸を取り込むことのできる細胞成分を同定することのできるものである。野生型ＤＨＦＲを用いた場合の好適な宿主細胞は、Urlaub 等により, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216 (1980)に記載されているようにして調製され増殖されたＤＨＦＲ活性に欠陥のあるＣＨＯ株化細胞である。酵母菌中での使用に好適な選択遺伝子は酵母プラスミドＹＲｐ７に存在するｔｒｐ１遺伝子である［Stinchcomb等, Nature, 282：39(1979)；Kingman等, Gene, 7：141(1979)；Tschemper等, Gene, 10：157(1980)］。ｔｒｐ１遺伝子は、例えば、ＡＴＣＣ番号４４０７６あるいはＰＥＰ４-１のようなトリプトファン内で成長する能力を欠く酵母菌の突然変異株に対する選択マーカーを提供する［Jones, Genetics, 85:12 (1977)］。 Both expression and cloning vectors contain a nucleic acid sequence that enables the vector to replicate in one or more selected host cells. Such sequences are well known for many bacteria, yeasts and viruses. The origin of replication derived from plasmid pBR322 is suitable for most gram-negative bacteria, the 2μ plasmid origin is suitable for yeast, and the various viral origins (SV40, polyoma, adenovirus, VSV or BPV) are suckling. Useful for cloning vectors in animal cells.
Expression and cloning vectors typically contain a selection gene, also termed a selectable marker. Typical selection genes are (a) conferring resistance to antibiotics or other toxins such as ampicillin, neomycin, methotrexate or tetracycline, (b) compensate for auxotrophic defects, or (c) the genetic code for eg Basili It encodes a protein that supplies important nutrients not available from complex media, such as D-alanine racemase.
Examples of markers that can be appropriately selected for mammalian cells are those that can identify cellular components that can take up a PRO-encoding nucleic acid, such as DHFR or thymidine kinase. Suitable host cells when using wild-type DHFR are DHFR activity prepared and grown as described by Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77: 4216 (1980). It is a defective CHO cell line. A suitable selection gene for use in yeast is the trp1 gene present in the yeast plasmid YRp7 [Stinchcomb et al., Nature, 282: 39 (1979); Kingman et al., Gene, 7: 141 (1979); Tschemper et al., Gene, 10: 157 (1980)]. The trp1 gene provides a selectable marker for mutant strains of yeast lacking the ability to grow in tryptophan, such as, for example, ATCC No. 44076 or PEP4-1 [Jones, Genetics, 85:12 (1977)].

発現及びクローニングベクターは、通常、ＰＲＯ-コード化核酸配列に作用可能に結合し、ｍＲＮＡ合成を制御するプロモーターを含む。種々の可能な宿主細胞により認識されるプロモーターが知られている。原核生物宿主での使用に好適なプロモーターはβ-ラクタマーゼ及びラクトースプロモーター系［Cahng等, Nature, 275:615 (1978)；Goeddel等, Nature, 281:544 (1979)］、アルカリホスファターゼ、トリプトファン(trp)プロモーター系［Goeddel, Nucleic Acids Res., 8:4057 (1980); EP 36,776］、及びハイブリッドプロモーター、例えばｔａｃプロモーター［deBoer 等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80:21-25 (1983)］を含む。細菌系で使用するプロモータもまたＰＲＯをコードするＤＮＡと作用可能に結合したシャイン・ダルガーノ(S.D.)配列を有する。
酵母宿主と共に用いて好適なプロモーター配列の例としては、３-ホスホグリセラートキナーゼ［Hitzeman 等, J. Biol. Chem., 255:2073 (1980)］又は他の糖分解酵素［Hess 等, J. Adv. Enzyme Reg., 7:149 (1968)；Holland, Biochemistry, 17：4900(1978)］、例えばエノラーゼ、グリセルアルデヒド-３-リン酸デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース-６-リン酸イソメラーゼ、３-ホスホグリセレートムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオセリン酸イソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼ、及びグルコキナーゼが含まれる。
他の酵母プロモーターとしては、成長条件によって転写が制御される付加的効果を有する誘発的プロモーターであり、アルコールデヒドロゲナーゼ２、イソチトクロムＣ、酸ホスファターゼ、窒素代謝と関連する分解性酵素、メタロチオネイン、グリセルアルデヒド-３-リン酸デヒドロゲナーゼ、及びマルトース及びガラクトースの利用を支配する酵素のプロモーター領域がある。酵母菌での発現に好適に用いられるベクターとプロモータはEP 73,657に更に記載されている。
哺乳動物の宿主細胞におけるベクターからのＰＲＯ転写は、例えば、ポリオーマウィルス、伝染性上皮腫ウィルス(1989年7月5日公開のUK 2,211,504)、アデノウィルス(例えばアデノウィルス２)、ウシ乳頭腫ウィルス、トリ肉腫ウィルス、サイトメガロウィルス、レトロウィルス、Ｂ型肝炎ウィルス及びサルウィルス４０(SV40)のようなウィルスのゲノムから得られるプロモーター、異種性哺乳動物プロモーター、例えばアクチンプロモーター又は免疫グロブリンプロモーター、及び熱衝撃プロモーターから得られるプロモーターによって、このようなプロモーターが宿主細胞系に適合し得る限り制御される。 Expression and cloning vectors usually contain a promoter that is operably linked to the PRO-encoding nucleic acid sequence and controls mRNA synthesis. Promoters recognized by a variety of possible host cells are known. Suitable promoters for use in prokaryotic hosts are the β-lactamase and lactose promoter systems [Cahng et al., Nature, 275: 615 (1978); Goeddel et al., Nature, 281: 544 (1979)], alkaline phosphatase, tryptophan (trp ) Promoter system [Goeddel, Nucleic Acids Res., 8: 4057 (1980); EP 36,776], and hybrid promoters such as the tac promoter [deBoer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80: 21-25 (1983). )]including. Promoters used in bacterial systems also have a Shine Dalgarno (SD) sequence operably linked to the DNA encoding PRO.
Examples of suitable promoter sequences for use with yeast hosts include 3-phosphoglycerate kinase [Hitzeman et al., J. Biol. Chem., 255: 2073 (1980)] or other glycolytic enzymes [Hess et al., J. Adv. Enzyme Reg., 7: 149 (1968); Holland, Biochemistry, 17: 4900 (1978)], eg enolase, glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, hexokinase, pyruvate decarboxylase, phosphofructokinase, Glucose-6-phosphate isomerase, 3-phosphoglycerate mutase, pyruvate kinase, trioselate isomerase, phosphoglucose isomerase, and glucokinase are included.
Other yeast promoters are inducible promoters that have the additional effect that transcription is controlled by growth conditions, such as alcohol dehydrogenase 2, isocytochrome C, acid phosphatase, degrading enzymes related to nitrogen metabolism, metallothionein, glycerin There are promoter regions of aldehyde-3-phosphate dehydrogenase and the enzymes that govern the utilization of maltose and galactose. Vectors and promoters suitably used for expression in yeast are further described in EP 73,657.
PRO transcription from vectors in mammalian host cells is, for example, polyomavirus, infectious epithelioma virus (UK 2,211,504 published July 5, 1989), adenovirus (eg adenovirus 2), bovine papilloma virus, avian Promoters derived from the genomes of viruses such as sarcoma virus, cytomegalovirus, retrovirus, hepatitis B virus and simian virus 40 (SV40), heterologous mammalian promoters such as actin promoter or immunoglobulin promoter, and heat shock promoter Is controlled as long as such a promoter is compatible with the host cell system.

より高等の真核生物による所望のＰＲＯをコードするＤＮＡの転写は、ベクター中にエンハンサー配列を挿入することによって増強され得る。エンハンサーは、通常は約１０から３００塩基対で、プロモーターに作用してその転写を増強するＤＮＡのシス作動要素である。哺乳動物遺伝子由来の多くのエンハンサー配列が現在知られている(グロビン、エラスターゼ、アルブミン、α-フェトプロテイン及びインスリン)。しかしながら、典型的には、真核細胞ウィルス由来のエンハンサーが用いられるであろう。例としては、複製起点の後期側のＳＶ４０エンハンサー(１００-２７０塩基対)、サイトメガロウィルス初期プロモーターエンハンサー、複製起点の後期側のポリオーマエンハンサー及びアデノウィルスエンハンサーが含まれる。エンハンサーは、ＰＲＯコード配列の５’又は３’位でベクター中にスプライシングされ得るが、好ましくはプロモーターから５’位に位置している。
また真核生物宿主細胞(酵母、真菌、昆虫、植物、動物、ヒト、又は他の多細胞生物由来の有核細胞)に用いられる発現ベクターは、転写の終結及びｍＲＮＡの安定化に必要な配列も含む。このような配列は、真核生物又はウィルスのＤＮＡ又はｃＤＮＡの通常は５’、時には３’の非翻訳領域から取得できる。これらの領域は、ＰＲＯをコードするｍＲＮＡの非翻訳部分にポリアデニル化断片として転写されるヌクレオチドセグメントを含む。
組換え脊椎動物細胞培養でのＰＲＯの合成に適応化するのに適切な他の方法、ベクター及び宿主細胞は、Gething等, Nature, 293:620-625 (1981); Mantei等, Nature, 281:40-46 (1979); EP 117,060; 及びEP 117,058に記載されている。 Transcription of the DNA encoding the desired PRO by higher eukaryotes can be enhanced by inserting an enhancer sequence into the vector. Enhancers are cis-acting elements of DNA, usually about 10 to 300 base pairs, that act on a promoter to enhance its transcription. Many enhancer sequences are now known from mammalian genes (globin, elastase, albumin, α-fetoprotein and insulin). Typically, however, one will use an enhancer from a eukaryotic cell virus. Examples include the late SV40 enhancer (100-270 base pairs) of the origin of replication, the cytomegalovirus early promoter enhancer, the polyoma enhancer and the adenovirus enhancer of the late origin of replication. Enhancers can be spliced into the vector at positions 5 'or 3' of the PRO coding sequence, but are preferably located 5 'from the promoter.
Expression vectors used for eukaryotic host cells (nucleated cells derived from yeast, fungi, insects, plants, animals, humans, or other multicellular organisms) are sequences required for termination of transcription and stabilization of mRNA. Including. Such sequences can be obtained from the normally 5 ', sometimes 3' untranslated region of eukaryotic or viral DNA or cDNA. These regions contain nucleotide segments that are transcribed as polyadenylated fragments in the untranslated portion of the mRNA encoding PRO.
Other methods, vectors and host cells suitable for adapting to the synthesis of PRO in recombinant vertebrate cell cultures are Gething et al., Nature, 293: 620-625 (1981); Mantei et al., Nature, 281: 40-46 (1979); EP 117,060; and EP 117,058.

４．遺伝子増幅／発現の検出
遺伝子の増幅及び／又は発現は、ここで提供された配列に基づき、適切に標識されたプローブを用い、例えば、従来よりのサザンブロット法、ｍＲＮＡの転写を定量化するノーザンブロット法［Thomas, Proc. Natl. Acad. Sci. USA,77:5201-5205 (1980)］、ドットブロット法(ＤＮＡ分析)、又はインサイツハイブリッド形成法によって、直接的に試料中で測定することができる。あるいは、ＤＮＡ二本鎖、ＲＮＡ二本鎖及びＤＮＡ-ＲＮＡハイブリッド二本鎖又はＤＮＡ-タンパク二本鎖を含む、特異的二本鎖を認識することができる抗体を用いることもできる。次いで、抗体を標識し、アッセイを実施することができ、ここで二本鎖は表面に結合しており、その結果二本鎖の表面での形成の時点でその二本鎖に結合した抗体の存在を検出することができる。
あるいは、遺伝子の発現は、遺伝子産物の発現を直接的に定量する免疫学的な方法、例えば細胞又は組織切片の免疫組織化学的染色及び細胞培養又は体液のアッセイによって、測定することもできる。試料液の免疫組織化学的染色及び／又はアッセイに有用な抗体は、モノクローナルでもポリクローナルでもよく、任意の哺乳動物で調製することができる。簡便には、抗体は、天然配列ＰＲＯポリペプチドに対して、又はここで提供されるＤＮＡ配列をベースとした合成ペプチドに対して、又はＰＲＯ ＤＮＡに融合し特異的抗体エピトープをコードする外因性配列に対して調製され得る。 4). Gene amplification / expression detection Gene amplification and / or expression is based on the sequences provided herein, using appropriately labeled probes, eg, conventional Southern blotting, Northern to quantify mRNA transcription It can be measured directly in a sample by blotting [Thomas, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77: 5201-5205 (1980)], dot blotting (DNA analysis), or in situ hybridization. it can. Alternatively, antibodies capable of recognizing specific double strands, including DNA double strands, RNA duplexes and DNA-RNA hybrid duplexes or DNA-protein duplexes, can also be used. The antibody can then be labeled and an assay can be performed, where the duplex is bound to the surface, so that the antibody bound to the duplex at the time of formation on the surface of the duplex is bound. The presence can be detected.
Alternatively, gene expression can be measured by immunological methods that directly quantify gene product expression, such as immunohistochemical staining of cells or tissue sections and cell culture or body fluid assays. Antibodies useful for immunohistochemical staining and / or assay of sample fluids can be monoclonal or polyclonal and can be prepared in any mammal. Conveniently, the antibody is directed against a native sequence PRO polypeptide or against a synthetic peptide based on the DNA sequence provided herein, or an exogenous sequence fused to PRO DNA and encoding a specific antibody epitope. Can be prepared.

５．ポリペプチドの精製
ＰＲＯの形態は、培地又は宿主細胞の溶菌液から回収することができる。膜結合性であるならば、適切な洗浄液(例えばトリトン-Ｘ１００)又は酵素的切断を用いて膜から引き離すことができる。ＰＲＯの発現に用いられる細胞は、凍結融解サイクル、超音波処理、機械的破壊、又は細胞溶解剤などの種々の化学的又は物理的手段によって破壊することができる。
ＰＲＯを、組換え細胞タンパク又はポリペプチドから精製することが望ましい。適切な精製手順の例である次の手順により精製される：すなわち、イオン交換カラムでの分画；エタノール沈殿；逆相ＨＰＬＣ；シリカ又はカチオン交換樹脂、例えばＤＥＡＥによるクロマトグラフィー；クロマトフォーカシング；ＳＤＳ-ＰＡＧＥ；硫酸アンモニウム沈殿；例えばセファデックスＧ-７５を用いるゲル濾過；ＩｇＧのような汚染物を除くプロテインＡセファロースカラム；及びＰＲＯのエピトープタグ形態を結合させる金属キレート化カラムである。この分野で知られ、例えば、Deutcher, Methodes in Enzymology, 182 (1990)；Scopes, Protein Purification: Principles and Practice, Springer-Verlag, New York (1982)に記載された多くのタンパク質精製方法を用いることができる。選ばれる精製過程は、例えば、用いられる生産方法及び特に生産される特定のＰＲＯの性質に依存する。 5. Purification of polypeptides PRO forms can be recovered from culture media or lysates of host cells. If membrane-bound, it can be detached from the membrane using an appropriate wash solution (eg Triton-X100) or enzymatic cleavage. Cells used for PRO expression can be disrupted by various chemical or physical means such as freeze-thaw cycles, sonication, mechanical disruption, or cytolytic agents.
It may be desirable to purify PRO from recombinant cell proteins or polypeptides. Purified by the following procedure, which is an example of a suitable purification procedure: fractionation on an ion exchange column; ethanol precipitation; reverse phase HPLC; chromatography on silica or a cation exchange resin such as DEAE; chromatofocusing; PAGE; ammonium sulfate precipitation; gel filtration using, for example, Sephadex G-75; protein A sepharose column to remove contaminants such as IgG; and metal chelation column to bind the epitope tag form of PRO. It is possible to use many protein purification methods known in the art and described, for example, in Deutcher, Methods in Enzymology, 182 (1990); Scopes, Protein Purification: Principles and Practice, Springer-Verlag, New York (1982). it can. The purification process chosen depends, for example, on the production method used and in particular on the nature of the particular PRO produced.

Ｅ．ＰＲＯの用途
ＰＲＯをコードするヌクレオチド配列(又はそれらの補体)は、ハイブリッド形成プローブとしての使用を含む分子生物学の分野において、染色体及び遺伝子マッピングにおいて、及びアンチセンスＲＮＡ及びＤＮＡの生成において種々の用途を有している。また、ＰＲＯ核酸も、ここに記載される組換え技術によるＰＲＯポリペプチドの調製に有用であろう。
全長天然配列ＰＲＯ遺伝子又はその一部は、全長ＰＲＯｃＤＮＡの単離又はここに開示したＰＲＯ配列に対して所望の配列同一性を持つ更に他の遺伝子(例えば、ＰＲＯの天然に生じる変異体又は他の種からのＰＲＯをコードするもの)の単離のためのｃＤＮＡライブラリー用のハイブリッド形成プローブとして使用できる。場合によっては、プローブの長さは約２０〜約５０塩基である。ハイブリッド形成プローブは、少なくとも部分的に全長天然ヌクレオチド配列の新規な領域から誘導してもよく、それらの領域は、過度の実験をすることなく、天然配列ＰＲＯのプロモーター、エンハンサー成分及びイントロンを含むゲノム配列から誘導され得る。例えば、スクリーニング法は、ＰＲＯ遺伝子のコード化領域を周知のＤＮＡ配列を用いて単離して約４０塩基の選択されたプローブを合成することを含む。ハイブリッド形成プローブは、３２Ｐ又は３５Ｓ等の放射性ヌクレオチド、又はアビディン／ビオチン結合系を介してプローブに結合したアルカリホスファターゼ等の酵素標識を含む種々の標識で標識されうる。本発明のＰＲＯ遺伝子に相補的な配列を有する標識されたプローブは、ヒトｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ又はｍＲＮＡのライブラリーをスクリーニングし、そのライブラリーの何れのメンバーがプローブにハイブッド形成するかを決定するのに使用できる。ハイブリッド形成技術は、以下の実施例において更に詳細に記載する。 E. PRO Applications Nucleotide sequences encoding PRO (or their complements) are widely used in the field of molecular biology, including use as hybridization probes, in chromosome and gene mapping, and in the production of antisense RNA and DNA. Has a use. PRO nucleic acids may also be useful for the preparation of PRO polypeptides by the recombinant techniques described herein.
The full-length native sequence PRO gene or a portion thereof may be isolated from the full-length PRO cDNA or other genes having the desired sequence identity to the PRO sequences disclosed herein (eg, naturally occurring variants of PRO or other It can be used as a hybridization probe for a cDNA library for isolation of a PRO encoding from a species. In some cases, the length of the probe is from about 20 to about 50 bases. Hybridization probes may be derived at least in part from novel regions of the full-length native nucleotide sequence, which regions include the promoter, enhancer component and intron of the native sequence PRO without undue experimentation. It can be derived from a sequence. For example, the screening method involves synthesizing a selected probe of about 40 bases by isolating the coding region of the PRO gene using a known DNA sequence. Hybridization probes can be labeled with a variety of labels including radioactive nucleotides such as 32P or 35S, or enzyme labels such as alkaline phosphatase attached to the probe via an avidin / biotin binding system. A labeled probe having a sequence complementary to the PRO gene of the present invention screens a library of human cDNA, genomic DNA or mRNA and determines which members of the library hybridize to the probe. Can be used for Hybridization techniques are described in further detail in the examples below.

本出願で開示する任意のＥＳＴ配列はプローブとして、ここに記載した方法で用いることができる。
ＰＲＯ核酸の他の有用な断片は、標的ＰＲＯｍＲＮＡ(センス)又はＰＲＯ ＤＮＡ(アンチセンス)配列に結合できる一本鎖核酸配列(ＲＮＡ又はＤＮＡのいずれか)を含むアンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチドを含む、アンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチドは、本発明によると、ＰＲＯ ＤＮＡのコード化領域の断片を含む。このような断片は、一般的には少なくとも約１４ヌクレオチド、好ましくは約１４から３０ヌクレオチドを含む。与えられたタンパク質をコードするｃＤＮＡ配列に基づく、アンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチドを誘導する能力は、例えば、Stein及びCohen(CancerRes. 48: 2659: 1988)及び van der Krol等(BioTechniques 6: 958, 1988)に記載されている。
アンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチドの標的核酸配列への結合は二重鎖の形成をもたらし、それは、二重鎖の分解の促進、転写又は翻訳の期外停止を含む幾つかの方法の一つ、又は他の方法により、標的配列の転写又は翻訳を阻止する。よって、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＰＲＯタンパク質の発現を阻止するのに用いられる。アンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチドは、修飾糖-ホスホジエステル骨格(又は他の糖結合、WO 91/06629に記載のもの等)を有するオリゴヌクレオチドをさらに含み、そのような糖結合は内因性ヌクレアーゼ耐性である。そのような耐性糖結合を持つオリゴヌクレオチドは、インビボで安定であるが(即ち、酵素分解に耐えうるが)、標的ヌクレオチド配列に結合できる配列特異性は保持している。 Any EST sequence disclosed in this application can be used as a probe in the methods described herein.
Other useful fragments of PRO nucleic acids include antisense or sense oligonucleotides comprising single stranded nucleic acid sequences (either RNA or DNA) that can bind to target PRO mRNA (sense) or PRO DNA (antisense) sequences. An antisense or sense oligonucleotide, according to the present invention, comprises a fragment of the coding region of PRO DNA. Such fragments generally comprise at least about 14 nucleotides, preferably from about 14 to 30 nucleotides. The ability to derive antisense or sense oligonucleotides based on a cDNA sequence encoding a given protein is described, for example, by Stein and Cohen (Cancer Res. 48: 2659: 1988) and van der Krol et al. (BioTechniques 6: 958, 1988). )It is described in.
Binding of the antisense or sense oligonucleotide to the target nucleic acid sequence results in the formation of a duplex, which can be one of several methods including promoting duplex degradation, premature termination of transcription or translation, or Other methods block transcription or translation of the target sequence. Thus, antisense oligonucleotides are used to block the expression of PRO proteins. Antisense or sense oligonucleotides further include oligonucleotides having modified sugar-phosphodiester backbones (or other sugar linkages, such as those described in WO 91/06629), where such sugar linkages are resistant to endogenous nucleases. is there. Oligonucleotides with such resistant sugar linkages are stable in vivo (ie, capable of withstanding enzymatic degradation), but retain sequence specificity that allows them to bind to target nucleotide sequences.

センス又はアンチセンスオリゴヌクレオチドの他の例は、WO 90/10048に記載されているもののような、有機部分、及びオリゴヌクレオチドの標的核酸配列への親和性を向上させる他の部分、例えばポリ-(Ｌ-リジン)に共有結合したオリゴヌクレオチドを含む。さらにまた、エリプチシン等の挿入剤、アルキル化剤又は金属作体をセンス又はアンチセンスオリゴヌクレオチドに結合させ、アンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチドの標的ヌクレオチド配列への結合特異性を改変してもよい。
アンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチドは、例えば、ＣａＰＯ４-媒介ＤＮＡ形質移入、エレクトロポレーションを含む任意の遺伝子転換方法により、又はエプスタイン-バーウイルスなどの遺伝子転換ベクターを用いることにより、標的核酸配列を含む細胞に導入される。好ましい方法では、アンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチドは、適切なレトロウイルスベクターに挿入される。標的核酸配列を含む細胞は、インビボ又はエキソビボで組換えレトロウイルスベクターに接触させる。好適なレトロウイルスベクターは、これらに限られないが、マウスレトロウイルスＭ-ＭｕＬＶから誘導されるもの、Ｎ２(Ｍ-ＭｕＬＶから誘導されたレトロウイルス)、又はＤＣＴ５Ａ、ＤＣＴ５Ｂ及びＤＣＴ５Ｃと命名されたダブルコピーベクター(WO 90/13641参照)を含む。
また、センス又はアンチセンスオリゴヌクレオチドは、WO 91/04753に記載されているように、リガンド結合分子との複合体の形成により標的ヌクレオチド配列を含む細胞に導入してもよい。適切なリガンド結合分子は、これらに限られないが、細胞表面レセプター、成長因子、他のサイトカイン、又は細胞表面レセプターに結合する他のリガンドを含む。好ましくは、リガンド結合分子の複合体形成は、リガンド結合分子がその対応する分子又はレセプターに結合する、あるいはセンス又はアンチセンスオリゴヌクレオチド又はその複合体の細胞への侵入を阻止する能力を実質的に阻害しない。
あるいは、センス又はアンチセンスオリゴヌクレオチドは、WO 90/10448に記載されたように、オリゴヌクレオチド-脂質複合体の形成により標的核酸配列を含む細胞に導入してもよい。センス又はアンチセンスオリゴヌクレオチド-脂質複合体は、好ましくは内因性リパーゼにより細胞内で分解される。 Other examples of sense or antisense oligonucleotides include organic moieties, such as those described in WO 90/10048, and other moieties that improve the affinity of the oligonucleotide for the target nucleic acid sequence, such as poly- ( L-lysine). Furthermore, an intercalating agent such as ellipticine, an alkylating agent or a metal product may be bound to the sense or antisense oligonucleotide to modify the binding specificity of the antisense or sense oligonucleotide to the target nucleotide sequence.
An antisense or sense oligonucleotide is a cell containing a target nucleic acid sequence, for example, by any gene transformation method including CaPO4-mediated DNA transfection, electroporation, or by using a gene transformation vector such as Epstein-Barr virus. To be introduced. In a preferred method, the antisense or sense oligonucleotide is inserted into a suitable retroviral vector. A cell containing the target nucleic acid sequence is contacted with the recombinant retroviral vector in vivo or ex vivo. Suitable retroviral vectors include, but are not limited to, those derived from the murine retrovirus M-MuLV, N2 (retrovirus derived from M-MuLV), or double named DCT5A, DCT5B and DCT5C Contains a copy vector (see WO 90/13641).
Sense or antisense oligonucleotides may also be introduced into cells containing the target nucleotide sequence by formation of a complex with a ligand binding molecule, as described in WO 91/04753. Suitable ligand binding molecules include, but are not limited to, cell surface receptors, growth factors, other cytokines, or other ligands that bind to cell surface receptors. Preferably, complex formation of the ligand binding molecule substantially reduces the ability of the ligand binding molecule to bind to its corresponding molecule or receptor or to prevent entry of a sense or antisense oligonucleotide or complex thereof into the cell. Does not interfere.
Alternatively, sense or antisense oligonucleotides may be introduced into cells containing the target nucleic acid sequence by formation of oligonucleotide-lipid complexes, as described in WO 90/10448. The sense or antisense oligonucleotide-lipid complex is preferably degraded intracellularly by endogenous lipase.

アンチセンス又はセンスＲＮＡ又はＤＮＡ分子は、一般的に少なくとも約５塩基長、約１０塩基長、約１５塩基長、約２０塩基長、約２５塩基長、約３０塩基長、約３５塩基長、約４０塩基長、約４５塩基長、約５０塩基長、約５５塩基長、約６０塩基長、約６５塩基長、約７０塩基長、約７５塩基長、約８０塩基長、約８５塩基長、約９０塩基長、約９５塩基長、約１００塩基長、又はそれ以上である。
また、プローブは、ＰＣＲ技術に用いて、密接に関連したＰＲＯコード配列の同定のための配列のプールを作成することができる。
また、ＰＲＯをコードするヌクレオチド配列は、そのＰＲＯをコードする遺伝子のマッピングのため、及び遺伝子疾患を持つ個体の遺伝子分析のためのハイブリッド形成プローブの作成にも用いることができる。ここに提供されるヌクレオチド配列は、インサイツハイブリッド形成、既知の染色体マーカーに対する結合分析、及びライブラリーでのハイブリッド形成スクリーニング等の周知の技術を用いて、染色体及び染色体の特定領域にマッピングすることができる。
ＰＲＯのコード配列が他のタンパク質に結合するタンパク質をコードする場合(例えば、ＰＲＯがレセプターである場合)、ＰＲＯは、結合性相互作用に係る他のタンパク質又は分子を同定するアッセイに用いることができる。このような方法により、レセプター／リガンド結合性相互作用のインヒビターを同定することができる。このような結合性相互作用に含まれるタンパク質も、ペプチド又は小分子阻害剤又は結合性相互作用のアゴニストのスクリーニングに用いることができる。また、レセプターＰＲＯは関連するリガンドの単離にも使用できる。スクリーニングアッセイは、天然ＰＲＯ又はＰＲＯのレセプターの生物学的活性に似たリード化合物の発見のために設計される。このようなスクリーニングアッセイは、化学的ライブラリーの高スループットスクリーニングにも用いられ、小分子候補薬剤の同定に特に適したものとする。考慮される小分子は、合成有機又は無機化合物を含む。アッセイは、この分野で良く知られ特徴付けられているタンパク質-タンパク質結合アッセイ、生物学的スクリーニングアッセイ、免疫検定及び細胞ベースのアッセイを含む種々の型式で実施される。 Antisense or sense RNA or DNA molecules generally have a length of at least about 5 bases, about 10 bases, about 15 bases, about 20 bases, about 25 bases, about 30 bases, about 35 bases, about 40 base length, about 45 base length, about 50 base length, about 55 base length, about 60 base length, about 65 base length, about 70 base length, about 75 base length, about 80 base length, about 85 base length, about It is 90 bases long, about 95 bases long, about 100 bases long, or more.
Probes can also be used in PCR techniques to create a pool of sequences for the identification of closely related PRO coding sequences.
The nucleotide sequence encoding PRO can also be used to create hybridization probes for mapping the gene encoding the PRO and for gene analysis of individuals with genetic disorders. The nucleotide sequences provided herein can be mapped to specific regions of chromosomes and chromosomes using well-known techniques such as in situ hybridization, binding analysis to known chromosomal markers, and hybridization screening in libraries. .
When a PRO coding sequence encodes a protein that binds to another protein (eg, when PRO is a receptor), PRO can be used in an assay to identify other proteins or molecules involved in binding interactions. . By such methods, inhibitors of receptor / ligand binding interactions can be identified. Proteins involved in such binding interactions can also be used to screen for peptides or small molecule inhibitors or agonists of binding interactions. Receptor PRO can also be used to isolate related ligands. Screening assays are designed for the discovery of lead compounds that resemble the biological activity of native PRO or its receptor. Such screening assays are also used for high-throughput screening of chemical libraries, making them particularly suitable for the identification of small molecule candidate drugs. Small molecules considered include synthetic organic or inorganic compounds. The assays are performed in a variety of formats including protein-protein binding assays, biological screening assays, immunoassays and cell-based assays that are well known and characterized in the art.

また、ＰＲＯ又はその任意の修飾型をコードする核酸は、トランスジェニック動物又は「ノックアウト」動物を産生するのにも使用でき、これらは治療的に有用な試薬の開発やスクリーニングに有用である。トランスジェニック動物(例えばマウス又はラット)とは、出生前、例えば胚段階で、その動物又はその動物の祖先に導入された導入遺伝子を含む細胞を有する動物である。導入遺伝子とは、トランスジェニック動物が発生する細胞のゲノムに組み込まれたＤＮＡである。一実施形態では、ＰＲＯをコードするｃＤＮＡは、確立された技術によりＰＲＯをコードするゲノムＤＮＡをクローン化するために使用することができ、ゲノム配列を、ＰＲＯをコードするＤＮＡを発現する細胞を有するトランスジェニック動物を産生するために使用することができる。トランスジェニック動物、特にマウス又はラット等の特定の動物を産生する方法は当該分野において常套的になっており、例えば米国特許第4,736,866号や第4,870,009号に記述されている。典型的には、特定の細胞を組織特異的エンハンサーでのＰＲＯ導入遺伝子の導入の標的にする。胚段階で動物の生殖系列に導入されたＰＲＯコード化導入遺伝子のコピーを含むトランスジェニック動物はＰＲＯをコードするＤＮＡの増大した発現の影響を調べるために使用できる。このような動物は、例えばその過剰発現を伴う病理学的状態に対して保護をもたらすと思われる試薬のテスター動物として使用できる。本発明のこの態様においては、動物を試薬で治療し、導入遺伝子を有する未治療の動物に比べ病理学的状態の発症率が低ければ、病理学的状態に対する治療的処置の可能性が示される。
あるいは、ＰＲＯの非ヒト相同体は、動物の胚性幹細胞に導入されたＰＲＯをコードする変更ゲノムＤＮＡと、ＰＲＯをコードする内在性遺伝子との間の相同的組換えによって、ＰＲＯをコードする欠陥又は変更遺伝子を有するＰＲＯ「ノックアウト」動物を作成するために使用できる。例えば、ＰＲＯをコードするｃＤＮＡは、確立された技術に従い、ＰＲＯをコードするゲノムＤＮＡのクローニングに使用できる。ＰＲＯをコードするゲノムＤＮＡの一部を欠失したり、組み込みを監視するために使用する選択可能なマーカーをコードする遺伝子等の他の遺伝子で置換することができる。典型的には、ベクターは無変化のフランキングＤＮＡ(５’と３’末端の両方)を数キロベース含む［例えば、相同的組換えベクターについてはThomas及びCapecchi, Cell, 51:503(1987)を参照のこと］。ベクターは胚性幹細胞に(例えばエレクトロポレーションによって)導入し、導入されたＤＮＡが内在性ＤＮＡと相同的に組換えられた細胞が選択される［例えば、Li等, Cell, 69:915(1992)参照］。選択された細胞は次に動物(例えばマウス又はラット)の胚盤胞内に注入されて集合キメラを形成する［例えば、Bradley, Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A Practical Approach, E. J. Robertson, ed. (IRL, Oxford, 1987), pp. 113-152参照］。その後、キメラ性胚を適切な偽妊娠の雌性乳母に移植し、期間をおいて「ノックアウト」動物をつくり出す。胚細胞に相同的に組換えられたＤＮＡを有する子孫は標準的な技術により同定され、それらを利用して動物の全細胞が相同的に組換えられたＤＮＡを含む動物を繁殖させることができる。ノックアウト動物は、ＰＲＯポリペプチドが不在であることによるある種の病理的状態及びその病理的状態の進行に対する防御能力によって特徴付けられる。 Nucleic acids encoding PRO or any modified form thereof can also be used to produce transgenic or “knockout” animals, which are useful in the development and screening of therapeutically useful reagents. A transgenic animal (eg, a mouse or rat) is an animal having cells that contain the transgene introduced into the animal or its ancestors before birth, eg, at the embryonic stage. A transgene is DNA that is integrated into the genome of a cell in which a transgenic animal develops. In one embodiment, the cDNA encoding the PRO can be used to clone the genomic DNA encoding the PRO by established techniques, the genomic sequence having cells expressing the DNA encoding the PRO. It can be used to produce transgenic animals. Methods for producing transgenic animals, particularly specific animals such as mice or rats, are routine in the art and are described, for example, in US Pat. Nos. 4,736,866 and 4,870,009. Typically, specific cells are targeted for introduction of the PRO transgene with a tissue-specific enhancer. Transgenic animals containing a copy of a PRO-encoded transgene introduced into the germ line of an animal at the embryonic stage can be used to examine the effects of increased expression of DNA encoding PRO. Such animals can be used, for example, as tester animals for reagents that would confer protection against pathological conditions associated with their overexpression. In this aspect of the invention, if an animal is treated with a reagent and the incidence of the pathological condition is low compared to an untreated animal with the transgene, a therapeutic treatment for the pathological condition is indicated. .
Alternatively, a non-human homologue of PRO is a defect that encodes PRO by homologous recombination between the altered genomic DNA encoding PRO introduced into an embryonic stem cell of an animal and an endogenous gene encoding PRO. Alternatively, it can be used to create PRO “knock-out” animals with altered genes. For example, a cDNA encoding PRO can be used to clone genomic DNA encoding PRO according to established techniques. A portion of the genomic DNA encoding PRO can be deleted or replaced with another gene, such as a gene encoding a selectable marker used to monitor integration. Typically, the vector contains several kilobases of intact flanking DNA (both 5 ′ and 3 ′ ends) [eg, Thomas and Capecchi, Cell, 51: 503 (1987) for homologous recombination vectors. checking]. Vectors are introduced into embryonic stem cells (eg, by electroporation), and cells are selected in which the introduced DNA is recombined homologously with endogenous DNA [eg, Li et al., Cell, 69: 915 (1992 )reference]. The selected cells are then injected into the blastocyst of the animal (eg mouse or rat) to form an aggregate chimera [eg Bradley, Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A Practical Approach, EJ Robertson, ed. , Oxford, 1987), pp. 113-152]. The chimeric embryo is then transplanted into an appropriate pseudopregnant female nanny to create a “knock-out” animal over time. Offspring with DNA homologously recombined into embryonic cells are identified by standard techniques and can be used to breed animals that contain DNA in which all cells of the animal are homologously recombined . Knockout animals are characterized by their ability to defend against certain pathological conditions and the progression of those pathological conditions due to the absence of PRO polypeptides.

また、ＰＲＯポリペプチドをコードする核酸は遺伝子治療にも使用できる。遺伝子治療用途においては、例えば欠陥遺伝子を置換するため、治療的有効量の遺伝子産物のインビボ合成を達成するために遺伝子が導入される。「遺伝子治療」とは、１回の処理により継続的効果が達成される従来の遺伝子治療と、治療的に有効なＤＮＡ又はｍＲＮＡの１回又は繰り返し投与を含む遺伝子治療薬の投与の両方を含む。アンチセンスＲＮＡ及びＤＮＡは、ある種の遺伝子のインビボ発現を阻止する治療薬として用いることができる。短いアンチセンスオリゴヌクレオチドを、細胞膜による制限された取り込みに起因する低い細胞内濃度にもかかわらず、それが阻害剤として作用する細胞中に移入できることは既に示されている(Zamecnik等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 4143-4146 [1986])。オリゴヌクレオチドは、例えばそれらの負に荷電したリン酸ジエステル基を非荷電基で置換することによって取り込みを促進するように修飾してもよい。
生存可能な細胞に核酸を導入するための種々の技術が存在する。これらの技術は、核酸が培養細胞にインビトロで、あるいは意図する宿主の細胞においてインビボで移入されるかに応じて変わる。核酸を哺乳動物細胞にインビトロで移入するのに適した方法は、リポソーム、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、細胞融合、ＤＥＡＥ-デキストラン、リン酸カルシウム沈殿法などを含む。現在好ましいインビボ遺伝子移入技術は、ウイルス(典型的にはレトロウイルス)ベクターでの形質移入及びウイルス被覆タンパク質-リポソーム媒介形質移入である(Dzau等, Trends, in Biotechnology 11, 205-210[1993])。幾つかの状況では、核酸供給源を、細胞表面膜タンパク質又は標的細胞に特異的な抗体、標的細胞上のレセプターに対するリガンド等の標的細胞を標的化する薬剤とともに提供するのが望ましい。リポソームを用いる場合、エンドサイトーシスを伴って細胞表面膜タンパク質に結合するタンパク質、例えば、特定の細胞型向性のカプシドタンパク質又はその断片、サイクルにおいて内部移行を受けるタンパク質に対する抗体、細胞内局在化を標的とし細胞内半減期を向上させるタンパク質が、標的化及び／又は取り込みの促進のために用いられる。レセプター媒介エンドサイトーシスの技術は、例えば、Wu等, J. Biol. Chem. 262, 4429-4432 (1987); 及びWagner等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 3410-3414 (1990)によって記述されている。遺伝子マーキング及び遺伝子治療のプロトコールの概説については、Anderson等, Science 256, 808-813 (1992)を参照のこと。 A nucleic acid encoding a PRO polypeptide can also be used for gene therapy. In gene therapy applications, genes are introduced to achieve in vivo synthesis of a therapeutically effective amount of a gene product, eg, to replace a defective gene. “Gene therapy” includes both conventional gene therapy in which a continuous effect is achieved by a single treatment and administration of a gene therapy drug including single or repeated administration of therapeutically effective DNA or mRNA. . Antisense RNA and DNA can be used as therapeutic agents to block in vivo expression of certain genes. It has already been shown that short antisense oligonucleotides can be transferred into cells that act as inhibitors, despite low intracellular concentrations due to limited uptake by the cell membrane (Zamecnik et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA 83: 4143-4146 [1986]). Oligonucleotides may be modified to facilitate uptake, for example, by replacing their negatively charged phosphodiester groups with uncharged groups.
There are a variety of techniques for introducing nucleic acids into viable cells. These techniques vary depending on whether the nucleic acid is transferred to the cultured cells in vitro or in vivo in the intended host cell. Suitable methods for transferring nucleic acids into mammalian cells in vitro include liposomes, electroporation, microinjection, cell fusion, DEAE-dextran, calcium phosphate precipitation, and the like. Currently preferred in vivo gene transfer techniques are transfection with viral (typically retroviral) vectors and viral coat protein-liposome mediated transfection (Dzau et al., Trends, in Biotechnology 11, 205-210 [1993]). . In some situations, it may be desirable to provide a source of nucleic acid with an agent that targets the target cell, such as a cell surface membrane protein or an antibody specific for the target cell, a ligand for a receptor on the target cell. When using liposomes, proteins that bind to cell surface membrane proteins with endocytosis, such as specific cell-type capsid proteins or fragments thereof, antibodies to proteins that undergo internalization in the cycle, intracellular localization Proteins that target and improve intracellular half-life are used to promote targeting and / or uptake. Techniques for receptor-mediated endocytosis are described, for example, by Wu et al., J. Biol. Chem. 262, 4429-4432 (1987); and Wagner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 3410-3414 (1990). Is described by. For a review of gene marking and gene therapy protocols, see Anderson et al., Science 256, 808-813 (1992).

ここに記載したＰＲＯポリペプチドは、タンパク質電気泳動目的の分子量マーカーとして用いてもよく、単離された核酸配列はそのマーカーを組換え的に発現するために使用してもよい。
ここに記載したＰＲＯポリペプチド又はその断片をコードする核酸分子は染色体同定に有用である。この点において、実際の配列に基づく染色体マーキング試薬は殆ど利用可能ではないため、新規な染色体マーカーの同定の必要性が存在している。本発明の各ＰＲＯ核酸分子は染色体マーカーとして使用できる。
また本発明のＰＲＯポリペプチド及び核酸分子は組織タイピングに使用でき、本発明のＰＲＯポリペプチドは一方の組織で他方に比較して異なる発現をする。ＰＲＯ核酸分子は、ＰＣＲ、ノーザン分析、サザン分析及びウェスタン分析のプローブ生成のための用途が見出されるであろう。
ここに記載したＰＲＯポリペプチドは治療薬として用いてもよい。本発明のＰＲＯポリペプチドは、製薬的に有用な組成物を調製するのに知られた方法に従って製剤され、それにより、このＰＲＯ生成物は製薬的に許容される担体媒体と混合される。治療用製剤は、凍結乾燥された製剤又は水性溶液の形態で、任意的な製薬上許容可能なキャリア、賦形剤又は安定剤と、所望の精製度を有する活性成分とを混合することにより(Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition, A. Osol, Ed., (1980))、調製され保管される。許容される担体、賦形剤又は安定剤は、用いる投与量及び濃度ではレシピエントに対して無毒性であり、リン酸、クエン酸及び他の有機酸等の緩衝液；アスコルビン酸を含む抗酸化剤；低分子量(残基数１０個未満)ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン又は免疫グロブリン等のタンパク質；ポリビニルピロリドン等の親水性重合体；グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン又はリシン等のアミノ酸；グルコース、マンノース又はデキストリン等の単糖類、二糖類又は他の炭水化物；ＥＤＴＡ等のキレート剤；マンニトール又はソルビトール等の糖アルコール類；ナトリウム等の塩形成対イオン；及び／又はTWEENＴＭ、PLURONICSＴＭ又はＰＥＧ等の非イオン性界面活性剤を含む。 The PRO polypeptides described herein may be used as molecular weight markers for protein electrophoresis purposes, and the isolated nucleic acid sequences may be used to recombinantly express the markers.
Nucleic acid molecules encoding the PRO polypeptides or fragments thereof described herein are useful for chromosome identification. In this regard, there is a need to identify new chromosomal markers, since chromosomal marking reagents based on actual sequences are hardly available. Each PRO nucleic acid molecule of the present invention can be used as a chromosomal marker.
The PRO polypeptides and nucleic acid molecules of the present invention can also be used for tissue typing, and the PRO polypeptides of the present invention are expressed differently in one tissue compared to the other. PRO nucleic acid molecules will find use for generating probes for PCR, Northern analysis, Southern analysis and Western analysis.
The PRO polypeptides described herein may be used as therapeutic agents. The PRO polypeptides of the invention are formulated according to known methods for preparing pharmaceutically useful compositions, whereby the PRO product is mixed with a pharmaceutically acceptable carrier medium. The therapeutic formulation is in the form of a lyophilized formulation or an aqueous solution by mixing any pharmaceutically acceptable carrier, excipient or stabilizer with an active ingredient having the desired degree of purification ( Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition, A. Osol, Ed., (1980)), prepared and stored. Acceptable carriers, excipients or stabilizers are nontoxic to recipients at the dosages and concentrations used and are buffers such as phosphate, citrate and other organic acids; antioxidants including ascorbic acid Agent; low molecular weight (less than 10 residues) polypeptide; protein such as serum albumin, gelatin or immunoglobulin; hydrophilic polymer such as polyvinylpyrrolidone; amino acid such as glycine, glutamine, asparagine, arginine or lysine; glucose, Monosaccharides, disaccharides or other carbohydrates such as mannose or dextrin; chelating agents such as EDTA; sugar alcohols such as mannitol or sorbitol; salt-forming counterions such as sodium; and / or TWEEN ™ , PLURONICS ™ or PEG, etc. Contains nonionic surfactant.

インビボ投与に使用される製剤は滅菌されていなくてはならない。これは、凍結乾燥及び再構成の前又は後に、滅菌フィルター膜を通す濾過により容易に達成される。
ここで、治療用組成物は一般に、無菌のアクセスポートを具備する容器、例えば、皮下注射針で貫通可能なストッパーを持つ静脈内バッグ又はバイアル内に配される。
投与経路は周知の方法、例えば、静脈内、腹膜内、脳内、筋肉内、眼内、動脈内又は病巣内経路での注射又は注入、局所投与、又は徐放系による。
本発明の製薬組成物の用量及び望ましい薬物濃度は、意図する特定の用途に応じて変化する。適切な用量又は投与経路の決定は、通常の内科医の技量の範囲内である。動物実験は、ヒト治療のための有効量の決定についての信頼できるガイダンスを提供する。有効量の種間スケーリングは、Toxicokinetics and New Drug Development, Yacobi等, 編, Pergamon Press, New York 1989, pp. 42-96のMordenti, J. 及びchappell, W. 「The use of interspecies scaling in toxicokinetics」に記載された原理に従って実施できる。
ＰＲＯポリペプチド又はそのアゴニスト又はアンタゴニストのインビボ投与が用いられる場合、正常な投与量は、投与経路に応じて、哺乳動物の体重当たり１日に約１０ｎｇ／ｋｇから１００ｍｇ／ｋｇまで、好ましくは約１μｇ／ｋｇ／日から１０ｍｇ／ｋｇ／日である。特定の用量及び輸送方法の指針は文献に与えられている；例えば、米国特許第4,657,760号、第5,206,344号、又は第5,225,212号参照。異なる製剤が異なる治療用化合物及び異なる疾患に有効であること、例えば一つの器官又な組織を標的とする投与には他の器官又は組織とは異なる方式で輸送することは必要であることが予想される。
ＰＲＯポリペプチドの投与を必要とする任意の疾患又は疾病の治療に適した放出特性を持つ製剤でＰＲＯポリペプチドの持続放出が望まれる場合、ＰＲＯポリペプチドのマイクロカプセル化が考えられる。持続放出のための組換えタンパク質のマイクロカプセル化は、ヒト成長ホルモン(ｒｈＧＨ)、インターフェロン(ｒｈＩＦＮ-)、インターロイキン-２、及びＭＮｒｇｐ１２０で成功裏に実施されている。Johnson等, Nat. Med., 2: 795-799 (1996); Yasuda, Biomed. Ther., 27: 1221-1223 (1993); Hora等, Bio/Technology, 8: 755-758 (1990); Cleland, 「Design and Production of Single Immunization Vaccines Using Polyactide Polyglycolide Microsphere Systems」Vaccine Design: The Subunit and Adjuvant Approach, Powell 及び Newman編, (Plenum Press: New York, 1995), p. 439-462; WO 97/03692, WO 96/40072, WO 96/07399; 及び米国特許第5,564,010号。 The formulation used for in vivo administration must be sterile. This is easily accomplished by filtration through sterile filter membranes before or after lyophilization and reconstitution.
Here, the therapeutic composition is generally placed in a container having a sterile access port, for example, an intravenous bag or vial having a stopper pierceable by a hypodermic needle.
The route of administration is by well known methods such as injection or infusion by intravenous, intraperitoneal, intracerebral, intramuscular, intraocular, intraarterial or intralesional route, local administration, or sustained release system.
The dosage of the pharmaceutical composition of the present invention and the desired drug concentration will vary depending on the particular application intended. The determination of an appropriate dose or route of administration is within the ordinary skill of a physician. Animal experiments provide reliable guidance on determining effective doses for human therapy. Effective species interspecific scaling is described in Toxicokinetics and New Drug Development, Yacobi et al., Ed., Pergamon Press, New York 1989, pp. 42-96, Mordenti, J. and chappell, W. “The use of interspecies scaling in toxicokinetics”. Can be implemented according to the principles described in.
When in vivo administration of a PRO polypeptide or agonist or antagonist thereof is used, the normal dosage is about 10 ng / kg to 100 mg / kg, preferably about 1 μg per day per mammal body weight, depending on the route of administration. / Kg / day to 10 mg / kg / day. Specific dosage and delivery method guidelines are given in the literature; see, eg, US Pat. Nos. 4,657,760, 5,206,344, or 5,225,212. It is anticipated that different formulations will be effective for different therapeutic compounds and different diseases, eg, administration targeting one organ or tissue will require delivery in a different manner than other organs or tissues Is done.
Where sustained release of the PRO polypeptide is desired in a formulation with release characteristics suitable for the treatment of any disease or condition that requires administration of the PRO polypeptide, microencapsulation of the PRO polypeptide is contemplated. Microencapsulation of recombinant proteins for sustained release has been successfully performed with human growth hormone (rhGH), interferon (rhIFN-), interleukin-2, and MNrgp120. Johnson et al., Nat. Med., 2: 795-799 (1996); Yasuda, Biomed. Ther., 27: 1221-1223 (1993); Hora et al., Bio / Technology, 8: 755-758 (1990); Cleland , `` Design and Production of Single Immunization Vaccines Using Polyactide Polyglycolide Microsphere Systems '' Vaccine Design: The Subunit and Adjuvant Approach, edited by Powell and Newman, (Plenum Press: New York, 1995), p. 439-462; WO 97/03692, WO 96/40072, WO 96/07399; and US Pat. No. 5,564,010.

これらのタンパク質の持続放出製剤は、ポリ-乳酸-コグリコール酸(ＰＬＧＡ)ポリマーを用い、その生体適合性及び広範囲の生分解特性に基づいて開発された。ＰＬＧＡの分解生成物である乳酸及びグリコール酸は、ヒト身体内で即座にクリアされる。さらに、このポリマーの分解性は、分子量及び組成に依存して数ヶ月から数年まで調節できる。Lewis, 「Controlled release of bioactive agents from lactide/glycolide polymer」: M. Chasin及び R. Langer (編), Biodegradable Polymers as Drug Delivery Systems (Marcel Dekker: New York, 1990), pp. 1-41。
本発明は、ＰＲＯポリペプチドに類似する(アゴニスト)又はＰＲＯポリペプチドの効果を阻害する(アンタゴニスト)ものを同定するための化合物のスクリーニング方法も包含する。アンタゴニスト候補薬のスクリーニングアッセイは、ここに同定した遺伝子にコードされるＰＲＯポリペプチドと結合又は複合体形成する化合物、又は他にコード化ポリペプチドの他の細胞性タンパク質との相互作用を阻害する化合物を同定するために設計される。このようなスクリーニングアッセイは、それを特に小分子候補薬の同定に適したものにする、化学的ライブラリーの高スループットスクリーニングに適用可能なアッセイを含む。
このアッセイは、タンパク質-タンパク質結合アッセイ、生化学的スクリーニングアッセイ、イムノアッセイ、及び細胞ベースのアッセイで、この分野で知られたものを含む種々の方式で実施される。
アンタゴニストについての全てのアッセイは、それらが候補薬をここで同定された核酸にコードされるＰＲＯポリペプチドと、これら２つの成分が相互作用するのに十分な条件下及び時間で接触させることを必要とすることにおいて共通する。 Sustained release formulations of these proteins have been developed based on their biocompatibility and a wide range of biodegradation properties using poly-lactic-coglycolic acid (PLGA) polymers. The degradation products of PLGA, lactic acid and glycolic acid, are cleared immediately in the human body. Furthermore, the degradability of the polymer can be adjusted from months to years depending on the molecular weight and composition. Lewis, “Controlled release of bioactive agents from lactide / glycolide polymer”: M. Chasin and R. Langer (eds.), Biodegradable Polymers as Drug Delivery Systems (Marcel Dekker: New York, 1990), pp. 1-41.
The invention also encompasses methods of screening compounds to identify those that are similar to PRO polypeptides (agonists) or that inhibit the effects of PRO polypeptides (antagonists). A screening assay for an antagonist candidate drug is a compound that binds or complexes with the PRO polypeptide encoded by the gene identified herein, or that otherwise inhibits the interaction of the encoded polypeptide with other cellular proteins Designed to identify Such screening assays include those applicable to high-throughput screening of chemical libraries that make it particularly suitable for the identification of small molecule drug candidates.
This assay is performed in a variety of formats, including protein-protein binding assays, biochemical screening assays, immunoassays, and cell-based assays, known in the art.
All assays for antagonists require that they contact the candidate drug with the PRO polypeptide encoded by the nucleic acid identified here under conditions and for a time sufficient for these two components to interact. Is common.

結合アッセイにおいて、相互作用は結合であり、形成された複合体は単離されるか、又は反応混合物中で検出される。特別な実施態様では、ここに同定された遺伝子にコードされるＰＲＯポリペプチド又は候補薬が、共有又は非共有結合により固相、例えばマイクロタイタープレートに固定化される。非共有結合は、一般的に固体表面をポリペプチドの溶液で被覆し乾燥させることにより達成される。あるいは、固定化されるＰＲＯポリペプチドに特異的な固定化抗体、例えばモノクローナル抗体を、それを固体表面に固着させるために用いることができる。アッセイは、固定化成分、例えば固着成分を含む被覆表面に、検出可能な標識で標識されていてもよい非固定化成分を添加することにより実施される。反応が完了したとき、未反応成分を例えば洗浄により除去し、固体表面に固着した複合体を検出する。最初の非固定化成分が検出可能な標識を有している場合、表面に固定化された標識の検出は複合体形成が起こったことを示す。最初の非固定化成分が標識を持たない場合は、複合体形成は、例えば、固定化された複合体に特異的に結合する標識抗体によって検出できる。
候補化合物が相互作用するがここに同定した遺伝子にコードされる特定のＰＲＯポリペプチに結合しない場合、そのポリペプチドとの相互作用は、タンパク質-タンパク質相互作用を検出するために良く知られた方法によってアッセイすることができる。そのようなアッセイは、架橋、同時免疫沈降、及び勾配又はクロマトグラフィカラムを通す同時精製などの伝統的な手法を含む。さらに、タンパク質-タンパク質相互作用は、Fields及び共同研究者等［Fiels及びSong, Nature(London) 340, 245-246 (1989); Chien等, Proc.Natl. Acad. Sci. USA 88, 9578-9582 (1991)］に記載された酵母菌ベースの遺伝子系を用いることにより、Chevray及びNathans, Proc.Natl. Acad. Sci. USA 89, 5789-5793 (1991)に開示されている酵母菌ベースの系を用いて監視することができる。酵母菌ＧＡＬ４などの多くの転写活性化剤は、２つの物理的に別個のモジュラードメインからなり、一方はＤＮＡ結合ドメインとして作用し、他方は転写活性化ドメインとして機能する。以前の文献に記載された酵母菌発現系(一般に「２-ハイブリッド系」と呼ばれる)は、この特性の長所を利用して、２つのハイブリッドタンパク質を用い、一方では標的タンパク質がＧＡＬ４のＤＮＡ結合ドメインに融合し、他方では、候補となる活性化タンパク質が活性化ドメインに融合している。ＧＡＬ１-ｌａｃＺリポーター遺伝子のＧＡＬ４活性化プロモーターの制御下での発現は、タンパク質-タンパク質相互作用を介したＧＡＬ４活性の再構成に依存する。相互作用するポリペプチドを含むコロニーは、β-ガラクトシダーゼに対する色素生産性物質で検出される。２-ハイブリッド技術を用いた２つの特定なタンパク質間のタンパク質-タンパク質相互作用を同定するための完全なキット(MATCHMAKERＴＭ)は、Clontechから商業的に入手可能である。この系は、特定のタンパク質相互作用に含まれるタンパク質ドメインのマッピング、並びにこの相互作用にとって重要なアミノ酸残基の特定にも拡張することができる。 In binding assays, the interaction is binding and the complex formed is isolated or detected in the reaction mixture. In a specific embodiment, the PRO polypeptide or candidate drug encoded by the gene identified herein is immobilized to a solid phase, such as a microtiter plate, by covalent or non-covalent bonding. Non-covalent binding is generally achieved by coating a solid surface with a solution of the polypeptide and drying. Alternatively, an immobilized antibody specific for the immobilized PRO polypeptide, such as a monoclonal antibody, can be used to anchor it to a solid surface. The assay is performed by adding a non-immobilized component, which may be labeled with a detectable label, to a coated surface containing an immobilized component, such as an anchoring component. When the reaction is completed, unreacted components are removed, for example, by washing, and the complex adhered to the solid surface is detected. If the first non-immobilized component has a detectable label, detection of the label immobilized on the surface indicates that complex formation has occurred. If the initial non-immobilized component does not have a label, complex formation can be detected, for example, by a labeled antibody that specifically binds to the immobilized complex.
If a candidate compound interacts but does not bind to a specific PRO polypeptide encoded by the gene identified herein, its interaction with the polypeptide is determined by well-known methods for detecting protein-protein interactions. Can be assayed. Such assays include traditional techniques such as cross-linking, co-immunoprecipitation, and co-purification through a gradient or chromatographic column. Furthermore, protein-protein interactions are described in Fields and co-workers [Fiels and Song, Nature (London) 340, 245-246 (1989); Chien et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 9578-9582. (1991)] by using the yeast-based gene system described in Chevray and Nathans, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 5789-5793 (1991). Can be monitored. Many transcriptional activators, such as yeast GAL4, consist of two physically distinct modular domains, one that acts as a DNA binding domain and the other that functions as a transcriptional activation domain. The yeast expression system described in the previous literature (commonly referred to as the “2-hybrid system”) takes advantage of this property and uses two hybrid proteins, while the target protein is the DNA binding domain of GAL4. On the other hand, the candidate activation protein is fused to the activation domain. Expression of the GAL1-lacZ reporter gene under the control of a GAL4-activated promoter depends on reconstitution of GAL4 activity through protein-protein interactions. Colonies containing interacting polypeptides are detected with a chromogenic substance for β-galactosidase. A complete kit (MATCHMAKER ™ ) for identifying protein-protein interactions between two specific proteins using two-hybrid technology is commercially available from Clontech. This system can also be extended to the mapping of protein domains involved in a particular protein interaction as well as the identification of amino acid residues important for this interaction.

ここで同定されたＰＲＯポリペプチドをコードする遺伝子と細胞内又は細胞外成分との相互作用を阻害する化合物は、次のように試験できる：通常は反応混合物は、遺伝子産物と細胞外又は細胞内成分を、それら２つの生成物が相互作用及び結合する条件下及び時間で含むように調製される。候補化合物が結合を阻害する能力を試験するために、反応は試験化合物の不存在及び存在下で実施される。さらに、プラシーボを第３の反応混合物に添加してポジティブ対照を提供してもよい。混合物中に存在する試験化合物と細胞内又は細胞外成分との結合(複合体形成)は上記のように監視される。試験化合物を含有する反応混合物ではなく対照反応における複合体の形成は、試験化合物が試験化合物とその結合パートナーとの相互作用を阻害することを示す。
アンタゴニストをアッセイするために、ＰＲＯポリペプチドを特定の活性についてスクリーニングする化合物とともに添加してよく、ＰＲＯポリペプチド存在下での関心ある活性を阻害する化合物の能力が化合物がＰＲＯポリペプチドのアンタゴニストであることを示す。あるいは、アンタゴニストは、ＰＲＯポリペプチド及び膜結合ＰＲＯポリペプチドレセプター又は組換えレセプターを持つ潜在的アンタゴニストを、競合的阻害アッセイに適した条件下で結合させることにより検出してもよい。ＰＲＯポリペプチドは、放射性等で標識でき、レセプターに結合したＰＲＯポリペプチドの数を潜在的アンタゴニストの有効性を決定するのに使用できる。レセプターをコードする遺伝子は、当業者に知られた多くの方法、例えばリガンドパンニング及びＦＡＣＳソートにより同定できる。Coligan等, Current Protocols in Immun., 1(2): Chapter 5 (1991)。好ましくは、発現クローニングが用いられ、ポリアデニル化ＲＮＡがＰＲＯポリペプチドに反応性の細胞から調製され、このＲＮＡから生成されたｃＤＮＡライブラリーがプールに分配され、ＣＯＳ細胞又はＰＲＯポリペプチド反応性でない他の細胞の形質移入に使用される。スライドガラスで成長させた形質移入細胞を標識したＰＲＯポリペプチドに暴露する。ＰＲＯポリペプチドは、ヨウ素化又は部位特異的タンパク質キナーゼの認識部位の包含を含む種々の手段で標識できる。固定及びインキュベーションの後、スライドにオートラジオグラフィ分析を施す。ポジティブプールを同定し、相互作用サブプール化及び再スクリーニング工程を用いてサブプールを調製して再形質移入し、結果的に推定レセプターをコードする単一のクローンを生成する。 Compounds that inhibit the interaction of the gene encoding the PRO polypeptide identified herein with intracellular or extracellular components can be tested as follows: Usually the reaction mixture is the gene product and extracellular or intracellular. The ingredients are prepared to include the conditions and time that the two products interact and bind. In order to test the ability of a candidate compound to inhibit binding, the reaction is performed in the absence and presence of the test compound. In addition, a placebo may be added to the third reaction mixture to provide a positive control. The binding (complex formation) between the test compound present in the mixture and the intracellular or extracellular component is monitored as described above. Formation of the complex in the control reaction but not the reaction mixture containing the test compound indicates that the test compound inhibits the interaction between the test compound and its binding partner.
To assay for an antagonist, a PRO polypeptide may be added with a compound that screens for a particular activity, and the compound's ability to inhibit the activity of interest in the presence of the PRO polypeptide is an antagonist of the PRO polypeptide. It shows that. Alternatively, antagonists may be detected by binding potential antagonists with PRO polypeptides and membrane-bound PRO polypeptide receptors or recombinant receptors under conditions suitable for competitive inhibition assays. PRO polypeptides can be labeled, such as radioactively, and the number of PRO polypeptides bound to the receptor can be used to determine the effectiveness of a potential antagonist. The gene encoding the receptor can be identified by a number of methods known to those skilled in the art, such as ligand panning and FACS sorting. Coligan et al., Current Protocols in Immun., 1 (2): Chapter 5 (1991). Preferably, expression cloning is used, polyadenylated RNA is prepared from cells reactive to the PRO polypeptide, cDNA libraries generated from this RNA are distributed into pools, COS cells or other non-PRO polypeptide reactive Used for transfection of cells. Transfected cells grown on glass slides are exposed to labeled PRO polypeptide. PRO polypeptides can be labeled by a variety of means including iodination or inclusion of a recognition site for a site-specific protein kinase. After fixation and incubation, the slides are subjected to autoradiographic analysis. Positive pools are identified, and subpools are prepared and retransfected using an interactive subpooling and rescreening process, resulting in a single clone encoding the putative receptor.

レセプター同定の代替的方法として、標識ＰＲＯポリペプチドをレセプター分子を発現する細胞膜又は抽出調製物に光親和性結合させることができる。架橋材料はＰＡＧＥに溶解させ、Ｘ線フィルムに暴露する。レセプターを含む標識複合体を励起し、ペプチド断片に分離し、タンパク質マイクロ配列決定を施すことができる。マイクロ配列決定から得たアミノ酸配列は、推定レセプターをコードする遺伝子を同定するｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングする分解性オリゴヌクレオチドプローブの組の設計に用いられる。
アンタゴニストの他の検定では、レセプターを発現する哺乳動物細胞又は膜調製物を、候補化合物の存在下で標識ＰＲＯポリペプチドとともにインキュベートする。次いで、この相互作用を促進又は阻止する化合物の能力を測定する。
潜在的なアンタゴニストのより特別な例は、免疫グロブリンとＰＲＯポリペプチドとの融合体に結合するオリゴヌクレオチド、特に、限られないが、ポリペプチド-及びモノクローナル抗体及び抗体断片、一本鎖抗体、抗-イディオタイプ抗体、及びこれらの抗体又は断片のキメラ又はヒト化形態、並びにヒト抗体及び抗体断片を含む抗体を含んでいる。あるいは、潜在的アンタゴニストは、密接に関連したタンパク質、例えば、レセプターを認識するが効果を与えず、従ってＰＲＯポリペプチドの作用を競合的に阻害するＰＲＯポリペプチドの変異形態であってもよい。
他の潜在的なＰＲＯポリペプチドアンタゴニストは、アンチセンス技術を用いて調製されたアンチセンスＲＮＡ又はＤＮＡ作成物であり、例えば、アンチセンスＲＮＡ又はＤＮＡは、標的ｍＲＮＡにハイブリッド形成してタンパク質翻訳を妨害することによりｍＲＮＡの翻訳を直接阻止するように作用する。アンチセンス技術は、トリプルへリックス形成又はアンチセンスＤＮＡ又はＲＮＡを通して遺伝子発現を制御するのに使用でき、それらの方法はともに、ポリヌクレオチドのＤＮＡ又はＲＮＡへの結合に基づく。例えば、ここでの成熟ＰＲＯポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列の５’コード化部分は、約１０から４０塩基対長のアンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオチドの設計に使用される。ＤＮＡオリゴヌクレオチドは、転写に含まれる遺伝子の領域に相補的であるように設計され(トリプルへリックス−Lee等, Nucl, Acid Res., 6: 3073 (1979); Cooney等, Science, 241: 456 (1988); Dervan等, Science, 251: 1360 (1991)参照)、それによりＰＲＯポリペプチドの転写及び生成を防止する。アンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオチドはインビボでｍＲＮＡにハイブリッド形成してｍＲＮＡ分子のＰＲＯポリペプチドへの翻訳を阻止する(アンチセンス−Okano, Neurochem., 56: 560 (1991); Oligodeoxynucleotides as Antisense Inhibitors of Gene Expression (CRC Press: Boca Raton, FL, 1988))。上記のオリゴヌクレオチドは、細胞に送達され、アンチセンスＲＮＡ又はＤＮＡをインビボで発現させて、ＰＲＯポリペプチドの生産を阻害することもできる。アンチセンスＤＮＡが用いられる場合、翻訳開始部位、例えば標的遺伝子ヌクレオチド配列の−１０から＋１０位置の間から誘導されるオリゴデオキシリボヌクレオチドが好ましい。 As an alternative method of receptor identification, labeled PRO polypeptides can be photoaffinity linked to cell membranes or extract preparations that express the receptor molecule. The cross-linked material is dissolved in PAGE and exposed to X-ray film. The labeled complex containing the receptor can be excited, separated into peptide fragments, and subjected to protein microsequencing. The amino acid sequence obtained from microsequencing is used to design a set of degradable oligonucleotide probes that screen a cDNA library that identifies the gene encoding the putative receptor.
In other assays for antagonists, mammalian cells or membrane preparations expressing the receptor are incubated with labeled PRO polypeptide in the presence of the candidate compound. The ability of the compound to promote or block this interaction is then measured.
More specific examples of potential antagonists include oligonucleotides that bind to fusions of immunoglobulins and PRO polypeptides, particularly but not limited to polypeptide- and monoclonal antibodies and antibody fragments, single chain antibodies, anti-chains, -Idiotype antibodies, and chimeric or humanized forms of these antibodies or fragments, as well as antibodies, including human antibodies and antibody fragments. Alternatively, a potential antagonist may be a closely related protein, eg, a variant form of a PRO polypeptide that recognizes but does not have an effect on the receptor and thus competitively inhibits the action of the PRO polypeptide.
Other potential PRO polypeptide antagonists are antisense RNA or DNA constructs prepared using antisense technology; for example, antisense RNA or DNA hybridizes to target mRNA and interferes with protein translation It acts to directly block the translation of mRNA. Antisense technology can be used to control gene expression through triple helix formation or antisense DNA or RNA, both of which are based on the binding of polynucleotides to DNA or RNA. For example, the 5 ′ coding portion of the polynucleotide sequence encoding the mature PRO polypeptide herein is used in the design of antisense RNA oligonucleotides of about 10 to 40 base pairs in length. DNA oligonucleotides are designed to be complementary to a region of the gene involved in transcription (Triple Helix-Lee et al., Nucl, Acid Res., 6: 3073 (1979); Cooney et al., Science, 241: 456 (1988); Dervan et al., Science, 251: 1360 (1991)), thereby preventing transcription and production of PRO polypeptides. Antisense RNA oligonucleotides hybridize to mRNA in vivo and block translation of mRNA molecules into PRO polypeptides (Antisense-Okano, Neurochem., 56: 560 (1991); Oligodeoxynucleotides as Antisense Inhibitors of Gene Expression ( CRC Press: Boca Raton, FL, 1988)). The oligonucleotides described above can also be delivered to cells to express antisense RNA or DNA in vivo to inhibit PRO polypeptide production. When antisense DNA is used, oligodeoxyribonucleotides derived from the translation initiation site, eg, between -10 and +10 positions of the target gene nucleotide sequence, are preferred.

潜在的アンタゴニストは、ＰＲＯポリペプチドの活性部位、レセプター結合部位、又は成長因子又は他の関連結合部位に結合し、それによりＰＲＯポリペプチドの正常な生物学的活性を阻止する小分子を含む。小分子の例は、これらに限られないが、小型ペプチド又はペプチド様分子、好ましくは可溶性ペプチド、及び合成非ペプチド有機又は無機化合物を含む。
リボザイムは、ＲＮＡの特異的切断を触媒できる酵素的ＲＮＡ分子である。リボザイムは、相補的標的ＲＮＡへの配列特異的ハイブリッド形成、次いでヌクレオチド鎖切断的切断により作用する。潜在的ＲＮＡ標的内の特異的リボザイム切断部位は、既知の技術で同定できる。更なる詳細は、例えば、Rossi, Current Biology 4: 469-471 (1994)及びＰＣＴ公報、番号WO 97/33551(1997年9月18日公開)を参照。
転写阻害に用いられるトリプルヘリックス形成における核酸分子は一本鎖でデオキシヌクレオチドからなる。これらのオリゴヌクレオチドの基本組成は、フーグスチン塩基対則を介するトリプルヘリックス形成を促進するように設計され、それは一般に二重鎖の一方の鎖上のプリン又はピリミジンのサイズ変更可能な伸展を必要とする。さらなる詳細は、例えば、ＰＣＴ公報、番号WO 97/33551, 上掲を参照。
これらの小分子は、上記で議論したスクリーニングアッセイの一又は複数の任意のものにより及び／又は当業者に良く知られた他の任意のスクリーニング技術により同定できる。
ここで開示される分子の用途は、以下に開示し記載するポジティブな機能アッセイの成功に基づいている。そのアッセイの成功に基づく方法もまた本発明に含まれる。 Potential antagonists include small molecules that bind to the active site, receptor binding site, or growth factor or other relevant binding site of a PRO polypeptide, thereby blocking the normal biological activity of the PRO polypeptide. Examples of small molecules include, but are not limited to, small peptides or peptide-like molecules, preferably soluble peptides, and synthetic non-peptide organic or inorganic compounds.
Ribozymes are enzymatic RNA molecules that can catalyze the specific cleavage of RNA. Ribozymes act by sequence-specific hybridization to complementary target RNA, followed by nucleotide strand breaks. Specific ribozyme cleavage sites within a potential RNA target can be identified by known techniques. For further details see, for example, Rossi, Current Biology 4: 469-471 (1994) and PCT Publication No. WO 97/33551 (published September 18, 1997).
Nucleic acid molecules in triple helix formation used for transcription inhibition are single-stranded and composed of deoxynucleotides. The basic composition of these oligonucleotides is designed to promote triple helix formation via Hoogstin base pairing rules, which generally requires a resizable extension of purine or pyrimidine on one strand of the duplex . For further details see, for example, PCT Publication No. WO 97/33551, supra.
These small molecules can be identified by any one or more of the screening assays discussed above and / or by any other screening technique well known to those skilled in the art.
The molecular applications disclosed herein are based on the success of the positive functional assay disclosed and described below. Methods based on the success of the assay are also included in the present invention.

Ｆ．抗-ＰＲＯ抗体
本発明は抗-ＰＲＯ抗体を更に提供する。抗体の例としては、ポリクローナル、モノクローナル、ヒト化、二重特異性及びヘテロ抱合体抗体が含まれる。 F. Anti-PRO Antibodies The present invention further provides anti-PRO antibodies. Examples of antibodies include polyclonal, monoclonal, humanized, bispecific and heteroconjugate antibodies.

１．ポリクローナル抗体
抗-ＰＲＯ抗体はポリクローナル抗体を含む。ポリクローナル抗体の調製方法は当業者に知られている。哺乳動物においてポリクローナル抗体は、例えば免疫化剤、及び所望するのであればアジュバントを、一又は複数回注射することで発生させることができる。典型的には、免疫化剤及び／又はアジュバントを複数回皮下又は腹腔内注射により、哺乳動物に注射する。免疫化剤は、ＰＲＯポリペプチド又はその融合タンパク質を含みうる。免疫化剤を免疫化された哺乳動物において免疫原性が知られているタンパク質に抱合させるのが有用である。このような免疫原タンパク質の例は、これらに限られないが、キーホールリンペットヘモシアニン、血清アルブミン、ウシサイログロブリン及び大豆トリプシンインヒビターが含まれる。使用され得るアジュバントの例には、フロイント完全アジュバント及びＭＰＬ-ＴＤＭアジュバント(モノホスホリル脂質Ａ、合成トレハロースジコリノミコラート)が含まれる。免疫化プロトコールは、過度の実験なく当業者により選択されるであろう。 1. Polyclonal antibodies Anti-PRO antibodies include polyclonal antibodies. Methods for preparing polyclonal antibodies are known to those skilled in the art. Polyclonal antibodies in mammals can be generated by one or more injections of, for example, an immunizing agent and, if desired, an adjuvant. Typically, the immunizing agent and / or adjuvant is injected into the mammal by multiple subcutaneous or intraperitoneal injections. The immunizing agent can comprise a PRO polypeptide or a fusion protein thereof. It is useful to conjugate the immunizing agent to a protein that is known to be immunogenic in the immunized mammal. Examples of such immunogenic proteins include, but are not limited to, keyhole limpet hemocyanin, serum albumin, bovine thyroglobulin, and soybean trypsin inhibitor. Examples of adjuvants that can be used include Freund's complete adjuvant and MPL-TDM adjuvant (monophosphoryl lipid A, synthetic trehalose dicorynomycolate). The immunization protocol will be selected by one skilled in the art without undue experimentation.

２．モノクローナル抗体
あるいは、抗-ＰＲＯ抗体はモノクローナル抗体であってもよい。モノクローナル抗体は、Kohler及びMilstein, Nature, 256:495 (1975)に記載されているようなハイブリドーマ法を使用することで調製することができる。ハイブリドーマ法では、マウス、ハムスター又は他の適切な宿主動物を典型的には免疫化剤により免疫化することで、免疫化剤に特異的に結合する抗体を生成するかあるいは生成可能なリンパ球を誘発する。また、リンパ球をインビトロで免疫化することもできる。
免疫化剤は、典型的にはＰＲＯポリペプチド又はその融合タンパク質を含む。一般にヒト由来の細胞が望まれる場合には末梢血リンパ球(「ＰＢＬ」)が使用され、あるいは非ヒト哺乳動物源が望まれている場合は、脾臓細胞又はリンパ節細胞が使用される。次いで、ポリエチレングリコール等の適当な融合剤を用いてリンパ球を不死化株化細胞と融合させ、ハイブリドーマ細胞を形成する［Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press, (1986) pp. 59-103］。不死化株化細胞は、通常は、形質転換した哺乳動物細胞、特に齧歯動物、ウシ、及びヒト由来の骨髄腫細胞である。通常、ラット又はマウスの骨髄腫株化細胞が使用される。ハイブリドーマ細胞は、好ましくは、未融合の不死化細胞の生存又は成長を阻害する一又は複数の物質を含有する適切な培地で培養される。例えば、親細胞が、酵素のヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ(HGPRT又はHPRT)を欠いていると、ハイブリドーマの培地は、典型的には、ヒポキサチン、アミノプチリン及びチミジンを含み(「ＨＡＴ培地」)、この物質がＨＧＰＲＴ欠乏性細胞の増殖を阻止する。
好ましい不死化株化細胞は、効率的に融合し、選択された抗体生成細胞による安定した高レベルの抗体発現を支援し、ＨＡＴ培地のような培地に対して感受性である。より好ましい不死化株化細胞はマウス骨髄腫株であり、これは例えばカリフォルニア州サンディエゴのSalk Institute Cell Distribution Centerやバージニア州マナッサスのアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションより入手可能である。ヒトモノクローナル抗体を生成するためのヒト骨髄腫及びマウス-ヒト異種骨髄腫株化細胞も開示されている［Kozbor, J. Immunol., 133:3001 (1984)、Brodeur等, Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, Marcel Dekker, Inc., New York, (1987) pp. 51-63］。 2. Monoclonal antibody Alternatively, the anti-PRO antibody may be a monoclonal antibody. Monoclonal antibodies can be prepared using the hybridoma method as described in Kohler and Milstein, Nature, 256: 495 (1975). In hybridoma methods, mice, hamsters or other suitable host animals are typically immunized with an immunizing agent to generate antibodies that specifically bind to the immunizing agent or to generate lymphocytes that can be generated. Trigger. Lymphocytes can also be immunized in vitro.
The immunizing agent typically comprises a PRO polypeptide or a fusion protein thereof. Generally, peripheral blood lymphocytes ("PBL") are used when cells derived from humans are desired, or spleen cells or lymph node cells are used when non-human mammalian sources are desired. Subsequently, lymphocytes are fused with immortalized cell lines using an appropriate fusion agent such as polyethylene glycol to form hybridoma cells [Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press, (1986) pp. 59- 103]. Immortalized cell lines are usually transformed mammalian cells, particularly myeloma cells from rodents, cows and humans. Usually, rat or mouse myeloma cell lines are used. The hybridoma cells are preferably cultured in a suitable medium containing one or more substances that inhibit the survival or growth of unfused, immortalized cells. For example, if the parent cell lacks the enzyme hypoxanthine guanine phosphoribosyltransferase (HGPRT or HPRT), the hybridoma medium typically contains hypoxatin, aminopetitin and thymidine ("HAT medium"). This substance prevents the growth of HGPRT-deficient cells.
Preferred immortalized cell lines are those that fuse efficiently, support stable high levels of antibody expression by selected antibody-producing cells, and are sensitive to a medium such as HAT medium. A more preferred immortalized cell line is the mouse myeloma line, which is available, for example, from the Salk Institute Cell Distribution Center in San Diego, California or the American Type Culture Collection in Manassas, Virginia. Human myeloma and mouse-human heteromyeloma cell lines for generating human monoclonal antibodies have also been disclosed [Kozbor, J. Immunol., 133: 3001 (1984), Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications , Marcel Dekker, Inc., New York, (1987) pp. 51-63].

次いでハイブリドーマ細胞が培養される培養培地を、ＰＲＯに対するモノクローナル抗体の存在について検定する。好ましくは、ハイブリドーマ細胞によって生成されたモノクローナル抗体の結合特異性は免疫沈降又はラジオイムノアッセイ(ＲＩＡ)や酵素結合免疫測定法(ＥＬＩＳＡ)等のインビトロ結合検定法によって測定する。このような技術及びアッセイは、当該分野において公知である。モノクローナル抗体の結合親和性は、例えばMunson及びPollard, Anal. Biochem., 107:220 (1980)によるスキャッチャード分析法によって測定することができる。
所望のハイブリドーマ細胞が同定された後、クローンを制限希釈工程によりサブクローニングし、標準的な方法で成長させることができる［Goding, 上掲］。この目的のための適当な培地には、例えば、ダルベッコの改変イーグル培地及びＲＰＭＩ-１６４０倍地が含まれる。あるいは、ハイブリドーマ細胞は哺乳動物においてインビボで腹水として成長させることもできる。
サブクローンによって分泌されたモノクローナル抗体は、例えばプロテインＡ−セファロース法、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー法、ゲル電気泳動法、透析法又はアフィニティークロマトグラフィー等の従来の免疫グロブリン精製方法によって培養培地又は腹水液から単離又は精製される。
また、モノクローナル抗体は、組換えＤＮＡ法、例えば米国特許第4,816,567号に記載された方法により作成することができる。本発明のモノクローナル抗体をコードするＤＮＡは、常套的な方法を用いて(例えば、マウス抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合可能なオリゴヌクレオチドプローブを使用して)、容易に単離し配列決定することができる。本発明のハイブリドーマ細胞はそのようなＤＮＡの好ましい供給源となる。ひとたび単離されたら、ＤＮＡは発現ベクター内に配することができ、これが宿主細胞、例えばサルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣(ＣＨＯ)細胞、あるいは免疫グロブリンタンパク質を生成等しない骨髄腫細胞内に形質移入され、組換え宿主細胞内でモノクローナル抗体の合成をすることができる。また、ＤＮＡは、例えば相同マウス配列に換えてヒト重鎖及び軽鎖定常ドメインのコード配列を置換することにより［米国特許第4,816,567号；上掲のMorrison等］、又は免疫グロブリンコード配列に非免疫グロブリンポリペプチドのコード配列の一部又は全部を共有結合することにより修飾することができる。このような非免疫グロブリンポリペプチドは、本発明の抗体の定常ドメインに置換でき、あるいは本発明の抗体の一つの抗原結合部位の可変ドメインに置換でき、キメラ性二価抗体を生成する。
抗体は一価抗体であってもよい。一価抗体の調製方法は当該分野においてよく知られてる。例えば、一つの方法は免疫グロブリン軽鎖と修飾重鎖の組換え発現を含む。重鎖は一般的に、重鎖の架橋を防止するようにＦｃ領域の任意の点で切断される。あるいは、関連するシステイン残基を他のアミノ酸残基で置換するか欠失させて架橋を防止する。
一価抗体の調製にはインビトロ法がまた適している。抗体の消化による、その断片、特にＦａｂ断片の生成は、当該分野において知られている慣用的技術を使用して達成できる。 The culture medium in which the hybridoma cells are cultured is then assayed for the presence of monoclonal antibodies against PRO. Preferably, the binding specificity of monoclonal antibodies produced by hybridoma cells is measured by immunoprecipitation or in vitro binding assays such as radioimmunoassay (RIA) or enzyme-linked immunoassay (ELISA). Such techniques and assays are known in the art. The binding affinity of the monoclonal antibody can be measured, for example, by the Scatchard analysis method by Munson and Pollard, Anal. Biochem., 107: 220 (1980).
After the desired hybridoma cells are identified, the clones can be subcloned by a limiting dilution step and grown by standard methods [Goding, supra]. Suitable media for this purpose include, for example, Dulbecco's Modified Eagle's Medium and RPMI-1640 medium. Alternatively, the hybridoma cells can be grown as ascites in vivo in a mammal.
Monoclonal antibodies secreted by the subclone can be isolated from the culture medium or ascites fluid by conventional immunoglobulin purification methods such as protein A-Sepharose method, hydroxylapatite chromatography method, gel electrophoresis method, dialysis method or affinity chromatography. Separated or purified.
Monoclonal antibodies can also be made by recombinant DNA methods, such as those described in US Pat. No. 4,816,567. The DNA encoding the monoclonal antibody of the present invention can be easily obtained using a conventional method (for example, using an oligonucleotide probe capable of specifically binding to the gene encoding the heavy and light chains of the mouse antibody). Can be isolated and sequenced. The hybridoma cells of the present invention are a preferred source of such DNA. Once isolated, the DNA can be placed in an expression vector that is transfected into a host cell, such as a monkey COS cell, a Chinese hamster ovary (CHO) cell, or a myeloma cell that does not produce immunoglobulin protein. And monoclonal antibodies can be synthesized in recombinant host cells. DNA can also be replaced, for example, by replacing the coding sequences of human heavy and light chain constant domains in place of homologous mouse sequences [US Pat. No. 4,816,567; Morrison et al. Supra] or non-immune to immunoglobulin coding sequences. Modification can be made by covalently binding part or all of the coding sequence of a globulin polypeptide. Such non-immunoglobulin polypeptides can be substituted for the constant domains of the antibodies of the invention, or can be substituted for the variable domains of one antigen binding site of the antibodies of the invention, producing chimeric bivalent antibodies.
The antibody may be a monovalent antibody. Methods for preparing monovalent antibodies are well known in the art. For example, one method involves recombinant expression of immunoglobulin light chains and modified heavy chains. The heavy chain is generally cleaved at any point in the Fc region so as to prevent heavy chain crosslinking. Alternatively, the relevant cysteine residues are substituted or deleted with other amino acid residues to prevent crosslinking.
In vitro methods are also suitable for preparing monovalent antibodies. Generation of fragments, particularly Fab fragments, by antibody digestion can be accomplished using conventional techniques known in the art.

３．ヒト及びヒト化抗体
本発明の抗-ＰＲＯ抗体は、さらにヒト化抗体又はヒト抗体を含む。非ヒト(例えばマウス)抗体のヒト化形とは、キメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖あるいはその断片(例えばＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ'、Ｆ(ａｂ')２あるいは抗体の他の抗原結合サブ配列)であって、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列を含むものである。ヒト化抗体はレシピエントの相補性決定領域(ＣＤＲ)の残基が、マウス、ラット又はウサギのような所望の特異性、親和性及び能力を有する非ヒト種(ドナー抗体)のＣＤＲの残基によって置換されたヒト免疫グロブリン(レシピエント抗体)を含む。幾つかの例では、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク残基は、対応する非ヒト残基によって置換されている。また、ヒト化抗体は、レシピエント抗体にも、移入されたＣＤＲもしくはフレームワーク配列にも見出されない残基を含んでいてもよい。一般に、ヒト化抗体は、全てあるいはほとんど全てのＣＤＲ領域が非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、全てあるいはほとんど全てのＦＲ領域がヒト免疫グロブリンコンセンサス配列のものである、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含む。ヒト化抗体は、最適には免疫グロブリン定常領域(Ｆｃ)、典型的にはヒトの免疫グロブリンの定常領域の少なくとも一部を含んでなる［Jones等, Nature, 321:522-525 (1986); Riechmann等, Nature, 332:323-329 (1988); 及びPresta, Curr. Op Struct. Biol., 2:593-596 (1992)］。
非ヒト抗体をヒト化する方法はこの分野でよく知られている。一般的に、ヒト化抗体には非ヒト由来の一又は複数のアミノ酸残基が導入される。これら非ヒトアミノ酸残基は、しばしば、典型的には「移入」可変ドメインから得られる「移入」残基と称される。ヒト化は基本的に、ウィンター(winter)及び共同研究者［Jones等, Nature, 321:522-525 (1986)；Riechmann等, Nature, 332:323-327 (1988)；Verhoeyen等, Science, 239:1534-1536 (1988)］の方法に従って、齧歯類ＣＤＲ又はＣＤＲ配列をヒト抗体の対応する配列に置換することにより実施される。よって、このような「ヒト化」抗体は、無傷のヒト可変ドメインより実質的に少ない分が非ヒト種由来の対応する配列で置換されたキメラ抗体(米国特許第4,816,567号)である。実際には、ヒト化抗体は典型的には幾つかのＣＤＲ残基及び場合によっては幾つかのＦＲ残基が齧歯類抗体の類似する部位からの残基によって置換されたヒト抗体である。 3. Human and humanized antibodies The anti-PRO antibodies of the present invention further include humanized antibodies or human antibodies. Humanized forms of non-human (eg mouse) antibodies are chimeric immunoglobulins, immunoglobulin chains or fragments thereof (eg Fv, Fab, Fab ′, F (ab ′) 2 or other antigen binding subsequences of antibodies). And contains the minimum sequence derived from non-human immunoglobulin. A humanized antibody is a CDR residue of a non-human species (donor antibody) in which the complementarity determining region (CDR) of the recipient has the desired specificity, affinity and ability, such as mouse, rat or rabbit. Human immunoglobulin (recipient antibody) substituted by In some examples, human immunoglobulin Fv framework residues are replaced by corresponding non-human residues. Humanized antibodies may also comprise residues that are found neither in the recipient antibody nor in the imported CDR or framework sequences. In general, a humanized antibody has at least one, typically all or almost all CDR regions corresponding to those of non-human immunoglobulin and all or almost all FR regions of human immunoglobulin consensus sequences, typically Contains substantially all of the two variable domains. Humanized antibodies optimally comprise at least part of an immunoglobulin constant region (Fc), typically that of a human immunoglobulin [Jones et al., Nature, 321: 522-525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332: 323-329 (1988); and Presta, Curr. Op Struct. Biol., 2: 593-596 (1992)].
Methods for humanizing non-human antibodies are well known in the art. Generally, one or more amino acid residues derived from non-human are introduced into a humanized antibody. These non-human amino acid residues are often referred to as “import” residues, which are typically taken from an “import” variable domain. Humanization is basically based on winter and co-workers [Jones et al., Nature, 321: 522-525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332: 323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science, 239 : 1534-1536 (1988)] by replacing the rodent CDR or CDR sequence with the corresponding sequence of a human antibody. Thus, such “humanized” antibodies are chimeric antibodies (US Pat. No. 4,816,567) wherein substantially less than an intact human variable domain has been substituted with the corresponding sequence from a non-human species. In practice, humanized antibodies are typically human antibodies in which some CDR residues and possibly some FR residues are substituted by residues from analogous sites in rodent antibodies.

また、ヒト抗体は、ファージディスプレイライブラリー［Hoogenboom及びWinter, J. Mol. Biol., 227:381 (1992)；Marks等, J. Mol. Biol., 222:581 (1991)］を含むこの分野で知られた種々の方法を用いて作成することもできる。また、Cole等及びBoerner等の技術も、ヒトモノクローナル抗体の調製に利用することができる(Cole等, Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss. p.77(1985)及びBoerner等, J. Immunol., 147(1)：86-95(1991) ］。同様に、ヒト抗体はヒト免疫グロブリン座位をトランスジェニック動物、例えば内在性免疫グロブリン遺伝子は部分的又は完全に不活性化されたマウスに導入することにより産生することができる。投与の際に、遺伝子再配列、組立、及び抗体レパートリーを含むあらゆる観点においてヒトに見られるものに非常に類似しているヒト抗体の生産が観察される。このアプローチは、例えば米国特許第5,545,807号；同第5,545,806号；同第5,569,825号；同第5,625,126号；同第5,633,425号；同第5,661,016号、及び次の科学刊行物：Marks等, Bio/Technology 10, 779-783 (1992); Lonberg等, Nature 368 856-859 (1994); Morrison, Nature 368, 812-13 (1994); Fishwild等, Nature Biotechnology 14, 845-51 (1996); Neuberger, Nature Biotechnology 14, 826 (1996); Lonberg及びHuszar, Intern. Rev. Immunol. 13 65-93 (1995)に記載されている。
また、抗体は上述した既知の選択及び／又は突然変異誘発法を使用して、親和成熟させてもよい。好ましい親和成熟抗体は、成熟抗体が調製される(一般的にマウス、ヒト化又はヒトの)出発抗体よりも、５倍、より好ましくは１０倍、さらに好ましくは２０又は３０倍の親和性を有する。 Human antibodies also include phage display libraries [Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol., 227: 381 (1992); Marks et al., J. Mol. Biol., 222: 581 (1991)]. It can also be created using various methods known in Techniques such as Cole et al. And Boerner et al. Can also be used to prepare human monoclonal antibodies (Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss. P. 77 (1985) and Boerner et al., J. Immunol ., 147 (1): 86-95 (1991)] Similarly, human antibodies introduce human immunoglobulin loci into transgenic animals, eg, mice in which endogenous immunoglobulin genes have been partially or completely inactivated. Upon administration, human antibody production is observed that is very similar to that found in humans in all respects, including gene rearrangement, assembly, and antibody repertoire. Approaches include, for example, US Pat. Nos. 5,545,807; 5,545,806; 5,569,825; 5,625,126; 5,633,425; 5,661,016 and the following scientific publications: Marks et al., Bio / Technology 10, 779-783 (1992); Lonberg et al., Nat ure 368 856-859 (1994); Morrison, Nature 368, 812-13 (1994); Fishwild et al., Nature Biotechnology 14, 845-51 (1996); Neuberger, Nature Biotechnology 14, 826 (1996); Lonberg and Huszar, Intern. Rev. Immunol. 13 65-93 (1995).
The antibodies may also be affinity matured using the known selection and / or mutagenesis methods described above. Preferred affinity matured antibodies have a 5-fold, more preferably 10-fold, even more preferably 20 or 30-fold affinity over the starting antibody (generally mouse, humanized or human) from which the mature antibody is prepared. .

４．二重特異性抗体
二重特異性抗体は、少なくとも２つの異なる抗原に対して結合特異性を有するモノクローナル抗体、好ましくはヒトもしくはヒト化抗体である。本発明の場合において、結合特異性の一方はＰＲＯに対してであり、他方は任意の他の抗原、好ましくは細胞表面タンパク質又はレセプター又はレセプターサブユニットに対してである。
二重特異性抗体を作成する方法は当該技術分野において周知である。伝統的には、二重特異性抗体の組換え生産は、二つの重鎖が異なる特異性を持つ二つの免疫グロブリン重鎖／軽鎖対の同時発現に基づく［Milstein及びCuello, Nature, 305:537-539 (1983)］。免疫グロブリンの重鎖と軽鎖を無作為に取り揃えるため、これらハイブリドーマ(クアドローマ)は１０種の異なる抗体分子の潜在的混合物を生成し、その内一種のみが正しい二重特異性構造を有する。正しい分子の精製は、アフィニティークロマトグラフィー工程によって通常達成される。同様の手順が1993年5月13日公開のWO93/08829、及びTraunecker等, EMBO J.,10:3655-3656 (1991)に開示されている。
所望の結合特異性(抗体-抗原結合部位)を有する抗体可変ドメインを免疫グロブリン定常ドメイン配列に融合できる。融合は、好ましくは少なくともヒンジ部、ＣＨ２及びＣＨ３領域の一部を含む免疫グロブリン重鎖定常ドメインとのものである。少なくとも一つの融合には軽鎖結合に必要な部位を含む第一の重鎖定常領域(ＣＨ１)が存在することが望ましい。免疫グロブリン重鎖融合をコードするＤＮＡ、及び望むのであれば免疫グロブリン軽鎖を、別々の発現ベクターに挿入し、適当な宿主生物に同時形質移入する。二重特異性抗体を作成するための更なる詳細については、例えばSuresh等, Methods in Enzymology, 121:210(1986)を参照されたい。 4). Bispecific antibodies Bispecific antibodies are monoclonal antibodies, preferably human or humanized antibodies, that have binding specificities for at least two different antigens. In the present case, one of the binding specificities is for PRO and the other is for any other antigen, preferably a cell surface protein or receptor or receptor subunit.
Methods for making bispecific antibodies are well known in the art. Traditionally, recombinant production of bispecific antibodies is based on the co-expression of two immunoglobulin heavy / light chain pairs with different specificities of the two heavy chains [Milstein and Cuello, Nature, 305: 537-539 (1983)]. Because of the random assortment of immunoglobulin heavy and light chains, these hybridomas (quadromas) produce a potential mixture of 10 different antibody molecules, only one of which has the correct bispecific structure. Purification of the correct molecule is usually achieved by an affinity chromatography step. Similar procedures are disclosed in WO 93/08829 published May 13, 1993 and Traunecker et al., EMBO J., 10: 3655-3656 (1991).
Antibody variable domains with the desired binding specificities (antibody-antigen combining sites) can be fused to immunoglobulin constant domain sequences. The fusion preferably is with an immunoglobulin heavy chain constant domain, comprising at least part of the hinge, CH2, and CH3 regions. Desirably, at least one fusion has a first heavy chain constant region (CH1) containing the site necessary for light chain binding. The DNA encoding the immunoglobulin heavy chain fusion and, if desired, the immunoglobulin light chain are inserted into separate expression vectors and cotransfected into a suitable host organism. For further details of generating bispecific antibodies see, for example, Suresh et al., Methods in Enzymology, 121: 210 (1986).

WO96/27011に記載された他の方法によれば、一対の抗体分子間の界面を操作して組換え細胞培養から回収される異種二量体の割合を最大にすることができる。好適な界面は抗体定常ドメインのＣＨ３領域の少なくとも一部を含む。この方法では、第１抗体分子の界面からの一又は複数の小さいアミノ酸側鎖がより大きな側鎖(例えばチロシン又はトリプトファン)と置き換えられる。大きな側鎖と同じ又は類似のサイズの相補的「キャビティ」を、大きなアミノ酸側鎖を小さいもの(例えばアラニン又はスレオニン)と置き換えることにより第２の抗体分子の界面に作り出す。これにより、ホモダイマーのような不要の他の最終産物に対してヘテロダイマーの収量を増大させるメカニズムが提供される。
二重特異性抗体は、全長抗体又は抗体断片(例えば、Ｆ(ａｂ')２二重特異性抗体)として調製できる。抗体断片から二重特異性抗体を産生する技術もまた文献に記載されている。例えば、化学結合を使用して二重特異性抗体を調製することができる。Brennan等, Science, 229:81(1985) は無傷の抗体をタンパク分解的に切断してＦ(ａｂ')２断片を産生する手順を記述している。これらの断片は、ジチオール錯体形成剤亜砒酸ナトリウムの存在下で還元して近接ジチオールを安定化させ、分子間ジスルフィド形成を防止する。産生されたＦａｂ'断片はついでチオニトロベンゾアート(ＴＮＢ)誘導体に転換される。Ｆａｂ'-ＴＮＢ誘導体の一つをついでメルカプトエチルアミンでの還元によりＦａｂ'-チオールに再転換し、他のＦａｂ'-ＴＮＢ誘導体の等モル量と混合して二重特異性抗体を形成する。作られた二重特異性抗体は酵素の選択的固定化用の薬剤として使用することができる。
大腸菌からＦａｂ'断片を直接回収でき、これは化学的に結合して二重特異性抗体を形成することができる。Shalaby等, J. Exp. Med., 175:217-225 (1992)は完全にヒト化された二重特異性抗体Ｆ(ａｂ')２分子の製造を記述している。各Ｆａｂ'断片は大腸菌から別個に分泌され、インビトロで定方向化学共役を受けて二重特異性抗体を形成する。このようにして形成された二重特異性抗体は、正常なヒトＴ細胞及びＥｒｂＢ２レセプターを過剰発現する細胞に結合可能で、ヒト***腫瘍標的に対するヒト細胞障害性リンパ球の細胞溶解活性の誘因となる。 According to another method described in WO96 / 27011, the interface between a pair of antibody molecules can be manipulated to maximize the proportion of heterodimers recovered from recombinant cell culture. A suitable interface includes at least a portion of the CH3 region of an antibody constant domain. In this method, one or more small amino acid side chains from the interface of the first antibody molecule are replaced with larger side chains (eg tyrosine or tryptophan). A complementary “cavity” of the same or similar size as the large side chain is created at the interface of the second antibody molecule by replacing the large amino acid side chain with a small one (eg, alanine or threonine). This provides a mechanism to increase the yield of heterodimers over other unwanted end products such as homodimers.
Bispecific antibodies can be prepared as full length antibodies or antibody fragments (eg F (ab ′) 2 bispecific antibodies). Techniques for producing bispecific antibodies from antibody fragments have also been described in the literature. For example, bispecific antibodies can be prepared using chemical linkage. Brennan et al., Science, 229: 81 (1985) describes a procedure in which intact antibodies are proteolytically cleaved to produce F (ab ′) 2 fragments. These fragments are reduced in the presence of the dithiol complexing agent sodium arsenite to stabilize vicinal dithiols and prevent intermolecular disulfide formation. The produced Fab ′ fragment is then converted to a thionitrobenzoate (TNB) derivative. One of the Fab′-TNB derivatives is then reconverted to Fab′-thiol by reduction with mercaptoethylamine and mixed with an equimolar amount of other Fab′-TNB derivatives to form bispecific antibodies. The produced bispecific antibody can be used as a drug for selective immobilization of an enzyme.
Fab ′ fragments can be recovered directly from E. coli, which can be chemically coupled to form bispecific antibodies. Shalaby et al., J. Exp. Med., 175: 217-225 (1992) describes the production of two fully humanized bispecific antibody F (ab ′) molecules. Each Fab ′ fragment is secreted separately from E. coli and undergoes directed chemical coupling in vitro to form bispecific antibodies. The bispecific antibody thus formed is capable of binding to normal human T cells and cells overexpressing ErbB2 receptor, and induces cytolytic activity of human cytotoxic lymphocytes against human breast tumor targets. Become.

組換え細胞培養から直接的に二重特異性抗体断片を作成し分離する様々な方法もまた記述されている。例えば、二重特異性抗体はロイシンジッパーを使用して生産されている。Kostelnyら, J.Immunol. 148(5):1547-1553 (1992)。Ｆｏｓ及びＪｕｎタンパク質からのロイシンジッパーペプチドを遺伝子融合により二つの異なった抗体のＦａｂ'部分に結合させる。抗体ホモダイマーをヒンジ領域で還元してモノマーを形成し、ついで再酸化して抗体ヘテロダイマーを形成する。この方法はまた抗体ホモダイマーの生産に対して使用することができる。Hollingerら, Proc.Natl.Acad.Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)により記述された「ダイアボディ」技術は二重特異性抗体断片を作成する別のメカニズムを提供した。断片は、同一鎖上の２つのドメイン間の対形成を可能にするには十分に短いリンカーにより軽鎖可変ドメイン(ＶＬ)に重鎖可変ドメイン(ＶＨ)を結合してなる。従って、一つの断片のＶＨ及びＶＬドメインは他の断片の相補的ＶＬ及びＶＨドメインと強制的に対形成させられ、２つの抗原結合部位を形成する。単鎖Ｆｖ(ｓＦｖ)ダイマーの使用により二重特異性抗体断片を製造する他の方策もまた報告されている。Gruberら, J.Immunol. 152:5368 (1994)を参照されたい。
二価より多い抗体も考えられる。例えば、三重特異性抗体を調製することができる。Tuttら J.Immunol. 147:60(1991)。
例示的な二重特異性抗体は、ここに与えられたＰＲＯポリペプチドの２つの異なるエピトープに結合しうる。あるいは、抗-ＰＲＯポリペプチドのアームは、特定のＰＲＯポリペプチド発現細胞に細胞防御メカニズムを集中させるように、Ｔ細胞レセプター分子(例えばＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ２８、又はＢ７)等の白血球上のトリガー分子、又はＦｃγＲＩ(ＣＤ６４)、ＦｃγＲＩＩ(ＣＤ３２)及びＦｃγＲＩＩＩ(ＣＤ１６)等のＩｇＧ(ＦｃγＲ)に対するＦｃレセプターに結合するアームと結合しうる。また、二重特異性抗体は特定のＰＲＯポリペプチドを発現する細胞に細胞毒性薬を局在化させるためにも使用されうる。これらの抗体はＰＲＯ結合アーム及び細胞毒性薬又は放射性キレート化剤、例えばＥＯＴＵＢＥ、ＤＰＴＡ、ＤＯＴＡ、又はＴＥＴＡと結合するアームを有する。関心ある他の二重特異性抗体はＰＲＯポリペプチドに結合し、そしてさらに組織因子(ＴＦ)に結合する。 Various methods for making and isolating bispecific antibody fragments directly from recombinant cell culture have also been described. For example, bispecific antibodies have been produced using leucine zippers. Kostelny et al., J. Immunol. 148 (5): 1547-1553 (1992). Leucine zipper peptides from Fos and Jun proteins are linked to the Fab ′ portions of two different antibodies by gene fusion. Antibody homodimers are reduced at the hinge region to form monomers and then reoxidized to form antibody heterodimers. This method can also be used for the production of antibody homodimers. The “diabody” technique described by Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 6444-6448 (1993) provided an alternative mechanism for generating bispecific antibody fragments. A fragment consists of a heavy chain variable domain (V H ) linked to a light chain variable domain (V L ) by a linker that is short enough to allow pairing between two domains on the same chain. Thus, the V H and V L domains of one fragment are forced to pair with the complementary V L and V H domains of another fragment to form two antigen binding sites. Other strategies for producing bispecific antibody fragments by use of single chain Fv (sFv) dimers have also been reported. See Gruber et al., J. Immunol. 152: 5368 (1994).
More than bivalent antibodies are also contemplated. For example, trispecific antibodies can be prepared. Tutt et al. J. Immunol. 147: 60 (1991).
Exemplary bispecific antibodies can bind to two different epitopes of the PRO polypeptide provided herein. Alternatively, the anti-PRO polypeptide arm is a trigger molecule on leukocytes such as a T cell receptor molecule (eg, CD2, CD3, CD28, or B7) so as to focus the cytoprotective mechanism on specific PRO polypeptide expressing cells. Or an arm that binds to an Fc receptor for IgG (FcγR) such as FcγRI (CD64), FcγRII (CD32) and FcγRIII (CD16). Bispecific antibodies can also be used to localize cytotoxic agents to cells that express a particular PRO polypeptide. These antibodies have a PRO binding arm and an arm that binds to a cytotoxic or radiochelating agent such as EOTUBE, DPTA, DOTA, or TETA. Other bispecific antibodies of interest bind to the PRO polypeptide and further bind to tissue factor (TF).

５．ヘテロ抱合体抗体
ヘテロ抱合抗体もまた本発明の範囲に入る。ヘテロ抱合抗体は、２つの共有結合した抗体からなる。このような抗体は、例えば、免疫系細胞を不要な細胞に対してターゲティングさせるため［米国特許第4,676,980号］及びＨＩＶ感染の治療のために［WO 91/00360; WO 92/200373; EP 03089］提案されている。この抗体は、架橋剤に関連したものを含む合成タンパク化学における既知の方法を使用して、インビトロで調製することができると考えられる。例えば、ジスルフィド交換反応を使用するか又はチオエーテル結合を形成することにより、免疫毒素を作成することができる。この目的に対して好適な試薬の例には、イミノチオレート及びメチル-４-メルカプトブチリミデート、及び例えば米国特許第4,676,980号に開示されているものが含まれる。 5. Heteroconjugate antibodies Heteroconjugate antibodies are also within the scope of the present invention. A heteroconjugated antibody consists of two covalently bound antibodies. Such antibodies are used, for example, to target immune system cells to unwanted cells [US Pat. No. 4,676,980] and for the treatment of HIV infection [WO 91/00360; WO 92/200373; EP 03089]. Proposed. This antibody could be prepared in vitro using known methods in synthetic protein chemistry, including those related to crosslinkers. For example, immunotoxins can be made using a disulfide exchange reaction or by forming a thioether bond. Examples of suitable reagents for this purpose include iminothiolate and methyl-4-mercaptobutyrimidate and those disclosed, for example, in US Pat. No. 4,676,980.

６．エフェクター機能の加工
本発明の抗体をエフェクター機能について改変し、例えば癌治療における抗体の有効性を向上させるのが望ましい。例えば、システイン残基をＦｃ領域に導入し、それにより、この領域に鎖間ジスルフィド結合を形成させるようにしてもよい。そのようにして生成された同種二量体抗体は、向上した内部移行能力及び／又は増加した補体媒介細胞殺傷及び抗体-依存性細胞性細胞毒性(ＡＤＣＣ)を有しうる。Caron等, J. Exp. Med. 176: 1191-1195 (1992)及びShopes, J. Immunol. 148: 2918-2922 (1992)を参照。向上した抗腫瘍活性を持つ同種二量体抗体はまた、Wolff等, Cancer Research 53: 2560-2565 (1993)に記載されたような異種二官能性架橋を用いても調製しうる。あるいは、抗体は、２つのＦｃ領域を有するように加工して、それにより補体溶解及びＡＤＣＣ能力を向上させることもできる。Stevenson等, Anti-Cancer Drug Design 3: 219-230 (1989)を参照。 6). Processing of Effector Function It is desirable to modify the antibody of the present invention for effector function, for example to improve the effectiveness of the antibody in treating cancer. For example, a cysteine residue may be introduced into the Fc region, thereby forming an interchain disulfide bond in this region. Allogeneic dimeric antibodies so produced can have improved internalization ability and / or increased complement-mediated cell killing and antibody-dependent cellular cytotoxicity (ADCC). See Caron et al., J. Exp. Med. 176: 1191-1195 (1992) and Shopes, J. Immunol. 148: 2918-2922 (1992). Allogeneic dimeric antibodies with improved anti-tumor activity can also be prepared using heterobifunctional cross-linking as described in Wolff et al., Cancer Research 53: 2560-2565 (1993). Alternatively, the antibody can be engineered to have two Fc regions, thereby improving complement lysis and ADCC capabilities. See Stevenson et al., Anti-Cancer Drug Design 3: 219-230 (1989).

７．免疫複合体
本発明はまた、化学治療薬、毒素(例えば、細菌、真菌、植物又は動物由来の酵素活性毒素、又はその断片)などの細胞毒性薬、あるいは放射性同位体(即ち、放射性抱合)に抱合された抗体を含む免疫複合体にも関する。
このような免疫複合体の生成に有用な化学治療薬は上記した。用いることのできる酵素活性毒素及びその断片は、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合活性断片、(緑膿菌からの)外毒素Ａ鎖、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデクシン(modeccin)Ａ鎖、α-サルシン、アレウリテス・フォーディ(Aleurites fordii)タンパク質、ジアンチン(dianthin)タンパク質、フィトラカ・アメリカーナ(Phytolaca americana)タンパク質(ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ、及びＰＡＰ-Ｓ)、モモルディカ・チャランチア(momordica charantia)インヒビター、クルシン(curcin)、クロチン(crotin)、サパオナリア・オフィシナリス(sapaonaria officinalis)インヒビター、ゲロニン(gelonin)、マイトゲリン(mitogellin)、レストリクトシン(restrictocin)、フェノマイシン(phenomycin)、エノマイシン(enomycin)及びトリコテセン(tricothecene)を含む。様々な放射性ヌクレオチドが放射性抱合抗体の生成に利用可能である。例として、２１２Ｂｉ、１３１Ｉ、１３１Ｉｎ、９０Ｙ及び１８６Ｒｅを含む。抗体及び細胞毒性薬の複合体は、種々の二官能性タンパク質カップリング剤、例えば、Ｎ-スクシンイミジル-３-(２-ピリジルジチオール)プロピオネート(ＳＰＤＰ)、イミノチオラン(ＩＴ)、イミドエステルの二官能性誘導体(ジメチルアジピミデートＨＣＬ等)、活性エステル(ジスクシンイミジルスベレート等)、アルデヒド(グルタルアルデヒド等)、ビス-アジド化合物(ビス(ｐ-アジドベンゾイル)ヘキサンジアミン等)、ビス-ジアゾニウム誘導体(ビス-(ｐ-ジアゾニウムベンゾイル)-エチレンジアミン等)、ジイソシアネート(トリエン２，６-ジイソシアネート等)、及びビス-活性フッ素化合物(１，５-ジフルオロ-２，４-ジニトロベンゼン等)を用いて作成できる。例えば、リシン免疫毒素は、Vitetta等, Science 238: 1098 (1987)に記載されたように調製することができる。カーボン-１４-標識１--イソチオシアナトベンジル-３-メチルジエチレントリアミン五酢酸(ＭＸ-ＤＴＰＡ)は、放射性ヌクレオチドの抗体への抱合のためのキレート剤の例である。WO 94/11026参照。
他の実施態様では、腫瘍の予備標的化で使用するために、抗体は「レセプター」(ストレプトアビジン等)に抱合されてもよく、抗体-レセプター複合体は患者に投与され、次いで清澄化剤を用いて未結合複合体を循環から除去し、次に細胞毒性薬(例えば、放射性ヌクレオチド等)に抱合された「リガンド」(アビジン等)を投与する。 7). Immunoconjugates The invention also relates to chemotherapeutic agents, cytotoxic agents such as toxins (e.g., enzymatically active toxins from bacteria, fungi, plants or animals, or fragments thereof), or radioisotopes (i.e., radioconjugates). It also relates to an immune complex comprising a conjugated antibody.
Chemotherapeutic agents useful for the generation of such immune complexes have been described above. Enzyme-active toxins and fragments thereof that can be used include diphtheria A chain, non-binding active fragment of diphtheria toxin, exotoxin A chain (from Pseudomonas aeruginosa), ricin A chain, abrin A chain, modeccin A chain , Α-sarcin, Aleurites fordii protein, dianthin protein, Phytolaca americana protein (PAPI, PAPII, and PAP-S), momordica charantia inhibitor, crusin (curcin), crotin, sapaonaria officinalis inhibitor, gelonin, mitogellin, restrictocin, phenomycin, enomycin and trichothecene )including. A variety of radioactive nucleotides are available for the production of radioconjugated antibodies. Examples include 212Bi, 131I, 131In, 90Y, and 186Re. The conjugates of antibodies and cytotoxic agents are various bifunctional protein coupling agents such as N-succinimidyl-3- (2-pyridyldithiol) propionate (SPDP), iminothiolane (IT), imidoester bifunctional Derivatives (such as dimethyl adipimidate HCL), active esters (such as disuccinimidyl suberate), aldehydes (such as glutaraldehyde), bis-azide compounds (such as bis (p-azidobenzoyl) hexanediamine), bis-diazonium Using derivatives (such as bis- (p-diazonium benzoyl) -ethylenediamine), diisocyanates (such as triene 2,6-diisocyanate), and bis-active fluorine compounds (such as 1,5-difluoro-2,4-dinitrobenzene) Can be created. For example, a ricin immunotoxin can be prepared as described in Vitetta et al., Science 238: 1098 (1987). Carbon-14-labeled 1-isothiocyanatobenzyl-3-methyldiethylenetriaminepentaacetic acid (MX-DTPA) is an example of a chelating agent for conjugation of radionucleotide to an antibody. See WO 94/11026.
In other embodiments, the antibody may be conjugated to a “receptor” (such as streptavidin) for use in tumor pre-targeting, the antibody-receptor complex is administered to the patient, and then a clarifier is applied. Used to remove unbound complexes from the circulation, followed by administration of a “ligand” (eg, avidin) conjugated to a cytotoxic agent (eg, a radionucleotide, etc.).

８．免疫リポソーム
また、ここに開示する抗体は、免疫リポソームとして調製してもよい。抗体を含むリポソームは、Epstein等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82: 3688 (1985); Hwang等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77: 4030 (1980); 及び米国特許第4,485,045号及び第4,544,545号に記載されたような、この分野で知られた方法で調製される。向上した循環時間を持つリポソームは、米国特許第5,013,556号に開示されている。
特に有用なリポソームは、ホスファチジルコリン、コレステロール及びＰＥＧ-誘導ホスファチジルエタノールアミン(ＰＥＧ-ＰＥ)を含む脂質組成物での逆相蒸発法によって生成される。リポソームは、所定サイズのフィルターを通して押し出され、所望の径を有するリポソームが生成される。本発明の抗体のＦａｂ’断片は、Martin等, J. Biol. Chem. 257: 286-288 (1982)に記載されているように、ジスルフィド交換反応を介してリポソームに抱合され得る。化学治療薬(ドキソルビシン等)は、場合によってはリポソーム内に包含される。Gabizon等, J. National Cancer Inst. 81(19) 1484 (1989)参照。 8). Immunoliposomes The antibodies disclosed herein may also be prepared as immunoliposomes. Liposomes containing antibodies are described in Epstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82: 3688 (1985); Hwang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77: 4030 (1980); Prepared by methods known in the art, such as described in 4,485,045 and 4,544,545. Liposomes with improved circulation time are disclosed in US Pat. No. 5,013,556.
Particularly useful liposomes are generated by the reverse phase evaporation method with a lipid composition comprising phosphatidylcholine, cholesterol and PEG-derivatized phosphatidylethanolamine (PEG-PE). Liposomes are extruded through a filter of a predetermined size to produce liposomes having a desired diameter. Fab ′ fragments of antibodies of the invention can be conjugated to liposomes via a disulfide exchange reaction as described in Martin et al., J. Biol. Chem. 257: 286-288 (1982). A chemotherapeutic agent (such as doxorubicin) is optionally contained within the liposome. See Gabizon et al., J. National Cancer Inst. 81 (19) 1484 (1989).

９．抗体の製薬組成物
ここで同定されるＰＲＯポリペプチドに特異的に結合する抗体、並びに上記に開示したスクリーニングアッセイで同定された他の分子は、種々の疾患の治療のために、製薬組成物の形態で投与することができる。
ＰＲＯポリペプチドが細胞内であり、全抗体が阻害剤として用いられる場合、内在化抗体が好ましい。しかし、リポフェクション又はリポソームも抗体、又は抗体断片を細胞に導入するのに使用できる。抗体断片が用いられる場合、標的タンパク質の結合ドメインに特異的に結合する最小阻害断片が好ましい。例えば、抗体の可変領域配列に基づいて、標的タンパク質配列に結合する能力を保持したペプチド分子が設計できる。このようなペプチドは、化学的に合成でき、及び／又は組換えＤＮＡ技術によって生成できる。例えば、Marasco等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 7889-7893 (1993)参照。ここでの製剤は、治療すべき特定の徴候に必要な場合に１以上の活性化合物、好ましくは互いに悪影響を及ぼさない相補的活性を持つものも含んでよい。あるいは、又はそれに加えて、組成物は、細胞毒性薬、サイトカイン、化学治療薬又は成長阻害剤を含んでもよい。これらの分子は、適切には、意図する目的に有効な量の組み合わせで存在する。
また、活性成分は、例えばコアセルベーション技術により又は界面重合により調製されたマイクロカプセル、例えば、各々ヒドロキシメチルセルロース又はゼラチン-マイクロカプセル及びポリ(メタクリル酸メチル)マイクロカプセル中、コロイド状薬物送達系(例えば、リポソーム、アルブミン小球、マイクロエマルション、ナノ粒子及びナノカプセル)中、又はマイクロエマルション中に包括されていてもよい。これらの技術は上掲のRemington's Pharmaceutical Scienceに開示されている。 9. Antibody Pharmaceutical Compositions Antibodies that specifically bind to the PRO polypeptides identified herein, as well as other molecules identified in the screening assays disclosed above, are useful for the treatment of various diseases. It can be administered in the form.
When the PRO polypeptide is intracellular and the whole antibody is used as an inhibitor, an internalizing antibody is preferred. However, lipofection or liposomes can also be used to introduce antibodies, or antibody fragments, into cells. Where antibody fragments are used, the smallest inhibitory fragment that specifically binds to the binding domain of the target protein is preferred. For example, peptide molecules that retain the ability to bind to a target protein sequence can be designed based on the variable region sequence of the antibody. Such peptides can be synthesized chemically and / or produced by recombinant DNA techniques. See, for example, Marasco et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 7889-7893 (1993). The formulations herein may also contain more than one active compound as necessary for the particular indication being treated, preferably those with complementary activities that do not adversely affect each other. Alternatively or in addition, the composition may comprise a cytotoxic agent, cytokine, chemotherapeutic agent or growth inhibitory agent. These molecules are suitably present in combination in amounts that are effective for the purpose intended.
The active ingredient can also be used in colloidal drug delivery systems (e.g. , Liposomes, albumin globules, microemulsions, nanoparticles and nanocapsules) or microemulsions. These techniques are disclosed in Remington's Pharmaceutical Science, supra.

インビボ投与に使用される製剤は無菌でなけらばならない。これは、滅菌濾過膜を通した濾過により容易に達成される。
徐放性製剤を調製してもよい。徐放性製剤の好適な例は、抗体を含有する固体疎水性ポリマーの半透性マトリクスを含み、このマトリクスは成形された物品、例えばフィルム、又はマイクロカプセルの形状である。除放性マトリクスの例は、ポリエステル、ヒドロゲル(例えば、ポリ(２-ヒドロキシエチル-メタクリレート)、又はポリ(ビニルアルコール))、ポリアクチド(米国特許第3,773,919号)、Ｌ-グルタミン酸及びγ-エチル-Ｌ-グルタメートのコポリマー、非分解性エチレン-酢酸ビニル、LUPRON DEPOTＴＭ(乳酸-グリコール酸コポリマーと酢酸リュープロリドの注射可能な小球)などの分解性乳酸-グリコール酸コポリマー、及びポリ-Ｄ-(-)-３-ヒドロキシブチル酸を含む。エチレン-酢酸ビニル及び乳酸-グリコール酸などのポリマーは分子を１００日に渡って放出することができるが、ある種のヒドロゲルはより短時間でタンパク質を放出してしまう。カプセル化された抗体が身体内に長時間残ると、それらは３７℃の水分に露出されることにより変性又は凝集し、その結果、生物学的活性の低下及び起こりうる免疫原性の変化をもたらす。合理的な方法は、含まれる機構に依存する安定化について工夫することができる。例えば、凝集機構がチオ−ジスルフィド交換を通した分子間Ｓ−Ｓ結合形成であると発見された場合、安定化はスルフヒドリル残基の修飾、酸性溶液からの凍結乾燥、水分含有量の制御、適切な添加剤の付加、及び特異的ポリマーマトリクス組成物の開発によって達成されうる。 The formulation used for in vivo administration must be sterile. This is easily accomplished by filtration through sterile filtration membranes.
Sustained release formulations may be prepared. Suitable examples of sustained release formulations include a semi-permeable matrix of solid hydrophobic polymer containing antibodies, which matrix is in the form of a molded article, such as a film or microcapsule. Examples of sustained release matrices include polyesters, hydrogels (eg, poly (2-hydroxyethyl-methacrylate) or poly (vinyl alcohol)), polyactides (US Pat. No. 3,773,919), L-glutamic acid and γ-ethyl-L -Degradable lactic acid-glycolic acid copolymers such as glutamate copolymers, non-degradable ethylene-vinyl acetate, LUPRON DEPOT ™ (injectable globules of lactic acid-glycolic acid copolymer and leuprolide acetate), and poly-D-(-) Contains -3-hydroxybutyric acid. While polymers such as ethylene-vinyl acetate and lactic acid-glycolic acid can release molecules for over 100 days, certain hydrogels release proteins in a shorter time. When encapsulated antibodies remain in the body for a long time, they denature or aggregate upon exposure to moisture at 37 ° C, resulting in reduced biological activity and possible changes in immunogenicity. . Reasonable methods can be devised for stabilization depending on the mechanism involved. For example, if the aggregation mechanism is found to be intermolecular S—S bond formation through thio-disulfide exchange, stabilization may include modification of sulfhydryl residues, lyophilization from acidic solutions, control of water content, appropriate Addition of various additives and the development of specific polymer matrix compositions.

Ｇ．抗-ＰＲＯ抗体の用途
本発明の抗-ＰＲＯ抗体は様々な有用性を有している。例えば、抗-ＰＲＯ抗体は、ＰＲＯの診断アッセイ、例えばその特定細胞、組織、又は血清での発現の検出に用いられる。競合的結合アッセイ、直接又は間接サンドウィッチアッセイ及び不均一又は均一相で行われる免疫沈降アッセイ［Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, CRC Press, Inc. (1987) pp. 147-158］等のこの分野で知られた種々の診断アッセイ技術が使用される。診断アッセイで用いられる抗体は、検出可能な部位で標識される。検出可能な部位は、直接又は間接に、検出可能なシグナルを発生しなければならない。例えば、検出可能な部位は、３Ｈ、１４Ｃ、３２Ｐ、３５Ｓ又は１２５Ｉ等の放射性同位体、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン又はルシフェリン等の蛍光又は化学発光化合物、あるいはアルカリホスファターゼ、ベータ-ガラクトシダーゼ又はセイヨウワサビペルオキシダーゼ等の酵素であってよい。抗体に検出可能な部位を抱合させるためにこの分野で知られた任意の方法が用いられ、それにはHunter等 Nature, 144:945 (1962)；David等, Biochemistry, 13: 1014 (1974)；Pain等, J. Immunol. Meth., 40:219 (1981) ;及びNygren, J. Histochem. and Cytochem., 30:407 (1982)に記載された方法が含まれる。
また、抗-ＰＲＯ抗体は組換え細胞培養又は天然供給源からのＰＲＯのアフィニティー精製にも有用である。この方法においては、ＰＲＯに対する抗体を、当該分野でよく知られている方法を使用して、セファデックス樹脂や濾紙のような適当な支持体に固定化する。次に、固定化された抗体を、精製するＰＲＯを含む試料と接触させた後、固定化された抗体に結合したＰＲＯ以外の試料中の物質を実質的に全て除去する適当な溶媒で支持体を洗浄する。最後に、ＰＲＯを抗体から脱離させる他の適当な溶媒で支持体を洗浄する。
以下の実施例は例示目的でのみ提供されるものであって、本発明の範囲を決して限定することを意図するものではない。
本明細書で引用した全ての特許及び参考文献の全体を、出典明示によりここに取り込む。 G. Uses of anti-PRO antibodies The anti-PRO antibodies of the present invention have various utilities. For example, anti-PRO antibodies are used in PRO diagnostic assays, such as detecting its expression in specific cells, tissues, or serum. Competitive binding assays, direct or indirect sandwich assays, and immunoprecipitation assays performed in heterogeneous or homogeneous phases [Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, CRC Press, Inc. (1987) pp. 147-158] Various diagnostic assay techniques known in the art are used. Antibodies used in diagnostic assays are labeled with a detectable moiety. The detectable site must generate a detectable signal, either directly or indirectly. For example, the detectable site is a radioisotope such as 3H, 14C, 32P, 35S or 125I, a fluorescent or chemiluminescent compound such as fluorescein isothiocyanate, rhodamine or luciferin, or alkaline phosphatase, beta-galactosidase or horseradish peroxidase, etc. The enzyme may be Any method known in the art can be used to conjugate the detectable site to the antibody, including Hunter et al. Nature, 144: 945 (1962); David et al., Biochemistry, 13: 1014 (1974); Pain Et al., J. Immunol. Meth., 40: 219 (1981); and Nygren, J. Histochem. And Cytochem., 30: 407 (1982).
Anti-PRO antibodies are also useful for affinity purification of PRO from recombinant cell culture or natural sources. In this method, the antibody against PRO is immobilized on a suitable support such as Sephadex resin or filter paper using methods well known in the art. Next, after the immobilized antibody is brought into contact with a sample containing PRO to be purified, the support is supported with an appropriate solvent that removes substantially all substances in the sample other than PRO bound to the immobilized antibody. Wash. Finally, the support is washed with another suitable solvent that will release PRO from the antibody.
The following examples are provided for illustrative purposes only, and are not intended to limit the scope of the invention in any way.
All patents and references cited herein are hereby incorporated by reference in their entirety.

(実施例)
実施例で言及されている全ての市販試薬は、特に示さない限りは製造者の使用説明に従い使用した。ＡＴＣＣ登録番号により以下の実施例及び明細書全体を通して同定されている細胞の供給源はバージニア州マナッサスのアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションである。 (Example)
All commercially available reagents referred to in the examples were used according to manufacturer's instructions unless otherwise indicated. The source of cells identified by the ATCC registration number throughout the following examples and specification is the American Type Culture Collection, Manassas, Virginia.

実施例１：新規なポリペプチド及びそれをコードするｃＤＮＡを同定するための細胞外ドメイン相同性スクリーニング
Swiss-Prot公的データベースからの約９５０の既知の分泌タンパク質からの細胞外ドメイン(ＥＣＤ)配列(あれば、分泌シグナル配列を含む)を、ＥＳＴデータベースの検索に使用した。ＥＳＴデータベースは、公的データベース(例えば、Dayhoff、GenBank)及び企業のデータベース(例えば、LIFESEQＴＭ、Incyte Pharmaceuticals、Palo Alto, CA)を含む。検索は、コンピュータプログラムBLAST又はBLAST-2(Altschul等, Methods in Enzymology 266: 460-480 (1996))を用いて、ＥＣＤタンパク質配列のＥＳＴ配列の６フレーム翻訳との比較として実施した。既知のタンパク質をコードせず、BLASTスコア７０(９０の場合もある)又はそれ以上を持つ比較物は、プログラム「phrap」(Phil Green, University of Washington, Seattle, WA)で集団化してコンセンサスＤＮＡ配列に構築した。
この細胞外ドメイン相同性スクリーニングを用いて、phrapを用いて他の同定されたＥＳＴ配列に対してコンセンサスＤＮＡ配列を構築した。さらに、得られたコンセンサスＤＮＡ配列を、しばしば(常にではない)BLAST又はBLAST-2及びphrapの繰り返しサイクルを用いて伸長し、コンセンサス配列を上で議論したＥＳＴ配列の供給源を用いて可能な限り伸長させた。
上記のように得られたコンセンサス配列に基づいて、オリゴヌクレオチドをついで合成し、ＰＣＲにより関心ある配列を含むｃＤＮＡライブラリーを同定するため、及びＰＲＯポリペプチドの全長コード配列のクローンを単離するプローブとして用いるために使用した。正方向及び逆方向ＰＣＲプライマーは一般的に２０から３０ヌクレオチドの範囲であり、しばしば約１００-１０００ｂｐ長のＰＣＲ産物を与えるために設計される。プローブ配列は、典型的に４０-５５ｂｐ長である。或る場合には、コンセンサス配列が約１−１．５ｋｂｐより大きいときに付加的なオリゴヌクレオチドが合成される。全長クローンについて幾つかのライブラリーをスクリーニングするために、ライブラリーからのＤＮＡを、Ausubel等, Current Protocols in Molecular Biologyに従って、ＰＣＲプライマー対でのＰＣＲによりスクリーニングした。ポジティブライブラリーを、次いで、プローブオリゴヌクレオチド及びプライマー対の一方を用いて関心ある遺伝子をコードするクローンの単離に使用した。
ｃＤＮＡクローンの単離に用いたｃＤＮＡライブラリーは、Invitrogen, San Diego, CAからのもの等の市販試薬を用いて標準的な方法によって作成した。ｃＤＮＡは、ＮｏｔＩ部位を含むオリゴｄＴでプライムし、平滑末端でＳａｌＩヘミキナーゼアダプターに結合させ、ＮｏｔＩで切断し、ゲル電気泳動で適切にサイズ分類し、そして適切なクローニングベクター(ｐＲＫ５Ｂ又はｐＲＫ５Ｄ等；ｐＲＫ５ＢはＳｆｉＩ部位を含まないｐＲＫ５Ｄの前駆体である；Holmes等, Science, 253: 1278-1280 (1991)参照)に、独特のＸｈｏＩ及びＮｏｔＩ部位において、所定の方向でクローニングした。 Example 1: Extracellular domain homology screening to identify novel polypeptides and cDNAs encoding them
Extracellular domain (ECD) sequences (including secreted signal sequences, if any) from about 950 known secreted proteins from the Swiss-Prot public database were used to search the EST database. EST databases include public databases (eg, Dayhoff, GenBank) and corporate databases (eg, LIFESEQ ™ , Incyte Pharmaceuticals, Palo Alto, CA). The search was performed using the computer program BLAST or BLAST-2 (Altschul et al., Methods in Enzymology 266: 460-480 (1996)) as a comparison of the ECD protein sequence with a 6-frame translation of the EST sequence. Comparisons that do not encode known proteins and have a BLAST score of 70 (possibly 90) or higher can be grouped with the program “phrap” (Phil Green, University of Washington, Seattle, WA) and consensus DNA sequences Built in.
Using this extracellular domain homology screen, consensus DNA sequences were constructed against other identified EST sequences using phrap. Furthermore, the resulting consensus DNA sequence is often (but not always) extended using BLAST or BLAST-2 and phrap repetitive cycles, and the consensus sequence is as long as possible using the sources of EST sequences discussed above. Elongated.
Probes for subsequently synthesizing oligonucleotides based on the consensus sequence obtained as described above, identifying a cDNA library containing the sequence of interest by PCR, and isolating a full-length coding sequence clone of the PRO polypeptide Used for use as. Forward and reverse PCR primers generally range from 20 to 30 nucleotides and are often designed to give PCR products that are about 100-1000 bp long. The probe sequence is typically 40-55 bp long. In some cases, additional oligonucleotides are synthesized when the consensus sequence is greater than about 1-1.5 kbp. To screen several libraries for full-length clones, DNA from the libraries was screened by PCR with PCR primer pairs according to Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology. The positive library was then used to isolate clones encoding the gene of interest using one of the probe oligonucleotides and primer pairs.
The cDNA library used to isolate the cDNA clones was made by standard methods using commercially available reagents such as those from Invitrogen, San Diego, CA. The cDNA is primed with oligo dT containing a NotI site, ligated to a SalI hemikinase adapter with blunt ends, cut with NotI, appropriately sized by gel electrophoresis, and an appropriate cloning vector (such as pRK5B or pRK5D; pRK5B is a precursor of pRK5D that does not contain an SfiI site; see Holmes et al., Science, 253: 1278-1280 (1991)), cloned in the defined orientation at unique XhoI and NotI sites.

実施例２：アミラーゼスクリーニングによるｃＤＮＡクローンの単離
１．オリゴｄＴプライムｃＤＮＡライブラリーの調製
ｍＲＮＡを関心あるヒト組織からInvitrogen, San Diego, CAからの試薬及びプロトコールを用いて単離した(Fast Track 2)。このＲＮＡを、Life Technologies, Gaithersburg, MD (Super Script Plasmid System)からの試薬及びプロトコールを用いるベクターｐＲＫ５ＤにおけるオリゴｄＴプライムしたｃＤＮＡの生成に使用した。この方法において、二本鎖ｃＤＮＡは１０００ｂｐを越えるサイズ分類し、ＳａｌＩ／ＮｏｔＩ結合ｃＤＮＡをＸｈｏＩ／ＮｏｔＩ切断ベクターにクローニングした。ｐＲＫ５Ｄを、ｓｐ６転写開始部位、それに続くＳｆｉＩ制限酵素部位、さらにＸｈｏＩ／ＮｏｔＩｃＤＮＡクローニング部位を持つベクターにクローニングした。 Example 2: Isolation of cDNA clones by amylase screening Preparation of oligo dT primed cDNA library mRNA was isolated from human tissues of interest using reagents and protocols from Invitrogen, San Diego, CA (Fast Track 2). This RNA was used to generate oligo dT primed cDNA in vector pRK5D using reagents and protocols from Life Technologies, Gaithersburg, MD (Super Script Plasmid System). In this method, double stranded cDNA was classified in size exceeding 1000 bp, and SalI / NotI binding cDNA was cloned into an XhoI / NotI digested vector. pRK5D was cloned into a vector with an sp6 transcription initiation site followed by an SfiI restriction enzyme site, followed by an XhoI / NotI cDNA cloning site.

２．ランダムプライムｃＤＮＡライブラリーの調製
一次ｃＤＮＡクローンの５’末端を好ましく表現するために二次ｃＤＮＡライブラリーを作成した。Ｓｐ６ＲＮＡを(上記の)一次ライブラリーから生成し、このＲＮＡを、ベクターｐＳＳＴ-ＡＭＹ．０におけるLife Technologies (上で参照したSuper Script Plasmid System)からの試薬及びプロトコールを用いたランダムプライムしたｃＤＮＡライブラリーの生成に使用した。この方法において、二本鎖ｃＤＮＡを５００-１０００ｂｐにサイズ分類し、平滑末端でＮｏｔＩアダプターに結合させ、ＳｆｉＩ部位で切断し、そしてＳｆｉＩ／ＮｏｔＩ切断ベクターにクローニングした。ｐＳＳＴ-ＡＭＹ．０は、ｃＤＮＡクローニング部位の前に酵母アルコールデヒドロゲナーゼプロモータ、及びクローニング部位の後にマウスアミラーゼ配列(分泌シグナルを持たない成熟配列)に次いで酵母アルコールデヒドロゲナーゼ転写終結区を有するクローニングベクターである。よって、アミラーゼ配列でフレームに融合するこのベクターにクローニングされたｃＤＮＡは、適当に形質移入された酵母コロニーからのアミラーゼの分泌を導く。 2. Preparation of Random Primed cDNA Library A secondary cDNA library was created to favorably express the 5 ′ end of the primary cDNA clone. Sp6 RNA was generated from the primary library (described above) and this RNA was ligated into the vector pSST-AMY. Used to generate a randomly primed cDNA library using reagents and protocols from Life Technologies at 0 (Super Script Plasmid System referenced above). In this method, double-stranded cDNA was sized to 500-1000 bp, ligated to a NotI adapter with blunt ends, cut at the SfiI site, and cloned into an SfiI / NotI cut vector. pSST-AMY. 0 is a cloning vector having a yeast alcohol dehydrogenase promoter before the cDNA cloning site and a mouse amylase sequence (mature sequence without a secretion signal) after the cloning site followed by a yeast alcohol dehydrogenase transcription termination region. Thus, cDNA cloned into this vector fused in frame with the amylase sequence leads to secretion of amylase from appropriately transfected yeast colonies.

３．形質転換及び検出
上記の段落２に記載したライブラリーからのＤＮＡを氷上で冷却し、それにエレクトロコンピテントＤＨ１０Ｂ細菌(Life Technoligies、２０ｍｌ)を添加した。細菌及びベクターの混合物は、次いで製造者に推奨されているように電気穿孔した。次いで、ＳＯＣ培地(Life Technplogies、１ｍｌ)を添加し、この混合物を３７℃で３０分間インキュベートした。形質転換体は、次いでアンピシリンを含む２０標準１５０ｍｍＬＢプレートに蒔き、１６時間インキュベートした(３７℃)。ポジティブコロニーをプレートから廃棄し、細菌ペレットから標準的な方法、例えばＣｓＣｌ-勾配を用いてＤＮＡを単離した。精製ＤＮＡは、次いで以下の酵母プロトコールにのせた。
酵母方法は３つの範疇に分けられる：(１)酵母のプラスミド／ｃＤＮＡ結合ベクターでの形質転換；(２)アミラーゼを分泌する酵母クローンの検出及び単離；及び(３)酵母コロニーから直接的な挿入物のＰＣＲ増幅及び配列決定及びさらなる分析のためのＤＮＡの精製。
用いた酵母菌株はＨＤ５６-５Ａ(ATCC-90785)であった。この株は以下の遺伝子型：ＭＡＴα、ｕｒａ３-５２、ｌｅｕ２-３、ｌｅｕ２-１１２、ｈｉｓ３-１１、ｈｉｓ３-１５、ＭＡＬ＋、ＳＵＣ＋、ＧＡＬ＋を有する。好ましくは、不完全な翻訳後経路を持つ酵母変異体を用いることができる。このような変異体は、ｓｅｃ７１、ｓｅｃ７２、ｓｅｃ６２に転位不全対立遺伝子を持つが、切断されたｓｅｃ７１が最も好ましい。あるいは、これらの遺伝子の正常な操作を阻害するアンタゴニスト(アンチセンスヌクレオチド及び／又はリガンドを含む)、この翻訳後経路に含まれる他のタンパク質(例えば、ＳＥＣ６１ｐ、ＳＥＣ７２ｐ、ＳＥＣ６２ｐ、ＳＥＣ６３ｐ、ＴＤＪ１ｐ又はＳＳＡ１ｐ-４ｐ)又はこれらのタンパク質の複合体形成も、アミラーゼ発現酵母と組み合わせて好ましく用いられる。
形質転換は、Gietz等, Nucl. Acid. Res., 20: 1425 (1992)に概略が記されたプロトコールに基づいて実施された。形質転換細胞は、次いで寒天からＹＥＰＤ複合培地ブロス(１００ｍｌ)に播種し、３０℃で終夜成長させた。ＹＥＰＤブロスは、Kaiser等, Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY, p. 207 (1994)に記載されているように調製した。終夜培地は、次いで新鮮なＹＥＰＤブロス(５００ｍｌ)中におよそ２ｘ１０６細胞／ｍｌ(約ＯＤ６００＝０．１)に希釈し、１ｘ１０７細胞／ｍｌ(約ＯＤ６００＝０．４-０．５)まで再成長させた。 3. Transformation and detection DNA from the library described in paragraph 2 above was chilled on ice, to which electrocompetent DH10B bacteria (Life Technologies, 20 ml) were added. The bacteria and vector mixture was then electroporated as recommended by the manufacturer. SOC media (Life Technplogies, 1 ml) was then added and the mixture was incubated at 37 ° C. for 30 minutes. Transformants were then plated on 20 standard 150 mm LB plates containing ampicillin and incubated for 16 hours (37 ° C.). Positive colonies were discarded from the plates and DNA was isolated from bacterial pellets using standard methods such as a CsCl-gradient. The purified DNA was then subjected to the following yeast protocol.
Yeast methods are divided into three categories: (1) transformation with yeast plasmid / cDNA binding vectors; (2) detection and isolation of yeast clones secreting amylase; and (3) direct from yeast colonies. PCR amplification and sequencing of the insert and DNA purification for further analysis.
The yeast strain used was HD56-5A (ATCC-90785). This strain has the following genotypes: MATα, ura3-52, leu2-3, leu2-112, his3-11, his3-15, MAL +, SUC +, GAL +. Preferably, yeast mutants with incomplete post-translational pathways can be used. Such mutants have transpositional deficient alleles at sec71, sec72, and sec62, with truncated sec71 being most preferred. Alternatively, antagonists (including antisense nucleotides and / or ligands) that inhibit the normal manipulation of these genes, other proteins involved in this post-translational pathway (eg, SEC61p, SEC72p, SEC62p, SEC63p, TDJ1p or SSA1p− 4p) or complex formation of these proteins is also preferably used in combination with amylase-expressing yeast.
Transformation was performed based on the protocol outlined in Gietz et al., Nucl. Acid. Res., 20: 1425 (1992). The transformed cells were then seeded from agar into YEPD complex medium broth (100 ml) and grown overnight at 30 ° C. YEPD broth was prepared as described in Kaiser et al., Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY, p. 207 (1994). The overnight medium is then diluted to approximately 2 × 10 6 cells / ml (approximately OD600 = 0.1) in fresh YEPD broth (500 ml) and regrown to 1 × 10 7 cells / ml (approximately OD600 = 0.4-0.5). I let you.

次いで細胞を収穫し、5,000rpmで５分間のSorval GS3 ローターのＧＳ３ローターボトルに移し、上清を捨て、次いで無菌水に再懸濁することにより形質転換のために調製し、そして５０ｍｌのファルコン管内で、Beckman GS-6KR遠心機において3,500rpmで再度遠心分離した。上清を捨て、細胞をＬｉＡｃ／ＴＥ(10ml, 10mMのトリス-HCl, 1mMのEDTA pH7.5, 100mMのＬｉ２ＯＯＣＣＨ３)で続けて洗浄し、ＬｉＡｃ／ＴＥ(2.5ml)中に再懸濁させた。
形質転換は、マイクロチューブ内で、調製した細胞(100μl)を新鮮な変性一本鎖サケ***ＤＮＡ(Lofstrand Labs, Gaitherburg, MD)及び形質転換ＤＮＡ(1μg vol.＜10μl)と混合することにより起こした。混合物はボルテックスにより簡単に混合し、次いで40%ＰＥＧ／ＴＥ(600μl, 40%のポリエチレングリコール-４０００, 10mMのトリス-HCl, 1mMのEDTA, 100mMのLi２OOCCH３, pH 7.5)を添加した。この混合物を緩く撹拌し、３０分間撹拌しながら３０℃でインキュベートした。次いで細胞に４２℃で１５分間熱衝撃を与え、反応容器をミクロチューブ内で12,000rpmで5-10秒間遠心分離し、デカント及びＴＥ(500μl, 10mMのトリス-HCl, 1mMのEDTA pH 7.5)への再懸濁に次いで遠心分離した。次いで、細胞をＴＥ(1ml)中に希釈し、アリコート(200μl)を150mm成長プレート(ＶＷＲ)に予め調製した選択培地に拡げた。
あるいは、複数の少量反応の代わりに、形質転換を１回の大規模反応で実施したが、試薬の量はしかるべくスケールアップした。
用いた選択培地は、Kaiser等, Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY, p. 208-210 (1994)に記載されているように調製したウラシルを欠く合成完全デキストロース寒天(ＳＣＤ-Ｕｒａ)であった。形質転換体は３０℃で２-３日成長させた。
アミラーゼを分泌するコロニーの検出は、選択成長培地における赤色デンプンの包含により実施した。Biely等, Anal. Biochem., 172: 176-179 (1988)に記載された方法に従って、デンプンを赤色染料(反応性 Red-120, Sigma)に結合させた。結合したデンプンをＳＣＤ-Ｕｒａ寒天プレートに最終濃度0.15%(w/v)で導入し、リン酸カリウムでｐＨ７．０に緩衝した(最終濃度50-100mM)。
ポジティブコロニーを拾って新鮮な選択培地(150mmプレート)に画線し、良好に単離され同定可能な単一コロニーを得た。アミラーゼ分泌についてポジティブな良好に単離された単一コロニーは、緩衝ＳＣＤ-Ｕｒａ寒天への赤色デンプンの直接導入により検出した。ポジティブコロニーは、デンプンを分解して、ポジティブコロニーの周囲に直接目視できる暈を形成する能力により決定した。 The cells are then harvested, transferred to a GS3 rotor bottle in a Sorval GS3 rotor for 5 minutes at 5,000 rpm, the supernatant is discarded and then prepared for transformation by resuspension in sterile water and in a 50 ml Falcon tube And centrifuged again at 3,500 rpm in a Beckman GS-6KR centrifuge. The supernatant was discarded and the cells were subsequently washed with LiAc / TE (10 ml, 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA pH 7.5, 100 mM Li 2 OOCCH 3) and resuspended in LiAc / TE (2.5 ml). .
Transformation occurs by mixing the prepared cells (100 μl) with fresh denatured single-stranded salmon sperm DNA (Lofstrand Labs, Gaitherburg, MD) and transforming DNA (1 μg vol. <10 μl) in a microtube. It was. The mixture was mixed briefly by vortexing, then 40% PEG / TE (600 μl, 40% polyethylene glycol-4000, 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, 100 mM Li 2 OOCCH 3, pH 7.5) was added. The mixture was gently stirred and incubated at 30 ° C. with stirring for 30 minutes. The cells were then heat shocked at 42 ° C. for 15 minutes and the reaction vessel was centrifuged in a microtube at 12,000 rpm for 5-10 seconds and decanted and TE (500 μl, 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA pH 7.5). Followed by centrifugation. The cells were then diluted in TE (1 ml) and aliquots (200 μl) were spread on selective media previously prepared in 150 mm growth plates (VWR).
Alternatively, instead of multiple small reactions, transformation was performed in one large scale reaction, but the amount of reagent was scaled up accordingly.
The selective medium used was synthetic complete dextrose agar lacking uracil prepared as described in Kaiser et al., Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY, p. 208-210 (1994). SCD-Ura). Transformants were grown at 30 ° C. for 2-3 days.
Detection of amylase-secreting colonies was performed by inclusion of red starch in the selective growth medium. Starch was coupled to a red dye (reactive Red-120, Sigma) according to the method described in Biely et al., Anal. Biochem., 172: 176-179 (1988). Bound starch was introduced into SCD-Ura agar plates at a final concentration of 0.15% (w / v) and buffered to pH 7.0 with potassium phosphate (final concentration 50-100 mM).
Positive colonies were picked and streaked on fresh selective medium (150 mm plate) to obtain a well-isolated and identifiable single colony. A well isolated single colony positive for amylase secretion was detected by direct introduction of red starch into buffered SCD-Ura agar. Positive colonies were determined by their ability to degrade starch and form visible wrinkles directly around positive colonies.

４．ＰＣＲ増幅によるＤＮＡの単離
ポジティブコロニーが単離された場合、その一部を楊枝で拾い、９６ウェルプレートにおいて無菌水(30μl)に希釈した。この時点で、ポジティブコロニーは凍結して次の分析のために保存するか、即座に増幅するかのいずれかである。細胞のアリコート(5μl)を、0.5μlのKlentaq(Clontech, Palo Alto, CA); 4.0μlの10mM dNTP(Perkin Elmer-Cetus); 2.5μlのKentaqバッファー(Clontech); 0.25μlの正方向オリゴ１；0.25μlの逆方向オリゴ２；12.5μlの蒸留水を含有する25μl容量におけるＰＣＲ反応のテンプレートとして使用した。正方向オリゴヌクレオチド１の配列は：
5'- TGTAAAACGACGGCCAGTTAAATAGACCTGCAATTATTAATCT-3' (配列番号：１)であった。
逆方向オリゴヌクレオチド２の配列は：
5'- CAGGAAACAGCTATGACCACCTGCACACCTGCAAATCCATT-3'(配列番号：２)
であった。
次いで、ＰＣＲは以下の通り実施した：
ａ． 変性 92℃、5分間
ｂ．３サイクル： 変性 92℃、30秒間
アニール 59℃、30秒間
伸長 72℃、60秒間
ｃ．３サイクル： 変性 92℃、30秒間
アニール 57℃、30秒間
伸長 72℃、60秒間
ｄ．２５サイクル： 変性 92℃、30秒間
アニール 55℃、30秒間
伸長 72℃、60秒間
ｅ． 保持 4℃
オリゴヌクレオチドの下線を施した領域は、各々ＡＤＨプロモーター領域及びアミラーゼ領域にアニーリングされ、挿入物が存在しない場合はベクターｐＳＳＴ-ＡＭＹ．０からの３０７ｂｐ領域を増幅する。典型的には、これらのオリゴヌクレオチドの５’末端の最初の１８ヌクレオチドは、配列プライマーのアニーリング部位を含んでいた。即ち、空のベクターからのＰＣＲ反応の全生成物は３４３ｂｐであった。しかしながら、シグナル配列融合ｃＤＮＡは、かなり長いヌクレオチド配列をもたらした。
ＰＣＲに続いて、反応のアリコート(5μl)を、上掲のSambrook等に記載されたように1%アガロースゲル中でトリス-ボレート-ＥＤＴＡ(ＴＢＥ)緩衝系を用いたアガロースゲル電気泳動により試験した。４００ｂｐより大きな単一で強いＰＣＲ産物をもたらすクローンを、96 Qiaquick PCR 清浄化カラム(Qiagen Inc., Chatsworth, CA)での精製の後にＤＮＡ配列によりさらに分析した。 4). Isolation of DNA by PCR amplification When positive colonies were isolated, a portion was picked with a toothpick and diluted in sterile water (30 μl) in a 96-well plate. At this point, positive colonies are either frozen and stored for subsequent analysis or are immediately amplified. Aliquots of cells (5 μl), 0.5 μl Klentaq (Clontech, Palo Alto, Calif.); 4.0 μl 10 mM dNTP (Perkin Elmer-Cetus); 2.5 μl Kentaq buffer (Clontech); 0.25 μl forward oligo 1; Used as template for PCR reaction in 25 μl volume containing 0.25 μl reverse oligo 2; 12.5 μl distilled water. The sequence of forward oligonucleotide 1 is:
5′-TGTAAAACGACGGCCAGTTAAATAGACCTGCAATTATTAATCT-3 ′ (SEQ ID NO: 1).
The sequence of reverse oligonucleotide 2 is:
5'-CAGGAAACAGCTATGACCACCTGCACACCTGCAAATCCATT-3 '(SEQ ID NO: 2)
Met.
PCR was then performed as follows:
a. Denaturation 92 ° C, 5 minutes b. 3 cycles: Denaturation 92 ℃, 30 seconds
Annealing 59 ℃, 30 seconds
Elongation 72 ° C, 60 seconds c. 3 cycles: Denaturation 92 ℃, 30 seconds
Annealing 57 ℃, 30 seconds
Elongation 72 ° C, 60 seconds d. 25 cycles: Denaturation 92 ° C, 30 seconds
Annealing 55 ℃, 30 seconds
Elongation 72 ° C, 60 seconds e. Holding 4 ℃
The underlined regions of the oligonucleotide are annealed to the ADH promoter region and amylase region, respectively, and in the absence of an insert, the vector pSST-AMY. Amplify the 307 bp region from zero. Typically, the first 18 nucleotides at the 5 'end of these oligonucleotides contained the annealing site for the sequence primer. That is, the total product of the PCR reaction from the empty vector was 343 bp. However, the signal sequence fusion cDNA resulted in a fairly long nucleotide sequence.
Following PCR, an aliquot (5 μl) of the reaction was examined by agarose gel electrophoresis using a Tris-borate-EDTA (TBE) buffer system in a 1% agarose gel as described in Sambrook et al., Supra. . Clones that yielded a single strong PCR product larger than 400 bp were further analyzed by DNA sequence after purification on a 96 Qiaquick PCR clean column (Qiagen Inc., Chatsworth, Calif.).

実施例３：シグナルアルゴリズム分析を用いたｃＤＮＡクローンの単離
種々のポリペプチド-コード化核酸配列は、ジェネンテク，インク(South San Francisco, CA)によって開発された独自の配列発見アルゴリズムを、公的(例えば、GenBank)及び／又は個人的(LIFESEQ(登録商標), Incyte Pharmaceuticals, Inc., Palo Alto, CA)データベースからのＥＳＴｓ並びに集団化及び組み立てられたＥＳＴ断片に適用することにより同定した。シグナル配列アルゴリズムは、考慮している配列又は配列断片の５'-末端の第１の、場合によっては第２のメチオニンコドン(ＡＴＧ)を取り囲むＤＮＡヌクレオチドの文字に基づく分泌シグナルスコアを計算する。第１のＡＴＧに続くヌクレオチドは、停止コドンを持たない少なくとも３５の不明瞭でないアミノ酸をコードしなければならない。第１のＡＴＧが必要なアミノ酸を有する場合、第２のものは試験しない。何れも要件を満たさない場合、候補配列にスコアをつけなかった。ＥＳＴ配列が真正のシグナル配列を含むか否かを決定するために、ＡＴＧコドンを取り囲むＤＮＡ及び対応するアミノ酸配列を、分泌シグナルに関連することが知られた７つのセンサー(評価パラメータ)の組を用いてスコアをつけた。このアルゴリズムの使用により、多くのポリペプチド-コード化核酸配列の同定がなされた。 Example 3 Isolation of cDNA Clones Using Signal Algorithm Analysis Various polypeptide-encoding nucleic acid sequences were developed using a proprietary sequence discovery algorithm developed by Genentech, Inc. (South San Francisco, Calif.). For example, identified by applying to ESTs and populations and assembled EST fragments from GenBank) and / or personal (LIFESEQ®, Incyte Pharmaceuticals, Inc., Palo Alto, Calif.) Databases. The signal sequence algorithm calculates a secretory signal score based on the letters of the DNA nucleotide surrounding the first, possibly second, methionine codon (ATG) at the 5'-end of the sequence or sequence fragment under consideration. The nucleotide following the first ATG must encode at least 35 unambiguous amino acids without a stop codon. If the first ATG has the required amino acid, the second is not tested. If none of the requirements were met, the candidate sequence was not scored. In order to determine whether an EST sequence contains a genuine signal sequence, a set of seven sensors (evaluation parameters) known to be associated with the secretory signal, the DNA surrounding the ATG codon and the corresponding amino acid sequence Used to score. Through the use of this algorithm, a number of polypeptide-encoding nucleic acid sequences have been identified.

実施例４：ＰＲＯ１９６をコードするｃＤＮＡクローンの単離
ＰＲＯ１９６を、コンピュータプログラムBLAST(Altschul等, Methods in Enzymology 266: 460-480 (1996))を用いて、GenBankデータベースをスクリーニングすることにより同定した。ＰＲＯ１９６配列は公知の発現配列タグ(ＥＳＴ)配列T35448、T11442、及びW77823との相同性を示す。公知のＥＳＴ配列のいずれも全長配列として同定されているものはなく、又はＴＩＥレセプターと結合するリガンドとして記載されているものもない。
その同定に続いて、ＮＬ１を、製造者の支持に従って、Clontech, Inc(Palo Alto, CA, USA)、カタログ#6528-1から購入したｍＲＮＡから作製されたヒト胎児肺ライブラリーからクローニングした。ライブラリーを、GenBankデータベースに見いだされたＥＳＴに基づき、合成オリゴヌクレオチドプローブを用いたハイブリッド形成によりスクリーニングした；
(ａ)5'-GCTGACGAACCAAGGCAACTACAAACTCCTGGT-3'(配列番号：５)；
(ｂ)5'-TGCGGCCGGACCAGTCCTCCATGGTCACCAGGAGTTTGTAG-3'(配列番号：６)；
(ｃ)5'-GGTGGTGAACTGCTTGCCGTTGTGCCATGTAAA-3'(配列番号：７)
ＰＲＯ１９６のヌクレオチドとアミノ酸配列を図１(配列番号：３)と図２(配列番号：４)にそれぞれ示す。ＰＲＯ１９６はＴＩＥ１及びＴＩＥ２リガンドと有意な配列同一性を示す。
ＰＲＯ１９６のクローンはアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション, 10801 ユニバーシティ・ブルーバード，マナッサス，ヴァージニア20110-2209，米国(ATCC)に、１９９７年９月１８日に、ブタペスト条約の条項に従って寄託し、寄託番号２０９２８０が付与された。 Example 4: Isolation of cDNA clones encoding PRO196 PRO196 was identified by screening the GenBank database using the computer program BLAST (Altschul et al., Methods in Enzymology 266: 460-480 (1996)). The PRO196 sequence exhibits homology with the known expressed sequence tag (EST) sequences T35448, T11442, and W77823. None of the known EST sequences have been identified as full-length sequences, or none have been described as ligands that bind to the TIE receptor.
Following its identification, NL1 was cloned from a human fetal lung library made from mRNA purchased from Clontech, Inc (Palo Alto, Calif., USA), catalog # 6528-1, according to manufacturer's support. The library was screened by hybridization with synthetic oligonucleotide probes based on ESTs found in the GenBank database;
(a) 5'-GCTGACGAACCAAGGCAACTACAAACTCCTGGT-3 '(SEQ ID NO: 5);
(b) 5'-TGCGGCCGGACCAGTCCTCCATGGTCACCAGGAGTTTGTAG-3 '(SEQ ID NO: 6);
(c) 5'-GGTGGTGAACTGCTTGCCGTTGTGCCATGTAAA-3 '(SEQ ID NO: 7)
The nucleotide and amino acid sequences of PRO196 are shown in FIG. 1 (SEQ ID NO: 3) and FIG. 2 (SEQ ID NO: 4), respectively. PRO196 shows significant sequence identity with TIE1 and TIE2 ligands.
The PRO196 clone was deposited with the American Type Culture Collection, 10801 University Bluebird, Manassas, Virginia 20110-2209, USA (ATCC) on September 18, 1997, in accordance with the terms of the Budapest Treaty, deposit number 209280 Was granted.

実施例５：ヒトＰＲＯ４４４をコードするｃＤＮＡクローンの単離
上記の実施例２に記載したように、アミラーゼスクリーニングにおいて単離されたｃＤＮＡ配列をＤＮＡ１３１２１と命名した。この配列に基づいてオリゴヌクレオチドプローブを作成し、上記実施例２のパラグラフ１に記載したようにして調製したヒト胎児肺ライブラリー(ＬＩＢ２５)のスクリーニングに使用した。クローニングベクターはｐＲＫ５Ｂであり(ｐＲＫ５ＢはＳｆｉＩ部位を含まないｐＲＫ５Ｄの前駆体である；Holmes等, Science, 253: 1278-1280 (1991)を参照)、切断されたｃＤＮＡサイズは２８００ｂｐ未満であった。
全長クローンが同定され、それは単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置６０８-６１０に見かけの翻訳開始部位を持ち、そしてヌクレオチド位置９５９-９６１の停止コドンで終端する(図３；配列番号：８)。予測されるポリペプチド前駆体は１１７アミノ酸長であり、約１２，６９２の計算された分子量及び約７．５０の見積もられたｐＩを有する。図４(配列番号：９)に示した全長ＰＲＯ４４４配列の分析は、アミノ酸１から約アミノ酸１６にシグナルペプチドの存在を証明した。Dayhoffデータベース(バージョン35.45 SwissProt 35)の分析により、ＰＲＯ４４４アミノ酸配列と以下のDayhoff配列：CEF44D12_8, P_R88452, YNE1_CAEEL, A47312, AF009957_1,及び A_06133_1との間の相同性が証明された。
クローンＤＮＡ２６８４６-１３９７は１９９８年１０月２７日にＡＴＣＣに寄託され、ＡＴＣＣ寄託番号２０３４０６が付された。 Example 5: Isolation of cDNA clone encoding human PRO444 As described in Example 2 above, the cDNA sequence isolated in the amylase screening was named DNA13121. An oligonucleotide probe was made based on this sequence and used to screen a human fetal lung library (LIB25) prepared as described in paragraph 1 of Example 2 above. The cloning vector was pRK5B (pRK5B is a precursor of pRK5D without the SfiI site; see Holmes et al., Science, 253: 1278-1280 (1991)) and the cleaved cDNA size was less than 2800 bp.
A full-length clone is identified, which contains a single open reading frame, has an apparent translation start site at nucleotide positions 608-610, and ends with a stop codon at nucleotide positions 959-961 (FIG. 3; SEQ ID NO: 8 ). The predicted polypeptide precursor is 117 amino acids long, has a calculated molecular weight of about 12,692 and an estimated pI of about 7.50. Analysis of the full-length PRO444 sequence shown in FIG. 4 (SEQ ID NO: 9) demonstrated the presence of a signal peptide from amino acid 1 to about amino acid 16. Analysis of the Dayhoff database (version 35.45 SwissProt 35) demonstrated homology between the PRO444 amino acid sequence and the following Dayhoff sequences: CEF44D12_8, P_R88452, YNE1_CAEEL, A47312, AF009957_1, and A_06133_1.
Clone DNA26846-1397 was deposited with ATCC on October 27, 1998 and is assigned ATCC deposit number 203406.

実施例６：ヒトＰＲＯ１８３、ＰＲＯ１８５、ＰＲＯ９９４０、ＰＲＯ２６３０及びＰＲＯ６３０９をコードするｃＤＮＡクローンの単離
添付した図に示すＰＲＯ１８３、ＰＲＯ１８５、ＰＲＯ９９４０、ＰＲＯ２６３０及びＰＲＯ６３０９ポリペプチドをコードするＤＮＡ分子はGenBankから得られた。 Example 6: Isolation of cDNA clones encoding human PRO183, PRO185, PRO9940, PRO2630 and PRO6309 DNA molecules encoding the PRO183, PRO185, PRO9940, PRO2630 and PRO6309 polypeptides shown in the accompanying figures were obtained from GenBank.

実施例７：ヒトＰＲＯ２１０及びＰＲＯ２１７をコードするｃＤＮＡクローンの単離
上記の実施例１に記載したようにphrapを使用してコンセンサスＤＮＡ配列を組み立てた。いくつかのケースにおいて、このコンセンサス配列をblast及びphrapの繰り返しサイクルを用いて伸長させ、上記のＥＳＴ配列の供給源を用いてコンセンサス配列をできるだけ伸長させた。このコンセンサス配列に基づいて、１)ＰＣＲにより関心ある配列を含むｃＤＮＡライブラリーを同定するため、及び２)全長コード化配列のクローンを単離するプローブとして使用するために、オリゴヌクレオチドを合成した。DNA３２２７９-１１３１を単離するために使用されるライブラリーは胎児腎臓であった。
ｃＤＮＡクローンは全体を配列決定した。ＤＮＡ３２２７９-１１３１の全ヌクレオチド配列を図９(配列番号：１４)に示し、ＰＲＯ２１０のアミノ酸配列を図１０(配列番号：１５)に示す。ＤＮＡ３３０９４-１１３１の全ヌクレオチド配列を図１３(配列番号：２１)に示し、ＰＲＯ２１７のアミノ酸配列を図１４(配列番号：２２)に示す。 Example 7: Isolation of cDNA clones encoding human PRO210 and PRO217 Consensus DNA sequences were assembled using phrap as described in Example 1 above. In some cases, the consensus sequence was extended using repeated cycles of blast and phrap, and the consensus sequence was extended as much as possible using the source of EST sequences described above. Based on this consensus sequence, oligonucleotides were synthesized for 1) identifying a cDNA library containing the sequence of interest by PCR and 2) using it as a probe to isolate a clone of the full-length coding sequence. The library used to isolate DNA32279-1131 was fetal kidney.
The cDNA clone was sequenced in its entirety. The entire nucleotide sequence of DNA32279-1131 is shown in FIG. 9 (SEQ ID NO: 14), and the amino acid sequence of PRO210 is shown in FIG. 10 (SEQ ID NO: 15). The entire nucleotide sequence of DNA33094-1131 is shown in FIG. 13 (SEQ ID NO: 21), and the amino acid sequence of PRO217 is shown in FIG. 14 (SEQ ID NO: 22).

実施例８：ヒト２１５をコードするｃＤＮＡクローンの単離
上記の実施例１に記載したようにコンセンサスＤＮＡ配列を他のＥＳＴ配列に対して構築し、このコンセンサス配列をＤＮＡ２８７４８と命名した。ＤＮＡ２８７４８コンセンサス配列に基づいて、ＰＣＲにより関心ある配列を含むｃＤＮＡライブラリーを同定するため、及びＰＲＯ２１５の全長コード化配列のクローンを単離するプローブとして使用するために、オリゴヌクレオチドを合成した。
ＰＣＲプライマー対(正及び逆)を合成した：
正方向ＰＣＲプライマー：5'-GTGGCTGGCACACAATGAGATC-3'(配列番号：１８)；及び
逆方向ＰＣＲプライマー：5'-CCAATGTGTGCAAGCGGTTGTG-3'(配列番号：１９)
さらに、合成オリゴヌクレオチドハイブリッド形成プローブは、以下のヌクレオチド配列を持つコンセンサスＤＮＡ２８７４８配列から作成した。
ハイブリッド形成プローブ：
5'-TCAAGAGCCTGGACCTCAGCCACAATCTCATCTCTGACTTTGCCTGGAGC-3'(配列番号：２０)。
全長クローンの供給源について幾つかのライブラリーをスクリーニングするために、ライブラリーからのＤＮＡを上述で同定したＰＣＲプライマー対でＰＣＲ増幅することによりスクリーニングした。次いで、ポジティブライブラリーを、プローブオリゴヌクレオチド及びＰＣＲプライマーの一方を用いてＰＲＯ２１５遺伝子をコードするクローンを単離するのに使用した。
ｃＤＮＡライブラリー作成のためのＲＮＡはヒト胎児肺組織から単離した。ｃＤＮＡクローンの単離に用いたｃＤＮＡライブラリーは、Invitrogen, San Diego, CAからのもの等の市販試薬を用いて標準的な方法によって作成した。ｃＤＮＡは、ＮｏｔＩ部位を含むオリゴｄＴでプライムし、平滑末端でＳａｌＩヘミキナーゼアダプターに結合させ、ＮｏｔＩで切断し、ゲル電気泳動でおよそのサイズ分類し、そして適切なクローニングベクター(ｐＲＫＢ又はｐＲＫ５Ｄ等；ｐＲＫ５ＢはＳｆｉＩ部位を含まないｐＲＫ５Ｄの前駆体である；Holmes等, Science, 253: 1278-1280 (1991)参照)に、独特のＸｈｏＩ及びＮｏｔＩ部位において、所定の方向でクローニングした。
上述のようにして単離されたクローンのＤＮＡ配列決定により、ここでＤＮＡ３２２８８-１１３２と命名されたＰＲＯ２１５の全長ＤＮＡ配列及びＰＲＯ２１５の誘導タンパク質配列が得られた。
ＤＮＡ３２２８８-１１３２の全ヌクレオチド配列を図１１(配列番号：１６)に示す。クローンＤＮＡ３２２８８-１１３２は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置３０８-３１０に見かけの翻訳開始部位を持ち、そしてヌクレオチド位置１５９１-１５９３の停止コドンで終端する(図１１、開始及び停止コドンを丸で囲んだ)。予測されるポリペプチド前駆体は４２８アミノ酸長である(図１２)。クローンＤＮＡ３２２８８-１１３２はＡＴＣＣに寄託され、ＡＴＣＣ寄託番号２０９２６１が付された。
全長ＰＲＯ２１５のアミノ酸配列の分析により、それが、ロイシンリッチ反復タンパク質とＳＬＩＴタンパク質を含む、ロイシンリッチ反復タンパク質スーパーファミリーのメンバーと相同性を有することが示された。 Example 8: Isolation of cDNA clone encoding human 215 A consensus DNA sequence was constructed against other EST sequences as described in Example 1 above, and this consensus sequence was named DNA28748. Based on the DNA28748 consensus sequence, oligonucleotides were synthesized to identify a cDNA library containing the sequence of interest by PCR and to use as a probe to isolate a clone of the full-length coding sequence of PRO215.
PCR primer pairs (forward and reverse) were synthesized:
Forward PCR primer: 5′-GTGGCTGGCACACAGAGATC-3 ′ (SEQ ID NO: 18); and reverse PCR primer: 5′-CCAATGTGTGCAAGCGGTTGTG-3 ′ (SEQ ID NO: 19)
In addition, synthetic oligonucleotide hybridization probes were generated from the consensus DNA28748 sequence having the following nucleotide sequence:
Hybridization probe:
5′-TCAAGAGCCTGGACCTCAGCCACAATCTCATCTCTGACTTTGCCTGGAGC-3 ′ (SEQ ID NO: 20).
To screen several libraries for a source of full-length clones, DNA from the libraries was screened by PCR amplification with the PCR primer pairs identified above. The positive library was then used to isolate clones encoding the PRO215 gene using one of the probe oligonucleotides and PCR primers.
RNA for construction of the cDNA library was isolated from human fetal lung tissue. The cDNA library used to isolate the cDNA clones was made by standard methods using commercially available reagents such as those from Invitrogen, San Diego, CA. The cDNA is primed with an oligo dT containing a NotI site, ligated to a SalI hemikinase adapter with blunt ends, cut with NotI, roughly sized by gel electrophoresis, and an appropriate cloning vector (such as pRKB or pRK5D; pRK5B is a precursor of pRK5D that does not contain an SfiI site; see Holmes et al., Science, 253: 1278-1280 (1991)), cloned in the defined orientation at unique XhoI and NotI sites.
DNA sequencing of the clone isolated as described above resulted in the full-length DNA sequence of PRO215, designated herein as DNA32288-1132, and the derived protein sequence of PRO215.
The complete nucleotide sequence of DNA32288-1132 is shown in FIG. 11 (SEQ ID NO: 16). Clone DNA32288-1132 contains a single open reading frame, has an apparent translation start site at nucleotide positions 308-310, and ends with a stop codon at nucleotide positions 1591-1593 (FIG. 11, start and stop codons). Circled). The predicted polypeptide precursor is 428 amino acids long (Figure 12). Clone DNA32288-1132 has been deposited with ATCC and is assigned ATCC deposit no.
Analysis of the amino acid sequence of full-length PRO215 showed that it has homology with members of the leucine-rich repeat protein superfamily, including leucine-rich repeat proteins and SLIT proteins.

実施例９：ヒトＰＲＯ２４２をコードするｃＤＮＡクローンの単離
発現配列タグ(ＥＳＴ)ＤＮＡデータベース(LIFESEQＴＭ, Incyte Pharmaceuticals, Palo Alto, CA)を検索して、ケモカインと相同性を示したＥＳＴを同定した。この配列に基づき、関心ある配列を含むｃＤＮＡライブラリーをＰＣＲにより同定するために、またＰＲＯ２４２に対する全長コード配列のクローンを単離するためのプローブとしての使用のために、オリゴヌクレオチドを合成した。
ＰＣＲプライマー対(正方向及び逆方向)を合成した：
正方向ＰＣＲプライマー 5'-GGATCAGGCAGGAGGAGTTTGGG-3'(配列番号：２５)
逆方向ＰＣＲプライマー 5'-GGATGGGTACAGACTTTCTTGCC-3'(配列番号：２６)
さらに、合成オリゴヌクレオチドハイブリッド形成プローブは、次のヌクレオチド配列：
ハイブリッド形成プローブ
5'-ATGATGGGCCTCTCCTTGGCCTCTGCTGTGCTCCTGGCCTCCCTCCTGAG-3'(配列番号：２７)
を持つコンセンサスＤＮＡ２８７０９配列から作成した。
全長クローンの供給源に対して数種のライブラリーをスクリーニングするために、ライブラリーからのＤＮＡを、上述で同定したＰＣＲプライマー対でのＰＣＲ増幅によりスクリーニングした。次いで、ポジティブライブラリーを、プローブオリゴヌクレオチド及びＰＣＲプライマーの一方を用いてＰＲＯ２４２遺伝子をコードするクローンを単離するために使用した。
ｃＤＮＡライブラリーの作成のためのＲＮＡはヒト胎児肺組織から単離された。ｃＤＮＡクローンは全体を配列決定した。ＤＮＡ３３７８５-１１４３の全ヌクレオチド配列を図１５(配列番号：２３)に示す。クローンＤＮＡ３３７８５-１１４３は単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置３３３-３３５に見かけの翻訳開始部位を持ち、ヌクレオチド位置６１５-６１７の停止コドンで終端する(図１６；配列番号：２４)。予測されるポリペプチド前駆体は９４アミノ酸長である(図１６)。
全長配列の(ALIGNコンピュータプログラムを用いた)BLAST及びFastA配列アラインメント分析に基づき、ＰＲＯ２４２は、ヒトマクロファージ炎症性タンパク質１-アルファ、ウサギマクロファージ炎症性タンパク質１-ベータ、ヒトＬＤ７８及びウサギ免疫活性化遺伝子２とのアミノ酸配列同一性を示した。 Example 9 Isolation of cDNA Clones Encoding Human PRO242 The expression sequence tag (EST) DNA database (LIFESEQ ™ , Incyte Pharmaceuticals, Palo Alto, Calif.) Was searched to identify ESTs that showed homology to chemokines. . Based on this sequence, oligonucleotides were synthesized for use in PCR to identify cDNA libraries containing sequences of interest and to isolate clones of the full-length coding sequence for PRO242.
PCR primer pairs (forward and reverse) were synthesized:
Forward PCR primer 5'-GGATCAGGCAGGAGGAGTTTGGG-3 '(SEQ ID NO: 25)
Reverse PCR primer 5′-GGATGGGTACAGACTTTCTTGCC-3 ′ (SEQ ID NO: 26)
In addition, the synthetic oligonucleotide hybridization probe has the following nucleotide sequence:
Hybridization probe
5'-ATGATGGGCCTCTCCTTGGCCTCTGCTGTGCTCCTGGCCTCCCTCCTGAG-3 '(SEQ ID NO: 27)
Consensus DNA28709 sequence with
In order to screen several libraries against a source of full-length clones, DNA from the libraries was screened by PCR amplification with the PCR primer pairs identified above. The positive library was then used to isolate a clone encoding the PRO242 gene using one of the probe oligonucleotides and PCR primers.
RNA for construction of the cDNA library was isolated from human fetal lung tissue. The cDNA clone was sequenced in its entirety. The entire nucleotide sequence of DNA33785-1143 is shown in FIG. 15 (SEQ ID NO: 23). Clone DNA33785-1143 contains a single open reading frame, has an apparent translation start site at nucleotide positions 333-335, and ends with a stop codon at nucleotide positions 615-617 (FIG. 16; SEQ ID NO: 24). The predicted polypeptide precursor is 94 amino acids long (Figure 16).
Based on BLAST and FastA sequence alignment analysis (using the ALIGN computer program) of the full-length sequence, PRO242 is human macrophage inflammatory protein 1-alpha, rabbit macrophage inflammatory protein 1-beta, human LD78 and rabbit immunostimulatory gene 2 And amino acid sequence identity.

実施例１０：ヒトＰＲＯ２８８をコードするｃＤＮＡクローンの単離
ＤｃＲ１ ＥＣＤ[Sheridanら, 上掲]をコードし、以下の配列：
5'-CATAAAAGTTCCTGCACCATGACCAGAGACACAGTGTGTCAGTGTAAAGA-3'(配列番号：３０)
を有する配列に基づく合成プローブを使用し、ヒト胎児肺ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングした。ｃＤＮＡライブラリーを作製するために、ｍＲＮＡをヒト胎児肺組織からInvitrogen, San Diego, CAからの試薬及びプロトコールを用いて単離した(Fast Track 2)。このＲＮＡを、Life Technologies, Gaithersburg, MD (Super Script Plasmid system)からの試薬及びプロトコールを用いるベクターｐＲＫ５ＤにおけるオリゴｄＴプライムしたｃＤＮＡの生成に使用した。この方法において、二本鎖ｃＤＮＡは１０００ｂｐを越えるサイズ分類し、ＳａｌＩ／ＮｏｔＩ結合ｃＤＮＡをＸｈｏＩ／ＮｏｔＩ切断ベクターにクローニングした。ｐＲＫ５Ｄを、ｓｐ６転写開始部位、それに続くＳｆｉＩ制限酵素部位、さらにＸｈｏＩ／ＮｏｔＩｃＤＮＡクローニング部位を持つベクターにクローニングした。
全長クローンを同定し(ＤＮＡ３５６６３-１１２９)、これは、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置１５７-１５９に見かけの翻訳開始部位を持ち、ヌクレオチド位置１３１５-１３１７に見出される停止コドンで終端する(図１７；配列番号：２８)。このクローンはｐＲＫ５-３５６６３と称され、ＡＴＣＣ番号２０９２０１として寄託されている。
予測されるポリペプチド前駆体は３８６アミノ酸長であり、約４１．８ｋＤａの算定分子量を有する。配列の解析により、Ｎ末端シグナルペプチド(アミノ酸１-５５)、続いてＥＣＤ(アミノ酸５６-２１２)、膜貫通ドメイン(アミノ酸２１３-２３２)及び細胞内領域(アミノ酸２３３-３８６)が示された(図１８)。シグナルペプチド切断部位は、ＰＲＯ２８８ＥＣＤイムノアドへシンのＮ末端タンパク質配列分析により確認した(図示せず)。この構造は、ＰＲＯ２８８がＩ型の膜貫通タンパク質であることを示唆している。ＰＲＯ２８８は、アミノ酸位置１２７、１７１及び１８２に３つの潜在的Ｎ結合グリコシル化部位を含む(図１８)。
ＴＮＦレセプターファミリータンパク質は、典型的には、その細胞外領域における複数(通常は４つ)のシステインリッチドメインの存在によって特徴付けられ、各システインリッチドメインは約４５アミノ酸長であり、約６つの規則的に離間したシステイン残基を含む。Ｉ型ＴＮＦレセプターの結晶構造に基づいて、各ドメインのシステインは３つのジスルフィド結合を形成するが、通常は、システイン１と２、３と５、及び４と６とが結合する。ＤＲ４、ＤＲ５及びＤｃＲ１と同様に、ＰＲＯ２８８は２つの細胞外のシステインリッチシュードリピート(pseudorepeat)を含むが、他の同定された哺乳動物ＴＮＦＲファミリーのメンバーは、そのようなドメインを３つ又はそれ以上含んでいる［Smithら, Cell, 76:959 (1994)］。
図１８(配列番号：２９)に示すＰＲＯ２８８配列のアライメント分析に基づくと、ＰＲＯ２８８は、他のアポトーシス関連レセプター、例えばＴＮＦＲ１、Ｆａｓ／Ａｐｏ-１又はＤＲ３よりも、ＤＲ４、ＤＲ５又はＤｃＲ１のＥＣＤに対して高い配列同一性を示した。予想されたＰＲＯ２８８の細胞内配列も、ＴＮＦＲ１、Ｆａｓ又はＤＲ３に比較して、ＤＲ４又はＤＲ５の対応する領域に対して高い相同性を示す。ＰＲＯ２８８の細胞内領域は、ＤＲ４又はＤＲ５について同定された細胞内領域より約５０残基短い。現在、ＰＲＯ２８８は、切断死亡ドメイン(アミノ酸３４０-３６４)を含み、それはＤＲ４又はＤＲ５の死亡ドメイン配列のカルボキシ末端部分に相当すると信じられている。ＴＮＦＲ１によるシグナル伝達に必要であり［Tartagliaら, 上掲］、そしてＤＲ４及びＤＲ５に保持又は半保持されている６アミノ酸の中の５つが、ＰＲＯ２８８には存在していない。 Example 10: Isolation of cDNA clone encoding human PRO288 encoding DcR1 ECD [Sheridan et al., Supra] and having the following sequence:
5'-CATAAAAGTTCCTGCACCATGACCAGAGACACAGTGTGTCAGTGTAAAGA-3 '(SEQ ID NO: 30)
A human fetal lung cDNA library was screened using a synthetic probe based on a sequence having To create a cDNA library, mRNA was isolated from human fetal lung tissue using reagents and protocols from Invitrogen, San Diego, CA (Fast Track 2). This RNA was used to generate oligo dT primed cDNA in vector pRK5D using reagents and protocols from Life Technologies, Gaithersburg, MD (Super Script Plasmid system). In this method, double stranded cDNA was classified in size exceeding 1000 bp, and SalI / NotI binding cDNA was cloned into an XhoI / NotI digested vector. pRK5D was cloned into a vector with an sp6 transcription initiation site followed by an SfiI restriction enzyme site, followed by an XhoI / NotI cDNA cloning site.
A full-length clone is identified (DNA35663-1129), which contains a single open reading frame, has an apparent translation start site at nucleotide positions 157-159, and ends with a stop codon found at nucleotide positions 1315-1317. (Figure 17; SEQ ID NO: 28). This clone is called pRK5-35663 and is deposited as ATCC number 209201.
The predicted polypeptide precursor is 386 amino acids long and has a calculated molecular weight of approximately 41.8 kDa. Sequence analysis revealed an N-terminal signal peptide (amino acids 1-55), followed by ECD (amino acids 56-212), transmembrane domain (amino acids 213-232) and intracellular region (amino acids 233-386) ( FIG. 18). The signal peptide cleavage site was confirmed by N-terminal protein sequence analysis of PRO288ECD immunoadhesin (not shown). This structure suggests that PRO288 is a type I transmembrane protein. PRO288 contains three potential N-linked glycosylation sites at amino acid positions 127, 171 and 182 (FIG. 18).
TNF receptor family proteins are typically characterized by the presence of multiple (usually four) cysteine-rich domains in their extracellular region, each cysteine-rich domain being about 45 amino acids long and about six rules Containing cysteine residues that are spaced apart. Based on the crystal structure of the type I TNF receptor, the cysteines in each domain form three disulfide bonds, but usually cysteines 1 and 2, 3 and 5, and 4 and 6 bind. Like DR4, DR5, and DcR1, PRO288 contains two extracellular cysteine-rich pseudorepeats, but other identified mammalian TNFR family members have three or more such domains. [Smith et al., Cell, 76: 959 (1994)].
Based on the alignment analysis of the PRO288 sequence shown in FIG. 18 (SEQ ID NO: 29), PRO288 is more potent against the ECD of DR4, DR5 or DcR1 than other apoptosis-related receptors such as TNFR1, Fas / Apo-1 or DR3. High sequence identity. The predicted intracellular sequence of PRO288 also shows high homology to the corresponding region of DR4 or DR5 compared to TNFR1, Fas or DR3. The intracellular region of PRO288 is about 50 residues shorter than the intracellular region identified for DR4 or DR5. Currently, PRO288 contains a truncated death domain (amino acids 340-364), which is believed to correspond to the carboxy-terminal portion of the death domain sequence of DR4 or DR5. Five of the six amino acids required for signaling by TNFR1 [Tartaglia et al., Supra] and retained or semi-retained in DR4 and DR5 are not present in PRO288.

実施例１１：ヒトＰＲＯ３６５をコードするｃＤＮＡクローンの単離
上記実施例１に記載したようにphrapを用いて他のＥＳＴ配列に対してコンセンサスＤＮＡ配列を組み立てた。このコンセンサス配列を、ここでＤＮＡ３５６１３と命名する。ＤＮＡ３５６１３コンセンサス配列に基づいて、１)ＰＣＲにより関心ある配列を含むｃＤＮＡライブラリーを同定するため、及び２)ＰＲＯ３６５の全長コード配列のクローンを単離するプローブとして使用するために、オリゴヌクレオチドを合成した。
次のように正方向及び逆方向ＰＣＲプライマーを合成した：
正方向ＰＣＲプライマー 5'-GGCTGGCCTGCAGAGATC-3'(配列番号：３３)
正方向ＰＣＲプライマー 5'-AATGTGACCACTGGACTCCC-3'(配列番号：３４)
正方向ＰＣＲプライマー 5'-AGGCTTGGAACTCCCTTC-3'(配列番号：３５)
逆方向ＰＣＲプライマー 5'-AAGATTCTTGAGCGATTCCAGCTG-3'(配列番号：３６)
さらに、以下のヌクレオチド配列を持つ合成オリゴヌクレオチドハイブリッド形成プローブをコンセンサスＤＮＡ３５６１３配列から作成した。
ハイブリッド形成プローブ
5'-AATCCCTGCTCTTCATGGTGACCTATGACGACGGAAGCACAAGACTG-3'(配列番号：３７)
全長クローンの供給源について幾つかのライブラリーをスクリーニングするために、ライブラリーからのＤＮＡを上で同定したＰＣＲプライマー対の一つでのＰＣＲ増幅によりスクリーニングした。次いで、ポジティブライブラリーを、プローブオリゴヌクレオチドとＰＣＲプライマー対の一つを用いてＰＲＯ３６５遺伝子をコードするクローンを単離するのに使用した。ｃＤＮＡライブラリー作成のためのＲＮＡは、ヒト胎児腎臓組織から単離した。
上記のように単離したクローンのＤＮＡ配列決定により、ＰＲＯ３６５の全長ＤＮＡ配列［ここではＤＮＡ４６７７７-１２５３と命名］(配列番号：３１)及びＰＲＯ３６５の誘導タンパク質配列が得られた。
ＤＮＡ４６７７７-１２５３の全ヌクレオチド配列を図１９(配列番号：３１)に示す。ＤＮＡ４６７７７-１２５３は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置１５-１７に見かけの翻訳開始部位を持ち、ヌクレオチド位置７２０-７２２の停止コドンで終端する(図１９)。予測されるポリペプチド前駆体は２３５アミノ酸長である(図２０)。クローンＤＮＡ４６７７７-１２５３によりコードされるポリペプチド配列の重要な領域が同定され、それは次のものを含む：アミノ酸１-２０に対応するシグナルペプチド、及び複数の潜在的なＮグリコシル化部位。クローンＤＮＡ４６７７７-１２５３はＡＴＣＣに寄託され、ＡＴＣＣ寄託番号２０９６１９が付与された。
全長ＰＲＯ３６５ポリペプチドのアミノ酸配列の分析により、その部分がヒト２-１９プロテインと有意な相同性を有していることが示唆され、ＰＲＯ３６５が新規なヒト２-１９プロテイン相同体であることを示している。 Example 11: Isolation of cDNA clones encoding human PRO365 Consensus DNA sequences were assembled against other EST sequences using phrap as described in Example 1 above. This consensus sequence is herein designated DNA35613. Based on the DNA35613 consensus sequence, oligonucleotides were synthesized for 1) identifying a cDNA library containing the sequence of interest by PCR, and 2) as a probe to isolate a clone of the full-length coding sequence of PRO365. .
Forward and reverse PCR primers were synthesized as follows:
Forward PCR primer 5'-GGCTGGCCTGCAGAGATC-3 '(SEQ ID NO: 33)
Forward PCR primer 5'-AATGTGACCACTGGACTCCC-3 '(SEQ ID NO: 34)
Forward PCR primer 5'-AGGCTTGGAACTCCCTTC-3 '(SEQ ID NO: 35)
Reverse PCR primer 5'-AAGATTCTTGAGCGATTCCAGCTG-3 '(SEQ ID NO: 36)
In addition, a synthetic oligonucleotide hybridization probe having the following nucleotide sequence was generated from the consensus DNA35613 sequence.
Hybridization probe
5'-AATCCCTGCTCTTCATGGTGACCTATGACGACGGAAGCACAAGACTG-3 '(SEQ ID NO: 37)
To screen several libraries for a source of full-length clones, DNA from the libraries was screened by PCR amplification with one of the PCR primer pairs identified above. The positive library was then used to isolate a clone encoding the PRO365 gene using one of the probe oligonucleotide and one of the PCR primer pairs. RNA for construction of the cDNA library was isolated from human fetal kidney tissue.
DNA sequencing of the clones isolated as described above yielded the full-length DNA sequence of PRO365 [here designated as DNA46777-1253] (SEQ ID NO: 31) and the derived protein sequence of PRO365.
The complete nucleotide sequence of DNA46777-1253 is shown in FIG. 19 (SEQ ID NO: 31). DNA46777-1253 contains a single open reading frame, has an apparent translation start site at nucleotide positions 15-17, and ends with a stop codon at nucleotide positions 720-722 (FIG. 19). The predicted polypeptide precursor is 235 amino acids long (Figure 20). A critical region of the polypeptide sequence encoded by clone DNA46777-1253 has been identified, which includes: a signal peptide corresponding to amino acids 1-20, and multiple potential N-glycosylation sites. Clone DNA46777-1253 has been deposited with ATCC and is assigned ATCC deposit no.
Analysis of the amino acid sequence of the full-length PRO365 polypeptide suggests that the portion has significant homology with human 2-19 protein, indicating that PRO365 is a novel human 2-19 protein homolog. ing.

実施例１２：ヒトＰＲＯ１３６１をコードするｃＤＮＡクローンの単離
上記の実施例３に記載したシグナル配列アルゴリズムの使用により、Incyteクラスター番号１０６８５と命名された、IncyteデータベースからのＥＳＴクラスター配列の同定が可能となった。次いでこのＥＳＴクラスター配列を、公的ＥＳＴデータベース(例えば、GenBank)及び企業のＥＳＴＤＮＡデータベース(LIFESEQ(商品名)、Incyte Pharmaceuticals、Palo Alto, CA)を含む種々の発現配列タグ(ＥＳＴ)データベースと比較して、存在する相同性を同定した。相同体検索は、コンピュータプログラムBLAST又はBLAST2(Altschul等, Methods in Enzymology 266: 460-480 (1996))を用いて実施した。既知のタンパク質をコードせず、BLASTスコア７０(９０の場合もある)又はそれ以上を持つ比較物は、プログラム「phrap」(Phil Green, University of Washington, Seattle, Washington)で集団化してコンセンサスＤＮＡ配列を構築した。そこから得られたコンセンサス配列をここでＤＮＡ５８８３９と命名する。
ＤＮＡ５８８３９配列とIncyteＥＳＴクローン番号２９６７９２７内に含まれるＥＳＴ配列との間の配列相同性に鑑みて、IncyteＥＳＴクローン番号２９６７９２７を購入し、ｃＤＮＡ挿入物を得て配列決定した。このｃＤＮＡ挿入物の配列を図２１に示し、ここでＤＮＡ６０７８３-１６１１と命名する。
クローンＤＮＡ６０７８３-１６１１は単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置１４２-１４４に見かけの翻訳開始部位を持ち、そしてヌクレオチド位置１１３２-１１３４の停止コドンで終端する(図２１)。予測されるポリペプチド前駆体は３３０アミノ酸長である(図２２)。図２２に示す全長ＰＲＯ１３６１タンパク質は、約３６,８４０ダルトンの算定分子量と約４．８４のｐＩを有する。図２２(配列番号：３９)に示した全長ＰＲＯ１３６１配列の分析は、以下のものの存在を明らかにした：約アミノ酸１〜約アミノ酸２３のシグナルペプチド、約アミノ酸２６６〜約アミノ酸２８４の膜貫通ドメイン、約アミノ酸１５５〜約アミノ酸１７６のロイシンジッパーパターン配列、及び約アミノ酸４６〜約アミノ酸４９、約アミノ酸６４〜約アミノ酸６７、約アミノ酸１６６〜約アミノ酸１６９及び約アミノ酸１９１〜約アミノ酸１９４の潜在的Ｎ-グルコシル化部位。クローンＤＮＡ６０７８３-１６１１は１９９８年８月１８日にＡＴＣＣに寄託され、ＡＴＣＣ寄託番号２０３１３０が付された。
図２２(配列番号：３９)に示す全長配列のWU-BLAST2配列アラインメント分析を使用するDayhoffデータベース(バージョン35.45 SwissProt 35)の分析により、ＰＲＯ１３６１アミノ酸配列と以下のDayhoff配列：I50620、G64876、PMCMSG102B_2MSG104、HUMIGLVXY_1及びPH1370との間の有意な相同性が明らかになった。 Example 12: Isolation of cDNA clones encoding human PRO1361 Use of the signal sequence algorithm described in Example 3 above allows identification of EST cluster sequences from the Incyte database, designated Incyte cluster number 10485 became. This EST cluster sequence is then compared to various expressed sequence tag (EST) databases including public EST databases (eg, GenBank) and corporate EST DNA databases (LIFESEQ (trade name), Incyte Pharmaceuticals, Palo Alto, Calif.). Identified the existing homology. Homologue searches were performed using the computer program BLAST or BLAST2 (Altschul et al., Methods in Enzymology 266: 460-480 (1996)). Comparisons that do not encode known proteins and have a BLAST score of 70 (may be 90) or higher are grouped with the program “phrap” (Phil Green, University of Washington, Seattle, Washington) and consensus DNA sequences Built. The consensus sequence obtained therefrom is designated herein as DNA58839.
In light of the sequence homology between the DNA58839 sequence and the EST sequence contained within Incyte EST clone no. 2967927, Incyte EST clone no. 2967927 was purchased and the cDNA insert was obtained and sequenced. The sequence of this cDNA insert is shown in FIG. 21 and is herein designated as DNA60783-1611.
Clone DNA60783-1611 contains a single open reading frame, has an apparent translation start site at nucleotide positions 142-144, and ends with a stop codon at nucleotide positions 1132-1134 (FIG. 21). The predicted polypeptide precursor is 330 amino acids long (Figure 22). The full-length PRO1361 protein shown in FIG. 22 has a calculated molecular weight of about 36,840 daltons and a pI of about 4.84. Analysis of the full-length PRO1361 sequence shown in FIG. 22 (SEQ ID NO: 39) revealed the presence of: a signal peptide from about amino acid 1 to about amino acid 23, a transmembrane domain from about amino acid 266 to about amino acid 284, A leucine zipper pattern sequence of about amino acid 155 to about amino acid 176 and a potential N- of about amino acid 46 to about amino acid 49, about amino acid 64 to about amino acid 67, about amino acid 166 to about amino acid 169 and about amino acid 191 to about amino acid 194 Glucosylation site. Clone DNA60783-1611 was deposited with ATCC on August 18, 1998 and is assigned ATCC deposit no.
Analysis of the Dayhoff database (version 35.45 SwissProt 35) using the WU-BLAST2 sequence alignment analysis of the full-length sequence shown in FIG. And significant homology between PH1370 was revealed.

実施例１３：ヒトＰＲＯ１３０８をコードするｃＤＮＡクローンの単離
上記実施例１に記載したようにphrapを用いて他のＥＳＴ配列に対してコンセンサスＤＮＡ配列を組み立てた。コンセンサス配列を、BLASTとphrapの繰り返しサイクルを用いて伸長し、コンセンサス配列を上で議論したＥＳＴ配列の供給源を用いて可能な限り伸長させた。伸長させたコンセンサス配列を、ここで「ＤＮＡ３５７２６」と命名する。ＤＮＡ３５７２６コンセンサス配列に基づいて、１)ＰＣＲにより関心ある配列を含むｃＤＮＡライブラリーを同定するため、及び２)ＰＲＯ１３０８の全長コード配列のクローンを単離するプローブとして使用するために、オリゴヌクレオチドを合成した。
次のプライマー(正方向及び逆方向)を合成した：
正方向ＰＣＲプライマー
5'-TCCTGTGAGCACGTGGTGTG-3'(配列番号：４２)
5'-GGGTGGGATAGACCTGCG-3'(配列番号：４３)
5'-AAGGCCAAGAAGGCTGCC-3'(配列番号：４４)；及び
5'-CCAGGCCTGCAGACCCAG-3'(配列番号：４５)
逆方向ＰＣＲプライマー
5'-CTTCCTCAGTCCTTCCAGGATATC-3'(配列番号：４６)
5'-AAGCTGGATATCCTCCGTGTTGTC-3'(配列番号：４７)
5'-CCTGAAGAGGCATGACTGCTTTTCTCA-3'(配列番号：４８)；及び
5'-GGGGATAAACCTATTAATTATTGCTAC-3'(配列番号：４９)
さらに、以下のヌクレオチド配列を持つ合成オリゴヌクレオチドハイブリッド形成プローブをＤＮＡ３５７２６コンセンサス配列から作成した。
ハイブリッド形成プローブ：
5'-AACGTCACCTACATCTCCTCGTGCCACATGCGCCAGGCCACCTG-3'(配列番号：５０)
全長クローンの供給源について幾つかのライブラリーをスクリーニングするために、ライブラリーからのＤＮＡを上で同定したＰＣＲプライマー対でのＰＣＲ増幅によりスクリーニングした。次いで、ポジティブライブラリーを、プローブオリゴヌクレオチドとＰＣＲプライマー対の一方を用いてＰＲＯ１３０８遺伝子をコードするクローンを単離するのに使用した。ｃＤＮＡライブラリー作成のためのＲＮＡは、ヒトＳＫ-Ｌｕ-１腺癌細胞系から単離した。
上記のように単離したクローンのＤＮＡ配列決定により、ＰＲＯ１３０８の全長ＤＮＡ配列(ここではＤＮＡ６２３０６-１５７０と命名[図２３、配列番号：４０]及びＰＲＯ１３０８の誘導タンパク質配列が得られた。
ＰＲＯ１３０８の全コード配列を図２３(配列番号：４０)に示す。クローンＤＮＡ６２３０６-１５７０は単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置１７-１９に見かけの翻訳開始部位、ヌクレオチド位置８０６-８０８に停止コドンを持つ。予測されるポリペプチド前駆体は２６３アミノ酸長である。図２４に示す全長ＰＲＯ１３０８タンパク質は、約２７,６６３の算定分子量、及び約６．７７のｐＩを有する。さらなる特徴は、約アミノ酸１-２０にシグナルペプチド、約アミノ酸７３-７６及び２１５-２１８に潜在的なＮ-グルコシル化部位、及び約アミノ酸９７-１２９及び１６９-２０１にオステオネクチンと相同性を有する領域を含む。
図２４(配列番号：４１)に示す全長配列のWU-BLAST2配列アラインメント分析を使用するDayhoffデータベース(バージョン35.45 SwissProt 35)の分析により、ＰＲＯ１３０８アミノ酸配列と以下のDayhoff配列Ｓ５５３６９との間の有意な相同性が明らかになった。また、ＰＲＯ１３０８アミノ酸配列と以下のDayhoff配列：FAS_HUMAN、P_R20063、CELT13C2_1、AGRI_RAT、p_W09406、G01639、SC1_RAT、S60062、S51362、及びIOV_CHICKとの間の相同性も明らかになった。
クローンＤＮＡ６２３０６-１５７０はＡＴＣＣに寄託され、ＡＴＣＣ寄託番号２０３２５４が付与された。 Example 13: Isolation of cDNA clones encoding human PRO1308 Consensus DNA sequences were assembled against other EST sequences using phrap as described in Example 1 above. The consensus sequence was extended using repeated cycles of BLAST and phrap, and the consensus sequence was extended as much as possible using the sources of EST sequences discussed above. The extended consensus sequence is designated herein as “DNA35726”. Based on the DNA35726 consensus sequence, oligonucleotides were synthesized to 1) identify a cDNA library containing the sequence of interest by PCR, and 2) use as a probe to isolate a clone of the full-length coding sequence of PRO1308. .
The following primers (forward and reverse) were synthesized:
Forward PCR primer
5'-TCCTGTGAGCACGTGGTGTG-3 '(SEQ ID NO: 42)
5'-GGGTGGGATAGACCTGCG-3 '(SEQ ID NO: 43)
5'-AAGGCCAAGAAGGCTGCC-3 '(SEQ ID NO: 44); and
5'-CCAGGCCTGCAGACCCAG-3 '(SEQ ID NO: 45)
Reverse PCR primer
5'-CTTCCTCAGTCCTTCCAGGATATC-3 '(SEQ ID NO: 46)
5'-AAGCTGGATATCCTCCGTGTTGTC-3 '(SEQ ID NO: 47)
5'-CCTGAAGAGGCATGACTGCTTTTCTCA-3 '(SEQ ID NO: 48); and
5'-GGGGATAAACCTATTAATTATTGCTAC-3 '(SEQ ID NO: 49)
In addition, a synthetic oligonucleotide hybridization probe having the following nucleotide sequence was generated from the DNA35726 consensus sequence.
Hybridization probe:
5'-AACGTCACCTACATCTCCTCGTGCCACATGCGCCAGGCCACCTG-3 '(SEQ ID NO: 50)
To screen several libraries for a source of full-length clones, DNA from the libraries was screened by PCR amplification with the PCR primer pairs identified above. The positive library was then used to isolate a clone encoding the PRO1308 gene using one of the probe oligonucleotide and PCR primer pair. RNA for construction of the cDNA library was isolated from a human SK-Lu-1 adenocarcinoma cell line.
DNA sequencing of the clones isolated as described above resulted in the full-length DNA sequence of PRO1308 (here named as DNA62306-1570 [Figure 23, SEQ ID NO: 40]) and the derived protein sequence of PRO1308.
The entire coding sequence of PRO1308 is shown in FIG. 23 (SEQ ID NO: 40). Clone DNA62306-1570 contains a single open reading frame with an apparent translation start site at nucleotide positions 17-19 and a stop codon at nucleotide positions 806-808. The predicted polypeptide precursor is 263 amino acids long. The full-length PRO1308 protein shown in FIG. 24 has a calculated molecular weight of about 27,663 and a pI of about 6.77. Further features are homologous to a signal peptide at about amino acids 1-20, a potential N-glucosylation site at about amino acids 73-76 and 215-218, and osteonectin at about amino acids 97-129 and 169-201 Includes area.
Analysis of the Dayhoff database (version 35.45 SwissProt 35) using the WU-BLAST2 sequence alignment analysis of the full-length sequence shown in FIG. 24 (SEQ ID NO: 41) shows significant homology between the PRO1308 amino acid sequence and the following Dayhoff sequence S55369 Sex became clear. In addition, the homology between the PRO1308 amino acid sequence and the following Dayhoff sequences: FAS_HUMAN, P_R20063, CELT13C2_1, AGRI_RAT, p_W09406, G01639, SC1_RAT, S60062, S51362, and IOV_CHICK was also revealed.
Clone DNA62306-1570 has been deposited with ATCC and is assigned ATCC deposit no. 203254.

実施例１４：ヒトＰＲＯ１１８３をコードするｃＤＮＡクローンの単離
上記の実施例３に記載したシグナル配列アルゴリズムの使用により、IncyteデータベースからのＥＳＴクラスター配列の同定が可能となった。次いでこのＥＳＴクラスター配列を、公的ＥＳＴデータベース(例えば、GenBank)及び企業のＥＳＴＤＮＡデータベース(LIFESEQ(商品名)、Incyte Pharmaceuticals、Palo Alto, CA)を含む種々の発現配列タグ(ＥＳＴ)データベースと比較して、存在する相同性を同定した。相同体検索は、コンピュータプログラムBLAST又はBLAST2(Altschul等, Methods in Enzymology 266: 460-480 (1996))を用いて実施した。既知のタンパク質をコードせず、BLASTスコア７０(９０の場合もある)又はそれ以上を持つ比較物は、プログラム「phrap」(Phil Green, University of Washington, Seattle, Washington)で集団化してコンセンサスＤＮＡ配列を構築した。そこから得られたコンセンサス配列をここでＤＮＡ５６０３７と命名する。
ＤＮＡ５６０３７配列と(前立腺腫瘍組織から構築されたライブラリーからの)IncyteＥＳＴ１６４５８５６内に含まれるＥＳＴ配列との間の配列相同性に鑑みて、ＥＳＴ１６４５８５６を購入し、ｃＤＮＡ挿入物を得て配列決定した。このｃＤＮＡ挿入物の配列を図２５に示し、ここでＤＮＡ６２８８０-１５１３と命名する。
図２５に示す全長クローンは単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置２０-２２に見かけの翻訳開始部位を持ち、そしてヌクレオチド位置１５３５-１５３７の停止コドンで終端する(図２５；配列番号：５１)。予測されるポリペプチド前駆体(図２６、配列番号：５２)は５０５アミノ酸長である。シグナルペプチドは配列番号：５２の約アミノ酸１-２３である。ＰＲＯ１１８３は約５６,６４０ダルトンの算定分子量と約６．１の推定ｐＩを有する。クローンＤＮＡ６２８８０-１５１３は１９９８年８月４日にＡＴＣＣに寄託され、ＡＴＣＣ寄託番号２０３０９７が付された。
図２６(配列番号：５２)に示す全長配列のWU-BLAST2配列アラインメント分析を使用するDayhoffデータベース(バージョン35.45 SwissProt 35)の分析により、ＰＲＯ１１８３アミノ酸配列と以下のDayhoff配列：MTV010_1、P_W41604、S54021、AOFB_HUMAN、NPAJ4683_1、S74689、GEN13608、ACHC_ACHFU、AB011173_1及びPUO_MICRUとの間の配列同一性が明らかになった。ＰＲＯ１１８３又はそのレギュレータの投与により、ある種のオキシダーゼ疾患、例えば多彩性ポルフィリン症を治療できると考えられる。 Example 14: Isolation of cDNA clone encoding human PRO1183 The use of the signal sequence algorithm described in Example 3 above allowed identification of EST cluster sequences from the Incyte database. This EST cluster sequence is then compared to various expressed sequence tag (EST) databases including public EST databases (eg, GenBank) and corporate EST DNA databases (LIFESEQ (trade name), Incyte Pharmaceuticals, Palo Alto, Calif.). Identified the existing homology. Homologue searches were performed using the computer program BLAST or BLAST2 (Altschul et al., Methods in Enzymology 266: 460-480 (1996)). Comparisons that do not encode known proteins and have a BLAST score of 70 (may be 90) or higher are grouped with the program “phrap” (Phil Green, University of Washington, Seattle, Washington) and consensus DNA sequences Built. The consensus sequence obtained therefrom is designated herein as DNA56037.
In view of the sequence homology between the DNA56037 sequence and the EST sequence contained within Incyte EST1645856 (from a library constructed from prostate tumor tissue), EST1645856 was purchased and the cDNA insert was obtained and sequenced. The sequence of this cDNA insert is shown in FIG. 25 and is herein designated as DNA62880-1513.
The full-length clone shown in FIG. 25 contains a single open reading frame, has an apparent translation start site at nucleotide positions 20-22, and ends with a stop codon at nucleotide positions 1535-1537 (FIG. 25; SEQ ID NO: 51). ). The predicted polypeptide precursor (FIG. 26, SEQ ID NO: 52) is 505 amino acids long. The signal peptide is about amino acids 1-23 of SEQ ID NO: 52. PRO1183 has a calculated molecular weight of about 56,640 daltons and an estimated pI of about 6.1. Clone DNA62880-1513 was deposited with ATCC on August 4, 1998 and is assigned ATCC deposit no.
Analysis of the Dayhoff database (version 35.45 SwissProt 35) using the WU-BLAST2 sequence alignment analysis of the full-length sequence shown in FIG. , NPAJ4683_1, S74689, GEN13608, ACHC_ACHFU, AB011173_1 and PUO_MICRU were revealed. It is believed that administration of PRO1183 or its regulator can treat certain oxidase diseases, such as variegated porphyria.

実施例１５：ヒトＰＲＯ１２７２をコードするｃＤＮＡクローンの単離
上記の実施例３に記載したシグナル配列アルゴリズムの使用により、IncyteデータベースからのＥＳＴクラスター配列の同定が可能となった。次いでこのＥＳＴクラスター配列を、公的ＥＳＴデータベース(例えば、GenBank)及び企業のＥＳＴＤＮＡデータベース(LIFESEQ(商品名)、Incyte Pharmaceuticals、Palo Alto, CA)を含む種々の発現配列タグ(ＥＳＴ)データベースと比較して、存在する相同性を同定した。相同体検索は、コンピュータプログラムBLAST又はBLAST2(Altschul等, Methods in Enzymology 266: 460-480 (1996))を用いて実施した。既知のタンパク質をコードせず、BLASTスコア７０(９０の場合もある)又はそれ以上を持つ比較物は、プログラム「phrap」(Phil Green, University of Washington, Seattle, Washington)で集団化してコンセンサスＤＮＡ配列を構築した。そこから得られたコンセンサス配列をここでＤＮＡ５８７５３と命名する。
ＤＮＡ５８７５３配列とＥＳＴ３０４９１６５内に含まれるＥＳＴ配列との間の配列相同性に鑑みて、ＥＳＴ３０４９１６５を含む(肺ライブラリーからの)Incyteクローンを購入し、ｃＤＮＡ挿入物を得て配列決定した。このｃＤＮＡ挿入物の配列を図２７に示し、ここでＤＮＡ６４８９６-１５３９と命名する。
図２７に示す全長クローンは単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置５８-６０に見かけの翻訳開始部位を持ち、そしてヌクレオチド位置５５６-５５８の停止コドンで終端する(図２７；配列番号：５３)。予測されるポリペプチド前駆体(図２８、配列番号：５４)は１６６アミノ酸長である。シグナルペプチドは配列番号：５４の約アミノ酸１-２３である。ＰＲＯ１２７２は約１９,１７１ダルトンの算定分子量と約８．２６の推定ｐＩを有する。クローンＤＮＡ６４８９６-１５３９は１９９８年９月９日にＡＴＣＣに寄託され、ＡＴＣＣ寄託番号２０３２３８が付された。
図２８(配列番号：５４)に示す全長配列のWU-BLAST2配列アラインメント分析を使用するDayhoffデータベース(バージョン35.45 SwissProt 35)の分析により、ＰＲＯ１２７２アミノ酸配列と以下のDayhoff配列(ここで導入されたデータベースからの情報)：AF025474_1、D69100、AE000757_10、H69466、CELC50E3_12、XLRANBP1_1、YD67_SCHPO、B69459、H36856、及びFRU40755_1との間の配列同一性が明らかになった。 Example 15: Isolation of cDNA clones encoding human PRO1272 Use of the signal sequence algorithm described in Example 3 above allowed identification of EST cluster sequences from the Incyte database. This EST cluster sequence is then compared to various expressed sequence tag (EST) databases including public EST databases (eg, GenBank) and corporate EST DNA databases (LIFESEQ (trade name), Incyte Pharmaceuticals, Palo Alto, Calif.). Identified the existing homology. Homologue searches were performed using the computer program BLAST or BLAST2 (Altschul et al., Methods in Enzymology 266: 460-480 (1996)). Comparisons that do not encode known proteins and have a BLAST score of 70 (may be 90) or higher are grouped with the program “phrap” (Phil Green, University of Washington, Seattle, Washington) and consensus DNA sequences Built. The consensus sequence obtained therefrom is designated herein as DNA58753.
In light of the sequence homology between the DNA587553 sequence and the EST sequence contained within EST3049165, an Incyte clone (from the lung library) containing EST3049165 was purchased and the cDNA insert was obtained and sequenced. The sequence of this cDNA insert is shown in FIG. 27 and is herein designated as DNA64896-1539.
The full-length clone shown in FIG. 27 contains a single open reading frame, has an apparent translation start site at nucleotide positions 58-60, and ends with a stop codon at nucleotide positions 556-558 (FIG. 27; SEQ ID NO: 53). ). The predicted polypeptide precursor (Figure 28, SEQ ID NO: 54) is 166 amino acids long. The signal peptide is about amino acids 1-23 of SEQ ID NO: 54. PRO1272 has a calculated molecular weight of about 19,171 daltons and an estimated pI of about 8.26. Clone DNA64896-1539 was deposited with ATCC on September 9, 1998 and is assigned ATCC deposit no.
Analysis of the Dayhoff database (version 35.45 SwissProt 35) using the WU-BLAST2 sequence alignment analysis of the full-length sequence shown in FIG. 28 (SEQ ID NO: 54) revealed that the PRO1272 amino acid sequence and the following Dayhoff sequence (from the database introduced here) Information): AF025474_1, D69100, AE000757_10, H69466, CELC50E3_1, XLRANBP1_1, YD67_SCHPO, B69459, H36856, and FRU40755_1 were revealed.

実施例１６：ヒトＰＲＯ１４１９をコードするｃＤＮＡクローンの単離
上記の実施例３に記載したシグナル配列アルゴリズムの使用により、IncyteデータベースからのＥＳＴクラスター配列の同定が可能となった。次いでこのＥＳＴクラスター配列を、公的ＥＳＴデータベース(例えば、GenBank)及び企業のＥＳＴＤＮＡデータベース(LIFESEQ(商品名)、Incyte Pharmaceuticals、Palo Alto, CA)を含む種々の発現配列タグ(ＥＳＴ)データベースと比較して、存在する相同性を同定した。一又は複数のＥＳＴは発病した扁桃組織ライブラリーから誘導した。相同体検索は、コンピュータプログラムBLAST又はBLAST2(Altschul等, Methods in Enzymology 266: 460-480 (1996))を用いて実施した。既知のタンパク質をコードせず、BLASTスコア７０(９０の場合もある)又はそれ以上を持つ比較物は、プログラム「phrap」(Phil Green, University of Washington, Seattle, Washington)で集団化してコンセンサスＤＮＡ配列を構築した。そこから得られたコンセンサス配列をここでＤＮＡ５９７６１と命名する。
ＤＮＡ５９７６１配列とIncyteＥＳＴ３８１５００８内に含まれるＥＳＴ配列との間の配列相同性に鑑みて、このＥＳＴを含むクローンを購入し、ｃＤＮＡ挿入物を得て配列決定した。このｃＤＮＡ挿入物の配列を図２９に示し、ここでＤＮＡ７１２９０-１６３０と命名する。
図２９に示す全長クローンは単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置８６-８８に見かけの翻訳開始部位を持ち、そしてヌクレオチド位置３４１-３４３の停止コドンで終端する(図２９；配列番号：５５)。予測されるポリペプチド前駆体(図３０、配列番号：５６)は８５アミノ酸長であり、シグナルペプチドは配列番号：５６の約アミノ酸１-１７である。ＰＲＯ１４１９は約９,７００ダルトンの算定分子量と約９．５５の推定ｐＩを有する。クローンＤＮＡ７１２９０-１６３０は１９９８年９月２２日にＡＴＣＣに寄託され、ＡＴＣＣ寄託番号２０３２７５が付された。
図３０(配列番号：５６)に示す全長配列のWU-BLAST2配列アラインメント分析を使用するDayhoffデータベース(バージョン35.45 SwissProt 35)の分析により、ＰＲＯ１４１９アミノ酸配列と以下のDayhoff配列(ここで導入されたデータ)：S07975(B3-hordein)、C48232、HOR7_HORVU、GEN11764、S14970、AF020312_1、STAJ3220_1、CER07E3_1、CEY37A1B、及びATAC00423810との間の配列同一性が明らかになった。 Example 16: Isolation of cDNA clones encoding human PRO1419 The use of the signal sequence algorithm described in Example 3 above allowed identification of EST cluster sequences from the Incyte database. This EST cluster sequence is then compared to various expressed sequence tag (EST) databases including public EST databases (eg, GenBank) and corporate EST DNA databases (LIFESEQ (trade name), Incyte Pharmaceuticals, Palo Alto, Calif.). Identified the existing homology. One or more ESTs were derived from a diseased tonsil tissue library. Homologue searches were performed using the computer program BLAST or BLAST2 (Altschul et al., Methods in Enzymology 266: 460-480 (1996)). Comparisons that do not encode known proteins and have a BLAST score of 70 (may be 90) or higher are grouped with the program “phrap” (Phil Green, University of Washington, Seattle, Washington) and consensus DNA sequences Built. The consensus sequence obtained therefrom is designated herein as DNA59761.
In view of the sequence homology between the DNA59761 sequence and the EST sequence contained within Incyte EST 3815008, a clone containing this EST was purchased and a cDNA insert was obtained and sequenced. The sequence of this cDNA insert is shown in FIG. 29 and is herein designated as DNA71290-1630.
The full-length clone shown in FIG. 29 contains a single open reading frame, has an apparent translation start site at nucleotide positions 86-88, and ends with a stop codon at nucleotide positions 341-343 (FIG. 29; SEQ ID NO: 55). ). The predicted polypeptide precursor (Figure 30, SEQ ID NO: 56) is 85 amino acids long, and the signal peptide is about amino acids 1-17 of SEQ ID NO: 56. PRO1419 has a calculated molecular weight of about 9,700 daltons and an estimated pI of about 9.55. Clone DNA71290-1630 was deposited with ATCC on September 22, 1998 and is assigned ATCC deposit no.
Analysis of the Dayhoff database (version 35.45 SwissProt 35) using the WU-BLAST2 sequence alignment analysis of the full-length sequence shown in FIG. : S07975 (B3-hordein), C48232, HOR7_HORVU, GEN11764, S14970, AF020312_1, STaj3220_1, CER07E3_1, CEY37A1B, and ATAC00423810 were revealed.

実施例１７：ヒトＰＲＯ４９９９をコードするｃＤＮＡクローンの単離
上記実施例１に記載したようにphrapを用いて他のＥＳＴ配列に対してコンセンサスＤＮＡ配列を組み立てた。コンセンサス配列をここでＤＮＡ８６６３４と命名する。ＤＮＡ８６６３４コンセンサス配列に基づいて、１)ＰＣＲにより関心ある配列を含むｃＤＮＡライブラリーを同定するため、及び２)ＰＲＯ４９９９の全長コード配列のクローンを単離するプローブとして使用するために、オリゴヌクレオチドを合成した。
次のプライマー(正方向及び逆方向)を合成した：
正方向ＰＣＲプライマー 5'-CCACTTGCCATGAACATGCCAC-3'(配列番号：５９)
逆方向ＰＣＲプライマー 5'-CCTCTTGACAGACATAGCGAGCCAC-3'(配列番号：６０)
さらに、以下のヌクレオチド配列を持つ合成オリゴヌクレオチドハイブリッド形成プローブをＤＮＡ８６６３４配列から作成した。
ハイブリッド形成プローブ：
5'-CACTCTTGTCTGTGGGAACCACACATCTTGCCACAACTGTGGC-3'(配列番号：６１)
ｃＤＮＡライブラリー作成のためのＲＮＡはヒト精巣組織から単離した。上述のようにして単離されたクローンのＤＮＡ配列決定により、全長ＰＲＯ４９９９の全長ＤＮＡ配列(ここではＤＮＡ９６０３１-２６６４と命名[図３１、配列番号：５７])及びＰＲＯ４９９９ポリペプチドの誘導タンパク質配列が得られた。
上述にて同定された全長クローンは単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置４２-４４に見かけの翻訳開始部位、ヌクレオチド位置２２８３-２２８５に停止コドンを持つ(図３１、配列番号：５７)。予測されるポリペプチド前駆体は７４７アミノ酸長であり、約８２,７１０の算定分子量、及び約６．３６の推定ｐＩを有する。図３２(配列番号：５８)に示す全長ＰＲＯ４９９９配列の分析により、図３２に示す種々の重要なポリペプチドドメインの存在が証明され、それらの重要なポリペプチドドメインに付与された位置は上述したように概略のものである。クローンＤＮＡ９６０３１-２６６４は１９９９年６月１５日にＡＴＣＣに寄託され、ＡＴＣＣ寄託番号２３７-ＰＴＡが付与された。
図３２(配列番号：５８)に示す全長配列のALIGN-2配列アラインメント分析を使用するDayhoffデータベース(バージョン35.45 SwissProt 35)の分析により、ＰＲＯ４９９９アミノ酸配列と以下のDayhoff配列：UROM_HUMAN；FBN1_HUMAN；GGU88872_1；S52111；GEN12408；P_R79478；P_W48756；P_R53087；P_R14584；及びS78549間の配列同一性が証明された。 Example 17: Isolation of cDNA clones encoding human PRO4999 Consensus DNA sequences were assembled against other EST sequences using phrap as described in Example 1 above. The consensus sequence is herein designated DNA86634. Based on the DNA86634 consensus sequence, oligonucleotides were synthesized to 1) identify a cDNA library containing the sequence of interest by PCR, and 2) use as a probe to isolate a full-length coding sequence of PRO4999. .
The following primers (forward and reverse) were synthesized:
Forward PCR primer 5'-CCACTTGCCATGAACATGCCAC-3 '(SEQ ID NO: 59)
Reverse PCR primer 5'-CCTCTTGACAGACATAGCGAGCCAC-3 '(SEQ ID NO: 60)
In addition, a synthetic oligonucleotide hybridization probe having the following nucleotide sequence was generated from the DNA86634 sequence.
Hybridization probe:
5'-CACTCTTGTCTGTGGGAACCACACATCTTGCCACAACTGTGGC-3 '(SEQ ID NO: 61)
RNA for construction of the cDNA library was isolated from human testis tissue. DNA sequencing of the clones isolated as described above yields the full-length PRO4999 full-length DNA sequence (herein named DNA96031-2664 [Figure 31, SEQ ID NO: 57]) and the derived protein sequence of PRO4999 polypeptide. It was.
The full-length clone identified above contains a single open reading frame, with an apparent translation start site at nucleotide positions 42-44 and a stop codon at nucleotide positions 2283-2285 (FIG. 31, SEQ ID NO: 57). The predicted polypeptide precursor is 747 amino acids long, has a calculated molecular weight of about 82,710, and an estimated pI of about 6.36. Analysis of the full-length PRO4999 sequence shown in FIG. 32 (SEQ ID NO: 58) demonstrates the existence of various important polypeptide domains shown in FIG. 32, and the positions assigned to these important polypeptide domains are as described above It is a rough one. Clone DNA96031-2664 was deposited with the ATCC on June 15, 1999 and was assigned ATCC deposit no. 237-PTA.
Analysis of the Dayhoff database (version 35.45 SwissProt 35) using the ALIGN-2 sequence alignment analysis of the full-length sequence shown in FIG. GEN12408; P_R79478; P_W48756; P_R53087; P_R14584; and S78549.

実施例１８：ヒトＰＲＯ７１７０をコードするｃＤＮＡクローンの単離
上記の実施例３に記載したシグナル配列アルゴリズムの使用により、ここでＣＬＵ５７８３６と命名する、LIFESEQ(商品名)データベース、Incyte Pharmaceuticals、Palo Alto,からのＥＳＴクラスター配列の同定が可能となった。次いでこのＥＳＴクラスター配列を、公的ＥＳＴデータベース(例えば、GenBank)及び企業のＥＳＴＤＮＡデータベース(LIFESEQ(商品名)、Incyte Pharmaceuticals、Palo Alto, CA)を含む種々の発現配列タグ(ＥＳＴ)データベースと比較して、存在する相同性を同定した。相同体検索は、コンピュータプログラムBLAST又はBLAST2(Altschul等, Methods in Enzymology 266: 460-480 (1996))を用いて実施した。既知のタンパク質をコードせず、BLASTスコア７０(９０の場合もある)又はそれ以上を持つ比較物は、プログラム「phrap」(Phil Green, University of Washington, Seattle, Washington)で集団化してコンセンサスＤＮＡ配列を構築した。そこから得られたコンセンサス配列をここでＤＮＡ５８７５６と命名する。
ＤＮＡ５８７５６配列と、LIFESEQ(商品名)データベース, Incyte Pharmaceuticals、Palo Altoからのクローン番号２２５１４６２内に含まれるＥＳＴ配列との間の配列相同性に鑑みて、クローン番号２２５１４６２を購入し、ｃＤＮＡ挿入物を得て配列決定した。そのｃＤＮＡ挿入物が全長タンパク質をコードしていることがここで見出された。このｃＤＮＡ挿入物の配列を図３３に示し、ここでＤＮＡ１０８７２２-２７４３と命名する。
クローンＤＮＡ１０８７２２-２７４３は単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置６０-６２に見かけの翻訳開始部位を持ち、そしてヌクレオチド位置１５０６-１５０８の停止コドンで終端する(図３３)。予測されるポリペプチド前駆体は４８２アミノ酸長である(図３４)。図３４に示す全長ＰＲＯ７１７０タンパク質はは約４９,０６０ダルトンの算定分子量と約４．７４のｐＩを有する。図３４(配列番号：６３)に示す全長ＰＲＯ７１７０配列の分析により、図３４に示す種々の重要なポリペプチドドメインの存在が証明され、ここで、それらの重要なポリペプチドドメインに付与された位置は上述した通り概略である。クローンＤＮＡ１０８７２２-２７４３は１９９９年８月１７日にＡＴＣＣに寄託され、ＡＴＣＣ寄託番号５５２-ＰＴＡが付与された。
図３４(配列番号：６３)に示す全長配列のALIGN-2配列アラインメント分析を使用するDayhoffデータベース(バージョン35.45 SwissProt 35)の分析により、ＰＲＯ７１７０アミノ酸配列と以下のDayhoff配列：P_Y12291、I47141、D88733_1、DMC56G7_1、P_Y11606、HWP1_CANAL、HSMUC5BEX_1、HSU78550_1、HSU70136_1、及びSGS3_DROMEとの間の配列同一性が証明された。 Example 18: Isolation of cDNA clone encoding human PRO7170 From the LIFESEQ (R) database, Incyte Pharmaceuticals, Palo Alto, herein designated CLU57836, by use of the signal sequence algorithm described in Example 3 above. EST cluster sequences can be identified. This EST cluster sequence is then compared to various expressed sequence tag (EST) databases including public EST databases (eg, GenBank) and corporate EST DNA databases (LIFESEQ (trade name), Incyte Pharmaceuticals, Palo Alto, Calif.). Identified the existing homology. Homologue searches were performed using the computer program BLAST or BLAST2 (Altschul et al., Methods in Enzymology 266: 460-480 (1996)). Comparisons that do not encode known proteins and have a BLAST score of 70 (may be 90) or higher are grouped with the program “phrap” (Phil Green, University of Washington, Seattle, Washington) and consensus DNA sequences Built. The consensus sequence obtained therefrom is designated herein as DNA58756.
In view of the sequence homology between the DNA58756 sequence and the EST sequence contained within clone number 22251462 from the LIFESEQ (trade name) database, Incyte Pharmaceuticals, Palo Alto, clone number 22251462 was purchased to obtain the cDNA insert. Sequenced. It has now been found that the cDNA insert encodes a full-length protein. The sequence of this cDNA insert is shown in FIG. 33 and is herein designated as DNA108722-2743.
Clone DNA108722-2743 contains a single open reading frame, has an apparent translation start site at nucleotide positions 60-62, and ends with a stop codon at nucleotide positions 1506-1508 (FIG. 33). The predicted polypeptide precursor is 482 amino acids long (Figure 34). The full-length PRO7170 protein shown in FIG. 34 has a calculated molecular weight of about 49,060 daltons and a pI of about 4.74. Analysis of the full-length PRO7170 sequence shown in FIG. 34 (SEQ ID NO: 63) demonstrates the existence of various important polypeptide domains shown in FIG. 34, where the positions assigned to those important polypeptide domains are The outline is as described above. Clone DNA108722-2743 was deposited with ATCC on August 17, 1999 and was assigned ATCC deposit no. 552-PTA.
Analysis of the Dayhoff database (version 35.45 SwissProt 35) using the ALIGN-2 sequence alignment analysis of the full-length sequence shown in FIG. , P_Y11606, HWP1_CANAL, HSMUC5BEX_1, HSU78550_1, HSU70136_1, and SGS3_DROME proved sequence identity.

実施例１９：ヒト２４８をコードするｃＤＮＡクローンの単離
上記の実施例１に記載したようにコンセンサスＤＮＡ配列を他の同定されたＥＳＴ配列に対して構築し、ここでこのコンセンサス配列をＤＮＡ３３４８１と命名した。ＤＮＡ３３４８１コンセンサス配列に基づいて、ＰＣＲにより関心ある配列を含むｃＤＮＡライブラリーを同定するため、及びＰＲＯ２４８の全長コード化配列のクローンを単離するプローブとして使用するために、オリゴヌクレオチドを合成した。特に、次のプライマーを使用した：
正方向プライマー１：(配列番号：６６)：5'-GTCTGACAGCCACTCCAGAG-3'
ハイブリッド形成プローブ(配列番号：６７)：
5'-TCTCCAATTTCTGGGCTTAGATAAGGCGCCTTCACCCCAGAAGTTCC-3'
逆方向プライマー１(配列番号：６８)：5'-GTCCCAGGTTATAGTAAGAATTGG-3'
正方向プライマー２(配列番号：６９)：5'-GTGTTGCGGTCAGTCCCATG-3'
正方向プライマー３(配列番号：７０)：5'-GCTGTCTCCCATTTCCATGC-3'
逆方向プライマー２(配列番号：７１)：5'-CGACTACCATGTCTTCATAATGTC-3'
全長クローンの供給源について幾つかのライブラリーをスクリーニングするために、ライブラリーからのＤＮＡを上述で同定したＰＣＲプライマー対でＰＣＲ増幅することによりスクリーニングした。次いで、ポジティブライブラリーを、プローブオリゴヌクレオチド及びＰＣＲプライマーの一方を用いてＰＲＯ２４８遺伝子をコードするクローンを単離するのに使用した。ｃＤＮＡライブラリー作成のためのＲＮＡはヒト胎児腎臓組織から単離した。
上述のようにして単離されたクローンのＤＮＡ配列決定により、ＰＲＯ２４８の全長ＤＮＡ配列[ここでＤＮＡ３５６７４-１１４２と命名]及びＰＲＯ２４８の誘導タンパク質配列が得られた。
ＤＮＡ３５６７４-１１４２の全ヌクレオチド配列を図３５(配列番号：６４)に示す。クローンＤＮＡ３５６７４-１１４２は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置６６-６８に見かけの翻訳開始部位を持ち、そしてヌクレオチド位置１２１７-１２１９の停止コドンで終端する(図３５；配列番号：６４)。予測されるポリペプチド前駆体は３６４アミノ酸長である(図３６)。クローンＤＮＡ３５６７４-１１４２は１９９７年１０月２８日にＡＴＣＣに寄託され、ＡＴＣＣ寄託番号２０９４１６が付された。
全長ＰＲＯ２４８のアミノ酸配列の分析により、それがヒト及びマウスからの成長分化因子３とある程度のアミノ酸配列同一性を有することが示唆された。 Example 19: Isolation of cDNA clone encoding human 248 A consensus DNA sequence was constructed against other identified EST sequences as described in Example 1 above, where this consensus sequence was designated DNA33481 did. Based on the DNA33481 consensus sequence, oligonucleotides were synthesized to identify cDNA libraries containing sequences of interest by PCR and to use as probes to isolate clones of the full-length coding sequence of PRO248. In particular, the following primers were used:
Forward primer 1: (SEQ ID NO: 66): 5′-GTCTGACAGCCACTCCAGAG-3 ′
Hybridization probe (SEQ ID NO: 67):
5'-TCTCCAATTTCTGGGCTTAGATAAGGCGCCTTCACCCCAGAAGTTCC-3 '
Reverse primer 1 (SEQ ID NO: 68): 5'-GTCCCAGGTTATAGTAAGAATTGG-3 '
Forward primer 2 (SEQ ID NO: 69): 5'-GTGTTGCGGTCAGTCCCATG-3 '
Forward primer 3 (SEQ ID NO: 70): 5'-GCTGTCTCCCATTTCCATGC-3 '
Reverse primer 2 (SEQ ID NO: 71): 5'-CGACTACCATGTCTTCATAATGTC-3 '
To screen several libraries for a source of full-length clones, DNA from the libraries was screened by PCR amplification with the PCR primer pairs identified above. The positive library was then used to isolate a clone encoding the PRO248 gene using one of the probe oligonucleotides and PCR primers. RNA for construction of the cDNA library was isolated from human fetal kidney tissue.
DNA sequencing of the clones isolated as described above yielded the full-length DNA sequence of PRO248 [herein designated as DNA35674-1142] and the derived protein sequence of PRO248.
The entire nucleotide sequence of DNA35674-1142 is shown in FIG. 35 (SEQ ID NO: 64). Clone DNA35674-1142 contains a single open reading frame, has an apparent translation start site at nucleotide positions 66-68, and ends with a stop codon at nucleotide positions 1217-1219 (FIG. 35; SEQ ID NO: 64). . The predicted polypeptide precursor is 364 amino acids long (Figure 36). Clone DNA35674-1142 was deposited with ATCC on October 28, 1997 and is assigned ATCC deposit number 209416.
Analysis of the amino acid sequence of full-length PRO248 suggested that it has some amino acid sequence identity with growth differentiation factor 3 from humans and mice.

実施例２０：ヒトＰＲＯ３５３をコードするｃＤＮＡクローンの単離
上記実施例１に記載したようにphrapを用いて他のＥＳＴ配列に対してコンセンサスＤＮＡ配列を組み立てた。このコンセンサス配列を、ここでＤＮＡ３６３６３と命名する。コンセンサスＤＮＡ配列を、BLASTとphrapの繰り返しサイクルを用いて伸長し、コンセンサス配列を上で議論したＥＳＴ配列の供給源を用いて可能な限り伸長させた。ＤＮＡ３６３６３コンセンサス配列に基づいて、１)ＰＣＲにより関心ある配列を含むｃＤＮＡライブラリーを同定するため、及び２)ＰＲＯ３５３の全長コード配列のクローンを単離するプローブとして使用するために、オリゴヌクレオチドを合成した。
ＤＮＡ３６３６３コンセンサス配列に基づいて、次のように正方向及び逆方向ＰＣＲプライマーを合成した：
正方向ＰＣＲプライマー 5'-TACAGGCCCAGTCAGGACCAGGGG-3'(配列番号：７４)
逆方向ＰＣＲプライマー 5'-CTGAAGAAGTAGAGGCCGGGCACG-3'(配列番号：７５)
さらに、以下のヌクレオチド配列を持つ合成オリゴヌクレオチドハイブリッド形成プローブをＤＮＡ３６３６３コンセンサス配列から作成した。
ハイブリッド形成プローブ
5'-CCCGGTGCTTGCGCTGCTGTGACCCCGGTACCTCCATGTACCCGG-3'(配列番号：７６)
全長クローンの供給源について幾つかのライブラリーをスクリーニングするために、ライブラリーからのＤＮＡを上で同定したＰＣＲプライマー対でのＰＣＲ増幅によりスクリーニングした。次いで、ポジティブライブラリーを、プローブオリゴヌクレオチドとＰＣＲプライマー対の一方を用いてＰＲＯ３５３遺伝子をコードするクローンを単離するのに使用した。ｃＤＮＡライブラリー作成のためのＲＮＡは、ヒト胎児腎臓組織から単離した。
上記のように単離したクローンのＤＮＡ配列決定により、ＰＲＯ３５３の全長ＤＮＡ配列［ここではＤＮＡ４１２３４-１２４２と命名］(配列番号：７２)及びＰＲＯ３５３の誘導タンパク質配列が得られた。
ＤＮＡ４１２３４-１２４２の全ヌクレオチド配列を図３７(配列番号：７２)に示す。クローンＤＮＡ４１２３４-１２４２は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置３０５-３０７に見かけの翻訳開始部位を持ち、ヌクレオチド位置１１４８-１１５０の停止コドンで終端する(図３７)。予測されるポリペプチド前駆体は２８１アミノ酸長である(図３８)。ＰＲＯ３５３によりコードされるアミノ酸配列の重要な領域は、アミノ酸１-２６に対応するシグナルペプチド、アミノ酸位置２７の成熟タンパク質の開始、アミノ酸９３-９８に対応する潜在的なＮグリコシル化部位及びアミノ酸９９-２８１に対応する３０ｋｄの含脂肪細胞補体関連タンパク質前駆体と相同性を有する領域を含む。クローンＤＮＡ４１２３４-１２４２はＡＴＣＣに寄託され、ＡＴＣＣ寄託番号２０９６１８が付与された。
全長ＰＲＯ３５３ポリペプチドのアミノ酸配列の分析により、それらの部分がヒト及びマウス補体タンパク質の一部と有意な相同性を有していることが示唆され、ＰＲＯ３５３が新規な補体タンパク質であることを示している。 Example 20: Isolation of cDNA clones encoding human PRO353 Consensus DNA sequences were assembled against other EST sequences using phrap as described in Example 1 above. This consensus sequence is herein designated DNA36363. The consensus DNA sequence was extended using repeated cycles of BLAST and phrap, and the consensus sequence was extended as much as possible using the sources of EST sequences discussed above. Based on the DNA36363 consensus sequence, oligonucleotides were synthesized to 1) identify a cDNA library containing the sequence of interest by PCR, and 2) use as a probe to isolate a clone of the full-length coding sequence of PRO353. .
Based on the DNA36363 consensus sequence, forward and reverse PCR primers were synthesized as follows:
Forward PCR primer 5'-TACAGGCCCAGTCAGGACCAGGGG-3 '(SEQ ID NO: 74)
Reverse PCR primer 5'-CTGAAGAAGTAGAGGCCGGGCACG-3 '(SEQ ID NO: 75)
In addition, a synthetic oligonucleotide hybridization probe having the following nucleotide sequence was generated from the DNA36363 consensus sequence.
Hybridization probe
5'-CCCGGTGCTTGCGCTGCTGTGACCCCGGTACCTCCATGTACCCGG-3 '(SEQ ID NO: 76)
To screen several libraries for a source of full-length clones, DNA from the libraries was screened by PCR amplification with the PCR primer pairs identified above. The positive library was then used to isolate a clone encoding the PRO353 gene using one of the probe oligonucleotide and PCR primer pair. RNA for construction of the cDNA library was isolated from human fetal kidney tissue.
DNA sequencing of the clones isolated as described above yielded the full-length DNA sequence of PRO353 [herein named DNA41234-1242] (SEQ ID NO: 72) and the derived protein sequence of PRO353.
The entire nucleotide sequence of DNA41234-1242 is shown in FIG. 37 (SEQ ID NO: 72). Clone DNA41234-1242 contains a single open reading frame, has an apparent translation start site at nucleotide positions 305-307, and ends with a stop codon at nucleotide positions 1148-1150 (FIG. 37). The predicted polypeptide precursor is 281 amino acids long (Figure 38). An important region of the amino acid sequence encoded by PRO353 is a signal peptide corresponding to amino acids 1-26, the start of the mature protein at amino acid position 27, a potential N-glycosylation site corresponding to amino acids 93-98 and amino acid 99- A region having homology with the 30 kd adipocyte complement-related protein precursor corresponding to 281. Clone DNA41234-1242 has been deposited with ATCC and is assigned ATCC deposit no.
Analysis of the amino acid sequence of the full-length PRO353 polypeptide suggests that these parts have significant homology with some of the human and mouse complement proteins, indicating that PRO353 is a novel complement protein. Show.

実施例２１：ヒトＰＲＯ１３１８をコードするｃＤＮＡクローンの単離
図３９(配列番号：７７)に示すＤＮＡ７３８３８-１６７４に相当するｃＤＮＡ分子をCuragen, Inc.から得た。 Example 21: Isolation of cDNA clone encoding human PRO1318 A cDNA molecule corresponding to DNA73838-1674 shown in Figure 39 (SEQ ID NO: 77) was obtained from Curagen, Inc.

実施例２２：ヒトＰＲＯ１６００をコードするｃＤＮＡクローンの単離
上記実施例１に記載したようにphrapを用いて他のＥＳＴ配列に対してコンセンサスＤＮＡ配列を組み立てた。このコンセンサス配列を、ここでＤＮＡ７５５１６と命名する。コンセンサスＤＮＡ配列を、BLASTとphrapの繰り返しサイクルを用いて伸長し、コンセンサス配列を上で議論したＥＳＴ配列の供給源を用いて可能な限り伸長させた。ＤＮＡ７５５１６コンセンサス配列に基づいて、１)ＰＣＲにより関心ある配列を含むｃＤＮＡライブラリーを同定するため、及び２)ＰＲＯ１６００の全長コード配列のクローンを単離するプローブとして使用するために、オリゴヌクレオチドを合成した。
ＤＮＡ７５５１６コンセンサス配列に基づいて、次のようにオリゴヌクレオチドプライマーを合成した：
5'-AGACATGGCTCAGTCACTGG-3'(配列番号：８１)
5'-GACCCCTAAAGGGCCATAG-3'(配列番号：８２)
全長クローンの供給源について幾つかのライブラリーをスクリーニングするために、ライブラリーからのＤＮＡを上で同定したプローブを用いてスクリーニングした。ｃＤＮＡライブラリー作成のためのＲＮＡは、ヒト胎児心臓組織から単離した。
上記のように単離したクローンのＤＮＡ配列決定により、ＰＲＯ１６００の全長ＤＮＡ配列［ここではＤＮＡ７７５０３-１６８６と命名］(配列番号：７９)及びＰＲＯ１６００の誘導タンパク質配列が得られた。
ＤＮＡ７７５０３-１６８６の全ヌクレオチド配列を図４１(配列番号：７９)に示す。クローンＤＮＡ７７５０３-１６８６は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置６-８に見かけの翻訳開始部位を持ち、ヌクレオチド位置４０８-４１０の停止コドンで終端する(図４１)。予測されるポリペプチド前駆体は１３４アミノ酸長である(図４２)。ＰＲＯ１６００によりコードされるアミノ酸配列の重要な領域を図４２に示す。クローンＤＮＡ７７５０３-１６８６はＡＴＣＣに寄託され、ＡＴＣＣ寄託番号２０３３６２が付与された。 Example 22: Isolation of cDNA clones encoding human PRO1600 Consensus DNA sequences were assembled against other EST sequences using phrap as described in Example 1 above. This consensus sequence is designated herein as DNA75516. The consensus DNA sequence was extended using repeated cycles of BLAST and phrap, and the consensus sequence was extended as much as possible using the sources of EST sequences discussed above. Based on the DNA75516 consensus sequence, oligonucleotides were synthesized for 1) identifying a cDNA library containing the sequence of interest by PCR, and 2) as a probe to isolate a clone of the full-length coding sequence of PRO1600. .
Based on the DNA75516 consensus sequence, oligonucleotide primers were synthesized as follows:
5'-AGACATGGCTCAGTCACTGG-3 '(SEQ ID NO: 81)
5'-GACCCCTAAAGGGCCATAG-3 '(SEQ ID NO: 82)
To screen several libraries for the source of full-length clones, DNA from the libraries was screened using the probes identified above. RNA for construction of the cDNA library was isolated from human fetal heart tissue.
DNA sequencing of the clones isolated as described above resulted in the full-length DNA sequence of PRO1600 [here designated as DNA77503-1686] (SEQ ID NO: 79) and the derived protein sequence of PRO1600.
The complete nucleotide sequence of DNA775033-1686 is shown in FIG. 41 (SEQ ID NO: 79). Clone DNA775033-1686 contains a single open reading frame, has an apparent translation start site at nucleotide positions 6-8, and ends with a stop codon at nucleotide positions 408-410 (FIG. 41). The predicted polypeptide precursor is 134 amino acids long (Figure 42). The key regions of the amino acid sequence encoded by PRO1600 are shown in FIG. Clone DNA77503-1686 has been deposited with ATCC and is assigned ATCC deposit no.

実施例２３：ヒトＰＲＯ５３３をコードするｃＤＮＡクローンの単離
ＥＳＴ配列寄託番号ＡＦ００７２６８であるマウス線維芽細胞成長因子(ＦＧＦ-１５)を様々な公的ＥＳＴデータベース(例えば、GenBank, Dayhoff等)を検索するのに使用した。検索は、コンピュータプログラムBLAST又はBLAST-2［Altschul等, Methods in Enzymology 266: 460-480 (1996)]を用いて、ＥＣＤタンパク質配列のＥＳＴ配列の６フレーム翻訳との比較として実施した。検索の結果GenBankＥＳＴ ＡＡ２２０９９４がヒットし、ストラタジーンＮＴ２ニューロン前駆体９３７２３０として同定された。
GenBankＥＳＴ ＡＡ２２０９９４配列に基づいて、１)ＰＣＲにより関心ある配列を含むｃＤＮＡライブラリーを同定するため、及び２)全長コード化配列のクローンを単離するプローブとして使用するために、オリゴヌクレオチドを合成した。正及び逆方向ＰＣＲプライマーは２０〜３０のヌクレオチド(典型的には約２４)の範囲とでき、１００-１０００ｂｐの長さのＰＣＲ産物が得られるように設計される。プローブ配列は典型的には４０-５５ｂｐ(典型的には約５０)の長さである。全長クローンの供給源について幾つかのライブラリーをスクリーニングするために、ライブラリーからのＤＮＡをＰＣＲプライマー対で、Ausubel等, Current Protocols in Molecular Biologyに従って、ＰＣＲ増幅によりスクリーニングした。次いで、ポジティブライブラリーを、プローブオリゴヌクレオチド及びＰＣＲプライマーの一方を用いて関心ある遺伝子をコードするクローンを単離するのに使用した。
全長クローンの供給源について幾つかのライブラリーをスクリーニングするために、ライブラリーからのＤＮＡを上で同定したＰＣＲプライマー対でのＰＣＲ増幅によりスクリーニングした。次いで、ポジティブライブラリーを、プローブオリゴヌクレオチド及びＰＣＲプライマーの一方を用いてＰＲＯ５３３遺伝子をコードするクローンを単離するのに使用した。
ｃＤＮＡライブラリーの作成のためのＲＮＡはヒト胎児網膜から単離した。ｃＤＮＡクローンの単離に用いたｃＤＮＡライブラリーは、市販試薬(例えばInvitrogen, San Diego, CA；Clontech等々)を用いて標準的な方法によって作成した。ｃＤＮＡは、ＮｏｔＩ部位を含むオリゴｄＴでプライムし、平滑末端でＳａｌＩヘミキナーゼアダプターに結合させ、ＮｏｔＩで切断し、ゲル電気泳動でおよそのサイズ分類し、そして適切なクローニングベクター(例えばｐＲＫＢ又はｐＲＫＤ等；ｐＲＫ５ＢはＳｆｉＩ部位を含まないｐＲＫ５Ｄの前駆体である；Holmes等, Science, 253: 1278-1280 (1991)参照)に、独特のＸｈｏＩ及びＮｏｔＩ部位において、所定の方向でクローニングした。
ｃＤＮＡクローンはその全体を配列決定した。ＰＲＯ５３３の全長ヌクレオチド列は図４５(配列番号：８５)に示す。クローンＤＮＡ４９４３５-１２１９は単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置４５９-４６１に見かけの翻訳開始部位を持つ(図４５；配列番号：８５)。予測されるポリペプチド前駆体は２１６アミノ酸長である。クローンＤＮＡ４７４１２-１２１９はＡＴＣＣに寄託され、ＡＴＣＣ寄託番号２０９４８０が付与された。
全長配列のBLAST-2及びFastA配列アラインメント分析に基づくと、ＰＲＯ５３３は線維芽細胞成長因子とアミノ酸配列同一性を示す(５３％)。上記の手順で使用したオリゴヌクレオチド配列は次のものであった：
FGF15.正:5'-ATCCGCCCAGATGGCTACAATGTGTA-3'(配列番号：８７)；
FGF15.プローブ:5'-GCCTCCCGGTCTCCCTGAGCAGTGCCAAACAGCGGCAGTGTA-3'(配列番号：８８)：
FGF15.逆:5'-CCAGTCCGGTGACAAGCCCAAA-3'(配列番号：８９)。 Example 23: Isolation of cDNA clones encoding human PRO533 Mouse fibroblast growth factor (FGF-15) with EST sequence accession number AF007268 is searched in various public EST databases (eg, GenBank, Dayhoff, etc.) Used for. The search was performed using the computer program BLAST or BLAST-2 [Altschul et al., Methods in Enzymology 266: 460-480 (1996)] as a comparison of the ECD protein sequence with the 6-frame translation of the EST sequence. As a result of the search, GenBank EST AA220994 was hit and identified as the Stratagene NT2 neuron precursor 937230.
Based on the GenBank EST AA220994 sequence, oligonucleotides were synthesized for 1) identifying a cDNA library containing the sequence of interest by PCR, and 2) as a probe to isolate a clone of the full-length coding sequence. The forward and reverse PCR primers can range from 20-30 nucleotides (typically about 24) and are designed to yield PCR products of 100-1000 bp in length. The probe sequence is typically 40-55 bp (typically about 50) long. To screen several libraries for a source of full-length clones, DNA from the libraries was screened by PCR amplification with PCR primer pairs according to Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology. The positive library was then used to isolate clones encoding the gene of interest using one of the probe oligonucleotides and PCR primers.
To screen several libraries for a source of full-length clones, DNA from the libraries was screened by PCR amplification with the PCR primer pairs identified above. The positive library was then used to isolate clones encoding the PRO533 gene using either probe oligonucleotides or PCR primers.
RNA for construction of the cDNA library was isolated from human fetal retina. The cDNA library used for the isolation of cDNA clones was made by standard methods using commercially available reagents (eg, Invitrogen, San Diego, CA; Clontech, etc.). The cDNA is primed with oligo dT containing a NotI site, ligated to a SalI hemikinase adapter with blunt ends, cut with NotI, roughly sized by gel electrophoresis, and an appropriate cloning vector (such as pRKB or pRKD, etc.) PRK5B is a precursor of pRK5D that does not contain an SfiI site; see Holmes et al., Science, 253: 1278-1280 (1991)), cloned in the specified orientation at unique XhoI and NotI sites.
The entire cDNA clone was sequenced. The full-length nucleotide sequence of PRO533 is shown in FIG. 45 (SEQ ID NO: 85). Clone DNA49435-1219 contains a single open reading frame and has an apparent translation start site at nucleotide positions 459-461 (FIG. 45; SEQ ID NO: 85). The predicted polypeptide precursor is 216 amino acids long. Clone DNA47412-1219 has been deposited with ATCC and is assigned ATCC deposit no.
Based on BLAST-2 and FastA sequence alignment analysis of the full length sequence, PRO533 shows amino acid sequence identity with fibroblast growth factor (53%). The oligonucleotide sequences used in the above procedure were:
FGF15. Correct: 5'-ATCCGCCCAGATGGCTACAATGTGTA-3 '(SEQ ID NO: 87);
FGF15. Probe: 5′-GCCTCCCGGTCTCCCTGAGCAGTGCCAAACAGCGGCAGTGTA-3 ′ (SEQ ID NO: 88):
FGF15. Reverse: 5'-CCAGTCCGGTGACAAGCCCAAA-3 '(SEQ ID NO: 89).

実施例２４：ヒトＰＲＯ３０１をコードするｃＤＮＡクローンの単離
上記実施例１に記載したように、phrapを用いて、ここでＤＮＡ３５９３６と命名するコンセンサスＤＮＡ配列を組み立てた。このコンセンサス配列に基づいて、１)ＰＣＲにより関心ある配列を含むｃＤＮＡライブラリーを同定するため、及び２)全長コード化配列のクローンを単離するプローブとして使用するために、オリゴヌクレオチドを合成した。
全長クローンの供給源について幾つかのライブラリーをスクリーニングするために、ライブラリーからのＤＮＡを上で同定したＰＣＲプライマー対でのＰＣＲ増幅によりスクリーニングした。次いで、ポジティブライブラリーを、プローブオリゴヌクレオチド及びＰＣＲプライマーの一方を用いてＰＲＯ３０１遺伝子をコードするクローンを単離するのに使用した。
ｃＤＮＡライブラリーの作成のためのＲＮＡはヒト胎児腎臓から単離した。
ｃＤＮＡクローンはその全体を配列決定した。天然配列ＰＲＯ３０１の全長ヌクレオチド配列を図４７(配列番号：９０)に示す。クローンＤＮＡ４０６２８-１２１６は単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置５２-５４に見かけの翻訳開始部位を持つ(図４７；配列番号：９０)。予測されるポリペプチド前駆体は２９９アミノ酸長で、３２,５８３ダルトンの予想分子量と８．２９のｐＩを持つ。クローンＤＮＡ４０６２８-１２１６はＡＴＣＣに寄託され、ＡＴＣＣ寄託番号２０９４３２が付与された。
全長配列のBLAST及びFastA配列アラインメント分析に基づいて、ＰＲＯ３０１はＡ３３抗原前駆体(３０％)及びコクサッキー及びアデノウィルスレセプタータンパク質(２９％)とアミノ酸配列同一性を示す。
上記の手順において使用されたオリゴヌクレオチド配列は次の通りであった：
OLI2162(35936.f1) 5'-TCGCGGAGCTGTGTTCTGTTTCCC-3'(配列番号：９２)
OLI2163(35936.p1)
5'-TGATCGCGATGGGGACAAAGGCGCAAGCTCGAGAGGAAACTGTTGTGCCT-3'(配列番号：９３)
OLI2164(35936.f2)
5'-ACACCTGGTTCAAAGATGGG-3'(配列番号：９４)
OLI2165(35936.r1)
5'-TAGGAAGAGTTGCTGAAGGCACGG-3'(配列番号：９５)
OLI2166(35936.f3)
5'-TTGCCTTACTCAGGTGCTAC-3'(配列番号：９６)
OLI2167(35936.r2)
5'-ACTCAGCAGTGGTAGGAAAG-3'(配列番号：９７) Example 24: Isolation of cDNA clones encoding human PRO301 A consensus DNA sequence, designated herein as DNA35936, was assembled using phrap as described in Example 1 above. Based on this consensus sequence, oligonucleotides were synthesized for 1) identifying a cDNA library containing the sequence of interest by PCR and 2) using it as a probe to isolate a clone of the full-length coding sequence.
To screen several libraries for a source of full-length clones, DNA from the libraries was screened by PCR amplification with the PCR primer pairs identified above. The positive library was then used to isolate a clone encoding the PRO301 gene using one of the probe oligonucleotides and PCR primers.
RNA for construction of the cDNA library was isolated from human fetal kidney.
The entire cDNA clone was sequenced. The full length nucleotide sequence of the native sequence PRO301 is shown in FIG. 47 (SEQ ID NO: 90). Clone DNA40628-1216 contains a single open reading frame and has an apparent translation start site at nucleotide positions 52-54 (FIG. 47; SEQ ID NO: 90). The predicted polypeptide precursor is 299 amino acids long, has a predicted molecular weight of 32,583 daltons and a pI of 8.29. Clone DNA40628-1216 has been deposited with ATCC and is assigned ATCC deposit no.
Based on BLAST and FastA sequence alignment analysis of the full length sequence, PRO301 shows amino acid sequence identity with the A33 antigen precursor (30%) and coxsackie and adenovirus receptor proteins (29%).
The oligonucleotide sequences used in the above procedure were as follows:
OLI2162 (35936.f1) 5'-TCGCGGAGCTGTGTTCTGTTTCCC-3 '(SEQ ID NO: 92)
OLI2163 (35936.p1)
5'-TGATCGCGATGGGGACAAAGGCGCAAGCTCGAGAGGAAACTGTTGTGCCT-3 '(SEQ ID NO: 93)
OLI2164 (35936.f2)
5'-ACACCTGGTTCAAAGATGGG-3 '(SEQ ID NO: 94)
OLI2165 (35936.r1)
5'-TAGGAAGAGTTGCTGAAGGCACGG-3 '(SEQ ID NO: 95)
OLI2166 (35936.f3)
5'-TTGCCTTACTCAGGTGCTAC-3 '(SEQ ID NO: 96)
OLI2167 (35936.r2)
5'-ACTCAGCAGTGGTAGGAAAG-3 '(SEQ ID NO: 97)

実施例２５：ヒトＰＲＯ１８７をコードするｃＤＮＡクローンの単離
企業の発現配列タグ(ＥＳＴ)ＤＮＡデータベース(LIFESEQTM、Incyte Pharmaceuticals、Palo Alto, CA)を検索して、アンドロゲン誘発成長因子としても知られている線維芽細胞成長因子(ＦＧＦ-８)と相同性を示したＥＳＴ(＃８４３１９３)を同定した。ｍＲＮＡはInvitrogen, San Diego, CAからの試薬とプロトコールを使用してヒト胎児肺組織から単離した(Fast Track2)。ｃＤＮＡクローンを単離するために使用したｃＤＮＡライブラリーは、商業的に入手できる試薬(例えば、Invitrogen, San Diego, CA, Life Technologies, Gaithersburg, MD)を使用する標準的な方法により作成した。ｃＤＮＡは、ＮｏｔＩ部位を含むオリゴｄＴでプライムし、平滑末端でＳａｌＩヘミキナーゼアダプターに結合させ、ＮｏｔＩで切断し、ゲル電気泳動で適当にサイズ分類し、そしてLife Technologies, Gaithersburg, MDからの試薬とプロトコール(Super Script Plasmid System)を使用してクローニングベクターｐＲＫ５Ｄに定まった方向でクローニングした。二本鎖ｃＤＮＡを１０００ｂｐより大きくなるようにサイズ調整し、ＳａｌＩ／ＮｏｔＩ結合ｃＤＮＡをＸｈｏＩ／ＮｏｔＩ切断ベクター中にクローニングした。ｐＲＫ５Ｄはｓｐ６転写開始部位に続いてＳｆｉＩ制限酵素部位と続いてＸｈｏＩ／ＮｏｔＩｃＤＮＡクローニング部位があるクローニングベクターである。
様々な組織供給源からの幾つかのライブラリーを次のオリゴヌクレオチドプローブでのＰＣＲ増幅によりスクリーニングした：
IN843193.f(OLI 315)(配列番号：１００)
5'-CAGTACGTGAGGGACCAGGGCGCCATGA-3'
IN843193.r(OLI 317)(配列番号：１０１)
5'-CCGGTGACCTGCACGTGCTTGCCA-3'
次いで、ポジティブライブラリーを、上記のオリゴヌクレオチドの一方と次のオリゴヌクレオチドプローブを用いてＰＲＯ１８７遺伝子をコードするクローンを単離するのに使用した。
IN843193.p(OLI 316)(配列番号：１０２)
5'-GCGGATCTGCCGCCTGCTCANCTGGTCGGTCATGGCGCCCT-3'
ｃＤＮＡクローンはその全体を配列決定した。ＰＲＯ１８７(ＤＮＡ２７８６４-１１５５)の全ヌクレオチド配列を図４９(配列番号：９８)に示す。クローンＤＮＡ２７８６４-１１５５は単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置１に見かけの翻訳開始部位を持つ(図４９；配列番号：９８)。予測されるポリペプチドは２０５アミノ酸長である。クローンＤＮＡ２７８６４-１１５５はＡＴＣＣに寄託され(命名：ＤＮＡ２７８６４-１１５５)、ＡＴＣＣ寄託番号２０９３７５が付与された。
全長配列の(ALIGNコンピュータプログラムを使用する)BLAST及びFastA配列アラインメント分析法に基づいて、ＰＲＯ１８７は、ヒト線維芽細胞成長因子-８(アンドロゲン誘発成長因子)と７４％のアミノ酸配列同一性(Blastスコア３１０)を示した。 Example 25: Isolation of cDNA clones encoding human PRO187 Searching the corporate expressed sequence tag (EST) DNA database (LIFESEQ ™ , Incyte Pharmaceuticals, Palo Alto, CA), also known as androgen-induced growth factor EST (# 84193) was identified that showed homology to fibroblast growth factor (FGF-8). mRNA was isolated from human fetal lung tissue using reagents and protocols from Invitrogen, San Diego, CA (Fast Track 2). The cDNA library used to isolate the cDNA clones was made by standard methods using commercially available reagents (eg, Invitrogen, San Diego, CA, Life Technologies, Gaithersburg, MD). The cDNA is primed with oligo dT containing a NotI site, ligated to a SalI hemikinase adapter with blunt ends, cut with NotI, appropriately sized by gel electrophoresis, and reagents from Life Technologies, Gaithersburg, MD. Using the protocol (Super Script Plasmid System), cloning was performed in a defined direction in the cloning vector pRK5D. Double stranded cDNA was sized to be larger than 1000 bp, and SalI / NotI binding cDNA was cloned into XhoI / NotI digested vector. pRK5D is a cloning vector with an sp6 transcription initiation site followed by an SfiI restriction enzyme site followed by an XhoI / NotI cDNA cloning site.
Several libraries from various tissue sources were screened by PCR amplification with the following oligonucleotide probes:
IN843193.f (OLI 315) (SEQ ID NO: 100)
5'-CAGTACGTGAGGGACCAGGGCGCCATGA-3 '
IN843193.r (OLI 317) (SEQ ID NO: 101)
5'-CCGGTGACCTGCACGTGCTTGCCA-3 '
The positive library was then used to isolate a clone encoding the PRO187 gene using one of the above oligonucleotides and the next oligonucleotide probe.
IN843193.p (OLI 316) (SEQ ID NO: 102)
5'-GCGGATCTGCCGCCTGCTCANCTGGTCGGTCATGGCGCCCT-3 '
The entire cDNA clone was sequenced. The entire nucleotide sequence of PRO187 (DNA27864-1155) is shown in FIG. 49 (SEQ ID NO: 98). Clone DNA27864-1155 contains a single open reading frame and has an apparent translation start site at nucleotide position 1 (FIG. 49; SEQ ID NO: 98). The predicted polypeptide is 205 amino acids long. Clone DNA27864-1155 has been deposited with ATCC (nomenclature: DNA27864-1155) and is assigned ATCC deposit no.
Based on BLAST and FastA sequence alignment analysis (using the ALIGN computer program) of the full-length sequence, PRO187 is 74% amino acid sequence identity (Blast score) with human fibroblast growth factor-8 (androgen-induced growth factor). 310).

実施例２６：ヒトＰＲＯ３３７をコードするｃＤＮＡクローンの単離
上記実施例２に記載したようなアミラーゼスクリーニングで単離されたｃＤＮＡを、ここでＤＮＡ４２３０１と命名する。上記実施例１に記載したようにphrapを用いてＤＮＡ４２３０１配列を他のＥＳＴ配列と比較し、ここでＤＮＡ２８７６１と命名するコンセンサス配列を同定した。このコンセンサス配列に基づいて、１)ＰＣＲにより関心ある配列を含むｃＤＮＡライブラリーを同定するため、及び２)全長コード化配列のクローンを単離するプローブとして使用するために、オリゴヌクレオチドを合成した。全長クローンの供給源について幾つかのライブラリーをスクリーニングするために、ライブラリーからのＤＮＡを上で同定したＰＣＲプライマー対でＰＣＲ増幅することによりスクリーニングした。次いで、ポジティブライブラリーを、プローブオリゴヌクレオチド及びＰＣＲプライマー対の一方を用いてＰＲＯ３３７遺伝子をコードするクローンを単離するのに使用した。ｃＤＮＡライブラリー作成のためのＲＮＡは、ヒト胎児脳から単離した。
ｃＤＮＡクローンは、その全体を配列決定した。ＤＮＡ４３３１６-１２３７の全長ヌクレオチド配列を図５１(配列番号：１０３)に示す。クローンＤＮＡ４３３１６-１２３７は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置１３４-１３６に見かけの翻訳開始部位を持つ(図５１；配列番号：１０３)。予測されるポリペプチド前駆体は３４４アミノ酸長である。クローンＤＮＡ４３３１６-１２３７はＡＴＣＣに寄託され、ＡＴＣＣ寄託番号２０９４８７が付与された。
全長配列のBLAST-2及びFastA配列アラインメント分析に基づいて、ＰＲＯ３３７はラットニューロトリミンとアミノ酸配列同一性(９７%)を示す。 Example 26: Isolation of cDNA clone encoding human PRO337 The cDNA isolated by amylase screening as described in Example 2 above is designated herein as DNA42301. The DNA4231 sequence was compared with other EST sequences using phrap as described in Example 1 above, and a consensus sequence designated herein as DNA28761 was identified. Based on this consensus sequence, oligonucleotides were synthesized for 1) identifying a cDNA library containing the sequence of interest by PCR and 2) using it as a probe to isolate a clone of the full-length coding sequence. To screen several libraries for a source of full-length clones, DNA from the libraries was screened by PCR amplification with the PCR primer pairs identified above. The positive library was then used to isolate a clone encoding the PRO337 gene using one of the probe oligonucleotide and PCR primer pair. RNA for construction of the cDNA library was isolated from human fetal brain.
The cDNA clone was sequenced in its entirety. The full-length nucleotide sequence of DNA43316-1237 is shown in FIG. 51 (SEQ ID NO: 103). Clone DNA43316-1237 contains a single open reading frame and has an apparent translation start site at nucleotide positions 134-136 (FIG. 51; SEQ ID NO: 103). The predicted polypeptide precursor is 344 amino acids long. Clone DNA43316-1237 has been deposited with ATCC and is assigned ATCC deposit no.
Based on BLAST-2 and FastA sequence alignment analysis of the full length sequence, PRO337 shows amino acid sequence identity (97%) with rat neurotrimin.

実施例２７：ヒトＰＲＯ１４１１をコードするｃＤＮＡクローンの単離
上記の実施例３に記載したシグナル配列アルゴリズムの使用により、IncyteデータベースからのＥＳＴクラスター配列の同定が可能となった。次いでこのＥＳＴクラスター配列を、公的ＥＳＴデータベース(例えば、GenBank)及び企業のＥＳＴＤＮＡデータベース(LIFESEQ(商品名)、Incyte Pharmaceuticals、Palo Alto, CA)を含む種々の発現配列タグ(ＥＳＴ)データベースと比較して、存在する相同性を同定した。一又は複数のＥＳＴは甲状腺組織ライブラリーから誘導した。相同体検索は、コンピュータプログラムBLAST又はBLAST2(Altschul等, Methods in Enzymology 266: 460-480 (1996))を用いて実施した。既知のタンパク質をコードせず、BLASTスコア７０(９０の場合もある)又はそれ以上を持つ比較物は、プログラム「phrap」(Phil Green, University of Washington, Seattle, Washington)で集団化してコンセンサスＤＮＡ配列を構築した。そこから得られたコンセンサス配列を、ここでＤＮＡ５６０１３と命名する。
ＤＮＡ５６０１３配列とIncyteＥＳＴ１４４４２２５に含まれるＥＳＴ配列との間の配列相同性に鑑みて、このＥＳＴを含むクローンを購入し、ｃＤＮＡ挿入物を得て配列決定した。このｃＤＮＡ挿入物の配列を図５３に示し、ここでＤＮＡ５９２１２-１６２７と命名する。
図５３に示した全長クローンは単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置１８４-１８６に見かけの翻訳開始部位を持ち、そしてヌクレオチド位置１５０４-１５０６の停止コドンで終端する(図５３；配列番号：１０５)。予測されるポリペプチド前駆体(図５４、配列番号：１０６)は４４０アミノ酸長である。シグナルペプチドは配列番号：１０６の約アミノ酸１-２１にあり、細胞付着部位は約アミノ酸３０１-３０３にある。ＰＲＯ１４１１は約４２,２０８ダルトンの算定分子量及び約６．３６の推定ｐＩを有する。クローンＤＮＡ５９２１２-１６２７は１９９８年９月９日にＡＴＣＣに寄託され、ＡＴＣＣ寄託番号２０３２４５が付与された。
図５４(配列番号：１０６)に示した全長配列のWU-BLAST2配列アラインメント分析法を使用しての、Dayhoffデータベース(バージョン35.45 SwissProt 35)の分析により、ＰＲＯ１４１１のアミノ酸配列と以下のDayhoff配列(ここに取り込んだデータベースからのデータ)：MTV023_19, P_R05307, P_W26348, P_P82962, AF000949_1, EBN1_EBV, P_R95107, GRP2_PHAVU, P_R81318, 及びS74439_1との間の配列同一性が明らかにされた。 Example 27: Isolation of cDNA clone encoding human PRO1411 Use of the signal sequence algorithm described in Example 3 above allowed identification of EST cluster sequences from the Incyte database. This EST cluster sequence is then compared to various expressed sequence tag (EST) databases including public EST databases (eg, GenBank) and corporate EST DNA databases (LIFESEQ (trade name), Incyte Pharmaceuticals, Palo Alto, Calif.). Identified the existing homology. One or more ESTs were derived from a thyroid tissue library. Homologue searches were performed using the computer program BLAST or BLAST2 (Altschul et al., Methods in Enzymology 266: 460-480 (1996)). Comparisons that do not encode known proteins and have a BLAST score of 70 (may be 90) or higher are grouped with the program “phrap” (Phil Green, University of Washington, Seattle, Washington) and consensus DNA sequences Built. The consensus sequence obtained therefrom is designated herein as DNA56013.
In view of the sequence homology between the DNA56013 sequence and the EST sequence contained in Incyte EST1444225, a clone containing this EST was purchased and a cDNA insert was obtained and sequenced. The sequence of this cDNA insert is shown in FIG. 53 and is herein designated as DNA59212-1627.
The full-length clone shown in FIG. 53 contains a single open reading frame, has an apparent translation start site at nucleotide positions 184-186, and ends with a stop codon at nucleotide positions 1504-1506 (FIG. 53; SEQ ID NO: 105). The predicted polypeptide precursor (Figure 54, SEQ ID NO: 106) is 440 amino acids long. The signal peptide is at about amino acids 1-21 of SEQ ID NO: 106, and the cell attachment site is at about amino acids 301-303. PRO1411 has a calculated molecular weight of about 42,208 daltons and an estimated pI of about 6.36. Clone DNA59212-1627 was deposited with ATCC on September 9, 1998 and is assigned ATCC deposit no.
Analysis of the Dayhoff database (version 35.45 SwissProt 35) using the WU-BLAST2 sequence alignment analysis method for the full-length sequence shown in FIG. (Data from the database imported into): sequence identity between MTV023_19, P_R05307, P_W26348, P_P82962, AF000949_1, EBN1_EBV, P_R95107, GRP2_PHAVU, P_R81318, and S74439_1.

実施例２８：ヒトＰＲＯ４３５６をコードするｃＤＮＡクローンの単離
上記実施例１に記載したようにphrapを用いて他のＥＳＴ配列に対してコンセンサスＤＮＡ配列を組み立てた。このコンセンサス配列を、ここで「ＤＮＡ８０２００」と命名する。ＤＮＡ８０２００コンセンサス配列とMerck ＥＳＴクローン２４８２８７内に含まれるＥＳＴ配列との間に観察される相同性に基づき、Merck ＥＳＴクローン２４８２８７を購入し、その挿入物を得て配列決定し、よってＤＮＡ８６５７６-２５９５を提供した。
ＰＲＯ４３５６の全コード配列を図５５(配列番号：１０７)に示す。クローンＤＮＡ８６５７６-２５９５は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置５５-５７に見かけの翻訳開始部位と、ヌクレオチド位置８０８-８１０に見かけの停止コドンを持つ。予測されるポリペプチド前駆体は２５１アミノ酸長である。クローンＤＮＡ８６５７６-２５９５はＡＴＣＣに寄託され、ＡＴＣＣ寄託番号２０３８６８が付与された。図５６に示す全長ＰＲＯ４３５６タンパク質は約２６,９３５ダルトンの算定分子量と、約７．４２のｐＩを有する。
図５６(配列番号：１０８)に示す全長配列のWU-BLAST2配列アラインメント分析を使用するDayhoffデータベース(バージョン35.45 SwissProt 35)の分析により、ＰＲＯ４３５６アミノ酸配列とここに導入される以下のDayhoff配列：RNMAGPIAN_1、UPAR_BOVIN、S42152、AF007789_1、UPAR_RAT、UPAR_MOUSE、P_W31165、P_W31168、P_R44423及びP_W26359との間の相同性が明らかになった。 Example 28: Isolation of cDNA clones encoding human PRO4356 Consensus DNA sequences were assembled against other EST sequences using phrap as described in Example 1 above. This consensus sequence is herein designated “DNA80200”. Based on the homology observed between the DNA80200 consensus sequence and the EST sequence contained within Merck EST clone 248287, Merck EST clone 248287 was purchased and its insert obtained and sequenced, thus providing DNA86576-2595 did.
The entire coding sequence of PRO4356 is shown in FIG. 55 (SEQ ID NO: 107). Clone DNA86576-2595 contains a single open reading frame with an apparent translation start site at nucleotide positions 55-57 and an apparent stop codon at nucleotide positions 808-810. The predicted polypeptide precursor is 251 amino acids long. Clone DNA86576-2595 has been deposited with ATCC and is assigned ATCC deposit no. The full-length PRO4356 protein shown in FIG. 56 has a calculated molecular weight of about 26,935 daltons and a pI of about 7.42.
Analysis of the Dayhoff database (version 35.45 SwissProt 35) using the WU-BLAST2 sequence alignment analysis of the full-length sequence shown in FIG. Homology between UPAR_BOVIN, S42152, AF007789_1, UPAR_RAT, UPAR_MOUSE, P_W31165, P_W31168, P_R44423 and P_W26359 was revealed.

実施例２９：ヒトＰＲＯ２４６をコードするｃＤＮＡクローンの単離
上記実施例１に記載したように、phrapを用いて他のＥＳＴに対してコンセンサスＤＮＡ配列を組み立てた。このコンセンサス配列を、ここでＤＮＡ３０９５５と命名する。ＤＮＡ３０９５５コンセンサス配列に基づいて、１)ＰＣＲにより関心ある配列を含むｃＤＮＡライブラリーを同定するため、及び２)ＰＲＯ２４６の全長コード化配列のクローンを単離するプローブとして使用するために、オリゴヌクレオチドを合成した。
一対のＰＣＲプライマー(正方向及び逆方向)を合成した：
正方向ＰＣＲプライマー 5'-AGGGTCTCCAGGAGAAAGACTC-3'(配列番号：１１１)
逆方向ＰＣＲプライマー 5'-ATTGTGGGCCTTGCAGACATAGAC-3'(配列番号：１１２)
また、合成オリゴヌクレオチドハイブリッド形成プローブを、次のヌクレオチド配列を持つコンセンサスＤＮＡ３０９５５配列から作成した。
ハイブリッド形成プローブ
5'-GGCCACAGCATCAAAACCTTAGAACTCAATGTACTGGTTCCTCCAGCTCC-3'(配列番号：１１３)
全長クローンの供給源について幾つかのライブラリーをスクリーニングするために、ライブラリーからのＤＮＡを上で同定したＰＣＲプライマー対でのＰＣＲ増幅によりスクリーニングした。次いで、ポジティブライブラリーを、プローブオリゴヌクレオチド及びＰＣＲプライマーの一方を用いてＰＲＯ２４６遺伝子をコードするクローンを単離するのに使用した。
ｃＤＮＡライブラリーの作成のためのＲＮＡはヒト胎児肝臓組織から単離した。上記のように単離したクローンのＤＮＡ配列決定により、ＰＲＯ２４６に対する全長ＤＮＡ配列［ここでＤＮＡ３５６３９-１１７２と命名］(配列番号：１０９)及びＰＲＯ２４６の誘導タンパク質配列が得られた。
ＤＮＡ３５６３９-１１７２の全ヌクレオチド配列を図５７(配列番号：１０９)に示す。クローンＤＮＡ３５６３９-１１７２は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置１２６-１２８に見かけの翻訳開始部位を持ち、そしてヌクレオチド位置１２９６-１２９８の停止コドンで終端する(図５７)。予測されるポリペプチド前駆体は３９０アミノ酸長である(図５８)。クローンＤＮＡ３５６３９-１１７２はＡＴＣＣに寄託され、ＡＴＣＣ寄託番号２０９３９６が付与された。
全長ＰＲＯ２４６ポリペプチドのアミノ酸配列の分析により、それがヒトの細胞表面タンパク質ＨＣＡＲと有意な相同性を有しており、よってＰＲＯ２４６は新規な細胞表面ウィルスレセプターでありうることが示される。 Example 29: Isolation of cDNA clones encoding human PRO246 Consensus DNA sequences were assembled against other ESTs using phrap as described in Example 1 above. This consensus sequence is herein designated DNA30955. Based on the DNA30955 consensus sequence, oligonucleotides were synthesized for 1) identifying a cDNA library containing the sequence of interest by PCR, and 2) as a probe to isolate a clone of the full-length coding sequence of PRO246. did.
A pair of PCR primers (forward and reverse) were synthesized:
Forward PCR primer 5'-AGGGTCTCCAGGAGAAAGACTC-3 '(SEQ ID NO: 111)
Reverse PCR primer 5'-ATTGTGGGCCTTGCAGACATAGAC-3 '(SEQ ID NO: 112)
In addition, a synthetic oligonucleotide hybridization probe was generated from the consensus DNA30955 sequence having the following nucleotide sequence.
Hybridization probe
5'-GGCCACAGCATCAAAACCTTAGAACTCAATGTACTGGTTCCTCCAGCTCC-3 '(SEQ ID NO: 113)
To screen several libraries for a source of full-length clones, DNA from the libraries was screened by PCR amplification with the PCR primer pairs identified above. The positive library was then used to isolate clones encoding the PRO246 gene using either probe oligonucleotides or PCR primers.
RNA for construction of the cDNA library was isolated from human fetal liver tissue. DNA sequencing of the clones isolated as described above yielded the full-length DNA sequence for PRO246 [herein designated as DNA35639-1172] (SEQ ID NO: 109) and the derived protein sequence of PRO246.
The entire nucleotide sequence of DNA35639-1172 is shown in FIG. 57 (SEQ ID NO: 109). Clone DNA35639-1172 contains a single open reading frame, has an apparent translation start site at nucleotide positions 126-128, and ends with a stop codon at nucleotide positions 1296-1298 (FIG. 57). The predicted polypeptide precursor is 390 amino acids long (Figure 58). Clone DNA35639-1172 has been deposited with ATCC and is assigned ATCC deposit no.
Analysis of the amino acid sequence of the full-length PRO246 polypeptide indicates that it has significant homology with the human cell surface protein HCAR, and thus PRO246 may be a novel cell surface viral receptor.

実施例３０：ヒトＰＲＯ２６５をコードするｃＤＮＡクローンの単離
上記実施例１に記載したように、phrapを用いて他のＥＳＴに対してコンセンサスＤＮＡ配列を組み立てた。このコンセンサス配列を、ここでＤＮＡ３３６７９と命名する。ＤＮＡ３３６７９コンセンサス配列に基づいて、１)ＰＣＲにより関心ある配列を含むｃＤＮＡライブラリーを同定するため、及び２)ＰＲＯ２６５の全長コード化配列のクローンを単離するプローブとして使用するために、オリゴヌクレオチドを合成した。
ＰＣＲプライマー(２つの正方向及び一つの逆方向)を合成した：
正方向ＰＣＲプライマーＡ：5'-CGGTCTACCTGTATGGCAACC-3'(配列番号：１１６)
正方向ＰＣＲプライマーＢ：5'-GCAGGACAACCAGATAAACCAC-3'(配列番号：１１７)
逆方向ＰＣＲプライマー 5'-ACGCAGATTTGAGAAGGCTGTC-3'(配列番号：１１８)
また、合成オリゴヌクレオチドハイブリッド形成プローブを、次のヌクレオチド配列を持つコンセンサスＤＮＡ３３６７９配列から作成した。
ハイブリッド形成プローブ
5'-TTCACGGGCTGCTCTTGCCCAGCTCTTGAAGCTTGAAGAGCTGCAC-3'(配列番号：１１９)
全長クローンの供給源について幾つかのライブラリーをスクリーニングするために、ライブラリーからのＤＮＡを上で同定したＰＣＲプライマー対でのＰＣＲ増幅によりスクリーニングした。次いで、ポジティブライブラリーを、プローブオリゴヌクレオチド及びＰＣＲプライマーの一方を用いてＰＲＯ２６５遺伝子をコードするクローンを単離するのに使用した。
ｃＤＮＡライブラリーの作成のためのＲＮＡはヒト胎児脳ライブラリーから単離した。
上記のように単離したクローンのＤＮＡ配列決定により、ＰＲＯ２６５に対する全長ＤＮＡ配列［ここでＤＮＡ３６３５０-１１５８と命名］(配列番号：１１４)及びＰＲＯ２６５の誘導タンパク質配列が得られた。
ＤＮＡ３６３５０-１１５８の全ヌクレオチド配列を図５９(配列番号：１１４)に示す。クローンＤＮＡ３６３５０-１１５８は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置３５２-３５４に見かけの翻訳開始部位を持ち、そして位置２３３２-２３３４の停止コドンで終端する(図５９)。予測されるポリペプチド前駆体は６６０アミノ酸長である(図６０)。クローンＤＮＡ３６３５０-１１５８はＡＴＣＣに寄託され、ＡＴＣＣ寄託番号２０９３７８が付与された。
全長ＰＲＯ２６５ポリペプチドのアミノ酸配列の分析により、その部分がフィブロモジュリン及びフィブロモジュリン前駆体に対して有意な相同性を有しており、よってＰＲＯ２６５を、特にフィブロモジュリンに関するロイシンリッチ反復ファミリーの新規なメンバーでありうることを示していることが示唆される。 Example 30: Isolation of cDNA clones encoding human PRO265 Consensus DNA sequences were assembled against other ESTs using phrap as described in Example 1 above. This consensus sequence is herein designated DNA33679. Based on the DNA33679 consensus sequence, oligonucleotides were synthesized for 1) identifying a cDNA library containing the sequence of interest by PCR, and 2) as a probe to isolate clones of the full-length coding sequence of PRO265. did.
PCR primers (2 forward and 1 reverse) were synthesized:
Forward PCR primer A: 5′-CGGTCTACCTGTATGGCAACC-3 ′ (SEQ ID NO: 116)
Forward PCR primer B: 5′-GCAGGACAACCAGATAAACCAC-3 ′ (SEQ ID NO: 117)
Reverse PCR primer 5'-ACGCAGATTTGAGAAGGCTGTC-3 '(SEQ ID NO: 118)
A synthetic oligonucleotide hybridization probe was also generated from the consensus DNA33679 sequence having the following nucleotide sequence:
Hybridization probe
5'-TTCACGGGCTGCTCTTGCCCAGCTCTTGAAGCTTGAAGAGCTGCAC-3 '(SEQ ID NO: 119)
To screen several libraries for a source of full-length clones, DNA from the libraries was screened by PCR amplification with the PCR primer pairs identified above. The positive library was then used to isolate a clone encoding the PRO265 gene using one of the probe oligonucleotides and PCR primers.
RNA for construction of the cDNA library was isolated from a human fetal brain library.
DNA sequencing of the clones isolated as described above yielded the full-length DNA sequence for PRO265 [herein designated as DNA36350-1158] (SEQ ID NO: 114) and the derived protein sequence of PRO265.
The entire nucleotide sequence of DNA36350-1158 is shown in FIG. 59 (SEQ ID NO: 114). Clone DNA36350-1158 contains a single open reading frame, has an apparent translation start site at nucleotide positions 352-354, and ends with a stop codon at positions 2332-2334 (FIG. 59). The predicted polypeptide precursor is 660 amino acids long (Figure 60). Clone DNA36350-1158 has been deposited with ATCC and is assigned ATCC deposit no.
Analysis of the amino acid sequence of the full-length PRO265 polypeptide shows that the portion has significant homology to fibromodulin and the fibromodulin precursor, and thus PRO265 is a member of the leucine-rich repeat family, particularly for fibromodulin. This suggests that it may be a new member.

実施例３１：ヒトＰＲＯ９４１をコードするｃＤＮＡクローンの単離
上記実施例１に記載したように種々のＥＳＴ配列に対してコンセンサス配列が得られ、得られたコンセンサス配列は、ここにＤＮＡ３５９４１と命名される。ＤＮＡ３５９４１コンセンサス配列に基づいて、１)ＰＣＲにより関心ある配列を含むｃＤＮＡライブラリーを同定するため、及び２)ＰＲＯ９４１の全長コード化配列のクローンを単離するプローブとして使用するために、オリゴヌクレオチドを合成した。
ＰＣＲプライマーの対(正方向及び逆方向)を合成した：
正方向ＰＣＲプライマー 5'-CTTGACTGTCTCTGAATCTGCACCC-3'(配列番号：１２２)
逆方向ＰＣＲプライマー 5'-AAGTGGTGGAAGCCTCCAGTGTGG-3'(配列番号：１２３)
さらに、合成オリゴヌクレオチドハイブリッド形成プローブは、以下のヌクレオチド配列を持つコンセンサスＤＮＡ３５９４１配列から作成した。
ハイブリッド形成プローブ
5'-CCACTACGGTATTAGAGCAAAAGTTAAAAACCATCATGGTTCCTGGAGCAGC-3'(配列番号：１２４)
全長クローンの供給源について幾つかのライブラリーをスクリーニングするために、ライブラリーからのＤＮＡを上で同定したＰＣＲプライマー対でＰＣＲ増幅してスクリーニングした。次いで、ポジティブライブラリーを、プローブオリゴヌクレオチド及びＰＣＲプライマー対の一方を用いてＰＲＯ９４１遺伝子をコードするクローンを単離するのに使用した。ｃＤＮＡライブラリー作成のためのＲＮＡは、ヒト胎児腎臓組織(LIB227)から単離した。
上記のように単離したクローンのＤＮＡ配列は、ＰＲＯ９４１の全長ＤＮＡ配列［ここで、ＤＮＡ５３９０６-１３６８と命名される］(配列番号：１２０)及びＰＲＯ９４１の誘導タンパク質配列を与えた。
ＤＮＡ５３９０６-１３６８の全ヌクレオチド配列を図６１(配列番号：１２０)に示す。クローンＤＮＡ５３９０６-１３６８は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置３７-３９に見かけの翻訳開始部位を持ち、そしてヌクレオチド位置２３５３-２３５５の停止コドンで終端する(図６１)。予測されるポリペプチド前駆体は７７２アミノ酸長である(図６２)。図６２に示した全長ＰＲＯ９４１タンパク質は、約８７,００２ダルトンの算定分子量及び約４．６４のｐＩを有する。図６２(配列番号：１２１)に示した全長ＰＲＯ９４１配列の分析は、以下のものの存在を明示している：約アミノ酸１〜約アミノ酸２１のシグナルペプチド、約アミノ酸５７〜約アミノ酸６０、約アミノ酸７４〜約アミノ酸７７、約アミノ酸４１９〜約アミノ酸４２２、約アミノ酸４３７〜約アミノ酸４４０、約アミノ酸５０８〜約アミノ酸５１１、約アミノ酸５１５〜約アミノ酸５１８、約アミノ酸５１６〜約アミノ酸５１９及び約アミノ酸５３４〜約アミノ酸５３７の潜在的Ｎ-グリコシル化部位、約アミノ酸１３６〜約アミノ酸１４６及び約アミノ酸２４４〜約アミノ酸２５４のカドヘリン細胞外繰り返しドメインシグネーチャー配列。クローンＤＮＡ５３９０６-１３６８は、１９９８年４月７日にＡＴＣＣに寄託され、ＡＴＣＣ寄託番号２０９７４７が付与されている。
全長ＰＲＯ９４１ポリペプチドのアミノ酸配列の分析は、それがカドヘリンタンパク質と有意な配列類似性を有することを示唆し、それによりＰＲＯ９４１が新規なカドヘリンタンパク質ファミリーメンバーとなりうることが示されている。より詳細には、Dayhoffデータベース(version 35.45 SwissProt 35)は、ＰＲＯ９４１アミノ酸配列と以下のDayhoff配列、I50180, CADA_CHICK, I50178, GEN12782, CADC_HUMAN, P_W25637, A38992, P_R49731, D38992及びG02678との間の有意な相同性を明らかにした。 Example 31: Isolation of cDNA clones encoding human PRO941 Consensus sequences are obtained for various EST sequences as described in Example 1 above, and the resulting consensus sequence is herein designated DNA35941 . Based on the DNA35941 consensus sequence, oligonucleotides were synthesized for 1) identifying a cDNA library containing the sequence of interest by PCR, and 2) as a probe to isolate a clone of the full-length coding sequence of PRO941 did.
PCR primer pairs (forward and reverse) were synthesized:
Forward PCR primer 5'-CTTGACTGTCTCTGAATCTGCACCC-3 '(SEQ ID NO: 122)
Reverse PCR primer 5'-AAGTGGTGGAAGCCTCCAGTGTGG-3 '(SEQ ID NO: 123)
In addition, a synthetic oligonucleotide hybridization probe was generated from the consensus DNA35941 sequence having the following nucleotide sequence:
Hybridization probe
5'-CCACTACGGTATTAGAGCAAAAGTTAAAAACCATCATGGTTCCTGGAGCAGC-3 '(SEQ ID NO: 124)
To screen several libraries for the source of full-length clones, DNA from the libraries was screened by PCR amplification with the PCR primer pairs identified above. The positive library was then used to isolate a clone encoding the PRO941 gene using one of the probe oligonucleotide and PCR primer pair. RNA for construction of the cDNA library was isolated from human fetal kidney tissue (LIB227).
The DNA sequence of the clone isolated as described above gave the full-length DNA sequence of PRO941 [herein named DNA53906-1368] (SEQ ID NO: 120) and the derived protein sequence of PRO941.
The entire nucleotide sequence of DNA53906-1368 is shown in FIG. 61 (SEQ ID NO: 120). Clone DNA53906-1368 contains a single open reading frame, has an apparent translation start site at nucleotide positions 37-39, and ends with a stop codon at nucleotide positions 2353-2355 (FIG. 61). The predicted polypeptide precursor is 772 amino acids long (Figure 62). The full-length PRO941 protein shown in FIG. 62 has a calculated molecular weight of about 87,002 daltons and a pI of about 4.64. Analysis of the full-length PRO941 sequence shown in FIG. 62 (SEQ ID NO: 121) demonstrates the presence of: a signal peptide from about amino acid 1 to about amino acid 21, about amino acid 57 to about amino acid 60, about amino acid 74. To about amino acid 77, about amino acid 419 to about amino acid 422, about amino acid 437 to about amino acid 440, about amino acid 508 to about amino acid 511, about amino acid 515 to about amino acid 518, about amino acid 516 to about amino acid 519 and about amino acid 534 to about A potential N-glycosylation site at amino acid 537, a cadherin extracellular repeat domain signature sequence from about amino acid 136 to about amino acid 146 and from about amino acid 244 to about amino acid 254. Clone DNA53906-1368 was deposited with ATCC on April 7, 1998 and is assigned ATCC deposit number 209747.
Analysis of the amino acid sequence of the full-length PRO941 polypeptide suggests that it has significant sequence similarity to the cadherin protein, indicating that PRO941 can be a novel cadherin protein family member. More specifically, the Dayhoff database (version 35.45 SwissProt 35) shows significant homology between the PRO941 amino acid sequence and the following Dayhoff sequences: I50180, CADA_CHICK, I50178, GEN12782, CADC_HUMAN, P_W25637, A38992, P_R49731, D38992 and G02678 Revealed sex.

実施例３２：ヒトＰＲＯ１００９６をコードするｃＤＮＡクローンの単離
上記の実施例３に記載したシグナル配列アルゴリズムの使用により、ここで５０８６１７３Ｈ１と命名された、IncyteデータベースからのＥＳＴクラスター配列の同定が可能となった。次いでこのＥＳＴクラスター配列を、公的ＥＳＴデータベース(例えば、GenBank)及び企業のＥＳＴＤＮＡデータベース(LIFESEQ(商品名)、Incyte Pharmaceuticals、Palo Alto, CA)を含む種々の発現配列タグ(ＥＳＴ)データベースと比較して、存在する相同性を同定した。相同体検索は、コンピュータプログラムBLAST又はBLAST2(Altschul等, Methods in Enzymology 266: 460-480 (1996))を用いて実施した。既知のタンパク質をコードせず、BLASTスコア７０(９０の場合もある)又はそれ以上を持つ比較物は、プログラム「phrap」(Phil Green, University of Washington, Seattle, Washington)で集団化してコンセンサスＤＮＡ配列を構築した。そこから得られたコンセンサス配列をここでＤＮＡ１１０８８０と命名する。
ＤＮＡ１１０８８０配列と、Incyteデータベースからのクローン番号５０８８３８４内に含まれるＥＳＴ配列との間の配列相同性に鑑みて、クローン番号５０８８３８４を購入し、ｃＤＮＡ挿入物を得て配列決定した。ｃＤＮＡ挿入物は全長タンパク質をコードすることがここで見出された。このｃＤＮＡ挿入物の配列を図６３に示し、ここでＤＮＡ１２５１８５-２５０６と命名する。
クローンＤＮＡ１２５１８５-２５０６は単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置５８-６０に見かけの翻訳開始部位を持ち、そしてヌクレオチド位置５９５-５９７の停止コドンで終端する(図６３)。予測されるポリペプチド前駆体は１７９アミノ酸長である(図６４)。図６４に示す全長ＰＲＯ１００９６タンパク質は、約２０,０１１ダルトンの算定分子量と約８．１０のｐＩを有する。図６４(配列番号：１２６)に示した全長ＰＲＯ１００９６配列の分析により、図６４に示す種々の重要なポリペプチドドメインの存在が証明され、ここで、それらの重要なポリペプチドドメインに付与された位置は上述した通り概略である。クローンＤＮＡ１２５１８５-２５０６は１９９９年１２月７日にＡＴＣＣに寄託され、ＡＴＣＣ寄託番号１０３１-ＰＴＡが付与された。 Example 32 Isolation of cDNA Clones Encoding Human PRO10096 Use of the signal sequence algorithm described in Example 3 above allows identification of EST cluster sequences from the Incyte database, designated here as 5086173H1. It was. This EST cluster sequence is then compared to various expressed sequence tag (EST) databases including public EST databases (eg, GenBank) and corporate EST DNA databases (LIFESEQ (trade name), Incyte Pharmaceuticals, Palo Alto, Calif.). Identified the existing homology. Homologue searches were performed using the computer program BLAST or BLAST2 (Altschul et al., Methods in Enzymology 266: 460-480 (1996)). Comparisons that do not encode known proteins and have a BLAST score of 70 (may be 90) or higher are grouped with the program “phrap” (Phil Green, University of Washington, Seattle, Washington) and consensus DNA sequences Built. The consensus sequence obtained therefrom is designated herein as DNA110880.
In view of the sequence homology between the DNA110880 sequence and the EST sequence contained within clone number 5088384 from the Incyte database, clone number 5088384 was purchased and the cDNA insert was obtained and sequenced. It has now been found that the cDNA insert encodes a full-length protein. The sequence of this cDNA insert is shown in FIG. 63 and is herein designated as DNA125185-2506.
Clone DNA125185-2506 contains a single open reading frame, has an apparent translation start site at nucleotide positions 58-60, and ends with a stop codon at nucleotide positions 595-597 (FIG. 63). The predicted polypeptide precursor is 179 amino acids long (Figure 64). The full-length PRO10096 protein shown in FIG. 64 has a calculated molecular weight of about 20,011 daltons and a pI of about 8.10. Analysis of the full-length PRO10096 sequence shown in FIG. 64 (SEQ ID NO: 126) demonstrates the existence of various important polypeptide domains shown in FIG. 64, where the positions assigned to those important polypeptide domains Is as outlined above. Clone DNA125185-2506 was deposited with ATCC on December 7, 1999 and is assigned ATCC deposit no. 1031-PTA.

実施例３３：ヒトＰＲＯ６００３をコードするｃＤＮＡクローンの単離
天然ヒトＰＲＯ６００３ポリペプチドをコードするｃＤＮＡクローン(ＤＮＡ８３５６８-２６９２)を、一次ｃＤＮＡクローンの５’末端を優勢に示すヒト胎児腎臓ｃＤＮＡライブラリーにおいて、酵母スクリーニングを使用して同定した。
クローンＤＮＡ８３５６８-２６９２は単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置６３８-６４０に見かけの翻訳開始部位を持ち、そしてヌクレオチド位置２２２５-２２２７の停止コドンで終端する(図６５)。予測されるポリペプチド前駆体は５２９アミノ酸長である(図６６)。図６６に示す全長ＰＲＯ６００３タンパク質は、約５９,５８３の算定分子量及び約６．３６の推定ｐＩを有する。図６６(配列番号：１２８)に示す全長ＰＲＯ６００３配列の分析により、図６６に示す種々の重要なポリペプチドドメインの存在が証明され、ここで、それらの重要なポリペプチドドメインに付与された位置は上述した通り概略である。クローンＤＮＡ８３５６８-２６９２は１９９９年７月２０日にＡＴＣＣに寄託され、ＡＴＣＣ寄託番号３８６-ＰＴＡが付与された。
図６６(配列番号：１２８)に示す全長配列のALIGN-2配列アラインメント分析を使用するDayhoffデータベース(バージョン35.45 SwissProt 35)の分析により、ＰＲＯ６００３アミノ酸配列と以下のDayhoff配列：P_W58986、PTND7_1、YKZ3_YEAST、CEK04B12_1、AB014464_1、PCU07059_1、S31213、CELF25E2_2、AF036408_1、及びAB007932_1との間の配列同一性が証明された。 Example 33: Isolation of cDNA clones encoding human PRO6003 A cDNA clone (DNA83568-2692) encoding native human PRO6003 polypeptide was isolated in a human fetal kidney cDNA library that predominantly represents the 5 'end of the primary cDNA clone. Identified using yeast screening.
Clone DNA83568-2692 contains a single open reading frame, has an apparent translation start site at nucleotide positions 638-640, and ends with a stop codon at nucleotide positions 2225-2227 (FIG. 65). The predicted polypeptide precursor is 529 amino acids long (Figure 66). The full-length PRO6003 protein shown in FIG. 66 has a calculated molecular weight of about 59,583 and an estimated pI of about 6.36. Analysis of the full-length PRO6003 sequence shown in FIG. 66 (SEQ ID NO: 128) demonstrates the existence of various important polypeptide domains shown in FIG. 66, where the positions assigned to those important polypeptide domains are The outline is as described above. Clone DNA83568-2692 was deposited with ATCC on July 20, 1999 and was assigned ATCC deposit no. 386-PTA.
Analysis of the Dayhoff database (version 35.45 SwissProt 35) using the ALIGN-2 sequence alignment analysis of the full-length sequence shown in FIG. 66 (SEQ ID NO: 128) revealed that the PRO6003 amino acid sequence and the following Dayhoff sequences: , AB014464_1, PCU07059_1, S31213, CELF25E2_2, AF036408_1, and AB007932_1 were proven sequence identity.

実施例３４：ヒトＰＲＯ６００４をコードするｃＤＮＡクローンの単離
上記実施例１に記載したように種々のＥＳＴ配列に対してコンセンサス配列が得られ、得られたコンセンサス配列は、ここにＤＮＡ８５０４２と命名される。ＤＮＡ８５４０２コンセンサス配列と、IncyteＥＳＴクローン番号３０７８４９２内に含まれるＥＳＴ配列との間に見られる相同性に基づいて、クローンを購入し、その挿入物を得て配列決定した。挿入物の配列をここでＤＮＡ９２２５９と命名し、図６７Ａ-Ｂ(配列番号：１２９)に示す。
クローンＤＮＡ９２２５９は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置１６-１８に見かけの翻訳開始部位を持ち、そしてヌクレオチド位置１０７８-１０８０の停止コドンで終端する(図６７Ａ-Ｂ)。予測されるポリペプチド前駆体は３５４アミノ酸長である(図６８)。図６８に示した全長ＰＲＯ６００４タンパク質は、約３８,７１９ダルトンの算定分子量及び約６．１２のｐＩを有する。図６８(配列番号：１３０)に示した全長ＰＲＯ６００４配列の分析により、図６８に示す種々の重要なポリペプチドドメインの存在が証明され、ここで、それらの重要なポリペプチドドメインに付与された位置は上述した通り概略である。
図６８(配列番号：１３０)に示す全長配列のALIGN-2配列アラインメント分析を使用するDayhoffデータベース(バージョン35.45 SwissProt 35)の分析により、ＰＲＯ６００３アミノ酸配列と以下のDayhoff配列：P_W05152、LAMP_HUMAN、P_W05157、P_W05155、I56551、OPCM_RAT、AMAL_DROME、DMU78177_1、I37246及びNCA1_HUMANとの間の配列同一性が証明された。 Example 34: Isolation of cDNA clones encoding human PRO6004 Consensus sequences are obtained for various EST sequences as described in Example 1 above, and the resulting consensus sequence is herein designated DNA85042 . Based on the homology found between the DNA85402 consensus sequence and the EST sequence contained within Incyte EST clone no. 3078492, a clone was purchased and its insert was obtained and sequenced. The sequence of the insert is herein designated DNA92259 and is shown in FIGS. 67A-B (SEQ ID NO: 129).
Clone DNA92259 contains a single open reading frame, has an apparent translation start site at nucleotide positions 16-18, and ends with a stop codon at nucleotide positions 1078-1080 (FIGS. 67A-B). The predicted polypeptide precursor is 354 amino acids long (Figure 68). The full-length PRO6004 protein shown in FIG. 68 has a calculated molecular weight of about 38,719 daltons and a pI of about 6.12. Analysis of the full-length PRO6004 sequence shown in FIG. 68 (SEQ ID NO: 130) demonstrates the existence of various important polypeptide domains shown in FIG. 68, where the positions assigned to those important polypeptide domains Is as outlined above.
Analysis of the Dayhoff database (version 35.45 SwissProt 35) using the ALIGN-2 sequence alignment analysis of the full-length sequence shown in FIG. 68 (SEQ ID NO: 130) reveals that the PRO6003 amino acid sequence and the following Dayhoff sequences: , I56551, OPCM_RAT, AMAL_DROME, DMU78177_1, I37246 and NCA1_HUMAN demonstrated sequence identity.

実施例３５：ヒトＰＲＯ３５０をコードするｃＤＮＡクローンの単離
上記実施例１に記載したように種々のＥＳＴ配列に対してコンセンサス配列が得られ、得られたコンセンサス配列は、ここにＤＮＡ３９４９３と命名される。ＤＮＡ３９４９３コンセンサス配列に基づいて、１)ＰＣＲにより関心ある配列を含むｃＤＮＡライブラリーを同定するため、及び２)ＰＲＯ３５０の全長コード配列のクローンを単離するプローブとして使用するために、オリゴヌクレオチドを合成した。
ＰＣＲプライマー対(正方向及び逆方向)を合成した：
正方向ＰＣＲプライマー 5'-TCAGGGCTGCCAGGAAGGAAGAGC-3'(配列番号：１３３)
逆方向ＰＣＲプライマー 5'-GCAGGAGGAGAAGGTCTTCCAGAAGAAG-3'(配列番号：１３４)
さらに、以下のヌクレオチド配列を持つ合成オリゴヌクレオチドハイブリッド形成プローブをコンセンサスＤＮＡ３９４９３配列から作成した。
ハイブリッド形成プローブ
5'-AGAAGTTCCAGTCAGCCCACAAGATGCCATTGTCCCCCGGCCTCC-3'(配列番号：１３５)
全長クローンの供給源について幾つかのライブラリーをスクリーニングするために、ライブラリーからのＤＮＡを上で同定したＰＣＲプライマー対の一つでのＰＣＲ増幅によりスクリーニングした。次いで、ポジティブライブラリーを、プローブオリゴヌクレオチドとＰＣＲプライマー対の一つを用いてＰＲＯ３５０遺伝子をコードするクローンを単離するのに使用した。ｃＤＮＡライブラリー作成のためのＲＮＡは、ヒト胎児腎臓組織から単離した。
上記のように単離したクローンのＤＮＡ配列決定により、ＰＲＯ３５０の全長ＤＮＡ配列［ここではＤＮＡ４４１７５-１３１４と命名］(配列番号：１３１)及びＰＲＯ３５０の誘導タンパク質配列が得られた。
ＤＮＡ４４１７５-１３１４の全ヌクレオチド配列を図６９(配列番号：１３１)に示す。ＤＮＡ４４１７５-１３１４は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置３５６-３５８に見かけの翻訳開始部位を持ち、ヌクレオチド位置８２１-８２３の停止コドンで終端する(図６９)。予測されるポリペプチド前駆体は１５５アミノ酸長である(図７０)。図７０に示す全長ＰＲＯ３５０タンパク質は約１７,１９４ダルトンの算定分子量及び約１０．４４のｐＩを有する。図７０(配列番号：１３２)に示した全長ＰＲＯ３５０配列の分析により、図７０に示す種々の重要なポリペプチドドメインの存在が証明された。 Example 35: Isolation of cDNA clones encoding human PRO350 Consensus sequences were obtained for various EST sequences as described in Example 1 above, and the resulting consensus sequence is herein designated DNA39493 . Based on the DNA39493 consensus sequence, oligonucleotides were synthesized for 1) identifying a cDNA library containing the sequence of interest by PCR, and 2) as a probe to isolate a clone of the full-length coding sequence of PRO350. .
PCR primer pairs (forward and reverse) were synthesized:
Forward PCR primer 5'-TCAGGGCTGCCAGGAAGGAAGAGC-3 '(SEQ ID NO: 133)
Reverse PCR primer 5'-GCAGGAGGAGAAGGTCTTCCAGAAGAAG-3 '(SEQ ID NO: 134)
In addition, a synthetic oligonucleotide hybridization probe having the following nucleotide sequence was generated from the consensus DNA39493 sequence.
Hybridization probe
5'-AGAAGTTCCAGTCAGCCCACAAGATGCCATTGTCCCCCGGCCTCC-3 '(SEQ ID NO: 135)
To screen several libraries for a source of full-length clones, DNA from the libraries was screened by PCR amplification with one of the PCR primer pairs identified above. The positive library was then used to isolate a clone encoding the PRO350 gene using one of the probe oligonucleotide and one of the PCR primer pairs. RNA for construction of the cDNA library was isolated from human fetal kidney tissue.
DNA sequencing of the clone isolated as described above yielded the full-length DNA sequence of PRO350 [herein named as DNA44175-1314] (SEQ ID NO: 131) and the derived protein sequence of PRO350.
The entire nucleotide sequence of DNA44175-1314 is shown in FIG. 69 (SEQ ID NO: 131). DNA44175-1314 contains a single open reading frame, has an apparent translation start site at nucleotide positions 356-358, and ends with a stop codon at nucleotide positions 821-823 (FIG. 69). The predicted polypeptide precursor is 155 amino acids long (Figure 70). The full-length PRO350 protein shown in FIG. 70 has a calculated molecular weight of about 17,194 daltons and a pI of about 10.44. Analysis of the full-length PRO350 sequence shown in FIG. 70 (SEQ ID NO: 132) demonstrated the existence of various important polypeptide domains shown in FIG.

実施例３６：ハイブリッド形成プローブとしてのＰＲＯの使用
以下の方法は、ＰＲＯをコードするヌクレオチド配列のハイブリッド形成プローブとしての使用を記載する。
ここに開示する全長又は成熟ＰＲＯのコード配列を含むＤＮＡは、ヒト組織ｃＤＮＡライブラリー又はヒト組織ゲノムライブラリーにおける相同性ＤＮＡ類(ＰＲＯの天然に生じる変異体をコードするものなど)のスクリーニングのためのプローブとして用いられる。
いずれかのライブラリーＤＮＡを含むフィルターのハイブリッド形成及び洗浄は、以下の高緊縮条件で実施した。放射標識ＰＲＯ誘導プローブのフィルターへのハイブリッド形成は、50%ホルムアミド、5xＳＳＣ、0.1%ＳＤＳ、0.1%ピロリン酸ナトリウム、50mMリン酸ナトリウム、pH6.8、2xデンハート液、及び10%デキストラン硫酸の溶液中で、42℃において20時間行った。フィルターの洗浄は、0.1xＳＳＣ及び0.1%ＳＤＳの水溶液中、42℃で行った。
次いで、全長天然配列ＰＲＯをコードするＤＮＡと所望の配列同一性を有するＤＮＡは、この分野で知られた標準的な方法を用いて同定できる。 Example 36: Use of PRO as a hybridization probe The following method describes the use of a nucleotide sequence encoding PRO as a hybridization probe.
DNA containing the full-length or mature PRO coding sequence disclosed herein is for screening homologous DNAs (such as those encoding naturally occurring variants of PRO) in human tissue cDNA libraries or human tissue genomic libraries. Used as a probe.
Hybridization and washing of the filters containing any library DNA was performed under the following high stringency conditions. Hybridization of the radiolabeled PRO induction probe to the filter was performed in a solution of 50% formamide, 5x SSC, 0.1% SDS, 0.1% sodium pyrophosphate, 50 mM sodium phosphate, pH 6.8, 2x Denhart solution, and 10% dextran sulfate. At 42 ° C. for 20 hours. The filter was washed at 42 ° C. in an aqueous solution of 0.1 × SSC and 0.1% SDS.
The DNA having the desired sequence identity with the DNA encoding the full-length native sequence PRO can then be identified using standard methods known in the art.

実施例３７：大腸菌におけるＰＲＯの発現
この実施例は、大腸菌における組み換え発現によるＰＲＯの非グリコシル化形態の調製を例示する。
ＰＲＯをコードするＤＮＡ配列は、選択されたＰＣＲプライマーを用いて最初に増幅した。プライマーは、選択された発現ベクターの制限酵素部位に対応する制限酵素部位を持たなければならない。種々の発現ベクターを用いることができる。好適なベクターの例は、ｐＢＲ３２２(大腸菌から誘導されたもの；Bolivar等, Gene, 2:95 (1977)を参照)であり、アンピシリン及びテトラサイクリン耐性についての遺伝子を含む。ベクターは、制限酵素で消化され、脱リン酸化される。ＰＣＲ増幅した配列は、次いで、ベクターに結合させる。ベクターは、好ましくは抗生物質耐性遺伝子、ｔｒｐプロモーター、ｐｏｌｙｈｉｓリーダー(最初の６つのＳＴＩＩコドン、ｐｏｌｙｈｉｓ配列、及びエンテロキナーゼ切断部位を含む)、ＰＲＯコード化領域、ラムダ転写終結区、及びａｒｇＵ遺伝子を含む。
ライゲーション混合物は、次いで、上掲のSambrook等に記載された方法を用いた選択した大腸菌株の形質転換に使用される。形質転換体は、それらのＬＢプレートで成長する能力により同定され、次いで抗生物質耐性クローンが選択される。プラスミドＤＮＡが単離され、制限分析及びＤＮＡ配列分析で確認される。
選択されたクローンは、抗生物質を添加したＬＢブロスなどの液体培地で終夜成長させることができる。終夜培養は、続いて大規模培養の播種に用いられる。次に細胞を最適光学密度まで成長させ、その間に発現プロモーターが作動する。
更に数時間の細胞培養の後、細胞を遠心分離により採集する。遠心分離で得られた細胞ペレットは、この分野で知られた種々の試薬を用いて可溶化され、次いで可溶化ＰＲＯタンパク質を金属キレート化カラムを用いてタンパク質を緊密に結合させる条件下で精製することができる。
以下の手法を用いて、大腸菌においてポリＨｉｓタグ形態でＰＲＯを発現させてもよい。ＰＲＯをコードするＤＮＡを選択したＰＣＲプライマーを用いて最初に増幅する。プライマーは、選択された発現ベクターの制限酵素部位に対応する制限酵素部位、及び効率的で信頼性のある翻訳開始、金属キレートカラムでの迅速な精製、及びエンテロキナーゼでのタンパク質分解的除去を与える他の有用な配列を含む。次いでＰＣＲ増幅された、ポリ-Ｈｉｓタグ配列を発現ベクターに結合させ、それを株５２(W3110 fuhA(tonA) lon galE rpoHts(htpRts) clpP(lacIq))に基づく大腸菌宿主の形質転換に使用した。形質転換体は、最初に50mg/mlのカルベニシリンを含有するＬＢ中、30℃で振盪しながら3-5のＯ．Ｄ．６００に達するまで成長させた。ついで培養をＣＲＡＰ培地(3.57gの(ＮＨ４)２ＳＯ４、0.71gのクエン酸ナトリウム・2H2O、1.07gのＫＣｌ、5.36gのDifco酵母抽出物、500mL水中の5.36gのShefield hycase SF、並びに110mMのＭＰＯＳ、pH7.3、0.55%(w/v)のグルコース及び７ｍMのＭｇＳＯ４の混合で調製)中に50-100倍希釈し、30℃で振盪させながら約20-30時間成長させた。試料を取り出してＳＤＳ-ＰＡＧＥ分析により発現を確認し、バルク培養を遠心分離して細胞をペレット化した。細胞ペレットを精製及び再折りたたみまで凍結させた。 Example 37: Expression of PRO in E. coli This example illustrates the preparation of an unglycosylated form of PRO by recombinant expression in E. coli.
The DNA sequence encoding PRO was first amplified using selected PCR primers. The primer must have a restriction enzyme site corresponding to the restriction enzyme site of the selected expression vector. Various expression vectors can be used. An example of a suitable vector is pBR322 (derived from E. coli; see Bolivar et al., Gene, 2:95 (1977)), which contains genes for ampicillin and tetracycline resistance. The vector is digested with restriction enzymes and dephosphorylated. The PCR amplified sequence is then ligated into a vector. The vector preferably contains an antibiotic resistance gene, trp promoter, polyhis leader (including the first 6 STII codons, polyhis sequence, and enterokinase cleavage site), PRO coding region, lambda transcription termination region, and argU gene .
The ligation mixture is then used to transform selected E. coli strains using the method described in Sambrook et al., Supra. Transformants are identified by their ability to grow on LB plates and then antibiotic resistant clones are selected. Plasmid DNA is isolated and confirmed by restriction analysis and DNA sequence analysis.
Selected clones can be grown overnight in liquid media such as LB broth supplemented with antibiotics. Overnight cultures are subsequently used for seeding large scale cultures. The cells are then grown to optimal optical density, during which the expression promoter is activated.
After a further several hours of cell culture, the cells are harvested by centrifugation. The cell pellet obtained by centrifugation is solubilized using various reagents known in the art, and then the solubilized PRO protein is purified under conditions that allow the protein to bind tightly using a metal chelation column. be able to.
PRO may be expressed in E. coli in poly-His tag form using the following procedure. DNA encoding PRO is first amplified using selected PCR primers. Primers provide restriction enzyme sites that correspond to the restriction enzyme sites of the selected expression vector, and efficient and reliable translation initiation, rapid purification with metal chelate columns, and proteolytic removal with enterokinase Includes other useful sequences. The PCR-amplified poly-His tag sequence was then ligated into an expression vector, which was used to transform an E. coli host based on strain 52 (W3110 fuhA (tonA) lon galE rpoHts (htpRts) clpP (lacIq)). Transformants were initially treated with 3-5 O.D. with shaking at 30 ° C. in LB containing 50 mg / ml carbenicillin. D. Grow to 600. The culture was then incubated with CRAP medium (3.57 g (NH 4) 2 SO 4, 0.71 g sodium citrate 2H 2 O, 1.07 g KCl, 5.36 g Difco yeast extract, 5.36 g Shefield hycase SF in 500 mL water, and 110 mM MPOS. , PH 7.3, prepared with a mixture of 0.55% (w / v) glucose and 7 mM MgSO 4) and grown for about 20-30 hours with shaking at 30 ° C. A sample was removed and expression was confirmed by SDS-PAGE analysis, and the bulk culture was centrifuged to pellet the cells. Cell pellets were frozen until purification and refolding.

0.5から1Lの発酵(6-10gペレット)からの大腸菌ペーストを、7Mのグアニジン、20mMのトリス、pH8バッファー中で10容量(w/v)で再懸濁させた。固体硫酸ナトリウム及びテトラチオン酸ナトリウムを添加して最終濃度を各々0.1M及び0.02Mとし、溶液を4℃で終夜撹拌した。この工程により、亜硫酸化によりブロックされた全てのシステイン残基を持つ変性タンパク質がもたらされた。溶液をBeckman Ultracentrifuge中で40,000rpmで30分間遠心分離した。上清を金属キレートカラムバッファー(6Mのグアニジン、20mMのトリス、pH7.4)の3-5容量で希釈し、0.22ミクロンフィルターを通して濾過して透明化した。透明化抽出物を、金属キレートカラムバッファーで平衡化させた5mlのQiagen Ni-NTA金属キレートカラムに充填した。カラムを50mMのイミダゾール(Calbiochem, Utrol grade)を含む添加バッファー、pH7.4で洗浄した。タンパク質を250mMのイミダゾールを含有するバッファーで溶離した。所望のタンパク質を含有する画分をプールし、4℃で保存した。タンパク質濃度は、そのアミノ酸配列に基づいて計算した吸光係数を用いて280nmにおけるその吸収により見積もった。
試料を、20mMのトリス、pH8.6、0.3MのＮａＣｌ、2.5Mの尿素、5ｍＭのシステイン、20mMのグリシン及び1mMのＥＤＴＡからなる新たに調製した再折りたたみバッファー中に徐々に希釈することによりタンパク質を再折りたたみさせた。リフォールディング容量は、最終的なタンパク質濃度が50〜100マイクログラム/mlとなるように選択した。リフォールディング溶液を4℃で12-36時間ゆっくり撹拌した。リフォールディング反応はＴＦＡを最終濃度0.4%(約３のｐＨ)で添加することにより停止させた。タンパク質をさらに精製する前に、溶液を0.22ミクロンフィルターを通して濾過し、アセトニトリルを最終濃度2-10%になるまで添加した。再折りたたみされたタンパク質を、Poros R1/H逆相カラムで、0.1%ＴＦＡの移動バッファーと10〜80%のアセトニトリル勾配での溶離を用いてクロマトグラフにかけた。A280吸収を持つ画分のアリコートをＳＤＳポリアクリルアミドゲルで分析し、相同な再折りたたみされたタンパク質を含有する画分をプールした。一般的に、殆どのタンパク質の正しく再折りたたみされた種は、これらの種が最もコンパクトであり、その疎水性内面が逆相樹脂との相互作用から遮蔽されているので、アセトニトリルの最低濃度で溶離される。凝集した種は通常、より高いアセトニトリル濃度で溶離される。タンパク質の誤って折りたたまれた形態を所望の形態から除くのに加えて、逆相工程は試料からエンドトキシンも除去する。
所望の折りたたまれたＰＲＯポリペプチドを含有する画分をプールし、溶液に向けた窒素の弱い気流を用いてアセトニトリルを除去した。タンパク質を、透析又は調製バッファーで平衡化したG25 Superfine(Pharmacia)樹脂でのゲル濾過及び滅菌濾過により、0.14Mの塩化ナトリウム及び4%のマンニトールを含む20mMのＨｅｐｅｓ、pH6.8に処方した。
ここに開示した多くのＰＲＯポリペプチドが上記のようにして成功裏に発現された。 E. coli paste from 0.5 to 1 L fermentation (6-10 g pellet) was resuspended in 10 volumes (w / v) in 7 M guanidine, 20 mM Tris, pH 8 buffer. Solid sodium sulfate and sodium tetrathionate were added to final concentrations of 0.1 M and 0.02 M, respectively, and the solution was stirred at 4 ° C. overnight. This process resulted in a denatured protein with all cysteine residues blocked by sulfation. The solution was centrifuged for 30 minutes at 40,000 rpm in a Beckman Ultracentrifuge. The supernatant was diluted with 3-5 volumes of metal chelate column buffer (6M guanidine, 20 mM Tris, pH 7.4) and filtered through a 0.22 micron filter to clarify. The clarified extract was loaded onto a 5 ml Qiagen Ni-NTA metal chelate column equilibrated with metal chelate column buffer. The column was washed with an addition buffer containing 50 mM imidazole (Calbiochem, Utrol grade), pH 7.4. The protein was eluted with a buffer containing 250 mM imidazole. Fractions containing the desired protein were pooled and stored at 4 ° C. The protein concentration was estimated by its absorption at 280 nm using the extinction coefficient calculated based on its amino acid sequence.
Proteins by gradually diluting samples in freshly prepared refolding buffer consisting of 20 mM Tris, pH 8.6, 0.3 M NaCl, 2.5 M urea, 5 mM cysteine, 20 mM glycine and 1 mM EDTA Was refolded. The refolding volume was selected so that the final protein concentration was 50-100 microgram / ml. The refolding solution was slowly stirred at 4 ° C. for 12-36 hours. The refolding reaction was stopped by adding TFA at a final concentration of 0.4% (pH of about 3). Prior to further purification of the protein, the solution was filtered through a 0.22 micron filter and acetonitrile was added to a final concentration of 2-10%. The refolded protein was chromatographed on a Poros R1 / H reverse phase column, eluting with a 0.1% TFA transfer buffer and a 10-80% acetonitrile gradient. Aliquots of fractions with A280 absorption were analyzed on SDS polyacrylamide gels and fractions containing homologous refolded proteins were pooled. In general, correctly refolded species of most proteins elute at the lowest concentration of acetonitrile because these species are the most compact and their hydrophobic inner surface is shielded from interaction with the reverse phase resin. Is done. Aggregated species are usually eluted at higher acetonitrile concentrations. In addition to removing the misfolded form of the protein from the desired form, the reverse phase process also removes endotoxin from the sample.
Fractions containing the desired folded PRO polypeptide were pooled and the acetonitrile removed using a gentle stream of nitrogen directed at the solution. The protein was formulated into 20 mM Hepes, pH 6.8 containing 0.14 M sodium chloride and 4% mannitol by gel filtration and sterile filtration on G25 Superfine (Pharmacia) resin equilibrated with dialysis or preparation buffer.
Many of the PRO polypeptides disclosed herein were successfully expressed as described above.

実施例３８：哺乳動物細胞でのＰＲＯの発現
この実施例は、哺乳動物細胞における組み換え発現による潜在的にグリコシル化した形態のＰＲＯの調製を例示する。
発現ベクターとしてベクターｐＲＫ５(1989年3月15日公開のEP 307,247参照)を用いた。場合によっては、ＰＲＯ ＤＮＡを選択した制限酵素を持つｐＲＫ５に結合させ、上掲のSambrook等に記載されたようなライゲーション方法を用いてＰＲＯＤＮＡを挿入させることができる。得られたベクターは、ｐＲＫ５-ＰＲＯと呼ばれる。
一実施態様では、選択された宿主細胞は２９３細胞とすることができる。ヒト２９３細胞(ATCC CCL 1573)は、ウシ胎児血清及び場合によっては滋養成分及び／又は抗生物質を添加したＤＭＥＭなどの培地中で組織培養プレートにおいて成長させて集密化した。約10μｇのｐＲＫ５-ＰＲＯ ＤＮＡを約1μgのＶＡ ＲＮＡ遺伝子コード化ＤＮＡ［Thimmappaya等, Cell, 31:543 (1982))］と混合し、500μlの1mMトリス-ＨＣｌ、0.1mMＥＤＴＡ、0.227MＣａＣｌ２に溶解させた。この混合物に、滴状の、500μlの50mMＨＥＰＥＳ(pH7.35)、280mMのＮａＣｌ、1.5mMのＮａＰＯ４を添加し、25℃で10分間析出物を形成させた。析出物を懸濁し、２９３細胞に加えて37℃で約4時間定着させた。培地を吸引し、ＰＢＳ中2mlの20%グリセロールを30秒間添加した。２９３細胞は、次いで無血清培地で洗浄し、新鮮な培地を添加し、細胞を約5日間インキュベートした。
形質移入の約24時間後、培地を除去し、培地(のみ)又は200μCi/ml３５Ｓ-システイン及び200μCi/ml３５Ｓ-メチオニンを含む培地で置換した。12時間のインキュベーションの後、条件培地を回収し、スピンフィルターで濃縮し、15%ＳＤＳゲルに添加した。処理したゲルを乾燥させ、ＰＲＯポリペプチドの存在を現す選択された時間にわたってフィルムにさらした。形質転換した細胞を含む培地に、更なるインキュベーションを施し(無血清培地で)、培地を選択されたバイオアッセイで試験した。
これに換わる技術において、ＰＲＯは、Somparyac等, Proc. Natl. Acad. Sci., 12:7575 (1981)に記載されたデキストラン硫酸法を用いて２９３細胞に一過的に導入される。２９３細胞は、スピナーフラスコ内で最大密度まで成長させ、700μｇのｐＲＫ５-ＰＲＯ ＤＮＡを添加する。細胞は、まずスピナーフラスコから遠心分離によって濃縮し、ＰＢＳで洗浄した。ＤＮＡ-デキストラン沈殿物を細胞ペレット上で4時間インキュベートした。細胞を20%グリセロールで90秒間処理し、組織培地で洗浄し、組織培地、5μg/mlウシインシュリン及び0.1μg/mlウシトランスフェリンを含むスピナーフラスコに再度導入した。約4日後に、条件培地を遠心分離して濾過し、細胞及び細胞片を除去した。次いで発現されたＰＲＯを含む試料を濃縮し、透析及び／又はカラムクロマトグラフィー等の選択した方法によって精製した。
他の実施態様では、ＰＲＯをＣＨＯ細胞で発現させることができる。ｐＲＫ５-ＰＲＯは、ＣａＰＯ４又はＤＥＡＥ-デキストランなどの公知の試薬を用いてＣＨＯ細胞に形質移入することができる。上記したように、細胞培地をインキュベートし、培地を培養培地(のみ)又は３５Ｓ-メチオニン等の放射性標識を含む培地に置換することができる。ＰＲＯポリペプチドの存在を同定した後、培地を無血清培地に置換してもよい。好ましくは、培地を約６日間インキュベートし、次いで条件培地を収集する。次いで、発現されたＰＲＯを含む培地を濃縮して、任意の選択した方法によって精製することができる。
また、エピトープタグＰＲＯは、宿主ＣＨＯ細胞において発現させてもよい。ＰＲＯはｐＲＫ５ベクターからサブクローニングしてもよい。サブクローン挿入物は、ＰＣＲを施してバキュロウイルス発現ベクター中のポリ-ｈｉｓタグ等の選択されたエピトープタグを持つ枠に融合できる。ポリ-ｈｉｓタグＰＲＯ挿入物は、次いで、安定なクローンの選択のためのＤＨＦＲ等の選択マーカーを含むＳＶ４０誘導ベクターにサブクローニングできる。最後に、ＣＨＯ細胞をＳＶ４０誘導ベクターで(上記のように)形質移入した。発現を確認するために、上記のように標識化を行ってもよい。発現されたポリ-ＨｉｓタグＰＲＯを含む培地は、次いで濃縮し、Ｎｉ２＋-キレートアフィニティクロマトグラフィー等の選択された方法により精製できる。
またＰＲＯは、一過性発現法によりＣＨＯ及び／又はＣＯＳ細胞で、他の安定な発現方法によりＣＨＯ細胞で発現させてもよい。 Example 38: Expression of PRO in mammalian cells This example illustrates the preparation of a potentially glycosylated form of PRO by recombinant expression in mammalian cells.
The vector pRK5 (see EP 307,247 published on March 15, 1989) was used as an expression vector. In some cases, PRO DNA can be ligated to pRK5 with a selected restriction enzyme and PRODNA inserted using a ligation method such as that described in Sambrook et al. The resulting vector is called pRK5-PRO.
In one embodiment, the selected host cell can be a 293 cell. Human 293 cells (ATCC CCL 1573) were grown and confluent in tissue culture plates in media such as DMEM supplemented with fetal bovine serum and optionally nourishing ingredients and / or antibiotics. About 10 μg of pRK5-PRO DNA is mixed with about 1 μg of VA RNA gene-encoding DNA [Thimmappaya et al., Cell, 31: 543 (1982))] and dissolved in 500 μl of 1 mM Tris-HCl, 0.1 mM EDTA, 0.227 MCaCl 2. It was. To this mixture, 500 μl of 50 mM HEPES (pH 7.35), 280 mM NaCl, 1.5 mM NaPO 4 was added dropwise, and a precipitate was formed at 25 ° C. for 10 minutes. The precipitate was suspended, added to 293 cells and allowed to settle at 37 ° C. for about 4 hours. The medium was aspirated and 2 ml of 20% glycerol in PBS was added for 30 seconds. The 293 cells were then washed with serum free medium, fresh medium was added and the cells were incubated for about 5 days.
Approximately 24 hours after transfection, the medium was removed and replaced with medium (only) or medium containing 200 μCi / ml 35S-cysteine and 200 μCi / ml 35S-methionine. After 12 hours of incubation, the conditioned medium was collected, concentrated with a spin filter and added to a 15% SDS gel. The treated gel was dried and exposed to the film for a selected time revealing the presence of PRO polypeptide. The medium containing the transformed cells was further incubated (in serum-free medium) and the medium was tested in the selected bioassay.
In an alternative technique, PRO is transiently introduced into 293 cells using the dextran sulfate method described in Somparyac et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 12: 7575 (1981). 293 cells are grown to maximum density in a spinner flask and 700 μg of pRK5-PRO DNA is added. The cells were first concentrated from the spinner flask by centrifugation and washed with PBS. The DNA-dextran precipitate was incubated on the cell pellet for 4 hours. Cells were treated with 20% glycerol for 90 seconds, washed with tissue culture medium, and re-introduced into a spinner flask containing tissue culture medium, 5 μg / ml bovine insulin and 0.1 μg / ml bovine transferrin. After about 4 days, the conditioned medium was centrifuged and filtered to remove cells and cell debris. The sample containing the expressed PRO was then concentrated and purified by selected methods such as dialysis and / or column chromatography.
In other embodiments, PRO can be expressed in CHO cells. pRK5-PRO can be transfected into CHO cells using known reagents such as CaPO4 or DEAE-dextran. As described above, the cell culture medium can be incubated and the culture medium can be replaced with culture medium (only) or a medium containing a radioactive label such as 35S-methionine. After identifying the presence of the PRO polypeptide, the medium may be replaced with serum-free medium. Preferably, the medium is incubated for about 6 days and then the conditioned medium is collected. The medium containing the expressed PRO can then be concentrated and purified by any selected method.
In addition, the epitope tag PRO may be expressed in the host CHO cell. PRO may be subcloned from the pRK5 vector. The subclone insert can be subjected to PCR and fused to a frame with a selected epitope tag, such as a poly-his tag in a baculovirus expression vector. The poly-his tagged PRO insert can then be subcloned into an SV40 derived vector containing a selectable marker such as DHFR for selection of stable clones. Finally, CHO cells were transfected with the SV40 derived vector (as described above). To confirm expression, labeling may be performed as described above. The medium containing the expressed poly-His-tagged PRO can then be concentrated and purified by selected methods such as Ni2 + -chelate affinity chromatography.
Moreover, PRO may be expressed in CHO and / or COS cells by a transient expression method, and in CHO cells by another stable expression method.

ＣＨＯ細胞における安定な発現は以下の方法を用いて実施された。タンパク質は、それぞれのタンパク質の可溶化形態のコード配列(例えば、細胞外ドメイン)がヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ２ドメインを含むＩｇＧ１定常領域配列に融合したＩｇＧ作成物(イムノアドヘシン)、及び／又はポリ-Ｈｉｓタグ形態として発現された。
ＰＣＲ増幅に続いて、それぞれのＤＮＡを、Ausubel等, Current Protocols of Molecular Biology, Unit 3.16, John Wiley and Sons (1997)に記載されたような標準的技術を用いてＣＨＯ発現ベクターにサブクローニングした。ＣＨＯ発現ベクターは、関心あるＤＮＡの５’及び３’に適合する制限部位を有し、ｃＤＮＡの便利なシャトル化ができるように作成される。ベクターは、Lucas等, Nucl. Acids res. 24: 9, 1774-1779 (1996)に記載されたようにＣＨＯ細胞での発現を用い、関心あるｃＤＮＡ及びジヒドロフォレートレダクターゼ(ＤＨＦＲ)の発現の制御にＳＶ４０初期プロモーター／エンハンサーを用いる。ＤＨＦＲ発現は、形質移入に続くプラスミドの安定な維持のための選択を可能にする。
所望のプラスミドＤＮＡの12マイクログラムを、市販の形質移入試薬Superfect(登録商標)(Quiagen), Dosper(登録商標)及びFugene(登録商標)(Boehringer Mannheim)を使用し約一千万のＣＨＯ細胞に導入する。細胞は、上掲のLucas等に記載されているように成長させた。約3x10−７細胞を、下記のような更なる成長及び生産のためにアンプル中で凍結させた。
プラスミドＤＮＡを含むアンプルを水槽に配して解凍し、ボルテックスにより混合した。内容物を10mLの媒質を含む遠心管にピペットして、1000rpmで５分間遠心分離した。上清を吸引して細胞を10mLの選択培地(0.2μm濾過ＰＳ２０、5%の0.2μm透析濾過ウシ胎児血清)中に懸濁させた。次いで細胞を90mLの選択培地を含む100mlスピナーに分ける。1-2日後、細胞を150mLの選択培地を満たした250mLスピナーに移し、37℃でインキュベートする。さらに2-3日後、250mL、500mL及び2000mLのスピナーを3x10５細胞/mLで播種した。細胞培地を遠心分離により新鮮培地に交換し、生産培地に再懸濁させた。任意の適切なＣＨＯ培地を用いてもよいが、実際には1992年6月16日に発行された米国特許第5,122,469号に記載された生産培地を使用した。3Lの生産スピナーを1.2ｘ106細胞/mLで播種した。0日目に、細胞数とｐＨを測定した。1日目に、スピナーをサンプルし、濾過空気での散布を実施した。2日目に、スピナーをサンプルし、温度を33℃に変え、500g/Lのグルコース及び0.6mLの10%消泡剤(例えば35%ポリジメチルシロキサンエマルション、Dow Corning 365 Medical Grade Emulsion)の30mLとした。生産を通して、ｐＨは7.2近傍に調節し維持した。10日後、又は生存率が70%を下回るまで、細胞培地を遠心分離で回収して0.22μmフィルターを通して濾過した。濾過物は、4℃で貯蔵するか、即座に精製用カラムに充填した。 Stable expression in CHO cells was performed using the following method. Proteins may be IgG constructs (immunoadhesins) in which the coding sequence of each protein solubilized form (eg, extracellular domain) is fused to an IgG1 constant region sequence comprising a hinge, CH2 and CH2 domains, and / or poly- It was expressed as a His tag form.
Following PCR amplification, each DNA was subcloned into a CHO expression vector using standard techniques as described in Ausubel et al., Current Protocols of Molecular Biology, Unit 3.16, John Wiley and Sons (1997). The CHO expression vector has restriction sites that match the 5 'and 3' of the DNA of interest and is constructed to allow convenient shuttle of the cDNA. The vector uses expression in CHO cells as described in Lucas et al., Nucl. Acids res. 24: 9, 1774-1779 (1996) to control the expression of the cDNA of interest and dihydrofolate reductase (DHFR). SV40 early promoter / enhancer is used. DHFR expression allows selection for stable maintenance of the plasmid following transfection.
Twelve micrograms of the desired plasmid DNA is transferred to approximately 10 million CHO cells using the commercially available transfection reagents Superfect® (Quiagen), Dosper® and Fugene® (Boehringer Mannheim). Introduce. Cells were grown as described in Lucas et al. Approximately 3x10-7 cells were frozen in ampoules for further growth and production as described below.
An ampoule containing the plasmid DNA was placed in a water bath, thawed, and mixed by vortexing. The contents were pipetted into a centrifuge tube containing 10 mL of medium and centrifuged at 1000 rpm for 5 minutes. The supernatant was aspirated and the cells were suspended in 10 mL selective medium (0.2 μm filtered PS20, 5% 0.2 μm diafiltered fetal bovine serum). The cells are then divided into 100 ml spinners containing 90 mL selective medium. After 1-2 days, the cells are transferred to a 250 mL spinner filled with 150 mL selective medium and incubated at 37 ° C. After a further 2-3 days, 250 mL, 500 mL and 2000 mL spinners were seeded at 3 × 10 5 cells / mL. The cell medium was replaced with fresh medium by centrifugation and resuspended in production medium. Any suitable CHO medium may be used, but in practice the production medium described in US Pat. No. 5,122,469 issued June 16, 1992 was used. A 3 L production spinner was seeded at 1.2 × 10 6 cells / mL. On day 0, cell number and pH were measured. On the first day, the spinner was sampled and sprayed with filtered air. On the second day, sample the spinner, change the temperature to 33 ° C, and add 500 g / L glucose and 30 mL of 0.6 mL of 10% antifoam (e.g. 35% polydimethylsiloxane emulsion, Dow Corning 365 Medical Grade Emulsion). did. Throughout production, the pH was adjusted and maintained near 7.2. After 10 days, or until the viability fell below 70%, the cell culture medium was collected by centrifugation and filtered through a 0.22 μm filter. The filtrate was stored at 4 ° C. or immediately loaded onto a purification column.

ポリ-Ｈｉｓタグ作成物について、タンパク質はNi-NTAカラム(Qiagen)を用いて精製する。精製の前に、イミダゾールを条件培地に5mMの濃度まで添加した。条件培地を、0.3MのＮａＣｌ及び5mMイミダゾールを含む20mMのＨｅｐｅｓ, pH7.4バッファーで平衡化した6mlのNi-NTAカラムに4-5ml/分の流速で4℃においてポンプ供給した。充填後、カラムをさらに平衡バッファーで洗浄し、タンパク質を0.25Mイミダゾールを含む平衡バッファーで溶離した。高度に精製されたタンパク質は、続いて10mMのＨｅｐｅｓ、0.14MのＮａＣｌ及び4%のマンニトールを含む貯蔵バッファー中で25mlのG25 Superfine(Pharmacia)を用いて脱塩し、-80℃で貯蔵した。
イムノアドヘシン(Ｆｃ含有)作成物を以下のようにして条件培地から精製した。条件培地を、20mMのリン酸ナトリウムバッファー, pH6.8で平衡化した5mlのプロテインＡカラム(Pharmacia)に汲み上げた。充填後、カラムを平衡バッファーで強く洗浄した後、100mMのクエン酸, pH3.5で溶離した。溶離したタンパク質は、1mlの画分を275μlの1Mトリスバッファー, pH9を含む管に回収することにより即座に中性化した。高度に精製されたタンパク質は、続いてポリ-Ｈｉｓタグタンパク質について上記した貯蔵バッファー中で脱塩した。均一性はＳＤＳポリアクリルアミドゲルとエドマン(Edman)分解によるＮ-末端アミノ酸配列決定により評価した。
ここに開示したＰＲＯポリペプチドの多くが上記のようにして成功裏に発現された。 For poly-His tag constructs, the protein is purified using a Ni-NTA column (Qiagen). Prior to purification, imidazole was added to the conditioned medium to a concentration of 5 mM. The conditioned medium was pumped at 4 ° C at a flow rate of 4-5 ml / min onto a 6 ml Ni-NTA column equilibrated with 20 mM Hepes, pH 7.4 buffer containing 0.3 M NaCl and 5 mM imidazole. After packing, the column was further washed with equilibration buffer and the protein was eluted with equilibration buffer containing 0.25M imidazole. The highly purified protein was subsequently desalted with 25 ml G25 Superfine (Pharmacia) in storage buffer containing 10 mM Hepes, 0.14 M NaCl and 4% mannitol and stored at −80 ° C.
Immunoadhesin (Fc-containing) constructs were purified from conditioned media as follows. Conditioned media was pumped onto a 5 ml protein A column (Pharmacia) equilibrated with 20 mM sodium phosphate buffer, pH 6.8. After packing, the column was washed strongly with equilibration buffer and then eluted with 100 mM citric acid, pH 3.5. The eluted protein was immediately neutralized by collecting 1 ml fractions into a tube containing 275 μl of 1M Tris buffer, pH 9. The highly purified protein was subsequently desalted in the storage buffer described above for the poly-His tag protein. Uniformity was assessed by SDS-polyacrylamide gel and N-terminal amino acid sequencing by Edman degradation.
Many of the PRO polypeptides disclosed herein were successfully expressed as described above.

実施例３９：酵母菌でのＰＲＯの発現
以下の方法は、酵母菌中でのＰＲＯの組換え発現を記載する。
第１に、ＡＤＨ２／ＧＡＰＤＨプロモーターからのＰＲＯの細胞内生産又は分泌のための酵母菌発現ベクターを作成する。ＰＲＯをコードするＤＮＡ及びプロモーターを選択したプラスミドの適当な制限酵素部位に挿入してＰＲＯの細胞内発現を指示する。分泌のために、ＰＲＯをコードするＤＮＡを選択したプラスミドに、ＡＤＨ２／ＧＡＰＤＨプロモーターをコードするＤＮＡ、天然ＰＲＯシグナルペプチド又は他の哺乳動物シグナルペプチド、又は、例えば酵母菌α因子又はインベルターゼ分泌シグナル／リーダー配列、及び(必要ならば)ＰＲＯの発現のためのリンカー配列とともにクローニングすることができる。
酵母菌株ＡＢ１１０等の酵母菌は、次いで上記の発現プラスミドで形質転換し、選択された発酵培地中で培養できる。形質転換した酵母菌上清は、10%トリクロロ酢酸での沈降及びＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分離で分析し、次いでクマシーブルー染色でゲルの染色をすることができる。
続いて組換えＰＲＯは、発酵培地から遠心分離により酵母菌細胞を除去し、次いで選択されたカートリッジフィルターを用いて培地を濃縮することによって単離及び精製できる。ＰＲＯを含む濃縮物は、選択されたカラムクロマトグラフィー樹脂を用いてさらに精製してもよい。
ここに開示したＰＲＯポリペプチドの多くが上記のようにして成功裏に発現された。 Example 39: Expression of PRO in yeast The following method describes recombinant expression of PRO in yeast.
First, a yeast expression vector is produced for intracellular production or secretion of PRO from the ADH2 / GAPDH promoter. DNA encoding PRO and a promoter are inserted into appropriate restriction enzyme sites of the selected plasmid to direct intracellular expression of PRO. For selection of plasmids encoding DNA encoding PRO for secretion, DNA encoding ADH2 / GAPDH promoter, native PRO signal peptide or other mammalian signal peptide, or, for example, yeast alpha factor or invertase secretion signal / reader The sequence and (if necessary) can be cloned with a linker sequence for the expression of PRO.
Yeasts such as yeast strain AB110 can then be transformed with the expression plasmid and cultured in the selected fermentation medium. Transformed yeast supernatants can be analyzed by precipitation with 10% trichloroacetic acid and separation by SDS-PAGE, followed by staining of the gel with Coomassie blue staining.
The recombinant PRO can then be isolated and purified by removing the yeast cells from the fermentation medium by centrifugation and then concentrating the medium using a selected cartridge filter. The concentrate containing PRO may be further purified using a selected column chromatography resin.
Many of the PRO polypeptides disclosed herein were successfully expressed as described above.

実施例４０：バキュロウイルス感染昆虫細胞でのＰＲＯの発現
以下の方法は、バキュロウイルス感染昆虫細胞中におけるＰＲＯの組換え発現を記載する。
ＰＲＯコードする配列を、バキュロウイルス発現ベクターに含まれるエピトープタグの上流に融合させた。このようなエピトープタグは、ポリ-ｈｉｓタグ及び免疫グロブリンタグ(ＩｇＧのＦｃ領域など)を含む。ｐＶＬ１３９３(Navogen)などの市販されているプラスミドから誘導されるプラスミドを含む種々のプラスミドを用いることができる。簡単には、ＰＲＯ又はＰＲＯコード配列の所望の部分、例えば膜貫通タンパク質の細胞外ドメインをコードする配列又はタンパク質が細胞外である場合の成熟タンパク質をコードする配列などが、５’及び３’領域に相補的なプライマーでのＰＣＲにより増幅される。５’プライマーは、隣接する(選択された)制限酵素部位を包含していてもよい。生産物は、次いで、選択された制限酵素で消化され、発現ベクターにサブクローニングされる。
組換えバキュロウイルスは、上記のプラスミド及びBaculoGold(商品名)ウイルスＤＮＡ(Pharmingen)を、Spodoptera frugiperda(「Ｓｆ９」)細胞(ATCC CRL 1711)中にリポフェクチン(GIBCO-BRLから市販)を用いて同時形質移入することにより作成される。28℃で4-5日インキュベートした後、放出されたウイルスを回収し、更なる増幅に用いた。ウイルス感染及びタンパク質発現は、O'Reilley等, Baculovirus expression vectors: A laboratory Manual, Oxford: Oxford University Press (1994)に記載されているように実施した。
次に、発現されたポリ-ｈｉｓタグＰＲＯは、例えばＮｉ２＋−キレートアフィニティクロマトグラフィーにより次のように精製される。抽出は、Rupert等, Nature, 362:175-179 (1993)に記載されているように、ウイルス感染した組み換えＳｆ９細胞から調製した。簡単には、Ｓｆ９細胞を洗浄し、超音波処理用バッファー(25mMのＨｅｐｅｓ、pH7.9；12.5mMのＭｇＣｌ２；0.1mM ＥＤＴＡ；10%グリセロール；0.1%のＮＰ-４０；0.4MのＫＣｌ)中に再懸濁し、氷上で2回20秒間超音波処理した。超音波処理物を遠心分離で透明化し、上清を負荷バッファー(50mMリン酸塩、300mMのＮａＣｌ、10%グリセロール、pH7.8)で50倍希釈し、0.45μmフィルターで濾過した。Ｎｉ２＋-ＮＴＡアガロースカラム(Qiagenから市販)を5mLの総容積で調製し、25mLの水で洗浄し、25mLの負荷バッファーで平衡させた。濾過した細胞抽出物は、毎分0.5mLでカラムに負荷した。カラムを、分画回収が始まる点であるＡ２８０のベースラインまで負荷バッファーで洗浄した。次に、カラムを、結合タンパク質を非特異的に溶離する二次洗浄バッファー(50mMリン酸塩；300mMのＮａＣｌ、10%グリセロール、pH6.0)で洗浄した。Ａ２８０のベースラインに再度到達した後、カラムを二次洗浄バッファー中で0から500mMイミダゾール勾配で展開した。1mLの分画を回収し、ＳＤＳ-ＰＡＧＥ及び銀染色又はアルカリホスファターゼ(Qiagen)に複合したＮｉ２＋-ＮＴＡでのウェスタンブロットで分析した。溶離したＨｉｓ１０−タグＰＲＯを含む画分をプールして負荷バッファーで透析した。
あるいは、ＩｇＧタグ(又はＦｃタグ)ＰＲＯの精製は、例えば、プロテインＡ又はプロテインＧカラムクロマトグラフィーを含む公知のクロマトグラフィー技術を用いて実施できる。
ここに開示したＰＲＯポリペプチドの多くが上記のようにして成功裏に発現された。 Example 40: Expression of PRO in baculovirus infected insect cells The following method describes recombinant expression of PRO in baculovirus infected insect cells.
The PRO-encoding sequence was fused upstream of an epitope tag contained in a baculovirus expression vector. Such epitope tags include poly-his tags and immunoglobulin tags (such as the Fc region of IgG). Various plasmids can be used, including plasmids derived from commercially available plasmids such as pVL1393 (Navogen). Briefly, the 5 'and 3' regions include PRO or a desired portion of the PRO coding sequence, such as a sequence encoding the extracellular domain of a transmembrane protein or a sequence encoding a mature protein when the protein is extracellular. Amplified by PCR with primers complementary to. The 5 ′ primer may include flanking (selected) restriction enzyme sites. The product is then digested with selected restriction enzymes and subcloned into an expression vector.
Recombinant baculoviruses were co-transformed using the above plasmid and BaculoGold (trade name) viral DNA (Pharmingen) into Spodoptera frugiperda (“Sf9”) cells (ATCC CRL 1711) using lipofectin (commercially available from GIBCO-BRL). Created by populating. After incubation at 28 ° C. for 4-5 days, the released virus was collected and used for further amplification. Viral infection and protein expression were performed as described in O'Reilley et al., Baculovirus expression vectors: A laboratory Manual, Oxford: Oxford University Press (1994).
The expressed poly-his tagged PRO is then purified as follows, for example, by Ni2 + -chelate affinity chromatography. Extracts were prepared from virus-infected recombinant Sf9 cells as described in Rupert et al., Nature, 362: 175-179 (1993). Briefly, Sf9 cells were washed and in sonication buffer (25 mM Hepes, pH 7.9; 12.5 mM MgCl 2; 0.1 mM EDTA; 10% glycerol; 0.1% NP-40; 0.4 M KCl). And sonicated twice on ice for 20 seconds. The sonicated product was clarified by centrifugation, and the supernatant was diluted 50-fold with loading buffer (50 mM phosphate, 300 mM NaCl, 10% glycerol, pH 7.8) and filtered through a 0.45 μm filter. A Ni2 + -NTA agarose column (commercially available from Qiagen) was prepared with a total volume of 5 mL, washed with 25 mL water and equilibrated with 25 mL loading buffer. The filtered cell extract was loaded onto the column at 0.5 mL per minute. The column was washed with loading buffer to the A280 baseline where fraction collection began. The column was then washed with a secondary wash buffer (50 mM phosphate; 300 mM NaCl, 10% glycerol, pH 6.0), which elutes nonspecifically bound protein. After reaching A280 baseline again, the column was developed with a 0 to 500 mM imidazole gradient in the secondary wash buffer. 1 mL fractions were collected and analyzed by SDS-PAGE and silver staining or Western blot with Ni2 + -NTA conjugated to alkaline phosphatase (Qiagen). Fractions containing the eluted His10-tag PRO were pooled and dialyzed against loading buffer.
Alternatively, purification of IgG tag (or Fc tag) PRO can be performed using known chromatographic techniques including, for example, protein A or protein G column chromatography.
Many of the PRO polypeptides disclosed herein were successfully expressed as described above.

実施例４１：ＰＲＯに結合する抗体の調製
この実施例は、ＰＲＯに特異的に結合できるモノクローナル抗体の調製を例示する。
モノクローナル抗体の生産のための技術は、この分野で知られており、例えば、上掲のGodingに記載されている。用いられ得る免疫原は、精製ＰＲＯ、ＰＲＯを含む融合タンパク質、細胞表面に組換えＰＲＯを発現する細胞を含む。免疫原の選択は、当業者が過度の実験をすることなくなすことができる。
Ｂａｌｂ／ｃ等のマウスを、完全フロイントアジュバントに乳化して皮下又は腹腔内に1-100マイクログラムで注入したＰＲＯ免疫原で免疫化する。あるいは、免疫原をＭＰＬ-ＴＤＭアジュバント(Ribi Immunochemical Researh, Hamilton, MT)に乳化し、動物の後足蹠に注入してもよい。免疫化したマウスは、次いで10から12日後に、選択したアジュバント中に乳化した付加的免疫源で追加免疫する。その後、数週間、マウスをさらなる免疫化注射で追加免疫する。抗-ＰＲＯ抗体の検出のためのＥＬＩＳＡアッセイで試験するために、レトロオービタル出血からの血清試料をマウスから周期的に採取してもよい。
適当な抗体力価が検出された後、抗体に「ポジティブ(陽性)」な動物に、ＰＲＯ静脈内注射の最後の注入をすることができる。3から4日後、マウスを屠殺し、脾臓細胞を取り出した。次いで脾臓細胞を(35%ポリエチレングリコールを用いて)、ＡＣＴＴから番号ＣＲＬ１５９７で入手可能なＰ３Ｘ６３ＡｇＵ．１等の選択されたマウス骨髄腫株化細胞に融合させた。融合によりハイブリドーマ細胞が生成され、次いで、ＨＡＴ(ヒポキサンチン、アミノプテリン、及びチミジン)培地を含む96ウェル組織培養プレートに蒔き、非融合細胞、骨髄腫ハイブリッド、及び脾臓細胞ハイブリッドの増殖を阻害した。
ハイブリドーマ細胞は、ＰＲＯに対する反応性についてのＥＬＩＳＡでスクリーニングされる。ＰＲＯに対する所望のモノクローナル抗体を分泌する「ポジティブ(陽性)」ハイブリドーマ細胞の決定は、技術常識の範囲内である。
陽性ハイブリドーマ細胞を同系のＢａｌｂ／ｃマウスに腹腔内注入し、抗-ＰＲＯモノクローナル抗体を含む腹水を生成させる。あるいは、ハイブリドーマ細胞を、組織培養フラスコ又はローラーボトルで成長させることもできる。腹水中に生成されたモノクローナル抗体の精製は、硫酸アンモニウム沈降、それに続くゲル排除クロマトグラフィ−を用いて行うことができる。あるいは、抗体のプロテインＡ又はプロテインＧへの親和性に基づくアフィニティクロマトグラフィーを用いることもできる。 Example 41: Preparation of antibodies that bind to PRO This example illustrates the preparation of monoclonal antibodies that can specifically bind to PRO.
Techniques for the production of monoclonal antibodies are known in the art and are described, for example, in Goding, supra. Immunogens that can be used include purified PRO, fusion proteins comprising PRO, cells expressing recombinant PRO on the cell surface. The selection of the immunogen can be made without undue experimentation by one skilled in the art.
Mice such as Balb / c are immunized with PRO immunogen emulsified in complete Freund's adjuvant and injected subcutaneously or intraperitoneally at 1-100 micrograms. Alternatively, the immunogen may be emulsified in MPL-TDM adjuvant (Ribi Immunochemical Research, Hamilton, MT) and injected into the animal's hind footpad. Immunized mice are then boosted 10 to 12 days later with additional immunogen emulsified in the selected adjuvant. Thereafter, for several weeks, the mice are boosted with additional immunization injections. Serum samples from retroorbital hemorrhage may be taken periodically from mice for testing in an ELISA assay for detection of anti-PRO antibodies.
After a suitable antibody titer has been detected, animals “positive” for antibodies can be given a final infusion of PRO intravenous injection. Three to four days later, the mice were sacrificed and spleen cells were removed. The spleen cells were then (using 35% polyethylene glycol), P3X63AgU. Fused to 1st selected mouse myeloma cell line. Hybridoma cells were generated by fusion and then plated on 96-well tissue culture plates containing HAT (hypoxanthine, aminopterin, and thymidine) medium to inhibit the growth of non-fused cells, myeloma hybrids, and spleen cell hybrids.
Hybridoma cells are screened by ELISA for reactivity to PRO. The determination of “positive” hybridoma cells that secrete the desired monoclonal antibody to PRO is within the common general knowledge.
Positive hybridoma cells are injected intraperitoneally into syngeneic Balb / c mice to produce ascites containing anti-PRO monoclonal antibodies. Alternatively, hybridoma cells can be grown in tissue culture flasks or roller bottles. Purification of monoclonal antibodies produced in ascites can be performed using ammonium sulfate precipitation followed by gel exclusion chromatography. Alternatively, affinity chromatography based on the affinity of antibody for protein A or protein G can also be used.

実施例４３：特異的抗体を用いたＰＲＯポリペプチドの精製
天然又は組換えＰＲＯポリペプチドは、この分野の種々の標準的なタンパク質精製方法によって精製できる。例えば、プロ-ＰＲＯポリペプチド、成熟ポリペプチド、又はプレ-ＰＲＯポリペプチドは、関心あるＰＲＯポリペプチドに特異的な抗体を用いた免疫親和性クロマトグラフィーによって精製される。一般に、免疫親和性カラムは抗-ＰＲＯポリペプチド抗体を活性化クロマトグラフィー樹脂に共有結合させて作成される。
ポリクローナル免疫グロブリンは、硫酸アンモニウムでの沈殿又は固定化プロテインＡ(Pharmacia LKB Biotechnology, Piscataway, N.J.)での精製のいずれかにより免疫血清から調製される。同様に、モノクローナル抗体は、硫酸アンモニウム沈殿又は固定化プロテインＡでのクロマトグラフィーによりマウス腹水液から調製される。部分的に精製された免疫グロブリンは、ＣｎＢｒ-活性化セファロースTM(Pharmacia LKB Biotechnology)等のクロマトグラフィー樹脂に共有結合される。抗体が樹脂に結合され、樹脂がブロックされ、誘導体樹脂は製造者の指示に従って洗浄される。
このような免疫親和性カラムは、可溶化形態のＰＲＯポリペプチドを含有する細胞からの画分を調製することによるＰＲＯポリペプチドの精製において利用される。この調製物は、洗浄剤の添加又はこの分野で公知の方法により微分遠心分離を介して得られる全細胞又は細胞成分画分の可溶化により誘導される。あるいは、シグナル配列を含む可溶化ＰＲＯポリペプチドは、細胞が成長する培地中に有用な量で分泌される。
可溶化ＰＲＯポリペプチド含有調製物は、免疫親和性カラムを通され、カラムはＰＲＯポリペプチドの好ましい吸着をさせる条件下(例えば、洗浄剤存在下の高イオン強度バッファー)で洗浄される。次いで、カラムは、抗体／ＰＲＯポリペプチド結合を分解する条件下(例えば、約2-3といった低ｐＨ、高濃度の尿素又はチオシアン酸イオン等のカオトロープ)で溶離され、ＰＲＯポリペプチドが回収される。 Example 43: Purification of PRO polypeptides using specific antibodies Native or recombinant PRO polypeptides can be purified by various standard protein purification methods in the art. For example, pro-PRO polypeptide, mature polypeptide, or pre-PRO polypeptide is purified by immunoaffinity chromatography using an antibody specific for the PRO polypeptide of interest. In general, an immunoaffinity column is made by covalently coupling an anti-PRO polypeptide antibody to an activated chromatography resin.
Polyclonal immunoglobulins are prepared from immune sera either by precipitation with ammonium sulfate or purification with immobilized protein A (Pharmacia LKB Biotechnology, Piscataway, NJ). Similarly, monoclonal antibodies are prepared from mouse ascites fluid by ammonium sulfate precipitation or chromatography with immobilized protein A. The partially purified immunoglobulin is covalently coupled to a chromatographic resin such as CnBr-activated Sepharose ™ (Pharmacia LKB Biotechnology). The antibody is bound to the resin, the resin is blocked, and the derivative resin is washed according to the manufacturer's instructions.
Such immunoaffinity columns are utilized in the purification of PRO polypeptides by preparing fractions from cells containing solubilized forms of PRO polypeptides. This preparation is derived by solubilization of whole cells or cell component fractions obtained via addition of detergents or differential centrifugation by methods known in the art. Alternatively, solubilized PRO polypeptide comprising a signal sequence is secreted in useful amounts into the medium in which the cells are grown.
The solubilized PRO polypeptide-containing preparation is passed through an immunoaffinity column and the column is washed under conditions that allow preferred adsorption of the PRO polypeptide (eg, a high ionic strength buffer in the presence of a detergent). The column is then eluted under conditions that degrade antibody / PRO polypeptide binding (eg, a low pH such as about 2-3, a high concentration of urea or a chaotrope such as thiocyanate ion), and the PRO polypeptide is recovered. .

実施例４４：薬物スクリーニング
本発明は、ＰＲＯポリペプチド又はその結合断片を種々の薬物スクリーニング技術において使用することによる化合物のスクリーニングに特に有用である。そのような試験に用いられるＰＲＯポリペプチド又は断片は、溶液中の遊離状態でも、固体支持体に固定されても、細胞表面に担持されていても、細胞内に位置していてもよい。薬剤スクリーニングの一つの方法は、ＰＲＯポリペプチド又は断片を発現する組換え核酸で安定に形質移入される真核生物又は原核生物宿主細胞を利用する。薬剤は、そのような形質移入細胞に対して、競合的結合アッセイにおいてスクリーニングされる。そのような細胞は、生存可能又は固定化形態のいずれかにおいて、標準的な結合アッセイに使用できる。例えば、ＰＲＯポリペプチド又は断片と試験される試薬の間での複合体の形成を測定してよい。あるいは、試験する試薬によって生ずるＰＲＯポリペプチドとその標的細胞との間の複合体形成における減少を試験することもできる。
しかして、本発明は、ＰＲＯポリペプチド関連疾患又は障害に影響を与えうる薬剤又は任意の他の試薬のスクリーニング方法を提供する。これらの方法は、その試薬をＰＲＯポリペプチド又は断片に接触させ、(ｉ)試薬とＰＲＯポリペプチド又は断片との間の複合体の存在について、又は(ｉｉ)ＰＲＯポリペプチド又は断片と細胞との間の複合体の存在について、当該技術でよく知られた方法でアッセイすることを含む。これらの競合結合アッセイでは、ＰＲＯポリペプチド又は断片が典型的には標識される。適切なインキュベーションの後、自由なＰＲＯポリペプチド又は断片を結合形態のものから分離し、自由又は未複合の標識の量が、特定の試薬がＰＲＯポリペプチドに結合する又はＰＲＯポリペプチド／細胞複合体を阻害する能力の尺度となる。
薬剤スクリーニングのための他の技術は、ポリペプチドに対して適当な結合親和性を持つ化合物についての高スループットスクリーニングを提供し、1984年9月13日に公開されたWO 84/03564に詳細に記載されている。簡単に述べれば、多数の異なる小型ペプチド試験化合物が、プラスチックピン等の固体支持体又は幾つかの他の表面上で合成される。ＰＲＯポリペプチドに適用すると、ペプチド試験化合物はＰＲＯポリペプチドと反応して洗浄される。結合したＰＲＯポリペプチドはこの分野で良く知られた方法により検出される。精製したＰＲＯポリペプチドは、上記の薬剤スクリーニング技術に使用するためにプレート上に直接被覆することもできる。さらに、非中和抗体は、ペプチドを捕捉し、それを固体支持体上に固定化するのに使用できる。
また、本発明は、ＰＲＯポリペプチドに結合可能な中和抗体がＰＲＯポリペプチド又はその断片について試験化合物と特異的に競合する競合薬剤スクリーニングアッセイも考慮する。この方法において、抗体は、ＰＲＯポリペプチドで、一又は複数の抗原決定基を持つ任意のペプチドの存在を検出するのに使用できる。 Example 44: Drug Screening The present invention is particularly useful for screening compounds by using PRO polypeptides or binding fragments thereof in various drug screening techniques. The PRO polypeptide or fragment used in such a test may be free in solution, immobilized on a solid support, supported on the cell surface, or located within the cell. One method of drug screening utilizes eukaryotic or prokaryotic host cells that are stably transfected with recombinant nucleic acids expressing the PRO polypeptide or fragment. Agents are screened against such transfected cells in a competitive binding assay. Such cells can be used in standard binding assays in either viable or immobilized form. For example, the formation of a complex between the PRO polypeptide or fragment and the reagent being tested may be measured. Alternatively, the decrease in complex formation between the PRO polypeptide and its target cells caused by the reagent being tested can be tested.
Thus, the present invention provides methods of screening for drugs or any other reagent that can affect a PRO polypeptide related disease or disorder. These methods involve contacting the reagent with a PRO polypeptide or fragment and (i) for the presence of a complex between the reagent and the PRO polypeptide or fragment, or (ii) between the PRO polypeptide or fragment and the cell. Assaying for the presence of a complex between them by methods well known in the art. In these competitive binding assays, the PRO polypeptide or fragment is typically labeled. After appropriate incubation, free PRO polypeptide or fragments are separated from those in bound form, and the amount of free or uncomplexed label determines whether a particular reagent binds to the PRO polypeptide or PRO polypeptide / cell complex. It is a measure of the ability to inhibit
Other techniques for drug screening provide high-throughput screening for compounds with appropriate binding affinity for polypeptides and are described in detail in WO 84/03564 published September 13, 1984. Has been. Briefly, a number of different small peptide test compounds are synthesized on a solid support such as plastic pins or some other surface. When applied to a PRO polypeptide, the peptide test compound reacts with the PRO polypeptide and is washed. Bound PRO polypeptide is detected by methods well known in the art. Purified PRO polypeptide can also be coated directly onto plates for use in the drug screening techniques described above. Furthermore, non-neutralizing antibodies can be used to capture the peptide and immobilize it on a solid support.
The present invention also contemplates competitive drug screening assays in which neutralizing antibodies capable of binding to the PRO polypeptide specifically compete with the test compound for the PRO polypeptide or fragment thereof. In this method, the antibody can be used to detect the presence of any peptide with one or more antigenic determinants in the PRO polypeptide.

実施例４５：合理的薬物設計
合理的薬物設計の目的は、関心ある生物学的活性ポリペプチド(例えば、ＰＲＯポリペプチド)又はそれらが相互作用する小分子、例えばアゴニスト、アンタゴニスト、又はインヒビターの構造的類似物を製造することである。これらの例の任意のものが、ＰＲＯポリペプチドのより活性で安定な形態又はインビボでＰＲＯポリペプチドの機能を向上又は阻害する薬物の創作に使用できる(参考、Hodgson, Bio/Technology, 9: 19-21 (1991))。
一つの方法において、ＰＲＯポリペプチド、又はＰＲＯポリペプチド-インヒビター複合体の三次元構造が、ｘ線結晶学により、コンピュータモデル化により、最も典型的には２つの方法の組み合わせにより決定される。分子の構造を解明し活性部位を決定するためには、ＰＲＯポリペプチドの形状及び電荷の両方が確認されなければならない。数は少ないが、ＰＲＯポリペプチドの構造に関する有用な情報が相同タンパク質の構造に基づいたモデル化によって得られることもある。両方の場合において、関連する構造情報は、類似ＰＲＯポリペプチド様分子の設計又は効果的なインヒビターの同定に使用される。合理的な薬剤設計の有用な例は、Braxton及びWells, Biochemistry, 31: 7796-7801 (1992)に示されているような向上した活性又は安定性を持つ分子、又はAthauda等, J. Biochem., 113: 742-746 (1993)に示されているような天然ペプチドのインヒビター、アゴニスト、又はアンタゴニストとして作用する分子を含む。
また、上記のような機能アッセイによって選択された標的特異的な抗体を単離しその結晶構造を解明することもできる。この方法は、原理的には、それに続く薬剤設計が基礎をおくことのできるファーマコア(pharmacore)を生成する。機能的な薬理学的に活性な抗体に対する抗-イディオタイプ抗体(抗-ids)を生成することにより、タンパク質結晶学をバイパスすることができる。鏡像の鏡像として、抗-idsの結合部位は最初のレセプターの類似物であると予測できる。抗-idは、次いで、化学的又は生物学的に製造したペプチドのバンクからペプチドを同定及び単離するのに使用できる。単離されたペプチドは、ファーマコアとして機能するであろう。
本発明により、十分な量のＰＲＯポリペプチドがＸ線結晶学などの分析実験を実施するために入手可能である。さらに、ここに提供したＰＲＯポリペプチドアミノ酸配列の知識は、ｘ線結晶学に換える、又はそれに加えるコンピュータモデル化技術で用いられる指針を提供する。 Example 45: Rational drug design The purpose of rational drug design is to construct a biologically active polypeptide of interest (eg, a PRO polypeptide) or a small molecule with which they interact, such as an agonist, antagonist, or inhibitor Is to produce similar products. Any of these examples can be used to create more active and stable forms of the PRO polypeptide or drugs that enhance or inhibit the function of the PRO polypeptide in vivo (see Hodgson, Bio / Technology, 9: 19 -21 (1991)).
In one method, the three-dimensional structure of a PRO polypeptide, or PRO polypeptide-inhibitor complex, is determined by x-ray crystallography, by computer modeling, most typically by a combination of the two methods. In order to elucidate the structure of the molecule and determine the active site, both the shape and charge of the PRO polypeptide must be confirmed. Less often, useful information regarding the structure of the PRO polypeptide may be obtained by modeling based on the structure of homologous proteins. In both cases, relevant structural information is used to design similar PRO polypeptide-like molecules or to identify effective inhibitors. Useful examples of rational drug design include molecules with improved activity or stability as shown in Braxton and Wells, Biochemistry, 31: 7796-7801 (1992), or Athauda et al., J. Biochem. , 113: 742-746 (1993), including molecules that act as inhibitors, agonists or antagonists of natural peptides.
It is also possible to isolate a target-specific antibody selected by the functional assay as described above and elucidate its crystal structure. This method in principle produces a pharmacore on which subsequent drug design can be based. By generating anti-idiotype antibodies (anti-ids) against functional pharmacologically active antibodies, protein crystallography can be bypassed. As a mirror image of the mirror image, the anti-ids binding site can be predicted to be an analog of the original receptor. The anti-id can then be used to identify and isolate peptides from a bank of chemically or biologically produced peptides. The isolated peptide will function as a pharmacore.
In accordance with the present invention, sufficient amounts of PRO polypeptides are available to perform analytical experiments such as X-ray crystallography. In addition, the knowledge of the PRO polypeptide amino acid sequence provided herein provides guidance for use in computer modeling techniques to replace or add to x-ray crystallography.

実施例４６：マウス腎臓メサンギウム細胞増殖アッセイ(アッセイ９２)
このアッセイでは本発明のあるポリペプチドが哺乳動物の腎臓メサンギウム細胞増殖を誘導する働きをし、及び、従って、例えばバーガー病ようなメサンギウム細胞機能の低下に関する腎障害、又はシェーンライン-ヘーノホ紫斑病、セリアック病、疱疹状皮膚炎又はクローン病に関連するその他ネフロパシーの治療に利用できることが示される。アッセイは次のように実施される。１日目、マウス腎臓メサンギウム細胞が成長培地(ダルベッコ修飾イーグル培地とヘムＦ１２培地の3：1の混合物、95％のウシ胎仔血清、5％の14mM HEPES)で９６ウェルプレート上に蒔かれ、一晩育成する。２日目、ＰＲＯポリペプチドは無血清の培地において２種の濃度に希釈され(1％と0.1％)、細胞に加えられる。コントロールサンプルは血清の培地のみである。４日目、Cell Titer 96 Aqueous１液試薬(Progema)２０μｌがそれぞれのウェルに加えられ、発色反応が２時間進められる。ついで吸光度(ＯＤ)が４９０nmで測定される。アッセイにおけるポジティブはコントロールの読みの少なくとも１５％を越える吸光度の読みを与えるものである。
次のポリペプチドはこのアッセイにおいてポジティブと検定された：ＰＲＯ１２７２ Example 46: Mouse kidney mesangial cell proliferation assay (Assay 92)
In this assay, a polypeptide of the present invention serves to induce mammalian kidney mesangial cell proliferation and, thus, kidney damage related to decreased mesangial cell function, such as Burger's disease, or Schönlein-Henoho purpura, It is shown that it can be used to treat celiac disease, herpes zosteritis or other nephropathy associated with Crohn's disease. The assay is performed as follows. On day 1, mouse kidney mesangial cells were plated on a 96-well plate in growth medium (3: 1 mixture of Dulbecco's modified Eagle medium and heme F12 medium, 95% fetal calf serum, 5% 14 mM HEPES) Raise in the evening. On day 2, the PRO polypeptide is diluted to two concentrations in serum-free medium (1% and 0.1%) and added to the cells. The control sample is only serum medium. On the fourth day, 20 μl of Cell Titer 96 Aqueous 1 solution (Progema) is added to each well and the color reaction is allowed to proceed for 2 hours. The absorbance (OD) is then measured at 490 nm. A positive in the assay is one that gives an absorbance reading that is at least 15% of the control reading.
The following polypeptide was tested positive in this assay: PRO1272

実施例４７：一次ラット含脂肪細胞によるグルコース又はＦＦＡの取込みに影響を及ぼすＰＲＯポリペプチドの検出(アッセイ９４)
このアッセイは、ＰＲＯポリペプチドが含脂肪細胞によるグルコース又はＦＦＡの取込みに影響を及ぼす能力を示すか否かを決定するために設計された。このアッセイにおいてポジティブであると検定されるＰＲＯポリペプチドは、例えば肥満、糖尿病、高-又は低-インシュリン血症を含む、含脂肪細胞によるグルコースの取込みの刺激又は阻害のいずれかが有益であるとされる疾患の治療に有用であることが予想される。
９６ウェル型において、アッセイされるＰＲＯポリペプチドを一次ラット含脂肪細胞に添加し、終夜インキュベートした。試料を４時間及び１６時間で取り出し、グリセロール、グルコース及びＦＦＡの取込についてアッセイした。１６時間のインキュベート後、インシュリンを培地に添加し、４時間インキュベートした。この時点で、試料を取り出し、グリセロール、グルコース及びＦＦＡの取込みを測定した。ＰＲＯポリペプチドを含有せずインシュリンを含有する培地をポジティブの基準対照として使用した。試験したＰＲＯポリペプチドがグルコース又はＦＦＡの取込みを刺激又は阻害する場合、インシュリン対照の１．５倍以上又は０．５倍未満であるならば、結果はこのアッセイにおいてポジティブであるとスコアされる。
次のＰＲＯポリペプチドが、このアッセイにおいてグルコース及び／又はＦＦＡの取込みの刺激剤又は阻害剤としてポジティブであると検定された：ＰＲＯ１９６、ＰＲＯ１８５、ＰＲＯ２１０、ＰＲＯ２１５、ＰＲＯ２４２、ＰＲＯ２８８、ＰＲＯ１１８３、ＰＲＯ１４１９、ＰＲＯ９９４０、ＰＲＯ３０１、ＰＲＯ３３７及びＰＲＯ２６５。 Example 47: Detection of PRO polypeptides affecting glucose or FFA uptake by primary rat adipocytes (assay 94)
This assay was designed to determine whether a PRO polypeptide exhibits the ability to affect glucose or FFA uptake by adipocytes. A PRO polypeptide that is tested positive in this assay is beneficial either for stimulation or inhibition of glucose uptake by adipocytes, including, for example, obesity, diabetes, high- or low-insulinemia. It is expected to be useful in the treatment of diseases.
In 96-well format, the PRO polypeptide to be assayed was added to primary rat adipocytes and incubated overnight. Samples were removed at 4 and 16 hours and assayed for glycerol, glucose and FFA uptake. After 16 hours of incubation, insulin was added to the medium and incubated for 4 hours. At this point, a sample was removed and glycerol, glucose and FFA uptake were measured. Medium containing insulin but no PRO polypeptide was used as a positive reference control. If the tested PRO polypeptide stimulates or inhibits glucose or FFA uptake, the result is scored positive in this assay if it is greater than 1.5 times or less than 0.5 times the insulin control.
The following PRO polypeptides were tested positive in this assay as stimulators or inhibitors of glucose and / or FFA uptake: PRO196, PRO185, PRO210, PRO215, PRO242, PRO288, PRO1183, PRO1419, PRO9940, PRO301, PRO337 and PRO265.

実施例４８：成人心臓肥大の刺激(アッセイ２)
このアッセイは成人心臓の肥大を刺激する様々なＰＲＯポリペプチドの能力を測定するように設計された。このアッセイにおいてポジティブであると検定されたＰＲＯポリペプチドは、種々の心臓の機能不全疾患の治療に有用であることが予期される。
成体(250g)Sprague Dawleyラットから新たに単離した心室筋細胞を2000細胞/180μlウェル容積でプレーティングした。細胞を単離し、１日目にプレーティングし、ＰＲＯポリペプチド含有試験試料又は成長培地のみ(負の対照)(20μl容積)を２日目に添加し、ついで細胞を固定し、５日目に染色した。染色後、細胞サイズを可視化し、対照細胞と比較して成長亢進のない細胞に０．０の値を与え、対照細胞と比較して小から中程度の成長亢進を示す細胞に０．１の値を与え、対照細胞と比較して大きな成長亢進を示す細胞に２．０の値を与える。負の対照細胞と比較した成長増強のあらゆる度合いがアッセイではポジティブと考えられる。
次のＰＲＯポリペプチドがこのアッセイにおいてポジティブであると検定された：ＰＲＯ３０１。 Example 48: Stimulation of adult cardiac hypertrophy (Assay 2)
This assay was designed to measure the ability of various PRO polypeptides to stimulate adult cardiac hypertrophy. PRO polypeptides that are tested positive in this assay are expected to be useful in the treatment of various cardiac dysfunction diseases.
Freshly isolated ventricular myocytes from adult (250 g) Sprague Dawley rats were plated at 2000 cells / 180 μl well volume. Cells are isolated and plated on day 1, PRO polypeptide-containing test sample or growth medium alone (negative control) (20 μl volume) is added on day 2, cells are then fixed, and on day 5 Stained. After staining, the cell size is visualized, giving 0.0 to cells without growth enhancement compared to control cells, and 0.1 to cells showing small to moderate growth enhancement compared to control cells. A value is given, and a value of 2.0 is given to cells that show a large increase in growth compared to control cells. Any degree of growth enhancement compared to negative control cells is considered positive in the assay.
The following PRO polypeptide was tested positive in this assay: PRO301.

実施例４９：血管内皮成長因子(ＶＥＧＦ)刺激の内皮細胞成長の増殖阻害(アッセイ９)
ＶＥＧＦに刺激された内皮細胞の増殖を阻害する種々のＰＲＯポリペプチドの能力を試験した。このアッセイにおいてポリペプチド試験がポジティブであると哺乳動物の内皮細胞の阻害に有用であり、このような効果は、例えば腫瘍成長の阻害する等の恩恵となる。
特に、ウシ副腎皮質性毛細管内皮(ＡＣＥ)細胞(一次培地から、最大12-14継代)を９６-ウェルの１００マイクロタイタープレートに500細胞／ウェルで蒔いた。アッセイ用培地は、低グルコースＤＭＥＭ、10%のウシ血清、2mMのグルタミン、1xペニシリン／ストレプトマイシン／フンギゾンを含有する。対照ウェルは次のものを含む：(１)ＡＣＥ細胞を添加しないもの；(２)ＡＣＥ細胞単独；(３)ＡＣＥ細胞プラス5ng/mlのＦＧＦ；(４)ＡＣＥ細胞プラス3ng/mlのＶＥＧＦ；(５)ＡＣＥ細胞プラス3ng/mlのＶＥＧＦプラス1ng/mlのＴＧＦ-ベータ；及び(６)ＡＣＥ細胞プラス3ng/mlのＶＥＧＦプラス5ng/mlのＬＩＦ。ついで、試験用試料であるポリ-ｈｉｓタグＰＲＯポリペプチド(100マイクロタイター容量中)をウェル(それぞれ１％、０．１％及び０．００１％に希釈)の添加した。細胞を３７℃／５％のＣＯ２で６-７日インキュベートした。インキュベート後、ウェルの培地を吸引し、細胞を１ｘＰＢＳで洗浄した。酸ホスファターゼ反応混合物(100マイクロタイター、0.1Mの酢酸ナトリウム、pH5.5、0.1%のトリトンX-100、10mMのｐ-ニトロフェニルホスフェート)を各ウェルに添加した。３７℃で２時間インキュベートした後、10マイクロタイターの1NのＮａＯＨの添加で反応を停止した。光学密度(ＯＤ)をマイクロプレートリーダーで405nmにおいて測定した。
ＰＲＯポリペプチドの活性を、刺激無しの細胞に対するＶＥＧＦ(3ng/ml)刺激増殖のパーセント阻害(ＯＤ405nmにおける酸ホスファターゼ活性を測定することにより決定)として算出した。ＴＧＦ-ベータはＶＥＧＦ刺激ＡＣＥ細胞増殖を70-90%阻止するので、1ng/mlで活性参照として使用した。結果は、ＰＲＯポリペプチドの癌治療、特に腫瘍新脈管形成の阻害における有用性を示している。数値(相対阻害度)は刺激なし細胞に対するＰＲＯポリペプチドによるＶＥＧＦ刺激増殖のパーセント阻害を算出し、ついで1ng/ml濃度でのＴＧＦ-βが、ＶＥＧＦ刺激細胞増殖を70-90%阻止することが知られていることで得られたパーセント阻害をパーセンテージに除することで決定される。結果は、ＰＲＯポリペプチドが内皮細胞成長のＶＥＧＦ刺激を３０％又はそれ以上(相対阻害度３０％又はそれ以上)を阻害したときにポジティブと考える。
以下の試験ポリペプチドがこのアッセイにおいてポジティブであった：ＰＲＯ３０１、ＰＲＯ１８７及びＰＲＯ２４６。 Example 49: Vascular endothelial growth factor (VEGF) stimulated proliferation inhibition of endothelial cell growth (Assay 9)
The ability of various PRO polypeptides to inhibit the proliferation of endothelial cells stimulated by VEGF was tested. A positive polypeptide test in this assay is useful for inhibiting mammalian endothelial cells, and such effects are beneficial, such as inhibiting tumor growth.
In particular, bovine adrenal cortical capillary endothelium (ACE) cells (from primary medium, up to 12-14 passages) were seeded in 96-well 100 microtiter plates at 500 cells / well. The assay medium contains low glucose DMEM, 10% bovine serum, 2 mM glutamine, 1 × penicillin / streptomycin / fungizone. Control wells include: (1) ACE cells not added; (2) ACE cells alone; (3) ACE cells plus 5 ng / ml FGF; (4) ACE cells plus 3 ng / ml VEGF; (5) ACE cells plus 3 ng / ml VEGF plus 1 ng / ml TGF-beta; and (6) ACE cells plus 3 ng / ml VEGF plus 5 ng / ml LIF. The test sample poly-his-tagged PRO polypeptide (in 100 microtiter volume) was then added to the wells (diluted to 1%, 0.1% and 0.001%, respectively). Cells were incubated for 6-7 days at 37 ° C / 5% CO2. After incubation, the well medium was aspirated and the cells were washed with 1 × PBS. Acid phosphatase reaction mixture (100 microtiter, 0.1 M sodium acetate, pH 5.5, 0.1% Triton X-100, 10 mM p-nitrophenyl phosphate) was added to each well. After 2 hours incubation at 37 ° C., the reaction was stopped by the addition of 10 microtiter 1N NaOH. Optical density (OD) was measured at 405 nm with a microplate reader.
The activity of the PRO polypeptide was calculated as the percent inhibition of VEGF (3 ng / ml) stimulated proliferation (as determined by measuring acid phosphatase activity at OD 405 nm) on unstimulated cells. TGF-beta blocked VEGF-stimulated ACE cell proliferation by 70-90% and was used as an activity reference at 1 ng / ml. The results indicate the usefulness of PRO polypeptides in cancer therapy, particularly in inhibiting tumor angiogenesis. The numerical value (relative inhibition) calculates the percent inhibition of VEGF-stimulated proliferation by PRO polypeptide relative to unstimulated cells, and then TGF-β at a concentration of 1 ng / ml prevents VEGF-stimulated cell proliferation by 70-90%. It is determined by dividing the percent inhibition obtained with known percentages. The results are considered positive when the PRO polypeptide inhibits VEGF stimulation of endothelial cell growth by 30% or more (relative inhibition of 30% or more).
The following test polypeptides were positive in this assay: PRO301, PRO187 and PRO246.

実施例５０：混合リンパ球反応(ＭＬＲ)における刺激活性アッセイ(アッセイ２４)
この実施例は、本発明のあるポリペプチドが刺激されたＴリンパ球の増殖刺激剤として活性であることを示す。リンパ球の増殖を刺激する化合物は、免疫反応の向上が好ましい治療において有用である。治療剤は本発明のポリペプチドのアンタゴニストの形態、例えばポリペプチドのマウス-ヒトキメラ、ヒト化又はヒト抗体であり得る。
このアッセイの基本的プロトコールは、Current Protocol in Immunology, unit3.12；J E Coligan, A M Kruisbeek, D H Marglies, E M Shevach, W Strober編, 国立衛生研究所, John Wiley & Sons, Incから出版に記載されている。
特に、このアッセイの一変形例では、末梢血液単核細胞(ＰＢＭＣ)を個々の哺乳動物、例えばヒトのボランティアからロイコフェレーシスにより単離する(一人のドナーには刺激物ＰＢＭＣを供給し、他のドナーにはレスポンダーＰＢＭＣを供給する)。所望するならば、単離後に、細胞をウシ胎児血清及びＤＭＳＯ中で凍結する。凍結細胞をアッセイ用培地(３７℃、5%ＣＯ２)で一晩解凍し、ついで洗浄し、アッセイ用培地(ＲＰＭＩ；10%ウシ胎児血清、1%ペニシリン／ストレプトマイシン、1%グルタミン、1%ＨＥＰＥＳ、1%非必須アミノ酸、1%ピルバート)に3X10６細胞/mlに再懸濁させる。刺激物ＰＢＭＣは細胞を光にさらす(約300ラド)ことにより調製される。
このアッセイは混合物：
100:1の1%又は0.1%に希釈された試験料試料、
50:1の光にさらされた刺激物細胞、及び
50:1のレスポンダーＰＢＭＣ細胞、
を三重ウェルに蒔くことにより調製される。100マイクロタイターの細胞培養培地又は100マイクロタイターのＣＤ４-ＩｇＧを対照体として使用する。ついで、ウェルを３７℃、5%ＣＯ２で４日間インキュベートする。５日目、各ウェルにトリチウム化チミジン(1.0mC/ウェル；Amersham)を適用する。６時間後、細胞を３回洗浄し、ついで標識の取込を評価する。
このアッセイの他の変形例では、ＰＢＭＣをBalb/cマウス及びC57B6マウスの脾臓から単離する。細胞を、アッセイ用培地(ＲＰＭＩ；10%ウシ胎児血清、1%ペニシリン／ストレプトマイシン、1%グルタミン、1%ＨＥＰＥＳ、1%非必須アミノ酸、1%ピルバート)において新たに回収された脾臓から顕微鏡検査用に細かく切断し、リンパライト(Lympholyte)Ｍ(Organon Teknika)上にこれらの細胞をオーバーレイすることによりＰＭＢＣを単離し、2000rpmで２０分間遠心分離し、集め、アッセイ用培地における単核細胞層を洗浄し、アッセイ用培地に1X10７細胞/mlになるように細胞を再懸濁させる。ついで、このアッセイは上記のように行われる。
ポジティブとは対照体よりも増加することであり、増加することはポジティブであると考えられ、180%以上の増加が好ましい。しかしながら、任意の値が対照体以上であるなら、試験用タンパク質について刺激効果を示す。
次のＰＲＯポリペプチドがこのアッセイでポジティブであった：ＰＲＯ５３３及びＰＲＯ３０１。 Example 50: Stimulating activity assay in mixed lymphocyte reaction (MLR) (Assay 24)
This example shows that certain polypeptides of the present invention are active as stimulators of proliferation of stimulated T lymphocytes. Compounds that stimulate lymphocyte proliferation are useful in treatments where an improved immune response is preferred. The therapeutic agent may be in the form of an antagonist of the polypeptide of the invention, eg, a mouse-human chimera, humanized or human antibody of the polypeptide.
The basic protocol for this assay is published in Current Protocol in Immunology, unit 3.12; published by JE Coligan, AM Kruisbeek, DH Marglies, EM Shevach, W Strober, National Institutes of Health, John Wiley & Sons, Inc. Yes.
In particular, in one variation of this assay, peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) are isolated from individual mammals, eg, human volunteers, by leucopheresis (one donor is provided with the stimulator PBMC, the other (Responder PBMC will be supplied to the donor). If desired, after isolation, the cells are frozen in fetal calf serum and DMSO. Frozen cells are thawed overnight in assay medium (37 ° C., 5% CO 2), then washed, assay medium (RPMI; 10% fetal calf serum, 1% penicillin / streptomycin, 1% glutamine, 1% HEPES, Resuspend at 3 × 10 6 cells / ml in 1% non-essential amino acids, 1% pyruvate). The stimulant PBMC is prepared by exposing the cells to light (approximately 300 rads).
This assay is a mixture:
Test sample diluted to 1% or 0.1% of 100: 1,
Stimulator cells exposed to 50: 1 light, and
50: 1 responder PBMC cells,
Prepared in a triple well. 100 microtiter cell culture medium or 100 microtiter CD4-IgG is used as a control. The wells are then incubated for 4 days at 37 ° C., 5% CO 2. On day 5, apply tritiated thymidine (1.0 mC / well; Amersham) to each well. After 6 hours, the cells are washed three times, and then label incorporation is evaluated.
In another variation of this assay, PBMC are isolated from the spleens of Balb / c and C57B6 mice. Cells for microscopy from freshly collected spleen in assay medium (RPMI; 10% fetal bovine serum, 1% penicillin / streptomycin, 1% glutamine, 1% HEPES, 1% non-essential amino acids, 1% pyruvate) PMBCs are isolated by overlaying these cells onto Lympholyte M (Organon Teknika), centrifuged at 2000 rpm for 20 minutes, collected, and the mononuclear cell layer in the assay medium is washed. And resuspend the cells in assay medium to 1 × 10 7 cells / ml. The assay is then performed as described above.
Positive is an increase over the control, an increase is considered positive and an increase of 180% or more is preferred. However, if any value is greater than or equal to the control, it shows a stimulating effect for the test protein.
The following PRO polypeptides were positive in this assay: PRO533 and PRO301.

実施例５１：ＰＤＢ１２細胞の増殖(アッセイ２９)
この実施例は、様々なＰＲＯポリペプチドがPDB12膵管細胞の増殖を誘導する効能を有していることを示すもので、よって糖尿病等を含む、膵臓によるタンパク質分泌に係る疾患の治療に有用である。
PDB12膵管細胞を、100μL/180μL成長培地中にウェル当り1.5x103細胞で、フィブロネクチンをコートした９６ウェルプレート上にプレーティングした。ＰＲＯポリペプチド試験試料又はＰＲＯポリペプチドを欠く負の対照を有する100μLの成長培地をついで最終容積200μLになるまでウェルに添加した。対照はこのアッセイにおいて不活性であることが知られているタンパク質を含む成長培地を含む。細胞を37℃で4日間インキュベートした。ついで、20μLのアラマーブルー染料(AB)を各ウェルに添加し、蛍光読みとりを、530nm励起及び590nm発光にてマイクロタイタープレートリーダーでＡＢ添加後４時間で測定した。用いた標準はウシ下垂体抽出物(BPE)なしの細胞と様々な濃度のＢＰＥの細胞である。未知のバッファー又は成長培地のみの対照は各９６ウェルプレートで２回なされる。
タンパク生産の増加パーセントが、負の対照細胞により生産されたアラマーブルー染料による算定タンパク質濃度と、ＰＲＯポリペプチド処理細胞により生産されたアラマーブルー染料による算定タンパク質濃度を比較することにより算定されている。負の対照細胞と比較して２５％以上のタンパク質生産の増加パーセントがポジティブと考えられる。
次のＰＲＯポリペプチドがこのアッセイにおいてポジティブであると検定された：ＰＲＯ３０１。 Example 51: Proliferation of PDB12 cells (Assay 29)
This example demonstrates that various PRO polypeptides have the effect of inducing proliferation of PDB12 pancreatic duct cells, and thus are useful in the treatment of diseases related to protein secretion by the pancreas, including diabetes and the like. .
PDB12 pancreatic duct cells were plated on 96-well plates coated with fibronectin at 1.5 × 103 cells per well in 100 μL / 180 μL growth medium. 100 μL of growth medium with a PRO polypeptide test sample or a negative control lacking PRO polypeptide was then added to the wells to a final volume of 200 μL. The control includes a growth medium containing a protein known to be inactive in this assay. Cells were incubated for 4 days at 37 ° C. Subsequently, 20 μL of Alamar Blue dye (AB) was added to each well, and fluorescence reading was measured 4 hours after adding AB with a microtiter plate reader at 530 nm excitation and 590 nm emission. The standards used were cells without bovine pituitary extract (BPE) and cells of various concentrations of BPE. An unknown buffer or growth medium only control is made twice in each 96-well plate.
The percent increase in protein production was calculated by comparing the calculated protein concentration with the alamar blue dye produced by the negative control cells to the calculated protein concentration with the alamar blue dye produced by the PRO polypeptide-treated cells. Yes. A percent increase in protein production of 25% or more compared to negative control cells is considered positive.
The following PRO polypeptide was tested positive in this assay: PRO301.

実施例５２：モルモット血管漏洩(アッセイ３２)
このアッセイは本発明のＰＲＯポリペプチドが血管透過性を誘導する能力を示すかどうかを決定するためのものである。このアッセイでポジティブであると検定されたポリペプチドは、例えば局部的に免疫系細胞浸潤を向上させることが有益である状態を含む、血管透過性を向上させることが有益な病状の治療に有用であることが予想される。
３５０ｇ又はそれ以上の無毛モルモットにケタミン(７５−８０ｍｇ／ｋｇ)と５ｍｇ／ｋｇのキシラジンを筋肉内投与して麻酔をかけた。ＲＯ３０２ポリペプチド又は試験ポリペプチドを含まない生理緩衝液を含む試験試料を、注射部位当たり１００μｌで試験動物の背の皮膚に皮内注射した。動物当たりおよそ１６-２４の注射部位があった。ついで１ｍｌのエバンスブルー染料(ＰＢＳ中１％)を心臓内注射した。化合物に対する皮膚血管透過性応答(すなわち、注射部位の斑点)について、試験動物の投与１及び６時間後に注射部位からの青色の漏出の直径(ｍｍ)を測定することで視覚によりスコアをつけた。注射部位の青さのｍｍ直径を観察し、血管漏出の重症度と共に記録した。少なくとも５ｍｍの直径の斑点は、精製タンパク質を試験する場合はアッセイでは正であると考えられ、血管漏出又は透過性を誘導する能力を示している。７ｍｍ直径を超える反応の場合に、条件媒体試料に対してポジティブであると考えられる。０．１μｇ／１００μｌのヒトＶＥＧＦが正の対照として使用され、４-８ｍｍ直径の応答を誘導した。
次のＰＲＯポリペプチドがこのアッセイにおいてポジティブであると検定された：ＰＲＯ５３３。 Example 52: Guinea Pig Vascular Leakage (Assay 32)
This assay is for determining whether a PRO polypeptide of the invention exhibits the ability to induce vascular permeability. Polypeptides that have been tested positive in this assay are useful in the treatment of conditions where it is beneficial to improve vascular permeability, including, for example, conditions where it is beneficial to improve immune system cell invasion locally. Expected to be.
350 g or more hairless guinea pigs were anesthetized by intramuscular administration of ketamine (75-80 mg / kg) and 5 mg / kg xylazine. Test samples containing RO302 polypeptide or physiological buffer without test polypeptide were injected intradermally into the dorsal skin of test animals at 100 μl per injection site. There were approximately 16-24 injection sites per animal. Then 1 ml of Evans Blue dye (1% in PBS) was injected intracardiac. The skin vascular permeability response to the compound (ie, spot at the injection site) was scored visually by measuring the diameter (mm) of the blue leakage from the injection site 1 and 6 hours after administration of the test animals. The blue diameter mm of the injection site was observed and recorded along with the severity of vascular leakage. Spots with a diameter of at least 5 mm are considered positive in the assay when testing purified protein, indicating the ability to induce vascular leakage or permeability. A reaction over 7 mm diameter is considered positive for the conditioned media sample. 0.1 μg / 100 μl of human VEGF was used as a positive control to induce a 4-8 mm diameter response.
The following PRO polypeptide was tested positive in this assay: PRO533.

実施例５３：網膜ニューロン生存(アッセイ５２)
この実施例はあるＰＲＯポリペプチドが網膜ニューロン細胞の生存の促進において有効性を有することを示し、よって、例えば色素性網膜症、ＡＭＤ等による哺乳動物の視力喪失の治療を含む、網膜疾患又は損傷の治療に有用である。
妊娠７日のSprague Dawleyラット胎児(混合集団：グリア及び網膜ニューロン型)をＣＯ２麻酔に続いて断頭により屠殺し、無菌条件下で眼を取り出した。神経網膜を色素上皮から切除し、他の眼組織をＣａ２＋、Ｍｇ２＋無しのＰＢＳ中の0.25%トリプシンを用いて単細胞懸濁物中に解離させた。網膜を３７℃で７−１０分間インキュベートし、その後1mlのダイズトリプシンインヒビターを添加することによりトリプシンを不活性化した。細胞を、Ｎ２を添加し、特異的な試験ＰＲＯポリペプチド有り又は無しのＤＭＥＭ／Ｆ１２中、９６-ウェルプレートにウェル当たり100,000細胞で蒔いた。全ての実験について、細胞は5%ＣＯ２の水飽和雰囲気下、３７℃で成長させた。培地中で２−３日後に細胞をカルセインＡＭで染色し、次いで4%のパラホルムアルデヒドで固定し、全細胞カウントの測定のためにＤＡＰＩで染色した。全細胞(蛍光)は、ＣＣＤカメラ及びMacIntosh用ＮＩＨ画像ソフトウェアを用いて20X対物倍率で定量化した。ウェルの視野は無作為に選択した。
種々の濃度のＰＲＯポリペプチドの効果は、培地中２−３日でのカルセインＡＭポジティブ細胞の合計数を、培地中２−３日のＤＡＰＩ標識細胞の合計数で除することにより計算した。３０％を越える生存をポジティブと考える。
以下のＰＲＯポリペプチドが、０．０１％〜１．０％の範囲内のポリペプチド濃度で使用するこのアッセイでポジティブであると検定された：ＰＲＯ３５０。 Example 53: Retinal neuron survival (Assay 52)
This example demonstrates that certain PRO polypeptides have efficacy in promoting the survival of retinal neuronal cells, and thus include retinal diseases or injuries, including the treatment of mammalian vision loss due to, for example, retinopathy of the pigment, AMD, etc. Useful for the treatment of
Day 7 Sprague Dawley rat fetuses (mixed population: glial and retinal neuronal types) were sacrificed by CO2 anesthesia followed by decapitation and eyes were removed under aseptic conditions. The neural retina was excised from the pigment epithelium and other ocular tissues were dissociated into single cell suspensions using 0.25% trypsin in PBS without Ca2 +, Mg2 +. Retinas were incubated at 37 ° C. for 7-10 minutes, after which trypsin was inactivated by adding 1 ml of soybean trypsin inhibitor. Cells were seeded at 100,000 cells per well in 96-well plates in DMEM / F12 with or without N2 and specific test PRO polypeptide. For all experiments, the cells were grown at 37 ° C. in a water saturated atmosphere of 5% CO2. Cells were stained with calcein AM after 2-3 days in medium, then fixed with 4% paraformaldehyde and stained with DAPI for determination of total cell count. Total cells (fluorescence) were quantified at 20X objective magnification using a CCD camera and NIH image software for MacIntosh. The field of view of the wells was chosen randomly.
The effect of various concentrations of PRO polypeptide was calculated by dividing the total number of calcein AM positive cells in 2-3 days in the medium by the total number of DAPI-labeled cells in the 2-3 days in the medium. Survival over 30% is considered positive.
The following PRO polypeptides were tested positive in this assay using polypeptide concentrations in the range of 0.01% to 1.0%: PRO350.

実施例５４：ラット小嚢支持細胞の増殖(アッセイ５４)
このアッセイは本発明のあるポリペプチドが聴覚毛細胞前駆体である内耳支持細胞の有糸***促進剤として作用し、したがって哺乳動物における聴覚毛細胞の再生誘発と軟調の治療に利用できることを示す。アッセイは次のように実施される。ラットＵＥＣ−４小嚢上皮細胞が３３℃、２００μｌの血清添加培地で密度３０００細胞／ウェルで９６ウェルプレートに等分される。細胞は一晩培養され、ついで３７℃で無血清培地に移される。ついで様々な希釈率のＰＲＯポリペプチド(又はコントロールには不含有)が培地に加えられ、ついで細胞は２４時間インキュベートされる。２４時間のインキュベーションの後、３Ｈ−チミジン(１μＣｉ/ウェル)が加えられ、ついでさらに２４時間培養される。次に培地は組み込まれなかった放射能標識を取り除くために洗浄され、細胞を取り出し、１ウェルあたりのCpmが決定される。コントロール培地と比較してＰＲＯポリペプチドで処置した培地で少なくとも３０％又はそれ以上のＣｐｍであった場合にはアッセイでポジティブと判断される。
次のポリペプチドがこのアッセイにおいてポジティブであると検定された：ＰＲＯ３３７。 Example 54: Proliferation of rat follicular feeder cells (Assay 54)
This assay shows that certain polypeptides of the invention act as mitogens for inner ear support cells, which are auditory hair cell precursors, and can therefore be used to induce regeneration of auditory hair cells and to treat softness in mammals. The assay is performed as follows. Rat UEC-4 follicular epithelial cells are aliquoted into 96-well plates at a density of 3000 cells / well in 200 μl serum-supplemented medium at 33 ° C. Cells are cultured overnight and then transferred to serum-free medium at 37 ° C. Various dilutions of PRO polypeptide (or no control) are then added to the medium and the cells are then incubated for 24 hours. After 24 hours of incubation, 3H-thymidine (1 μCi / well) is added and then incubated for an additional 24 hours. The medium is then washed to remove unincorporated radiolabel, the cells removed and the Cpm per well determined. A positive in the assay is determined if there is at least 30% or more Cpm in the medium treated with the PRO polypeptide compared to the control medium.
The following polypeptide was tested positive in this assay: PRO337.

実施例５５：杆状体光受容体細胞の生存(アッセイ５６)
このアッセイは、本発明のあるポリペプチドが杆状体光受容体細胞の生存／増殖を高めるように作用し、よって、例えば色素性網膜炎、ＡＭＤ等による哺乳動物の視力喪失の治療を含む網膜疾患又は損傷の治療的処置に有用であることを示す。
妊娠７日のSprague Dawleyラット胎児(混合集団：グリア及び網膜ニューロン細胞型)をＣＯ２麻酔に続いて断頭により屠殺し、無菌条件下で眼を取り出した。神経網膜を色素上皮及び他の眼組織から切除し、ついでＣａ２＋、Ｍｇ２＋無しのＰＢＳ中の0.25%トリプシンを用いて単細胞懸濁物中に解離させた。網膜を３７℃で７−１０分間インキュベートし、その後1mlのダイズトリプシンインヒビターを添加することによりトリプシンを不活性化した。細胞を、Ｎ２を添加したＤＭＥＭ／Ｆ１２中、９６-ウェルプレートにウェル当たり100,000細胞で蒔いた。全ての実験について、細胞は5%ＣＯ２の水飽和雰囲気下、３７℃で成長させた。培地中で２−３日後に細胞を4%のパラホルムアルデヒドで固定し、次いでセルトラッカーグリーンＣＭＦＤＡ染色した。Rho 4D2(腹水又はＩｇＧ1:100)、可視色素ロドプシンに対するモノクローナル抗体を、間接的免疫蛍光法による杆状体光受容体の検出に使用した。結果は％生存：培地中２−３日のカルセイン−ロドプシンポジティブ細胞の全数を、培地中２−３日でのロドプシンポジティブ細胞の全数で除するものとして計算する。全細胞(蛍光)は、ＣＣＤカメラ及びMacIntosh用ＮＩＨ画像ソフトウェアを用いて20X対物倍率で定量化した。ウェルの視野は無作為に選択した。
次のポリペプチドがこのアッセイにおいてポジティブであると検定された：ＰＲＯ３５０。 Example 55: Survival of rod photoreceptor cells (assay 56)
This assay acts to increase the survival / proliferation of rod photoreceptor cells with certain polypeptides of the invention and thus includes treatment of mammalian vision loss due to, for example, retinitis pigmentosa, AMD, etc. It is useful for therapeutic treatment of disease or injury.
Day 7 Sprague Dawley rat fetuses (mixed population: glial and retinal neuronal cell types) were sacrificed by CO2 anesthesia followed by decapitation and eyes were removed under aseptic conditions. The neural retina was excised from the pigment epithelium and other ocular tissues and then dissociated into single cell suspensions using 0.25% trypsin in PBS without Ca2 +, Mg2 +. Retinas were incubated at 37 ° C. for 7-10 minutes, after which trypsin was inactivated by adding 1 ml of soybean trypsin inhibitor. Cells were seeded at 100,000 cells per well in 96-well plates in DMEM / F12 supplemented with N2. For all experiments, the cells were grown at 37 ° C. in a water saturated atmosphere of 5% CO2. After 2-3 days in medium, cells were fixed with 4% paraformaldehyde and then stained with Cell Tracker Green CMFDA. Rho 4D2 (ascites or IgG1: 100), a monoclonal antibody against the visible dye rhodopsin, was used for detection of rod photoreceptors by indirect immunofluorescence. Results are calculated as% survival: total number of calcein-rhodopsin positive cells in 2-3 days in medium divided by total number of rhodopsin positive cells in 2-3 days in medium. Total cells (fluorescence) were quantified at 20X objective magnification using a CCD camera and NIH image software for MacIntosh. The field of view of the wells was chosen randomly.
The following polypeptide was tested positive in this assay: PRO350.

実施例５６：皮膚血管透過性アッセイ(アッセイ６４)
このアッセイは本発明のあるポリペプチドが動物の注入部位での単核細胞、好酸球及びＰＭＮ浸潤を誘発することにより免疫反応を促進及び炎症反応を誘発することを示す。免疫反応を刺激する化合物は免疫反応の刺激が有用な治療に利用可能である。この皮膚血管透過性アッセイは次のように実施される。体重が３５０グラム又はそれ以上の毛の無いモルモットをケタミン(７５−８０mg/Kg)及び５mg/Kgキシラジンの筋肉注射(IM)をして麻酔をかけた。精製された本発明のポリペプチドの試料又は条件培地試験試料が、注入部位あたり１００μｌを試験動物の背中に皮内注入される。動物あたり約１０−３０、好ましくは約１６−２４箇所の部位に注入が可能である。エバンスブルー色素(１％に生理的食塩水で緩衝)の１μｌが心臓内に注入される。ついで注入部位における斑点が注入後１時間と６時間で測定(直径ｍｍ)される。動物は注入後６時間で屠殺される。それぞれの皮膚注入部位は生体組織検査され、ホルマリンで固定される。ついで皮膚は組織病理学検査用に調製される。それぞれ部位は皮膚への炎症細胞浸潤を検査される。可視的な炎症細胞の炎症を有する部位はポジティブとして記録される。炎症細胞は好中球、好酸球、単球、リンパ球であり得る。少なくとも注入部位での最小血管周囲の浸潤はポジティブとして記録され、注入部位で浸潤のなかった場合にはネガティブとして記録される。
次のポリペプチドがこのアッセイにおいてポジティブであると検定された：ＰＲＯ３０１。 Example 56: Skin Vascular Permeability Assay (Assay 64)
This assay shows that certain polypeptides of the invention promote immune responses and induce inflammatory responses by inducing mononuclear cells, eosinophils and PMN infiltration at the injection site of animals. Compounds that stimulate the immune response are available for treatments where stimulation of the immune response is useful. This skin vascular permeability assay is performed as follows. Hairless guinea pigs weighing 350 grams or more were anesthetized by intramuscular injection (IM) of ketamine (75-80 mg / Kg) and 5 mg / Kg xylazine. A purified sample of the polypeptide of the invention or conditioned medium test sample is injected intradermally into the back of the test animal at 100 μl per injection site. Injection can be made to about 10-30, preferably about 16-24, sites per animal. 1 μl of Evans Blue dye (buffered with 1% saline) is injected into the heart. The spots at the injection site are then measured (diameter mm) at 1 and 6 hours after injection. Animals are sacrificed 6 hours after injection. Each skin injection site is biopsied and fixed with formalin. The skin is then prepared for histopathology examination. Each site is examined for inflammatory cell infiltration into the skin. Sites with visible inflammatory cell inflammation are scored as positive. Inflammatory cells can be neutrophils, eosinophils, monocytes, lymphocytes. At least infiltration around the minimal blood vessel at the injection site is recorded as positive, and negative when there is no infiltration at the injection site.
The following polypeptide was tested positive in this assay: PRO301.

実施例５７：内皮細胞アポトーシスの誘導(アッセイ７３)
内皮細胞においてアポトーシスを誘導するＰＲＯポリペプチドの能力を、ヒト静脈の臍静脈内皮細胞(HUVEC, Cell Systems)中で試験した。このアッセイでポジティブであると、内皮細胞のアポトーシスの誘発が有益である腫瘍並びに血管疾患の治療にポリペプチドが有用であることを示している。
細胞を９６ウェルマイクロタータープレート(Amersham Life Science, cytostar-Tシンチレーティングマイクロプレート、RPNQ160、無菌、組織培地処理、個々にラッピング)で10%の血清(CSG-媒体、Cell Systems)中、ウェル当たり2x104細胞の密度で全容量100μｌでプレーティングした。２日目に、ＰＲＯポリペプチドを含有する試験試料を1%、0.33%及び0.11%希釈の３段階で添加した。細胞無しのウェルをブランクとして用い、細胞のみのウェルをネガティブ対照として用いた。ポジティブ対照としてスタウロスポリンの３ｘストックの1:3連続希釈50μlを用いた。ＰＲＯポリペプチドのアポトーシスを誘導する能力は、カルシウム及びリン脂質結合タンパク質のメンバーであるアネキシンＶの検出のために９６ウェルをプロセッシングしてアポトーシスを検出することにより決定した。
0.2mlのアネキシンＶ-ビオチンのストック溶液(100μg/ml)を、4.6mlの2 x Ｃａ２＋結合バッファー及び2.5%BSA中に希釈した(1:25希釈)。50μlの希釈アネキシンＶ-ビオチン液を、1.0μg/mlの最終濃度になるまで各ウェル(対照を除く)に添加した。試料を３５Ｓ-ストレプトアビジンの直接添加の前にアネキシン-ビオチンと共に10-15分間インキュベートした。３５Ｓ-ストレプトアビジンは2 x Ｃａ２＋結合バッファー、2.5%BSA中に希釈し、最終濃度が3 x 104cpm／ウェルになるまで全てのウェルに添加した。次いでプレートを密封し、1000rpmで15分間遠心分離し、2時間の間、軌道シェイカー上に配した。分析は1450 Microbeta Trilux (Wallac)で実施した。バックグラウンドを越えるパーセントがネガティブ対照を越える毎分当たりのカウントのパーセント量を表す。バックグラウンドを越えるパーセントが30%以上のものがポジティブであると考えられる。
次のＰＲＯポリペプチドがこのアッセイにおいてポジティブであると検定された：ＰＲＯ３０１。 Example 57: Induction of endothelial cell apoptosis (Assay 73)
The ability of PRO polypeptides to induce apoptosis in endothelial cells was tested in human vein umbilical vein endothelial cells (HUVEC, Cell Systems). A positive in this assay indicates that the polypeptide is useful in the treatment of tumors as well as vascular diseases where induction of endothelial cell apoptosis is beneficial.
Cells were 2 × 10 4 per well in 10% serum (CSG-medium, Cell Systems) in 96-well microtarter plates (Amersham Life Science, cytostar-T scintillating microplates, RPNQ160, sterile, tissue culture treated, individually wrapped) Plated in 100 μl total volume at cell density. On the second day, test samples containing PRO polypeptide were added in three stages, diluted 1%, 0.33% and 0.11%. Wells without cells were used as blanks and cell-only wells were used as negative controls. As a positive control, 50 μl of a 1: 3 serial dilution of a 3 × stock of staurosporine was used. The ability of the PRO polypeptide to induce apoptosis was determined by processing 96 wells to detect apoptosis for the detection of annexin V, a member of calcium and phospholipid binding proteins.
0.2 ml of annexin V-biotin stock solution (100 μg / ml) was diluted in 4.6 ml 2 × Ca 2+ binding buffer and 2.5% BSA (1:25 dilution). 50 μl of diluted annexin V-biotin solution was added to each well (except controls) to a final concentration of 1.0 μg / ml. Samples were incubated with annexin-biotin for 10-15 minutes prior to direct addition of 35S-streptavidin. 35S-Streptavidin was diluted in 2 × Ca 2+ binding buffer, 2.5% BSA and added to all wells to a final concentration of 3 × 104 cpm / well. The plate was then sealed and centrifuged at 1000 rpm for 15 minutes and placed on an orbital shaker for 2 hours. Analysis was performed with 1450 Microbeta Trilux (Wallac). Represents the percentage amount of counts per minute where the percentage above the background exceeds the negative control. A percentage above 30% of the background is considered positive.
The following PRO polypeptide was tested positive in this assay: PRO301.

実施例５８：皮質ニューロンにおけるｃ-ｆｏｓの誘発(アッセイ８３)
このアッセイは、ＰＲＯポリペプチドが皮質ニューロンにおいてｃ-ｆｏｓを誘発する能力を示すか否かを決定するために設計される。このアッセイでポジティブであると検定されるＰＲＯポリペプチドは、ニューロン増殖が有益であろう神経系疾患及び損傷の治療に有用であることが予想される。
皮質ニューロンを分離し、９６ウェルのプレートに１ウェル当たり10,000細胞で成長培地にプレーティングした。およそ２の細胞分割後、細胞をＰＲＯポリペプチドで30分間処理するか、又はしなかった(負の対照)。次いで、細胞を５分間、冷メタノールで固定し、ホスホリル化ＣＲＥＢに対する抗体で染色した。ｍＲＮＡのレベルを化学ルミネセンス法を使用して計算した。このアッセイでポジティブであると、負の対照と比較して、ｃ-ｆｏｓメッセージが少なくとも２倍増加する結果になる因子である。
次のＰＲＯポリペプチドがこのアッセイにおいてポジティブであると検定された：ＰＲＯ２８８。 Example 58: Induction of c-fos in cortical neurons (Assay 83)
This assay is designed to determine whether a PRO polypeptide exhibits the ability to induce c-fos in cortical neurons. PRO polypeptides that are tested positive in this assay are expected to be useful in the treatment of neurological diseases and injuries where neuronal proliferation would be beneficial.
Cortical neurons were isolated and plated in growth medium at 10,000 cells per well in 96 well plates. After approximately 2 cell divisions, cells were treated with PRO polypeptide for 30 minutes or not (negative control). The cells were then fixed with cold methanol for 5 minutes and stained with an antibody against phosphorylated CREB. The level of mRNA was calculated using a chemiluminescence method. A positive in this assay is a factor that results in at least a 2-fold increase in c-fos message compared to a negative control.
The following PRO polypeptide was tested positive in this assay: PRO288.

実施例５９：膵臓β-細胞前駆体分化の誘発(アッセイ８９)
このアッセイは本発明のあるポリペプチドが膵臓β-細胞前駆体から成熟した膵臓β-細胞への分化を誘発する働きをし、したがって、真正糖尿病を含む哺乳動物における様々なインシュリン不全段階の治療に利用できることを示す。アッセイは次のように実施される。アッセイはマウス胎児膵臓細胞の初代培養を使用し、初期測定はβ-細胞前駆体又は成熟したβ-細胞のどちらかに相当するマーカーの発現の変化である。マーカー発現はリアルタイム定量的ＰＣＲ(ＲＴＱ−ＰＣＲ)で測定され；ここで評価されるマーカーはインシュリンである。
膵臓はＥ１４胚(ＣＤ１マウス)から取り出される。ついで膵臓は３７℃で４０から６０分、Ｆ１２/ＤＭＥＭ中のコラゲナーゼ/ディスパーゼで消化される(コラゲナーゼ/ディスパーゼ、1.37mg/ml、Boehringer Mannheim、＃1097113)。ついで消化は同容量の５％ＢＳＡで中和され、細胞は一度ＲＰＭＩ１６４０で洗浄される。１日目、細胞は１２ウェル組織培養プレートに蒔かれる(PBS中で20μ/mlのラミニンでプレ被覆される、Boehringer Mannheim、＃124317)。１−２胚の膵臓由来の細胞はウェル当たり分配される。この初代培養の培地は１４Ｆ／１６４０である。２日目、培体は取り除かれ、付着した細胞はＲＰＭＩ／１６４０で洗浄される。試験されるタンパク質に加えて、２ｍｌの最小培地が加えられる。４日目、培地は取り除かれ、細胞からＲＮＡが調製され、リアルタイム定量的ＲＴ−ＰＣＲによってマーカー発現が分析される。未処置対照に比べ、関連したβ-細胞マーカーの発現が増加した場合には、タンパク質はアッセイにおいて活性であると考えられる。
１４Ｆ／１６４０はＲＰＭＩ１６４０(Gibco)に次のものを加えたものである：
グループＡ 1：1000
グループＢ 1：1000
組み換えヒトインシュリン 10μg／ml
アプロチニン(50μg／ml)1：2000(Boehringer manhein #981532)
ウシ下垂体エキス(ＢＰＥ)60μg／ml
ゲンタマイシン 100ng／ml
グループＡ：(10mlＰＢＳ中)
トランスフェリン、100mg(シグマ T2252)
上皮成長因子、100μg(BRL100004)
トリヨードチロニン、5x10−6Mの10μl(シグマ T5516)
エタノールアミン、10−１Ｍの100μl(シグマE0135)
ホスホエタノールアミン、10−１Ｍの100μl(シグマP0503)
セレニウム、10−1Ｍの4μl(Aesar#12574)
グループＣ：(10mlの100%エタノール中)
ヒドロコルチゾン、5x10−３Mの2μl(シグマ#H0135)
プロゲステロン、1x10−３Mの100μl(シグマ#P6149)
フォルスコリン、20mMの500μl(Calbiochem#344270)
最小培地：
ＲＰＭＩ１６４０にトランスフェリン(10μ/ml)、インシュリン(1μg/ml)、ゲンタマイシン(100ng/ml)、アプロチニン(50μg/ml)及びＢＰＥ(15μg/ml)を加える。
定まった培地：
ＲＰＭＩ１６４０にトランスフェリン(10μ/ml)、インシュリン(1μg/ml)、ゲンタマイシン(100ng/ml)及びアプロチニン(50μg/ml)を加える。
次のポリペプチドはこのアッセイで活性であった：ＰＲＯ１１３６１、ＰＲＯ１３０８、ＰＲＯ１６００及びＰＲＯ４３５６。 Example 59: Induction of pancreatic β-cell precursor differentiation (assay 89)
This assay serves to induce differentiation of certain polypeptides of the invention from pancreatic β-cell precursors into mature pancreatic β-cells, and thus, in the treatment of various stages of insulin deficiency in mammals including diabetes mellitus. Indicates that it can be used. The assay is performed as follows. The assay uses primary cultures of mouse fetal pancreatic cells and the initial measurement is a change in the expression of markers corresponding to either β-cell precursors or mature β-cells. Marker expression is measured by real-time quantitative PCR (RTQ-PCR); the marker evaluated here is insulin.
The pancreas is removed from the E14 embryo (CD1 mouse). The pancreas is then digested with collagenase / dispase in F12 / DMEM at 37 ° C. for 40-60 minutes (collagenase / dispase, 1.37 mg / ml, Boehringer Mannheim, # 1097113). The digestion is then neutralized with the same volume of 5% BSA and the cells are washed once with RPMI 1640. On day 1, cells are seeded in 12-well tissue culture plates (precoated with 20 μ / ml laminin in PBS, Boehringer Mannheim, # 124317). Cells from 1-2 embryonic pancreas are distributed per well. The medium for this primary culture is 14F / 1640. On day 2, the culture is removed and the attached cells are washed with RPMI / 1640. In addition to the protein to be tested, 2 ml of minimal medium is added. On day 4, the medium is removed, RNA is prepared from the cells, and marker expression is analyzed by real-time quantitative RT-PCR. A protein is considered active in the assay if the expression of the associated β-cell marker is increased compared to an untreated control.
14F / 1640 is RPMI 1640 (Gibco) plus the following:
Group A 1: 1000
Group B 1: 1000
Recombinant human insulin 10μg / ml
Aprotinin (50μg / ml) 1: 2000 (Boehringer manhein # 981532)
Bovine pituitary extract (BPE) 60μg / ml
Gentamicin 100ng / ml
Group A: (in 10ml PBS)
Transferrin, 100 mg (Sigma T2252)
Epidermal growth factor, 100 μg (BRL100004)
10 μl of triiodothyronine, 5x10-6M (Sigma T5516)
100 μl of ethanolamine, 10-1M (Sigma E0135)
100 μl of phosphoethanolamine, 10-1M (Sigma P0503)
Selenium, 10-1M 4μl (Aesar # 12574)
Group C: (in 10 ml 100% ethanol)
Hydrocortisone, 5x10-3M 2 μl (Sigma # H0135)
Progesterone, 1x10-3M 100 μl (Sigma # P6149)
Forskolin, 20 mM 500 μl (Calbiochem # 344270)
Minimum medium:
Transferrin (10 μ / ml), insulin (1 μg / ml), gentamicin (100 ng / ml), aprotinin (50 μg / ml) and BPE (15 μg / ml) are added to RPMI 1640.
Fixed medium:
Transferin (10 μ / ml), insulin (1 μg / ml), gentamicin (100 ng / ml) and aprotinin (50 μg / ml) are added to RPMI 1640.
The following polypeptides were active in this assay: PRO11361, PRO1308, PRO1600 and PRO4356.

実施例６０：周皮細胞ｃ-ｆｏｓの誘発(アッセイ９３)
このアッセイは、本発明のあるポリペプチドが周皮細胞においてｃ-ｆｏｓの発現を誘発するように作用し、よって特定の種類の周皮細胞結合腫瘍の診断用マーカーとして有用であるばかりでなく、周皮細胞関連腫瘍の治療的処置に有用であると予想されるアンタゴニストを生じることを示す。周皮細胞におけるｃ-ｆｏｓの発現の誘発はまた血管形成が誘発されたことを示し、よって、ｃ-ｆｏｓの発現を誘発可能なＰＲＯポリペプチドが、例えば創傷治癒等を含む、血管形成の誘発が有益である病状の治療に有用であることが予想される。特に１日目に、周皮細胞をVEC Technologiesから得、５mlの培地以外をフラスコから取り出した。２日目に周皮細胞をトリプシン化し、洗浄し、スピンさせ、ついで９６ウェルプレートに蒔いた。７日目に培地を取り出し、周皮細胞を100μlのＰＲＯポリペプチドテスト用試料及び対照体(ポジティブ対照体＝ＤＥＭ＋5%血清＋／−500ng/mlのＰＤＧＦ；ネガティブ対照体＝プロテイン３２)で処理した。複製を平均し、ＳＤ／ＣＶを決定した。化学ルミネセンス単位(ＲＬＵ)照度計リーディングバース頻度により示されたプロテイン３２値を越える折り畳み増加(バッファー対照)をヒストグラム上にプロットする。上記のプロテイン３２値を２倍越えると、アッセイについてポジティブであると考えられる。ＡＳＹマトリックス：成長培地＝低グルコースＤＭＥＭ＝20%ＦＢＳ＋1xペンストレップ(pen strep)＋1Xフンギゾン(fungizone)。アッセイ用培地＝低グルコースＤＭＥＭ＋5%ＦＢＳ。
次のポリペプチドがこのアッセイにおいてポジティブであると検定された：ＰＲＯ４４４及びＰＲＯ２１７。 Example 60: Induction of pericyte c-fos (Assay 93)
This assay not only acts to induce the expression of c-fos in pericytes, but is useful as a diagnostic marker for certain types of pericyte-binding tumors, FIG. 5 shows that it produces antagonists that are expected to be useful for therapeutic treatment of pericyte-associated tumors. Induction of c-fos expression in pericytes also indicates that angiogenesis has been induced, and thus PRO polypeptides capable of inducing c-fos expression induce angiogenesis, including, for example, wound healing. Is expected to be useful in the treatment of medical conditions that are beneficial. In particular, on the first day, pericytes were obtained from VEC Technologies and all but 5 ml of medium was removed from the flask. On day 2, pericytes were trypsinized, washed, spun and then seeded in 96 well plates. On day 7, medium was removed and pericytes were treated with 100 μl of PRO polypeptide test sample and control (positive control = DEM + 5% serum +/− 500 ng / ml PDGF; negative control = protein 32). . Replications were averaged and SD / CV was determined. The increase in folding (buffer control) over the protein 32 value as indicated by the chemiluminescence unit (RLU) luminometer reading verse frequency is plotted on the histogram. Exceeding the protein 32 value of 2 above is considered positive for the assay. ASY matrix: Growth medium = low glucose DMEM = 20% FBS + 1 × pen strep + 1 × fungizone. Assay medium = low glucose DMEM + 5% FBS.
The following polypeptides were tested positive in this assay: PRO444 and PRO217.

実施例６１：骨格筋におけるグルコース又はＦＦＡの取込みに影響を及ぼすＰＲＯポリペプチドの検出(アッセイ１０６)
このアッセイは、ＰＲＯポリペプチドが骨格筋細胞によるグルコース又はＦＦＡの取込みに影響を及ぼす能力を示すか否かを決定するために設計された。このアッセイにおいてポジティブであると検定されたＰＲＯポリペプチドは、例えば糖尿病、高-又は低-インシュリン血症を含む、骨格筋によるグルコースの取込みの刺激又は阻害のいずれかが有益であるとされる疾患の治療に有用であることが予想される。
９６ウェル型において、アッセイされるＰＲＯポリペプチドを一次ラット分化骨格筋に添加し、終夜インキュベートした。次に、ＰＲＯポリペプチド及び＋／−インシュリンを含む新鮮な培地をウェルに添加した。ついで、試料培地を監視して、骨格筋細胞によるグルコース及びＦＦＡの取込みを測定した。インシュリンは骨格筋によるグルコース及びＦＦＡの取込みを刺激し、ＰＲＯポリペプチドを含有しない培地中のインシュリンをポジティブな対照とし、スコアの限界値として使用した。試験したＰＲＯポリペプチドがグルコース又はＦＦＡの取込みを刺激又は阻害する場合、インシュリン対照の１．５倍以上か、０．５倍未満であるならば、結果はこのアッセイにおいてポジティブであるとスコアされる。
次のＰＲＯポリペプチドが、このアッセイにおいてグルコース及び／又はＦＦＡの取込みの刺激剤又は阻害剤としてポジティブであると検定された：ＰＲＯ１９６、ＰＲＯ１８３、ＰＲＯ１８５、ＰＲＯ２１５、ＰＲＯ２８８、ＰＲＯ１３６１、ＰＲＯ１６００、ＰＲＯ４９９９、ＰＲＯ７１７０、ＰＲＯ５３３及びＰＲＯ１８７。 Example 61: Detection of PRO polypeptides affecting glucose or FFA uptake in skeletal muscle (Assay 106)
This assay was designed to determine whether a PRO polypeptide exhibits the ability to affect glucose or FFA uptake by skeletal muscle cells. PRO polypeptides that have been tested positive in this assay are those diseases in which either stimulation or inhibition of glucose uptake by skeletal muscle is beneficial, including, for example, diabetes, high- or low-insulinemia It is expected to be useful in the treatment of
In 96-well format, the PRO polypeptide to be assayed was added to primary rat differentiated skeletal muscle and incubated overnight. Next, fresh medium containing PRO polypeptide and +/- insulin was added to the wells. The sample medium was then monitored to measure glucose and FFA uptake by skeletal muscle cells. Insulin stimulated glucose and FFA uptake by skeletal muscle, and insulin in media without PRO polypeptide was used as a positive control and was used as a score limit. If the tested PRO polypeptide stimulates or inhibits glucose or FFA uptake, the result is scored as positive in this assay if it is greater than 1.5 times or less than 0.5 times the insulin control. .
The following PRO polypeptides were tested positive in this assay as stimulators or inhibitors of glucose and / or FFA uptake: PRO196, PRO183, PRO185, PRO215, PRO288, PRO1361, PRO1600, PRO4999, PRO7170, PRO533 and PRO187.

実施例６２：赤芽球細胞系における胎児ヘモグロビン誘発(アッセイ１０７)
このアッセイは、成人のヘモグロビンから赤芽球細胞系における胎児ヘモグロビンへの切替を誘発する、ＰＲＯポリペプチドの能力をスクリーニングするのに有用である。このアッセイにおいてポジティブであると検定された分子は、種々のサラセミア等の、多様な哺乳動物ヘモグロビン関連疾患を治療的に処置するのに有用であることが期待される。このアッセイは以下のようにして行われる。赤芽球細胞を標準的成長培地において、９６ウェルフォーマットに1000細胞／ウェルで蒔く。0.2%又は2%の濃度でＰＲＯポリペプチドを成長培地に添加し、細胞を３７℃で５日間インキュベートする。ポジティブ対照体として、細胞を100μMのヘミンで処理し、ネガティブ対照として、細胞を処理しない。５日後、細胞溶解物を調製し、ガンマグロブリンの発現について分析した(胎児用マーカー)。このアッセイにおいてポジティブとは、ガンマグロブリンレベルがネガティブ対照体の少なくとも２倍であることである。
次のポリペプチドがこのアッセイにおいてポジティブであると検定された：ＰＲＯ１４１９。 Example 62: Induction of fetal hemoglobin in an erythroblast cell line (assay 107)
This assay is useful for screening the ability of PRO polypeptides to induce the switch from adult hemoglobin to fetal hemoglobin in erythroblast cell lines. Molecules that have been tested positive in this assay are expected to be useful for therapeutic treatment of a variety of mammalian hemoglobin-related diseases, such as various thalassemias. This assay is performed as follows. Erythroid cells are seeded in standard growth medium at 1000 cells / well in a 96 well format. PRO polypeptide is added to the growth medium at a concentration of 0.2% or 2% and the cells are incubated at 37 ° C. for 5 days. As a positive control, cells are treated with 100 μM hemin and as a negative control, cells are not treated. After 5 days, cell lysates were prepared and analyzed for gamma globulin expression (fetal marker). Positive in this assay is that the gamma globulin level is at least twice that of the negative control.
The following polypeptide was tested positive in this assay: PRO1419.

実施例６３：軟骨細胞再分化アッセイ(アッセイ１１０)
このアッセイは、本発明のあるポリペプチドが軟骨細胞の再分化を誘導する働きをし、従って、例えばスポーツ障害や関節炎のような様々な骨及び／又は軟骨の障害の治療に役立つことが期待されることが示される。アッセイは次のように実施される。ブタの軟骨細胞が４−６月齢の雌ブタの中手指節関節の関節軟骨を一晩コラゲナーゼ消化することによって単離される。ついで単離された細胞はＦＢＳを１０％とゲンタマイシンを４μｇ/ml含有するヘムＦ-１２に25,000細胞/cm２で蒔かれる。培地は３日ごとに替えられ、次いで血清なしの100μｌの同培地中に、5,000細胞/ウェルで９６ウェルに蒔かれ、100μｌ試験ＰＲＯポリペプチド５nMのスタウロスポリン(ポジティブ対照体)または培地のみ(ネガティブ対照体)が最終的な総量が200μｌ/ウェルになるように加えられる。３７℃でインキュベーションして５日後、それぞれのウェルの写真が撮られ、軟骨細胞の分化状態が決定される。アッセイにおけるポジティブの結果は軟骨細胞の再分化がネガティブ対照体よりもポジティブ対照体に、より類似していると決定された時である。
次のポリペプチドがこのアッセイにおいてポジティブであると検定された：ＰＲＯ２１５、ＰＲＯ３５３、ＰＲＯ３６５、ＰＲＯ１２７２、ＰＲＯ３０１及びＰＲＯ３３７。 Example 63: Chondrocyte Redifferentiation Assay (Assay 110)
This assay is expected to help certain polypeptides of the present invention induce chondrocyte redifferentiation and thus be useful in the treatment of various bone and / or cartilage disorders such as, for example, sports disorders and arthritis. It is shown that. The assay is performed as follows. Porcine chondrocytes are isolated by overnight collagenase digestion of articular cartilage of 4-6 month old sow metacarpophalangeal joints. The isolated cells are then seeded at 25,000 cells / cm 2 in Heme F-12 containing 10% FBS and 4 μg / ml gentamicin. The medium was changed every 3 days and then seeded in 96 μl at 5,000 cells / well in 100 μl of the same medium without serum and 100 μl test PRO polypeptide 5 nM staurosporine (positive control) or medium alone ( Negative control) is added to a final total volume of 200 μl / well. After 5 days of incubation at 37 ° C., pictures of each well are taken to determine the state of chondrocyte differentiation. A positive result in the assay is when the redifferentiation of chondrocytes is determined to be more similar to the positive control than to the negative control.
The following polypeptides were tested positive in this assay: PRO215, PRO353, PRO365, PRO1272, PRO301 and PRO337.

実施例６４：軟骨細胞増殖アッセイ(アッセイ１１１)
このアッセイは、本発明のＰＲＯポリペプチドが培養中に軟骨細胞の増殖及び／又は再分化を誘導する能力を示すか否かを決定するために設計された。このアッセイにおいてポジティブであると検定されると、例えばスポーツ障害や関節炎のような様々な骨及び／又は軟骨疾患の治療に役立つことが期待される。アッセイは次のように実施される。
ブタの軟骨細胞が４−６月齢の雌ブタの中手指節関節の関節軟骨を一晩コラゲナーゼ消化することによって単離される。ついで単離された細胞はＦＢＳを１０％とゲンタマイシンを４μｇ/ml含有するヘムＦ-１２に25,000細胞/cm２で蒔かれる。培地は３日ごとに替えられ、５日ごとに25,000細胞／/cm２が再度蒔かれる。１２日目に、血清なしの100μｌの同培地中に、5,000細胞/ウェルで９６ウェルに蒔かれ、100μｌの血清なし培地(ネガティブ対照)、スタウロスポリン(最終濃度５nM；ポジティブ対照)または試験ＰＲＯポリペプチド(ネガティブ対照)が最終的な総量が200μｌ/ウェルになるように加えられる。３７℃でインキュベーションして５日後、20μｌのアラマーブルーを各ウェルに添加し、３７℃でさらに３時間、プレートをインキュベートした。次に各ウェルの蛍光を測定した(励起：530nm；発光：590nm)。200μｌの無血清培地を含むプレートの蛍光を測定し、バックグラウンドを得た。アッセイにおいてポジティブな結果は、ＰＲＯポリペプチドで処理された試料の蛍光がネガティブ対照よりもポジティブ対照のものにより近い場合に得られる。
次のＰＲＯポリペプチドがこのアッセイにおいてポジティブであると検定された：ＰＲＯ２１５、ＰＲＯ２１７、ＰＲＯ２４８、ＰＲＯ１３６１、ＰＲＯ１４１９、ＰＲＯ５３３及びＰＲＯ２６５。 Example 64: Chondrocyte proliferation assay (Assay 111)
This assay was designed to determine whether the PRO polypeptides of the invention show the ability to induce chondrocyte proliferation and / or redifferentiation in culture. If tested positive in this assay, it is expected to help treat various bone and / or cartilage diseases such as, for example, sports disorders and arthritis. The assay is performed as follows.
Porcine chondrocytes are isolated by overnight collagenase digestion of articular cartilage of 4-6 month old sow metacarpophalangeal joints. The isolated cells are then seeded at 25,000 cells / cm 2 in Heme F-12 containing 10% FBS and 4 μg / ml gentamicin. The medium is changed every 3 days and 25,000 cells / cm 2 are seeded again every 5 days. On day 12, 100 μl of the same medium without serum was seeded in 96 wells at 5,000 cells / well and 100 μl of serum-free medium (negative control), staurosporine (final concentration 5 nM; positive control) or test PRO Polypeptide (negative control) is added to a final total volume of 200 μl / well. After 5 days of incubation at 37 ° C., 20 μl of alamar blue was added to each well and the plate was incubated at 37 ° C. for an additional 3 hours. Next, the fluorescence of each well was measured (excitation: 530 nm; emission: 590 nm). The fluorescence of the plate containing 200 μl of serum-free medium was measured to obtain a background. A positive result in the assay is obtained when the fluorescence of the sample treated with PRO polypeptide is closer to that of the positive control than to the negative control.
The following PRO polypeptides were tested positive in this assay: PRO215, PRO217, PRO248, PRO1361, PRO1419, PRO533 and PRO265.

実施例６５：マウスメセンギアル細胞阻害アッセイ(アッセイ１１４)
このアッセイでは本発明のＰＲＯポリペプチドが培養中のマウスメセンギアル(mesengial)細胞の増殖を阻害する能力を示すか否かを決定するために設計された。このアッセイでポジティブであると検定されたＰＲＯポリペプチドは、例えば嚢胞性腎臓形成異常、多嚢胞性腎臓病、又はメセンギアル細胞の異常増殖に関連する他の腎臓病、腎腫瘍等のような、メセンギアル細胞の増殖を阻害することが有益な病気又は症状の治療に有用であることが予想される。
１日目、マウスメセンギアル細胞が成長培地(ダルベッコ変性イーグル培地とヘムＦ１２培地、95％；ウシ胎仔血清、5％；14mM HEPESが3：1の混合物)で９６ウェルプレート上に蒔かれ、一晩育成する。２日目、ＰＲＯポリペプチドは無血清の培地において２種の濃度に希釈され(1％と0.1％)、細胞に加えられる。ネガティブ対照体はＰＲＯポリペプチドを添加しない成長培地である。細胞を４８時間インキュベートした後、Cell Titer 96 Aqueous１液試薬(Progema)２０μｌがそれぞれのウェルに加えられ、発色反応が２時間進められる。ついで吸光度(ＯＤ)が４９０nmで測定される。アッセイにおけるポジティブはネガティブ対照の少なくとも１０％を越える吸光度の読みを与えるものである。
次のＰＲＯポリペプチドがこのアッセイにおいてポジティブであると検定された：ＰＲＯ１３１８。 Example 65: Mouse mesengial cell inhibition assay (Assay 114)
This assay was designed to determine whether the PRO polypeptides of the present invention show the ability to inhibit the growth of mouse mesengial cells in culture. PRO polypeptides that have been tested positive in this assay include mesengial, such as cystic kidney dysplasia, polycystic kidney disease, or other kidney diseases associated with abnormal proliferation of mesengial cells, kidney tumors, etc. It is anticipated that inhibiting cell growth will be useful in the treatment of diseases or conditions where it is beneficial.
On day 1, mouse mesengial cells were plated on a 96-well plate in growth medium (Dulbecco's modified Eagle medium and heme F12 medium, 95%; fetal calf serum, 5%; 14 mM HEPES in a 3: 1 mixture). Raise in the evening. On day 2, the PRO polypeptide is diluted to two concentrations in serum-free medium (1% and 0.1%) and added to the cells. The negative control is growth medium without the addition of PRO polypeptide. After incubating the cells for 48 hours, 20 μl of Cell Titer 96 Aqueous 1-solution reagent (Progema) is added to each well and the color reaction is allowed to proceed for 2 hours. The absorbance (OD) is then measured at 490 nm. A positive in the assay is one that gives an absorbance reading that exceeds at least 10% of the negative control.
The following PRO polypeptide was tested positive in this assay: PRO1318.

実施例６６：膵臓β-細胞前駆体増殖の誘発(アッセイ１１７)
このアッセイは本発明のあるポリペプチドが多数の膵臓β-細胞前駆細胞の増加を誘発する働きをし、したがって、真正糖尿病を含む哺乳動物における様々なインシュリン不全段階の治療に利用できることを示す。アッセイは次のように実施される。アッセイはマウス胎児膵臓細胞の初代培養を使用し、初期測定はβ-細胞前駆体又は成熟したβ-細胞のどちらかに相当するマーカーの発現の変化である。マーカー発現はリアルタイム定量的ＰＣＲ(ＲＴＱ−ＰＣＲ)で測定され；ここで評価されるマーカーはＰｄｘ１と呼ばれる転写因子である。
膵臓はＥ１４胚(ＣＤ１マウス)から取り出される。ついで膵臓は３７℃で４０から６０分、Ｆ１２/ＤＭＥＭ中でコラゲナーゼ/ディスパーゼで消化される(コラゲナーゼ/ディスパーゼ、1.37mg/ml、Boehringer Mannheim、＃1097113)。ついで消化は同容量の５％ＢＳＡで中和され、細胞は一度ＲＰＭＩ１６４０で洗浄される。１日目、細胞は１２ウェル組織培養プレートに蒔かれる(PBSで20μ/mlのラミニンで前もってコートされる、Boehringer Mannheim、＃124317)。１-２胚の膵臓由来の細胞が１ウェル当たり分配される。この初代培養の培地は１４Ｆ／１６４０である。２日目、培地が取り除かれ、付着した細胞はＲＰＭＩ／１６４０で洗浄される。試験されるタンパク質に加えて、２ｍｌの最小培地が加えられる。４日目、培地は取り除かれ、細胞からＲＮＡが調製され、リアルタイム定量的ＲＴ−ＰＣＲによってマーカー発現が分析される。未処理のコントロールに比べ、関連したβ-細胞マーカーの発現を増加させている場合には、タンパク質はアッセイにおいて活性であると考えられる。
１４Ｆ／１６４０はＲＰＭＩ１６４０(Gibco)に次のものを加えたものである：
グループＡ 1：1000
グループＢ 1：1000
組み換えヒトインシュリン 10μg／ml
アプロチニン(50μg／ml)1：2000(Boehringer manhein #981532)
ウシ下垂体エキス(ＢＰＥ)60μg／ml
ゲンタマイシン 100ng／ml
グループＡ：(10mlＰＢＳ中)
トランスフェリン、100mg(シグマT2252)
上皮成長因子、100μg(BRL100004)
トリヨードチロニン、5x10−6Mの10μl(シグマT5516)
エタノールアミン、10−１Ｍの100μl(シグマE0135)
ホスホエタノールアミン、10−１Ｍの100μl(シグマP0503)
セレニウム、10−1Ｍの4μl(Aesar#12574)
グループＣ：(10mlの100%エタノール中)
ヒドロコルチゾン、5x10−３Mの2μl(シグマ#H0135)
プロゲステロン、1x10−３Mの100μl(シグマ#P6149)
フォルスコリン、20mMの500μl(Calbiochem#344270)
最小培地：
ＲＰＭＩ１６４０にトランスフェリン(10μ/ml)、インシュリン(1μg/ml)、ゲンタマイシン(100ng/ml)、アプロチニン(50μg/ml)及びＢＰＥ(15μg/ml)を加える。
定まった培地：
ＲＰＭＩ１６４０にトランスフェリン(10μ/ml)、インシュリン(1μg/ml)、ゲンタマイシン(100ng/ml)及びアプロチニン(50μg/ml)を加える。
次のポリペプチドはこのアッセイにおいてポジティブであると検定された：ＰＲＯ１８３、ＰＲＯ１８５、ＰＲＯ２８８。 Example 66: Induction of pancreatic β-cell precursor proliferation (Assay 117)
This assay shows that certain polypeptides of the invention serve to induce an increase in a large number of pancreatic β-cell progenitors and can therefore be used to treat various stages of insulin deficiency in mammals including diabetes mellitus. The assay is performed as follows. The assay uses primary cultures of mouse fetal pancreatic cells and the initial measurement is a change in the expression of markers corresponding to either β-cell precursors or mature β-cells. Marker expression is measured by real-time quantitative PCR (RTQ-PCR); the marker evaluated here is a transcription factor called Pdx1.
The pancreas is removed from the E14 embryo (CD1 mouse). The pancreas is then digested with collagenase / dispase in F12 / DMEM at 37 ° C. for 40-60 minutes (collagenase / dispase, 1.37 mg / ml, Boehringer Mannheim, # 1097113). The digestion is then neutralized with the same volume of 5% BSA and the cells are washed once with RPMI 1640. On day 1, cells are plated in 12-well tissue culture plates (pre-coated with 20 μ / ml laminin in PBS, Boehringer Mannheim, # 124317). Cells from the pancreas of 1-2 embryos are distributed per well. The medium for this primary culture is 14F / 1640. On day 2, the medium is removed and the attached cells are washed with RPMI / 1640. In addition to the protein to be tested, 2 ml of minimal medium is added. On day 4, the medium is removed, RNA is prepared from the cells, and marker expression is analyzed by real-time quantitative RT-PCR. A protein is considered active in an assay if it increases the expression of the associated β-cell marker relative to an untreated control.
14F / 1640 is RPMI 1640 (Gibco) plus the following:
Group A 1: 1000
Group B 1: 1000
Recombinant human insulin 10μg / ml
Aprotinin (50μg / ml) 1: 2000 (Boehringer manhein # 981532)
Bovine pituitary extract (BPE) 60μg / ml
Gentamicin 100ng / ml
Group A: (in 10ml PBS)
Transferrin, 100 mg (Sigma T2252)
Epidermal growth factor, 100 μg (BRL100004)
10 μl of triiodothyronine, 5x10-6M (Sigma T5516)
100 μl of ethanolamine, 10-1M (Sigma E0135)
100 μl of phosphoethanolamine, 10-1M (Sigma P0503)
Selenium, 10-1M 4μl (Aesar # 12574)
Group C: (in 10 ml 100% ethanol)
Hydrocortisone, 5x10-3M 2 μl (Sigma # H0135)
Progesterone, 1x10-3M 100 μl (Sigma # P6149)
Forskolin, 20 mM 500 μl (Calbiochem # 344270)
Minimum medium:
Transferrin (10 μ / ml), insulin (1 μg / ml), gentamicin (100 ng / ml), aprotinin (50 μg / ml) and BPE (15 μg / ml) are added to RPMI 1640.
Fixed medium:
Transferin (10 μ / ml), insulin (1 μg / ml), gentamicin (100 ng / ml) and aprotinin (50 μg / ml) are added to RPMI 1640.
The following polypeptides were tested positive in this assay: PRO183, PRO185, PRO288.

実施例６７：インビトロ抗腫瘍アッセイ(アッセイ１６１)
種々のＰＲＯポリペプチドの抗増殖活性を、本質的にSkehan等, J. Natl. Cancer Inst. 82: 1107-1112 (1990)に記載されたスルホローダミンＢ(ＳＲＢ)染料結合アッセイを用いる国立癌研究所(ＮＣＩ)の実験的、疾患指向的インビトロ抗癌薬発見アッセイにおいて測定した。このアッセイで用いた６０の腫瘍細胞系(「ＮＣＩパネル」)、並びにそれらの維持およびインビトロ培養の条件は、Monks等, J. Natl. Cancer Inst. 83: 757-766 (1991)に記載されている。このスクリーニングの目的は、異なる型の腫瘍に対する試験化合物の細胞毒性及び／又は細胞***停止活性を最初に評価することである(Monks等, 上掲; Boyd, Cancer: Princ. Pract. Oncol. Update 3(10): 1-12[1989])。
約６０のヒト腫瘍細胞系からの細胞をトリプシン／ＥＤＴＡ(Gibco)で回収し、１回洗浄し、ＩＭＥＭ中に再懸濁し、それらの生存を測定した。細胞懸濁物をピペット(100μL容量)で別の９６-ウェルマイクロタイタープレートに添加した。６日インキュベーションの細胞密度は２日インキュベーションより小さく過剰成長は防止された。播種後、安定化のために３７℃で２４時間プレインキュベーションした。目的とする試験濃度の２倍希釈をゼロ時に100μlのアリコートにマイクロタイタープレートウェルに添加した(1:2希釈)。試験化合物を２分の５log希釈(1000〜100,000倍)で評価した。インキュベーションは5%ＣＯ２雰囲気および100%湿度で２日および６日実施した。
インキュベーション後、培地を除去し、細胞を10%トリクロロ酢酸の0.1mlで４０℃において固定した。プレートを脱イオン水で５回洗浄し、乾燥させ、1%酢酸に溶解した0.4%スルホローダミンＢ染料(Sigma)の0.1mlで３０分間染色し、1%酢酸で４回洗浄して非結合染料を除去し、乾燥させ、染色物を10mMトリス塩基［トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン］, pH10.5の0.1mlで５分間抽出した。スルホローダミンＢの492nmにおける吸収(ＯＤ)を、コンピュータ接続96-ウェルマイクロタイタープレートリーダーを使用して測定した。
試験試料は、一又は複数の濃度で少なくとも50%の成長阻害を示すときにポジティブと考える。ポジティブな結果を以下の表７に示す。

Figure 2006068006
これらのアッセイの結果には、ＰＲＯポリペプチドが多くの異なる細胞系の新生物成長の阻害に有用であり、治療的に使用できることが示されている。これらのＰＲＯポリペプチドに対する抗体は、この有用なポリペプチドの親和増殖に有用である。これらのＰＲＯポリペプチドをコードする核酸はこれらのポリペプチドの組換え調製に有用である。 Example 67: In vitro anti-tumor assay (Assay 161)
The anti-proliferative activity of various PRO polypeptides has been investigated by a national cancer study using a sulforhodamine B (SRB) dye binding assay essentially as described by Skehan et al., J. Natl. Cancer Inst. 82: 1107-1112 (1990). (NCI) experimental, disease-oriented in vitro anticancer drug discovery assay. The 60 tumor cell lines used in this assay ("NCI panel"), and their maintenance and in vitro culture conditions, are described in Monks et al., J. Natl. Cancer Inst. 83: 757-766 (1991). Yes. The purpose of this screening is to first assess the cytotoxicity and / or mitotic activity of the test compound against different types of tumors (Monks et al., Supra; Boyd, Cancer: Princ. Pract. Oncol. Update 3 (10): 1-12 [1989]).
Cells from approximately 60 human tumor cell lines were harvested with trypsin / EDTA (Gibco), washed once, resuspended in IMEM, and their survival was measured. The cell suspension was pipetted (100 μL volume) into another 96-well microtiter plate. The cell density of the 6 day incubation was smaller than the 2 day incubation and overgrowth was prevented. After seeding, preincubation was performed at 37 ° C. for 24 hours for stabilization. Two-fold dilutions of the desired test concentration were added to microtiter plate wells in a 100 μl aliquot at zero (1: 2 dilution). The test compound was evaluated at 5 log dilution (1000 to 100,000 times). Incubations were performed for 2 and 6 days in a 5% CO2 atmosphere and 100% humidity.
After incubation, the medium was removed and the cells were fixed with 0.1 ml of 10% trichloroacetic acid at 40 ° C. The plate is washed 5 times with deionized water, dried, stained with 0.1 ml of 0.4% sulforhodamine B dye (Sigma) dissolved in 1% acetic acid for 30 minutes, and washed 4 times with 1% acetic acid to unbound dye. The dyeing was extracted with 0.1 ml of 10 mM Tris base [Tris (hydroxymethyl) aminomethane], pH 10.5 for 5 minutes. Absorption (OD) of sulforhodamine B at 492 nm was measured using a computer-connected 96-well microtiter plate reader.
A test sample is considered positive when it exhibits at least 50% growth inhibition at one or more concentrations. The positive results are shown in Table 7 below.
Figure 2006068006
The results of these assays indicate that PRO polypeptides are useful for inhibiting neoplastic growth in many different cell lines and can be used therapeutically. Antibodies against these PRO polypeptides are useful for affinity growth of this useful polypeptide. Nucleic acids encoding these PRO polypeptides are useful for the recombinant preparation of these polypeptides.

実施例６８：腫瘍における遺伝子増幅
この実施例は、あるＰＲＯポリペプチドコード化遺伝子が、ある種のヒト肺、結腸及び／又は乳癌及び／又は細胞系のゲノムで増幅されることを示す。増幅は遺伝子産物の過剰発現を伴い、ポリペプチドが結腸、肺、乳及び他の癌等の或る種の癌において治療的処置、及びこられあの癌の存在性を診断決定するのに有用な標的であることを示している。治療薬は、ＰＲＯポリペプチドのアンタゴニスト、例えばＰＲＯポリペプチドに対するマウス−ヒトキメラ、ヒト化又はヒト抗体を形成し得る。
スクリーニングの出発物質は種々の癌から単離したゲノムＤＮＡである。ＤＮＡは、正確に定量され、例えば蛍光的に定量される。ネガティブ対照として、ＤＮＡを１０の正常な健常個体の細胞からＤＮＡを単離し、それをプールして健常個体における遺伝子コピーのアッセイ対照として使用した(示さず)。５’ヌクレアーゼアッセイ(例えばTaqManＴＭ)及び実時間定量的ＰＣＲ(例えば、ABI Prizm 7700 Sequence Detection System(商品名)(Perkin Elmer, Applied Biosystems Division, Foster City, CA))を、或る種の癌で潜在的に増幅される遺伝子の発見に使用した。結果を、ＰＲＯポリペプチドをコードするＤＮＡがスクリーニングされた一次肺又は大腸癌又は癌細胞系又は乳癌細胞系の何れかで過剰表現されるか否かを決定するために用いた。一次肺癌は、表８に示した型及び段階の腫瘍を持つ個体から得た。表８に列挙した一次腫瘍及びこの実施例を通して参照される一次腫瘍及び細胞系の表示に使用した略語の説明は以下に示す。 Example 68: Gene amplification in tumors This example demonstrates that certain PRO polypeptide-encoding genes are amplified in the genomes of certain human lung, colon and / or breast cancer and / or cell lines. Amplification involves overexpression of the gene product and the polypeptide is useful for therapeutic treatment in certain types of cancer, such as colon, lung, breast and other cancers, and for the diagnostic determination of the presence of these cancers. It shows that it is a target. The therapeutic agent may form an antagonist of the PRO polypeptide, eg, a mouse-human chimera, humanized or human antibody to the PRO polypeptide.
The starting material for the screening is genomic DNA isolated from various cancers. DNA is accurately quantified, eg, fluorescently. As a negative control, DNA was isolated from cells of 10 normal healthy individuals, which were pooled and used as an assay control for gene copy in healthy individuals (not shown). 5 ′ nuclease assays (eg, TaqMan ™ ) and real-time quantitative PCR (eg, ABI Prizm 7700 Sequence Detection System (trade name) (Perkin Elmer, Applied Biosystems Division, Foster City, Calif.)) For certain cancers. Used to find potentially amplified genes. The results were used to determine whether the DNA encoding the PRO polypeptide is overexpressed in either screened primary lung or colon cancer or cancer cell lines or breast cancer cell lines. Primary lung cancer was obtained from individuals with tumors of the type and stage shown in Table 8. A description of the abbreviations used to display the primary tumors listed in Table 8 and the primary tumors and cell lines referenced throughout this example is given below.

TaqManＴＭの結果はデルタ(Δ)Ｃｔ単位で報告した。１単位は１ＰＣＲサイクル又は正常に対して約２倍の増幅に相当し、２単位は４倍、３単位は８倍増幅等々に相当する。定量化はプライマー及びＰＲＯポリペプチド-コード化遺伝子から誘導したTaqManＴＭ蛍光プローブを用いて得た。独特の核酸配列を含む可能性が高く、イントロンをスプライシングしている可能性が少ないと思われるＰＲＯポリペプチド-コード化遺伝子の領域がプライマー及びプローブ誘導に好適であり、例えば３-非翻訳領域である。ＰＲＯポリペプチド遺伝子増幅分析に使用したプライマー及びプローブ(正方向、逆方向及びプローブ)の配列は次の通りである：
ＰＲＯ５３３(ＤＮＡ４９４３５-１２１９)
正方向 ：5'-GGGACGTGCTTCTACAAGAACAG-3' (配列番号：１４０)
逆方向 ：5'-CAGGCTTACAATGTTATGATCAGACA-3' (配列番号：１４１)
プローブ ：5'-TATTCAGAGTTTTCCATTGGCAGTGCCAGTT-3' (配列番号：１４２)
ＰＲＯ１８７(ＤＮＡ２７８６４-１１５５)
正方向 ：5'-GGCCTTGCAGACAACCGT-3' (配列番号：１４３)
逆方向 ：5'-CAGACTGAGGGAGATCCGAGA-3' (配列番号：１４４)
プローブ ：5'-GCAGATTTTGAGGACAGCCACCTCCA-3' (配列番号：１４５)
正方向２ ：5'-CATCAAGCGCCTCTACCA-3' (配列番号：１４６)
逆方向２ ：5'-CACAAACTCGAACTGCTTCTG-3' (配列番号：１４７)
プローブ２：5'-CAGCTGCCCTTCCCCAACCA-3' (配列番号：１４８)
ＰＲＯ２４６(ＤＮＡ３５６３９-１１７２)
正方向 ：5'-GGCAGAGACTTCCAGTCACTGA-3' (配列番号：１４９)
逆方向 ：5'-GCCAAGGGTGGTGTTAGATAGG-3' (配列番号：１５０)
プローブ ：5'-CAGGCCCCCTTGATCTGTACCCCA-3' (配列番号：１５１) TaqMan ™ results were reported in delta (Δ) Ct units. One unit corresponds to about 2 times amplification with respect to one PCR cycle or normal, 2 units corresponds to 4 times, 3 units corresponds to 8 times amplification, and so on. Quantification was obtained using TaqMan ™ fluorescent probes derived from primers and PRO polypeptide-encoded genes. A region of the PRO polypeptide-encoding gene that is likely to contain a unique nucleic acid sequence and is unlikely to be splicing introns is suitable for primer and probe derivation, for example in the 3-untranslated region is there. The sequences of primers and probes (forward, reverse and probe) used for PRO polypeptide gene amplification analysis are as follows:
PRO533 (DNA49435-1219)
Positive direction: 5'-GGGACGTGCTTCTACAAGAACAG-3 '(SEQ ID NO: 140)
Reverse direction: 5'-CAGGCTTACAATGTTATGATCAGACA-3 '(SEQ ID NO: 141)
Probe: 5'-TATTCAGAGTTTTCCATTGGCAGTGCCAGTT-3 '(SEQ ID NO: 142)
PRO187 (DNA27864-1155)
Positive direction: 5′-GGCCTTGCAGACAACCGT-3 ′ (SEQ ID NO: 143)
Reverse direction: 5'-CAGACTGAGGGAGATCCGAGA-3 '(SEQ ID NO: 144)
Probe: 5'-GCAGATTTTGAGGACAGCCACCTCCA-3 '(SEQ ID NO: 145)
Positive direction 2: 5′-CATCAAGCGCCTCTACCA-3 ′ (SEQ ID NO: 146)
Reverse direction 2: 5′-CACAAACTCGAACTGCTTCTG-3 ′ (SEQ ID NO: 147)
Probe 2: 5′-CAGCTGCCCTTCCCCAACCA-3 ′ (SEQ ID NO: 148)
PRO246 (DNA35639-1172)
Positive direction: 5′-GGCAGAGACTTCCAGTCACTGA-3 ′ (SEQ ID NO: 149)
Reverse direction: 5'-GCCAAGGGTGGTGTTAGATAGG-3 '(SEQ ID NO: 150)
Probe: 5′-CAGGCCCCCTTGATCTGTACCCCA-3 ′ (SEQ ID NO: 151)

５’ヌクレアーゼアッセイ反応は蛍光ＰＣＲベースの技術であり、実時間での増幅監視のためのＴａｑＤＮＡポリメラーゼ酵素の５’エキソヌクレアーゼ活性を使用する。ＰＣＲ反応に典型的なアプリコンの生成に２つのオリゴヌクレオチドプライマーを使用する(正方向[.f]及び逆方向[.r])。第３のオリゴヌクレオチド、又はプローブ(.p)は、２つのＰＣＲプライマーの間に位置するヌクレオチド配列を検出するために設計された。プローブはＴａｑＤＮＡポリメラーゼ酵素により非伸展性であり、レポーター蛍光染料及びクエンチャー蛍光染料で標識される。２つの染料がプローブ上に接近して位置する場合、レポーター染料からのレーザー誘導発光は消光染料によって消光される。増幅反応の間、プローブはＴＡＱ ＤＮＡポリメラーゼ酵素によりテンプレートに依存する形で切断される。得られたプローブ断片は溶液中に解離し、放出されたレポーター染料からのシグナルは第２のフルオロホアからの消光効果を受けない。レポーター染料の一分子は、新たに合成された各分子に対して遊離せしめられ、非消光レポーター染料の検出がデータの定量的解釈の基礎を提供する。
５’ヌクレアーゼ法は、ABI Prism 7700TM配列検出などの実時間定量的ＰＣＲ装置で実施される。系は温度サイクル器、レーザー、電荷結合素子(ＣＣＤ)カメラ及びコンピュータからなる。系は温度サイクル器上で96-ウェルでの試料を増幅させる。増幅中に、レーザー誘導蛍光シグナルは、実時間で、光ファイバーケーブルで９６ウェルに集められ、ＣＣＤで検出される。系は装置の実行及びデータの分析のためのソフトウェアを含む。
５’ヌクレアーゼアッセイデータは、最初はＣｔ又は境界サイクルで表される。これは、レポーターシグナルが蛍光のバックグラウンドを越えて蓄積されるサイクルとして定義される。正常なヒトＤＮＡの結果を癌ＤＮＡの結果と比較する場合に、△Ｃｔ値を核酸試料における特定の標的配列の出発コピー相対数の定量的尺度として使用した。
表８は、本発明のＰＲＯポリペプチド化合物のスクリーニングに用いた種々の一次腫瘍の段階、Ｔ段階及びＮ段階を記載する。

Figure 2006068006
The 5 ′ nuclease assay reaction is a fluorescent PCR-based technique that uses the 5 ′ exonuclease activity of the Taq DNA polymerase enzyme for real-time amplification monitoring. Two oligonucleotide primers are used (forward [.f] and reverse [.r]) to generate apricons typical of PCR reactions. A third oligonucleotide, or probe (.p), was designed to detect the nucleotide sequence located between the two PCR primers. The probe is non-extensible by Taq DNA polymerase enzyme and is labeled with a reporter fluorescent dye and a quencher fluorescent dye. When the two dyes are located close together on the probe, the laser-induced emission from the reporter dye is quenched by the quenching dye. During the amplification reaction, the probe is cleaved in a template-dependent manner by the TAQ DNA polymerase enzyme. The resulting probe fragment dissociates into solution and the signal from the released reporter dye is not subject to the quenching effect from the second fluorophore. One molecule of reporter dye is liberated for each newly synthesized molecule, and detection of non-quenched reporter dye provides the basis for quantitative interpretation of the data.
The 5 ′ nuclease method is performed on a real-time quantitative PCR instrument such as ABI Prism 7700 ™ sequence detection. The system consists of a temperature cycler, laser, charge coupled device (CCD) camera and computer. The system amplifies the sample in 96-well on a temperature cycler. During amplification, the laser-induced fluorescence signal is collected in 96 wells with a fiber optic cable in real time and detected with a CCD. The system includes software for device execution and data analysis.
5 ′ nuclease assay data is initially expressed in Ct or boundary cycles. This is defined as the cycle in which the reporter signal accumulates beyond the fluorescent background. When comparing normal human DNA results with cancer DNA results, the ΔCt value was used as a quantitative measure of the relative number of starting copies of a particular target sequence in a nucleic acid sample.
Table 8 lists the various primary tumor stages, T stage and N stage used in the screening of the PRO polypeptide compounds of the present invention.
Figure 2006068006

ＤＮＡ調製：
ＤＮＡは培養した細胞系、一次腫瘍、正常ヒト血液から調製した。単離は、全てQuiagenからの、精製キット、バッファーセット及びプロテアーゼを用い、製造者の指示と下記に従って実施した。
細胞培養溶解：
細胞を洗浄し、チップ当たり7.5x10８の濃度でトリプシン化し、４℃で５分間1000rpmで遠心分離してペレット化し、次いで1/2容量のＰＢＳ再遠心で洗浄した。ペレットを３回洗浄し、懸濁細胞を回収して2xＰＢＳで洗浄した。次いで細胞を10mLのＰＢＳに懸濁させた。バッファーＣ１を４℃で平衡化させた。Quiagenプロテアーゼ#19155を6.25mlの冷ｄｄＨ２Ｏで最終濃度20mg/mlまで希釈して４℃で平衡化させた。10mLのＧ２バッファーを、QuiagenＲＮＡｓｅＡストック(100mg/ml)を200μg/mlの最終濃度まで希釈して調製した。
バッファーＣ１(10mL、４℃)及びｄｄＨ２Ｏ(40mL、４℃)を、次いで10mlの細胞懸濁物に添加し、反転させて混合し、氷上で１０分間インキュベートした。細胞核をBeckmanスイングバケットロータで４℃において2500rpmで１５分間遠心分離することによりペレット化した。上清を捨て、核をボルテックスしながら2mlのバッファーＣ１(４℃)及び6mlのｄｄＨ２Ｏに懸濁し、４℃において2500rpmで１５分間２回目の遠心分離をした。次いで核を残りのバッファー中にチップ当たり200μlを用いて再懸濁した。Ｇ２バッファー(10ml)を懸濁した核に添加しながら緩いボルテックスを適用した。バッファー添加が完了したら、強いボルテックスを３０秒間適用した。Quiagenプロテアーゼ(200μl、上記のように調製)を添加し、５０℃で６０分間インキュベートした。インキュベーション及び遠心分離を、溶解物が透明になるまで繰り返した(例えば、さらに30-60分間インキュベートし、４℃で１０分間3000xgでペレット化する)。 DNA preparation:
DNA was prepared from cultured cell lines, primary tumors, and normal human blood. Isolation was performed using purification kits, buffer sets and proteases, all from Quiagen, according to manufacturer's instructions and below.
Cell culture lysis:
Cells were washed, trypsinized at a concentration of 7.5 × 10 8 per chip, pelleted by centrifugation at 1000 rpm for 5 minutes at 4 ° C., then washed with 1/2 volume PBS re-centrifuge. The pellet was washed 3 times and the suspended cells were collected and washed with 2 × PBS. The cells were then suspended in 10 mL PBS. Buffer C1 was equilibrated at 4 ° C. Quiagen protease # 19155 was diluted with 6.25 ml of cold ddH2O to a final concentration of 20 mg / ml and equilibrated at 4 ° C. 10 mL of G2 buffer was prepared by diluting Quiagen RNAse A stock (100 mg / ml) to a final concentration of 200 μg / ml.
Buffer C1 (10 mL, 4 ° C.) and ddH 2 O (40 mL, 4 ° C.) were then added to 10 ml of cell suspension, mixed by inversion, and incubated on ice for 10 minutes. Cell nuclei were pelleted by centrifuging at 2500 rpm for 15 minutes at 4 ° C. in a Beckman swing bucket rotor. The supernatant was discarded, and the nuclei were vortexed and suspended in 2 ml of buffer C1 (4 ° C.) and 6 ml of ddH 2 O, followed by a second centrifugation at 2500 rpm for 15 minutes at 4 ° C. The nuclei were then resuspended in the remaining buffer using 200 μl per chip. Loose vortex was applied while adding G2 buffer (10 ml) to the suspended nuclei. When buffer addition was complete, a strong vortex was applied for 30 seconds. Quiagen protease (200 μl, prepared as above) was added and incubated at 50 ° C. for 60 minutes. Incubation and centrifugation were repeated until the lysate was clear (eg, incubated for an additional 30-60 minutes and pelleted at 3000 × g for 10 minutes at 4 ° C.).

固体ヒト腫瘍試料の調製及び溶解：
腫瘍試料を秤量し50mlのコニカル管に配して氷上に保持した。加工は調製当たり250mgの組織未満に制限した(１チップ／調製)。プロテアーゼ溶液を6.25mlの冷ｄｄＨ２Ｏ中に最終濃度20mg/mlまで希釈することにより新たに調製して４℃で貯蔵した。ＤＮＡｓｅＡを最終濃度200mg/mlまで希釈することによりＧ２バッファー(20ml)を調製した(100mg/mlのストックから)。エアロゾルの吸入を避けるために層流ＴＣフード内でポリトロンの大きなチップを用いて、腫瘍組織を19mlのＧ２バッファー中で６０秒間均一化し、室温に保持した。試料間で、各々2LのｄｄＨ２Ｏで２ｘ３０秒間、次いでＧ２バッファー(50ml)でスピンさせることによりポリトロンを清浄化した。組織がジェネレータチップ上に存在する場合は、装置を分解して清浄化した。
Quiagenプロテアーゼ(上記のように調製、1.0ml)を添加し、次いでボルテックスして５０℃で３時間インキュベートした。インキュベーション及び遠心分離を、溶解物が透明になるまで繰り返した(例えば、さらに30-60分間インキュベートし、４℃で１０分間3000xgでペレット化する)。
ヒト血液調製及び溶解：
健常なボランティアから標準的な感染剤プロトコールを用いて血液を採りだし、チップ当たり10mlの試料にクエン酸化した。Quiagenプロテアーゼを6.25mlの冷ｄｄＨ２Ｏ中に最終濃度20mg/mlまで希釈することにより新たに調製して４℃で貯蔵した。ＤＮＡｓｅＡを100mg/mlのストックから最終濃度200μg/mlまで希釈することによりＧ２バッファーを調製した。血液(10ml)を50mlのコニカル管に配し、10mlのＣ１バッファー及び30mlのｄｄＨ２Ｏ(ともに予め４℃で平衡化したもの)を添加し、反転させて成分を混合して氷上に１０分間保持した。Beckmanスイングバケットローターで、４℃において2500rpmで１５分間核をペレット化し、上清を捨てた。ボルテックスしながら、核を2mlのＣ１バッファー(４℃)及び6mlのｄｄＨ２Ｏ(４℃)中に懸濁させた。ボルテックスはペレットが白くなるまで繰り返した。次いで核を残りのバッファー中に200μlチップを用いて懸濁させた。Ｇ２バッファー(10ml)を懸濁核に添加しながら緩くボルテックスし、次いで３０秒間強くボルテックスした。Quiagenプロテアーゼを添加(200μl)し、５０℃で６０分間インキュベートした。インキュベーション及び遠心分離を、溶解物が透明になるまで繰り返した(例えば、さらに30-60分間インキュベートし、４℃で１０分間3000xgでペレット化する)。 Preparation and lysis of solid human tumor samples:
Tumor samples were weighed and placed in a 50 ml conical tube and kept on ice. Processing was limited to less than 250 mg tissue per preparation (1 chip / preparation). The protease solution was freshly prepared by diluting in 6.25 ml cold ddH2O to a final concentration of 20 mg / ml and stored at 4 ° C. G2 buffer (20 ml) was prepared by diluting DNAseA to a final concentration of 200 mg / ml (from a 100 mg / ml stock). Tumor tissues were homogenized in 19 ml G2 buffer for 60 seconds and kept at room temperature using a large polytron tip in a laminar flow TC hood to avoid aerosol inhalation. The polytron was cleaned between samples by spinning with 2 L of ddH 2 O for 2 × 30 seconds and then with G2 buffer (50 ml). If tissue was present on the generator chip, the device was disassembled and cleaned.
Quiagen protease (prepared as above, 1.0 ml) was added, then vortexed and incubated at 50 ° C. for 3 hours. Incubation and centrifugation were repeated until the lysate was clear (eg, incubated for an additional 30-60 minutes and pelleted at 3000 × g for 10 minutes at 4 ° C.).
Human blood preparation and lysis:
Blood was drawn from healthy volunteers using a standard infectious agent protocol and citrated to a 10 ml sample per chip. Quiagen protease was freshly prepared by dilution in 6.25 ml of cold ddH2O to a final concentration of 20 mg / ml and stored at 4 ° C. G2 buffer was prepared by diluting DNAseA from a 100 mg / ml stock to a final concentration of 200 μg / ml. Blood (10 ml) was placed in a 50 ml conical tube, 10 ml C1 buffer and 30 ml ddH2O (both previously equilibrated at 4 ° C.) were added, inverted and mixed and kept on ice for 10 minutes. . The nuclei were pelleted with a Beckman swinging bucket rotor at 2500 rpm at 4 ° C. for 15 minutes and the supernatant discarded. While vortexing, the nuclei were suspended in 2 ml C1 buffer (4 ° C.) and 6 ml ddH 2 O (4 ° C.). Vortexing was repeated until the pellet was white. The nuclei were then suspended in the remaining buffer using a 200 μl tip. Vortex gently with addition of G2 buffer (10 ml) to the suspension nuclei, then vortex vigorously for 30 seconds. Quiagen protease was added (200 μl) and incubated at 50 ° C. for 60 minutes. Incubation and centrifugation were repeated until the lysate was clear (eg, incubated for an additional 30-60 minutes and pelleted at 3000 × g for 10 minutes at 4 ° C.).

透明化溶解物の精製：
(１)ゲノムＤＮＡの単離：
ゲノムＤＮＡを10mlのＱＢＴバッファーで平衡化した(マキシチップ調製当たり１試料)。ＱＦ溶離バッファーを５０℃で平衡化した。試料を３０秒間ボルテックスし、次いで平衡化チップに負荷して重力により排液した。チップを2x15mlのＱＣバッファーで洗浄した。ＤＮＡを、30mlのシラン化し、オートクレーブした30mlCortex管に15mlのＱＦバッファー(５０℃)で溶離した。イソプロパノール(10.5ml)を各試料に添加し、管をパラフィンで被覆し、ＤＮＡが沈殿するまで繰り返し反転させて混合した。試料を、SS-34ロータで４℃において15,000rpmで１０分間遠心分離してペレット化した。ペレット位置をマークして上清を捨て、10mlの70%エタノール(４℃)を添加した。試料を、SS-34ロータで４℃において10,000rpmで１０分間遠心分離して再度ペレット化した。ペレット位置をマークして上清を捨てた。次いで管を乾燥棚に横にして置き、３７℃で１０分間乾燥させたが、試料の過剰乾燥には注意した。
乾燥後、ペレットを1.0mlのＴＥ(pH8.5)に溶解し、５０℃に１−２時間置いた。試料を４℃に終夜保持して溶解を続けた。次いでＤＮＡ溶液を、ツベルクリンシリンジ上に２６ゲージの針を具備する1.5ml管に移した。ＤＮＡを剪断するために移行を５ｘ繰り返した。次いで試料を５０℃に１−２時間置いた。 Purification of clarified lysate:
(1) Isolation of genomic DNA:
Genomic DNA was equilibrated with 10 ml QBT buffer (1 sample per maxi chip preparation). QF elution buffer was equilibrated at 50 ° C. The sample was vortexed for 30 seconds, then loaded onto the equilibration tip and drained by gravity. The chip was washed with 2x15 ml QC buffer. The DNA was eluted with 15 ml QF buffer (50 ° C.) into 30 ml silanized and autoclaved 30 ml Cortex tubes. Isopropanol (10.5 ml) was added to each sample and the tube was covered with paraffin and mixed by inverting repeatedly until the DNA precipitated. Samples were pelleted by centrifugation for 10 minutes at 15,000 rpm at 4 ° C. in an SS-34 rotor. The pellet position was marked, the supernatant was discarded, and 10 ml of 70% ethanol (4 ° C.) was added. The sample was pelleted again by centrifugation at 10,000 rpm for 10 minutes at 4 ° C. in an SS-34 rotor. The pellet position was marked and the supernatant was discarded. The tube was then placed on a drying shelf and allowed to dry for 10 minutes at 37 ° C., but care was taken to avoid over drying the sample.
After drying, the pellet was dissolved in 1.0 ml TE (pH 8.5) and placed at 50 ° C. for 1-2 hours. The sample was kept at 4 ° C. overnight to continue dissolution. The DNA solution was then transferred to a 1.5 ml tube equipped with a 26 gauge needle on a tuberculin syringe. The transition was repeated 5x to shear the DNA. The sample was then placed at 50 ° C. for 1-2 hours.

(２)ゲノムＤＮＡの定量及び遺伝子増幅アッセイのための調製：
各管のＤＮＡレベルを1:20希釈(5μlＤＮＡ＋95μlｄｄＨ２Ｏ)での標準的なＡ２６０、Ａ２８０スペクトルにより、Beckman DU640分光光度計の0.1ml石英キュベットを用いて定量した。Ａ２６０／Ａ２８０比率は１．８−１．９の範囲であった。次いで各ＤＮＡ試料をＴＥ(pH8.5)中に約200ng/mlまで希釈した。最初の材料が高濃度(約700ng/μl)である場合、材料を５０℃に再懸濁するまで数時間置いた。
次いで、希釈した材料(20-600ng/ml)に対して、製造者の指示を以下のように改変して蛍光ＤＮＡ定量を実施した。これは、Hoeffer DyNA Quant 200蛍光計を約１５分間暖めて実施した。Hoechst染料作業溶液(#H33258、10μl、使用の１２時間以内に調製)を100mlの1xＴＮＥバッファーに希釈した。2mlキュベットを蛍光計溶液で満たし、機械に配し、機械をゼロ調節した。ｐＧＥＭ３Ｚｆ(＋)(２μl、ロット#360851026)を2mlの蛍光計溶液に添加して200単位で校正した。次いで、さらに２μlのｐＧＥＭ３Ｚｆ(＋)ＤＮＡを試験し、400+/-10単位で読みを確認した。次いで各試料を少なくとも３回読んだ。３試料が互いに10%以内であることが見られたとき、それらの平均をとり、この値を定量化値として用いた。
次いで、蛍光測定で決定した濃度を、各試料をｄｄＨ２Ｏ中に10ng/μlまで希釈するのに用いた。これは、１回のTaqManプレートアッセイについて全てのテンプレート試料について同時に行い、500-1000アッセイを実施するのに十分な材料で行った。試料は、TaqmanＴＭプライマー及びプローブで、Ｂ-アクチン及びＧＡＰＤＨともに、正常なヒトＤＮＡとテンプレート対照を持たない単一のプレート上で３回試験した。試験ＤＮＡから減算した正常ヒトＤＮＡのＣＴ値が＋/−１Ｃｔであったときに希釈試料を用いた。希釈した、ロット定性化したゲノムＤＮＡを、1.0mlアリコートで−８０℃において保存した。続いて遺伝子増幅アッセイに使用するアリコートは、４℃で保存した。各1mlのアリコートが、８−９プレート又は６４の試験に十分である。
遺伝子増幅アッセイ：
本発明のＰＲＯポリペプチド化合物を以下の一次腫瘍でスクリーニングし、０．１以上の得られたΔＣｔ値を以下の表９に報告する。 (2) Preparation for genomic DNA quantification and gene amplification assay:
The DNA level in each tube was quantified using a standard A260, A280 spectrum at a 1:20 dilution (5 μl DNA + 95 μl ddH 2 O) using a 0.1 ml quartz cuvette in a Beckman DU640 spectrophotometer. The A260 / A280 ratio was in the range of 1.8-1.9. Each DNA sample was then diluted to about 200 ng / ml in TE (pH 8.5). If the initial material was at a high concentration (about 700 ng / μl), the material was allowed to stand for several hours until resuspended at 50 ° C.
The diluted material (20-600 ng / ml) was then subjected to fluorescent DNA quantification with the manufacturer's instructions modified as follows. This was done by warming the Hoeffer DyNA Quant 200 fluorometer for about 15 minutes. Hoechst dye working solution (# H33258, 10 μl, prepared within 12 hours of use) was diluted in 100 ml 1 × TNE buffer. A 2 ml cuvette was filled with the fluorometer solution and placed on the machine, and the machine was zeroed. pGEM3Zf (+) (2 μl, lot # 360851026) was added to a 2 ml fluorometer solution and calibrated to 200 units. An additional 2 μl of pGEM3Zf (+) DNA was then tested and the reading was confirmed at 400 +/− 10 units. Each sample was then read at least three times. When 3 samples were found to be within 10% of each other, they were averaged and this value was used as the quantification value.
The concentration determined by fluorescence measurement was then used to dilute each sample in ddH2O to 10 ng / μl. This was done on all template samples simultaneously for a single TaqMan plate assay and with enough material to perform a 500-1000 assay. Samples were tested in triplicate on a single plate with Taqman ™ primers and probes, both B-actin and GAPDH, without normal human DNA and template controls. Diluted samples were used when the CT value of normal human DNA subtracted from the test DNA was +/- 1 Ct. Diluted, lot-qualified genomic DNA was stored at −80 ° C. in 1.0 ml aliquots. Subsequent aliquots used for gene amplification assays were stored at 4 ° C. Each 1 ml aliquot is sufficient for 8-9 plates or 64 tests.
Gene amplification assay:
The PRO polypeptide compounds of the invention are screened in the following primary tumors and the resulting ΔCt values of 0.1 or greater are reported in Table 9 below.

Figure 2006068006
Figure 2006068006
上述した種々のＤＮＡの増幅は種々のヒト組織から誘導された種々の癌腫瘍及び腫瘍細胞系で起こるので、これらの分子は腫瘍形成及び／又は成長において有意な役割を果たすと思われる。結果として、これらの分子の増幅及び／又は向上した発現により、個々の腫瘍の存在を検出するための診断を行うことが可能で、上述したＤＮＡ分子にコードされるタンパク質に対して指向するアンタゴニスト(例えば抗体)は、癌治療における有用性を持つと予測される。
Figure 2006068006
Figure 2006068006
Since the various DNA amplifications described above occur in various cancer tumors and tumor cell lines derived from various human tissues, these molecules appear to play a significant role in tumorigenesis and / or growth. As a result, amplification and / or improved expression of these molecules can be used to make diagnostics to detect the presence of individual tumors, and antagonists directed against the proteins encoded by the DNA molecules described above ( For example, antibodies) are expected to have utility in cancer therapy.

実施例６９：ウシ周皮細胞における遺伝子発現(アッセイ１０５)
このアッセイは、上述したアッセイ９６におけるヒットによって誘発された周皮細胞の遺伝子発現パターンを特定するために設計された。ウシ周皮細胞を１週間、成長培地において６０mm培養皿に蒔いた。１日目、種々のポリペプチドを希釈し(1%)、１、４及び２４時間の間、周皮細胞と共にインキュベートした。細胞を収集し、含まれていた使用説明書に従い、ＴＲＩ-試薬を使用してＲＮＡを単離した。次に、ＲＮＡを、分光光度計を使用し、２６０／２８０ＯＤを読みとることにより定量した。Perkin Elmer試薬と、特に設計されたウシプローブ及びプライマーを使用し、TaqMan反応により遺伝子発現分析を行った。次の遺伝子の発現を分析した：ＧＡＰＤＨ、ベータ-インテグリン、結合組織成長因子-ベータ(CTGF)、ＩＣＡＭ-１、単球化学誘引物質タンパク-１(ＭＣＰ-１)、オステオポンチン、トランスフォーミング成長因子-ベータ(ＴＧＦ-ベータ)、ＴＧＦ-ベータレセプター、メタロプロテイナーゼの組織インヒビター(ＴＩＭＰ)、組織因子(ＴＦ)、ＶＥＧＦ-α、トロンボスポンジン、ＶＥＧＦ-β、アンギオポエイチン-２、及びコラゲナーゼ。複製を平均し、ＳＤを決定した。次に遺伝子発現レベルをＧＡＰＤＨに標準化した。ついで、これらを、未処理の対照と比較したときにウシ周皮細胞に遺伝子発現を有意には誘発しないタンパク質(ＰＩＮ３２)で得られた発現レベルに標準化した。ＰＩＮ３２対照よりも２倍以上の遺伝子発現を生じさせた全てのＰＲＯポリペプチドがポジティブであるとみなされる。
次のＰＲＯポリペプチドがこのアッセイにおいてポジティブであると検定された：ＰＲＯ２１７。 Example 69: Gene expression in bovine pericytes (Assay 105)
This assay was designed to identify pericyte gene expression patterns induced by hits in assay 96 described above. Bovine pericytes were seeded in 60 mm culture dishes in growth medium for 1 week. On day 1, various polypeptides were diluted (1%) and incubated with pericytes for 1, 4 and 24 hours. Cells were harvested and RNA was isolated using TRI-reagent according to the included instructions. RNA was then quantified by reading 260/280 OD using a spectrophotometer. Gene expression analysis was performed by TaqMan reaction using Perkin Elmer reagent and specially designed bovine probes and primers. Expression of the following genes was analyzed: GAPDH, beta-integrin, connective tissue growth factor-beta (CTGF), ICAM-1, monocyte chemoattractant protein-1 (MCP-1), osteopontin, transforming growth factor- Beta (TGF-beta), TGF-beta receptor, tissue inhibitor of metalloproteinase (TIMP), tissue factor (TF), VEGF-α, thrombospondin, VEGF-β, angiopoietin-2, and collagenase. Replications were averaged and SD was determined. The gene expression level was then normalized to GAPDH. They were then normalized to expression levels obtained with a protein (PIN32) that did not significantly induce gene expression in bovine pericytes when compared to untreated controls. All PRO polypeptides that produced more than 2-fold gene expression over the PIN32 control are considered positive.
The following PRO polypeptide was tested positive in this assay: PRO217.

実施例７０：サイトカイン放出アッセイ(アッセイ１２０)
このアッセイは、本発明のＰＲＯポリペプチドが末梢血液単核細胞(ＰＢＭＣｓ)からサイトカインの放出を誘発することができるか否かを決定するために設計された。ＰＢＭＣｓからサイトカインの放出を誘発可能なＰＲＯポリペプチドは、サイトカインの放出を高めることが有益な病状の治療に有用であり、当業者により容易に明らかになるであろう。特に、1x10６細胞／mlの末梢血液単核細胞(ＰＢＭＣ)を1%のＰＲＯポリペプチドと共に、完全ＲＰＭＩ培地で３日間培養した。次に上清を回収し、ヒトＩｇＧ処理対照と比較し、ＥＬＩＳＡにより種々のサイトカインの濃度の増加度合いを検定した。アッセイにおいてポジティブとは、ヒトＩｇＧ処理対照と比較して、ＰＲＯポリペプチド処理試料のサイトカイン濃度が１０倍以上増加したものである。
次のポリペプチドがこのアッセイにおいてポジティブであると検定された：ＰＲＯ９９４０。 Example 70: Cytokine release assay (Assay 120)
This assay was designed to determine whether the PRO polypeptides of the present invention can induce the release of cytokines from peripheral blood mononuclear cells (PBMCs). PRO polypeptides capable of inducing cytokine release from PBMCs are useful in the treatment of conditions where it is beneficial to enhance cytokine release and will be readily apparent to those skilled in the art. In particular, 1 × 10 6 cells / ml peripheral blood mononuclear cells (PBMC) were cultured with complete RPMI medium for 3 days with 1% PRO polypeptide. The supernatant was then collected and compared to human IgG treated controls and assayed for increases in concentration of various cytokines by ELISA. Positive in the assay is an increase in the cytokine concentration of the PRO polypeptide-treated sample by a factor of 10 or more compared to the human IgG-treated control.
The following polypeptide was tested positive in this assay: PRO9940.

実施例７１：周皮細胞を活性化させるＰＲＯポリペプチドの同定(アッセイ１２５)
このアッセイは、本発明のあるポリペプチドが周皮細胞の増殖を活性化するように作用し、よって周皮細胞関連腫瘍の特定のタイプの診断用マーカーとしてだけでなく、周皮細胞関連腫瘍の治療に有用であることが予想されるアンタゴニストの生成にも有用であることを示すものである。また、周皮細胞増殖の活性化は血管形成の誘発にも相関しており、よって、周皮細胞の増殖を誘発可能なＰＲＯポリペプチドは、例えば創傷治癒等を含む、血管形成の誘発が有益である病状の治療に有用であることが予想される。特に、１日目に、周皮細胞をVEC Technologiesから取得し、５mlの培地以外をフラスコから取り出した。２日目に周皮細胞をトリプシン化し、洗浄し、スピンさせ、ついで９６ウェルプレートに蒔いた。７日目に培地を取り出し、周皮細胞を100μlの特定のＰＲＯポリペプチド又は対照処理体(ポジティブ対照＝ＤＥＭ＋5%＋／−ＰＤＧＦ＠500ng/ml；ネガティブ対照＝ＰＩＮ３２、周皮細胞の増殖において何ら有意な影響がないと決定されたポリペプチド)で処理した。次にＣ-ｆｏｓ及びＧＡＰＤＨ遺伝子発現レベルを測定し、複製を平均し、ＳＤを決定した。ｃ-ｆｏｓ値をＧＡＰＤＨに標準化し、結果をＰＩＮ２に対する増加倍数として表す。ネガティブ対照と比較して少なくとも２倍以上の反応があるならば、アッセイにおいてポジティブとみなされる。
次のポリペプチドがこのアッセイにおいてポジティブであると検定された：ＰＲＯ２１７。 Example 71: Identification of a PRO polypeptide that activates pericytes (Assay 125)
This assay acts to activate certain polypeptides of the present invention to activate pericyte cell proliferation, thus not only as a specific type of diagnostic marker for pericyte-associated tumors, but also for pericyte-associated tumors. It is also useful for the production of antagonists that are expected to be useful for therapy. Also, activation of pericyte cell proliferation correlates with induction of angiogenesis, and thus PRO polypeptides capable of inducing pericyte cell proliferation are beneficial in inducing angiogenesis, including wound healing, for example. It is expected to be useful in the treatment of certain medical conditions. In particular, on the first day, pericytes were obtained from VEC Technologies and all but 5 ml of medium was removed from the flask. On day 2, pericytes were trypsinized, washed, spun and then seeded in 96 well plates. On day 7 the medium was removed and pericytes were added to 100 μl of the specific PRO polypeptide or control treatment (positive control = DEM + 5% + / − PDGF @ 500 ng / ml; negative control = PIN32, whatever in pericyte proliferation The polypeptide was determined to have no significant effect. C-fos and GAPDH gene expression levels were then measured, replicates were averaged, and SD was determined. c-fos values are normalized to GAPDH and results are expressed as fold increase over PIN2. A positive in the assay is considered if there is at least a 2-fold or greater response compared to the negative control.
The following polypeptide was tested positive in this assay: PRO217.

実施例７２：レセプター／リガンド相互作用の同定
このアッセイでは、様々なポリペプチドが、レセプター／リガンド相互作用を同定する目的で、潜在的レセプター又はリガンド分子のパネルに結合する能力について検定される。既知のレセプターに対するリガンド、既知のリガンドに対するレセプター又は新規のレセプター／リガンド対の同定は、例えばレセプター又はリガンドを発現することが知られている細胞に対する（リガンド又はレセプターに結合した）生物活性分子の標的化、それらを含むと思われる組成物で、ここで組成物はリガンド又はレセプターを発現する疑いのある細胞を含むものの中のレセプター又はリガンドの存在を検出するための試薬としてのレセプター又はリガンドの使用、レセプター又はリガンドを発現することが知られている細胞の成長又はその他の生物学的又は免疫学的活性の変調、レセプター又はリガンドを発現する細胞の又は細胞に対する免疫反応の変調、レセプター又はリガンドを発現する細胞の成長、又は生物学的又は免疫学的活性を変調するレセプター又はリガンドに対するアゴニスト、アンタゴニスト及び／又は抗体の調製、及び当業者により直ぐに明らかになるであろう様々な他の適応を含む様々な適応に対して有用である。
このアッセイは次のようにして実施される。レセプターに対するリガンドであると思われる本発明のＰＲＯポリペプチドをヒトＩｇＧのＦｃ領域を含む融合タンパク質(イムノアドヘシン)として発現される。レセプター-リガンド結合は、イムノアドヘシンポリペプチドと候補ＰＲＯポリペプチドレセプターを発現する細胞(例えばＣｏｓ細胞)と相互作用させ、Ｆｃ融合ドメインに対する蛍光試薬で結合イムノアドヘシンを可視化し、顕微鏡で検査することにより検出される。候補レセプターを発現する細胞を、レセプター分子として機能しうるＰＲＯポリペプチドをコードするｃＤＮＡ発現ベクターのライブラリーの所定のサブセットの平行した一過性形質移入により作製する。次に、細胞を、レセプター結合可能性を検定しているＰＲＯポリペプチドイムノアドヘシンの存在下で１時間インキュベートする。次に細胞を洗浄し、パラホルムアルデヒドで固定した。次に、細胞を、ＰＲＯポリペプチドイムノアドヘシンのＦｃ部分に対する蛍光抱合抗体(例えば、ＦＩＴＣ抱合ヤギ抗ヒトＦｃ抗体)と共にインキュベートした。次いで細胞を再度洗浄し、顕微鏡で検査した。ポジティブな相互作用は、特定のＰＲＯポリペプチドレセプター又はレセプタープールをコードするｃＤＮＡで形質移入された細胞の蛍光標識の存在、及び他のｃＤＮＡ又はｃＤＮＡプールで形質移入された同様の調製細胞の同様の蛍光標識の不在により判断される。ｃＤＮＡ発現ベクターの所定のプールが、ＰＲＯポリペプチドイムノアドヘシンとの相互作用がポジティブであると判断されたならば、そのプールを含む個々のｃＤＮＡ種は個々に検定されて(プールは「壊される」)、ＰＲＯポリペプチドイムノアドヘシンとの相互作用が可能なレセプターをコードする特異的なｃＤＮＡが決定される。
このアッセイにおける他の実施態様では、エピトープタグ潜在的リガンドＰＲＯポリペプチド(例えば、ヒスチジン「Ｈｉｓ」タグ)を、ヒトＩｇＧ(イムノアドヘシン)のＦｃドメインとの融合物として発現された潜在的レセプターＰＲＯポリペプチド分子のパネルと相互作用させることができる。エピトープタグＰＲＯポリペプチドとの１時間の共インキュベーションに続いて、候補レセプターをプロテインＡビーズでそれぞれ免疫沈降させ、ビーズを洗浄した。潜在的リガンド相互作用を、エピトープタグに対する抗体を用いた免疫沈降複合体のウエスタンブロット分析により決定した。エピトープタグタンパク質の予想される分子量のバンドが、候補レセプターを用いたウエスタンブロット分析で見出され、潜在的レセプターのパネルの他のメンバーとの間に生じることが見出されなかった場合は、相互作用が生じたと判断される。
これらのアッセイを使用して、次のレセプター／リガンド相互作用をここで同定した：
(１)ＰＲＯ５３３は線維芽成長因子レセプター-４(ＦＧＦＲ-４；Partanenら, EMBO J. 10(6)：1347-1354(1991)を参照)に結合する。
(２)ＰＲＯ３０１はそれ自体に結合し、よって接着分子として機能する。
(３)ＰＲＯ１８７は、高親和性で線維芽成長因子レセプター-３(ＦＧＦＲ-３；Keeganら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88：1095-1099(1991)を参照)、低親和性でＦＧＦＲ-１、２及び４(それぞれ、Isacchiら, Nuc. Acids. Res. 18(7)：1906(1990)、Dionneら, EMBO J. 9(9)：2685-2692(1990)及びPartanenら, EMBO J. 10(6)：1347-1354(1991)を参照)に結合する。
(４)ＰＲＯ３３７はＰＲＯ６００４に結合する。
(５)ＰＲＯ１４１１はＰＲＯ４３５６に結合する。
(６)ＰＲＯ１００９６はＰＲＯ２６３０に結合する。
(７)ＰＲＯ２４６はそれ自体に結合し、よって付着分子として機能する。
(８)ＰＲＯ６３０７はＰＲＯ２６５に結合する。
(９)ＰＲＯ６００３はＰＲＯ９４１に結合する。 Example 72: Identification of receptor / ligand interactions In this assay, various polypeptides are assayed for the ability to bind to a panel of potential receptors or ligand molecules in order to identify receptor / ligand interactions. Identification of a ligand for a known receptor, a receptor for a known ligand or a novel receptor / ligand pair, for example, targeting a biologically active molecule (ligand or bound to a receptor) to a cell known to express the receptor or ligand Use of a receptor or ligand as a reagent for detecting the presence of a receptor or ligand in a cell containing a cell suspected of expressing the ligand or receptor Modulation of cell growth or other biological or immunological activity known to express the receptor or ligand, modulation of the immune response of or to the cell expressing the receptor or ligand, receptor or ligand Cell growth, or biological or immune Preparation of agonists, antagonists and / or antibodies to the receptor or ligand to modulate the activity, and are useful for a variety of indications including immediately will become apparent various other adaptations by those skilled in the art.
This assay is performed as follows. The PRO polypeptide of the present invention, which appears to be a ligand for the receptor, is expressed as a fusion protein (immunoadhesin) containing the Fc region of human IgG. Receptor-ligand binding interacts with immunoadhesin polypeptides and cells expressing candidate PRO polypeptide receptors (eg, Cos cells), visualizes the bound immunoadhesins with a fluorescent reagent for the Fc fusion domain, and examines under a microscope Is detected. Cells expressing the candidate receptor are generated by parallel transient transfection of a predetermined subset of a library of cDNA expression vectors encoding a PRO polypeptide that can function as a receptor molecule. The cells are then incubated for 1 hour in the presence of the PRO polypeptide immunoadhesin being assayed for receptor binding potential. Cells were then washed and fixed with paraformaldehyde. The cells were then incubated with a fluorescent conjugated antibody (eg, FITC-conjugated goat anti-human Fc antibody) against the Fc portion of the PRO polypeptide immunoadhesin. The cells were then washed again and examined under a microscope. Positive interactions are similar to the presence of fluorescent labels in cells transfected with a cDNA encoding a particular PRO polypeptide receptor or receptor pool, and similar prepared cells transfected with other cDNA or cDNA pools. Judged by the absence of fluorescent label. If a given pool of cDNA expression vectors is determined to be positive for interaction with the PRO polypeptide immunoadhesin, the individual cDNA species containing that pool are individually tested (the pool is "broken""), A specific cDNA encoding a receptor capable of interacting with the PRO polypeptide immunoadhesin is determined.
In another embodiment in this assay, an epitope-tagged potential ligand PRO polypeptide (eg, a histidine “His” tag) is expressed as a potential receptor PRO expressed as a fusion with the Fc domain of human IgG (immunoadhesin). It can interact with a panel of polypeptide molecules. Following a 1 hour co-incubation with the epitope-tagged PRO polypeptide, candidate receptors were each immunoprecipitated with protein A beads and the beads washed. Potential ligand interactions were determined by Western blot analysis of immunoprecipitation complexes using antibodies against the epitope tag. If the expected molecular weight band of the epitope tag protein was found by Western blot analysis using the candidate receptor and was not found to occur with other members of the panel of potential receptors, It is determined that an action has occurred.
Using these assays, the following receptor / ligand interactions were identified here:
(1) PRO533 binds to fibroblast growth factor receptor-4 (FGFR-4; see Partanen et al., EMBO J. 10 (6): 1347-1354 (1991)).
(2) PRO301 binds to itself and thus functions as an adhesion molecule.
(3) PRO187 has high affinity and fibroblast growth factor receptor-3 (FGFR-3; see Keegan et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 1095-1099 (1991)), low affinity FGFR-1, 2 and 4 (Isacchi et al., Nuc. Acids. Res. 18 (7): 1906 (1990), Dionne et al., EMBO J. 9 (9): 2685-2692 (1990) and Partanen et al., Respectively. EMBO J. 10 (6): 1347-1354 (1991)).
(4) PRO337 binds to PRO6004.
(5) PRO1411 binds to PRO4356.
(6) PRO10096 binds to PRO2630.
(7) PRO246 binds to itself and thus functions as an adhesion molecule.
(8) PRO6307 binds to PRO265.
(9) PRO6003 is coupled to PRO941.

材料の寄託
次の材料をアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション, 10801 ユニバーシティ ブルバード，マナッサス，ヴァージニア20110-2209，米国(ATCC)に寄託した：
表１０
材料 ATCC寄託番号 寄託日
DNA22779-1130 209280 1997年9月18日
DNA26846-1397 203406 1998年10月27日
DNA32279-1131 209259 1997年9月16日
DNA32288-1132 209261 1997年9月16日
DNA33094-1131 209256 1997年9月16日
DNA33785-1143 209417 1997年10月28日
DNA35663-1129 209201 1997年6月18日
DNA46777-1253 209619 1998年2月5日
DNA60783-1611 203130 1998年8月18日
DNA62306-1570 203254 1998年9月9日
DNA62880-1513 203097 1998年8月4日
DNA64896-1539 203238 1998年9月9日
DNA71290-1630 203275 1998年9月22日
DNA96031-2664 PTA-237 1999年6月15日
DNA108722-2743 PTA-552 1999年8月17日
DNA35674-1142 209416 1997年10月28日
DNA41234 209618 1998年2月5日
DNA77503-1686 203362 1998 年10月20日
DNA49435-1219 209480 1997 年11月21日
DNA40628-1216 209432 1997 年11月7日
DNA27864-1155 209375 1997 年10月16日
DNA43316-1237 209487 1997年11月21日
DNA59212-1627 203245 1998年9月9日
DNA86576-2595 203868 1999年3月23日
DNA35639-1172 209396 1997年10月17日
DNA36350-1158 209378 1997年10月16日
DNA53906-1368 209747 1998年4月7日
DNA125185-2806 PTA-1031 1999年12月7日
DNA83568-2692 PTA-386 1999年7月20日 Deposit of materials The following materials were deposited with the American Type Culture Collection, 10801 University Boulevard, Manassas, Virginia 20110-2209, USA (ATCC):
Table 10
Material ATCC Deposit Number Deposit Date
DNA22779-1130 209280 September 18, 1997
DNA26846-1397 203406 Oct 27, 1998
DNA32279-1131 209259 September 16, 1997
DNA32288-1132 209261 September 16, 1997
DNA33094-1131 209256 September 16, 1997
DNA33785-1143 209417 October 28, 1997
DNA35663-1129 209201 June 18, 1997
DNA46777-1253 209619 Feb 5, 1998
DNA60783-1611 203130 Aug 18, 1998
DNA62306-1570 203254 September 9, 1998
DNA62880-1513 203097 Aug 4, 1998
DNA64896-1539 203238 Sep 9, 1998
DNA71290-1630 203275 September 22, 1998
DNA96031-2664 PTA-237 June 15, 1999
DNA108722-2743 PTA-552 August 17, 1999
DNA35674-1142 209416 October 28, 1997
DNA41234 209618 Feb 5, 1998
DNA77503-1686 203362 Oct 20, 1998
DNA49435-1219 209480 November 21, 1997
DNA40628-1216 209432 November 7, 1997
DNA27864-1155 209375 October 16, 1997
DNA43316-1237 209487 November 21, 1997
DNA59212-1627 203245 September 9, 1998
DNA86576-2595 203868 Mar 23, 1999
DNA35639-1172 209396 October 17, 1997
DNA36350-1158 209378 Oct 16, 1997
DNA53906-1368 209747 Apr 7, 1998
DNA125185-2806 PTA-1031 Dec 7, 1999
DNA83568-2692 PTA-386 Jul 20, 1999

これらの寄託は、特許手続き上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約及びその規則(ブダペスト条約)の規定に従って行われた。これは、寄託の日付から３０年間、寄託の生存可能な培養が維持されることを保証するものである。寄託物はブダペスト条約の条項に従い、またジェネンテク社とＡＴＣＣとの間の合意に従い、ＡＴＣＣから入手することができ、これは、どれが最初であろうとも、関連した米国特許の発行時又は任意の米国又は外国特許出願の公開時に、寄託培養物の後代を永久かつ非制限的に入手可能とすることを保証し、米国特許法第１２２条及びそれに従う特許庁長官規則(特に参照番号８８６ＯＧ６３８の３７ＣＦＲ第１．１４条を含む)に従って権利を有すると米国特許庁長官が決定した者に子孫を入手可能とすることを保証するものである。
本出願の譲受人は、寄託した培養物が、適切な条件下で培養されていた場合に死亡もしくは損失又は破壊されたならば、材料は通知時に同一の他のものと即座に取り替えることに同意する。寄託物質の入手可能性は、特許法に従いあらゆる政府の権限下で認められた権利に違反して、本発明を実施するライセンスであるとみなされるものではない。
上記の文書による明細書は、当業者に本発明を実施できるようにするために十分であると考えられる。寄託した態様は、本発明のある側面の一つの説明として意図されており、機能的に等価なあらゆる作成物がこの発明の範囲内にあるため、寄託された作成物により、本発明の範囲が限定されるものではない。ここでの物質の寄託は、ここに含まれる文書による説明が、そのベストモードを含む、本発明の任意の側面の実施を可能にするために不十分であることを認めるものではないし、それが表す特定の例証に対して請求の範囲を制限するものと解釈されるものでもない。実際、ここに示し記載したものに加えて、本発明を様々に改変することは、前記の記載から当業者にとっては明らかなものであり、添付の請求の範囲内に入るものである。 These deposits were made in accordance with the provisions of the Budapest Treaty and its regulations (Budapest Convention) on the international recognition of the deposit of microorganisms in the patent procedure. This assures that the viable culture of the deposit is maintained for 30 years from the date of deposit. Deposits may be obtained from the ATCC in accordance with the terms of the Budapest Treaty and in accordance with the agreement between Genentech and ATCC, regardless of which is the first issue of the relevant U.S. patent or any Ensures that the progeny of the deposited culture are made available permanently and unrestricted at the time of publication of the US or foreign patent application, and is subject to 35 USC 122 and the Patent Office Commissioner Regulation (specifically 37 CFR of reference number 886OG638). Guarantees that the offspring will be available to those who have been determined to have rights in accordance with (including Section 1.14).
The assignee of this application agrees that if the deposited culture dies or is lost or destroyed when cultured under appropriate conditions, the material will be immediately replaced with the same other upon notification. To do. The availability of deposited materials is not considered a license to practice the present invention in violation of rights granted under any governmental authority in accordance with patent law.
The above written description is considered to be sufficient to enable one skilled in the art to practice the invention. The deposited embodiments are intended as an illustration of certain aspects of the invention, and since any functionally equivalent product is within the scope of the invention, the deposited product will limit the scope of the invention. It is not limited. The deposit of material herein does not admit that the written description contained herein is insufficient to allow implementation of any aspect of the present invention, including its best mode, and that It is not to be construed as limiting the scope of the claims for the particular illustrations represented. Indeed, various modifications of the invention in addition to those shown and described herein will be apparent to those skilled in the art from the foregoing description and fall within the scope of the appended claims.

天然配列ＰＲＯ１９６ｃＤＮＡのヌクレオチド配列(配列番号：３)を示し、配列番号：３は、ここで「ＤＮＡ２２７７９-１１３０」と命名されるクローンである。The nucleotide sequence of the native sequence PRO196 cDNA (SEQ ID NO: 3) is shown, which is a clone designated herein as “DNA22779-1130”. 図１に示した配列番号：３のコード配列から誘導されたアミノ酸配列(配列番号：４)を示す。The amino acid sequence (sequence number: 4) induced | guided | derived from the coding sequence of sequence number: 3 shown in FIG. 1 is shown. 天然配列ＰＲＯ４４４ｃＤＮＡのヌクレオチド配列(配列番号：８)を示し、配列番号：８は、ここで「ＤＮＡ２６８４６-１３９７」と命名されるクローンである。The nucleotide sequence of the native sequence PRO444 cDNA (SEQ ID NO: 8) is shown, which is a clone designated herein as “DNA26846-1397”. 図３に示した配列番号：８のコード配列から誘導されたアミノ酸配列(配列番号：９)を示す。The amino acid sequence (SEQ ID NO: 9) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 8 shown in FIG. 3 is shown. 天然配列ＰＲＯ１８３ｃＤＮＡのヌクレオチド配列(配列番号：１０)を示し、配列番号：１０は、ここで「ＤＮＡ２８４９８」と命名されるクローンである。The nucleotide sequence of the native sequence PRO183 cDNA (SEQ ID NO: 10) is shown, which is a clone designated herein as “DNA28498”. 図５に示した配列番号：１０のコード配列から誘導されたアミノ酸配列(配列番号：１１)を示す。The amino acid sequence (SEQ ID NO: 11) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 10 shown in FIG. 5 is shown. 天然配列ＰＲＯ１８５ｃＤＮＡのヌクレオチド配列(配列番号：１２)を示し、配列番号：１２は、ここで「ＤＮＡ２８５０３」と命名されるクローンである。The nucleotide sequence of the native sequence PRO185 cDNA (SEQ ID NO: 12) is shown, which is a clone designated herein as “DNA28503”. 図７に示した配列番号：１２のコード配列から誘導されたアミノ酸配列(配列番号：１３)を示す。The amino acid sequence (SEQ ID NO: 13) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 12 shown in FIG. 7 is shown. 天然配列ＰＲＯ２１０ｃＤＮＡのヌクレオチド配列(配列番号：１４)を示し、配列番号：１４は、ここで「ＤＮＡ３２２７９-１１３１」と命名されるクローンである。The nucleotide sequence of the native sequence PRO210 cDNA (SEQ ID NO: 14) is shown, which is a clone designated herein as “DNA32279-1131”. 図９に示した配列番号：１４のコード配列から誘導されたアミノ酸配列(配列番号：１５)を示す。The amino acid sequence (SEQ ID NO: 15) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 14 shown in FIG. 9 is shown. 天然配列ＰＲＯ２１５ｃＤＮＡのヌクレオチド配列(配列番号：１６)を示し、配列番号：１６は、ここで「ＤＮＡ３２２８８-１１３２」と命名されるクローンである。The nucleotide sequence of the native sequence PRO215 cDNA (SEQ ID NO: 16) is shown, which is a clone designated herein as “DNA32288-1132”. 図１１に示した配列番号：１６のコード配列から誘導されたアミノ酸配列(配列番号：１７)を示す。The amino acid sequence (SEQ ID NO: 17) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 16 shown in FIG. 11 is shown. 天然配列ＰＲＯ２１７ｃＤＮＡのヌクレオチド配列(配列番号：２１)を示し、配列番号：２１は、ここで「ＤＮＡ３３０９４-１１３１」と命名されるクローンである。The nucleotide sequence of the native sequence PRO217 cDNA (SEQ ID NO: 21) is shown, and SEQ ID NO: 21 is a clone designated herein as “DNA33094-1131”. 図１３に示した配列番号：２１のコード配列から誘導されたアミノ酸配列(配列番号：２２)を示す。The amino acid sequence (SEQ ID NO: 22) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 21 shown in FIG. 13 is shown. 天然配列ＰＲＯ２４２ｃＤＮＡのヌクレオチド配列(配列番号：２３)を示し、配列番号：２３は、ここで「ＤＮＡ３３７８５-１１４３」と命名されるクローンである。The nucleotide sequence of the native sequence PRO242 cDNA (SEQ ID NO: 23) is shown, which is a clone designated herein as “DNA33785-1143”. 図１５に示した配列番号：２３のコード配列から誘導されたアミノ酸配列(配列番号：２４)を示す。This shows the amino acid sequence (SEQ ID NO: 24) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 23 shown in FIG. 天然配列ＰＲＯ２８８ｃＤＮＡのヌクレオチド配列(配列番号：２８)を示し、配列番号：２８は、ここで「ＤＮＡ３５６６３-１１２９」と命名されるクローンである。The nucleotide sequence of the native sequence PRO288 cDNA (SEQ ID NO: 28) is shown, and SEQ ID NO: 28 is a clone designated herein as “DNA35663-1129”. 図１７に示した配列番号：２８のコード配列から誘導されたアミノ酸配列(配列番号：２９)を示す。This shows the amino acid sequence (SEQ ID NO: 29) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 28 shown in FIG. 天然配列ＰＲＯ３６５ｃＤＮＡのヌクレオチド配列(配列番号：３１)を示し、配列番号：３１は、ここで「ＤＮＡ４６７７７-１２５３」と命名されるクローンである。The nucleotide sequence of the native sequence PRO365 cDNA (SEQ ID NO: 31) is shown, and SEQ ID NO: 31 is a clone designated herein as “DNA46777-1253”. 図１９に示した配列番号：３１のコード配列から誘導されたアミノ酸配列(配列番号：３２)を示す。The amino acid sequence (SEQ ID NO: 32) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 31 shown in FIG. 19 is shown. 天然配列ＰＲＯ１３６１ｃＤＮＡのヌクレオチド配列(配列番号：３８)を示し、配列番号：３８は、ここで「ＤＮＡ６０７８３-１６１１」と命名されるクローンである。The nucleotide sequence of the native sequence PRO1361 cDNA (SEQ ID NO: 38) is shown, and SEQ ID NO: 38 is a clone designated herein as “DNA60783-1611”. 図２１に示した配列番号：３８のコード配列から誘導されたアミノ酸配列(配列番号：３９)を示す。The amino acid sequence (SEQ ID NO: 39) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 38 shown in FIG. 21 is shown. 天然配列ＰＲＯ１３０８ｃＤＮＡのヌクレオチド配列(配列番号：４０)を示し、配列番号：４０は、ここで「ＤＮＡ６２３０６-１５７０」と命名されるクローンである。The nucleotide sequence of the native sequence PRO1308 cDNA (SEQ ID NO: 40) is shown, which is a clone designated herein as “DNA62306-1570”. 図２３に示した配列番号：４０のコード配列から誘導されたアミノ酸配列(配列番号：４１)を示す。An amino acid sequence (SEQ ID NO: 41) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 40 shown in FIG. 23 is shown. 天然配列ＰＲＯ１１８３ｃＤＮＡのヌクレオチド配列(配列番号：５１)を示し、配列番号：５１は、ここで「ＤＮＡ６２８８０-１５１３」と命名されるクローンである。This shows the nucleotide sequence of the native sequence PRO1183 cDNA (SEQ ID NO: 51), which is a clone designated herein as “DNA62880-1513”. 図２５に示した配列番号：５１のコード配列から誘導されたアミノ酸配列(配列番号：５２)を示す。An amino acid sequence (SEQ ID NO: 52) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 51 shown in FIG. 25 is shown. 天然配列ＰＲＯ１２７２ｃＤＮＡのヌクレオチド配列(配列番号：５３)を示し、配列番号：５３は、ここで「ＤＮＡ６４８９６-１５３９」と命名されるクローンである。The nucleotide sequence of the native sequence PRO1272 cDNA (SEQ ID NO: 53) is shown, which is a clone designated herein as “DNA64896-1539”. 図２７に示した配列番号：５３のコード配列から誘導されたアミノ酸配列(配列番号：５４)を示す。This shows the amino acid sequence (SEQ ID NO: 54) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 53 shown in FIG. 天然配列ＰＲＯ１４１９ｃＤＮＡのヌクレオチド配列(配列番号：５５)を示し、配列番号：５５は、ここで「ＤＮＡ７１２９０-１６３０」と命名されるクローンである。The nucleotide sequence of the native sequence PRO1419 cDNA (SEQ ID NO: 55) is shown, which is a clone designated herein as “DNA71290-1630”. 図２９に示した配列番号：５５のコード配列から誘導されたアミノ酸配列(配列番号：５６)を示す。The amino acid sequence (SEQ ID NO: 56) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 55 shown in FIG. 29 is shown. 天然配列ＰＲＯ４９９９ｃＤＮＡのヌクレオチド配列(配列番号：５７)を示し、配列番号：５７は、ここで「ＤＮＡ９６０３１-２６６４」と命名されるクローンである。The nucleotide sequence of the native sequence PRO4999 cDNA (SEQ ID NO: 57) is shown, which is a clone designated herein as “DNA96031-2664”. 図３１に示した配列番号：５７のコード配列から誘導されたアミノ酸配列(配列番号：５８)を示す。An amino acid sequence (SEQ ID NO: 58) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 57 shown in FIG. 31 is shown. 天然配列ＰＲＯ７１７０ｃＤＮＡのヌクレオチド配列(配列番号：６２)を示し、配列番号：６２は、ここで「ＤＮＡ１０８７２２-２７４３」と命名されるクローンである。This shows the nucleotide sequence of the native sequence PRO7170 cDNA (SEQ ID NO: 62), which is a clone designated herein as “DNA108722-2743”. 図３３に示した配列番号：６２のコード配列から誘導されたアミノ酸配列(配列番号：６３)を示す。An amino acid sequence (SEQ ID NO: 63) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 62 shown in FIG. 33 is shown. 天然配列ＰＲＯ２４８ｃＤＮＡのヌクレオチド配列(配列番号：６４)を示し、配列番号：６４は、ここで「ＤＮＡ３５６７４-１１４２」と命名されるクローンである。The nucleotide sequence of the native sequence PRO248 cDNA (SEQ ID NO: 64) is shown, and SEQ ID NO: 64 is a clone designated herein as “DNA35674-1142”. 図３５に示した配列番号：６４のコード配列から誘導されたアミノ酸配列(配列番号：６５)を示す。An amino acid sequence (SEQ ID NO: 65) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 64 shown in FIG. 35 is shown. 天然配列ＰＲＯ３５３ｃＤＮＡのヌクレオチド配列(配列番号：７２)を示し、配列番号：７２は、ここで「ＤＮＡ４１２３４」と命名されるクローンである。The nucleotide sequence of the native sequence PRO353 cDNA (SEQ ID NO: 72) is shown, which is a clone designated herein as “DNA41234”. 図３７に示した配列番号：７２のコード配列から誘導されたアミノ酸配列(配列番号：７３)を示す。An amino acid sequence (SEQ ID NO: 73) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 72 shown in FIG. 37 is shown. 天然配列ＰＲＯ１３１８ｃＤＮＡのヌクレオチド配列(配列番号：７７)を示し、配列番号：７７は、ここで「ＤＮＡ７３８３８-１６７４」と命名されるクローンである。The nucleotide sequence of the native sequence PRO1318 cDNA (SEQ ID NO: 77) is shown, and SEQ ID NO: 77 is a clone designated herein as “DNA73838-1674”. 図３９に示した配列番号：７７のコード配列から誘導されたアミノ酸配列(配列番号：７８)を示す。The amino acid sequence (SEQ ID NO: 78) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 77 shown in FIG. 39 is shown. 天然配列ＰＲＯ１６００ｃＤＮＡのヌクレオチド配列(配列番号：７９)を示し、配列番号：７９は、ここで「ＤＮＡ７７５０３-１６８６」と命名されるクローンである。This shows the nucleotide sequence of the native sequence PRO1600 cDNA (SEQ ID NO: 79), which is a clone designated herein as “DNA77503-1686”. 図４１に示した配列番号：７９のコード配列から誘導されたアミノ酸配列(配列番号：８０)を示す。The amino acid sequence (SEQ ID NO: 80) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 79 shown in FIG. 41 is shown. 天然配列ＰＲＯ９９４０ｃＤＮＡのヌクレオチド配列(配列番号：８３)を示し、配列番号：８３は、ここで「ＤＮＡ９２２８２」と命名されるクローンである。The nucleotide sequence of the native sequence PRO9940 cDNA (SEQ ID NO: 83) is shown, which is a clone designated herein as “DNA92282”. 図４３に示した配列番号：８３のコード配列から誘導されたアミノ酸配列(配列番号：８４)を示す。43 shows the amino acid sequence (SEQ ID NO: 84) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 83 shown in FIG. 天然配列ＰＲＯ５３３ｃＤＮＡのヌクレオチド配列(配列番号：８５)を示し、配列番号：８５は、ここで「ＤＮＡ４９４３５-１２１９」と命名されるクローンである。The nucleotide sequence of the native sequence PRO533 cDNA (SEQ ID NO: 85) is shown, which is a clone designated herein as “DNA49435-1219”. 図４５に示した配列番号：８５のコード配列から誘導されたアミノ酸配列(配列番号：８６)を示す。An amino acid sequence (SEQ ID NO: 86) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 85 shown in FIG. 45 is shown. 天然配列ＰＲＯ３０１ｃＤＮＡのヌクレオチド配列(配列番号：９０)を示し、配列番号：９０は、ここで「ＤＮＡ４０６２８-１２１６」と命名されるクローンである。The nucleotide sequence of the native sequence PRO301 cDNA (SEQ ID NO: 90) is shown, which is a clone designated herein as “DNA40628-1216”. 図４７に示した配列番号：９０のコード配列から誘導されたアミノ酸配列(配列番号：９１)を示す。47 shows the amino acid sequence (SEQ ID NO: 91) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 90 shown in FIG. 天然配列ＰＲＯ１８７ｃＤＮＡのヌクレオチド配列(配列番号：９８)を示し、配列番号：９８は、ここで「ＤＮＡ２７８６４-１１５５」と命名されるクローンである。The nucleotide sequence of the native sequence PRO187 cDNA (SEQ ID NO: 98) is shown, which is a clone designated herein as “DNA27864-1155”. 図４９に示した配列番号：９８のコード配列から誘導されたアミノ酸配列(配列番号：９９)を示す。49 shows the amino acid sequence (SEQ ID NO: 99) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 98 shown in FIG. 天然配列ＰＲＯ３３７ｃＤＮＡのヌクレオチド配列(配列番号：１０３)を示し、配列番号：１０３は、ここで「ＤＮＡ４３３１６-１２３７」と命名されるクローンである。The nucleotide sequence of the native sequence PRO337 cDNA (SEQ ID NO: 103) is shown, which is a clone designated herein as “DNA43316-1237”. 図５１に示した配列番号：１０３のコード配列から誘導されたアミノ酸配列(配列番号：１０４)を示す。51 shows the amino acid sequence (SEQ ID NO: 104) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 103 shown in FIG. 天然配列ＰＲＯ１４１１ｃＤＮＡのヌクレオチド配列(配列番号：１０５)を示し、配列番号：１０５は、ここで「ＤＮＡ５９２１２-１６２７」と命名されるクローンである。The nucleotide sequence of the native sequence PRO1411 cDNA (SEQ ID NO: 105) is shown, which is a clone designated herein as “DNA59212-1627”. 図５３に示した配列番号：１０５のコード配列から誘導されたアミノ酸配列(配列番号：１０６)を示す。An amino acid sequence (SEQ ID NO: 106) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 105 shown in FIG. 53 is shown. 天然配列ＰＲＯ４３５６ｃＤＮＡのヌクレオチド配列(配列番号：１０７)を示し、配列番号：１０７は、ここで「ＤＮＡ８６５７６-２５９５」と命名されるクローンである。The nucleotide sequence of the native sequence PRO4356 cDNA (SEQ ID NO: 107) is shown, and SEQ ID NO: 107 is a clone designated herein as “DNA86576-2595”. 図５５に示した配列番号：１０７のコード配列から誘導されたアミノ酸配列(配列番号：１０８)を示す。An amino acid sequence (SEQ ID NO: 108) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 107 shown in FIG. 55 is shown. 天然配列ＰＲＯ２４６ｃＤＮＡのヌクレオチド配列(配列番号：１０９)を示し、配列番号：１０９は、ここで「ＤＮＡ３５６３９-１１７２」と命名されるクローンである。The nucleotide sequence of the native sequence PRO246 cDNA (SEQ ID NO: 109) is shown, and SEQ ID NO: 109 is a clone designated herein as “DNA35639-1172”. 図５７に示した配列番号：１０９のコード配列から誘導されたアミノ酸配列(配列番号：１１０)を示す。57 shows the amino acid sequence (SEQ ID NO: 110) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 109 shown in FIG. 天然配列ＰＲＯ２６５ｃＤＮＡのヌクレオチド配列(配列番号：１１４)を示し、配列番号：１１４は、ここで「ＤＮＡ３６３５０-１１５８」と命名されるクローンである。The nucleotide sequence of the native sequence PRO265 cDNA (SEQ ID NO: 114) is shown, and SEQ ID NO: 114 is a clone designated herein as “DNA36350-1158”. 図５９に示した配列番号：１１４のコード配列から誘導されたアミノ酸配列(配列番号：１１５)を示す。An amino acid sequence (SEQ ID NO: 115) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 114 shown in FIG. 59 is shown. 天然配列ＰＲＯ９４１ｃＤＮＡのヌクレオチド配列(配列番号：１２０)を示し、配列番号：１２０は、ここで「ＤＮＡ５３９０６-１３６８」と命名されるクローンである。The nucleotide sequence of the native sequence PRO941 cDNA (SEQ ID NO: 120) is shown, and SEQ ID NO: 120 is a clone designated herein as “DNA53906-1368”. 図６１に示した配列番号：１２０のコード配列から誘導されたアミノ酸配列(配列番号：１２１)を示す。An amino acid sequence (SEQ ID NO: 121) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 120 shown in FIG. 61 is shown. 天然配列ＰＲＯ１００９６ｃＤＮＡのヌクレオチド配列(配列番号：１２５)を示し、配列番号：１２５は、ここで「ＤＮＡ１２５１８５-２８０６」と命名されるクローンである。The nucleotide sequence of the native sequence PRO10096 cDNA (SEQ ID NO: 125) is shown, which is a clone designated herein as “DNA125185-2806”. 図６３に示した配列番号：１２５のコード配列から誘導されたアミノ酸配列(配列番号：１２６)を示す。An amino acid sequence (SEQ ID NO: 126) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 125 shown in FIG. 63 is shown. 天然配列ＰＲＯ６００３ｃＤＮＡのヌクレオチド配列(配列番号：１２７)を示し、配列番号：１２７は、ここで「ＤＮＡ８３５６８-２６９２」と命名されるクローンである。The nucleotide sequence of the native sequence PRO6003 cDNA (SEQ ID NO: 127) is shown, which is a clone designated herein as “DNA83568-2692.” 図６５に示した配列番号：１２７のコード配列から誘導されたアミノ酸配列(配列番号：１２８)を示す。An amino acid sequence (SEQ ID NO: 128) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 127 shown in FIG. 65 is shown. 天然配列ＰＲＯ６００４ｃＤＮＡのヌクレオチド配列(配列番号：１２９)を示し、配列番号：１２９は、ここで「ＤＮＡ９２２５９」と命名されるクローンである。The nucleotide sequence of the native sequence PRO6004 cDNA (SEQ ID NO: 129) is shown, which is a clone designated herein as “DNA92259”. 図６７Ａ-Ｂに示した配列番号：１２９のコード配列から誘導されたアミノ酸配列(配列番号：１３０)を示す。The amino acid sequence (SEQ ID NO: 130) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 129 shown in FIGS. 67A-B is shown. 天然配列ＰＲＯ３５０ｃＤＮＡのヌクレオチド配列(配列番号：１３１)を示し、配列番号：１３１は、ここで「ＤＮＡ４４１７５-１３１４」と命名されるクローンである。This shows the nucleotide sequence of the native sequence PRO350 cDNA (SEQ ID NO: 131), which is a clone designated herein as “DNA44175-1314”. 図６９に示した配列番号：１３１のコード配列から誘導されたアミノ酸配列(配列番号：１３２)を示す。An amino acid sequence (SEQ ID NO: 132) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 131 shown in FIG. 69 is shown. 天然配列ＰＲＯ２６３０ｃＤＮＡのヌクレオチド配列(配列番号：１３６)を示し、配列番号：１３６は、ここで「ＤＮＡ８３５５１」と命名されるクローンである。The nucleotide sequence of the native sequence PRO2630 cDNA (SEQ ID NO: 136) is shown, which is a clone designated herein as “DNA83551”. 図７１に示した配列番号：１３６のコード配列から誘導されたアミノ酸配列(配列番号：１３７)を示す。An amino acid sequence (SEQ ID NO: 137) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 136 shown in FIG. 71 is shown. 天然配列ＰＲＯ６３０９ｃＤＮＡのヌクレオチド配列(配列番号：１３８)を示し、配列番号：１３８は、ここで「ＤＮＡ１１６５１０」と命名されるクローンである。The nucleotide sequence of the native sequence PRO6309 cDNA (SEQ ID NO: 138) is shown, which is a clone designated herein as “DNA116510”. 図７３に示した配列番号：１３８のコード配列から誘導されたアミノ酸配列(配列番号：１３９)を示す。An amino acid sequence (SEQ ID NO: 139) derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 138 shown in FIG. 73 is shown.

Claims (39)

図２(配列番号：４)、図４(配列番号：９)、図６(配列番号：１１)、図８(配列番号：１３)、図１０(配列番号：１５)、図１２(配列番号：１７)、図１４(配列番号：２２)、図１６(配列番号：２４)、図１８(配列番号：２９)、図２０(配列番号：３２)、図２２(配列番号：３９)、図２４(配列番号：４１)、図２６(配列番号：５２)、図２８(配列番号：５４)、図３０(配列番号：５６)、図３２(配列番号：５８)、図３４(配列番号：６３)、図３６(配列番号：６５)、図３８(配列番号：７３)、図４０(配列番号：７８)、図４２(配列番号：８０)、図４４(配列番号：８４)、図４６(配列番号：８６)、図４８(配列番号：９１)、図５０(配列番号：９９)、図５２(配列番号：１０４)、図５４(配列番号：１０６)、図５６(配列番号：１０８)、図５８(配列番号：１１０)、図６０(配列番号：１１５)、図６２(配列番号：１２１)、図６６(配列番号：１２８)、図６８(配列番号：１３０)、図７０(配列番号：１３２)、図７２(配列番号：１３７)及び図７４(配列番号：１３９)に示したアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列に対して少なくとも８０％の核酸配列同一性を有する単離された核酸。 FIG. 2 (SEQ ID NO: 4), FIG. 4 (SEQ ID NO: 9), FIG. 6 (SEQ ID NO: 11), FIG. 8 (SEQ ID NO: 13), FIG. 10 (SEQ ID NO: 15), FIG. 17), FIG. 14 (SEQ ID NO: 22), FIG. 16 (SEQ ID NO: 24), FIG. 18 (SEQ ID NO: 29), FIG. 20 (SEQ ID NO: 32), FIG. 22 (SEQ ID NO: 39), FIG. 24 (SEQ ID NO: 41), FIG. 26 (SEQ ID NO: 52), FIG. 28 (SEQ ID NO: 54), FIG. 30 (SEQ ID NO: 56), FIG. 32 (SEQ ID NO: 58), FIG. 63), FIG. 36 (SEQ ID NO: 65), FIG. 38 (SEQ ID NO: 73), FIG. 40 (SEQ ID NO: 78), FIG. 42 (SEQ ID NO: 80), FIG. 44 (SEQ ID NO: 84), FIG. (SEQ ID NO: 86), FIG. 48 (SEQ ID NO: 91), FIG. 50 (SEQ ID NO: 99), FIG. 52 (SEQ ID NO: 104), FIG. 54 (SEQ ID NO: 106), FIG. 56 (SEQ ID NO: 108) ), FIG. 58 (SEQ ID NO: 1 0), FIG. 60 (SEQ ID NO: 115), FIG. 62 (SEQ ID NO: 121), FIG. 66 (SEQ ID NO: 128), FIG. 68 (SEQ ID NO: 130), FIG. 70 (SEQ ID NO: 132), FIG. An isolated nucleic acid having at least 80% nucleic acid sequence identity to a nucleotide sequence encoding an amino acid sequence selected from the group consisting of the amino acid sequences shown in (SEQ ID NO: 137) and FIG. 74 (SEQ ID NO: 139) Nucleic acid. 図１(配列番号：３)、図３(配列番号：８)、図５(配列番号：１０)、図７(配列番号：１２)、図９(配列番号：１４)、図１１(配列番号：１６)、図１３(配列番号：２１)、図１５(配列番号：２３)、図１７(配列番号：２８)、図１９(配列番号：３１)、図２１(配列番号：３８)、図２３(配列番号：４０)、図２５(配列番号：５１)、図２７(配列番号：５３)、図２９(配列番号：５５)、図３１(配列番号：５７)、図３３(配列番号：６２)、図３５(配列番号：６４)、図３７(配列番号：７２)、図３９(配列番号：７７)、図４１(配列番号：７９)、図４３(配列番号：８３)、図４５(配列番号：８５)、図４７(配列番号：９０)、図４９(配列番号：９８)、図５１(配列番号：１０３)、図５３(配列番号：１０５)、図５５(配列番号：１０７)、図５７(配列番号：１０９)、図５９(配列番号：１１４)、図６１(配列番号：１２０)、図６３(配列番号：１２５)、図６７Ａ-Ｂ(配列番号：１２９)、図６９(配列番号：１３１)、図７１(配列番号：１３６)及び図７３(配列番号：１３８)に示したヌクレオチド配列からなる群から選択されるヌクレオチド配列と少なくとも８０％の核酸配列同一性を有する単離された核酸。 FIG. 1 (SEQ ID NO: 3), FIG. 3 (SEQ ID NO: 8), FIG. 5 (SEQ ID NO: 10), FIG. 7 (SEQ ID NO: 12), FIG. 9 (SEQ ID NO: 14), FIG. : 16), FIG. 13 (SEQ ID NO: 21), FIG. 15 (SEQ ID NO: 23), FIG. 17 (SEQ ID NO: 28), FIG. 19 (SEQ ID NO: 31), FIG. 21 (SEQ ID NO: 38), FIG. 23 (SEQ ID NO: 40), FIG. 25 (SEQ ID NO: 51), FIG. 27 (SEQ ID NO: 53), FIG. 29 (SEQ ID NO: 55), FIG. 31 (SEQ ID NO: 57), FIG. 33 (SEQ ID NO: 62), FIG. 35 (SEQ ID NO: 64), FIG. 37 (SEQ ID NO: 72), FIG. 39 (SEQ ID NO: 77), FIG. 41 (SEQ ID NO: 79), FIG. 43 (SEQ ID NO: 83), FIG. (SEQ ID NO: 85), FIG. 47 (SEQ ID NO: 90), FIG. 49 (SEQ ID NO: 98), FIG. 51 (SEQ ID NO: 103), FIG. 53 (SEQ ID NO: 105), FIG. 55 (SEQ ID NO: 107) ), FIG. 57 (SEQ ID NO: 10) 59 (SEQ ID NO: 114), FIG. 61 (SEQ ID NO: 120), FIG. 63 (SEQ ID NO: 125), FIG. 67A-B (SEQ ID NO: 129), FIG. 69 (SEQ ID NO: 131), FIG. 71. An isolated nucleic acid having at least 80% nucleic acid sequence identity with a nucleotide sequence selected from the group consisting of the nucleotide sequences shown in 71 (SEQ ID NO: 136) and FIG. 73 (SEQ ID NO: 138). 図１(配列番号：３)、図３(配列番号：８)、図５(配列番号：１０)、図７(配列番号：１２)、図９(配列番号：１４)、図１１(配列番号：１６)、図１３(配列番号：２１)、図１５(配列番号：２３)、図１７(配列番号：２８)、図１９(配列番号：３１)、図２１(配列番号：３８)、図２３(配列番号：４０)、図２５(配列番号：５１)、図２７(配列番号：５３)、図２９(配列番号：５５)、図３１(配列番号：５７)、図３３(配列番号：６２)、図３５(配列番号：６４)、図３７(配列番号：７２)、図３９(配列番号：７７)、図４１(配列番号：７９)、図４３(配列番号：８３)、図４５(配列番号：８５)、図４７(配列番号：９０)、図４９(配列番号：９８)、図５１(配列番号：１０３)、図５３(配列番号：１０５)、図５５(配列番号：１０７)、図５７(配列番号：１０９)、図５９(配列番号：１１４)、図６１(配列番号：１２０)、図６３(配列番号：１２５)、図６７Ａ-Ｂ(配列番号：１２９)、図６９(配列番号：１３１)、図７１(配列番号：１３６)及び図７３(配列番号：１３８)に示したヌクレオチド配列の全長コード配列からなる群から選択されるヌクレオチド配列と少なくとも８０％の核酸配列同一性を有する単離された核酸。 FIG. 1 (SEQ ID NO: 3), FIG. 3 (SEQ ID NO: 8), FIG. 5 (SEQ ID NO: 10), FIG. 7 (SEQ ID NO: 12), FIG. 9 (SEQ ID NO: 14), FIG. : 16), FIG. 13 (SEQ ID NO: 21), FIG. 15 (SEQ ID NO: 23), FIG. 17 (SEQ ID NO: 28), FIG. 19 (SEQ ID NO: 31), FIG. 21 (SEQ ID NO: 38), FIG. 23 (SEQ ID NO: 40), FIG. 25 (SEQ ID NO: 51), FIG. 27 (SEQ ID NO: 53), FIG. 29 (SEQ ID NO: 55), FIG. 31 (SEQ ID NO: 57), FIG. 33 (SEQ ID NO: 62), FIG. 35 (SEQ ID NO: 64), FIG. 37 (SEQ ID NO: 72), FIG. 39 (SEQ ID NO: 77), FIG. 41 (SEQ ID NO: 79), FIG. 43 (SEQ ID NO: 83), FIG. (SEQ ID NO: 85), FIG. 47 (SEQ ID NO: 90), FIG. 49 (SEQ ID NO: 98), FIG. 51 (SEQ ID NO: 103), FIG. 53 (SEQ ID NO: 105), FIG. 55 (SEQ ID NO: 107) ), FIG. 57 (SEQ ID NO: 10) 59 (SEQ ID NO: 114), FIG. 61 (SEQ ID NO: 120), FIG. 63 (SEQ ID NO: 125), FIG. 67A-B (SEQ ID NO: 129), FIG. 69 (SEQ ID NO: 131), FIG. An isolated nucleic acid having at least 80% nucleic acid sequence identity with a nucleotide sequence selected from the group consisting of the full-length coding sequence of the nucleotide sequence shown in Figure 71 (SEQ ID NO: 136) and Figure 73 (SEQ ID NO: 138) . 表１０に示されたＡＴＣＣ受託番号で寄託されたＤＮＡの全長コード配列と少なくとも８０％の核酸配列同一性を有する単離された核酸。 An isolated nucleic acid having at least 80% nucleic acid sequence identity with the full length coding sequence of the DNA deposited with the ATCC accession number shown in Table 10. 請求項１ないし４の何れか１項に記載の核酸を含んでなるベクター。 A vector comprising the nucleic acid according to any one of claims 1 to 4. ベクターで形質転換された宿主細胞に認識されるコントロール配列に作用可能に結合した請求項５に記載のベクター。 6. The vector of claim 5 operably linked to a control sequence recognized by a host cell transformed with the vector. 請求項５に記載のベクターを含んでなる宿主細胞。 A host cell comprising the vector of claim 5. 前記細胞がＣＨＯ細胞である請求項７に記載の宿主細胞。 The host cell according to claim 7, wherein the cell is a CHO cell. 前記細胞が大腸菌である請求項７に記載の宿主細胞。 The host cell according to claim 7, wherein the cell is Escherichia coli. 前記細胞が酵母細胞である請求項７に記載の宿主細胞。 The host cell according to claim 7, wherein the cell is a yeast cell. 請求項７に記載の宿主細胞を、前記ＰＲＯポリペプチドの発現に適した条件下で培養し、細胞培養物から前記ＰＲＯポリペプチドを回収することを含んでなるＰＲＯポリペプチドの製造方法。 A method for producing a PRO polypeptide, comprising culturing the host cell according to claim 7 under conditions suitable for expression of the PRO polypeptide, and recovering the PRO polypeptide from a cell culture. 図２(配列番号：４)、図４(配列番号：９)、図６(配列番号：１１)、図８(配列番号：１３)、図１０(配列番号：１５)、図１２(配列番号：１７)、図１４(配列番号：２２)、図１６(配列番号：２４)、図１８(配列番号：２９)、図２０(配列番号：３２)、図２２(配列番号：３９)、図２４(配列番号：４１)、図２６(配列番号：５２)、図２８(配列番号：５４)、図３０(配列番号：５６)、図３２(配列番号：５８)、図３４(配列番号：６３)、図３６(配列番号：６５)、図３８(配列番号：７３)、図４０(配列番号：７８)、図４２(配列番号：８０)、図４４(配列番号：８４)、図４６(配列番号：８６)、図４８(配列番号：９１)、図５０(配列番号：９９)、図５２(配列番号：１０４)、図５４(配列番号：１０６)、図５６(配列番号：１０８)、図５８(配列番号：１１０)、図６０(配列番号：１１５)、図６２(配列番号：１２１)、図６６(配列番号：１２８)、図６８(配列番号：１３０)、図７０(配列番号：１３２)、図７２(配列番号：１３７)及び図７４(配列番号：１３９)に示したアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有する単離されたポリペプチド。 FIG. 2 (SEQ ID NO: 4), FIG. 4 (SEQ ID NO: 9), FIG. 6 (SEQ ID NO: 11), FIG. 8 (SEQ ID NO: 13), FIG. 10 (SEQ ID NO: 15), FIG. 17), FIG. 14 (SEQ ID NO: 22), FIG. 16 (SEQ ID NO: 24), FIG. 18 (SEQ ID NO: 29), FIG. 20 (SEQ ID NO: 32), FIG. 22 (SEQ ID NO: 39), FIG. 24 (SEQ ID NO: 41), FIG. 26 (SEQ ID NO: 52), FIG. 28 (SEQ ID NO: 54), FIG. 30 (SEQ ID NO: 56), FIG. 32 (SEQ ID NO: 58), FIG. 63), FIG. 36 (SEQ ID NO: 65), FIG. 38 (SEQ ID NO: 73), FIG. 40 (SEQ ID NO: 78), FIG. 42 (SEQ ID NO: 80), FIG. 44 (SEQ ID NO: 84), FIG. (SEQ ID NO: 86), FIG. 48 (SEQ ID NO: 91), FIG. 50 (SEQ ID NO: 99), FIG. 52 (SEQ ID NO: 104), FIG. 54 (SEQ ID NO: 106), FIG. 56 (SEQ ID NO: 108) ), FIG. 58 (SEQ ID NO: 1 0), FIG. 60 (SEQ ID NO: 115), FIG. 62 (SEQ ID NO: 121), FIG. 66 (SEQ ID NO: 128), FIG. 68 (SEQ ID NO: 130), FIG. 70 (SEQ ID NO: 132), FIG. An isolated polypeptide having at least 80% amino acid sequence identity with an amino acid sequence selected from the group consisting of the amino acid sequences shown in (SEQ ID NO: 137) and FIG. 74 (SEQ ID NO: 139). 図２(配列番号：４)、図４(配列番号：９)、図６(配列番号：１１)、図８(配列番号：１３)、図１０(配列番号：１５)、図１２(配列番号：１７)、図１４(配列番号：２２)、図１６(配列番号：２４)、図１８(配列番号：２９)、図２０(配列番号：３２)、図２２(配列番号：３９)、図２４(配列番号：４１)、図２６(配列番号：５２)、図２８(配列番号：５４)、図３０(配列番号：５６)、図３２(配列番号：５８)、図３４(配列番号：６３)、図３６(配列番号：６５)、図３８(配列番号：７３)、図４０(配列番号：７８)、図４２(配列番号：８０)、図４４(配列番号：８４)、図４６(配列番号：８６)、図４８(配列番号：９１)、図５０(配列番号：９９)、図５２(配列番号：１０４)、図５４(配列番号：１０６)、図５６(配列番号：１０８)、図５８(配列番号：１１０)、図６０(配列番号：１１５)、図６２(配列番号：１２１)、図６６(配列番号：１２８)、図６８(配列番号：１３０)、図７０(配列番号：１３２)、図７２(配列番号：１３７)及び図７４(配列番号：１３９)に示したアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列と比較したとき少なくとも８０％のポジティブのスコアを示す単離されたポリペプチド。 FIG. 2 (SEQ ID NO: 4), FIG. 4 (SEQ ID NO: 9), FIG. 6 (SEQ ID NO: 11), FIG. 8 (SEQ ID NO: 13), FIG. 10 (SEQ ID NO: 15), FIG. 17), FIG. 14 (SEQ ID NO: 22), FIG. 16 (SEQ ID NO: 24), FIG. 18 (SEQ ID NO: 29), FIG. 20 (SEQ ID NO: 32), FIG. 22 (SEQ ID NO: 39), FIG. 24 (SEQ ID NO: 41), FIG. 26 (SEQ ID NO: 52), FIG. 28 (SEQ ID NO: 54), FIG. 30 (SEQ ID NO: 56), FIG. 32 (SEQ ID NO: 58), FIG. 63), FIG. 36 (SEQ ID NO: 65), FIG. 38 (SEQ ID NO: 73), FIG. 40 (SEQ ID NO: 78), FIG. 42 (SEQ ID NO: 80), FIG. 44 (SEQ ID NO: 84), FIG. (SEQ ID NO: 86), FIG. 48 (SEQ ID NO: 91), FIG. 50 (SEQ ID NO: 99), FIG. 52 (SEQ ID NO: 104), FIG. 54 (SEQ ID NO: 106), FIG. 56 (SEQ ID NO: 108) ), FIG. 58 (SEQ ID NO: 1 0), FIG. 60 (SEQ ID NO: 115), FIG. 62 (SEQ ID NO: 121), FIG. 66 (SEQ ID NO: 128), FIG. 68 (SEQ ID NO: 130), FIG. 70 (SEQ ID NO: 132), FIG. An isolated polypeptide that exhibits a positive score of at least 80% when compared to an amino acid sequence selected from the group consisting of the amino acid sequences shown in (SEQ ID NO: 137) and FIG. 74 (SEQ ID NO: 139). 表１０に示されたＡＴＣＣ受託番号で寄託されたＤＮＡの全長コード配列によってコードされるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有する単離されたポリペプチド。 An isolated polypeptide having at least 80% amino acid sequence identity to the amino acid sequence encoded by the full-length coding sequence of the DNA deposited with the ATCC accession number shown in Table 10. 異種アミノ酸配列に融合した請求項１２ないし１４の何れか１項に記載のポリペプチドを含んでなるキメラ分子。 A chimeric molecule comprising the polypeptide of any one of claims 12 to 14 fused to a heterologous amino acid sequence. 前記異種アミノ酸配列がエピトープタグ配列である請求項１５に記載のキメラ分子。 The chimeric molecule according to claim 15, wherein the heterologous amino acid sequence is an epitope tag sequence. 前記異種アミノ酸配列が免疫グロブリンのＦｃ領域である請求項１５に記載のキメラ分子。 The chimeric molecule according to claim 15, wherein the heterologous amino acid sequence is an Fc region of an immunoglobulin. 請求項１２ないし１４の何れか１項に記載のポリペプチドに特異的に結合する抗体。 An antibody that specifically binds to the polypeptide according to any one of claims 12 to 14. 前記抗体がモノクローナル抗体、ヒト化抗体又は一本鎖抗体である請求項１８に記載の抗体。 The antibody according to claim 18, wherein the antibody is a monoclonal antibody, a humanized antibody or a single chain antibody. (ａ)図２(配列番号：４)、図４(配列番号：９)、図６(配列番号：１１)、図８(配列番号：１３)、図１０(配列番号：１５)、図１２(配列番号：１７)、図１４(配列番号：２２)、図１６(配列番号：２４)、図１８(配列番号：２９)、図２０(配列番号：３２)、図２２(配列番号：３９)、図２４(配列番号：４１)、図２６(配列番号：５２)、図２８(配列番号：５４)、図３０(配列番号：５６)、図３２(配列番号：５８)、図３４(配列番号：６３)、図３６(配列番号：６５)、図３８(配列番号：７３)、図４０(配列番号：７８)、図４２(配列番号：８０)、図４４(配列番号：８４)、図４６(配列番号：８６)、図４８(配列番号：９１)、図５０(配列番号：９９)、図５２(配列番号：１０４)、図５４(配列番号：１０６)、図５６(配列番号：１０８)、図５８(配列番号：１１０)、図６０(配列番号：１１５)、図６２(配列番号：１２１)、図６６(配列番号：１２８)、図６８(配列番号：１３０)、図７０(配列番号：１３２)、図７２(配列番号：１３７)又は図７４(配列番号：１３９)に示したポリペプチドをコードし、その関連シグナルペプチドを欠くヌクレオチド配列；
(ｂ)図２(配列番号：４)、図４(配列番号：９)、図６(配列番号：１１)、図８(配列番号：１３)、図１０(配列番号：１５)、図１２(配列番号：１７)、図１４(配列番号：２２)、図１６(配列番号：２４)、図１８(配列番号：２９)、図２０(配列番号：３２)、図２２(配列番号：３９)、図２４(配列番号：４１)、図２６(配列番号：５２)、図２８(配列番号：５４)、図３０(配列番号：５６)、図３２(配列番号：５８)、図３４(配列番号：６３)、図３６(配列番号：６５)、図３８(配列番号：７３)、図４０(配列番号：７８)、図４２(配列番号：８０)、図４４(配列番号：８４)、図４６(配列番号：８６)、図４８(配列番号：９１)、図５０(配列番号：９９)、図５２(配列番号：１０４)、図５４(配列番号：１０６)、図５６(配列番号：１０８)、図５８(配列番号：１１０)、図６０(配列番号：１１５)、図６２(配列番号：１２１)、図６６(配列番号：１２８)、図６８(配列番号：１３０)、図７０(配列番号：１３２)、図７２(配列番号：１３７)又は図７４(配列番号：１３９)に示したポリペプチドの細胞外ドメインをコードし、その関連シグナルペプチドを伴うヌクレオチド配列；又は
(ｃ)図２(配列番号：４)、図４(配列番号：９)、図６(配列番号：１１)、図８(配列番号：１３)、図１０(配列番号：１５)、図１２(配列番号：１７)、図１４(配列番号：２２)、図１６(配列番号：２４)、図１８(配列番号：２９)、図２０(配列番号：３２)、図２２(配列番号：３９)、図２４(配列番号：４１)、図２６(配列番号：５２)、図２８(配列番号：５４)、図３０(配列番号：５６)、図３２(配列番号：５８)、図３４(配列番号：６３)、図３６(配列番号：６５)、図３８(配列番号：７３)、図４０(配列番号：７８)、図４２(配列番号：８０)、図４４(配列番号：８４)、図４６(配列番号：８６)、図４８(配列番号：９１)、図５０(配列番号：９９)、図５２(配列番号：１０４)、図５４(配列番号：１０６)、図５６(配列番号：１０８)、図５８(配列番号：１１０)、図６０(配列番号：１１５)、図６２(配列番号：１２１)、図６６(配列番号：１２８)、図６８(配列番号：１３０)、図７０(配列番号：１３２)、図７２(配列番号：１３７)又は図７４(配列番号：１３９)に示したポリペプチドの細胞外ドメインをコードし、その関連シグナルペプチドを欠くヌクレオチド配列；
と少なくとも８０％の核酸配列同一性を有する単離された核酸。 (a) FIG. 2 (SEQ ID NO: 4), FIG. 4 (SEQ ID NO: 9), FIG. 6 (SEQ ID NO: 11), FIG. 8 (SEQ ID NO: 13), FIG. 10 (SEQ ID NO: 15), FIG. (SEQ ID NO: 17), FIG. 14 (SEQ ID NO: 22), FIG. 16 (SEQ ID NO: 24), FIG. 18 (SEQ ID NO: 29), FIG. 20 (SEQ ID NO: 32), FIG. 22 (SEQ ID NO: 39) ), FIG. 24 (SEQ ID NO: 41), FIG. 26 (SEQ ID NO: 52), FIG. 28 (SEQ ID NO: 54), FIG. 30 (SEQ ID NO: 56), FIG. 32 (SEQ ID NO: 58), FIG. SEQ ID NO: 63), FIG. 36 (SEQ ID NO: 65), FIG. 38 (SEQ ID NO: 73), FIG. 40 (SEQ ID NO: 78), FIG. 42 (SEQ ID NO: 80), FIG. 44 (SEQ ID NO: 84) 46 (SEQ ID NO: 86), FIG. 48 (SEQ ID NO: 91), FIG. 50 (SEQ ID NO: 99), FIG. 52 (SEQ ID NO: 104), FIG. 54 (SEQ ID NO: 106), and FIG. No. 108), FIG. 58 (SEQ ID NO: 110), FIG. 60 (sequence number: 115), FIG. 62 (sequence number: 121), FIG. 66 (sequence number: 128), FIG. 68 (sequence number: 130), FIG. 70 (sequence number: 132), FIG. (SEQ ID NO: 137) or nucleotide sequence encoding the polypeptide shown in FIG. 74 (SEQ ID NO: 139) and lacking its associated signal peptide;
(b) FIG. 2 (SEQ ID NO: 4), FIG. 4 (SEQ ID NO: 9), FIG. 6 (SEQ ID NO: 11), FIG. 8 (SEQ ID NO: 13), FIG. 10 (SEQ ID NO: 15), FIG. (SEQ ID NO: 17), FIG. 14 (SEQ ID NO: 22), FIG. 16 (SEQ ID NO: 24), FIG. 18 (SEQ ID NO: 29), FIG. 20 (SEQ ID NO: 32), FIG. 22 (SEQ ID NO: 39) ), FIG. 24 (SEQ ID NO: 41), FIG. 26 (SEQ ID NO: 52), FIG. 28 (SEQ ID NO: 54), FIG. 30 (SEQ ID NO: 56), FIG. 32 (SEQ ID NO: 58), FIG. SEQ ID NO: 63), FIG. 36 (SEQ ID NO: 65), FIG. 38 (SEQ ID NO: 73), FIG. 40 (SEQ ID NO: 78), FIG. 42 (SEQ ID NO: 80), FIG. 44 (SEQ ID NO: 84) 46 (SEQ ID NO: 86), FIG. 48 (SEQ ID NO: 91), FIG. 50 (SEQ ID NO: 99), FIG. 52 (SEQ ID NO: 104), FIG. 54 (SEQ ID NO: 106), and FIG. No. 108), FIG. 58 (SEQ ID NO: 110), FIG. 60 (sequence number: 115), FIG. 62 (sequence number: 121), FIG. 66 (sequence number: 128), FIG. 68 (sequence number: 130), FIG. 70 (sequence number: 132), FIG. (SEQ ID NO: 137) or a nucleotide sequence encoding the extracellular domain of the polypeptide shown in FIG. 74 (SEQ ID NO: 139) and with its associated signal peptide; or
(c) FIG. 2 (SEQ ID NO: 4), FIG. 4 (SEQ ID NO: 9), FIG. 6 (SEQ ID NO: 11), FIG. 8 (SEQ ID NO: 13), FIG. 10 (SEQ ID NO: 15), FIG. (SEQ ID NO: 17), FIG. 14 (SEQ ID NO: 22), FIG. 16 (SEQ ID NO: 24), FIG. 18 (SEQ ID NO: 29), FIG. 20 (SEQ ID NO: 32), FIG. 22 (SEQ ID NO: 39) ), FIG. 24 (SEQ ID NO: 41), FIG. 26 (SEQ ID NO: 52), FIG. 28 (SEQ ID NO: 54), FIG. 30 (SEQ ID NO: 56), FIG. 32 (SEQ ID NO: 58), FIG. SEQ ID NO: 63), FIG. 36 (SEQ ID NO: 65), FIG. 38 (SEQ ID NO: 73), FIG. 40 (SEQ ID NO: 78), FIG. 42 (SEQ ID NO: 80), FIG. 44 (SEQ ID NO: 84) 46 (SEQ ID NO: 86), FIG. 48 (SEQ ID NO: 91), FIG. 50 (SEQ ID NO: 99), FIG. 52 (SEQ ID NO: 104), FIG. 54 (SEQ ID NO: 106), and FIG. No. 108), FIG. 58 (SEQ ID NO: 110), FIG. 60 (sequence number: 115), FIG. 62 (sequence number: 121), FIG. 66 (sequence number: 128), FIG. 68 (sequence number: 130), FIG. 70 (sequence number: 132), FIG. (SEQ ID NO: 137) or nucleotide sequence encoding the extracellular domain of the polypeptide shown in FIG. 74 (SEQ ID NO: 139) and lacking its associated signal peptide;
And an isolated nucleic acid having at least 80% nucleic acid sequence identity. (ａ)図２(配列番号：４)、図４(配列番号：９)、図６(配列番号：１１)、図８(配列番号：１３)、図１０(配列番号：１５)、図１２(配列番号：１７)、図１４(配列番号：２２)、図１６(配列番号：２４)、図１８(配列番号：２９)、図２０(配列番号：３２)、図２２(配列番号：３９)、図２４(配列番号：４１)、図２６(配列番号：５２)、図２８(配列番号：５４)、図３０(配列番号：５６)、図３２(配列番号：５８)、図３４(配列番号：６３)、図３６(配列番号：６５)、図３８(配列番号：７３)、図４０(配列番号：７８)、図４２(配列番号：８０)、図４４(配列番号：８４)、図４６(配列番号：８６)、図４８(配列番号：９１)、図５０(配列番号：９９)、図５２(配列番号：１０４)、図５４(配列番号：１０６)、図５６(配列番号：１０８)、図５８(配列番号：１１０)、図６０(配列番号：１１５)、図６２(配列番号：１２１)、図６６(配列番号：１２８)、図６８(配列番号：１３０)、図７０(配列番号：１３２)、図７２(配列番号：１３７)又は図７４(配列番号：１３９)に示され、その関連シグナルペプチドを欠くポリペプチド；
(ｂ)図２(配列番号：４)、図４(配列番号：９)、図６(配列番号：１１)、図８(配列番号：１３)、図１０(配列番号：１５)、図１２(配列番号：１７)、図１４(配列番号：２２)、図１６(配列番号：２４)、図１８(配列番号：２９)、図２０(配列番号：３２)、図２２(配列番号：３９)、図２４(配列番号：４１)、図２６(配列番号：５２)、図２８(配列番号：５４)、図３０(配列番号：５６)、図３２(配列番号：５８)、図３４(配列番号：６３)、図３６(配列番号：６５)、図３８(配列番号：７３)、図４０(配列番号：７８)、図４２(配列番号：８０)、図４４(配列番号：８４)、図４６(配列番号：８６)、図４８(配列番号：９１)、図５０(配列番号：９９)、図５２(配列番号：１０４)、図５４(配列番号：１０６)、図５６(配列番号：１０８)、図５８(配列番号：１１０)、図６０(配列番号：１１５)、図６２(配列番号：１２１)、図６６(配列番号：１２８)、図６８(配列番号：１３０)、図７０(配列番号：１３２)、図７２(配列番号：１３７)又は図７４(配列番号：１３９)に示され、その関連シグナルペプチドを伴うポリペプチドの細胞外ドメイン；又は
(ｃ)図２(配列番号：４)、図４(配列番号：９)、図６(配列番号：１１)、図８(配列番号：１３)、図１０(配列番号：１５)、図１２(配列番号：１７)、図１４(配列番号：２２)、図１６(配列番号：２４)、図１８(配列番号：２９)、図２０(配列番号：３２)、図２２(配列番号：３９)、図２４(配列番号：４１)、図２６(配列番号：５２)、図２８(配列番号：５４)、図３０(配列番号：５６)、図３２(配列番号：５８)、図３４(配列番号：６３)、図３６(配列番号：６５)、図３８(配列番号：７３)、図４０(配列番号：７８)、図４２(配列番号：８０)、図４４(配列番号：８４)、図４６(配列番号：８６)、図４８(配列番号：９１)、図５０(配列番号：９９)、図５２(配列番号：１０４)、図５４(配列番号：１０６)、図５６(配列番号：１０８)、図５８(配列番号：１１０)、図６０(配列番号：１１５)、図６２(配列番号：１２１)、図６６(配列番号：１２８)、図６８(配列番号：１３０)、図７０(配列番号：１３２)、図７２(配列番号：１３７)又は図７４(配列番号：１３９)に示され、その関連シグナルペプチドを欠くポリペプチドの細胞外ドメイン；
と少なくとも８０％の核酸配列同一性を有する単離されたポリペプチド。 (a) FIG. 2 (SEQ ID NO: 4), FIG. 4 (SEQ ID NO: 9), FIG. 6 (SEQ ID NO: 11), FIG. 8 (SEQ ID NO: 13), FIG. 10 (SEQ ID NO: 15), FIG. (SEQ ID NO: 17), FIG. 14 (SEQ ID NO: 22), FIG. 16 (SEQ ID NO: 24), FIG. 18 (SEQ ID NO: 29), FIG. 20 (SEQ ID NO: 32), FIG. 22 (SEQ ID NO: 39) ), FIG. 24 (SEQ ID NO: 41), FIG. 26 (SEQ ID NO: 52), FIG. 28 (SEQ ID NO: 54), FIG. 30 (SEQ ID NO: 56), FIG. 32 (SEQ ID NO: 58), FIG. SEQ ID NO: 63), FIG. 36 (SEQ ID NO: 65), FIG. 38 (SEQ ID NO: 73), FIG. 40 (SEQ ID NO: 78), FIG. 42 (SEQ ID NO: 80), FIG. 44 (SEQ ID NO: 84) 46 (SEQ ID NO: 86), FIG. 48 (SEQ ID NO: 91), FIG. 50 (SEQ ID NO: 99), FIG. 52 (SEQ ID NO: 104), FIG. 54 (SEQ ID NO: 106), and FIG. No. 108), FIG. 58 (SEQ ID NO: 110), FIG. 60 (sequence number: 115), FIG. 62 (sequence number: 121), FIG. 66 (sequence number: 128), FIG. 68 (sequence number: 130), FIG. 70 (sequence number: 132), FIG. (SEQ ID NO: 137) or a polypeptide shown in FIG. 74 (SEQ ID NO: 139) and lacking its associated signal peptide;
(b) FIG. 2 (SEQ ID NO: 4), FIG. 4 (SEQ ID NO: 9), FIG. 6 (SEQ ID NO: 11), FIG. 8 (SEQ ID NO: 13), FIG. 10 (SEQ ID NO: 15), FIG. (SEQ ID NO: 17), FIG. 14 (SEQ ID NO: 22), FIG. 16 (SEQ ID NO: 24), FIG. 18 (SEQ ID NO: 29), FIG. 20 (SEQ ID NO: 32), FIG. 22 (SEQ ID NO: 39) ), FIG. 24 (SEQ ID NO: 41), FIG. 26 (SEQ ID NO: 52), FIG. 28 (SEQ ID NO: 54), FIG. 30 (SEQ ID NO: 56), FIG. 32 (SEQ ID NO: 58), FIG. SEQ ID NO: 63), FIG. 36 (SEQ ID NO: 65), FIG. 38 (SEQ ID NO: 73), FIG. 40 (SEQ ID NO: 78), FIG. 42 (SEQ ID NO: 80), FIG. 44 (SEQ ID NO: 84) 46 (SEQ ID NO: 86), FIG. 48 (SEQ ID NO: 91), FIG. 50 (SEQ ID NO: 99), FIG. 52 (SEQ ID NO: 104), FIG. 54 (SEQ ID NO: 106), and FIG. No. 108), FIG. 58 (SEQ ID NO: 110), FIG. 60 (sequence number: 115), FIG. 62 (sequence number: 121), FIG. 66 (sequence number: 128), FIG. 68 (sequence number: 130), FIG. 70 (sequence number: 132), FIG. The extracellular domain of the polypeptide shown in (SEQ ID NO: 137) or in FIG. 74 (SEQ ID NO: 139), with its associated signal peptide; or
(c) FIG. 2 (SEQ ID NO: 4), FIG. 4 (SEQ ID NO: 9), FIG. 6 (SEQ ID NO: 11), FIG. 8 (SEQ ID NO: 13), FIG. 10 (SEQ ID NO: 15), FIG. (SEQ ID NO: 17), FIG. 14 (SEQ ID NO: 22), FIG. 16 (SEQ ID NO: 24), FIG. 18 (SEQ ID NO: 29), FIG. 20 (SEQ ID NO: 32), FIG. 22 (SEQ ID NO: 39) ), FIG. 24 (SEQ ID NO: 41), FIG. 26 (SEQ ID NO: 52), FIG. 28 (SEQ ID NO: 54), FIG. 30 (SEQ ID NO: 56), FIG. 32 (SEQ ID NO: 58), FIG. SEQ ID NO: 63), FIG. 36 (SEQ ID NO: 65), FIG. 38 (SEQ ID NO: 73), FIG. 40 (SEQ ID NO: 78), FIG. 42 (SEQ ID NO: 80), FIG. 44 (SEQ ID NO: 84) 46 (SEQ ID NO: 86), FIG. 48 (SEQ ID NO: 91), FIG. 50 (SEQ ID NO: 99), FIG. 52 (SEQ ID NO: 104), FIG. 54 (SEQ ID NO: 106), and FIG. No. 108), FIG. 58 (SEQ ID NO: 110), FIG. 60 (sequence number: 115), FIG. 62 (sequence number: 121), FIG. 66 (sequence number: 128), FIG. 68 (sequence number: 130), FIG. 70 (sequence number: 132), FIG. The extracellular domain of a polypeptide shown in (SEQ ID NO: 137) or FIG. 74 (SEQ ID NO: 139) and lacking its associated signal peptide;
And an isolated polypeptide having at least 80% nucleic acid sequence identity. Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ又はＩポリペプチドを含有すると思われる試料中の、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ又はＩと命名されたポリペプチドを検出する方法において、前記試料をＪ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｏ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ又はＴと命名されたポリペプチドと接触させ、前記試料中のＡ／Ｊ、Ｂ／Ｋ、Ｃ／Ｌ、Ｃ／Ｍ、Ｃ／Ｎ、Ｃ／Ｊ、Ｄ／Ｏ、Ｅ／Ｐ、Ｆ／Ｑ、Ｇ／Ｒ、Ｈ／Ｓ又はＩ／Ｔポリペプチド抱合体の形成を測定することを含んでなり、ここで前記抱合体の形成が前記試料中のＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ又はＩポリペプチドの存在を示すものであり、ＡがＰＲＯ５３３ポリペプチド、ＢがＰＲＯ３０１ポリペプチド、ＣがＰＲＯ１８７ポリペプチド、ＤがＰＲＯ３３７ポリペプチド、ＥがＰＲＯ１４１１ポリペプチド、ＦがＰＲＯ１００９６ポリペプチド、ＧがＰＲＯ２４６ポリペプチド、ＨがＰＲＯ６３０７ポリペプチド、ＩがＰＲＯ６００３ポリペプチド、ＪがＦＧＦＲ-４ポリペプチド、ＫがＰＲＯ３０１ポリペプチド、ＬがＦＧＦＲ-３ポリペプチド、ＭがＦＧＦＲ-１ポリペプチド、ＮがＦＧＦＲ-２ポリペプチド、ＯがＰＲＯ６００４ポリペプチド、ＰがＰＲＯ４３５６ポリペプチド、ＱがＰＲＯ２６３０ポリペプチド、ＲがＰＲＯ２４６ポリペプチド、ＳがＰＲＯ２６５ポリペプチド及びＴがＰＲＯ９４１ポリペプチドである方法。 A poly, designated A, B, C, D, E, F, G, H or I, in a sample suspected of containing an A, B, C, D, E, F, G, H or I polypeptide. In a method for detecting peptides, said sample is contacted with a polypeptide designated J, K, L, M, N, O, P, Q, R, S or T, and A / J, B in said sample Measure formation of / K, C / L, C / M, C / N, C / J, D / O, E / P, F / Q, G / R, H / S or I / T polypeptide conjugates Wherein the formation of the conjugate is indicative of the presence of an A, B, C, D, E, F, G, H or I polypeptide in the sample, wherein A is a PRO533 poly Peptide, B is PRO301 polypeptide, C is PRO187 polypeptide, D is PRO337 polypeptide, E is PRO1411 polypeptide F, PRO10096 polypeptide, G is PRO246 polypeptide, H is PRO6307 polypeptide, I is PRO6003 polypeptide, J is FGFR-4 polypeptide, K is PRO301 polypeptide, L is FGFR-3 polypeptide, M is FGFR-1 polypeptide, N is FGFR-2 polypeptide, O is PRO6004 polypeptide, P is PRO4356 polypeptide, Q is PRO2630 polypeptide, R is PRO246 polypeptide, S is PRO265 polypeptide and T is PRO941 polypeptide There is a way. 前記試料がＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ又はＩポリペプチドを発現すると思われる細胞を含んでいる請求項２２に記載の方法。 23. The method of claim 22, wherein the sample comprises cells suspected of expressing A, B, C, D, E, F, G, H or I polypeptides. 前記Ｊ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｏ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ又はＴポリペプチドが検出可能な標識で標識されている請求項２２に記載の方法。 23. The method of claim 22, wherein the J, K, L, M, N, O, P, Q, R, S, or T polypeptide is labeled with a detectable label. 前記Ｊ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｏ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ又はＴポリペプチドが固体支持体に付着している請求項２２に記載の方法。 23. The method of claim 22, wherein the J, K, L, M, N, O, P, Q, R, S, or T polypeptide is attached to a solid support. Ｊ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｏ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ又はＴポリペプチドを含有すると思われる試料中の、Ｊ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｏ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ又はＴと命名されたポリペプチドを検出する方法において、前記試料をＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ又はＩと命名されるポリペプチドと接触させ、前記試料中におけるＡ／Ｊ、Ｂ／Ｋ、Ｃ／Ｌ、Ｃ／Ｍ、Ｃ／Ｎ、Ｃ／Ｊ、Ｄ／Ｏ、Ｅ／Ｐ、Ｆ／Ｑ、Ｇ／Ｒ、Ｈ／Ｓ又はＩ／Ｔポリペプチド抱合体の形成を測定することを含んでなり、ここで前記抱合体の形成が該試料中のＪ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｏ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ又はＴポリペプチドの存在を示すものであり、ＡがＰＲＯ５３３ポリペプチド、ＢがＰＲＯ３０１ポリペプチド、ＣがＰＲＯ１８７ポリペプチド、ＤがＰＲＯ３３７ポリペプチド、ＥがＰＲＯ１４１１ポリペプチド、ＦがＰＲＯ１００９６ポリペプチド、ＧがＰＲＯ２４６ポリペプチド、ＨがＰＲＯ６３０７ポリペプチド、ＩがＰＲＯ６００３ポリペプチド、ＪがＦＧＦＲ-４ポリペプチド、ＫがＰＲＯ３０１ポリペプチド、ＬがＦＧＦＲ-３ポリペプチド、ＭがＦＧＦＲ-１ポリペプチド、ＮがＦＧＦＲ-２ポリペプチド、ＯがＰＲＯ６００４ポリペプチド、ＰがＰＲＯ４３５６ポリペプチド、ＱがＰＲＯ２６３０ポリペプチド、ＲがＰＲＯ２４６ポリペプチド、ＳがＰＲＯ２６５ポリペプチド及びＴがＰＲＯ９４１ポリペプチドである方法。 J, K, L, M, N, O, P, Q, R, in a sample suspected of containing a J, K, L, M, N, O, P, Q, R, S or T polypeptide. In a method of detecting a polypeptide designated S or T, the sample is contacted with a polypeptide designated A, B, C, D, E, F, G, H or I, and A in the sample / J, B / K, C / L, C / M, C / N, C / J, D / O, E / P, F / Q, G / R, H / S or I / T polypeptide conjugates Measuring the formation of, wherein said conjugate formation indicates the presence of a J, K, L, M, N, O, P, Q, R, S or T polypeptide in said sample. A is PRO533 polypeptide, B is PRO301 polypeptide, C is PRO187 polypeptide, D is PRO337 polypeptide, E is P O1411 polypeptide, F is PRO10096 polypeptide, G is PRO246 polypeptide, H is PRO6307 polypeptide, I is PRO6003 polypeptide, J is FGFR-4 polypeptide, K is PRO301 polypeptide, L is FGFR-3 polypeptide, M is FGFR-1 polypeptide, N is FGFR-2 polypeptide, O is PRO6004 polypeptide, P is PRO4356 polypeptide, Q is PRO2630 polypeptide, R is PRO246 polypeptide, S is PRO265 polypeptide and T is PRO941 polypeptide A method which is a peptide. 前記試料がＪ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｏ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ又はＴポリペプチドを発現すると思われる細胞を含んでいる請求項２６に記載の方法。 27. The method of claim 26, wherein the sample comprises cells suspected of expressing J, K, L, M, N, O, P, Q, R, S or T polypeptides. 前記Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ又はＩポリペプチドが検出可能な標識で標識されている請求項２６に記載の方法。 27. The method of claim 26, wherein the A, B, C, D, E, F, G, H or I polypeptide is labeled with a detectable label. 前記Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ又はＩポリペプチドが固体支持体に付着している請求項２６に記載の方法。 27. The method of claim 26, wherein the A, B, C, D, E, F, G, H or I polypeptide is attached to a solid support. Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ又はＩと命名されたポリペプチドを発現する細胞に生物活性分子を結合させる方法において、前記生物活性分子と結合したＪ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｏ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ又はＴと命名されるポリペプチドと前記細胞を接触させ、前記Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ又はＩと前記Ｊ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｏ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ又はＴポリペプチドとを互いに結合させ、よって前記細胞に前記生物活性分子を結合させることを含んでなり、ＡがＰＲＯ５３３ポリペプチド、ＢがＰＲＯ３０１ポリペプチド、ＣがＰＲＯ１８７ポリペプチド、ＤがＰＲＯ３３７ポリペプチド、ＥがＰＲＯ１４１１ポリペプチド、ＦがＰＲＯ１００９６ポリペプチド、ＧがＰＲＯ２４６ポリペプチド、ＨがＰＲＯ６３０７ポリペプチド、ＩがＰＲＯ６００３ポリペプチド、ＪがＦＧＦＲ-４ポリペプチド、ＫがＰＲＯ３０１ポリペプチド、ＬがＦＧＦＲ-３ポリペプチド、ＭがＦＧＦＲ-１ポリペプチド、ＮがＦＧＦＲ-２ポリペプチド、ＯがＰＲＯ６００４ポリペプチド、ＰがＰＲＯ４３５６ポリペプチド、ＱがＰＲＯ２６３０ポリペプチド、ＲがＰＲＯ２４６ポリペプチド、ＳがＰＲＯ２６５ポリペプチド及びＴがＰＲＯ９４１ポリペプチドである方法。 A method for binding a biologically active molecule to a cell expressing a polypeptide designated A, B, C, D, E, F, G, H or I, wherein J, K, L, bound to said biologically active molecule Contacting said cell with a polypeptide designated M, N, O, P, Q, R, S or T, said A, B, C, D, E, F, G, H or I and said J, Binding K, L, M, N, O, P, Q, R, S or T polypeptides to each other, and thus binding the biologically active molecule to the cell, wherein A is a PRO533 polypeptide, B is PRO301 polypeptide, C is PRO187 polypeptide, D is PRO337 polypeptide, E is PRO1411 polypeptide, F is PRO10096 polypeptide, G is PRO246 polypeptide, H is PRO6307 polypeptide, I is RO6003 polypeptide, J is FGFR-4 polypeptide, K is PRO301 polypeptide, L is FGFR-3 polypeptide, M is FGFR-1 polypeptide, N is FGFR-2 polypeptide, O is PRO6004 polypeptide, P is A method wherein the PRO4356 polypeptide, Q is a PRO2630 polypeptide, R is a PRO246 polypeptide, S is a PRO265 polypeptide and T is a PRO941 polypeptide. 前記生物活性分子が毒素、放射標識又は抗体である請求項３０に記載の方法。 32. The method of claim 30, wherein the bioactive molecule is a toxin, radiolabel or antibody. 前記生物活性分子が細胞死を引き起こす請求項３０に記載の方法。 32. The method of claim 30, wherein the bioactive molecule causes cell death. Ｊ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｏ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ又はＴと命名されたポリペプチドを発現する細胞に生物活性分子を結合させる方法において、前記生物活性分子と結合したＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ又はＩと命名されるポリペプチドと前記細胞を接触させ、前記Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ又はＩと前記Ｊ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｏ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ又はＴとを互いに結合させ、よって前記細胞に前記生物活性分子を結合させることを含んでなり、ＡがＰＲＯ５３３ポリペプチド、ＢがＰＲＯ３０１ポリペプチド、ＣがＰＲＯ１８７ポリペプチド、ＤがＰＲＯ３３７ポリペプチド、ＥがＰＲＯ１４１１ポリペプチド、ＦがＰＲＯ１００９６ポリペプチド、ＧがＰＲＯ２４６ポリペプチド、ＨがＰＲＯ６３０７ポリペプチド、ＩがＰＲＯ６００３ポリペプチド、ＪがＦＧＦＲ-４ポリペプチド、ＫがＰＲＯ３０１ポリペプチド、ＬがＦＧＦＲ-３ポリペプチド、ＭがＦＧＦＲ-１ポリペプチド、ＮがＦＧＦＲ-２ポリペプチド、ＯがＰＲＯ６００４ポリペプチド、ＰがＰＲＯ４３５６ポリペプチド、ＱがＰＲＯ２６３０ポリペプチド、ＲがＰＲＯ２４６ポリペプチド、ＳがＰＲＯ２６５ポリペプチド及びＴがＰＲＯ９４１ポリペプチドである方法。 A method for binding a biologically active molecule to a cell expressing a polypeptide designated J, K, L, M, N, O, P, Q, R, S or T, wherein A is bound to said biologically active molecule, Contacting said cell with a polypeptide designated B, C, D, E, F, G, H or I, said A, B, C, D, E, F, G, H or I and said J, Binding K, L, M, N, O, P, Q, R, S or T to each other, thus binding the biologically active molecule to the cell, wherein A is a PRO533 polypeptide, and B is PRO301 polypeptide, C is PRO187 polypeptide, D is PRO337 polypeptide, E is PRO1411 polypeptide, F is PRO10096 polypeptide, G is PRO246 polypeptide, H is PRO6307 polypeptide, I is PRO600 Polypeptide, J is FGFR-4 polypeptide, K is PRO301 polypeptide, L is FGFR-3 polypeptide, M is FGFR-1 polypeptide, N is FGFR-2 polypeptide, O is PRO6004 polypeptide, P is PRO4356 A method wherein the polypeptide is Q, PRO2630 polypeptide, R is PRO246 polypeptide, S is PRO265 polypeptide and T is PRO941 polypeptide. 前記生物活性分子が毒素、放射標識又は抗体である請求項３３に記載の方法。 34. The method of claim 33, wherein the bioactive molecule is a toxin, radiolabel or antibody. 前記生物活性分子が細胞死を引き起こす請求項３３に記載の方法。 34. The method of claim 33, wherein the bioactive molecule causes cell death. Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ又はＩと命名されたポリペプチドを発現する細胞の少なくとも一つの生物学的活性を調節する方法において、Ｊ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｏ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ又はＴと命名されたポリペプチド、又は抗-Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ又はＩポリペプチド抗体と前記細胞を接触させ、前記Ｊ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｏ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ又はＴポリペプチド、又は前記抗-Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ又はＩポリペプチド抗体を前記Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ又はＩポリペプチドに結合させ、よって前記細胞の少なくとも一つの生物学的活性を調節することを含む方法。 In a method of modulating at least one biological activity of a cell expressing a polypeptide designated A, B, C, D, E, F, G, H or I, J, K, L, M, N Contacting said cell with a polypeptide designated O, P, Q, R, S or T, or an anti-A, B, C, D, E, F, G, H or I polypeptide antibody; J, K, L, M, N, O, P, Q, R, S or T polypeptide, or said anti-A, B, C, D, E, F, G, H or I polypeptide antibody A method comprising binding to an A, B, C, D, E, F, G, H or I polypeptide, thereby modulating at least one biological activity of said cell. 前記細胞を死亡させる請求項３６に記載の方法。 38. The method of claim 36, wherein the cell is killed. Ｊ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｏ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ又はＴと命名されたポリペプチドを発現する細胞の少なくとも一つの生物学的活性を調節する方法において、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ又はＩと命名されたポリペプチド、又は抗-Ｊ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｏ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ又はＴポリペプチド抗体と前記細胞を接触させ、前記抗-Ｊ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｏ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ又はＴポリペプチド抗体、又はＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ又はＩポリペプチドを、前記Ｊ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｏ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ又はＴポリペプチドに結合させ、よって前記細胞の少なくとも一つの生物学的活性を調節することを含む方法。 In a method for modulating at least one biological activity of a cell expressing a polypeptide designated J, K, L, M, N, O, P, Q, R, S or T, A, B, C A polypeptide named D, E, F, G, H or I, or an anti-J, K, L, M, N, O, P, Q, R, S or T polypeptide antibody and said cell Said anti-J, K, L, M, N, O, P, Q, R, S or T polypeptide antibody, or A, B, C, D, E, F, G, H or I poly A method comprising binding a peptide to said J, K, L, M, N, O, P, Q, R, S or T polypeptide, thereby modulating at least one biological activity of said cell. 前記細胞を死亡させる請求項３６に記載の方法。 38. The method of claim 36, wherein the cell is killed.
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